CN110438113A - D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化技术领域，公开了一种D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的固定化方法，所述方法包括如下步骤：将大孔树脂用缓冲液漂洗并过滤得到干净的大孔树脂；将得到的干净的大孔树脂与D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶液混合进行酶的固定化，得到混合液并固液分离，得到以大孔树脂为载体的固定化D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶；其中，100重量份所述D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶液中无机盐‑2为5‑25重量份。本发明使仅可单次使用的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶实现多次重复利用，使得产业链中酶促反应成本大大降低，且后续分离成本也有所下降，且树脂本身无毒无害，安全可靠，具有良好的工业化生产及市场开发前景。

Description

D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法

技术领域

本发明涉及生化工程技术领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法。

背景技术

随着肥胖、糖尿病、“三高”等慢性病在全球范围内漫延。饮食中糖分的“健康摄取”成为新的健康课题，其中，低热量甜味剂的开发和应用是最为有效的途径之一。

阿洛酮糖(D-psicose，Psi)是D-果糖(D-fructose，Fru)C-3的差向异构体，甜度相当于蔗糖的70％，热量相当于蔗糖0.3％，容积特性及口感与蔗糖相近，可作为食药行业中蔗糖的替代品。相对于高果糖浆具有引发肥胖和糖尿病的风险，阿洛酮糖具有控制肥胖和糖尿病的功效，能明显抑制体重的增加和腹部脂肪的堆积，可以通过肝葡糖激酶的核输出，维持葡萄糖的耐受性和胰岛素的敏感性，控制体重和腹部脂肪，达到控制肥胖和糖尿病的功效。

韩国希杰第一制糖株式会社于2011年向美国食品药品监督管理局(FDA) 申请D-阿洛酮糖的“一般认为安全”(GRAS)认定，于2012年6月得到“没有问题”的答复(GRASNotice No.GRN000400)。

松谷集团于2013年向FDA申请其产品D-阿洛酮糖的GRAS认定，并于2014年6月得到“没有问题”的回复(GRAS Notice No.GRN000498)。该报告总结，人体实验每日摄入31-33gD-阿洛酮糖是没有任何副作用的。因此，D-阿洛酮糖被归类为一种常规的碳水化合物替代品，且不会构成任何安全问题。2011年FDA认可甜味剂D-阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用。自此D-阿洛酮糖得到了迅速发展，市场上出现了多种含D-阿洛酮糖的产品，像糖尿病患者可以选择此类低热量安全性高的甜味剂，从而在维持健康膳食的前提下同样享受甜蜜滋味。由2012-2016年的亚洲新产品开发活动中糖和甜味剂的使用情况看，蔗糖的使用比例逐渐降低，而其他天然甜味剂的比例逐步上升，2016年达到17％。我国市场关于国内关于D-阿洛酮糖的研究工作起步较晚，主要进行了菌种筛选、酶基因克隆和酶的固定化研究等，尚无产业化报道。因此，该糖市场空间广阔。

但D-阿洛酮糖3-异构酶催化果糖转化为阿洛酮糖过程中，由于酶无法重复利用，使得该工艺成本较高，且反应结束后，D-阿洛酮糖3-异构酶本身作为杂蛋白，需要从反应体系中除去，增加了分离成本，因此，开发D-阿洛酮糖3-异构酶的固定化技术，使得D-阿洛酮糖3-异构酶可以重复利用，不仅可以大幅压缩发酵成本，也可以降低后续分离成本，对阿洛酮糖的产业发展具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的固定化方法，所述方法实现了D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化，使D-阿洛酮糖3-差向异构酶可多次重复利用，降低酶催化反应成本。

为了实现上述目的，本发明提供了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法，所述方法包括如下步骤：

将大孔树脂用缓冲液漂洗并过滤得到干净的大孔树脂；

将得到的干净的大孔树脂与D-阿洛酮糖3-差向异构酶液混合进行酶的固定化，得到混合液并过滤，得到以大孔树脂为载体的固定化D-阿洛酮糖 3-差向异构酶；

其中，100重量份所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液中含有无机盐-2为 5-25重量份。

优选地，本发明提供了一种所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液通过以下步骤制备而得：

(1)将D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产菌进行活化、发酵、菌体收集、菌体破碎及固液分离得到粗酶液；

(2)将所述粗酶液进行加热，然后加入无机盐-1，得到的母液进行过滤得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液；

(3)向所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液中加入活性炭，充分搅拌混匀后，固液分离除去活性炭，得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶液。

通过上述技术方案，与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：

首先，本发明所述方法可以制备固定化的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，大大降低的阿洛酮糖酶促反应的成本，另外，由于酶固定于载体上，避免了酶蛋白直接溶于反应液中带来的后续分离问题，降低了后续分离成本。而且，本发明制备产品的过程中，不使用任何有毒有害的试剂，因此产品安全。

其次，采用本发明所述的方法制备的固定化酶的稳定性高，可重复多次使用，在55℃条件下，经连续反应18批次后固定化酶的酶活性仍没有明显衰减。在70℃条件下，反应10批次后酶活性无明显衰减。

此外，使用本发明所述的优选的技术方案纯化获得的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶够得到相对较高的酶活收率和酶纯度倍数。

附图说明

图1是本发明中一个优选地实施方式所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法的流程图；

图2是实施例1所述的方法制备的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶在 55℃和70℃条件下连续反应的衰减曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，术语“酶活力(Enzyme Activity)”也称酶活性，1min内将1mg底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位(U)。 D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活力的测定方法为：在底物果糖过量的反应条件下，测定最初5min反应时间内产物D-阿洛酮糖的生成重量，则酶的活力＝D- 阿洛酮糖的重量/5min。

术语“酶活收率”是指每一步工艺操作后的酶活与操作前的酶活比值乘以100％。

术语“酶纯度倍数”是指酶的比活之比，即酶的纯度倍数＝(每次比活力)/(第一次比活力)。

术语“酶的比活”是酶纯度的量度，是指单位重量的蛋白质中所具有的的酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋白质来表示。具体的，在底物果糖过量的反应条件下，测定最初5min反应时间内产物D-阿洛酮糖的生成重量，则酶的比活＝(D-阿洛酮糖的重量/5min)/总蛋白重量。

固定化酶的衰减曲线绘制方法：同一批酶，在相同反应时间内连续催化不同批次的底物，酶催化反应的转化率的衰减趋势即为酶的衰减曲线。在本发明中，多次连续催化后，在酶催化反应的转化率衰减至首次催化时的转化率的50％以下时，该次数记为固定化酶使用的最多次数。

在本发明中，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的来源可以不受特别的限制，比如可以为专利申请201711458026.0公开的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，具体的，D-阿洛酮糖3-差向异构酶来自于深海温泉的嗜热嗜酸菌 Mesoaciditogalauensis，其基因序列如下所示：

MNFGVYLYLWEDRILEEEKALKIFKTIAELGYDGIEIPLNNPNLIDPFL ARKLAKEFELNITTSVALPQNINFMSDDESERDKAKEFLTNCVDLCNTMG SAVLGGVLYAPWGRTDVDKSEKKIGFLVEGLREISKYAEERGINLYLEPV NRFETNVLNTVKEGIDLIEKINSNNVSLLLDTFHMNIEEKDLSTAITEAGN LVGHFHTCENDRGIPGTGHIPWKDIVQSLKKINYDGFLVFEAFSVKKEEIL NSANIWRSQELIPNPDKAAYESISFFKSIIY。

本发明公开了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法，所述方法包括如下步骤：

将大孔树脂用缓冲液漂洗并过滤得到干净的大孔树脂；

将得到的干净的大孔树脂与D-阿洛酮糖3-差向异构酶液混合进行酶的固定化，得到混合液并过滤，得到以大孔树脂为载体的固定化D-阿洛酮糖 3-差向异构酶；

其中，100重量份所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液中无机盐-2为5-25 重量份。

在本发明中，D-阿洛酮糖3-差向异构酶液是指包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶的溶液，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液中含有5-25重量份的无机盐-2，例如可以为5、10、15、20、25重量份以及任意两个值之间组成的用量范围，优选为10-20重量份。

所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液可以是将D-阿洛酮糖3-差向异构酶溶解于无机盐溶液中获得，也可以是自制获得的酶液(可根据需要，比如pH 或离子强度，选择补加或者不补加无机盐)，优选的是通过本发明中下述的制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶液，补加或者不补加无机盐获得。所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶可以自行加工或制备制得，也可以市售购得。

所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液中的所述无机盐-2可以为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾中的至少一种，优选为至少含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的组合或含有磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的组合，例如，可以为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的组合，可以为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾的组合，可以为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠的组合，可以为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和氯化钾的组合，可以为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和硫酸钠的组合，可以为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和硫酸钾的组合。所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液的pH可以为7.5-8.5，优选为7.8-8.2。

本领域常规使用的大孔树脂均可用于本发明，可以用于本发明的大孔树脂优选包括(但不限于)弱碱性大孔树脂中的至少一种，更优选地，本发明中所述的大孔树脂为环氧基大孔树脂或氨基大孔树脂。所述大孔树脂可以自产或商购获的，比如可以是购自西安蓝晓新材料科技有限公司的LX-1000EP、 LX-1000HA和LX-1000EA中的至少一种。

本领域技术人员应理解，可用于本发明中的弱碱性大孔树脂除了以上用商品名所限定的具体产品以外，还包括任何具有其他商品名的市售树脂产品或自行制备或加工得到的树脂，只要它们具有与所述具体产品相同或相似的结构和吸附或交换性能。

在本发明中，相对于100重量份的所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液，所述大孔树脂可以为5-60重量份，例如可以为5、10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55、60重量份以及任意两个数值之间组成的任意范围，优选为 20-40重量份。

在漂洗时，所述缓冲液可以本领域常规使用的缓冲液，优选为磷酸缓冲液。所述磷酸缓冲液的浓度为0.05％-1％，优选为0.1％-0.8％。所述缓冲液的pH可以为7.5-8.5，进一步优选为7.8-8.2。

在漂洗时，缓冲液与大孔树脂重量比可以在较宽的范围内选择，优选地，相对于100重量份的所述大孔树脂，所述缓冲液为200-500重量份。

可采用本领域常规技术手段进行酶的固定化。优选地，在本发明中，所述酶的固定化的条件可以包括：固定化温度为10-40℃，例如可以为10℃、 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，进一步优选为15-35℃；固定化时间为24-48h，进一步优选为30-40h；固定化的搅拌转速为90-150rpm。

可以采用本领域常规技术手段固液分离固定化后的混合液。优选地，固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶与残留液体的分离方式可以为过滤，滤孔尺寸可以为40-500目，例如可以为40目、60目、100目、200目、300目、 500目，优选60-200目。

优选地，在本发明中，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液通过以下步骤制备而得：

(1)将D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产菌进行活化、发酵、菌体收集、菌体破碎及固液分离得到粗酶液；

(2)将所述粗酶液进行加热，然后加入无机盐-1，得到的母液进行过滤得到的滤液为D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液；

(3)向所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液中加入活性炭，充分搅拌混匀后，固液分离除去活性炭，得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶液。

在本发明中，所述“D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产菌”可以是通过基因工程手段构建的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的载体菌，也可以是经自然驯化菌，也可以是两种及以上的组合。比如，可以是携带D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因序列的大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或梭菌(Clostridium.sp)。所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因序列可以从专利申请201711458026.0中获得，也可以采用常规技术手段，如诱发突变对其序列进行密码子优化。

可采用本领域常规技术手段对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产菌进行活化、发酵、菌体收集、破碎和固液分离。

其中，菌体活化过程可以将保存在超低温冰箱中携带D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因序列的生产菌保存管自然解冻，然后经摇瓶和至少一级种子罐扩培后获得种子液。

其中，发酵过程可以是将种子液接种到装有本领域常用的液体培养基的发酵罐中进行发酵培养，所述液体培养基可以为LB液体培养基。优选地，所述发酵培养的条件为接种量为0.1-5％，搅拌转速为60-200rpm，温度为 30-38℃，通风比为1：(0.1-0.4)，培养12-36h后，停止发酵，得到发酵液。

其中，菌体收集方式可以为碟片式离心或者管式离心；离心转速可以在较大的范围内，可以为5000rpm-20000rpm，优选8000rpm-15000rpm。离心处理得到的发酵液，可收集得到菌体。

其中，得到菌体后，可以使用无菌溶液对菌体进行重悬稀释处理；所述无菌溶液可以是水、生理盐水或缓冲液等，优选地，使用浓度为0.1％、pH 为8.2的磷酸缓冲液，所述无菌溶液的重量份任选，优选的相对于100重量份菌体重量，所述无菌溶液重量为100-200重量份。

其中，所述的菌体破碎方式可以为均质机破碎法或超声波破碎法；使用均质机破碎法处理时，压力可以为5MPa-60MPa，优选10MPa-40MPa；使用超声波破碎法处理时，超声波功率密度为100W/L-1000W/L，优选 300W/L-700W/L。

在本发明中，可以在步骤(1)中的固液分离之前或之后加入絮凝剂，以去除菌体碎片和其他杂质。本发明的发明人发现，在固液分离之前添加絮凝剂更能够提高固液分离的效果，提高最终得到的酶的纯度和回收率，还能够降低固液分离的能耗，比如通过加入絮凝剂使得离心分离时转速降低。

因此，在本申请的优选的一个实施方案中，在步骤(1)中所述固液分离的步骤前还包括加絮凝剂；优选地，所述絮凝剂可以为铝盐、铁盐、氯化钙、丙烯酰氨、壳聚糖中的至少一种；相对于100重量份所述菌体，所述絮凝剂的用量可以为0.05-1.5重量份，例如，可以为0.05、0.1、0.2、0.5、0.7、 0.9、1.0、1.2、1.5重量份以及任意两个数值之间组成的任意范围，优选为 0.2-0.8重量份。

在本发明中，可以采用常规的固液分离手段分离菌体碎片和粗酶液，比如可以是离心或过滤。所述离心的条件可以是2000-8000rpm；所述过滤目数可以是60-500目，例如可以为60目、80目、100目、200目、300目、400 目和500目中的一种；本领域技术人员可以根据实际需要进行选择。

本发明的发明人发现，对粗酶液进行加热处理能够促进粗酶液中热稳定性差的蛋白或其他杂质变性、沉降，若结合使用无机盐溶液(优选含磷酸盐的无机盐)处理加热后的粗酶液，能够进一步提高酶的回收率和纯度。在步骤(2)中，所述加热温度可以为40-60℃，例如可以为40℃、45℃、50℃、 55℃、60℃，优选45-55℃；所述加热时间可以为30-300min，例如可以为 30min、60min、120min、180min、240min、300min以及任意两个数值之间组成的任意范围，优选60min-180min。

在步骤(2)中，所述无机盐-1可以为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾中的至少一种，优选地包含磷酸盐。相对于100重量份的所述粗酶液，所述无机盐-1可以为 1-25重量份，优选为10-20重量份。通过加入所述无机盐-1，使得所述加热后的粗酶液的pH为7.5-8.5，优选为7.8-8.2。

在本发明中，加入活性炭的目的是为了吸附酶液中的色素及部分杂质，活性炭的添加量可在较大的范围内。相对于100重量份的所述粗酶液，所述活性炭的用量可以为0.05-1重量份，例如可以为0.05、0.1、0.2、0.5、0.7、0.9、1重量份以及任意两个数值之间组成的任意范围，优选为0.1-0.5重量份。

在本发明中，所述粗酶液的酶液体积与所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液的酶液体积之间的差异忽略不计。

如图1，在本发明的一个优选地实施方式中，一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法包括如下步骤：

(1)将D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产菌进行活化、发酵、菌体收集、菌体破碎及固液分离得到粗酶液；

(2)将所述粗酶液进行加热，然后加入无机盐-1，得到的母液进行过滤得到的滤液为D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液；

(3)向所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液中加入活性炭进行脱色，充分搅拌混匀后，固液分离除去活性炭，得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶液；

(4)将大孔树脂用缓冲液漂洗并过滤得到干净的大孔树脂；

(5)将得到的干净的大孔树脂与D-阿洛酮糖3-差向异构酶液混合进行酶的固定化，得到混合液并固液分离，得到以大孔树脂为载体的固定化D- 阿洛酮糖3-差向异构酶。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

下述实施例和对比例：

所使用的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因序列见专利申请 201711458026.0。所用生产菌通过将所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因序列导入大肠杆菌(Escherichia coli)得到。

所述大孔树脂的型号为西安蓝晓新材料科技有限公司的LX-1000EP。

当磷酸缓冲液由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制得到时，称为磷酸钠盐缓冲液；当磷酸缓冲液由磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制得到时，称为磷酸钾盐缓冲液。其中，磷酸氢二钠为七水磷酸氢二钠；磷酸二氢钠为一水磷酸二氢钠；磷酸氢二钾为三水磷酸氢二钾；磷酸二氢钾为无水磷酸二氢钾。

未特别注明的物质和材料，均为常规实验用品，可通过市售获得。

菌体扩培和发酵培养基：LB液体培养基，1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠，pH＝6.8-7.0。

酶活力测定方法：取质量浓度为45％-60％的果糖溶液10ml，加入待测定酶0.5g(或ml)。在55-70℃条件下反应5min，测定产物D-阿洛酮糖的生成重量，计算酶的活力。酶的活力＝D-阿洛酮糖的质量(单位mg)/5min。

固定化酶的衰减曲线绘制方法：同一批酶，在相同反应时间内连续催化不同批次的底物，酶催化反应的转化率的衰减趋势即为酶的衰减曲线。在下述实施例中，以实施例1获得的固定化酶作为催化剂，绘制所述固定化酶的衰减曲线，如图2所示。具体的，以500g/L的果糖溶液为底物，以实施例1 获得的固定化酶为催化剂，按每100mL果糖溶液中加入5g催化剂的比例催化果糖生成D-阿洛酮糖，反应完成一次后从反应液中过滤出固定化酶，进行第二次催化反应，依次进行，直至检测到固定化酶的酶活降低到原酶的 50％。

酶催化反应的转化率的测定方法为测定催化转化前后果糖的含量，转化率＝(转化后的果糖的含量/转化前的果糖的含量)×100％。

制备例1

本制备例用于说明本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产菌菌体的获得

将保存在超低温冰箱中携带D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因序列的大肠杆菌保存管提前0.5h自然解冻，经摇瓶、一级种子罐扩培后获得种子液。

将一级种子液接种到装有50L LB液体培养基的100L发酵罐中，接种量为1％，搅拌转速150rpm，温度为35℃，通风比为1：0.4，培养16h后，停止发酵，得到发酵液。

使用管式离心机10000rpm离心得到的发酵液，收集菌体。

制备例2

本制备例用于说明本发明中干净的大孔树脂的制备

取1kg大孔树脂LX-1000EP，用3L浓度为0.1％，pH为7.8-8.2的磷酸缓冲液漂洗2h，过滤得到干净的大孔树脂。

其中，所述磷酸缓冲液中的阳离子(钠离子或钾离子)根据需要选择，即在制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的过程中钠离子和钾离子择一使用。

实施例1

本实施例用于说明本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法。

1)粗酶液的获得

使用750ml磷酸钠盐缓冲液重悬制备例1获得的500g菌体，其中，所述磷酸钠盐缓冲液浓度为0.1％，pH为8.2。使用均质机在峰值压力25MPa 的条件下破碎所述重悬后的菌体。然后向破碎处理后的溶液内加入3g氯化钙絮凝，5000rpm的转速下离心分离沉淀，得1000ml上清液，即为粗酶液。

2)D-阿洛酮糖3-差向异构酶液的获得

将步骤(1)获得的粗酶液50℃加热120min，降至常温后加入150g无机盐-1，使得粗酶液的pH为8.2。所述无机盐-1为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠的混合物，其中，氯化钠的重量为80g。经过过滤得到D-阿洛酮糖 3-差向异构酶盐溶液；再加入2g活性炭，过滤除去活性炭，得D-阿洛酮糖 3-差向异构酶液。

3)固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的获得

将制备例2制备得到的300g干净的大孔树脂加进酶液中，20℃、120rpm 搅拌35h，100目滤布过滤，得到固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

4)数据测定和计算

取步骤(1)获得的均质后发酵液和步骤(2)获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶液，测定其酶活力和比活，计算酶的纯度倍数。

测定步骤(3)获得的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的比活以及在55℃和70℃下催化转化生产D-阿洛酮糖的转化率，得到最多重复批次。

结果见表1。

实施例2

本实施例用于说明本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法。

1)粗酶液的获得

使用500ml磷酸钾盐缓冲液重悬制备例1获得的500g菌体，其中，所述磷酸钾盐缓冲液浓度为0.1％，pH为8。使用均质机在峰值压力40MPa 的条件下破碎所述重悬后的菌体。然后向破碎处理后的溶液内加入4g氯化铁絮凝，2000rpm的转速下离心分离沉淀，得750ml上清液，即为粗酶液。

2)D-阿洛酮糖3-差向异构酶液的获得

将步骤(1)获得的粗酶液45℃加热180min，降至常温后加入150g无机盐-1，使得粗酶液的pH为8。所述无机盐-1为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和氯化钾的混合物，其中，氯化钾的重量为75g。经过过滤得到D-阿洛酮糖 3-差向异构酶盐溶液；再加入0.75g活性炭，过滤除去活性炭，得D-阿洛酮糖3-差向异构酶液。

3)固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的获得

将制备例2制备得到的150g干净的大孔树脂加进酶液中，15℃、90rpm 搅拌40h，300目滤布过滤，得到固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

4)数据测定和计算

取步骤(1)获得的均质后发酵液和步骤(2)获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶液，测定其酶活力和比活，计算酶的纯度倍数。

测定步骤(3)获得的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的比活以及在55℃和70℃下催化转化生产D-阿洛酮糖的转化率，得到最多重复批次。

结果见表1。

实施例3

本实施例用于说明本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法。

1)粗酶液的获得

使用1000ml磷酸钾盐缓冲液重悬制备例1获得的500g菌体，其中，所述磷酸钾盐缓冲液浓度为0.1％，pH为7.8。使用均质机在峰值压力10MPa 的条件下破碎所述重悬后的菌体。然后向破碎处理后的溶液内加入1g壳聚糖絮凝，8000rpm的转速下离心分离沉淀，得1250ml上清液，即为粗酶液。

2)D-阿洛酮糖3-差向异构酶液的获得

将步骤(1)获得的粗酶液55℃加热60min，降至常温后加入125g无机盐-1，使得粗酶液的pH为7.8，其中，所述无机盐-1为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的混合物。经过过滤得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液；再加入 6.25g活性炭，过滤除去活性炭，得D-阿洛酮糖3-差向异构酶液。

3)固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的获得

称取25g氯化钾加入酶液中混合均匀后，再加入制备例2制备得到的 500g干净的大孔树脂，在35℃、150rpm搅拌30h，60目滤布过滤，得到固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

4)数据测定和计算

取步骤(1)获得的均质后发酵液和步骤(2)获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶液，测定其酶活力和比活，计算酶的纯度倍数。

测定步骤(3)获得的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的比活以及在55℃和70℃下催化转化生产D-阿洛酮糖的转化率，得到最多重复批次。

结果见表1。

实施例4

本实施例用于说明本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法。

1)粗酶液的获得

使用750ml磷酸钠盐缓冲液重悬制备例1获得的500g菌体，其中，所述磷酸钠盐缓冲液浓度为0.1％，pH为8.2。使用均质机在峰值压力25MPa 的条件下破碎所述重悬后的菌体。然后向破碎处理后的溶液内加入0.25g氯化钙絮凝，5000rpm的转速下离心分离沉淀，得1000ml上清液，即为粗酶液。

2)D-阿洛酮糖3-差向异构酶液的获得

将步骤(1)获得的粗酶液40℃加热300min，降至常温后加入240g无机盐-1，使得粗酶液的pH为8.2。所述无机盐-1为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠的混合物，其中，氯化钠的重量为170g。经过过滤得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液；再加入0.5g活性炭，过滤除去活性炭，得D-阿洛酮糖3-差向异构酶液。

3)固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的获得

将制备例2制备得到的600g干净的大孔树脂加进酶液中，10℃、120rpm 搅拌48h，100目滤布过滤，得到固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

4)数据测定和计算

取步骤(1)获得的均质后发酵液和步骤(2)获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶液，测定其酶活力和比活，计算酶的纯度倍数。

测定步骤(3)获得的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的比活以及在55℃和70℃下催化转化生产D-阿洛酮糖的转化率，得到最多重复批次。

结果见表1。

实施例5

本实施例用于说明本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法。

1)粗酶液的获得

使用750ml磷酸钠盐缓冲液重悬制备例1获得的500g菌体，其中，所述磷酸钠盐缓冲液浓度为0.1％，pH为8.2。使用均质机在峰值压力25MPa 的条件下破碎所述重悬后的菌体。然后向破碎处理后的溶液内加入7.5g氯化钙絮凝，5000rpm的转速下离心分离沉淀，得1000ml上清液，即为粗酶液。

2)D-阿洛酮糖3-差向异构酶液的获得

将步骤(1)获得的粗酶液60℃加热30min，降至常温后加入50g无机盐-1，使得粗酶液的pH为8.2，其中，所述无机盐-1为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物。经过过滤得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液；再加入10g 活性炭，过滤除去活性炭，得D-阿洛酮糖3-差向异构酶液。

3)固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的获得

称取10g氯化钠加入酶液中混合均匀后，再加入制备例2制备得到的50g 干净的大孔树脂，40℃、120rpm搅拌24h，100目滤布过滤，得到固定化 D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

4)数据测定和计算

取步骤(1)获得的均质后发酵液和步骤(2)获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶液，测定其酶活力和比活，计算酶的纯度倍数。

测定步骤(3)获得的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的比活以及在55℃和70℃下催化转化生产D-阿洛酮糖的转化率，得到最多重复批次。

结果见表1。

实施例6

本实施例用于说明本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法。

实施例6-1、其他条件均与实施例3相同，不同的是第2)步骤中添加的无机盐-1为25g氯化钾，在第3)步骤中向酶液中添加125g磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的混合物，然后再加入干净的大孔树脂。

实施例6-2、其他条件均与实施例3相同，不同的是第2)步骤中不添加无机盐-1，在第3)步骤中向酶液中添加150g磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和氯化钾的混合物，然后再加入干净的大孔树脂；其中，添加的氯化钾的重量为25g，添加的混合物使得粗酶液的pH为7.8。

实施例6-3、其他条件均与实施例3相同，不同的是第2)步骤中添加的无机盐-1为150g氯化钾，在第3)步骤中不添加无机盐。

结果见表1。

实施例7

本实施例用于说明步骤2)中添加絮凝剂的效果。

实施例7-1、其他条件与实施例1相同，不同的是不添加絮凝剂，转速提高至10000rpm。

实施例7-2、其他条件与实施例1相同，不同的是先10000rpm离心破碎处理后的溶液，然后添加3g氯化钙絮凝，絮凝后5000rpm离心处理。

结果见表1。

对比例1

本对比例1用于说明无机盐种类和添加量的影响

对比例1-1、其他条件与实施例1相同，不同的是无机盐-1为氯化钠，重量为38.5g。

对比例1-2、其他条件与实施例1相同，不同的是无机盐-1为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物，其总重量为26g，添加无机盐-1使得粗酶液的pH 为8。

对比例1-3、其他条件与实施例1相同，不同的是无机盐-1为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠的混合物，其总重量为26g，添加无机盐-1使得粗酶液的pH为8。

结果见表1。

表1

从实施例和对比例的数据可以看出，在固定化酶制备过程中，控制无机盐-2中足够的离子强度，能够使得固定化酶的比活相对较高，还能够提高固定化酶在55℃和70℃条件下催化的最多重复批次。

从实施例1至实施例5与实施例6的比较来看，在酶液的制备过程中无机盐-1包含磷酸盐，能够提高制备得到的酶液的酶活收率以及酶纯度倍数，另外，对于后续制备得到的固定化酶的酶比活以及重复批次均产生了正向的影响。

从实施例1与实施例7的比较来看，先添加絮凝剂再离心的方法能够显著提高酶液的酶活收率和酶纯度倍数，取得了有益的效果。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将大孔树脂用缓冲液漂洗并过滤得到干净的大孔树脂；

将得到的干净的大孔树脂与D-阿洛酮糖3-差向异构酶液混合进行酶的固定化，得到混合液并固液分离，得到以大孔树脂为载体的固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶；

其中，100重量份所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液中无机盐-2为5-25重量份。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液；所述磷酸缓冲液的浓度为0.05-1重量％，优选为0.1-0.8重量％；

所述缓冲液的pH为7.5-8.5，优选为7.8-8.2；相对于100重量份的所述大孔树脂，所述缓冲液为200-500重量份。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述大孔树脂为弱碱性大孔树脂中的至少一种；

相对于100重量份的所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液，所述大孔树脂为5-60重量份，优选为20-40重量份。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液的pH为7.5-8.5，优选为7.8-8.2；

优选地，所述无机盐-2为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述酶的固定化的条件包括：固定化温度为10-40℃，优选为15-35℃；固定化时间为24-48h，优选为30-40h；固定化的搅拌转速为90-150rpm。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的固定化方法，其中，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶液通过以下步骤制备而得：

(1)将D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产菌进行活化、发酵、菌体收集、菌体破碎及固液分离得到粗酶液；

(2)将所述粗酶液进行加热，然后加入无机盐-1，得到的母液进行过滤得到的滤液为D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液；

(3)向所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶盐溶液中加入活性炭，充分搅拌混匀后，固液分离除去活性炭，得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤(1)中所述固液分离的步骤前还包括加絮凝剂；优选地，所述絮凝剂为铝盐、铁盐、氯化钙、丙烯酰氨、壳聚糖中的至少一种；相对于100重量份所述菌体，所述絮凝剂的用量为0.05-1.5重量份，优选为0.2-0.8重量份。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述加热温度为40-60℃，优选45-55℃；所述加热时间为30min-300min，优选60min-180min。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述无机盐-1为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾中的至少一种；相对于100重量份的所述粗酶液，所述无机盐-1为1-25重量份，优选为10-20重量份；

所述母液的pH为7.5-8.5，优选为7.8-8.2。

10.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤(2)中，相对于100重量份的所述粗酶液，所述活性炭的用量为0.05-1重量份，优选为0.1-0.5重量份。