CN110476817A - 一种鸢尾辐射诱变剂量筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸢尾辐射诱变剂量筛选方法，通过构建鸢尾无性系组培苗，并将鸢尾无性系组培苗,用不同剂量进行辐射诱变处理，辐射处理后继续培养，选取诱变处理40天时的组培苗，测定丙二醛(MDA)含量、超氧阴离子自由基(O₂ ^－·)产生速率、H₂O₂含量、抗氧化酶(SOD、CAT)活性，通过测定诱变处理后40天时的MDA和H₂O₂含量、O₂ ^－·产生速率、SOD和CAT活性判断适宜的诱变剂量，指标测得值越大，对应材料成活率越低，对应的辐射诱变剂量越不合适，测得值越小，成活率越高，对应的辐射诱变剂量越合适。本发明先构建鸢尾无性系组培苗作为诱变材料，克服了杂交后代种子为诱变材料时本身存在一定的性状分离的问题，通过辐射诱变后，鸢尾组培苗生理生化指标与成活率的相关性分析，筛选出评价诱变系成活率相关的生理生化指标，用于筛选鸢尾适宜诱变剂量。

Description

一种鸢尾辐射诱变剂量筛选方法

技术领域

本发明涉及辐射诱变育种领域，具体涉及一种鸢尾辐射诱变剂量筛选方法。

背景技术

鸢尾是鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris L.)多年生草本植物，鸢尾通常花冠较大、花色较艳、花型奇特，具有较高观赏价值。

目前，国内外鸢尾属植物的育种主要有常规杂交育种、体细胞杂交、倍性育种、辐射育种、转基因技术等。其中杂交育种作为植物育种的常用技术，但大量的研究结果表明鸢尾属品种多为近缘种间、品种间杂交产生，远缘种间杂交较少，然而远缘种间杂交可为观赏性、适应性等方面提供更大潜力。然而，鸢尾属染色体数目变化较大，导致远缘种间杂交不易结实，限制了鸢尾属远缘杂交育种的进程。

近年来，诱变育种因其简便、安全、经济和突变率高的优势，且产生的变异稳定较快，可在短时间内育出新品种，而备受育种工作者重视。常用的诱变育种方法包括化学诱变、辐射诱变、航空诱变等，其中辐射诱变育种因其突变率一般可达千分之几，甚至百分之几，比自然突变率高千百倍，并可引起植物形态结构和并可引起植物形态结构和生理生化多方面的变异，由于观赏植物的色泽、大小、类型易于选择，很多材料在遗传上是高度杂合的，易获得高的突变频率，更适合于人们在培育观赏植物时求新求异的特点。因此，辐射诱变成为目前观赏植物品种培育和改良中一种非常重要的方法和手段(田杰等,2012)，且经过几十年的发展，仅我国就已对40多种花卉进行辐射育种和改良，且已成功获得60多个突变种，其中包括我国的名花，如菊花、兰花、百合、月季、观赏性海棠、水仙和蝴蝶兰等(赵利坤和强继业,2013)。

辐射诱变所使用的辐射源常用的有γ射线、中子、X射线、β射线以及非电离辐射的紫外线和激光。⁶⁰Co-γ射线是花卉和农作物上最常用的辐射诱变源，不同物种间，同一物种不同品种和不同组织，其最适的⁶⁰Co-γ射线剂量存在较大差异，辐射诱变剂量过高则导致致死率过高，诱变剂量过低则可能未能获得足够的新种质。

简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)，也称为微卫星DNA，SSR原理是根据微卫星序列两端互补序列设计引物，对模板DNA进行PCR扩增的产物用琼脂糖凝胶或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据扩增产物的大小确定基因型及计算等位基因频率。与其它分子标记技术相比，由于微卫星呈共显性遗传，因此可鉴别杂合子和纯合子；另外还具有DNA用量少，DNA质量要求不高，快速简便，重复性好等优点。目前，SSR标记已成功用于平菇、狼尾草属牧草、高羊茅、紫花苜蓿等不同物种的诱变系鉴定。

随着组培快繁技术的成熟，可利用组培快繁技术构建鸢尾种质资源无性系，既可用于后续诱变育种，又利于后期诱变系的表型鉴定。对诱变的材料，通过生理生化的测定，能快速筛选出合适的辐射诱变剂量，可为科研工作人员在鸢尾新品种的选育方面减轻工作量，缩短育种时间，加快鸢尾新优品种的选育进程。

发明内容

为了克服现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鸢尾辐射诱变剂量筛选方法。

技术方案：本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一个方面，提供了一种鸢尾辐射诱变剂量筛选方法，包括以下步骤：

S1，构建鸢尾无性系组培苗；

S2，将S1中鸢尾无性系组培苗,用不同剂量辐射诱变处理，辐射处理后继续培养；

S3，选取步骤2中诱变处理40天时的组培苗，测定丙二醛(MDA)含量、超氧阴离子自由基(O₂ ^－·)产生速率、H₂O₂含量、抗氧化酶(SOD、CAT)活性；

S4，诱变剂量筛选，根据所述步骤S3的测定结果进行筛选，通过测定诱变处理后40天时的MDA和H₂O₂含量、O₂ ^－·生成速率、SOD和CAT活性判断适宜的诱变剂量，指标测得值越大，对应材料成活率越低，对应的辐射诱变剂量越不合适，测得值越小，成活率越高，对应的辐射诱变剂量越合适。

作为优选，步骤S1中，以鸢尾当年新萌发幼芽的茎尖为外植体，使用0.1％HgCl2对外植体消毒7min，初代培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+IAA 0.2mg/L，继代培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L。培养温度为25℃±2℃，湿度60％-70％，光照强度2000lx，光照时间12h/d。

作为优选,步骤S2中，所述辐射诱变的诱变源为⁶⁰Co-γ射线。

作为优选,步骤S2中，所述辐射诱变的剂量为1-40Gy，剂量率为1Gy·min^-1。

作为优选，本发明还包括以下步骤，

S5：筛选用于SSR标记鉴定的诱变材料，选择MDA、H₂O₂、O₂ ^－·、SOD和CAT 5个指标测定值分别在2.77～3.24nmol·g^-1、0.524～0.564μmol/g、0.558～0.736nmol/(g FW·min)、234.44～320.40U/g·FW和132.33～134.17U/g·FW范围内诱变苗，用于后续鉴定；

S6：基于SSR标记的诱变系鉴定，选取步骤S5中符合指标范围的诱变苗，通过筛选和验证SSR标记进行遗传多样性分析，通过聚类图鉴定诱变材料与亲本的遗传距离，从中鉴定出与亲本遗传背景一致的材料，筛选出与亲本存在遗传差异的诱变材料，后期对这部分材料扩繁生根、炼苗后种植。

有益效果

本发明使用组培快繁体系，可在短时间内对诱变系进行扩繁，有利于新优鸢尾种质的扩繁和推广。本发明先构建鸢尾无性系组培苗作为诱变材料，克服了杂交后代种子为诱变材料时本身存在一定的性状分离的问题，更容易观测其表型(叶色、长势)变化，且可测定其叶片生理生化指标，通过综合指标评价不同剂量对鸢尾的影响；通过辐射诱变后，鸢尾组培苗生理生化指标与成活率的相关性分析，筛选出评价诱变系成活率相关的生理生化指标，用于指导筛选鸢尾适宜诱变剂量，并通过SSR标记用于鉴定诱变系与亲本的遗传多样性，进一步快速高效的缩小诱变系范围，减轻育种工作量。

附图说明

图1；不同辐射剂量对鸢尾组培苗MOD含量的影响。

图2；不同辐射剂量对鸢尾组培苗H₂O₂含量的影响。

图3；不同辐射剂量对鸢尾组培苗O₂ ^－·生成速率影响。

图4；不同辐射剂量对鸢尾组培苗SOD活性的影响。

图5：不同辐射剂量对鸢尾组培苗CAT活性的影响。

图6：不同辐射剂量对鸢尾组培苗POD活性的影响。

图7:基于10对SSR标记的鸢尾聚类分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

1、鸢尾无性系的构建

以路易斯安那鸢尾品种‘Heather Stream’为试验材料，试验材料种植于双层塑料大棚内,构建其组培苗无性系。具体操作为：以当年新萌发幼芽的茎尖为外植体，使用0.1％HgCl2对外植体消毒7min，初代培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+IAA 0.2mg/L，继代培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L。培养温度为25℃±2℃，湿度60％-70％，光照强度2000lx，光照时间12h/d。

2、辐射诱变处理

选择长势一致、株高为2-3cm的‘Heather Stream’组培苗用于辐射诱变处理。利用⁶⁰Co-γ射线进行辐射诱变处理，共设2.5、5、10、20和40Gy共5个剂量，剂量率为1Gy·min-1。辐射诱变处理后，培养条件(培养基、光照强度和周期、温湿度)与无性系构建时期一致，每30d转接至新配置的继代培养基。

3、诱变系叶片生理生化测定和成活率统计

于诱变处理后的0、5、10、15、20、30和40d时取鸢尾组培苗叶片，按照各项生理生化指标测试需求称重后，冻存于-80℃冰箱。采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量；利用羟胺氧化法测定超氧阴离子自由基(O₂ ^－·)产生速率；采用紫外吸收法测定H₂O₂含量；采用氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性；采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性；于40d时统计不同剂量诱变处理的成活率。

4、毛细管电泳

引物来源：由于路易斯安那鸢尾是由短茎鸢尾(I.Brevicaulis)、暗黄鸢尾(I.Fulva)、六角果鸢尾(I.Hexagona)、高大鸢尾(I.Giganticaerulea)和内耳森鸢尾(I.Nelsonii)共5个野生种杂交而来；因此，使用了Tang等(2009)通过短茎鸢尾和暗黄鸢尾叶片和根系的转录组数据所挖掘的SSR标记，从其挖掘的532对SSR引物中筛选14对相对多态性较高的SSR引物用于后续测试。14对SSR引物用于40份不同的路易斯安那鸢尾材料(不同品种、不同品种的杂交后代、不同品种诱变系)分析时，检测结果表明其中10对SSR引物(表1)特异性高且多态性较好，适用于后续分析；而其余4对引物在检测中存在无多态性、条带杂乱或多态性低等问题，因此未用于测试样本的遗传多样性分析。10对筛选出的SSR引物分别是IB127、IB168、IB175、IB179、IB211、IB241、IB314、IB318、IF173、IF194。

DNA提取和检测：使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒提取叶片DNA。通过1.0％琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop ND测定DNA浓度及纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，质量满足试验要求的DNA，-20℃冻存备用。

SSR-PCR扩增：多重PCR扩增体系为15μL，包括7.5μL 2*Tsingke Master mix(green)、DNA 1μL(浓度10ng/μL)、正反向引物各1μL(浓度10μmol/L)、ddH₂O 4.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃～64℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min，最后4℃保存扩增产物。第一次扩增后的产物(2μL扩增产物+5μL溴酚蓝)通过1.0％琼脂糖凝胶电泳(电压300V,12min)检测，依据胶图判断对应引物是否扩增出目的DNA片段；随后进行二次扩增，扩增体系和PCR反应程序同于第一次，第二轮退火温度为53℃～57℃(不同引物具体退火温度见表2)。

毛细管电泳检测：将高度去离子甲酰胺与分子量内标ROX500按照130:1配置成混合液，随后分装至国产96孔反应板中，每孔分装10μL。在每孔中加入PCR产物0.5μL，常温下离心4000rpm即停。混合板通过博日HB-T2-D金属浴加热仪加热，95℃预变性5min，随后立即拿出放入-20℃快速冷却，冷却后的96孔板4 000rpm离心，解冻并混匀后，通过ABI 3730xl遗传分析仪(Applied Biosystems,USA)进行毛线管电泳检测。

数据统计：毛细管电泳检测的原始数据，使用软件Gene mapper V4.1(美国Applied Biosystems公司)进行数据准确位点的分析。根据峰图和位点信息判断检测引物是否具有位点多态性，选取特异性高，多态性好的位点做为后续分析重点。使用PopGen32软件计算SSR位点遗传多样性指标，并计算样本间的标准遗传距离；随后，采用非加权平均数法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)进行遗传相似性聚类分析，并绘制遗传亲缘关系树状聚类图。

5、诱变处理后生理生化指标和成活率

不同辐射诱变处理后，0-30d期间均导致叶片中丙二醛(MDA)和过氧化氢(H₂O₂)的积累、超氧阴离子(O₂ ^－)生成速率提高以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性的增强；在30-40d期间，随着转接至新的培养基，以上生理生化指标均有所下降。相同生理生化指标，辐射剂量越高其丙二醛和过氧化氢含量越高，超氧阴离子生成速率快，且抗氧化酶活性(SOD、CAT、POD)显著增强。2.5、5、10、20和40Gy 5个剂量的成活率分别为21.11％、13.33％、12.22％、3.33％和1.11％。结合生理生化指标的检测结果，初步认为辐射剂量、生理生化指标及成活率间可能存在一定的相关性。

6、诱变剂量、生理生化指标及成活率的相关性分析

通过SPSS 17.0软件，对不同诱变剂量处理后的生理生化指标(MDA、H₂O₂、O₂ ^－·、SOD、CAT和POD)与成活率进行相关性分析，相关性分析结果见下表。各项生理生化指标间，存在一定的相关性，例如MDA含量与H₂O₂含量、O₂ ^－生成速率在0.01水平上显著相关，与SOD、CAT活性在0.05水平上显著相关，但与POD无相关性。值得关注的是，虽然POD在变化趋势方面与SOD、CAT相似，但其与各项生理生化指标和成活率并不相关。

由相关性分析数据可见，不同剂量的诱变苗，其成活率与MDA含量、O₂ ^－生成速率在0.01水平上显著相关(负相关)；与H₂O₂含量、SOD和CAT活性在0.05水平显著相关(负相关)。即MDA含量高、O₂ ^－生成速率快，SOD和CAT活性高诱变苗成活率低。MDA、H₂O₂、O₂ ^－、SOD和CAT可作为预估诱变系成活率的指标，用于快速筛选合适的剂量。

表1各项生理生化指标与成活率相关性分析

7、基于SSR标记的诱变系鉴定

对于‘Heather Stream’路易斯安那鸢尾品种，2.5Gy处理下成活率为21.11％，相对较高。对获得的部分诱变系基于10对SSR标记进行遗传多样性分析，分析结果如图7所示。其中L6为‘Heather Stream’，L7-L15为不同诱变系，L17为♀‘Heather Stream’×♂‘Pegaletta’的杂交后代。由图可知，L7、L13、L14与亲本遗传背景较为一致，后续可不进行继代培养，诱变系L8、L9、L10、L11和L12则与亲本在遗传背景上存在一定差异，尤其是L10和L12可重点扩繁并生根、炼苗后种植，以观察其表型是否与亲本存在差异，或可否表现出一些优异性状。

综上所属，MDA和H₂O₂含量、O₂ ^－产生速率、SOD和CAT活性与诱变苗成活率密切相关，表现为该些指标值越高，成活率越低。辐射诱变后，对组培苗造成一定胁迫伤害，导致以上指标在0-30d期间测得的值随着时间的延长而增长，但在30d时转接后，30-40d期间该些指标明显下降。因此，对于不同剂量的⁶⁰Co-γ处理，可通过测定诱变处理后40d时的MDA和H₂O₂含量、O₂ ^－产生速率、SOD和CAT活性，指标测得值越大，对应材料成活率越低，测得值越小，成活率越高。对于路易斯安那‘Heather Stream’品种，通过2.5Gy处理时，成活率为21.11％，2.5Gy处理时，成活率仅为13.33％，然而2.5Gy处理时，经SSR标记鉴定，获得多个与亲本具有一定遗传差异的诱变材料。因此，对于路易斯安那‘Heather Stream’品种，进行⁶⁰Co-γ处理时，在40d时测定其MDA、H₂O₂、O₂ ^－·、SOD和CAT，当5个指标测的值分别在2.77-3.24nmol·g-1、0.524-0.564μmol/g、0.558-0.736nmol/(g FW·min)、234.44-320.40U/g·FW和132.33-134.17U/g·FW范围内时，可保证其一定的成活率(10％-25％)且可获得较多与亲本存在一定差异的诱变材料。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种鸢尾辐射诱变剂量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，构建鸢尾无性系组培苗；

S2，将S1中鸢尾无性系组培苗,用不同剂量辐射诱变处理，辐射处理后继续培养；

S3，选取步骤2中诱变处理40天时的组培苗，测定丙二醛(MDA)含量、超氧阴离子自由基(O₂ ^－·)产生速率、H₂O₂含量、抗氧化酶(SOD、CAT)活性；

S4，诱变剂量筛选，根据所述步骤S3的测定结果进行筛选，通过测定诱变处理后40天时的MDA和H₂O₂含量、O₂ ^－·产生速率、SOD和CAT活性判断适宜的诱变剂量，指标测得值越大，对应材料成活率越低，对应的辐射诱变剂量越不合适，测得值越小，成活率越高，对应的辐射诱变剂量越合适。

2.根据权利要求1所述的一种的方法，其特征在于,步骤S1中，以鸢尾当年新萌发幼芽的茎尖为外植体，使用0.1％HgCl2对外植体消毒7min，初代培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+IAA 0.2mg/L，继代培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L。培养温度为25℃±2℃，湿度60％-70％，光照强度2000lx，光照时间12h/d。

3.根据权利要求1所述的一种的方法，其特征在于,步骤S2中，所述辐射诱变的诱变源为⁶⁰Co-γ射线。

4.根据权利要求1所述的一种的方法，其特征在于,步骤S2中，所述辐射诱变的剂量为1-40Gy，剂量率为1Gy·min^-1。

5.根据权利要求1所述的一种的方法，其特征在于,还包括以下步骤

S5，筛选用于SSR标记鉴定的诱变材料：选择MDA、H₂O₂、O₂ ^－·、SOD和CAT 5个指标测定值分别在2.77～3.24nmol·g^-1、0.524～0.564μmol/g、0.558～0.736nmol/(g FW·min)、234.44～320.40U/g·FW和132.33～134.17U/g·FW范围内诱变苗，用于后续鉴定；

S6，基于SSR标记的诱变系鉴定：选取步骤S5中符合指标范围的诱变苗，通过筛选和验证SSR标记进行遗传多样性分析，通过聚类图鉴定诱变材料与亲本的遗传距离，从中鉴定出与亲本遗传背景一致的材料，筛选出与亲本存在遗传差异的诱变材料，后期对这部分材料扩繁生根、炼苗后种植。