CN110506634A - 一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法，通过构建鸢尾无性系组培苗，并将鸢尾无性系组培苗,用不同剂量化学诱变剂秋水仙素进行化学诱变处理，处理后继续培养,选取诱变处理40天时的组培苗，测定H2O2含量和POD活性，根据测定结果进行筛选，通过测定诱变处理后40天时的H2O2含量和POD活性判断适宜的化学诱变剂量，指标测得值越大，对应材料成活率越低，对应的化学诱变剂量越不合适，测得值越小，成活率越高，对应的化学诱变剂量越合适。本发明先构建鸢尾无性系组培苗作为诱变材料，克服了杂交后代种子为诱变材料时本身存在一定的性状分离的问题；本发明通过生理生化指标与成活率的相关性分析，筛选出2个与化学诱变显著相关的生理生化指标，可以用于化学诱变剂量和诱变时间的筛选，可快速缩小诱变系范围，减轻育种工作量。
Description
技术领域
本发明涉及化学诱变育种领域，具体涉及一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法。
背景技术
鸢尾属(Iris)为鸢尾科(Iridaceae)最大的属，属于多年生草本植物。鸢尾属植物不仅拥有较好的观赏价值和药用价值，而且还用于烟草、食品、化妆品、纺织等方面，因此具有较高的经济效益和社会效益，和巨大的市场潜力(姬常平,2013)。
在鸢尾众多类别中，路易斯安那鸢尾(Louisiana irises)作为一类杂种鸢尾，具有花色鲜艳丰富、适应性强、抗寒性强等优点，是较好的观花、观叶类水体绿化材料。路易斯安那鸢尾原产于美国，我国虽已开展了引种栽培、生长习性调查、组培快繁体系构建、抗性评价、育种等工作，但目前市场仍大量使用国外引进品种，缺乏我国自主育成的新优品种。近年来，路易斯安那鸢尾育种工作，主要为杂交授粉方法、杂交果实收获、杂交种子筛选以及通过离体胚培养促进杂交种子萌发。
诱变育种是指利用人工诱变的方法获得生物新品种的育种方法，主要通过辐射、激光、化学物质、太空(辐射、失重)的方法选育新品种，可提高突变率，并加速育种进程，但缺点是需要处理大量生物材料。在诱变育种中，辐射诱变和化学诱变使用较为广泛，已应用于不同物种和组织材料的诱变。化学诱变是通过化学试剂使生物DNA发生损伤和错误修复，产生突变体的技术。化学诱变剂大致包括碱基类似物、碱基修饰剂、嵌入染料、叠氮类化合物和一些抗生素等；具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤小、突变率高等特点，因而近年来成为运用最为广泛的诱变技术之一。此外，对于突变数量而言，化学诱变比辐射诱变更有效，有利于更好地培育花卉新品的优点。目前，常用的化学诱变剂主要包括：甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)、叠氮化钠(Sodium azide,NaN3)、秋水仙素。其中，秋水仙素作为一种高效的多倍体诱导剂，利用秋水仙素诱导多倍体目的性强，能达到定向改良花卉的目的，其诱导、选择、快繁都可在离体条件下完成，短期内繁殖出大量的多倍体植株。
总结以往的研究结果，不同物种的最佳秋水仙素浓度存在较大差异。例如红掌的最佳处理浓度为0.3％，处理时间为9d，其再生苗变异率可达60％，杂交兰为0.1％秋水仙素处理48h时诱导效果最佳；荷兰水仙适宜的浓度则为0.05％-0.01％处理1-2d。
鸢尾化学诱变育种的研究极少，基本集中在杂交育种和辐射诱变。利用秋水仙素开展鸢尾多倍体诱变育种可完善鸢尾育种体系，加快新优种质育种进程。然而，秋水仙素具有一定的剧毒性，对外植体有毒害作用，在诱变过程中常常使材料在处理过程中死亡，影响种子萌发、根的生长等。因此，鸢尾化学诱变剂量快速筛选的方法，对于提高诱变效率和诱导频率均有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法。
技术方案：本发明提供了一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法，包括以下步骤：
S1，构建鸢尾无性系组培苗；
S2，将S1中鸢尾无性系组培苗,用不同剂量化学诱变剂进行化学诱变处理，处理后继续培养,所述化学诱变剂为秋水仙素；
S3，选取步骤2中诱变处理40天时的组培苗，测定H2O2含量和POD活性；
S4，化学诱变剂量筛选，根据所述步骤S3的测定结果进行筛选，通过测定诱变处理后40天时的H2O2含量和POD活性判断适宜的化学诱变剂量，指标测得值越大，对应材料成活率越低，对应的化学诱变剂量越不合适，测得值越小，成活率越高，对应的化学诱变剂量越合适。
作为优选，步骤S1中，以鸢尾当年新萌发幼芽的茎尖为外植体，使用0.1％HgCl2对外植体消毒7min，初代培养基配方为MS+6-BA1.5mg/L+IAA0.2mg/L，继代培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L。培养温度为25℃±2℃，湿度60％-70％，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
作为优选，所述步骤S2中化学诱变剂秋水仙素的浓度范围为0.1％～0.5％。
作为优选，步骤S1中以路易斯安那鸢尾品种‘Heather Stream’为试验材料，步骤S3中测定的H2O2含量和POD活性，2个指标的测定值分别不高于0.448μmol/g和942.57U/g·FW时，所述无性系组培苗成活率不低于30％。
有益效果
本发明先构建鸢尾无性系组培苗作为诱变材料，克服了杂交后代种子为诱变材料时本身存在一定的性状分离的问题；本发明使用组培苗作为诱变材料，更容易观测其表型(叶色、长势)变化，且可测定其叶片生理生化指标，通过综合指标评价不同剂量对鸢尾的影响；本发明通过生理生化指标与成活率的相关性分析，筛选出2个与化学诱变显著相关的生理生化指标，可以用于化学诱变剂量和诱变时间的筛选，可快速缩小诱变系范围，减轻育种工作量。
附图说明
图1：不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗MOD含量的影响。
图2：不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗H2O2含量的影响。
图3:不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗O2 －·生成速率影响。
图4；不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗SOD活性的影响。
图5：不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗CAT活性的影响。
图6：不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗POD活性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
1、鸢尾无性系的构建
以路易斯安那鸢尾品种‘Heather Stream’为试验材料，试验材料种植于双层塑料大棚内，构建其组培苗无性系。具体操作为：以当年新萌发幼芽的茎尖为外植体，使用0.1％HgCl2对外植体消毒7min，初代培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+IAA 0.2mg/L，继代培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L。培养温度为25℃±2℃，湿度60％-70％，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
2、秋水仙素诱变处理
选择长势一致、株高为2～3cm的‘Heather Stream’组培苗用于诱变处理。使用秋水仙素(Colchicine,美国SIGMA)进行化学诱变处理，秋水仙素浓度共设3个梯度，分别为0.1％、0.2％和0.3％，将不同剂量秋水仙素添加至培养基中，培养2d后将组培苗转接至新的继代培养基中。秋水仙素诱变处理后，培养条件(培养基、光照强度和周期、温湿度)与无性系构建时期一致，每30d转接至新配置的继代培养基。
3、诱变系叶片生理生化测定和成活率统计
诱变处理后的0、5、10、15、20、30和40d时取鸢尾组培苗叶片，按照各项生理生化指标测试需求称重后，冻存于-80℃冰箱。采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量；利用羟胺氧化法测定超氧阴离子自由基(O2 －)产生速率；采用紫外吸收法测定H2O2含量；采用氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性；采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性；于40d时统计不同剂量诱变处理的成活率。
4、诱变处理后生理生化指标和成活率
如图所示，不同剂量秋水仙素处理后，0-30d期间均导致叶片中丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)的积累、超氧阴离子(O2 －)生成速率提高以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性的增强；在30-40d期间，随着转接至新的培养基，以上生理生化指标均有所下降。相同生理生化指标，秋水仙素浓度越高其丙二醛和过氧化氢含量越高，超氧阴离子生成速率快，且抗氧化酶活性(SOD、CAT、POD)显著增强。0.1％、0.2％和0.3％秋水仙素处理后的成活率分别为55.56％、35.56％和32.22％。结合生理生化指标的检测结果，初步认为秋水仙素剂量、生理生化指标及成活率间可能存在一定的相关性。
5、诱变剂量、生理生化指标及成活率的相关性分析
通过SPSS 17.0软件，对不同诱变剂量处理后的生理生化指标(MDA、H2O2、O2 －、SOD、CAT和POD)与成活率进行相关性分析，相关性分析结果见下表1。对于秋水仙素处理的鸢尾组培苗叶片，部分生理生化指标间存在一定的相关性，例如O2 －生成速率与抗氧化酶(SOD、CAT和POD)活性存在显著相关性，CAT活性与SOD、POD活性显著相关；然而，MDA含量与其他5项生理生化指标不相关。
由相关性分析数据可见，不同浓度的秋水仙素处理后的诱变苗，其成活率与H2O2含量和POD活性在0.01水平上显著负相关。即H2O2含量高和POD活性高诱变苗成活率低。H2O2、和POD可作为预估秋水仙素诱变系成活率的指标，用于快速筛选合适的剂量。
表1各项生理生化指标与成活率相关性分析
注：**在0.01水平(双侧)上显著相关；*在0.05水平(双侧)上显著相关。
综上所述，H2O2含量和POD活性与秋水仙素诱变苗成活率密切相关，表现为这2个指标测得值越高，成活率越低。秋水仙素诱变处理后，对组培苗造成一定胁迫伤害，导致以上指标在0-30d期间测得的值随着时间的延长而增长，但在30d时转接至新配制的继代培养基后，30-40d期间这2个指标明显下降。因此，对于不同剂量的秋水仙素诱变处理，可通过测定诱变处理后40d时的H2O2含量和POD活性，2个指标测得值越大，对应材料成活率越低，所用诱变剂量越不合适，测得值越小，成活率越高，所用化学诱变剂量越合适。对于路易斯安那‘Heather Stream’品种，0.1％、0.2％和0.3％秋水仙素处理后的成活率分别为55.56％、35.56％和32.22％。因此，进行秋水仙素诱变处理时，在40d时测定其H2O2含量和POD活性，2个指标的测定值分别不高于0.448μmol/g和942.57U/g·FW时，可保证其一定的成活率，即不低于30％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，构建鸢尾无性系组培苗；
S2，将S1中鸢尾无性系组培苗,用不同剂量化学诱变剂进行化学诱变处理，处理后继续培养,所述化学诱变剂为秋水仙素；
S3，选取步骤2中诱变处理40天时的组培苗，测定H2O2含量和POD活性；
S4，化学诱变剂量筛选，根据所述步骤S3的测定结果进行筛选，通过测定诱变处理后40天时的H2O2含量和POD活性判断适宜的化学诱变剂量，指标测得值越大，对应材料成活率越低，对应的化学诱变剂量越不合适，测得值越小，成活率越高，对应的化学诱变剂量越合适。
2.根据权利要求1所述的一种的方法，其特征在于,步骤S1中，以鸢尾当年新萌发幼芽的茎尖为外植体，使用0.1％HgCl2对外植体消毒7min，初代培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+IAA 0.2mg/L，继代培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L。培养温度为25℃±2℃，湿度60％-70％，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
3.根据权利要求1所述的一种的方法，其特征在于,所述步骤S2中化学诱变剂秋水仙素的浓度范围为0.1％～0.5％。
4.根据权利要求1所述的一种的方法，其特征在于,步骤S1中以路易斯安那鸢尾品种‘Heather Stream’为试验材料，步骤S3中测定的H2O2含量和POD活性，2个指标的测定值分别不高于0.448μmol/g和942.57U/g·FW时，所述无性系组培苗成活率不低于30％。
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