CN109937048A

CN109937048A - 用2-单酰甘油分解酶的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法

Info

Publication number: CN109937048A
Application number: CN201780057429.6A
Authority: CN
Inventors: 金载雨
Original assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University
Current assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2019-06-25
Also published as: KR102011556B1; KR20180009630A; EP3488859A4; US11116822B2; EP3488859A1; WO2018016806A1; US20190351030A1

Abstract

本发明涉及利用2‑单酰甘油分解酶的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法，更详细地，提供利用2‑单酰甘油分解酶在消化道中将中性脂肪完全分解为脂肪酸和甘油来延迟脂肪吸收，降低血液中的中性脂肪的吸收，在消化道中用单酰甘油脂肪酶分解单酰甘油的情况下，尽管中性脂肪被吸收也可通过延迟消化道上皮细胞中的中性脂肪的重新结合或者促进此过程中的能量消耗来如治疗肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症等代谢综合征的方法。

Description

用2-单酰甘油分解酶的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法

技术领域

本发明涉及利用2-单酰甘油分解酶的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法，更详细地，提供利用2-单酰甘油分解酶在消化道中将中性脂肪完全分解为脂肪酸和甘油来延迟脂肪吸收，降低血液中的中性脂肪的吸收，在消化道中用单酰甘油脂肪酶分解单酰甘油的情况下，尽管中性脂肪被吸收也可通过延迟消化道上皮细胞中的中性脂肪的重新结合或者促进此过程中的能量消耗来如治疗肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症等代谢综合征的方法。

背景技术

最近，随着经济发展和饮食习惯等的变化，包括肥胖症、高血脂症、高血压、动脉硬化、高胰岛素血症、2型糖尿病、肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝等多种疾病的代谢综合征相关疾病的发病率急剧增加。这些疾病单独发生，但在一般情况下，大多数互相具有紧密的关系且多种症状一起出现。

肥胖症为威胁现代人健康的最强有力的疾病组。高度的肥胖症使胰岛素的感受性降低而诱发体内的各种代谢变化，最终，诱发血管系统、神经系统等多种综合征而死亡。因此，在医疗系统中非常重视可减少肥胖症的生活习惯或治疗肥胖症的药物开发。

肥胖症是由不均衡的能量摄取和能量使用导致的。在大脑的下丘脑有中枢，在体内由胰岛素激素或生长素释放肽等激素调节能量摄取。一旦被摄取而被消化道吸收的营养素绝不被排泄，而是用作能量或贮存在体内。因此，在肥胖症的治疗中，为开发作为抑制能量摄取的机制的肥胖症抑制剂做出了努力，并使用了如茯苓或诺美亭等食欲抑制剂。

减少能量摄取的另一种方法为在消化道中抑制脂肪吸收的方法。利用这种方法的药物有罗氏鲜，其为抑制作为其脂肪分解酶的脂肪酶的药物。在给药罗氏鲜的情况下，中性脂肪无法被分解，因此不被消化道吸收而随着大便排出。

第二种方法为增大能量使用的方法。通常人们应对肥胖症的方法为“少吃多运动”，因此，可以认为多做运动来增加能量消耗确实能够治疗肥胖症。最近，为了借助药物促进能量消耗而做出了各种努力，主要往通过增加存在于褐色脂肪的解偶联蛋白的表达来促进能量消耗的方向进行研究。

然而，抑制食欲的方法中，在大多数情况下，存在作用于中枢神经的药物必然对神经系统产生副作用且减少食欲会导致抑郁的问题，在消化道中抑制脂肪分解的罗氏鲜由于脂肪便和其恶臭等，患者们不太愿意使用，而且由于无法控制排便时间而带来社会生活上的不便。应用解偶联蛋白的能量消耗促进方法还处于开发阶段中，根据肠道信号的特殊性，在无法保障药物特异性之前，难以给人们利用。

并且，市售中的抗肥胖剂有噻唑烷二酮类(thiazolidinediones，TZDs)、罗氏鲜(韩国罗氏)以及西布曲明等，但据报道，这些药物具有心血管作用、中枢作用、肝功能障碍以及肾功能障碍等副作用。因此，急需开发即使长期服用也没有副作用且对肥胖症同时进行预防和治疗的高附加值的多功能产品。

另一方面，单酰甘油脂肪酶(monoacylglycerol lipase，MGL)将单酰甘油分解并形成游离脂肪酸及甘油。现有技术中报道过，在肠道内因单酰甘油脂肪酶的表达增加而导致由暴食引起的肥胖症表现型((Chon，et al.，FASEB，22:807，2008)，抑制单酰甘油脂肪酶有用于治疗疼痛、炎症以及中枢神经系统(central nervous system；CNS)障碍的治疗(Schlossburg et al.，Nat.Neurosci.，13(9):1113，2010)。这些研究报告均为单酰甘油脂肪酶在体内细胞中起作用时的现象，且没有报道过与在消化道内起作用时的相关内容，在人的消化道不存在单酰甘油脂肪酶活性。

对此，在本发明中，在使单酰甘油脂肪酶在消化道起作用的情况下，在消化道中将中性脂肪完全分解为脂肪酸和甘油来延迟脂肪吸收，可降低血液中的中性脂肪的吸收，在消化道中用单酰甘油脂肪酶分解单酰甘油的情况下，尽管中性脂肪被吸收也可通过延迟消化道上皮细胞中的中性脂肪的重新结合或者促进此过程中的能量消耗，因此，考虑可将2-单酰甘油分解酶用作肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症的预防或治疗剂的构想并证实其构想，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明为了解决如上所述的问题而提出，本发明的目的在于，提供利用2-单酰甘油分解酶的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法。

本发明的目的在于，提供包含2-单酰甘油分解酶的用于预防、改善或治疗肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症的组合物。

解决问题的手段

本发明为了解决如上所述的技术问题，本发明提供利用单酰甘油分解酶的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法。

并且，本发明提供利用单酰甘油分解酶的高血脂症或2型糖尿病的治疗方法。

并且，本发明提供利用单酰甘油分解酶的肥胖症的治疗方法。

并且，本发明提供包含单酰甘油分解酶的用于预防或治疗肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药学组合物以及用于预防或改善肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的健康功能食品组合物。

并且，本发明提供包含2-单酰甘油分解酶的用于预防或治疗高血脂症或2型糖尿病的药学组合物以及用于预防或改善高血脂症或2型糖尿病的健康功能食品组合物。

并且，本发明提供包含2-单酰甘油分解酶的用于预防或治疗肥胖症的药学组合物以及用于预防或改善肥胖症的健康功能食品组合物。

根据本发明的一实施例，上述2-单酰甘油分解酶可为特异性或非特异性地分解2-单酰甘油的脂肪酶。优选地，上述2-单酰甘油分解酶可为特异性地分解2-单酰甘油的脂肪酶。

根据本发明的再一优选实施例，特异性地分解2-单酰甘油的上述脂肪酶可为来源于选自由人、小鼠、酵母、霉以及细菌组成的组中的一种的2-位置特异性脂肪酶(2-position specific lipase)。

根据本发明的另一优选实施例，上述2-位置特异性脂肪酶可由序列7或序列8的氨基酸序列形成。

根据本发明的还有一优选实施例，上述2-位置特异性脂肪酶可由包含序列5或序列6的碱基序列的重组载体表达。

根据本发明的又一优选实施例，上述2-位置特异性脂肪酶可通过由上述重组载体转化的菌株而生成。

根据本发明的又一优选实施例，非特异性地分解2-单酰甘油的上述脂肪酶可为来源于选自由酵母、霉以及细菌组成的组中的一种的位置非特异性脂肪酶(positional non-specific lipase)。

根据本发明的又一优选实施例，上述2-单酰甘油分解酶可通过将2-单酰甘油完全分解为脂肪酸和甘油来降低2-单酰甘油被消化道上皮细胞吸收的吸收量。

根据本发明的又一优选实施例，上述2-单酰甘油分解酶将2-单酰甘油完全分解为脂肪酸和甘油，由于所分解的上述脂肪酸和甘油被吸收至消化道上皮细胞并重组成为中性脂肪的过程而能量消耗增加，此时，相比于在消化道上皮细胞中单酰甘油及脂肪酸重组成为中性脂肪的过程，可在上述能量消耗的增加过程中多消耗3个至4个ATP。

本发明提供用于制备肝脂肪变性(hepatic steatosis)、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症治疗用药剂的2-单酰甘油分解酶的用途。

发明的效果

本发明的包含2-单酰甘油分解酶的组合物在消化道中将中性脂肪完全分解为脂肪酸和甘油来延迟脂肪吸收，具有降低血液中的中性脂肪的吸收的效果，在消化道中用2-单酰甘油脂肪酶分解2-单酰甘油的情况下，尽管中性脂肪被吸收也可通过延迟消化道上皮细胞中的中性脂肪的重新结合或者促进此过程中的能量消耗，因此，可应用于预防、改善或治疗肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症等的准药品及健康功能食品。

附图说明

图1为示出中性脂肪的结构的示意图。

图2为示出在消化道中的中性脂肪的消化及吸收过程的示意图，由其脂肪酶分解的两个脂肪酸和单酰甘油被吸收至消化道上皮细胞，并在消化道上皮细胞重新结合为中性脂肪而以乳糜微粒的形态游离到淋巴系统。

图3为示出消化中性脂肪后在消化道上皮细胞被吸收的脂肪的中性脂肪重新合成路径的示意图，在存在单酰甘油脂肪酶(monoacylglycerol lipase，MGL)的情况下，中性脂肪分解为3个脂肪酸和甘油，因此，在消化道上皮细胞重新形成中性脂肪时消耗更多的能量。

图4示出人和小鼠的单酰甘油脂肪酶(MGL)基因库编号及氨基酸序列。

图5示出为了大量生产单酰甘油脂肪酶(MGL)而制成的细菌表达载体系统。

图6为示出单酰甘油脂肪酶(MGL)的分离纯化后实施SDS-PAGE的结果的数据，1表示透析前的蛋白质，2表示透析后的蛋白质。

图7为示意性示出单酰甘油脂肪酶(MGL)的纯分离纯化过程的图。

图8为示出向6周龄的小鼠分别给药猪胰脏的脂肪酶(对照组)和褶皱假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶(实验组)7周后出现的体重变化的曲线图。

图9为示出在给药橄榄油的小鼠中出现由单酰甘油脂肪酶(MGL)产生的血液中的中性脂肪的浓度变化的数据。

图10为对在给药橄榄油的小鼠中出现的由单酰甘油脂肪酶(MGL)产生的血液中的中性脂肪的浓度变化按时间检测的图，根据Tyroxapol的给药与否来表示。

图11为给药单酰甘油脂肪酶后1小时和2小时后致死小鼠来检测作用于小肠内的酶的活性的结果。

图12为利用作为人小肠上皮细胞株的Caco-2示出小肠上皮细胞脂肪重新结合能力随着单酰甘油脂肪酶的给药而减少的结果。

图13a为示意性示出在向肥胖症诱发的ob/ob小鼠给药单酰甘油脂肪酶(MGL)4周的实验中试样的给药计划。

图13b为示出在图13a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠状态的照片。

图13c示出在图13a的实验中BSA给药组和MGL给药组的饮食量。

图13d示出在图13a的实验中BSA给药组和MGL给药组的大便的脂肪量。

图13e为示出在图13a的实验过程中BSA给药组和MGL给药组的体重变化的曲线图。

图13f为示出在图13a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的对小鼠进行葡萄糖耐量试验的结果的曲线图。

图13g为对在图13a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠的肝脏(liver)和内脏脂肪(epididymal fat，Epi-WAT)的重量进行检测的曲线图。

图14a为示出从在图13a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠取出肝脏的状态(上方)和在组织显微镜下观察的照片(下方)。

图14b为对图14a肝脏的中性脂肪和胆固醇水平进行检测的曲线图。

图14c为示出从在图13a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠取出附睾周围脂肪组织的状态(上方)和在组织显微镜下观察的照片(下方)。

图14d为对图14c脂肪组织的脂肪细胞的平均大小进行检测的曲线图。

图15a为示出在图13a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠的腹股沟脂肪(inguinal fat)中的中性脂肪合成基因和脂肪酸合成基因的表达变化的曲线图。

图15b为示出在图13a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠的腹股沟脂肪(inguinal fat)中脂肪酸运输基因、转录基因以及氧化基因的表达变化的曲线图。

图16a示意性示出在向供给高脂肪饮食的C57BL/6小鼠给药BSA或MGL的实验中试样的给药计划。

图16b为示出在图16a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠状态的照片。

图16c示出在图16a的实验中BSA给药组和MGL给药组的饮食量。

图16d示出在图16a的实验中BSA给药组和MGL给药组的大便的脂肪量。

图16e为示出在图16a的实验过程中BSA给药组和MGL给药组的体重变化的曲线图。

图16f为示出在图16a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的对小鼠进行葡萄糖耐量试验的结果的曲线图。

图16g为对在图16a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠的肝脏(liver)和内脏脂肪(epididymal fat，Epi-WAT)的重量进行检测的曲线图。

图17a为示出从在图16a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠取出肝脏的状态(上方)和在组织显微镜下观察经H&E染色的照片(中间)和经油红O(oil-red O)染色的照片(下方)。

图17b为对图17a肝脏的中性脂肪和胆固醇水平进行检测的曲线图。

图17c为示出从在图16a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠取出附睾周围脂肪组织的状态(上方)和在组织显微镜下观察的照片(下方)。

图17d为对图17c脂肪组织的脂肪细胞的平均大小进行检测的曲线图。

图17e为对在图16a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠的血液中的中性脂肪及血液中胆固醇值进行测定的曲线图。

图17f为对在图16a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠中作为肝功能数值的ALT和AST进行测定的曲线图。

图17g为对在图16a的实验结束之后BSA给药组和MGL给药组的小鼠的血液中GLP-1水平进行检测的曲线图。

图18为向C57BL/6小鼠给药本发明的MGL或罗氏鲜(orlistat，ORL)3周后对体重、大便的脂肪量以及大便的胆固醇量进行检测的曲线图。

图19为示出从在图18的实验中在罗氏鲜给药组中死亡的小鼠上发现的胆囊病变照片。

具体实施方式

以下，更详细地说明本发明。

如上所述，用作肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症的治疗剂的药物存在诱发如心脏疾病、呼吸道疾病、血压升高以及失眠症等副作用且其功效的持续性低的问题。因此，急需开发没有副作用且预防和治疗代谢综合征以及通过降低氧化应激来兼备多种疾病的预防效果和治疗效果的高附加值的多功能产品。

对此，本发明通过提供包含2-单酰甘油分解酶的用于预防、改善和/或治疗肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的组合物以及利用上述2-单酰甘油分解酶的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法来摸索如上所述的问题的解决方案。本发明提供的组合物在消化道中将中性脂肪完全分解为脂肪酸和甘油来延迟脂肪吸收，具有降低血液中的中性脂肪的吸收的效果，因此，可应用于预防、改善或治疗肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症的准药品及健康功能食品。

肥胖症使血压及血糖升高，增加血压中的中性脂肪且减少HDL胆固醇，进一步提高代谢综合征的危险性，最终会增加心血管疾病的危险性。上述代谢综合征(metabolicsyndrome)是指在同一个人上同时多发性地发生腹部肥胖症、糖尿病、血脂异常症(中性脂肪上升，高密度胆固醇下降)、高血压等。即，本发明的包含2-单酰甘油分解酶的组合物可用作肝脂肪变性，非酒精性脂肪肝，高血脂症，2型糖尿病和/或肥胖症的预防或治疗剂，因此，也可以用作脂质相关代谢综合征疾病的治疗剂。

单酰甘油脂肪酶可降低血液中的中性脂肪，在上述单酰甘油脂肪酶存在于肠内的情况下，2-单酰甘油完全分解为脂肪酸和甘油，单酰甘油及脂肪酸被吸收至消化道上皮细胞，从而可延迟重新合成为中性脂肪的过程。

并且，2-单酰甘油借助上述2-单酰甘油分解酶完全分解为脂肪酸和甘油，由于所分解的上述脂肪酸和甘油被吸收至消化道上皮细胞并重新合成为中性脂肪的过程而能量消耗增加，此时，相比于在消化道上皮细胞中单酰甘油及脂肪酸重新合成为中性脂肪的过程，可在上述能量消耗的增加过程中多消耗3个至4个ATP。

本发明出于考虑在消化道中的营养素吸收和代谢路径的特性的反向构思，是建立在通过更加促进在消化道中的中性脂肪消化来减少脂肪吸收并促进能量消耗的机制基础之上的。

如图1所示，中性脂肪具有在甘油结合有3个脂肪酸的形态，在人的消化道中分解中性脂肪的酶在其中分解的脂肪酶具有代表性。但是，上述脂肪酶为不完整的脂肪酶，虽然分解1号和3号的脂肪酸，但不能游离与2号结合的脂肪酸，因此，通过该酶生成的产物存在2个脂肪酸和1个单酰甘油。

在上述两个脂肪酸和单酰甘油重新结合为中性脂肪的过程中，存在于消化道上皮细胞的称为MGAT2的酶起作用，如图3中上方所示，上述酶在单酰甘油粘贴一个脂肪酸来形成甘油二酯，所形成的甘油二酯即称为中性脂肪。以这种方式重新形成中性脂肪后需要形成乳糜微粒形态的蛋白质才能够分泌至淋巴系统或血管系统而以被溶解的状态循环。

如图3中下方所示，在上述代谢路径中，若假设使用单酰甘油脂肪酶来分解为脂肪酸和甘油，则最终会导致中性脂肪的重新形成路径改变。甘油需要通过消耗能量来进行磷酸化，并在其中粘贴两个脂肪酸成为磷脂酸后，可通过磷酸被掉落并形成甘油二酯的过程来重新形成中性脂肪。相比于2-单酰甘油直接形成中性脂肪的过程，可在上述过程中多消耗3个至4个ATP，因此，可通过促进能量消耗来预防或治疗肥胖症。

即，在本发明中，通过口服给药2-单酰甘油分解酶来在消化道内将中性脂肪完全分解为脂肪酸和甘油，并通过促进脂肪的吸收及重新形成延迟/能量消耗来治疗肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症。

因此，本发明提供利用2-单酰甘油分解酶的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法；包含2-单酰甘油分解酶的用于预防或治疗肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的药学组合物；或者用于预防或改善肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的健康功能食品组合物。

并且，本发明提供利用2-单酰甘油分解酶的高血脂症或2型糖尿病的治疗方法；包含2-单酰甘油分解酶的用于预防或治疗高血脂症或2型糖尿病的药学组合物；或者用于预防或改善高血脂症或2型糖尿病的健康功能食品组合物。

并且，本发明提供利用2-单酰甘油分解酶的肥胖症的治疗方法；包含2-单酰甘油分解酶的用于预防或治疗肥胖症的药学组合物；或者用于预防或改善肥胖症的健康功能食品组合物。

在本发明的方法或组合物中，只要是能够将2-单酰甘油完全分解为脂肪酸和甘油，对上述2-单酰甘油分解酶的使用没有特别限制，优选地，可为特异性分解2-单酰甘油的脂肪酶。

对特异性地分解2-单酰甘油的脂肪酶的来源没有特别限制，例如，可为来源于选自由人、小鼠、酵母、霉以及细菌组成的组中的一种的2-位置特异性脂肪酶(2-positionspecific lipase)。

本发明的术语“2-位置特异性脂肪酶(2-position specific lipase)”是指仅对甘油三酯的2-位置上的脂肪酰基产生反应特异性的脂肪酶。

在本发明的一优选实施例中，为了制备2-位置特异性脂肪，将来源于人或小鼠的单酰甘油脂肪酶(MGL)基因序列导入重组载体中并利用可大量表达上述单酰甘油脂肪酶蛋白的E.coli系统表达蛋白质来对一部分进行纯化，利用His-tag使对靶蛋白的纯化变得容易。但是，除人或小鼠以外，只要是编码2-位置特异性脂肪酶的基因序列，可无限制地使用。

图4示出人和小鼠的单酰甘油脂肪酶(MGL)基因库编号及氨基酸序列，根据需要，可通过改变如图4所示的来源于人或小鼠的单酰甘油脂肪酶的部分氨基酸序列来增加酶的活性，并可通过改变单酰甘油脂肪酶的一部分碱基序列来增加在重组微生物中单酰甘油的生成。

图5示出为了大量生产单酰甘油脂肪酶(MGL)而制成的细菌表达载体系统，利用其大量生产蛋白质后观察结果，如图6所示，成功分离了单酰甘油脂肪酶(MGL)。如图7所示，通过用于纯分离单酰甘油脂肪酶的柱纯化工序来导出由此蛋白质特殊化的蛋白质的大量生产过程。

在本发明的组合物中，对非特异性地分解2-单酰甘油的上述酶的来源没有特别限制，但例如，可以为来源于选自由酵母、霉以及细菌组成的组中的一种的位置非特异性脂肪酶(positional non-specific lipase)。

本发明中的术语“位置非特异性脂肪酶(non-specific lipase)”是指与甘油三酯的三种脂肪酰基均产生反应的脂肪酶。

在本发明的另一实施例中，虽然使用来源于褶皱假丝酵母的脂肪酶作为位置非特异性脂肪酶，但除了褶皱假丝酵母之外，还可以使用来源于其他酵母、霉、细菌等微生物的位置非特异性脂肪酶。

图8为示出向6周龄的小鼠给药来源于褶皱假丝酵母的脂肪酶供6周后检测体重变化的结果。由于2-位置特异性脂肪酶仅特异性地作用于2-单酰甘油，相比于位置非特异性脂肪酶，2-位置特异性脂肪酶具有更优秀的基质特异性及分解活性，从而可更有效地治疗肥胖症。因此，2-位置特异性脂肪酶即使不与其他额外成分组合使用也可以通过单独使用来有效治疗肥胖症。

图9为示出在给药橄榄油的小鼠中出现由单酰甘油脂肪酶(MGL)产生的血液中的中性脂肪的浓度变化的数据，图10为对在给药橄榄油的小鼠中出现的由单酰甘油脂肪酶(MGL)产生的血液中的中性脂肪的浓度变化按时间检测的图。由其结果可确认，通过给药单酰甘油脂肪酶有效减少血液中的中性脂肪，并可利用为高血脂症治疗剂。

图11和图12分别为示出给药单酰甘油脂肪酶后作用于小肠内和在作为人小肠上皮细胞株的Caco-2细胞中脂肪重新结合延迟效果的结果。

图13a至图13g为在向肥胖症诱发的ob/ob小鼠给药单酰甘油脂肪酶(MGL)4周后对体重变化(图13b及图13e)、饮食量变化(图13c)、大便的脂肪量(图13d)、葡萄糖耐量试验结果(图13f)以及肝脏(liver)和内脏脂肪(epididymal fat，Epi-WAT)的重量(图13g)进行检测的图。并且，图14a至图14d为图13a实验的延续，为示出在向肥胖症诱发的ob/ob小鼠给药单酰甘油脂肪酶(MGL)4周后对肝脏的状态(图14a)、上述肝脏的中性脂肪和胆固醇水平(图14b)、附睾周围脂肪组织的状态(图14c)以及上述脂肪组织的脂肪细胞平均大小(图14d)的图。

可通过上述实验结果确认由MGL的给药引起的体重减少和由肝脏的大小呈现的脂肪肝的减少、肝脏脂肪的减少。由此可知，若长期给药单酰甘油脂肪酶，则对肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的缓解和体重减少产生效果，这表示可将单酰甘油脂肪酶用作肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗剂和肥胖症治疗剂。

并且，确认了单酰甘油脂肪酶的给药无法改变饮食量，且不产生如脂肪便等副作用。脂肪便为由以往的肥胖症治疗剂之一的罗氏鲜引起的严重的副作用，而本发明的单酰甘油脂肪酶完全不会产生这种副作用且产生相比于总体重减少15％的效果，作为肥胖症治疗剂发挥卓越的功效。

直接比较图8和图13e的结果，图8示出将作为位置非特异性脂肪酶的一种的来源于褶皱假丝酵母的脂肪酶以2000单位/日给药后产生的体重减少效果，图13e示出将作为2-位置特异性脂肪酶的单酰甘油脂肪酶以约100单位/日给药后产生的体重减少效果，上述两个实施例中的效果相似，均呈现出约3g左右的体重减少效果。这表示(1)在以单酰甘油作为机制的反应中2-位置特异性脂肪酶的每蛋白质活性高于(50～100倍)非特异性脂肪酶的每蛋白质活性，(2)对2-单酰甘油的非特异性脂肪酶的亲和力比2-位置特异性脂肪酶差，(3)2-位置特异性脂肪酶对基于生理性消化液的中性脂肪分解不产生影响，因此不会产生不需要被吸收的中性脂肪反而被分解的现象。这些事实意味着2-位置特异性脂肪酶比非特异性脂肪酶可具有更优秀的治疗效果。

同时，向肥胖症诱导的ob/ob小鼠给药本发明的单酰甘油脂肪酶4周后进行葡萄糖耐量试验的结果，单酰甘油脂肪酶的给药使肥胖症得到缓解，由此确认，如图13f所示，体内代谢得到改善而使葡萄糖处理能力得到提高。这种结果表示本发明的单酰甘油脂肪酶的给药可与如2型糖尿病等代谢综合征的治疗有关联。

图15a及图15b也为图13a实验的延续，图15a示出在BSA给药组和MGL给药组的小鼠的可称为皮下脂肪的腹股沟脂肪(inguinal fat)中的中性脂肪合成基因和脂肪酸合成基因的表达变化，图15b示出在腹股沟脂肪(inguinal fat)中脂肪酸运输基因、转录基因以及氧化基因的表达变化。由此可知，在MGL给药组中没有出现中性脂肪合成及脂肪酸合成基因的表达变化或者在MGL组中反而有所增加，且可知，脂肪酸运输基因也呈现出类似的图案。这种结果表示，在MGL给药组中脂肪蓄积减少是因为在消化道中的吸收变少或被消耗，而不是由中性脂肪合成或运输或脂肪酸合成的减少而导致的结果。特殊点在于，PGC1和UCP1的表达在MGL给药组中明显增加，这意味着白色脂肪被棕色化且能量消耗有所增加。

图16a至图16g示出在向供给高脂肪饮食的C57BL/6小鼠给药MGL后对体重变化(图16b及图16e)、饮食量变化(图16c)、大便的脂肪量(图16d)、葡萄糖耐量试验结果(图16f)以及肝脏(liver)和内脏脂肪(epididymal fat，Epi-WAT)的重量(图16g)进行检测的结果。如诱发肥胖症的ob/ob小鼠中的结果(图13b至图13g)，同样确认了MGL的给药产生相比于总体重减少约15％左右的体重减少效果，没有出现饮食量变化，也没有产生如脂肪便等副作用。并且，确认了葡萄糖耐量试验中耐糖能力得到提高，肝脏的重量和脂肪组织的重量也减少了很多。

图17a至图17g为图16a实验的延续，为示出在向供给高脂肪饮食的C57BL/6小鼠给药MGL后对肝脏的状态(图17a)、上述肝脏的中性脂肪和胆固醇水平(图17b)、附睾周围脂肪组织的状态(图17c)以及上述脂肪组织的脂肪细胞平均大小(图17d)、血液中的中性脂肪和胆固醇值(图17e)、作为肝功能数值的ALT和AST(图17f)以及血液中GLP变化(图17g)进行检测的结果。由此可知，相比于，在MGL给药组中脂肪肝明显得到改善，肝脏的中性脂肪量大大减少，胆固醇值也有所减少。并且，可确认脂肪组织及脂肪细胞的大小变小，平均脂肪细胞大小也变小，血液中的中性脂肪有所减少。如ALT及AST等肝功能数值也减少了很多，可对饮食产生影响的GLP-1中没有出现变化。

图18为示出本发明的MGL给药组与以往的公知为肥胖症治疗剂的罗氏鲜(ORL)给药组的比较实验的结果，经确认，在MGL给药组和ORL给药组中观察到相似程度的体重减少效果，但大便的脂肪量及胆固醇量在ORL给药组中明显高。进一步对在ORL给药组中在实验过程中死亡的4只小鼠进行解剖的结果，如图19所示，胆囊变黑，这被判断为由罗氏鲜引起的副作用症状中的色素性胆结石(pigmented gall stone)。

通过以上结果可确认，若给药本发明的MGL，则产生卓越的抗肥胖症效果及脂肪肝治疗效果。尤其，本发明的MGL通过4周的给药产生相比于总体重减少15％的体重减少效果，当给药正在开发使用中的抗肥胖剂1年时，若考虑到产生8～11％的体重减少效果则为好药，则可判断为在本发明的小鼠实验中所证实的结果几乎达到最大值的效果。进一步地，相比于目前用作肥胖症治疗剂的罗氏鲜的效果，MGL为与罗氏鲜具有不同性状的药物，由于无法定义最佳剂量，无法掌握对体重减少效果的比较优势，但在本发明的MGL中从未出现作为罗氏鲜的致命性缺点的脂肪便及胆囊病变，因此，暗示了本发明的MGL为可代替以往的肥胖症治疗剂的优秀的药物。

可将本发明的包含2-单酰甘油分解酶的用于预防或治疗肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症的药学组合物通过口服给药方式给药到鼠、小家鼠、家畜、人类等哺乳动物。并且，可将本发明药学组合物制剂化成多种剂型。在进行制剂化的情况下，在不阻碍2-单酰甘油分解酶的活性的范围内，可通过使用通常使用的填充剂、增量剂、键合剂、湿润剂、崩解剂以及表面活性剂等稀释剂或赋形剂来进行试剂化。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂以及胶囊剂等，这种固体制剂可通过在单酰甘油脂肪酶中混合一种以上赋形剂(例如，淀粉、蔗糖、乳糖以及明胶)等来制备而成。优选地，为了防止2-单酰甘油分解酶的活性被胃酸和胃液破坏而可使用涂敷制剂，并且，除了简单的赋形剂之外，还可以使用多种润滑剂。作为用于口服给药的液相制剂，可举例悬浮剂、内用液剂、乳剂以及糖浆剂等，可包括除了作为通常使用的简单的稀释剂的水、液体石蜡之外的各种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂以及保存剂等。用于胃肠外给药的制剂可包括灭菌的水溶液、非水溶性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂以及栓剂。作为非水溶性溶剂和悬浮剂溶剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油等植物油、如油酸乙酯等可注射的酯等。作为栓剂的机制，可使用甘油及明胶等。

本发明的包含2-单酰甘油分解酶的药学组合物的给药量可根据患者的年龄、性别、体重而不同，通常，可将1单位/㎏至500单位/㎏的量分为一天一次至数次来进行给药，1单位表示在pH 7.4、37℃的温度条件下将1μ摩尔的单酰甘油完全分解1小时的量。并且，包含单酰甘油脂肪酶的组合物的给药量可随着给药路径、疾病的程度、性别、体重、年龄等而增减。因此，上述给药量在任何方面上都不限定本发明的范围。

并且，对包含本发明的包含2-单酰甘油分解酶的用于预防或改善肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症的健康功能食品组合物的健康功能食品种类没有特别限定，例如，可为肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、点心类、饼干类、披萨、拉面、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋类在内的乳制品、各种汤、饮料、茶、维他命饮料、酒精饮料以及维他命复合剂等。

上述健康食品除了上述单酰甘油脂肪酶之外还与其他食品或食品添加剂一起使用，可根据常规的方法适当使用。例如，包含上述2-单酰甘油分解酶的非酒精性脂肪肝预防用饮料除了包含2-单酰甘油分解酶之外，还可以添加钙、带刺五加皮浓缩液、液相果糖、纯化水等进行混合后填充至饮料瓶并杀菌后在室温下冷却来制备饮料。并且，包含上述2-单酰甘油分解酶的用于预防肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症的健康助剂可通过在单酰甘油脂肪酶中添加营养辅助成分(维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素E、醋酸酯以及烟酰胺)、低聚糖、50％的乙醇、纯化水并进行混合，成形为颗粒状并在真空干燥机干燥后，将其通过12～14目(mesh)来均匀地制备颗粒并以适量进行压缩成形，从而制成片剂或粉末，或者可通过填充至硬质胶囊中来制成硬质胶囊制品。

上述健康食品中含有的上述2-单酰甘油分解酶的有效剂量能够以上述药学组合物的有效剂量为基准来使用，有效成分的混合量可根据预防或治疗性处置等使用目的而适当地决定。在以健康及卫生为目的或以健康调节为目的而长期摄取的情况下，可在上述范围之下。

在本发明中，“对象”为动物，优选地为哺乳动物，尤其，可为包括人类在内的动物，也可以为来源于动物的细胞、组织、器官等。上述对象可以为需要治疗的患者。

以下，参照本发明的优选实施例进行详细的说明，以使本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施。但是，本发明能够以多种不同的形式实现，而并不限定于在这里说明的实施例。

本发明的实施方式

实施例1.单酰甘油脂肪酶蛋白的制备及纯化

1-1：制备重组载体及重组微生物

在本发明中，为了制备单酰甘油脂肪酶蛋白，利用了可表达大量蛋白质的E.coli系统及His-tag，将来源于人的单酰甘油脂肪酶mRNA(Genebank Number：NM_001003794)及来源于小鼠的单酰甘油脂肪酶mRNA(Genebank Number：NM_011844)的开放阅读框(openreading frame；ORF)部分克隆到pT7-HMT(His-Myc-TEVprotease)载体(Geisbrecht BV etal.，Protein Expression Purif46:23-32，2006)。

上述pT7-HMT载体为将6个His-tag与靶蛋白融合来在细菌中表达的载体，所表达的蛋白质具有可容易纯化的特征，由于利用TEV protease，具有在必要时可分离出tag的优点。

首先，将可扩增来源于人或小鼠的单酰甘油脂肪酶mRNA的ORF部分(ATG起始密码子除外)的引物制成如下列表1所示，为了可将所扩增的基因插入于载体中，以包含限制酶部位的方式制作。

表1

引物序列

(下划线部分表示限制酶作用的部分)

从脂肪组织提取来源于人或小鼠的总RNA，将其作为模板并使用上述表1中的各个引物对来执行PCR(Polymerase chain reaction)。确认PCR扩增产物的序列结果，人的单酰甘油脂肪酶基因由序列5表示，来源于小鼠的单酰甘油脂肪酶基因由序列6表示(表2)。

表2

基因序列信息

将上述所扩增的来源于人或小鼠的单酰甘油脂肪酶基因分解为NdeI(Cat.No.R0111S；New England BioLabs，美国)或SalI(Cat.No.R0138S；New EnglandBioLabs，美国)及XhoI(Cat.No.R0146S；New England BioLabs，美国)后，导入至切割相同部位的pT7-HMT载体来制备重组载体。在此情况下，，可将6个His-tag利用于蛋白质的纯化，将Myc-tag利用于在之后的基于蛋白质印迹分析法的蛋白质检测中。并且，必要时，以可适用TEV protease来去除His-Myc-tag的方式设计。

1-2：生产及纯化单酰甘油脂肪酶蛋白

之后，将上述重组载体转化到作为大肠杆菌的BL21(DE3)pCodon plus菌株。将上述菌株接种至含有卡那徽素(kanamycin)、氯霉素以及2％的乙醇的500ml的LB培养基中培养，直到600nm的吸光度变成0.5～0.6，然后，为了表达蛋白质，添加1mM的IPTG并在16℃的温度下还培养16小时。

通过离心分离从培养液获得菌并使其悬浮在裂解液(Lysis buffer)(50mM的Tris-Cl，pH8.0，500mM的NaCl，5mM的咪唑(imidazole)，pH8.0)，添加1％的Triton X-100后通过包含lysozyme的冷冻-解冻方法粉碎菌来制备蛋白质均等液。通过超声波粉碎法分解核酸并进行离心分离后，利用Ni-NTA琼脂糖小球(Ni-NTA agarose bead)(Cat.No.30210，Qiagen，美国)将His-Myc-MGL融合蛋白结合在柱。为了去除在溶解细菌过程中产生的内毒素(endotoxin)，利用包含0.1％的Triton X-114的冲洗缓冲液(washing buffer)以50柱体积清洗柱，之后，利用不包含Triton X-114的冲洗缓冲液以10柱体积清洗柱。

进行多种测试结果，利用EDTA来洗脱附着于柱的蛋白质，而不是利用咪唑。之后用200倍的50mM的Tris-Cl，pH 8.0来对使用洗脱液(150mM的EDTA，pH 8.0，150mM的NaCl，50mM的Tris-Cl，pH 8.0)获得的蛋白质进行透析并称为“crude MGL”来利用于实验中。

图6为示出来源于小鼠的单酰甘油脂肪酶(MGL)的分离纯化后实施SDS-PAGE的结果的数据，经确认，在本发明中纯化的来源于小鼠的单酰甘油脂肪酶(MGL)的大小为约33kDa，与实际小鼠单酰甘油脂肪酶具有相同的大小。

对于需给药到动物的单酰甘油脂肪酶，通过如图7所述的工序依次适用HiTrapPhenyl HP、HiTrap SP、HiTrapQ柱纯化上述crude MGL，使其变得更纯。

实施例2.单酰甘油脂肪酶蛋白的活性检测

在本发明中，为了检测在实施例1中纯化的来源于小鼠的单酰甘油脂肪酶的活性，将分离的蛋白质与作为其基质的oleoyl-rac-glycerol(Cat.No.M7765，Sigma，美国)进行反应，将由此游离的甘油(glycerol)使用甘油检测试剂盒(Glycerol assay kit)(Cat.No.MAK117，Sigma，美国)并参照试剂盒中所附的说明书来进行检测。将1单位定义为在pH 7.4、37℃的温度条件下将1μ摩尔的单酰甘油完全分解1小时的量。此活性检测法中参照甘油标准(glycerol standard)来计算其量。

并且，利用Pierce^TMBCA assay kit(Cat.No.23225，ThermoFisher Scientific，美国)检测蛋白质的浓度，也计算了每mg的活性度。

利用Pierce^TMLAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit(Cat.No.88282，ThermoFisher Scientific，美国)检测可残留在蛋白质的内毒素(endotoxin)。

以如上所述的方法检测的来源于小鼠的单酰甘油脂肪酶显示如下的结果：

浓度：3～5mg/ml，共300～500mg/40升培养基

活性度：30～100单位/mg蛋白质(protein)

内毒素<10EU/ml(*EU，内毒素单位(endotoxin单位))。

实施例3.2-单酰甘油的分解和肥胖症减少效果

在本实施例中，确认了由2-单酰甘油分解酶产生的肥胖症减少效果。具体地，将1,3-特异性脂肪酶作为猪胰脏的脂肪酶(L3126，Sigma，美国)作为对照组，选择褶皱假丝酵母脂肪酶(L1756，Sigma，美国)作为非特异性脂肪酶并通过强饲法向ob/ob小鼠(中央实验动物，韩国)给药7周。其结果，如图8所示，作为非特异性脂肪酶的C.rugosa的脂肪酶相比于对照组体重稍微减少。

实施例4.由单酰甘油脂肪酶的给药产生的血液中的中性脂肪减少效果

在本发明中，为了确认实际血液中的中性脂肪是否由在实施例1中制备的小鼠单酰甘油脂肪酶减少，向小鼠口服给药单酰甘油脂肪酶，在实施例2的活性检测结果的基础上，向小鼠给药单位(单位)左右。

首先，使C57BL6/J小鼠禁食4小时以上后，通过利用管的强饲法(gavage)给药250μl的橄榄油，同时向对照组给药250μl的食盐水，向实验组给药250μl的单酰甘油脂肪酶蛋白。

在2小时之后，致死小鼠并采血后分析血液中的中性脂肪的量，使用甘油三酯比色分析试剂盒(Triglyceride Colorimetric Assay Kit)(Cat No 10010303，Cayman，美国)并按照试剂盒中所附的说明书在500nm的吸光度下进行检测。其结果，如图9所示，在给药单酰甘油脂肪酶的小鼠组中，血液中的中性脂肪大大减少。由此可确认，本发明的单酰甘油脂肪酶在消化道中将中性脂肪完全分解为脂肪酸和甘油，从而具有减少中性脂肪在血液中的吸收的效果。

并且，将如上所述的实验按时间段进行检测的结果，如图10所示，相比于生理食盐水给药组，在单酰甘油脂肪酶给药组中的脂肪的吸收非常低(图10的左侧)，在给药Tyloxopol来防止血液中的脂肪游离到脂肪组织中的实验中更明显(图10的右侧)。

实施例5.小肠中的单酰甘油脂肪酶活性度检测

在本实施例中，为了证明在上述实施例4中证实的脂肪吸收减少效果实际上是单酰甘油脂肪酶起作用的结果，在小肠中对经过口服给药的小鼠单酰甘油脂肪酶的活性度进行检测。

在给药生理食盐水或单酰甘油脂肪酶后1小时或2小时之后，致死小鼠并将小肠中的空肠(jejunum)部位分为近位部和远位部(distal)来进行解剖，并将其浸泡在PBS中来使小肠内的物质溶出至PBS。在这里，利用实施例2中的方法来检测单酰甘油脂肪酶的活性。

其结果，如图11所示，可观察到给药单酰甘油(MGL)的组在口服给药后1小时后从近位部移动至远位部，其中所残留的蛋白质的总活性相当于口服给药的蛋白质的1/5～1/10。这意味着虽然所给药的单酰甘油脂肪酶被胃酸或胃液破坏，但至少相当于1/10的酶活性在小肠中起作用。因此，这表明在小鼠实验中需要给药过量，而不是给药体内需要量。之后，可通过涂敷制剂等方法来从胃酸或胃液中保护单酰甘油脂肪酶。

实施例6.由单酰甘油脂肪酶产生的小肠细胞的中性脂肪重新结合延迟效果

在本实施例中，为了证明在上述实施例4和实施例5中确认的中性脂肪吸收延迟效果实际上是通过延迟在小肠细胞的中性脂肪重新结合及血液中游离过程而产生，利用作为人的小肠细胞株的Caco-2细胞来进行实验。

如图12所示，该培养系统为将小肠管侧放置成顶端侧后给药消化脂肪和在实施例1中制备的小鼠单酰甘油脂肪酶蛋白并将血液侧放置成基底侧来检测置于它们之间的小肠上皮细胞是否可在消化道中吸收脂肪而游离到血液中的系统。

将Caco-2细胞分化21天，以两侧培养基不通过细胞是无法混合的方式分化后，通过电阻测量法来确认细胞之间的是否连接好，然后，向小肠管侧给药油酸(oleic acid)和十八烯酸单甘油酯(monooleoylglycerol)，并给药生理食盐水或单酰甘油脂肪酶。在培养基中放置17小时后，回收血液侧培养基并通过ELISA方法检测包含在该培养基中的作为脂蛋白表变蛋白质的ApoB蛋白。

其结果，如图12的右侧曲线图所示，在单酰甘油脂肪酶给药组中，ApoB的检测量非常低，这直接证明，若通过该酶阻碍单酰甘油的吸收，则可延迟或减少小肠上皮细胞的血液中的脂肪游离。

实施例7.肥胖症诱发小鼠中单酰甘油脂肪酶的给药效果

7-1.由单酰甘油脂肪酶给药引起的体重、饮食量变化以及脂肪便确认

在本实施例中，确认了在给药在上述实施例1中制备的小鼠单酰甘油脂肪酶4周的肥胖症ob/ob小鼠中是否出现体重减少或体重增加延迟效果。以因胰岛素激素基因的突变而食欲抑制变迟钝并呈现肥胖症形质的ob/ob小鼠(中央实验动物，韩国)作为对象，通过口服强饲法(oral gavage)向8周龄的小鼠每天给药约100单位/日的单酰甘油脂肪酶4周。为了统一饲料的摄取和单酰甘油脂肪酶的作用时点，在白天周期(light cycle)进行禁食后在夜间周期(dark cycle)开始饮食之前给药MGL(图13a)。

其结果，如图13b及图13e所示，给药单酰甘油脂肪酶后体重明显减少，4周后产生相比于总体重减少15％的效果。

若在小肠内分解单酰甘油而使脂肪吸收延迟，则饮食量也能够发生变化，可想到大量脂肪随着大便排出而诱发脂肪便的可能性，为了观察此现象，在给药单酰甘油脂肪酶的过程中检测饮食量，并且，随机采取大便来观察脂肪含量。其结果，MGL给药组与BSA给药组之间的饮食量和大便的脂肪量相似(图13c及图13d)，没有出现由单酰甘油脂肪酶的给药产生的饮食量变化，也没有出现如脂肪便等副作用。这表示阻碍脂肪吸收的作用中伴随着促进小肠中的能量消耗，与如罗氏鲜(成分名：奥利司他(orlistat))等药物抑制脂肪吸收的机制不同，也没有脂肪便副作用。

综合上述结果与实施例4至实施例6的结果，在小鼠中单酰甘油脂肪酶的给药延迟或减少小肠上皮细胞的中性脂肪的重新结合，因此，游离到血液中而使蓄积在脂肪组织的脂肪量减少，从而减少体重。这意味着，由上述酶阻碍单酰甘油吸收，因此可将单酰甘油脂肪酶利用为肥胖症治疗剂。

7-2.葡萄糖耐量试验

在上述实施例7-1中，以给药BSA或单酰甘油脂肪酶的小鼠作为对象来进行葡萄糖耐量试验。以体重腹腔注射方式向给药单酰甘油脂肪酶的小鼠给药1.5mg/g的葡萄糖，耐量前、耐量后15分钟、30分钟、60分钟以及120分钟时采血并检测血糖值。

其结果，如图13f所示，葡萄糖耐量试验结果大大提高。这种结果暗示可将单酰甘油脂肪酶使用于如糖尿病等代谢综合征治疗中。

7-3.由单酰甘油脂肪酶给药产生的脂肪肝改善及脂肪减少效果

在上述实施例7-1中，用乙醚麻醉给药BSA或单酰甘油脂肪酶的小鼠并进行剖腹，取出肝脏和附睾周围脂肪组织(epididymal fat tissue)后进行观察。

其结果，在MGL给药组中，肝脏的重量和脂肪组织的重量很多(图13g)，脂肪肝明显得到改善(图14a)，肝脏的中性脂肪量及胆固醇值也大大降低(图14b)。并且，随着MGL的给药，附睾周围脂肪组织的大小变小，用组织显微镜观察的结果，脂肪细胞的大小变得非常小(图14c)。图14d为示出脂肪细胞的平均大小的曲线图，可确认相比于BSA给药组，在MGL给药组中脂肪细胞的平均大小明显变小。

7-4.腹股沟脂肪中的基因表达变化

从实施例7-3的小鼠分离可称为皮下脂肪(subcutaneous fat tissue)的腹股沟脂肪(inguinal fat)来观察中性脂肪合成基因(DGAT1、GPAT2、MGAT1、Lipin2以及Lipin3)、脂肪酸合成基因(SCD1、FAS以及ME1)、脂肪酸运输基因(CD36及FATP1)、脂肪酸转录基因(PPARγ2、PPARα以及PGC1)、脂肪酸氧化基因(L-CPT1、ACOX1以及UCP1)的表达变化。

具体地，致死小鼠后分离腹股沟脂肪并将100mg的组织磨碎后放入1ml的Trizolreagent(Cat.No.15596，Invitrogen，美国)，通过离心分离来去除油层并获取上清液后，从中提取RNA。在所分离的RNA2ug中利用SuperScript III反向transcriptase(Cat.No.18-080-044，Invitrogen，美国)合成cDNA，在此基础上，利用SYBR Green Master mix(Cat.No.4309155，Applied Biosystems，美国)来执行Real-time qPCR。将各基因的表达修正为rRNA的表达并以曲线图示出。用于基因表达检测的引物序列如下列表3所示。

表3

其结果，如图15a所示，中性脂肪合成基因及脂肪酸合成的基因的表达没有变化或者在MGL给药组中反而有所增加，脂肪酸运输基因、脂肪酸转录基因以及脂肪酸氧化基因也呈现出相似的图案。特殊点在于，PGC1和UCP1的表达明显增加，这意味着白色脂肪被棕色化且能量消耗有所增加。

实施例8.供给高脂肪饮食的小鼠中的单酰甘油脂肪酶的给药效果

8-1.由单酰甘油脂肪酶给药产生的体重、饮食量以及脂肪便确认

向5周龄的C57BL/6小鼠(中央实验动物，韩国)供给45％的脂肪量的高脂肪饮食供13周，开始高脂肪饮食起7周开始给药在上述实施例1中制备的单酰甘油脂肪酶来确认是否产生体重减少或体重增加延迟效果(图16a)。其结果，如图16b及16e所示，给药单酰甘油脂肪酶后，体重明显减少而产生相比于总体重减少15％的效果。

并且，如图16c及图16d所示，MGL给药组与BSA给药组之间的饮食量和大便的脂肪量相似，没有出现由单酰甘油脂肪酶的给药产生的饮食量变化及如脂肪便等副作用

8-2.葡萄糖耐量试验

在上述实施例8-1中，以给药BSA或单酰甘油脂肪酶的小鼠作为对象来进行葡萄糖耐量试验。以体重腹腔注射方式向给药单酰甘油脂肪酶的小鼠给药1.5mg/g的葡萄糖，耐量前、耐量后15分钟、30分钟、60分钟以及120分钟时采血并检测血糖值。

其结果，如图16f所示，葡萄糖耐量试验结果大大提高。由此再次确认可将MGL用作糖尿病治疗剂。

8-3.由单酰甘油脂肪酶给药产生的脂肪肝改善及脂肪减少效果

在上述实施例8-1中，用乙醚麻醉给药BSA或单酰甘油脂肪酶的小鼠并进行剖腹，取出肝脏和附睾周围脂肪组织(epididymal fat tissue)后进行观察。

其结果，在MGL给药组中，肝脏的重量和脂肪组织的重量很多(图16g)，由用肉眼观察到的取出的肝脏的状态及通过H&E染色或油红O(oil-red O)染色的组织显微镜照片确认了脂肪肝明显得到改善(图17a)。并且，肝脏的中性脂肪量及胆固醇值也大大降低(图17b)，附睾周围脂肪组织的大小变小，用组织显微镜观察上述脂肪组织的结果，脂肪细胞的大小变小(图17c)。图17d为示出脂肪细胞的平均大小的曲线图，可确认相比于BSA给药组，在MGL给药组中脂肪细胞的平均大小明显变小。

8-4.由单酰甘油脂肪酶给药产生的血液中的中性脂肪和胆固醇值变化、肝功能数值变化以及GLP变化的确认

在上述实施例8-1中，从给药BSA或单酰甘油脂肪酶的小鼠采血并分析血液中的中性脂肪及胆固醇的量。其结果，如图17e所示，MGL的给药使血液中的中性细胞减少，血液中的胆固醇与BSA给药组相似。血液中的中性脂肪的减少是因为本发明的MGL在消化道中将中性脂肪完全分解为脂肪酸和甘油来使中性脂肪的血液中的吸收减少而产生，由此再次确认，MGL作为高血脂症治疗剂具有效果。

并且，可知，在MGL给药组中作为肝功能数值的ALT及AST减少了很多，因此MGL有助于恢复肝功能(图17f)。同样地，在MGL给药组中，可对饮食产生影响的血液中GLP-1中没有出现变化，从而再次确认，MGL的给药并不产生饮食量的变化。

实施例9.本发明的MGL和罗氏鲜的效果比较

为了比较本发明的MGL与目前用作肥胖症治疗剂的罗氏鲜的效果，通过强饲法向C57BL/6小鼠每天给药100单位的在上述实施例1中制备的人类MGL或100n摩尔的罗氏鲜(orlistat，ORL，Sigma)3周来检测体重及大便的脂肪量和胆固醇量。

其结果，如图18所示，MGL与ORL相似，体重均相比于总体重减少了15％左右，但MGL与ORL为不同性状的药物，由于无法定义最佳剂量，在此基础上无法比较MGL或ORL中哪个优秀。然而，如图18所示，MGL给药组与BSA给药组的大便的脂肪量几乎相似，但在ORL给药组中出现明显的脂肪便，因此具有很大差异。并且，大便的胆固醇也在ORL给药组中明显增加。一个特殊点在于，在给药3周的实验过程中，在ORL给药组中的5只中4只小鼠死亡，解剖结果，如图19所示，胆囊变黑。认为这是色素性胆结石，是由ORL引起的副作用之一。通过本实施例的结果可了解，与罗氏鲜不同地，MGL从未出现脂肪便的范围内也具有明显的体重减少效果，尤其，MGL为没有出现如脂肪便及胆囊病变等罗氏鲜的副作用的卓越的抗肥胖剂及脂肪肝治疗剂。

产业上的可利用性

本发明的包含2-单酰甘油分解酶的组合物在消化道中将中性脂肪完全分解为脂肪酸和甘油来延迟脂肪吸收，具有降低血液中的中性脂肪的吸收的效果，在消化道中用2-单酰甘油脂肪酶分解单酰甘油的情况下，尽管中性脂肪被吸收也可通过延迟消化道上皮细胞中的中性脂肪的重新结合或者促进此过程中的能量消耗，因此，可应用于预防、改善或治疗肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝、高血脂症、2型糖尿病和/或肥胖症等的准药品及健康功能食品。

序列表

<110> 延世大学校产学协力团

<120> 用2-单酰甘油分解酶的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法

<130> SOP114615CN

<150> KR 10-2016-0091606

<151> 2016-07-19

<160> 42

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 人 MGL 正向引物

<400> 1

gccatatgcc agaggaaagt tccccagg 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 人 MGL 反向引物

<400> 2

cgctcgagtc agggtgggga cgcagttc 28

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 小鼠 MGL 正向引物

<400> 3

gcgtcgaccc tgaggcaagt tcacccagg 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 小鼠 MGL 反向引物

<400> 4

cgctcgagtc agggtggaca cccagctc 28

<210> 5

<211> 925

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 人单酰甘油脂肪酶 (MGL)

<400> 5

gccatatgcc agaggaaagt tcccccaggc ggaccccgca gagcattccc taccaggacc 60

tccctcacct ggtcaatgca gacggacagt acctcttctg caggtactgg aaacccacag 120

gcacacccaa ggccctcatc tttgtgtccc atggagccgg agagcacagt ggccgctatg 180

aagagctggc tcggatgctg atggggctgg acctgctggt gttcgcccac gaccatgttg 240

gccacggaca gagcgaaggg gagaggatgg tagtgtctga cttccacgtt ttcgtcaggg 300

atgtgttgca gcatgtggat tccatgcaga aagactaccc tgggcttcct gtcttccttc 360

tgggccactc catgggaggc gccatcgcca tcctcacggc cgcagagagg ccgggccact 420

tcgccggcat ggtactcatt tcgcctctgg ttcttgccaa tcctgaatct gcaacaactt 480

tcaaggtcct tgctgcgaaa gtgctcaacc ttgtgctgcc aaacttgtcc ctcgggccca 540

tcgactccag cgtgctctct cggaataaga cagaggtcga catttataac tcagaccccc 600

tgatctgccg ggcagggctg aaggtgtgct tcggcatcca actgctgaat gccgtctcac 660

gggtggagcg cgccctcccc aagctgactg tgcccttcct gctgctccag ggctctgccg 720

atcgcctatg tgacagcaaa ggggcctacc tgctcatgga gttagccaag agccaggaca 780

agactctcaa gatttatgaa ggtgcctacc atgttctcca caaggagctt cctgaagtca 840

ccaactccgt cttccatgaa ataaacatgt gggtctctca aaggacagcc acggcaggaa 900

ctgcgtcccc accctgactc gagcg 925

<210> 6

<211> 925

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 小鼠单酰甘油脂肪酶 (MGL)

<400> 6

gcgtcgaccc tgaggcaagt tcacccaggc gaactccaca gaatgttccc taccaggacc 60

tgcctcacct ggtcaatgca gacggacagt acctcttttg tagatactgg aagcccagtg 120

gcacacccaa ggccctcatc tttgtgtccc atggagctgg ggaacactgt ggccgttatg 180

atgagctggc tcatatgttg aaggggctgg acatgctggt atttgcccat gaccatgttg 240

gccatgggca gagtgaggga gagaggatgg tggtgtcgga cttccaagtt tttgtcagag 300

atgtgctgca acacgtggac accatccaga aggactaccc cgacgtcccc atcttcctcc 360

tgggccactc catgggcggt gccatctcca tcctagtggc tgcagagagg ccaacctact 420

tttctggcat ggtcctgatt tcacctctgg tccttgccaa tccggaatct gcatcgactt 480

tgaaggtcct tgctgccaaa ctgctcaatt ttgtcctgcc aaatatgacc ttggggcgca 540

ttgactccag cgtgctgtct cggaacaagt cggaggttga cctgtacaac tctgacccac 600

tcgtctgccg agcagggctg aaggtgtgct ttggcataca gctgctgaat gccgtcgcaa 660

gagtggagcg agcaatgccc aggctgacac tgccattcct gctgctgcag ggttctgctg 720

accggctttg cgacagcaaa ggtgcctacc tgctcatgga atcatcccgg agtcaggaca 780

aaacactcaa gatgtatgaa ggtgcctatc acgtcctcca cagggagctt ccggaagtga 840

ccaactccgt cctccatgaa gtaaactcgt gggtgtctca caggatagca gcagcaggag 900

ctgggtgtcc accctgactc gagcg 925

<210> 7

<211> 303

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人单酰甘油脂肪酶 (MGL)

<400> 7

Met Pro Glu Glu Ser Ser Pro Arg Arg Thr Pro Gln Ser Ile Pro Tyr

1 5 10 15

Gln Asp Leu Pro His Leu Val Asn Ala Asp Gly Gln Tyr Leu Phe Cys

20 25 30

Arg Tyr Trp Lys Pro Thr Gly Thr Pro Lys Ala Leu Ile Phe Val Ser

35 40 45

His Gly Ala Gly Glu His Ser Gly Arg Tyr Glu Glu Leu Ala Arg Met

50 55 60

Leu Met Gly Leu Asp Leu Leu Val Phe Ala His Asp His Val Gly His

65 70 75 80

Gly Gln Ser Glu Gly Glu Arg Met Val Val Ser Asp Phe His Val Phe

85 90 95

Val Arg Asp Val Leu Gln His Val Asp Ser Met Gln Lys Asp Tyr Pro

100 105 110

Gly Leu Pro Val Phe Leu Leu Gly His Ser Met Gly Gly Ala Ile Ala

115 120 125

Ile Leu Thr Ala Ala Glu Arg Pro Gly His Phe Ala Gly Met Val Leu

130 135 140

Ile Ser Pro Leu Val Leu Ala Asn Pro Glu Ser Ala Thr Thr Phe Lys

145 150 155 160

Val Leu Ala Ala Lys Val Leu Asn Leu Val Leu Pro Asn Leu Ser Leu

165 170 175

Gly Pro Ile Asp Ser Ser Val Leu Ser Arg Asn Lys Thr Glu Val Asp

180 185 190

Ile Tyr Asn Ser Asp Pro Leu Ile Cys Arg Ala Gly Leu Lys Val Cys

195 200 205

Phe Gly Ile Gln Leu Leu Asn Ala Val Ser Arg Val Glu Arg Ala Leu

210 215 220

Pro Lys Leu Thr Val Pro Phe Leu Leu Leu Gln Gly Ser Ala Asp Arg

225 230 235 240

Leu Cys Asp Ser Lys Gly Ala Tyr Leu Leu Met Glu Leu Ala Lys Ser

245 250 255

Gln Asp Lys Thr Leu Lys Ile Tyr Glu Gly Ala Tyr His Val Leu His

260 265 270

Lys Glu Leu Pro Glu Val Thr Asn Ser Val Phe His Glu Ile Asn Met

275 280 285

Trp Val Ser Gln Arg Thr Ala Thr Ala Gly Thr Ala Ser Pro Pro

290 295 300

<210> 8

<211> 303

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 小鼠单酰甘油脂肪酶 (MGL)

<400> 8

Met Pro Glu Ala Ser Ser Pro Arg Arg Thr Pro Gln Asn Val Pro Tyr

1 5 10 15

Gln Asp Leu Pro His Leu Val Asn Ala Asp Gly Gln Tyr Leu Phe Cys

20 25 30

Arg Tyr Trp Lys Pro Ser Gly Thr Pro Lys Ala Leu Ile Phe Val Ser

35 40 45

His Gly Ala Gly Glu His Cys Gly Arg Tyr Asp Glu Leu Ala His Met

50 55 60

Leu Lys Gly Leu Asp Met Leu Val Phe Ala His Asp His Val Gly His

65 70 75 80

Gly Gln Ser Glu Gly Glu Arg Met Val Val Ser Asp Phe Gln Val Phe

85 90 95

Val Arg Asp Val Leu Gln His Val Asp Thr Ile Gln Lys Asp Tyr Pro

100 105 110

Asp Val Pro Ile Phe Leu Leu Gly His Ser Met Gly Gly Ala Ile Ser

115 120 125

Ile Leu Val Ala Ala Glu Arg Pro Thr Tyr Phe Ser Gly Met Val Leu

130 135 140

Ile Ser Pro Leu Val Leu Ala Asn Pro Glu Ser Ala Ser Thr Leu Lys

145 150 155 160

Val Leu Ala Ala Lys Leu Leu Asn Phe Val Leu Pro Asn Met Thr Leu

165 170 175

Gly Arg Ile Asp Ser Ser Val Leu Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val Asp

180 185 190

Leu Tyr Asn Ser Asp Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Leu Lys Val Cys

195 200 205

Phe Gly Ile Gln Leu Leu Asn Ala Val Ala Arg Val Glu Arg Ala Met

210 215 220

Pro Arg Leu Thr Leu Pro Phe Leu Leu Leu Gln Gly Ser Ala Asp Arg

225 230 235 240

Leu Cys Asp Ser Lys Gly Ala Tyr Leu Leu Met Glu Ser Ser Arg Ser

245 250 255

Gln Asp Lys Thr Leu Lys Met Tyr Glu Gly Ala Tyr His Val Leu His

260 265 270

Arg Glu Leu Pro Glu Val Thr Asn Ser Val Leu His Glu Val Asn Ser

275 280 285

Trp Val Ser His Arg Ile Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Pro Pro

290 295 300

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> rRNA 正向引物

<400> 9

gcaggtgttt gacaacggca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> rRNA 反向引物

<400> 10

gatgatggag tgtggcaccg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PPARalpha 正向引物

<400> 11

gtgtacgaca agtgtgatcg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PPARalpha 反向引物

<400> 12

gatttgaggt ctgcagtttc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> ACOX1 正向引物

<400> 13

ccacatatga ccccaagacc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> ACOX1 反向引物

<400> 14

aggcatgtaa cccgtagcac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> Me1 正向引物

<400> 15

agaggtgttt gcccatgaac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> Me1 反向引物

<400> 16

gaaggcagcc atatccttga 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> L-CPT1a 正向引物

<400> 17

ctcagtggga gcgactcttc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> L-CPT1a 反向引物

<400> 18

ggcctctgtg gtacacgaca 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> FATP1 正向引物

<400> 19

cagtgccacc aacaagaaga 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> FATP1 反向引物

<400> 20

ctgcggtcac ggaaatacat 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> CD36 正向引物

<400> 21

tgcaccacat atctaccaaa 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> CD36 反向引物

<400> 22

ttgtaacccc acaagagttc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> FAS 正向引物

<400> 23

aagccgttgg gagtgaaagt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> FAS 反向引物

<400> 24

caatctggat ggcagtgagg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> MGAT1 正向引物

<400> 25

ctggttctgt ttcccgttgt 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> MGAT1 反向引物

<400> 26

tgggtcaagg ccatcttaac 20

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> DGAT1 正向引物

<400> 27

ttccgcctct gggcatt 17

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> DGAT1 反向引物

<400> 28

agaatcggcc cacaatcca 19

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> SCD1 正向引物

<400> 29

ttctcagaaa cacacgccga 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> SCD1 反向引物

<400> 30

agcttctcgg ctttcaggtc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> AGPAT2 正向引物

<400> 31

agcggacaga agaaactgga 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> AGPAT2 反向引物

<400> 32

agcggacaga agaaactgga 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> LIPIN2 正向引物

<400> 33

ccgttgagtc ctgggttaaa 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> LIPIN2 反向引物

<400> 34

cattggaagg caggtcattt 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> LIPIN3 正向引物

<400> 35

gcccatgatt ctttctctgc 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> LIPIN3 反向引物

<400> 36

tctccaggaa aaccaccatc 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PPARdelta2 正向引物

<400> 37

ctctgggaga ttctcctgtt 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PPARdelta2 反向引物

<400> 38

ggtgggccag aatggcatct 20

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PGC1a 正向引物

<400> 39

tttttggtga aattgaggaa t 21

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PGC1a 反向引物

<400> 40

cggtaggtga tgaaaccata 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> UCP1 正向引物

<400> 41

ggtataaagg tgtcctaggg 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> UCP1 反向引物

<400> 42

caagctttct gtggtggcta 20

Claims

1.一种肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法，其特征在于，包括将2-单酰甘油分解酶给药到需要其的对象的步骤。

2.根据权利要求1所述的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法，其特征在于，上述2-单酰甘油分解酶为特异性或非特异性地分解2-单酰甘油的脂肪酶。

3.根据权利要求2所述的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法，其特征在于，特异性地分解2-单酰甘油的上述脂肪酶为来源于选自由人、小鼠、酵母、霉以及细菌组成的组中的一种的2-位置特异性脂肪酶。

4.根据权利要求3所述的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法，其特征在于，上述2-位置特异性脂肪酶由序列7或序列8的氨基酸序列形成。

5.根据权利要求4所述的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法，其特征在于，上述2-位置特异性脂肪酶由包含序列5或序列6的碱基序列的重组载体表达。

6.根据权利要求5所述的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法，其特征在于，上述2-位置特异性脂肪酶通过由上述重组载体转化的菌株而生成。

7.根据权利要求2所述的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法，其特征在于，非特异性地分解2-单酰甘油的上述脂肪酶为来源于选自由酵母、霉以及细菌组成的组中的一种的位置非特异性脂肪酶。

8.根据权利要求1所述的肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝的治疗方法，其特征在于，上述2-单酰甘油分解酶通过将2-单酰甘油完全分解为脂肪酸和甘油来降低2-单酰甘油被消化道上皮细胞吸收的吸收量。

9.一种用于制备肝脂肪变性或非酒精性脂肪肝治疗用药剂的2-单酰甘油分解酶的用途。

10.一种高血脂症或2型糖尿病的治疗方法，其特征在于，包括将2-单酰甘油分解酶给药到需要其的对象的步骤。

11.根据权利要求10所述的高血脂症或2型糖尿病的治疗方法，其特征在于，上述2-单酰甘油分解酶为特异性或非特异性地分解2-单酰甘油的脂肪酶。

12.根据权利要求11所述的高血脂症或2型糖尿病的治疗方法，其特征在于，特异性地分解2-单酰甘油的上述脂肪酶为来源于选自由人、小鼠、酵母、霉以及细菌组成的组中的一种的2-位置特异性脂肪酶。

13.根据权利要求12所述的高血脂症或2型糖尿病的治疗方法，其特征在于，上述2-位置特异性脂肪酶由序列7或序列8的氨基酸序列形成。

14.根据权利要求13所述的高血脂症或2型糖尿病的治疗方法，其特征在于，上述2-位置特异性脂肪酶由包含序列5或序列6的碱基序列的重组载体表达。

15.根据权利要求14所述的高血脂症或2型糖尿病的治疗方法，其特征在于，上述2-位置特异性脂肪酶通过由上述重组载体转化的菌株而生成。

16.根据权利要求11所述的高血脂症或2型糖尿病的治疗方法，其特征在于，非特异性地分解2-单酰甘油的上述脂肪酶为来源于选自由酵母、霉以及细菌组成的组中的一种的位置非特异性脂肪酶。

17.根据权利要求10所述的高血脂症或2型糖尿病的治疗方法，其特征在于，上述2-单酰甘油分解酶通过将2-单酰甘油完全分解为脂肪酸和甘油来降低2-单酰甘油被消化道上皮细胞吸收的吸收量。

18.一种用于制备高血脂症或2型糖尿病治疗用药剂的2-单酰甘油分解酶的用途。

19.一种肥胖症的治疗方法，其特征在于，包括将2-单酰甘油分解酶给药到需要其的对象的步骤。

20.根据权利要求19所述的肥胖症的治疗方法，其特征在于，上述2-单酰甘油分解酶为特异性或非特异性地分解2-单酰甘油的脂肪酶。

21.根据权利要求20所述的肥胖症的治疗方法，其特征在于，特异性地分解2-单酰甘油的上述脂肪酶为来源于选自由人、小鼠、酵母、霉以及细菌组成的组中的一种的2-位置特异性脂肪酶。

22.根据权利要求21所述的肥胖症的治疗方法，其特征在于，上述2-位置特异性脂肪酶由序列7或序列8的氨基酸序列形成。

23.根据权利要求22所述的肥胖症的治疗方法，其特征在于，上述2-位置特异性脂肪酶由包含序列5或序列6的碱基序列的重组载体表达。

24.根据权利要求23所述的肥胖症的治疗方法，其特征在于，上述2-位置特异性脂肪酶通过由上述重组载体转化的菌株而生成。

25.根据权利要求20所述的肥胖症的治疗方法，其特征在于，非特异性地分解2-单酰甘油的上述脂肪酶为来源于选自由酵母、霉以及细菌组成的组中的一种的位置非特异性脂肪酶。

26.根据权利要求19所述的肥胖症的治疗方法，其特征在于，上述2-单酰甘油分解酶将2-单酰甘油完全分解为脂肪酸和甘油，由于所分解的上述脂肪酸和甘油被吸收至消化道上皮细胞并重新合成为中性脂肪的过程而能量消耗增加，此时，相比于在消化道上皮细胞中单酰甘油及脂肪酸重新合成为中性脂肪的过程，在上述能量消耗的增加过程中多消耗3个至4个ATP。

27.一种用于制备肥胖症治疗用药剂的2-单酰甘油分解酶的用途。