CN105052730A

CN105052730A - 一种三倍体矮牵牛的培育方法

Info

Publication number: CN105052730A
Application number: CN201510605407.1A
Authority: CN
Inventors: 魏跃; 樊开青; 陈啸寅; 颜志明; 王全智; 贾思振; 史红林
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2035-09-21
Also published as: CN105052730B

Abstract

本发明公开了一种三倍体矮牵牛的培育方法，包括以下步骤：选择杂种优势强的二倍体矮牵牛组合作为杂交亲本，在父本开花期选择适当大小的花蕾，用秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵混合药液进行化学诱变促使形成2n花粉，将2n花粉授粉到二倍体母本柱头上得到F₁杂交种子，同时将父本没有经化学诱变处理的n花粉与母本杂交得到对照二倍体F₁杂交种子。F₁杂交种子发育的成株与对照二倍体F₁杂交后代进行农艺性状、解剖学比较，在此基础上再进行染色体数目检测，最终确定三倍体植株。本发明育种周期短、操作简便诱变效率高，具有较好的应用前景。

Description

一种三倍体矮牵牛的培育方法

技术领域

本发明属于园艺植物遗传育种领域，特别涉及一种三倍体矮牵牛的培育方法。

背景技术

矮牵牛(PetuniahybridaVilm.)为茄科碧冬茄属植物，为一年生草本花卉。矮牵牛花朵硕大，色彩丰富，花型变化颇多，目前矮牵牛在国际上已成为主要的盆花和装饰植物，广泛应用于庭院、露天花坛、广场的美化装饰与绿化，被喻为“世界花坛花卉之王”。我国矮牵牛于20世纪初开始少量引种栽培，80年代逐渐从欧美等国引进新品种进行规模种植，现在随着经济发展和城市建设需要对矮牵牛需求越来越大，目前国内广泛种植的优良矮牵牛品种如重瓣“双瀑布”系列、大花“梦幻”系列、多花单瓣“庆典”系列和吊蓝等系列都为国外培育的二倍体品种。

通过倍性育种可使植物基因组多倍化获得生长势旺盛、适应性强、抗逆性好的品种，应用于观赏植物可提高花卉的观赏性与品质。三倍体是指体细胞中含有三个染色体组，不但具有多倍体的优良特性而且可以利用杂种优势、获得无籽果实，并且作为遗传育种桥梁材料选育出的系列单体和三体可应用于染色体上基因定位、确定基因连锁群等遗传研究。培育三倍体一般先诱导形成遗传稳定的四倍体，再由四倍体和二倍体杂交获得三倍体，此法育种周期较长。迄今为止，还没有三倍体矮牵牛(2n＝3x＝21)培育方法的公开报道。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种三倍体矮牵牛的培育方法。此种方法育种周期短、操作简便诱变效率高。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种三倍体矮牵牛的培育方法，该方法包括如下步骤：

1)选择杂交优势较强的二倍体组合作为亲本，按常规技术种植；

2)在亲本进入花期时，用化学诱导剂诱导父本植株上的花蕾，使之产生2n花粉；

3)诱导后花蕾纵轴长度生长至1.5cm～2.6cm时，采摘放置于低温、干燥、黑暗处保存；

4)杂交前对母本进行去雄处理，将步骤3)中诱导花蕾中的2n花粉取出，涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到F1杂交种子；同时将父本没有经过诱导处理的n花粉涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到对照二倍体F₁杂交种子；

5)将F₁杂交种子生长至成植，筛选出三倍体植株。

其中，上述的化学诱导剂为秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵的混合药液。秋水仙素的最终质量浓度为0.1％～0.5％，氨磺灵最终质量浓度为20mg.L^-1～50mg.L^-1，氟乐灵最终质量浓度为50mg.L^-1～100mg.L^-1。

其中，上述步骤2)诱导的方法为：上午8～10时温室大棚内温度控制在22～33℃，选择父本植株上纵轴长度为2.2mm～3.4mm花蕾，用微量注射器将化学诱导剂混合药液注入花蕾内，每次10～15μL，连续1～3天。

步骤3)具体方法为：采摘经诱导处理纵轴长度生长至1.5cm～2.6cm的花蕾，放置于密闭的容器中(内含无水氯化钙或无水硫酸镁或硅胶等干燥剂)，并用黑色遮光物覆盖，将容器放置于冷柜中温度设置为3～10℃，可存放1～3天，等待授粉的合适时机。

步骤4)中，杂交前对母本进行去雄处理，是指杂交前选择母本植株上纵轴长度达2.5厘米或以上的未开花花蕾，对花蕾进行去除雄蕊后套袋隔离，1～3天后进行杂交授粉；父本没有经过经过诱导处理的n花粉，是指选择父本植株上没有经化学药剂处理、纵轴长度达2.5厘米或以上的未开花花蕾，进行套袋隔离，1～2天后取花粉进行授粉。

其中，上述步骤5)的筛选方法为：将F₁杂交种、对照二倍体F₁杂交种按常规技术种植，成株后先进行农艺性状、解剖学比较，选择多倍体特征明显的植株，再进行细胞学染色体检测确定三倍体植株。

其中，上述步骤1)中杂交优势较强的二倍体组合是指F₁杂交后代的株高、冠幅、茎粗、叶面积、开花数的农艺性状超过双亲。

其中，上述步骤3)中，低温、干燥黑暗处是指3～10℃、干燥剂干燥和遮光。

其中，上述步骤5)中农艺性状为：叶片长度与宽度、叶面是否扭曲、茎粗、株高、冠幅、萼片长度与宽度、柱头和花药大小、花瓣直径、花瓣边缘褶皱程度。

步骤5)农艺性状鉴定指，在F₁杂交群体中选择第5～10片真叶平均长度与宽度、主茎粗、株高、冠幅、萼片长度与宽度、柱头直径、花药长度与宽度、花瓣直径其中有任意5项或5项以上数值显著大于对照二倍体F₁杂交种，同时叶面扭曲、花瓣边缘波状褶皱程度明显大于对照二倍体F₁杂交种的植株。

其中，上述步骤5)中解剖学观察性状有气孔和花粉细胞，观察气孔方法为：将叶片背面表皮撕下，在显微镜下测量表皮气孔大小；观察花粉细胞方法为：对成熟花粉进行染色，在显微镜镜下测量成熟花粉细胞大小。解剖学中气孔鉴定指，用尖头镊子将叶片背面表皮撕下，放置于载玻片上，滴1～2滴清水在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜测量气孔长与宽度，选择长、宽度显著大于对照二倍体F₁杂交种的植株。

花粉细胞鉴定指：从开放花朵中取少量成熟花粉，放置于载玻片上，滴1～2滴质量浓度为1％醋酸洋红染色3～5分钟，在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜测量花粉细胞大小，选择花粉平均直径、不育花粉率(形状畸形和不染色)明显大于对照二倍体F₁杂交种的植株。

其中，上述步骤5)中细胞学染色体检测方法为：

晴天上午8～10时取长度3.1～7.3mm的幼蕾，立即放入装有0.002mol.L^-18-羟基喹啉水溶液0～10℃容器中，放置在0～10℃的冷柜中预处理1～5小时，蒸馏水冲洗3～5次后转入卡诺氏固定液固定12～24小时，蒸馏水冲洗3～5次，1mol.L^-1HCl溶液50～60℃水浴解离3～6分钟，蒸馏水冲洗3～5次用滤纸吸干水，放入体积百分浓度为45％的醋酸溶液配制的质量浓度1％的洋红染色液染色12～24小时，用镊子将幼蕾移入干净的载玻片上，用刀片切取雌蕊子房，用镊子取子房中心部位少量分生组织，放置于载玻片上，滴1～2滴1％洋红染色液，盖上盖玻片，先在低倍镜下寻找有丝分裂中期分裂相视野，然后在100倍油镜下进行染色体计数，选择体细胞染色体数目2n＝3x＝21的三倍体植株。

其中，上述卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。

其中，上述体积百分浓度45％醋酸溶液配制的质量浓度1％的洋红染色液配制方法为：先加入45ml乙酸再加水55ml，混匀后将洋红粉末1克缓慢倒入100ml45％醋酸溶液中，边煮边搅拌，煮沸冷却后过滤即可使用。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、现有技术大多先诱导形成四倍体再与二倍体杂交形成三倍体，本发明所述方法通过直接诱导矮牵牛二倍体形成2n花粉再与二倍体杂交形成三倍体，显著缩短育种时间，操作简便易行；对2n花粉进行低温保存延长了花粉活力，解决花期不遇，方法简单易行。

2、诱导剂的选择：本发明采用秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵混合液为诱导剂，通过干扰纺锤丝形成从而抑制细胞有丝分裂使染色体加倍，三者混合使用后可提高2n花粉诱导率。

附图说明

图1在100倍油镜下观察三倍体植株子房分生组织体细胞的染色体数目，2n＝21；

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1一种三倍体矮牵牛的培育方法

1)选择二倍体矮牵牛Petuniahybrida‘Pink’为父本，二倍体矮牵牛Petuniahybrida‘RoseHalo’为母本，均购于浙江虹越花卉股份有限公司，按常规技术种植；

2)父母本进入花期，于上午9时温室大棚内温度28℃，选择父本植株上长度为2.6mm～3.1mm花蕾，用微量注射器将去离子水配制最终质量浓度秋水仙素0.2％，氨磺灵30mg.L^-1，氟乐灵80mg.L^-1，体积为10μL混合药液注入花蕾内，处理1次；花粉成熟后，取花粉粒于载玻片上用质量浓度为1％醋酸洋红染色，在40倍镜下用显微测微尺测量花粉的直径并结合外观特征确认2n花粉，经统计2n花粉率可达40.1％。

3)诱导处理后花蕾纵轴长度生长至1.8cm～2.2cm时，采摘放置于密闭的玻璃干燥器中(内含硅胶)并用黑布覆盖，将玻璃干燥器放置于冷柜中，温度设置为5℃，存放1天后用于授粉。

4)杂交前对母本进行去雄处理，选择母本植株上纵轴长度3.1～3.8厘米的未开花花蕾，对花蕾进行去除雄蕊后套袋隔离，第2天进行杂交授粉；

5)选择父本植株上纵轴长度3.1～3.8厘米的未开花花蕾进行套袋隔离，1～2天后取花粉进行授粉。

6)于晴天上午8时，将诱导花蕾中的2n花粉取出，涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到F₁杂交种子；同时将父本没有经过诱导处理的n花粉涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到对照二倍体F₁杂交种子；

7)将F₁杂交种、对照二倍体F₁杂交种按常规技术种植，成株后先根据第5～10片真叶长度与宽度、叶面扭曲程度、主茎粗、株高、柱头直径、萼片长度与宽度，花瓣边缘褶皱程度、气孔长度与宽度、花粉细胞直径筛选，在此基础上取花蕾子房内分生组织进行染色体检测，体细胞染色体数目2n＝3x＝21的植株确定为三倍体植株；

上述农艺性状为：叶片长度与宽度、叶面是否扭曲、茎粗、株高、冠幅、萼片长度与宽度、柱头和花药大小、花瓣直径、花瓣边缘褶皱程度。

农艺性状鉴定指，在F₁杂交群体中选择第5～10片真叶平均长度与宽度、主茎粗、株高、冠幅、萼片长度与宽度、柱头直径、花药长度与宽度、花瓣直径其中有任意5项或5项以上数值显著大于对照二倍体F₁杂交种，同时叶面扭曲、花瓣边缘波状褶皱程度明显大于对照二倍体F₁杂交种的植株。

解剖学观察性状有气孔和花粉细胞，观察气孔方法为：将叶片背面表皮撕下，在显微镜下测量表皮气孔大小；观察花粉细胞方法为：对成熟花粉进行染色，在显微镜镜下测量成熟花粉细胞大小。解剖学中气孔鉴定指，用尖头镊子将叶片背面表皮撕下，放置于载玻片上，滴1～2滴清水在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜测量气孔长与宽度，选择长、宽度显著大于对照二倍体F₁杂交种的植株。

细胞学染色体检测方法为：

卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。

体积百分浓度45％醋酸溶液配制的质量浓度1％的洋红染色液配制方法为：先加入45ml乙酸再加水55ml，混匀后将洋红粉末1克缓慢倒入100ml45％醋酸溶液中，边煮边搅拌，煮沸冷却后过滤即可使用。

实施例2一种三倍体矮牵牛的培育方法

1)选择二倍体矮牵牛Petuniahybrida‘MERLIN’为父本，二倍体矮牵牛Petuniahybrida‘U-IRIS’为母本，均购于浙江虹越花卉股份有限公司，按常规技术种植；

2)父母本进入花期，上午10时温室大棚内温度31℃，选择父本植株上长度为2.7mm～3.2mm花蕾，用微量注射器将去离子水配制最终质量浓度秋水仙素0.1％，氨磺灵20mg.L^-1，氟乐灵50mg.L^-1，体积为12μL混合药液注入花蕾内，处理1次；

花粉成熟后，取花粉粒于载玻片上用质量浓度为1％醋酸洋红染色，在40倍镜下用显微测微尺测量花粉的直径并结合外观特征确认2n花粉，经统计2n花粉率可达37.9％。

3)诱导处理后花蕾纵轴长度生长至1.8cm～2.2cm时，采摘放置于密闭的玻璃干燥器中(内含硅胶)并用黑布覆盖，将玻璃干燥器放置于冷柜中，温度设置为5℃，存放1～2天后用于授粉。

4)杂交前对母本进行去雄处理，选择母本植株上纵轴长度3.3～3.8厘米的未开花花蕾，对花蕾进行去除雄蕊后套袋隔离，第2天进行杂交授粉；

5)选择父本植株上纵轴长度2.7～3.8厘米的未开花花蕾进行套袋隔离，1～2天后取花粉进行授粉。

6)于晴天上午9时，将诱导花蕾中的2n花粉取出，涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到F₁杂交种子；同时将父本没有经过诱导处理的n花粉涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到对照二倍体F₁杂交种子；

7)将F₁杂交种、对照二倍体F₁杂交种按常规技术种植，成株后先根据第5～10片真叶长度、叶面扭曲程度、主茎粗、株高、冠幅、柱头直径、萼片长度，花瓣边缘褶皱程度、气孔长度与宽度、花粉细胞直径筛选，在此基础上取花蕾子房内分生组织进行染色体检测，体细胞染色体数目2n＝3x＝21的植株确定为三倍体植株。

细胞学染色体检测方法为：

卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。

实施例3

1)选择杂交优势较强的二倍体组合作为亲本，其中父本为二倍体矮牵牛Petuniahybrida‘PURPLE’，母本为二倍体矮牵牛Petuniahybrida‘HAPPINESS’，均购于浙江虹越花卉股份有限公司，按常规技术种植；

2)父母本进入花期，上午8时温室大棚内温度控制在22℃，选择父本植株上纵轴长度为2.2mm～3.4mm花蕾，用微量注射器将去离子水配制最终质量浓度为秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵的混合药液，其中秋水仙素的最终质量浓度为0.5％，氨磺灵最终质量浓度为50mg.L^-1，氟乐灵最终质量浓度为100mg.L^-1的混合药液注入花蕾内，每次15μL，连续3天；

花粉成熟后，取花粉粒于载玻片上用质量浓度为1％醋酸洋红染色，在40倍镜下用显微测微尺测量花粉的直径并结合外观特征确认2n花粉，经统计2n花粉率可达38.8％。

3)诱导后花蕾纵轴长度生长至1.5cm～2.6cm时，放置于密闭的容器中(内含无水氯化钙或无水硫酸镁或硅胶等干燥剂)，并用黑色遮光物覆盖，将容器放置于冷柜中温度设置为3～10℃，可存放1～3天，等待授粉的合适时机；

6)杂交前对母本进行去雄处理，将步骤3)中诱导花蕾中的2n花粉取出，涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到F1杂交种子；同时将父本没有经过诱导处理的n花粉涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到对照二倍体F₁杂交种子；

7)将F₁杂交种、对照二倍体F₁杂交种按常规技术种植，成株后先进行农艺性状、解剖学比较，选择多倍体特征明显的植株，再进行细胞学染色体检测确定三倍体植株。

细胞学染色体检测方法为：

卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。

实施例4

基本步骤与实施例1一样，所不同的在于本实施例是具体的对64个不同诱导处理中以秋水仙素浓度0.1～0.5％，氨磺灵浓度20～50mg.L^-1，氟乐灵浓度50～100mg.L^-1的混合药剂诱导效果最好，2n花粉率高于其它处理和对照。

表1不同药剂配方诱导2n花粉效果的比较

Claims

1.一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

3)诱导后花蕾纵轴长度生长至1.5cm~2.6cm时，采摘放置于低温、干燥、黑暗处保存；

4)杂交前对母本进行去雄处理，将步骤3）中诱导花蕾中的2n花粉取出，涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到F1杂交种子；同时将父本没有经过诱导处理的n花粉涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到对照二倍体F₁杂交种子；

5)将F₁杂交种子生长至成植，筛选出三倍体植株。

2.根据权利要求1所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述的化学诱导剂为秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵的混合药液，其中秋水仙素的最终质量浓度为0.1%～0.5％，氨磺灵最终质量浓度为20mg.L^-1～50mg.L^-1，氟乐灵最终质量浓度为50mg.L^-1～100mg.L^-1。

3.根据权利要求1所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤2）诱导的方法为：选择父本植株上纵轴长度为2.2mm~3.4mm花蕾，用微量注射器将化学诱导剂混合药液注入花蕾内，每次10～15μL，连续1~3天。

4.根据权利要求1所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤5）的筛选方法为：将F₁杂交种、对照二倍体F₁杂交种按常规技术种植，成株后先进行农艺性状、解剖学比较，选择多倍体特征明显的植株，再进行细胞学染色体检测确定三倍体植株。

5.根据权利要求1所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤1）中杂交优势较强的二倍体组合是指F₁杂交后代的株高、冠幅、茎粗、叶面积、开花数的农艺性状超过双亲。

6.根据权利要求4所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤5）中农艺性状为：叶片长度与宽度、叶面是否扭曲、茎粗、株高、冠幅、萼片长度与宽度、柱头和花药大小、花瓣直径、花瓣边缘褶皱程度。

7.根据权利要求4所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤5）中解剖学观察性状有气孔和花粉细胞，观察气孔方法为：将叶片背面表皮撕下，在显微镜下测量表皮气孔大小；观察花粉细胞方法为：对成熟花粉进行染色，在显微镜镜下测量成熟花粉细胞大小。

8.根据权利要求4所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤5）中细胞学染色体检测方法为：

取长度3.1~7.3mm的幼蕾，0.002mol.L^-18-羟基喹啉水溶液0~10℃预处理1~5小时，蒸馏水冲洗3~5次后转入卡诺氏固定液固定12~24小时，蒸馏水冲洗3~5次，1mol.L-1HCl溶液50~60℃水浴解离3~6分钟，蒸馏水冲洗3~5次用滤纸吸干水，放入体积百分浓度45%醋酸溶液配制的质量浓度1%的洋红染色液染色12~24小时，用镊子将幼蕾移入干净的载玻片上，用刀片切取雌蕊子房，用镊子取子房中心部位少量分生组织，放置于载玻片上，滴1~2滴1%洋红染色液，压片观察统计体细胞染色体数目，筛选2n=3x=21的三倍体植株。

9.根据权利要求8所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。

10.根据权利要求8所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述体积百分浓度45%醋酸溶液配制的质量浓度1%的洋红染色液配制方法为：先加入45ml乙酸再加水55ml，混匀后将洋红粉末1克缓慢倒入100ml45%醋酸溶液中，边煮边搅拌，煮沸冷却后过滤即可使用。