CN100526470C - 一种功能性甜味剂d-塔格糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种功能性甜味剂D-塔格糖的制备方法，具体涉及微生物发酵生物转化制备D-塔格糖的一种方法，属于食品生物技术领域。用乳酸菌作为菌种，以半乳糖为转化底物，添加碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵法生物转化制备D-塔格糖。所用乳酸菌在MRS培养基中，25-40℃培养，生长良好，作为种子培养液，发酵培养基碳源为葡萄糖、乳糖、麦芽糖或可溶性淀粉，氮源选用蛋白胨、酵母膏、玉米浆、大豆粕中的一种或几种混合使用，发酵后经检测，在发酵液中D-塔格糖浓度达250-450mg/100ml。本发明所得产品安全可靠，具有很高的生理功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种功能性甜味剂D-塔格糖的制备方法，具体涉及微生物发酵生物转化制备D-塔格糖的一种方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
塔格糖是一种在自然界中较为稀有的天然己酮糖，属于稀少糖的一种。国际稀少糖协会(ISRS)对稀少糖的定义为“在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”。塔格糖(tagatose)是果糖的“差向异构体”，广泛存在于自然界中，许多食品，如灭菌牛乳、超高温灭菌乳、乳粉、热可可、各种干酪、某些品种的酸乳、婴儿配方食品，以及某些植物中都存在有一定量的塔格糖。其甜味类似于蔗糖，而热量值只有1.5kcal/g，因此被称为低能量甜味剂。同时D-塔格糖还具有良好的功能特性，如正常人食用后不增加体内血糖水平，糖尿病人食用后可以抑制和减缓血糖的升高，不会引起龋齿；在加热和烘烤食品过程中发生美拉德反应，产生良好色泽，在食品加工中可以作为蔗糖的替代品或和其它甜味剂复配使用。目前塔格糖的生产有天然提取分离、化学催化合成以及生物转化等方法。由于塔格糖是一种较为罕见的单糖，其在自然界的含量极低，天然提取分离成本高，不适宜工业化大生产的要求，而化学催化法有许多不利的因素，例如在碱性反应条件下会形成许多副产物和化学污染物，而形成的众多副产物又使纯化步骤变得复杂。近年来研究人员都在寻找生物转化的方法来生产塔格糖。曾报道用Mycobacterium smegmatis和Arthrobacter globiformis菌脱氢酶氧化半乳糖醇和己六醇生成塔格糖，但由于原料成本价格高，不适宜工业化生产。还有人利用Lactobacillus gayonii代谢产生的L-阿拉伯糖异构酶成功转化半乳糖生成塔格糖，提出了利用乳酸菌生产塔格糖的设想。目前，对塔格糖的生物转化主要通过基因重组，然后在大肠杆菌内表达产生的L-阿拉伯糖异构酶进行。主要是把耐热细菌L-阿拉伯糖异构酶基因通过大肠杆菌转基因表达，尽管增加了酶的耐热性，但是均存在对底物半乳糖专一性差的缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种功能性甜味剂D-塔格糖的制备方法，具体内容涉及利用乳酸菌发酵生物转化制备D-塔格糖的一种方法。本发明采用的乳酸菌产生的L-阿拉伯糖异构酶在耐热性和底物专一性方面得到较好的结果，通过发酵转化取得了显著效果，为塔格糖的生物转化提供了一个新途径。
本发明的技术方案：以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentose)作为菌种，以半乳糖为转化底物，采用碳源、氮源以及诱导物和无机盐组成发酵培养基，发酵法生物转化制备D-塔格糖。
(1)菌种：
植物乳杆菌AS1.550；植物乳杆菌AS1.557；
戊糖乳杆菌BCRC11053；戊糖乳杆菌BCRC15317。
用乳酸菌作为菌种生物转化时，选用植物乳杆菌AS1.557或戊糖乳杆菌BCRC15317效果较好。
(2)培养基，以g/100ml计：
保藏培养基：葡萄糖1.5，酵母膏1，碳酸钙1.5，琼脂1.5，pH 6.5-7.0。
种子培养基：葡萄糖1，蛋白胨1，酵母膏1，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，
硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，pH 6.5-7.0。
(3)制备工艺：
菌种保藏：所用菌种保藏在保藏培养基上，4℃保存，两周转接一次。
种子培养：从保藏培养基上转入种子培养基，培养活化2代，每次培养12h。
发酵：底物半乳糖在培养基中的质量浓度为1％，种子培养液以1％-3％的接种量，接入添加不同碳源，氮源以及诱导物和无机盐组成的发酵培养基中，250ml三角瓶装液量为50ml，碳源添加水平为发酵培养基质量的0.5％-3％，氮源添加水平为发酵培养基质量的0.5％-3.5％，发酵培养基组成以g/100ml计为：半乳糖0.5-2.0，碳源0.5-3.0，氮源0.5-3.5，L-阿拉伯糖0.15，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，pH 7.0，25-40℃静置培养12-20h得到含D-塔格糖的发酵液。所用碳源为葡萄糖、乳糖、麦芽糖或可溶性淀粉，所用氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、大豆粕中的一种或几种混用。
(4)分离纯化：
将含有D-塔格糖的发酵液用D001型强酸性苯乙烯树脂进行离子交换，去离子水洗涤，再经U20专用树脂纯化，浓缩，结晶，干燥后即得成品D-塔格糖。
优选的发酵培养基以g/100ml计：半乳糖1，葡萄糖0.5，蛋白胨1，酵母膏1，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，L-阿拉伯糖0.15，pH 7.0为较好。
检测D-塔格糖含量的方法如下：
取发酵液离心，上清液微孔滤膜过滤(0.22μm)，滤液上HPLC分析。HPLC条件：Waters2410色谱柱：Sugarpak 1.65mmid×300mm，流动相：纯水，检测器：示差折光检测器，柱温：85℃，流速：0.4ml/min，进样量：10μl，塔格糖标样浓度：0.5％。
本发明的有益效果：本发明提供了一种利用乳酸菌发酵生物转化制备D-塔格糖的方法，表明通过发酵的方法，12hD-塔格糖的产量可以达到359-450mg/100ml。采用乳酸菌产生的L-阿拉伯糖异构酶在耐热性和底物专一性方面得到较好的结果，通过发酵转化取得了显著效果，为D-塔格糖的生物转化提供了一个新途径。
生物材料来源说明
所用菌种为：植物乳杆菌AS1.550；植物乳杆菌AS1.557；
戊糖乳杆菌BCRC11053；戊糖乳杆菌BCRC15317，以上菌种均已公开，AS编号表示(China General Microbiological Cuture CollectionCenter.CGMCC.Institute of Micribiology，Chinese Academy of Science：中国微生物菌种委员会普通微生物中心)。BCRC编号表示(Bioresource Collection andResearch Center：台湾生物资源保藏研究中心)。其后编号代表保藏编号，具体查看各菌种数据库网页。
具体实施方式
通过实验，得到了影响发酵转化D-塔格糖产率的主要因素：
实施例1不同菌种对D-塔格糖产率的影响
在发酵培养基中添加1％的半乳糖(分析纯)，按说明书上述的优选的培养基对初选的一些乳酸菌进行发酵实验，发酵12h后对发酵液进行检测，结果如表1所示，植物乳杆菌AS1.557，戊糖乳杆菌BCRC15317的D-塔格糖产率较高，不同菌种对D-塔格糖的生成有较为显著的区别。
表1 不同菌种对产D-塔格糖的影响
实施例2发酵时间对产D-塔格糖的影响
按说明书所述的发酵条件，操作条件同实施例1，通过对植物乳杆菌AS1.557在不同发酵时间产D-塔格糖的检测，发现发酵12h后D-塔格糖含量最高，随着发酵时间延长，D-塔格糖含量下降，表明菌株有利用D-塔格糖的能力。所以发酵12h后，立即终止发酵。发酵时间对产D-塔格糖的影响如表2所示。
表2 发酵时间对产D-塔格糖的影响
Claims (3)
1.一种D-塔格糖的制备方法，其特征是以植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentose)作为菌种，以半乳糖为转化底物，采用碳源、氮源以及诱导物和无机盐组成发酵培养基，发酵法生物转化制备D-塔格糖；
(1)菌种：采用植物乳杆菌AS1.550；植物乳杆菌AS1.557；戊糖乳杆菌BCRC11053或戊糖乳杆菌BCRC 15317；
(2)培养基，以g/100ml计：
保藏培养基：葡萄糖1.5，酵母膏1，碳酸钙1.5，琼脂1.5，pH6.5-7.0；
种子培养基：葡萄糖1，蛋白胨1，酵母膏1，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，pH6.5-7.0；
(3)制备工艺：
菌种保藏：所用菌种保藏在保藏培养基上，4℃保存，两周转接一次；
种子培养：从保藏培养基上转入种子培养基，培养活化2代，每次培养12h；
发酵：底物半乳糖在培养基中的质量浓度为1％，种子培养液以1％-3％的接种量，接入添加不同碳源、氮源以及诱导物和无机盐组成的发酵培养基中，250ml三角瓶装液量为50ml，碳源添加水平为发酵培养基质量的0.5％-3％，氮源添加水平为发酵培养基质量的0.5％-3.5％，发酵培养基组成以g/100ml计为：半乳糖0.5-2.0，碳源0.5-3.0，氮源0.5-3.5，L-阿拉伯糖0.15，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，pH7.0，25-40℃静置培养12-20h，得到含D-塔格糖的发酵液，所用碳源为葡萄糖、乳糖、麦芽糖或可溶性淀粉，所用氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、大豆粕中的一种或几种混用；
(4)分离纯化：
将含有D-塔格糖的发酵液用D001型强酸性苯乙烯树脂进行离子交换，去离子水洗涤，再经U20专用树脂纯化，浓缩，结晶，干燥后即得成品D-塔格糖。
2.根据权利要求1所述的D-塔格糖的制备方法，其特征是发酵培养基以g/100ml计：半乳糖1，葡萄糖0.5，蛋白胨1，酵母膏1，无水乙酸钠1，磷酸钾0.02，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，L-阿拉伯糖0.15，pH7.0。
3.根据权利要求1所述的D-塔格糖的制备方法，其特征是菌种选用植物乳杆菌AS1.557或戊糖乳杆菌BCRC15317。
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