CN105219661B - 合成低聚半乳糖的专用菌株及用其合成低聚半乳糖的方法 - Google Patents
合成低聚半乳糖的专用菌株及用其合成低聚半乳糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株合成低聚半乳糖的专用菌株及用其合成低聚半乳糖的方法。该专用菌株为解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369。对该菌株进行培养，培养结束后菌液分离得到解脂亚罗威酵母CGMCC NO.11369细胞，加入乳糖溶液进行转化合成低聚半乳糖；转化结束后进行纯化精制，得到低聚半乳糖。采用本发明的方法，由于该酵母能合成β‑半乳糖苷酶且能循环使用，因此不用购买β‑半乳糖苷酶，降低了生产成本；由于该酵母同时还能合成赤藓糖醇，可以利用合成赤藓糖醇后得到的酵母细胞转化半乳糖合成低聚半乳糖，节省了培养细胞的成本。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一株用于合成低聚半乳糖的解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369菌株，及其用乳糖合成低聚半乳糖的方法。
背景技术
低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)是一类非消化性短链聚糖(non-digestible polysaccharides)，聚合度大多是3-6(即：低聚三糖，低聚四糖，低聚五糖以及低聚六糖)，即在半乳糖分子的还原端聚合1-4分子的半乳糖，半乳糖分子之间大多以β-1，6-糖苷键连接，少数以β-1，4-糖苷键连接。
低聚半乳糖具有优良的物理性质。具有很好的保湿效果以及高的溶解性能，在高温以及低pH值下很稳定，在180℃或者pH＝3的条件下几乎不水解，每克的热量只有1.7Kcal(Saka et al.1999.Recent progress on research and application of non-digestible galacto-oligosaccharides.Int Dairy,9:69-80)。
低聚半乳糖还具有优良的生理特性。它通过机体小肠不会被分解吸收，只有通过大肠的过程中才会被其中的有益菌群分解吸收，能显著的促进有益菌群的增殖，并合成对机体有益的挥发性短链脂肪酸如乙酸、丙酸、丁酸，这些短链脂肪酸还能降低消化道的pH值，抑制有害菌群的增殖(Macfarlane GT,et al.2008.Bacterial metabolism andhealth-related effects of galacto-oligosaccharides and otherprebiotics.Journal of Applied Microbiology,104:305-344)。还能有效地降低消化道有毒物质的累积，降低大肠癌的发生，促进矿物质元素的吸收，降低脂的含量(Niittyen L,et al.2007.Galacto-oligosaccharides and bowel function.Scandinavian Journalof Food and Nutrition,51:62-66)。由于低聚半乳糖能提高有益菌群尤其是双歧杆菌类菌群的增殖，最新研究发现双歧杆菌能显著降低机体的胆固醇的含量(Zanotti etal.2015.Evidence for cholesterol-lowering activity by Bifidobacterium bifidumPRL2010through gut microbiota modulation.Applied Microbiology andBiotechnology,99:6813-6829)。
由于低聚半乳糖具有良好的物理性质与生理特性，欧美等发达国家早在十年前就批准其作为食品配料，在烘焙食品、发酵乳制品、乳粉(包括婴幼儿奶制品)、酿造品中添加使用。我国在2008年也批准其作为新资源食品，允许在乳粉中添加使用。随着低聚半乳糖的市场也逐年增加，研究其先进的生产方法就具有重要的价值。
迄今为止，已经有很多文献报道以乳糖为原料合成低聚半乳糖的方法。这些方法主要分成两种，一种是采用酶转化的方法，另一种是采用细胞转化的方法。这两种方法还可以分别采取游离的或者固定化的形式进行转化。如采用游离的酶或者固定化的酶，采用游离的细胞或者固定化的细胞进行转化。Vera Carlos等人采用来自米曲霉的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)转化40％乳糖，在55℃条件下转化，最高得到27％的转化率(生成的低聚半乳糖与起始乳糖的质量比)(Vera C,et al.2012.Synthesis of galacto-oligosaccharides byβ-galactosidase from Aspergillus oryzae using partiallydissolved and supersaturated solution of lactose.Enzyme and MicrobialTechnology,50:188-194.)。中国发明专利CN201210172977.2描述了一种采用来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶，并将该酶进行固定化来转化乳糖生成低聚半乳糖。首先发酵环状芽孢杆菌得到酶液，再用戊二醛进行固定在树脂上，然后以固定酶的树脂进行转化。Albayrak N与Yang S等人采用多层棉布固定米曲霉的β-半乳糖苷酶转化乳糖合成低聚半乳糖，在200克/升与400克/升的乳糖溶液中转化分别获得21％与26％的转化率(Albayraket al.2002.Production of galacto-oligosaccharides from lactose by Aspergillusoryzaeβ-galactosidase immobilized on cotton cloth.Biotechnology andBioengineering,77:8-19)。上述酶转化的方法需要购买或者自行制备纯酶，成本较高。而且固定酶的制备步骤较多，首选需要发酵培养芽孢杆菌，然后分离酶液，再进行固定，存在固定效率低下，需要固定介质等问题。
由于酶的成本较大，使用细胞直接发酵合成低聚半乳糖的方法也得到使用。中国发明专利CN200910018452.1描述了一种采用米曲霉(Aspergillus oryzae)直接发酵乳糖合成低聚半乳糖的方法。该方法在含有碳源(包含20-40％底物乳糖)、氮源以及无机盐的液体培养基中培养米曲霉，曲霉细胞一边生长一边转化乳糖合成低聚半乳糖。该方法虽然不需要单独制备酶，但由于发酵培养基的成分复杂，细胞无法全部将加入的营养成分利用完全，而且还会产生初级或者次级代谢产物，因此发酵产物除了含有低聚半乳糖外，还含有其它未知成分，增加了低聚半乳糖分离的难度与成本。而采用细胞转化的方法则能降低培养副产物成分，提高产物的纯度。因此，采用固定化细胞转化的方法也得到一定的使用。虽然固定化细胞合成低聚半乳糖具有能循环使用以及使用周期较长的优点，但是细胞的固定化与酶的固定化一样，存在步骤较多，需要使用戊二醛等有机溶剂，在反复使用的过程中细胞容易脱落以及污染，而且固定化的过程中存在固定化效率的问题，使得很多细胞没有被固定未得到利用，同时固定化柱的制备需要介质(比如微孔树脂、壳聚糖、纤维素珠、琼脂糖珠等)，本身也增加了成本，难以大规模使用。
因此，研究开发一种即能够自我合成β-半乳糖苷酶，又具有类似固定化酶能循环利用，并且容易高密度培养的微生物对于提高低聚半乳糖的合成效率、降低生产成本具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的酶合成或细胞合成低聚半乳糖的不足之处，提供了一株合成低聚半乳糖的专用菌株及用其合成低聚半乳糖的方法。本发明提供的能合成β-半乳糖苷酶的解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369菌株，该菌株除了具备出发菌株的性能之外(合成赤藓糖醇)，还具有出发菌株所没有的功能，即：能合成低聚半乳糖。因此可以用合成赤藓糖醇后的酵母泥作为细胞催化剂，再转化乳糖生成低聚半乳糖，还可以直接培养细胞发酵乳糖合成低聚半乳糖。
本发明中使用的合成低聚半乳糖的酵母菌株是解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)，已经于2015年9月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.11369。
本发明所使用的解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369来源于出发菌株解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica BLC13)CGMCC NO.7326，该菌株在中国发明专利ZL201310282059.X中已经做了描述，该菌株不能同化乳糖，不能在含乳糖为唯一碳源的基本培养基上生长繁殖(基本培养基成分：酵母氮碱6.7克/升，硫酸铵5克/升，乳糖10克/升，pH6.0)。而本发明所采用的酵母菌株--解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11369含有β-半乳糖苷酶基因，该基因编码产物具有水解酶活性，也具有糖基转移酶活性。能将乳糖分解为D-半乳糖与D-葡萄糖，能在含乳糖为唯一碳源的基本培养基中生长，同时合成低聚半乳糖。因此，本发明使用的解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11369菌株不但能合成赤藓糖醇，还具备新的特性，能同化乳糖并合成低聚半乳糖。这是第一次报道能够以乳糖为底物合成低聚半乳糖的解脂亚罗威酵母，具有发明创造性。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11369。该酵母能合成β-半乳糖苷酶。
第二方面，本发明涉及所述的解脂亚罗威酵母菌株在合成低聚半乳糖中的用途。
第三方面，本发明涉及所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚半乳糖的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、将解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369菌株进行发酵培养，培养结束后菌液分离得到解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369细胞；
S2、在分离得到的细胞中加入乳糖水溶液，在40～60℃，pH4.0～8.0条件下振荡或搅拌，进行转化合成低聚半乳糖。
优选的，所述发酵培养为高密度发酵培养；该高密度发酵培养采用的培养基为含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基，培养条件为在pH值3.0～8.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌。优选发酵pH值为5.0～7.0。更优选发酵温度为28℃～32℃，最优选30℃。所述发酵培养也可为常规发酵培养，其采用的发酵培养基以及培养条件同上述的高密度发酵培养。
优选的，所述高密度发酵培养还包括如下步骤：经过多级(一级、二级甚至是三级)扩大培养，以得到更多的所述酵母细胞。高密度培养中的高密度是指在吸光度600纳米下细胞密度达到50及以上，常规发酵培养是指在吸光度600纳米下细胞密度达到50以下。
优选的，所述碳源为固体葡萄糖、葡萄糖母液中的一种或两种，碳源用量为10～100克/升；所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵中的一种或几种的混合，氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种，无机盐用量为0～2.5克/升。更优选碳源用量为25～100克/升。更优选氮源为磷酸氢二铵、酵母粉、玉米浆干粉中的一种或几种，氮源用量为5～22.5克/升。更优选无机盐用量为0.01～2克/升，最优选为1～2克/升。
优选的，所述发酵培养为高浓度碳源的发酵培养；该高浓度碳源的发酵培养基为含高浓度碳源、氮源、无机盐以及水的培养基，培养条件为在pH值3～8，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌。
优选的，所述高浓度碳源为固体葡萄糖、葡萄糖浆、葡萄糖母液中的一种或多种，折合葡萄糖含量为200～300克/升；所述氮源为酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵中的一种或几种的混合，氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种，无机盐用量为0.01～2克/升。
采用高浓度碳源的发酵培养时，菌液分离得到的上清液为含有赤藓糖醇的溶液，用于纯化分离赤藓糖醇，沉淀为解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369细胞。
优选的，采用高浓度碳源的发酵培养时，步骤S2中可选择加入葡萄糖氧化酶以及过氧化氢酶进行转化合成低聚半乳糖。
优选的，步骤S2中的乳糖水溶液浓度为200～600克/升；更优选为300～500克/升；最优选为400克/升。
优选的，步骤S2中转化温度为40～60℃，最优选为40～55℃。转化pH值优选为5.0～7.0；更优选为5.5～6.5。
优选的，所述步骤S2后还包括当转化液中低聚半乳糖的含量不再增加时停止转化，进行纯化精制，得到液体或者粉状低聚半乳糖的步骤。低聚半乳糖的含量不再增加是指在连续转化5小时期间，低聚半乳糖的含量没有显著的变化，这时可以停止转化。所述纯化精制包括：过滤分离细胞、浓缩、脱色、离子交换、纳滤、喷雾干燥等工序。这些工序方法均为行业内的通识方法。
优选的，停止转化后，过滤得到的细胞还可以循环利用3～5次，按照步骤S2的条件进行转化乳糖。
转化得到的低聚半乳糖溶液经过浓缩，离子交换，脱色，色谱分离、干燥等工艺，可以得到低聚半乳糖糖浆或者低聚半乳糖粉。这些工艺都是本领域内常用的通识方法，一般技术人员既能掌握使用。
本发明提供的能合成低聚半乳糖的解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC No.11369是通过以下方法制备的：
合成β-半乳糖苷酶编码序列的表达盒，并将该表达盒转化出发菌株--解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC 7326，在含乳糖为唯一碳源的基本培养基中筛选，只有含有β-半乳糖苷酶编码序列的表达盒的酵母转化子才能利用乳糖，将乳糖分解为葡萄糖与半乳糖(请见实施例1)，并长出单菌落克隆，该单菌落克隆能转化乳糖合成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶编码序列的表达盒包含以下脱氧核糖核酸元件：5’端同源臂脱氧核糖核酸序列、启动子脱氧核糖核酸序列、β-半乳糖苷酶编码序列、终止子脱氧核糖核酸序列以及3’端同源臂脱氧核糖核酸序列。表达盒中各脱氧核糖核酸元件按照如下顺序连接：5’端同源臂脱氧核糖核酸序列+启动子脱氧核糖核酸序列+β-半乳糖苷酶编码序列+终止子脱氧核糖核酸序列+3’端同源臂脱氧核糖核酸序列。同源臂序列可以为来自Yarrowia lipolytica酵母自身的URA3编码的序列，也可以为LEU2编码的序列，也可以为其自身核糖体18S核糖体脱氧核糖核酸编码序列，也可以为长末端重复脱氧核糖核酸序列(Zeta序列)等。启动子脱氧核糖核酸序列可以为来自Yarrowia lipolytica酵母自身的任意编码序列的启动子脱氧核糖核酸序列，比如TEF1编码序列(转录延长因子1编码序列)的启动子，也可以为hp4d启动子(杂合启动子)，也可以为GPD编码序列(3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列)启动子，也可以是1，6-二磷酸果糖裂解酶编码序列(FBA)的启动子，也可以是XPR2编码序列的启动子等。β-半乳糖苷酶编码序列可以是来自曲霉菌的β-半乳糖苷酶编码序列，如黑曲霉(Aspergillusniger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)等，也可以是来自酵母的β-半乳糖苷酶编码序列，如来自乳酸克鲁维酵母，还可以是来自细菌的β-半乳糖苷酶编码序列，如来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶编码序列。终止子脱氧核糖核酸序列可以为来自Yarrowia lipolytica酵母的任何编码序列的终止子脱氧核糖核酸序列，如TEF1编码序列的终止子脱氧核糖核酸序列，也可以是XPR2编码序列的终止子脱氧核糖核酸序列等。上述启动子脱氧核糖核酸序列、β-半乳糖苷酶编码序列、终止子脱氧核糖核酸序列在公共数据库中都已公开，如在GenBank数据库中都能查询并免费得到序列。合成基因的表达盒的技术目前也是很成熟的技术，一般的基因合成公司都能合成。本发明使用的分子生物学技术(如脱氧核糖核酸元件的连接、转化等)都是本领域的通用的公开的技术。而且，本发明所使用的脱氧核糖核酸元件均来自食品安全的微生物，比如同源臂脱氧核糖核酸元件、启动子元件以及终止子元件都是来自Yarrowia lipolytica，该酵母是合成赤藓糖醇的安全菌株。β-半乳糖苷酶编码序列来自黑曲霉、米曲霉、日本曲霉、环状芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母等，都是食品安全微生物。本发明提供的合成低聚半乳糖的专用菌株含有上述β-半乳糖苷酶编码序列的表达盒，是食品安全的微生物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.相比现有的曲霉细胞培养(米曲霉、黑曲霉等)，本发明采用的解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369更容易进行液体深层培养发酵，更容易进行高密度培养以获得更多的细胞。而曲霉在培养过程中容易菌丝体成团，不容易高密度培养。
2.由于解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369本身能高效率合成β-半乳糖苷酶，较其它野生型的酵母(如乳酸克鲁维酵母)合成酶的效率更高。因此，无需购买酶，能有效降低合成低聚半乳糖的成本。
3.解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369可以被循环利用3-5次，转化乳糖合成低聚半乳糖，而采用游离的β-半乳糖苷酶只能被利用一次。
4.解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369还可以来自发酵赤藓糖醇后经过过滤得到的废酵母泥，有效提高了资源的利用率。由于解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369来自于解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13CGMCC NO.7326，具备其合成赤藓糖醇的特性，同时又具备了合成低聚半乳糖的新性能。因此，可以先用其来合成赤藓糖醇，再用得到的酵母细胞用来转化乳糖合成低聚半乳糖，充分利用了酵母资源。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为出发菌株解脂亚罗酵母CGMCC NO.7326以及解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCC NO.11369分解乳糖的HPLC分析图；其中，A为出发菌株解脂亚罗酵母CGMCC NO.7326在含乳糖的基本培养基中培养3天的HPLC分析；B为含有β-半乳糖苷酶编码序列的新菌株解脂亚罗威酵母CGMCC NO.11369在含有乳糖的基本培养基中培养3天的HPLC分析；
图2为14.5克湿细胞转化50毫升200克/升的乳糖水溶液结束时HPLC分析；
图3为17.5克湿重细胞转化50毫升400克/升的乳糖水溶液结束时HPLC分析；
图4为在转化反应液中加入葡萄糖氧化酶以及过氧化氢酶后的HPLC图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
解脂亚罗威酵母属于公认安全的酵母菌株，在食品发酵领域具有重要的应用。有的能高效合成柠檬酸，有的能高效合成赤藓糖醇，有的能高效由果糖合成甘露醇。同时，该酵母也是常用的异源蛋白表达宿主，用于高效表达具有功能的酶(Nicaud et al,Proteinexpression and secretion in the yeast Yarrowia lipolytica.FEMS YeastResearch,2002,Vol2:371-379)。我们经过研究，以合成赤藓糖醇的解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13CGMCC No.7326为出发菌株构建了一株能够合成β-半乳糖苷酶的新菌株解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369，该菌株除了能合成赤藓糖醇外，还能够由乳糖合成低聚半乳糖，并能够高密度培养。因此，在利用该新菌株解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369合成赤藓糖醇后，得到的酵母泥可以再用来转化乳糖合成低聚半乳糖，充分利用了酵母资源，省却了培养细胞的成本。
实施例1、解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369能分解乳糖
由于解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369来源于解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica BLC13)CGMCC NO.7326，解脂亚罗酵母CGMCC NO.7326不能分解乳糖，不能在含乳糖为唯一碳源的基本培养基上生长(基本培养基成分：乳糖10克/升，酵母氮碱6.7克/升，硫酸铵5克/升，pH6.0)。而解脂亚罗威酵母CGMCC11369含有β-半乳糖苷酶编码序列，编码翻译的β-半乳糖苷酶是一个双功能酶，即具有半乳糖基转移功能，还具有水解乳糖的功能，水解乳糖释放出葡萄糖，而释放的葡萄糖能作为碳源支持其生长。因此，解脂亚罗威酵母CGMCC NO.11369能在含乳糖为唯一碳源的基本培养基中生长。将解脂亚罗威酵母CGMCC NO.11369接种在含10克/升的乳糖的基本液体培养基中(乳糖：10克/升，酵母氮碱6.7克/升，硫酸铵5克/升，pH6.0)，在30℃培养60小时，HPLC分析，乳糖部分解为半乳糖为葡萄糖，同时测定细胞在600纳米的吸光值，由培养0时的0.12提高到9.4。分解蔗糖的HPLC分析图如图1所示；保留时间8.115min为乳糖，8.623min为葡萄糖，10.023min为半乳糖。由图1可见，新菌株解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369能分解乳糖，而出发菌株解脂亚罗酵母CGMCC NO.7326不能分解乳糖，新菌株获得了新的性能。
实施例2、转化200克/升乳糖合成低聚半乳糖
按照如下步骤实施：
(1)在50毫升发酵培养基中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11369。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖25，酵母粉2.5，蛋白胨2.0克，磷酸氢二铵0.5，硫酸镁2，pH3.0。
(2)接种后在25℃振荡培养直到葡萄糖消耗完全即停止培养。
(3)离心保留细胞，获得14.5克湿细胞。将细胞用无菌水洗涤1次，再用50毫升200克/升的乳糖水溶液悬浮细胞，调节pH至4.0，在40℃振荡转化。
(4)每隔5小时取样HPLC检测低聚半乳糖生成的量，在连续5小时期间若低聚半乳糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化(25小时)。
(5)离心，菌液分离。此时HPLC检测蔗糖转化为低聚半乳糖的转化率为22％。在乳糖浓度比较低的情况下，由乳糖转化合成低聚半乳糖的转化率也比较低。HPLC检测图如图2所示，图2中，保留时间7.710min与8.088min为低聚半乳糖；8.635min为未转化完的乳糖；9.455min为葡萄糖；9.917min为半乳糖。
实施例3、转化400克/升乳糖合成低聚半乳糖
按照如下步骤实施：
(1)在50毫升发酵培养基中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11369。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖50，酵母粉5，玉米浆干粉10克，磷酸氢二铵5，硫酸镁1.5，pH 8。
(2)接种后在35℃振荡培养直到葡萄糖消耗完全即停止培养。
(3)离心保留细胞，获得17.5克湿细胞。将细胞用无菌水洗涤1次，再用50毫升400克/升的乳糖水溶液悬浮细胞，调节pH至8，在60℃振荡转化。
(4)每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖生成的量，在连续5小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化(25小时)。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测蔗糖转化为低聚果糖的转化率为35％。HPLC检测转化反应液结果如图3所示，图3中，保留时间7.735min与8.112min为低聚半乳糖；8.655min为未转化完的乳糖；9.470min为葡萄糖；9.953min为半乳糖。
实施例4、转化600克/升乳糖合成低聚半乳糖
(1)在50毫升发酵培养基中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11369。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖100，酵母粉5，玉米浆干粉15克，磷酸氢二铵2.5，硫酸镁1，氯化锰0.005，pH5.5。
(2)接种后在30℃振荡培养直到葡萄糖消耗完全即停止培养。
(3)离心保留细胞，获得20.5克湿细胞。将细胞用无菌水洗涤1次，再用50毫升600克/升的乳糖水溶液悬浮细胞，调节pH至6.0，在50℃振荡转化。
(4)每隔5小时取样HPLC检测低聚半乳糖生成的量，在连续5小时期间若低聚乳糖糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化(45小时)。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测乳糖转化为低聚半乳糖的转化率为40.5％。
实施例5、在发酵罐中合成低聚半乳糖
(1)在3升发酵罐中先培养解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11369。培养基的成分为(克/升)：葡萄糖50，蛋白胨5，玉米浆干粉10克，磷酸氢二铵2.5，硫酸镁1.5，氯化锰0.005，pH6.0。
(2)接种后在30℃搅拌培养，通气，葡萄糖消耗完后再进行补料葡萄糖，直到细胞密度达到80即停止培养(进行高密度培养)。
(3)离心保留细胞，获得337克湿细胞。将细胞用无菌水洗涤1次，再用2000毫升400克/升的乳糖水溶液悬浮细胞，装入发酵罐，调节pH至5.5，在50℃搅拌转化。
(4)每隔5小时取样HPLC检测低聚半乳糖生成的量，在连续5小时期间若低聚半乳糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化(50小时)。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测乳糖转化为低聚半乳糖的转化率为41.5％。
(6)离心后得到的细胞沉淀再加入2000毫升400克/升的乳糖水溶液，悬浮细胞，装入发酵罐，调节pH至5.5，在50℃搅拌转化。每隔5小时取样HPLC检测低聚半乳糖的合成量，在连续5小时期间若低聚半乳糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化，检测分析，细胞第二次转化率为38.5％，保留90％的酶活力。细胞依次重复使用3次。第三次的转化率为34.5％。
实施例6、先发酵合成赤藓糖醇，再以废酵母泥转化合成低聚半乳糖(1)
(1)在含500毫升发酵培养基的摇瓶中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCC NO.11369。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖200，酵母粉2.5，玉米浆干粉2.5，硫酸镁1，氯化锰0.005，氯化铜0.002，pH6.5。
(2)接种后在30℃，好氧振荡培养直到葡萄糖全部转化为赤藓糖醇后即停止发酵。
(3)离心，上清依次经过脱色、浓缩、离子交换、再浓缩、结晶的步骤提取赤藓糖醇，这些步骤均为本领域内常用的通识方法。得到细胞沉淀用于转化。获得57.5克湿细胞。将细胞用无菌水洗涤1次，再用500毫升600克/升的乳糖水溶液悬浮细胞，调节pH至5.5，在50℃振荡转化。
(4)每隔5小时取样HPLC检测低聚半乳糖生成的量，在连续5小时期间若低聚半乳糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化(50小时)。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测乳糖转化为低聚半乳糖的转化率为38.5％。
实施例7、先发酵合成赤藓糖醇，再以废酵母泥转化合成低聚半乳糖(2)
(1)在含2500毫升培养基的发酵罐中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCC NO.11369。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖300，酵母浸膏10，玉米浆5克，磷酸氢二铵5，硫酸镁1，氯化锰0.005，氯化铜0.002，pH6.5。
(2)接种后在30℃，好氧搅拌培养直到葡萄糖全部转化为赤藓糖醇后即停止发酵。
(3)离心，上清依次经过脱色、浓缩、离子交换、再浓缩、结晶的步骤提取赤藓糖醇，这些步骤均为本领域内常用的通识方法。得到细胞沉淀用于转化。获得315.5克湿细胞(酵母泥)。将细胞用无菌水洗涤1次，再用2000毫升550克/升的乳糖水溶液悬浮细胞，调节pH至6.0，在50℃振荡转化。
(4)每隔5小时取样HPLC检测低聚半乳糖生成的量，在连续5小时期间若低聚半乳糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测乳糖转化为低聚半乳糖的转化率为43.2％。
(6)离心后得到的细胞沉淀再加入2000毫升550克/升的乳糖水溶液，悬浮细胞，装入发酵罐，调节pH至6.0，在53℃搅拌转化。每隔5小时取样HPLC检测低聚半乳糖的合成量，在连续5小时期间若低聚半乳糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化，检测分析，细胞第二次转化率为40.5％，保留93.7％的酶活力。细胞依次重复使用5次。第5次的转化率为34.5％，细胞保留80％的活性。可见，随着重复利用次数的增加，细胞的转化率会逐渐降低，因此，利用次数一般不超过5次。
实施例8、低葡萄糖含量低聚半乳糖的制备
为了得到低葡萄糖含量的低聚半乳糖，本实施例在转化液中加入葡萄糖氧化酶以及过氧化氢酶，来氧化生产的副产物葡萄糖。由于在上述酶转化合成低聚半乳糖的同时，会产生大约15-25％含量的葡萄糖。为了制备较高纯度的低聚半乳糖糖，同时降低葡萄糖对β-半乳糖苷酶的反馈抑制，需要将这些葡萄糖去除。在转化液里加入葡萄糖氧化酶以及过氧化氢酶，将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，减低对β-半乳糖苷酶的反馈抑制。然后通过离子交换去除葡萄糖酸。
按照上述实施例7培养酵母细胞的方法得到酵母泥，用无菌水洗涤1次，再用2000毫升400克/升的乳糖水溶液悬浮细胞，调节pH至6.0，加入2克葡萄糖氧化酶(10000单位/克)与1克过氧化氢酶(20000单位/克)，在45℃振荡转化。每隔5小时取样HPLC检测低聚半乳糖生成的量，在连续5小时期间若低聚半乳糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化。转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测乳糖转化为低聚半乳糖的转化率为30.5％，葡萄糖含量低于1％，与不用葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶相比，降低了90％。采用葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶处理后，HPLC分析如图4所示，图4中，保留时间为7.715min以及8.098min为低聚半乳糖；8.632min为未转化完的底物乳糖；9.465min为葡糖糖；9.932min为半乳糖。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369，该酵母能合成β-半乳糖苷酶。
2.一种如权利要求1所述的解脂亚罗威酵母菌株在合成低聚半乳糖中的用途。
3.一种将如权利要求1所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚半乳糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369菌株进行发酵培养，培养结束后菌液分离得到解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369细胞；
S2、在分离得到的细胞中加入乳糖水溶液，在40～60℃，pH4.0～8.0条件下振荡或搅拌，进行转化合成低聚半乳糖。
4.如权利要求3所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚半乳糖的方法，其特征在于，所述发酵培养可以为高密度发酵培养；该高密度发酵培养采用的培养基为含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基，培养条件为在pH值3.0～8.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌。
5.如权利要求4所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚半乳糖的方法，其特征在于，所述碳源为固体葡萄糖、葡萄糖母液中的一种或两种，碳源用量为10～100克/升；所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵中的一种或几种的混合，氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种，无机盐用量为0～2.5克/升。
6.如权利要求3所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚半乳糖的方法，其特征在于，所述发酵培养为高浓度碳源的发酵培养；该高浓度碳源的发酵培养采用的培养基为含高浓度碳源、氮源、无机盐以及水的培养基，培养条件为在pH值3～8，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌。
7.如权利要求6所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚半乳糖的方法，其特征在于，所述高浓度碳源为固体葡萄糖、葡萄糖浆、葡萄糖母液中的一种或多种，折合葡萄糖含量为200～300克/升；所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵中的一种或几种的混合，氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种，无机盐用量为0～2.5克/升。
8.如权利要求6所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚半乳糖的方法，其特征在于，采用高浓度碳源的发酵培养时，菌液分离得到的上清液为含有赤藓糖醇的溶液，用于纯化分离赤藓糖醇，沉淀为解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11369细胞。
9.如权利要求6所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚半乳糖的方法，其特征在于，采用高浓度碳源的发酵培养时，步骤S2中可选择加入葡萄糖氧化酶以及过氧化氢酶进行转化合成低聚半乳糖。
10.如权利要求3所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚半乳糖的方法，其特征在于，所述步骤S2后还包括当转化液中低聚半乳糖的含量不再增加时停止转化，进行纯化精制，得到液体或者粉状低聚半乳糖的步骤。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |