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WO2018016806A1 - 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료방법 - Google Patents

2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료방법 Download PDF

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WO2018016806A1
WO2018016806A1 PCT/KR2017/007585 KR2017007585W WO2018016806A1 WO 2018016806 A1 WO2018016806 A1 WO 2018016806A1 KR 2017007585 W KR2017007585 W KR 2017007585W WO 2018016806 A1 WO2018016806 A1 WO 2018016806A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
monoacylglycerol
lipase
enzyme
seq
mgl
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/007585
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김재우
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 산학협력단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Priority to US16/318,258 priority Critical patent/US11116822B2/en
Priority to EP17831279.9A priority patent/EP3488859A4/en
Priority to CN201780057429.6A priority patent/CN109937048A/zh
Publication of WO2018016806A1 publication Critical patent/WO2018016806A1/ko

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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
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    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
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    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
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    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
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    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01023—Acylglycerol lipase (3.1.1.23)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver using 2-monoacylglycerol cleavage enzyme, and more particularly, to completely break down triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract using 2-monoacylglycerol cleavage enzyme.
  • Obesity is a group of diseases that most threatens the health of modern people. High obesity reduces the sensitivity of insulin, causing a number of metabolic changes in the body, eventually causing a number of complications, including the vascular system, nervous system, and death. Therefore, the development of lifestyle or therapeutic drugs that can reduce obesity is considered very important in the medical community.
  • Obesity results from an imbalance between energy intake and energy use.
  • energy intake is the brain's hypothalamus, which is regulated by hormones such as leptin and ghrelin in the body. Once ingested and absorbed from the digestive tract, it is never excreted and is used as energy or stored in the body. Therefore, in the treatment of obesity, efforts have been made to develop an obesity inhibitor as a mechanism for suppressing energy intake, and appetite suppressants such as puring and reductil have been used.
  • Drugs using this method include Xenical, which inhibits lipase, a lipolytic enzyme of interest.
  • Zenical When administered with Zenical, triglycerides are not broken down and are not absorbed by the digestive tract and are excreted in the stool.
  • the second method is to increase the use of energy. Often people's response to obesity is "eat less, exercise a lot,” so exercise to increase energy consumption can be seen as a sure treatment of obesity. Recently, various efforts have been made to promote energy consumption by drugs, and research has been made toward promoting energy consumption by increasing expression of unfolding proteins present in brown fat.
  • anti-obesity agents include thiazolidinediones (TZDs), Zenical (Roche Korea) and sibutramine (sibutramine).
  • ZTDs thiazolidinediones
  • Zenical Fucosaminose
  • sibutramine sibutramine
  • Side effects of these drugs include cardiovascular, central, hepatic and kidney disorders. Has been reported. Therefore, there is an urgent need to develop high value-added multifunctional products that do not have side effects from long-term intake and combine with obesity prevention and treatment.
  • MDL monoacylglycerol lipase
  • the monoacylglycerol lipase when the monoacylglycerol lipase to act in the digestive tract, it is possible to delay the absorption of fat by completely decomposing triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract, reducing the absorption of triglycerides in the blood, 2-mono in the digestive tract
  • Degradation of acylglycerol to monoacylglycerol lipase can delay triglyceride recombination in digestive epithelial cells or promote energy expenditure even when absorbed, so that 2-monoacylglycerol cleavage enzymes are known as hepatic steatosis and nonalcoholic.
  • the present invention has been accomplished by focusing on the idea that it can be used as a prophylactic or therapeutic agent for fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity.
  • the present invention has been made to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a method for treating hepatic steatosis, nonalcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity using 2-monoacylglycerol cleavage enzyme. .
  • the present invention provides a method for treating hepatic steatosis or non-alcoholic fatty liver using a monoacylglycerol cleavage enzyme.
  • the present invention also provides a method for treating hyperlipidemia or type 2 diabetes using monoacylglycerol cleavage enzyme.
  • the present invention also provides a method for treating obesity using a monoacylglycerol cleavage enzyme.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hepatic steatosis or non-alcoholic fatty liver comprising a monoacylglycerol cleavage enzyme; And it provides a health functional food composition for preventing or improving liver fatty acid or non-alcoholic fatty liver.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hyperlipidemia or type 2 diabetes, including 2-monoacylglycerol cleavage enzyme; And it provides a health functional food composition for the prevention or improvement of hyperlipidemia or type 2 diabetes.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising 2-monoacylglycerol cleavage enzyme; And it provides a dietary supplement for the prevention or improvement of obesity.
  • the 2-monoacylglycerol cleavage enzyme may be a lipase that cleaves 2-monoacylglycerol specifically or nonspecifically.
  • the enzyme specifically cleaving the 2-monoacylglycerol is a 2-position specific lipase derived from any one selected from the group consisting of human, mouse, yeast, fungus and bacteria (2-position specific lipase).
  • the 2-position specific lipase may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 8.
  • the 2-position specific lipase may be expressed by a recombinant vector comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
  • the 2-position specific lipase may be produced by a strain transformed with the recombinant vector.
  • the lipase for non-specifically cleaving 2-monoacylglycerol is a positional non-specific lipase derived from any one selected from the group consisting of yeast, fungi and bacteria. It may be.
  • the 2-monoacylglycerol cleavage enzyme completely decomposes 2-monoacylglycerol into fatty acids and glycerol, thereby reducing the absorption of 2-monoacylglycerol into digestive epithelial cells. It may be.
  • the 2-monoacylglycerol cleavage enzyme completely decomposes 2-monoacylglycerol into fatty acids and glycerol, and the degraded fatty acid and glycerol are absorbed into digestive epithelial cells to neutral fat.
  • Energy consumption is increased due to the process of resynthesizing, and the increase in energy consumption is that 3 to 4 ATPs are consumed more than the process of resynthesizing monoacylglycerol and fatty acid to triglycerides in digestive epithelial cells.
  • the present invention provides the use of 2-monoacylglycerol cleavage enzymes for the manufacture of a medicament for the treatment of hepatic steatosis, nonalcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity.
  • composition comprising 2-monoacylglycerol cleavage enzyme of the present invention has the effect of delaying fat absorption by completely decomposing triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract, reducing the absorption of triglycerides in the blood, 2- Degradation of monoacylglycerol into specific or nonspecific lipases may delay hepatic triglyceride recombination in digestive epithelial cells or promote energy expenditure during absorption, even if absorbed, resulting in hepatic steatosis, nonalcoholic fatty liver, hyperlipidemia, secondary It can be used in medicines and dietary supplements to prevent, improve or treat type diabetes and / or obesity.
  • 1 is a schematic diagram showing the structure of triglycerides.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the process of digestion and absorption of triglycerides in the digestive tract, two fatty acids and monoacylglycerol decomposed by lipase of interest is absorbed into digestive epithelial cells, recombined into triglycerides in digestive epithelial cells again In the form of microns is liberated into the lymphatic system.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the triglyceride resynthesis pathway of fats absorbed from digestive epithelial cells after digesting triglycerides, when monoacylglycerol lipase (MGL) is present, triglycerides are completely composed of three fatty acids and glycerol Because it breaks down, it consumes more energy to regenerate triglycerides in digestive epithelial cells.
  • MDL monoacylglycerol lipase
  • FIG 4 shows the gene bank number and amino acid sequence of monoacylglycerol lipase (MGL) in humans and mice.
  • MML monoacylglycerol lipase
  • MDL monoacylglycerol lipase
  • MDL monoacylglycerol lipase
  • Fig. 8 shows lipase (control) and Candida of pig pancreas in 6-week-old mice.
  • the rugosa lipase (experimental group) was administered for 7 weeks, and the graph shows the weight change.
  • FIG. 9 is a data showing the change in the concentration of triglycerides in blood by monoacylglycerol lipase (MGL) in mice administered olive oil.
  • FIG. 10 is a time-dependent measurement of blood triglyceride concentration by monoacylglycerol lipase in olive oil-treated mice, and is displayed according to whether or not Tyroxapol was administered.
  • 11 is a result of measuring the activity of the enzyme acting in the small intestine at 1 and 2 hours after monoacylglycerol lipase administration.
  • FIG. 13A shows the dosing schedule of samples in an experiment in which obesity-induced ob / ob mice were administered BSA or monoacylglycerol lipase (MGL) for 4 weeks.
  • Figure 13b is a photograph showing the appearance of the mouse in the BSA administration group and the MGL administration group after the end of the experiment of Figure 13a.
  • Figure 13c shows the diet of the BSA administration group and the MGL administration group in the experiment of Figure 13a.
  • Figure 13d shows the fat mass of the feces in the BSA administration group and the MGL administration group in the experiment of Figure 13a.
  • FIG. 13E graphically depicts the weight change of the BSA administered group and the MGL administered group during the experiment of FIG. 13A.
  • FIG. 13F is a graph showing the results of the glucose loading test for the mice of the BSA administration group and the MGL administration group after the end of the experiment of FIG. 13A.
  • Figure 13g is a graph showing the weight of the liver (liver) and visceral fat (epididymal fat, Epi-WAT) in the mice of the BSA administration group and MGL administration group after the end of the experiment of Figure 13a.
  • FIG. 14A shows the liver (top) taken from the mice of the BSA administration group and the MGL administration group after the termination of the experiment of FIG. 13A and a photograph of the liver observed under a tissue microscope (bottom).
  • Figure 14b is a graphical representation of the measurement of triglycerides and cholesterol levels in the liver of Figure 14a.
  • Figure 14c shows the appearance (above) of the epididymal tissue surrounding the epididymis extracted from mice of the BSA administration group and the MGL administration group after the end of 13a (photo) and a photograph of the tissue microscopic observation (bottom).
  • FIG. 14d is a graph showing the average size of fat cells in the adipose tissue of FIG. 14c.
  • Figure 15a is a graph showing the change in the expression of triglyceride synthesis gene and fatty acid synthesis gene in the inguinal fat (inguinal fat) of the mice of the BSA administration group and MGL administration group after the end of the experiment of Figure 13a.
  • FIG. 15B is a graph showing the expression changes of fatty acid transport genes, transcription genes and oxidative genes in the inguinal fat of mice of the BSA administration group and the MGL administration group after the experiment of FIG. 13A.
  • FIG. 16A shows the dosing schedule of samples in an experiment in which BSA or MGL was administered to C57BL / 6 mice fed a high fat diet.
  • Figure 16b is a photograph showing the appearance of the mouse in the BSA administration group and the MGL administration group after the end of the experiment of Figure 16a.
  • Figure 16c shows the dietary amount of the BSA administration group and the MGL administration group in the experiment of Figure 16a.
  • Figure 16d shows the fat mass of the feces in the BSA administration group and the MGL administration group in the experiment of Figure 16a.
  • FIG. 16E graphically depicts the weight change of the BSA administered group and the MGL administered group during the experiment of FIG. 16A.
  • Figure 16f is a graph showing the results of the glucose loading test for the mice in the BSA administration group and the MGL administration group after the end of the experiment of Figure 16a.
  • Figure 16g is a graph showing the weight of the liver (liver) and visceral fat (epididymal fat, Epi-WAT) in the mice of the BSA administration group and MGL administration group after the end of the experiment of Figure 13a.
  • FIG. 17A shows the liver (top) taken from the mice of the BSA administration group and the MGL administration group after the experiment of FIG. 16A (above), and the image (middle) and oil-red O observed with H & E staining under a tissue microscope. ) The photographs observed by staining (below) are shown.
  • Figure 17b is a graphical representation of the measurement of triglycerides and cholesterol levels in the liver of Figure 17a.
  • Figure 17c shows the appearance (above) of the epididymal tissue around the epididymis extracted from mice of the BSA administration group and the MGL administration group after the end of 16a (photo) and a photograph of the tissue microscopic observation (bottom).
  • Figure 17d is a graph showing the average size of the fat cells in the adipose tissue of Figure 17c.
  • FIG. 17E is a graph showing the measurement of blood triglycerides and blood cholesterol levels in the mice of the BSA administration group and the MGL administration group after the end of the experiment of FIG. 16a.
  • Figure 17f is a graph showing the measurement of liver ALT and AST in the mice of the BSA administration group and MGL administration group after the end of the experiment of Figure 16a.
  • FIG. 17G is a graph showing blood GLP-1 levels measured in mice of the BSA administration group and the MGL administration group after the end of the experiment of FIG. 16A.
  • FIG. 18 is a graph showing the body weight, the amount of fat in feces, and the amount of cholesterol in the feces after 3 weeks of administration of MGL or Jenal (orlistat, ORL) of the present invention to C57BL / 6 mice.
  • drugs used for the treatment of hepatic steatosis, nonalcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity cause side effects such as heart disease, respiratory disease, increased blood pressure and insomnia, There is a low problem. Therefore, there is an urgent need to develop high value-added multifunctional products that have no side effects, prevent and treat metabolic syndrome, and reduce oxidative stress and combine various diseases.
  • the present invention provides a composition for preventing, improving and / or treating hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver comprising 2-monoacylglycerol cleavage enzyme and treatment of hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver using the 2-monoacylglycerol cleavage enzyme.
  • the composition provided in the present invention has the effect of delaying fat absorption by completely degrading triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract, and reducing the absorption of triglycerides into the blood, resulting in hepatic steatosis, nonalcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes. And / or pharmaceuticals and nutraceuticals that prevent, ameliorate or treat obesity.
  • Obesity can raise blood pressure and blood sugar, increase blood triglycerides and reduce HDL cholesterol, which in turn increases the risk of metabolic syndrome and ultimately increases the risk of cardiovascular disease.
  • the metabolic syndrome refers to the simultaneous occurrence of abdominal obesity, diabetes, dyslipidemia (elevated triglycerides, high density cholesterol), hypertension, etc. in one person. That is, the composition comprising the 2-monoacylglycerol cleavage enzyme of the present invention can be used as a prophylactic or therapeutic agent for liver fatosis, nonalcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity, It can also be used as a therapeutic.
  • Monoacylglycerol lipase can reduce blood triglycerides, and when the monoacylglycerol lipase is present in the intestine, 2-monoacylglycerol is completely decomposed into fatty acids and glycerol, and monoacylglycerol and fatty acids are converted into digestive epithelial cells. This may delay the process of absorption and resynthesis of triglycerides.
  • the 2-monoacylglycerol by the cleavage enzyme the 2-monoacylglycerol is completely decomposed into fatty acids and glycerol, the digested fatty acid and glycerol is absorbed into the digestive epithelial cells and resynthesized into triglycerides Increased energy consumption, where increased energy consumption may consume 3 to 4 more ATPs compared to the process of resynthesizing monoacylglycerol and fatty acids into triglycerides in digestive epithelial cells.
  • the present invention starts with a paradoxical idea that focuses on the absorption of nutrients and metabolic pathways in the digestive tract, and is based on a mechanism for further promoting triglyceride digestion in the digestive tract to reduce fat absorption and promote energy consumption.
  • triglycerides have a form in which three fatty acids are bound to glycerol, and an enzyme that decomposes triglycerides in a human digestive tract is representative of lipase secreted from interest.
  • the lipase is an incomplete lipase, which decomposes fatty acids 1 and 3 but does not favor fatty acids bound to 2, so the product of this enzyme is present as 2 fatty acids and 1 monoacylglycerol. .
  • Figure 2 is a diagram showing the digestion and absorption process of triglycerides in the digestive tract, two fatty acids and monoacylglycerol decomposed by the lipase of interest is absorbed into the digestive epithelial cells, recombined into triglycerides in the digestive epithelium again In the form of microns is liberated into the lymphatic system.
  • an enzyme called MGAT2 is present in the digestive epithelial cells, and as shown in the upper part of FIG. 3, the enzyme attaches a fatty acid from monoacylglycerol to diacyl Glycerol forms, and the resulting diacylglycerol soon becomes triglycerides.
  • lipoproteins in the form of chylomicron must be formed, but they can be secreted into the lymphatic or vascular system and circulated as dissolved.
  • 2-monoacylglycerol is orally taken with a cleavage enzyme to completely break down triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract, and promote fat absorption and delayed remodeling / energy consumption, thereby promoting hepatic steatosis and nonalcoholicity. It is intended for use in the treatment of fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity.
  • the present invention provides a method for treating hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver using 2-monoacylglycerol cleavage enzymes; Hepatic steatosis or nonalcoholic fatty liver prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition comprising 2-monoacylglycerol cleavage enzyme; Or it provides a health functional food composition for preventing or improving liver fatty acid or non-alcoholic fatty liver.
  • the present invention also provides a method for treating hyperlipidemia or type 2 diabetes using 2-monoacylglycerol cleavage enzyme;
  • Pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of hyperlipidemia or type 2 diabetes comprising 2-monoacylglycerol cleavage enzymes;
  • it provides a health functional food composition for the prevention or improvement of hyperlipidemia or type 2 diabetes.
  • the present invention also provides a method for treating obesity using 2-monoacylglycerol cleavage enzyme; Pharmaceutical compositions for preventing or treating obesity, including 2-monoacylglycerol cleavage enzymes; Or it provides a health functional food composition for preventing or improving obesity.
  • the 2-monoacylglycerol cleavage enzyme may be used without limitation as long as it can completely decompose 2-monoacylglycerol into fatty acids and glycerol, and preferably 2-monoacylglycerol Lipase that cleaves red or nonspecifically.
  • the origin of the enzyme that specifically cleaves the 2-monoacylglycerol is not particularly limited, but for example, 2-position specific lipase derived from any one selected from the group consisting of human, mouse, yeast, fungus and bacteria (2-position specific lipase).
  • 2-position specific lipase refers to a lipase which shows reaction specificity only at the fatty acyl group at the 2-position of triglyceride.
  • a human or mouse-derived monoacylglycerol lipase (MGL) gene sequence can be introduced into a recombinant vector to mass-express the monoacylglycerol lipase protein to prepare a 2-position specific lipase.
  • MML monoacylglycerol lipase
  • E. coli The protein was expressed and partially purified using the system, and the His-tag was used to facilitate purification of the desired protein.
  • any gene sequence encoding 2-position specific lipase can be used without limitation.
  • Figure 4 shows the gene bank number and amino acid sequence of monoacylglycerol lipase (MGL) in humans and mice, if necessary, by modifying the amino acid sequence of some of the human or mouse-derived monoacylglycerol lipase shown in Figure 4 enzyme activity It is possible to increase the production of monoacylglycerol in recombinant microorganisms by modifying some sequences of monoacylglycerol lipase.
  • MML monoacylglycerol lipase
  • FIG. 5 shows a bacterial expression vector system prepared for the mass production of monoacylglycerol lipase (MGL), the protein after the mass production using the results of the separation as shown in Figure 6 monoacylglycerol lipase (MGL) was performed successfully.
  • MML monoacylglycerol lipase
  • the origin of the enzyme for non-specifically cleaving the 2-monoacylglycerol is also not particularly limited, but for example, a site-specific lipase derived from any one selected from the group consisting of yeast, mold and bacteria ( positional non-specific lipase).
  • non-specific lipase in the present invention means a lipase that reacts with all three fatty acyl groups of all triglycerides.
  • Candida rugosa- derived lipase was used as a site-specific lipase, but Candida In addition to rugosa , non-specific lipases derived from microorganisms such as other yeasts, fungi, bacteria and the like can be used.
  • FIG. 8 Candida in 6-week-old mice As a result of measuring the change in body weight by administering rugosa- derived lipase for a total of 6 weeks, it indicates that the cleavage enzyme can be usefully used for the treatment of obesity. This confirmed that not only 2-position specific lipase but also site-specific lipase can be used as a therapeutic agent for obesity. In particular, since 2-position specific lipase specifically acts only on 2-monoacylglycerol, it has better substrate specificity and degrading activity than position-specific lipase so that obesity can be more effectively treated. Thus, 2-position specific lipases have excellent therapeutic effects on obesity even when used alone without combining with other additional ingredients.
  • FIG 9 is a data showing the change in the concentration of triglycerides in blood by monoacylglycerol lipase (MGL) in olive oil-treated mice
  • Figure 10 is the change in the concentration of triglycerides in blood by monoacylglycerol lipase in mice administered olive oil This is a picture measured by time. As a result, it was confirmed that administration of monoacylglycerol lipase is effective in reducing triglyceride in blood, and it can be used as a therapeutic agent for hyperlipidemia.
  • 11 and 12 show the effect of monoacylglycerol lipase on the small intestine after administration and the delayed fat recombination effect in Caco-2 cells, a human small intestinal epithelial cell line.
  • FIGS. 13B and 13E show body weight changes (FIGS. 13B and 13E), dietary changes (FIG. 13C), and stool fat amount (13d) after 4 weeks of monoacylglycerol lipase (MGL) administration in ob / ob mice induced obesity ), Glucose loading test results (Fig. 13f) and the weight of the liver (liver) and visceral (epididymal fat, Epi-WAT) (Fig. 13g) is shown.
  • Figure 14a to 14d is an extension of the experiment of Figure 13a, obesity-induced ob / ob mice after the administration of monoacylglycerol lipase (MGL) for 4 weeks liver (Fig. 14a), hepatic triglycerides and cholesterol Levels (FIG. 14B), appearance of epididymal adipose tissue (FIG. 14C), and mean cell size of adipose tissue (FIG. 14D).
  • FIG. 8 is a mono-acylglycerol lipase, which is a 2-position specific lipase, at about 100 unit / day. In both examples, the effect was similarly about 3 g weight loss.
  • FIG. 15A and 15B are also an extension of the experiment of FIG. 13A, in which FIG. 15A is a triglyceride synthesis gene and fatty acid synthesis in the inguinal fat, which is the subcutaneous fat tissue of mice in the BSA and MGL groups.
  • Figure 15b shows a change in the expression of the gene
  • Figure 15b shows a change in the expression of fatty acid transport gene, transcription gene and oxidizing gene in the inguinal fat (inguinal fat).
  • FIGs. 16A to 16G show the change in body weight (FIGs. 16B and 16E), the change in dietary amount (FIG. 16C), the amount of fat in the stool (16D) and the glucose load test result after administration of MGL to C57BL / 6 mice fed a high fat diet.
  • Figure 16f and the results of measuring the weight of the liver (liver) and visceral fat (epididymal fat, Epi-WAT) (Fig. 16g). Similar to the results in ob / ob mice that induced obesity (FIGS. 13B-13G), MGL administration showed about 15% weight loss of the total body weight, no change in diet, and side effects such as fatty stools. It was confirmed that it is not shown.
  • glucose tolerance test improved glucose tolerance and significantly reduced liver weight and adipose tissue weight.
  • Figure 17a to 17g is an extension of the experiment of Figure 16a, after administration of MGL to a C57BL / 6 mouse fed a high fat diet, liver ( Figure 17a), the liver's triglycerides and cholesterol levels (Figure 17b), epididymal fat
  • Figure 17c The appearance of the tissue (Fig. 17c) and the average size of fat cells (Fig. 17d), the blood triglyceride and cholesterol levels (Fig. 17e), the liver ALT and AST levels (Fig. 17f) and blood GLP changes to be.
  • the fatty liver was significantly improved in the MGL-administered group compared to the BSA-administered group, the triglyceride amount in the liver was greatly reduced, and the cholesterol level was also reduced.
  • the size of the adipose tissue and adipocytes was reduced, the average adipocyte size was also reduced, blood triglycerides were confirmed to decrease. Liver numbers such as ALT and AST were also significantly reduced, with no change in GLP-1, which is known to affect diet.
  • FIG. 18 shows a comparative experiment between the MGL-administered group of the present invention and the Zenical (ORL) -administered group known as a conventional obesity treatment agent. Similar weight loss effects were observed in the MGL-administered group and the ORL-administered group. It was confirmed that the amount of cholesterol was significantly higher in the ORL-administered group. In addition, the necropsy of the four mice that died during the experiment in the ORL-administered group showed a blackening of the gallbladder as shown in FIG. 19, which is a pigmented gallstone among the symptoms reported as a side effect of Xenical. gall stone).
  • MGL administration of the present invention shows an excellent anti-obesity effect and fatty liver effect.
  • MGL of the present invention shows a weight loss effect corresponding to 15% of the total body weight when administered for 4 weeks, and when the anti-obesity agent currently being developed and used for one year, the weight loss effect of 8 ⁇ 11% Considering what is considered to be a good drug, the results demonstrated in the mouse experiments of the present invention are judged to be almost maximal effects and to be very good in weight loss.
  • MGL and Xenical are not able to define the optimal dose as a drug with different properties, but the comparative advantage of the weight loss effect can not be determined, but the present invention MGL does not show fatal and gallbladder lesions, which are the fatal drawbacks of Xenical, suggesting that it is an excellent alternative to conventional obesity treatments.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hepatic steatosis, nonalcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity, including 2-monoacylglycerol cleavage enzyme according to the present invention is used in mammals such as mice, mice, livestock, humans, and the like. It may be administered orally to the animal.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention can be formulated in various formulations. When formulated, it can be formulated using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants commonly used in a range that does not inhibit the activity of 2-monoacylglycerol cleavage enzymes.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which solid preparations contain at least one excipient (e.g., starch, sucrose, lactose and gelatin) in monoacylglycerol lipase. Etc. may be mixed.
  • a coating agent may be used to prevent the activity of 2-monoacylglycerol cleavage enzymes from being destroyed by gastric acid and gastric juice.
  • Lubricants may also be used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, water-insoluble solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • Glycerol and gelatin may be used as the base of the suppository.
  • the pharmaceutical composition comprising 2-monoacylglycerol cleavage enzyme according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, but in general, the amount of 1 to 500 unit / kg is divided once to several times daily. 1 unit means the amount of 1 ⁇ mole of monoacylglycerol completely decomposed for 1 hour at pH 7.4, 37 conditions.
  • the dosage of the composition containing monoacylglycerol lipase may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, and the like. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • the type of health functional food comprising a dietary supplement composition for preventing or improving liver fatosis, non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity, comprising 2-monoacylglycerol of the present invention
  • a dietary supplement composition for preventing or improving liver fatosis, non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity comprising 2-monoacylglycerol of the present invention
  • a dietary supplement composition for preventing or improving liver fatosis, non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity comprising 2-monoacylglycerol of the present invention Not particularly limited, for example, meat, sausages, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products, including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and Vitamin complexes and the like.
  • the health food is used with other food or food additives in addition to the monoacylglycerol lipase, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the non-alcoholic fatty liver preventive drink containing 2-monoacylglycerol cleavage enzyme may be added to calcium, brambles, liquid fructose, purified water, and the like, in addition to the 2-monoacylglycerol cleavage enzyme. After the bottle is filled and sterilized, the beverage may be prepared by cooling to room temperature.
  • hepatic steatosis non-alcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity preventive health supplements containing the 2-monoacylglycerol cleavage enzymes in a monoacylglycerol lipase supplements (vitamins B1, B2, B5 , B6, E and acetic acid ester, nicotinic acid amide), oligosaccharide, 50% ethanol, and purified water were added and mixed to form granules, dried in a vacuum dryer, and then uniformly manufactured by passing through 12 to 14 mesh.
  • a monoacylglycerol lipase supplements vitamins B1, B2, B5 , B6, E and acetic acid ester, nicotinic acid amide
  • oligosaccharide 50% ethanol
  • purified water purified water
  • the effective dose of the 2-monoacylglycerol cleavage enzyme contained in the health food may be used in accordance with the effective dose of the pharmaceutical composition, and the mixed amount of the active ingredient may be appropriately used depending on the purpose of use, such as preventive or therapeutic treatment. Can be determined. In the case of long term intake for health and hygiene purposes or health control purposes, it may be less than the above range.
  • the "individual” may be an animal, preferably an animal including a mammal, especially a human, and may be a cell, tissue, period, or the like derived from the animal.
  • the subject may be a patient in need of treatment.
  • the present invention provides the use of 2-monoacylglycerol cleavage enzymes for the manufacture of a medicament for the treatment of hepatic steatosis, nonalcoholic fatty liver, hyperlipidemia, type 2 diabetes and / or obesity.
  • E. coli that can express a large amount of protein to prepare a monoacylglycerol lipase protein
  • the system and His-tag were used, and the pT7 portion of the open reading frame (ORF) of human-derived monoacylglycerol lipase mRNA (Genebank Number: NM_001003794) and mouse-derived monoacylglycerol lipase mRNA (Genebank Number: NM_011844) -HMT (His-Myc-TEVprotease) vector (Geisbrecht BV et al., Protein Expression Purif 46: 23-32, 2006).
  • ORF open reading frame
  • the pT7-HMT vector is a vector that expresses in bacteria by fusing six His-tags with a protein of interest, and has the characteristic of easily purifying the expressed protein, and it is possible to separate the tag if necessary using TEV protease. There is an advantage.
  • a primer capable of amplifying the ORF portion of human or mouse-derived monoacylglycerol lipase mRNA was prepared as shown in Table 1 below, and the restriction site was included to insert the amplified gene into the vector. It was produced to be.
  • Primer sequence gene Primer sequence Restriction enzyme SEQ ID NO: MGL forward 5'-GC CATATG ccagaggaaagttccccagg-3 ' NdeI SEQ ID NO: 1 reverse 5'-CG CTCGAG tcagggtggggacgcagttc-3 ' XhoI SEQ ID NO: 2 Mouse MGL forward 5'-GC GTCGAC cctgaggcaagttcacccagg-3 ' SalI SEQ ID NO: 3 reverse 5'-CG CTCGAG tcagggtggacacccagctc-3 ' XhoI SEQ ID NO: 4
  • RNA Human or mouse-derived total RNA was extracted from adipose tissue, and PCR (Polymerase chain reaction) was performed using each primer pair of Table 1 as a template. As a result of confirming the sequence of the PCR amplification product, it was confirmed that the human monoacylglycerol lipase gene is represented by SEQ ID NO: 5, and the mouse-derived monoacylglycerol lipase gene is represented by SEQ ID NO: 6 (Table 2).
  • the amplified human or mouse-derived monoacylglycerol lipase gene was identified by NdeI (Cat. No. R0111S; New England BioLabs, USA) or SalI (Cat. No. R0138S; New England BioLabs, USA) and XhoI (Cat. No. R0146S). New England BioLabs, USA), followed by introduction into a pT7-HMT vector that delivered the same restriction site to prepare a recombinant vector.
  • six His-tags could be used for protein purification
  • Myc-tag could be used for protein detection by Western analysis.
  • TEV protease was applied to remove His-Myc-tag.
  • the recombinant vector was then transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) pCodon plus strain (Cat. No. # 230245; Agilent, USA).
  • the strain was inoculated in 500 ml of LB medium containing kanamycin and chloramphenicol and 2% ethanol until the absorbance at 600 nm was 0.5-0.6, followed by 1 mM IPTG for protein expression.
  • the culture was further incubated for 16 hours at 16 degrees Celsius.
  • the bacteria were harvested from the culture by centrifugation, suspended in Lysis buffer (50 mM Tris-Cl, pH8.0, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH8.0), 1% Triton X-100 was added, and frozen with lysozyme. Break the bacteria by thawing to make protein equalizer. The nucleic acid was digested by ultrasonic grinding and centrifuged, and then His-Myc-MGL fusion protein was bound to the column using Ni-NTA agarose bead (Cat. No. 30210, Qiagen, USA).
  • the column was washed with 50 column volumes using a washing buffer containing 0.1% of Triton X-114, and then using a washing buffer without Triton X-114. Rinse with 10 column volumes.
  • FIG. 6 is a data showing the results of the SDS-PAGE after separation and purification of mouse-derived monoacylglycerol lipase (MGL), the size of the mouse-derived monoacylglycerol lipase (MGL) purified in the present invention is about 33kDa It was confirmed that the same size as the actual mouse monoacylglycerol.
  • Monoacylglycerol lipase to be administered to the animal was purified more purely by applying the crude MGL sequentially to the HiTrap Phenyl HP, HiTrap SP, HiTrapQ column through the process as shown in FIG.
  • the isolated protein and its substrate oleoyl-rac-glycerol (Cat. No. M7765, Sigma, USA) are reacted by Free glycerol was measured using a Glycerol assay kit (Cat. No. MAK117, Sigma, USA) with reference to the manual attached to the kit.
  • Glycerol assay kit Cat. No. MAK117, Sigma, USA
  • One unit was defined as the amount of complete degradation of 1 ⁇ mole of monoacylglycerol for 1 hour at pH 7.4, 37. This activity assay was calculated based on the glycerol standard.
  • the protein concentration was measured using a Pierce TM BCA assay kit (Cat. No. 23225, ThermoFisher Scientific, USA), through which activity per mg was calculated.
  • Endotoxins that may remain in the protein were measured using the Pierce TM LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit (Cat. No. 88282, ThermoFisher Scientific, USA).
  • mice-derived monoacylglycerol lipase measured as described above showed the following results.
  • Endotoxin ⁇ 10 EU / ml (* EU, endotoxin unit)
  • the mouse monoacylglycerol lipase prepared in Example 1 was orally administered to the mouse monoacylglycerol lipase to determine whether the actual triglycerides in the blood, based on the activity measurement results of Example 2 unit in the mouse as much as (unit).
  • the triglyceride Colorimetric Assay Kit (Cat No 10010303, Cayman, USA) was used to measure absorbance at 500 nm according to the manual included in the kit.
  • Figure 9 it was confirmed that the blood triglycerides significantly reduced in the group of mice administered monoacylglycerol lipase.
  • the monoacylglycerol lipase of the present invention has an effect of reducing the absorption of triglycerides in blood by completely degrading triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract.
  • mice were sacrificed and the jejunum area of the small intestine was divided into proximal and distal parts, and the substance in the small intestine was immersed in PBS. This was allowed to elute in PBS.
  • the activity of the monoacylglycerol lipase present here was measured using the method in Example 2.
  • the group to which monoacylglycerol (MGL) was administered can be seen to be used at the proximal part and distal part 2 hours after 1 hour after oral administration, and the total activity of the protein remaining therein is orally administered. It was 1/5 to 1/10 of one protein.
  • MCL monoacylglycerol
  • Caco-2 cells which are human small intestine cell lines ( Cat No. HTB37, ATCC, USA).
  • the small intestine is placed on the apical side to administer digestive fat and the mouse monoacylglycerol lipase protein prepared in Example 1, and the blood side is placed on the basolateral side to place the small intestine epithelium in between.
  • the amount of diet may also change, and the feces may be over-exhausted to cause fat stool.
  • the amount of food was measured, and the stool was taken at random to check the fat content.
  • the amount of fat and stool fat was similar between the MGL administration group and the BSA administration group (FIGS. 13C and 13D), indicating no change in diet due to the administration of monoacylglycerol lipase, and no side effects such as stool. It was confirmed. This implies that the action of inhibiting fat absorption is accompanied by promoting energy expenditure in the small intestine, and it is shown that drugs such as Xenical (component name orlistat) have a different mechanism and no side effect of fat stool.
  • Glucose loading test was performed in mice administered BSA or monoacylglycerol lipase in Example 7-1. Mice treated with monoacylglycerol lipase were administered with 1.5 mg / g body weight intraperitoneal glucose, and blood glucose levels were measured before and 15 minutes after loading, 30 minutes, 60 minutes and 120 minutes after loading.
  • mice administered with BSA or monoacylglycerol lipase were anesthetized with ether, and opened. The liver and epididymal fat tissues were removed and observed.
  • FIG. 13g the weight of liver and adipose tissue was significantly reduced in the MGL administration group
  • FIG. 14a the fatty liver was significantly improved
  • FIG. 14b the triglyceride and cholesterol levels of the liver were significantly lowered
  • FIG. 14C the size of the adipocytes was found to be very small.
  • Figure 14d is a graph showing the average size of the adipocytes, it was confirmed that the mean size of the adipocytes in the MGL administration group is significantly smaller than the BSA administration group.
  • Inguinal fat which can be called subcutaneous fat tissue, was isolated from the mouse of Example 7-3, and triglyceride synthesis genes (DGAT1, GPAT2, MGAT1, Lipin2 and Lipin3), fatty acid synthesis genes (SCD1, The expression changes of FAS and ME1), fatty acid transport genes (CD36 and FATP1), fatty acid transcription genes (PPAR ⁇ 2, PPAR ⁇ and PGC1) and fatty acid oxidation genes (L-CPT1, ACOX1 and UCP1) were observed.
  • DGAT1, GPAT2, MGAT1, Lipin2 and Lipin3 fatty acid synthesis genes
  • SCD1 The expression changes of FAS and ME1
  • CD36 and FATP1 fatty acid transport genes
  • PPAR ⁇ 2, PPAR ⁇ and PGC1 fatty acid transcription genes
  • L-CPT1, ACOX1 and UCP1 fatty acid oxidation genes
  • the expression of the triglyceride synthesis gene and the gene of fatty acid synthesis was unchanged or rather increased in the MGL administration group, and the fatty acid transport gene, fatty acid transcription gene and fatty acid oxidation gene showed similar patterns.
  • the marked increase in the expression of PGC1 and UCP1 in the MGL-administered group indicating that browning of white fat is occurring and increased energy consumption.
  • Glucose loading test was performed in mice administered with BSA or monoacylglycerol lipase in Example 8-1. Mice treated with monoacylglycerol lipase were administered with 1.5 mg / g body weight intraperitoneal glucose, and blood glucose levels were measured before and 15 minutes after loading, 30 minutes, 60 minutes and 120 minutes after loading.
  • mice administered with BSA or monoacylglycerol lipase were anesthetized with ether, and opened. The liver and epididymal fat tissues were removed and observed.
  • FIG. 16 g the liver and adipose tissue weights were significantly reduced in the MGL-administered group (FIG. 16 g), and the gross appearance of the extracted liver and histological micrographs through H & E staining or oil-red O staining. It was confirmed that fatty liver was significantly improved (FIG. 16A). In addition, the amount of triglycerides in the liver was significantly reduced and cholesterol levels were also lowered (FIG. 16b). The fat tissues around the epididymis decreased in size, and the fat tissues were observed under a tissue microscope. Figure 16c).
  • Figure 16d is a graph showing the average size of the adipocytes, it was confirmed that the mean size of the adipocytes in the MGL administration group is significantly smaller than the BSA administration group.
  • Blood was collected from mice administered BSA or monoacylglycerol lipase in Example 8-1 to analyze the amount of triglyceride and cholesterol in the blood.
  • the blood triglyceride was reduced due to the MGL administration, and the blood cholesterol was similar to the BSA administration group.
  • the decrease in triglyceride in blood appears because MGL of the present invention reduces the absorption of triglycerides in the blood by completely breaking down triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract, thereby confirming that MGL is effective as a treatment for hyperlipidemia. .
  • mice were treated with 100 units of human MGL prepared in Example 1 or 100 nmole of Xenical (orlistat, ORL, Sigma) for 3 weeks. Garbage was administered daily and the body weight, fecal fat and cholesterol were measured.
  • the weight of MGL and ORL was similarly decreased by about 15% of the total weight, but since MGL and ORL cannot define the optimal dose as drugs of different properties, It is incomparable whether it is excellent.
  • the amount of fecal fat was about the same in the MGL-administered group and the BSA-administered group.
  • cholesterol in feces was significantly increased in the ORL-administered group.
  • One peculiarity was that four out of five mice died in the ORL-administered group during the three-week dosing experiment, and the autopsy showed that the charges turned black as shown in FIG. 19.
  • MGL has a significant weight loss effect even in the range where no fatty stool appears, unlike the zenical, and is an excellent anti-obesity agent and a fatty liver treatment that does not show the side effects of the zenical, such as fatty stools and gallbladder lesions.
  • composition comprising 2-monoacylglycerol cleavage enzyme of the present invention has the effect of delaying fat absorption by completely decomposing triglycerides into fatty acids and glycerol in the digestive tract, reducing the absorption of triglycerides in the blood, 2- Degradation of monoacylglycerol into specific or nonspecific lipases may delay hepatic triglyceride recombination in digestive epithelial cells or promote energy expenditure during absorption, even if absorbed, resulting in hepatic steatosis, nonalcoholic fatty liver, hyperlipidemia, secondary It can be used in medicines and dietary supplements to prevent, improve or treat type diabetes and / or obesity.

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Abstract

본 발명은 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용하여 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써 지방 흡수를 지연시키고, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시키며, 소화관에서 모노아실글리세롤을 모노아실글리세롤 리파아제로 분해할 경우, 흡수가 되더라도 소화상피세포에서의 중성지방 재결합을 지연하거나 이 과정의 에너지 소모를 촉진하여, 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만과 같은 대사증후군의 치료방법을 제공한다.

Description

2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료방법
본 발명은 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용하여 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써 지방 흡수를 지연시키고, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시키며, 소화관에서 모노아실글리세롤을 모노아실글리세롤 리파아제로 분해할 경우, 흡수가 되더라도 소화상피세포에서의 중성지방 재결합을 지연하거나 이 과정의 에너지 소모를 촉진하여, 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만과 같은 대사증후군의 치료방법을 제공한다.
최근 경제적 발전과 식습관 등의 변화에 따라 비만, 고지혈증, 고혈압, 동맥경화, 고인슐린혈증, 제2형 당뇨병, 간지방증 또는 비알코올성 지방간 등 다양한 질환을 포함하는 대사증후군 관련 질환의 발병이 급증하고 있는 상황이다. 이와 같은 질환들은 각각 발생하기도 하지만 일반적으로는 서로 밀접한 관련을 맺고 있으면서 여러 증상들을 동반하여 발생되는 경우가 대부분이다.
비만은 현대인의 건강을 가장 강력하게 위협하는 질병군이다. 고도의 비만은 인슐린의 감수성을 떨어뜨려 체내의 여러 대사 변화를 유발하게 되며, 결국 혈관계, 신경계 등 많은 합병증을 유발하여 사망하게 된다. 따라서 비만을 줄일 수 있는 생활습관이나 이에 대한 치료 약물을 개발하는 것이 의료계에서 매우 중요하게 생각되고 있다.
비만은 에너지의 섭취와 에너지의 사용의 불균형에서 초래된다. 첫째로 에너지의 섭취는 뇌의 시상하부 그 중추가 있으며, 체내에서 렙틴이나 그렐린 등의 호르몬에 의해 조절된다. 한번 섭취되어 소화관에서 흡수된 영양소는 결코 배설되지 않으며, 에너지로 사용되거나 몸에 저장된다. 따라서 비만 치료에서는 에너지의 섭취를 억제하는 메커니즘으로 비만 억제제를 개발하려는 노력이 있어 왔으며, 푸링이나 리덕틸 같은 식욕억제제가 사용되고 있다.
에너지 섭취를 감소하는 또 다른 방법은 소화관에서 지방의 흡수를 억제하는 방법이다. 이 방법을 이용한 약물은 제니칼이 있는데, 이는 이자의 지방분해효소인 리파아제를 억제하는 약물이다. 제니칼을 투여할 경우 중성지방은 분해되지 못하여 소화관에서 흡수되지 않고 대변으로 배출된다.
두 번째 방법은 에너지의 사용을 증대시키는 방법이다. 흔히 비만에 대한 사람들의 대처 방법이 "적게 먹고 운동을 많이 하는 것"이므로 운동을 많이 하여 에너지 소모를 증가시키는 것이 확실한 비만 치료라고 볼 수 있다. 최근에는 약물에 의해 에너지의 소모를 촉진시키기 위한 여러 노력이 이루어지고 있으며, 주로 갈색지방에 존재하는 짝풀림 단백질의 발현을 증가시켜 에너지 소모를 촉진하는 방향으로 연구가 이루어지고 있다.
하지만, 식욕을 억제하는 방법의 경우는 중추 신경에 작용하는 약물이 대부분으로 필연적인 신경계 부작용이 동반되는 경우가 많고, 식욕의 감소는 또한 우울함을 동반할 수 있는 문제점이 있으며, 소화관에서 지방 분해를 억제하는 제니칼의 경우 지방변과 그에 따른 악취 등으로 환자들이 복용하길 꺼려하며, 배변의사의 조절 문제로 사회 생활의 불편함도 초래한다. 짝풀림 단백질을 응용한 에너지 소모 촉진의 방법은 아직도 개발 단계이며, 장기별 특수성에 따라 약물의 특이성이 확보되기 전에는 사람에 이용되기 어려운 형편이다.
또한, 시판되고 있는 항비만제로는 티아졸리디네디온(thiazolidinediones, TZDs), 제니칼(한국로슈)과 시부트라민(sibutramine) 등이 있으나, 이러한 약물들의 부작용으로는 심혈관작용, 중추작용, 간장장애 및 신장장애 등이 있는 것으로 보고되었다. 그러므로 향후 장기 섭취 등에 따른 부작용이 없고 비만 예방과 치료를 겸한 고부가가치의 다기능성 제품의 개발이 시급한 실정이다.
한편, 모노아실글리세롤 리파아제(monoacylglycerol lipase, MGL)는 모노아실글리세롤을 절단하여 유리 지방산 및 글리세롤을 형성하는 것으로 알려져 있으며, 종래의 기술에서는 장내에서 모노아실글리세롤 리파아제의 발현 증가에 의해 과식에 기인한 비만 표현형을 야기하는 것으로 보고된바 있으며(Chon, et al., FASEB, 22:807, 2008), 모노아실글리세롤 리파아제를 억제함으로써, 통증, 염증 및 중추신경계(central nervous system; CNS) 장애의 치료에 유용하다고 보고되었다 (Schlossburg et al., Nat. Neurosci ., 13(9):1113, 2010). 이들 연구 보고는 모두 모노아실 글리세롤 리파아제가 체내 세포에서 작용할 때의 현상으로, 소화관 내에서 작용할 때에 대한 보고는 없으며, 사람의 소화관에서는 모노아실 글리세롤 리파아제 활성이 없다.
이에 본 발명에서는, 모노아실글리세롤 리파아제를 소화관에서 작용하게 할 경우 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써 지방 흡수를 지연시키고, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시킬 수 있으며, 소화관에서 2-모노아실글리세롤을 모노아실글리세롤 리파아제로 분해할 경우, 흡수가 되더라도 소화상피세포에서의 중성지방 재결합을 지연하거나 이 과정의 에너지 소모를 촉진할 수 있으므로, 2-모노아실글리세롤 절단 효소가 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있을 것이라는 아이디어에 착안하여 이를 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 치료방법을 제공하는데 목적이 있다.
2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 본 발명은 모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 비만의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 2-모노아실글리세롤 절단 효소는 2-모노아실글리세롤을 특이적 또는 비특이적으로 절단하는 리파아제일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 절단하는 효소는 사람, 마우스, 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 2-위치 특이적 리파아제(2-position specific lipase)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 균주에 의해 생산되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 2-모노아실글리세롤을 비특이적으로 절단하는 리파아제는 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 위치 비특이적 리파아제(positional non-specific lipase)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2-모노아실글리세롤 절단 효소는 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해하여, 2-모노아실글리세롤의 소화상피세포로의 흡수량을 저감하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 2-모노아실글리세롤 절단 효소는 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해하고, 상기 분해된 지방산과 글리세롤이 소화상피세포로 흡수되어 중성지방으로 재합성되는 과정으로 인해 에너지 소비가 증가하며, 이때, 상기 에너지 소비 증가는 소화상피세포 내에서 모노아실글리세롤 및 지방산이 중성지방으로 재합성되는 과정에 비해 3 내지 4개의 ATP가 더 소모되는 것일 수 있다.
본 발명은 간지방증(hepatic steatosis), 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 치료용 약제의 제조를 위한 2-모노아실글리세롤 절단 효소의 용도를 제공한다.
본 발명의 2-모노아실글리세롤을 절단 효소를 포함하는 조성물은 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써 지방 흡수를 지연시키고, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시키는 효과가 있으며, 소화관에서 2-모노아실글리세롤을 특이적 또는 비특이적 리파아제로 분해할 경우, 흡수가 되더라도 소화상피세포에서의 중성지방 재결합을 지연하거나 이 과정에서 에너지 소모를 촉진할 수 있으므로, 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만 등을 예방, 개선 또는 치료하는 의약품 및 건강기능식품에 활용할 수 있다.
도 1은 중성지방의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 소화관에서 중성지방의 소화 및 흡수과정을 나타낸 모식도이며, 이자의 리파아제에 의해 분해된 지방산 2개와 모노아실글리세롤은 소화상피세포로 흡수되며, 소화상피세포에서 다시 중성지방으로 재결합하여 카일로미크론의 형태로 임파계로 유리된다.
도 3은 중성지방을 소화한 후 소화상피세포에서 흡수된 지방의 중성지방 재합성 경로를 나타낸 모식도이며, 모노아실글리세롤 리파아제(monoacylglycerol lipase, MGL)가 존재하는 경우 중성지방은 지방산 3개와 글리세롤로 완전히 분해되기 때문에 소화상피세포에서 중성지방을 재형성하는데 더 많은 에너지를 소모하게 된다.
도 4는 사람과 마우스의 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 유전자은행 번호 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 대량 생산을 위해 제조된 박테리아 발현 벡터 시스템을 나타낸 것이다.
도 6은 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 분리 정제 후 SDS-PAGE를 시행한 결과를 나타낸 데이터로, 1은 투석 전, 2는 투석 후의 단백질을 의미한다.
도 7은 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 순수분리 정제 과정을 모식화한 그림이다.
도 8은 6주령 마우스에 돼지 췌장의 리파아제(대조군)와 Candida rugosa 리파아제(실험군)를 각각 7주간 투여한 후 체중 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 올리브 오일을 투여한 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)에 의한 혈중 중성지방 농도변화를 나타낸 데이터이다.
도 10은 올리브 오일을 투여한 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제에 의한 혈중 중성지방 농도변화를 시간 별로 측정한 그림이며, 타일록사폴(Tyroxapol) 투여 유무에 따라 표시하였다.
도 11은 모노아실글리세롤 리파아제 투여 후 1시간과 2시간 후에 마우스를 희생하여 소장 내에 작용하고 있는 효소의 활성을 측정한 결과이다.
도 12는 사람 소장 상피세포주인 Caco-2 세포를 이용하여 소장 상피세포 지방 재결합 능력이 모노아실글리세롤 리파아제의 투여에 의해 감소함을 보여주는 결과이다.
도 13a는 비만이 유발된 ob/ob 마우스에 BSA 또는 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)를 4주간 투여한 실험에서 시료의 투여 스케줄을 도식화한 것이다.
도 13b는 도 13a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스 모습을 보여주는 사진이다.
도 13c는 도 13a의 실험에서 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 식이량을 나타낸 것이다.
도 13d는 도 13a의 실험에서 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 대변의 지방량을 나타낸 것이다.
도 13e는 도 13a의 실험 동안 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 체중 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13f는 도 13a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에 대하여 포도당 부하검사를 실시한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13g는 도 13a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에서 간(liver)과 내장지방(epididymal fat, Epi-WAT)의 무게를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 14a는 도 13a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에서 적출한 간의 모습(위)과 이를 조직 현미경으로 관찰한 사진(아래)을 나타낸 것이다.
도 14b는 도 14a의 간에서 중성 지방과 콜레스테롤 수준을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 14c는 13a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에서 적출한 부고환 주변 지방 조직의 모습(위)과 이를 조직 현미경으로 관찰한 사진(아래)을 나타낸 것이다.
도 14d는 도 14c의 지방 조직에서 지방 세포의 평균 크기를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 15a는 도 13a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스의 서혜부 지방부(inguinal fat)에서 중성지방 합성 유전자와 지방산 합성 유전자의 발현 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15b는 도 13a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스의 서혜부 지방부(inguinal fat)에서 지방산 수송 유전자, 전사 유전자 및 산화 유전자의 발현 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16a는 고지방 식이를 공급한 C57BL/6 마우스에 BSA 또는 MGL을 투여한 실험에서 시료의 투여 스케줄을 도식화한 것이다.
도 16b는 도 16a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스 모습을 보여주는 사진이다.
도 16c는 도 16a의 실험에서 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 식이량을 나타낸 것이다.
도 16d는 도 16a의 실험에서 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 대변의 지방량을 나타낸 것이다.
도 16e는 도 16a의 실험 동안 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 체중 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16f는 도 16a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에 대하여 포도당 부하검사를 실시한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16g는 도 13a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에서 간(liver)과 내장지방(epididymal fat, Epi-WAT)의 무게를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 17a는 도 16a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에서 적출한 간의 모습(위) 및 이를 조직 현미경에서 H&E 염색으로 관찰한 사진(중간)과 오일-레드 오(oil-red O) 염색으로 관찰한 사진(아래)을 나타낸 것이다.
도 17b는 도 17a의 간에서 중성 지방과 콜레스테롤 수준을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 17c는 16a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에서 적출한 부고환 주변 지방 조직의 모습(위)과 이를 조직 현미경으로 관찰한 사진(아래)을 나타낸 것이다.
도 17d는 도 17c의 지방 조직에서 지방 세포의 평균 크기를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 17e는 도16a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에서 혈중 중성지방 및 혈중 콜레스테롤 수치를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 17f는 도16a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에서 간 수치인 ALT와 AST를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 17g는 도 16a의 실험 종료 후 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스에서 혈중 GLP-1 수준을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 18은 C57BL/6 마우스에 본 발명의 MGL 또는 제니칼(orlistat, ORL)을 3주간 투여한 후, 체중, 대변의 지방량 및 대변의 콜레스테롤량을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 도 18의 실험 중 제니칼 투여 그룹에서 사망한 마우스로부터 발견된 담낭 병변 사진을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 치료제로 사용되는 약물은 심장질환, 호흡기 질환, 혈압상승 및 불면증과 같은 부작용을 유발하며 그 효능의 지속성이 낮은 문제점이 있다. 따라서 향후 부작용이 없고, 대사증후군의 예방과 치료, 그리고 산화스트레스를 줄여 다양한 질환 예방 효과를 겸한 고부가 가치의 다기능성 제품의 개발이 시급한 실정이다.
이에, 본 발명은 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물 및 상기 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명에서 제공되는 조성물은 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써 지방 흡수를 지연시키고, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시키는 효과가 있으므로, 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 의약품 및 건강기능식품에 활용할 수 있다.
비만은 혈압 및 혈당을 상승시키고, 혈중 중성지방을 증가시키며 HDL 콜레스테롤을 감소시켜 결과적으로 대사증후군의 위험을 높이고, 궁극적으로는 심혈관 질환의 위험도를 증가시킬 수 있다. 상기 대사증후군(metabolic syndrome)은 복부 비만, 당뇨병, 이상지혈증(중성지방 상승, 고밀도 콜레스테롤 저하), 고혈압 등이 한 사람에게 동시다발적으로 생기는 것을 말한다. 즉, 본 발명의 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 조성물은 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 예방 또는 치료제로 사용이 가능하므로, 지질 관련 대상증후군 질환의 치료제로도 사용이 가능하다.
모노아실글리세롤 리파아제는 혈중 중성지방을 감소시킬 수 있으며, 상기 모노아실글리세롤 리파아제가 장 내에 존재하는 경우, 2-모노아실글리세롤이 지방산과 글리세롤로 완전히 분해되어, 모노아실글리세롤 및 지방산이 소화상피세포로 흡수되어 중성지방으로 재합성되는 과정을 지연시킬 수 있다.
또한, 상기 2-모노아실글리세롤을 절단 효소에 의해, 2-모노아실글리세롤이 지방산과 글리세롤로 완전히 분해되고, 상기 분해된 지방산과 글리세롤이 소화상피세포로 흡수되어 중성지방으로 재합성되는 과정으로 인해 에너지 소비가 증가하며, 이때, 에너지 소비 증가는 소화상피세포 내에서 모노아실글리세롤 및 지방산이 중성지방으로 재합성되는 과정에 비해 3 내지 4개의 ATP가 더 소모될 수 있다.
본 발명은 소화관에서의 영양소 흡수와 대사 경로의 특성에 착안한 역설적인 발상에서 출발한 것으로서, 소화관에서의 중성지방 소화를 더욱 촉진하여 지방 흡수를 줄이고 에너지 소모를 촉진하는 메커니즘에 기반을 두고 있다.
도 1에 나타난 바와 같이, 중성지방은 글리세롤에 세 개의 지방산이 결합된 형태를 가지고 있으며, 사람의 소화관에서 중성지방을 분해하는 효소는 이자에서 분비되는 리파아제가 대표적이다. 하지만, 상기 리파아제는 불완전한 리파아제로서, 1번과 3번의 지방산을 분해하지만 2번에 결합된 지방산을 유리하지 못하므로, 결국 이 효소에 의한 산물은 2개의 지방산과 1개의 모노아실글리세롤로 존재하게 된다.
도 2는 소화관에서 중성지방의 소화 및 흡수과정을 나타낸 모식도로, 이자의 리파아제에 의해 분해된 지방산 2개와 모노아실글리세롤은 소화상피세포로 흡수되며, 소화상피세포에서 다시 중성지방으로 재결합하여 카일로미크론의 형태로 임파계로 유리된다.
상기 두 개의 지방산과 모노아실글리세롤이 중성지방으로 결합하는 과정에는 소화상피세포에 존재하는 MGAT2라는 효소가 작용하며, 도 3 상단에 나타낸 바와 같이, 상기 효소는 모노아실글리세롤에서 지방산 하나를 붙여 다이아실글리세롤을 형성하며, 형성된 다이아실글리세롤은 곧 중성지방이 된다. 이렇게 중성지방을 재형성한 후 카일로미크론 형태의 지단백을 형성해야지만 임파계 혹은 혈관계로 분비되어 용해된 채로 순환할 수 있다.
도 3 하단에 나타낸 바와 같이, 상기 대사경로에서, 모노아실글리세롤 리파아제를 사용하여 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 분해한다고 가정하면 결국 중성지방의 재형성 경로가 달라지게 된다. 글리세롤은 에너지를 소모하여 인산화가 되어야 하고, 이에 지방산 2개가 붙어 포스파티딘산이 된 다음 인산이 떨어지고 다이아실글리세롤을 형성하는 과정에 의해서 중성지방을 재형성할 수 있다. 상기 과정은 2-모노아실글리세롤이 직접 중성지방을 형성하는 과정에 비하여 3~4개의 ATP가 더 소모되므로, 에너지 소모를 촉진하여 비만을 예방 또는 치료할 수 있게 된다.
즉, 본 발명에서는, 2-모노아실글리세롤을 절단 효소를 경구 복용하여 소화관 내에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해시키고, 지방의 흡수 및 재형성 지연/에너지 소모를 촉진하여 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만 치료에 사용하고자 하였다.
따라서, 본 발명은 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료방법; 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 간지방증 또는 비알코올성 지방간 예방의 또는 치료용 약학적 조성물; 또는 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 치료방법; 2-모노아실글리세롤을 절단 효소를 포함하는 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 또는 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 비만의 치료방법; 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 또는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법 또는 조성물에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤 절단 효소는 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해할 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 2-모노아실글리세롤을 특이적 또는 비특이적으로 절단하는 리파아제일 수 있다.
상기 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 절단하는 효소의 기원은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 사람, 마우스, 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 2-위치 특이적 리파아제(2-position specific lipase)일 수 있다.
본 발명의 용어 "2-위치 특이적 리파아제(2-position specific lipase)"란 트리글리세라이드의 2-위치에서의 지방 아실기 (fatty acyl group)에만 반응 특이성을 보이는 리파아제를 의미한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 2-위치 특이적 리파아제를 제조하기 위해 사람 또는 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제(MGL) 유전자 서열을 재조합 벡터에 도입하고 상기 모노아실글리세롤 리파아제 단백질을 대량 발현할 수 있는 E. coli 시스템을 이용하여 단백질을 발현하여 부분 정제하였으며, His-tag을 이용하여 목적 단백질의 정제를 용이하게 하였다. 그러나, 사람 또는 마우스 이외에도, 2-위치 특이적 리파아제를 암호화하는 유전자 서열이라면 제한없이 사용할 수 있다.
도 4는 사람과 마우스의 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 유전자은행 번호 및 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 필요에 따라서는 도 4에 제시된 사람 또는 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제의 일부 아미노산 서열을 변형시켜 효소활성을 증가시킬 수 있으며, 모노아실글리세롤 리파아제의 일부 염기서열을 변형시켜 재조합 미생물에서 모노아실글리세롤의 생산을 증가시킬 수 있다.
도 5는 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 대량 생산을 위해 제조된 박테리아 발현 벡터 시스템을 나타낸 것이며, 이를 이용하여 단백질을 대량 생산 후 조사한 결과 도 6에 나타낸 바와 같이 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 분리가 성공적으로 수행되었다. 모노아실글리세롤 리파아제의 순수분리를 위한 컬럼 정제 공정을 통해 이 단백질에 특화된 단백질의 대량 생산 과정을 도출하였으며, 이를 도 7에 나타내었다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤을 비특이적으로 절단하는 효소의 기원 또한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 위치 비특이적 리파아제(positional non-specific lipase)일 수 있다.
본 발명에서 용어 "위치 비특이적 리파아제 (non-specific lipase)"란 모든 트리글리세라이드의 모든 세 가지의 지방 아실기와 반응하는 리파아제를 의미한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예서는, 위치 비특이적 리파아제로 Candida rugosa 유래 리파아제를 사용하였으나, Candida rugosa 이외에도, 다른 효모, 곰팡이, 박테리아 등의 미생물 유래 위치 비특이적 리파아제를 사용할 수 있다.
도 8은 6주령 마우스에 Candida rugosa 유래 리파아제를 총 6주간 투여하여 체중 변화를 측정한 결과로, 2-모노아실글리세롤을 비특이적으로 절단 효소가 비만 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 나타낸다. 이를 통해, 2-위치 특이적 리파아제 뿐만 아니라 위치 비특이적 리파아제 또한 비만 치료제로 사용될 수 있다는 것을 확인하였다. 특히, 2-위치 특이적 리파아제는 2-모노아실글리세롤에만 특이적으로 작용하므로, 위치 비특이적 리파아제 보다 기질 특이성 및 분해 활성이 더 우수하여 더욱 효과적으로 비만을 치료할 수 있다. 따라서, 2-위치 특이적 리파아제는 다른 추가의 성분과의 조합하지 않고 단독으로 사용하여도 비만 치료효과가 탁월하다.
도 9는 올리브 오일을 투여한 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)에 의한 혈중 중성지방 농도변화를 나타낸 데이터이며, 도 10은 올리브 오일을 투여한 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제에 의한 혈중 중성지방 농도변화를 시간 별로 측정한 그림이다. 이 결과로 모노아실글리세롤 리파아제의 투여가 혈중 중성지방의 감소에 효과가 있음을 확인하였으며, 고지혈증 치료제로 이용할 수 있음을 보여준다.
도 11과 12는 각각 모노아실글리세롤 리파아제가 투여 후 소장 내에 작용한다는 것과 사람 소장 상피세포주인 Caco-2 세포에서 지방 재결합 지연 효과를 보여주는 결과이다.
도 13a 내지 13g는 비만이 유발된 ob/ob 마우스에 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)를 4주간 투여한 후, 체중 변화(도 13b 및 13e), 식이량 변화(도 13c), 대변의 지방량(13d), 포도당 부하검사 결과(도 13f) 및 간(liver)과 내장지방(epididymal fat, Epi-WAT)의 무게(도 13g)를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 또한, 도 14a 내지 도 14d는 도 13a 실험의 연장선으로, 비만이 유발된 ob/ob 마우스에 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)를 4주간 투여한 후 간의 모습(도 14a), 상기 간의 중성 지방과 콜레스테롤 수준(도 14b), 부고환 지방 조직의 모습(도 14c) 및 상기 지방 조직의 지방 세포 평균 크기(도 14d)를 나타낸 것이다.
상기 실험 결과를 통해, MGL 투여로 인한 체중 감소와 간의 크기로 보여지는 지방간의 감소, 내장 지방의 감소를 확인할 수 있었다. 따라서, 모노아실글리세롤 리파아제의 장기 투여가 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 완화와 체중 감소에 효과를 나타냄을 알 수 있으며, 이는 모노아실글리세롤 리파아제를 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료제와 비만 치료제로 활용할 수 있음을 시사한다.
또한, 모노아실글리세롤 리파아제의 투여는 식이량에 변화를 가져오지 않으며, 지방변과 같은 부작용도 나타내지 않음을 확인하였다. 지방변은 종래 비만 치료제 중 하나인 제니칼의 심각한 부작용으로, 본 발명의 모노아실글리세롤 리파아제는 이러한 부작용을 전혀 나타내지 않으면서 총 체중의 15% 감량 효과를 나타내는바, 비만 치료제로서 탁월한 효능을 발휘함을 확인하였다.
도 8과 13e의 결과를 직접적으로 비교하면, 도 8은 위치 비특이적 리파아제의 한 종류인 Candida rugosa 유래 리파아제를 2,000 unit/day로 투여한 후 체중 감량 효과를 본 것이고, 도 13e는 2-위치 특이적 리파아제인 모노아실글리세롤 리파아제를 약 100 unit/day로 투여하고 체중 감량 효과를 본 것으로, 상기 두 실시예에서 효과는 비슷하게 약 3 g 정도의 체중 감량 효과를 보였다. 이는 (1) 모노아실글리세롤을 기질로 한 반응에서 2-위치 특이적 리파아제의 단백질당 활성이 비특이적 리파아제보다 월등하게 높음(50~100배)을 말해주고, (2) 비특이적 리파아제의 2-모노아실글리세롤에 대한 친화력이 2-위치 특이적 리파아제만큼 우수하지 않다는 점을 말해주며, (3) 2-위치 특이적 리파아제는 생리적인 소화액에 의한 중성지방 분해에 영향을 주지 않아 흡수되지 않아도 될 중성지방을 오히려 분해하는 현상이 일어나지 않음을 시사한다. 이러한 사실은 2-위치 특이적 리파아제가 비특이적 리파아제보다 매우 우수한 치료효과를 보일 수 있음을 의미한다.
아울러, 본 발명의 모노아실글리세롤 리파아제를 비만이 유발된 ob/ob 마우스에 4주간 투여한 후에 포도당 부하검사를 실시한 결과, 모노아실글리세롤 리파아제의 투여로 인해 비만이 완화되고, 이에 따라 도 13f에 나타난 바와 같이 체내 대사가 개선되어 포도당 처리 능력이 향상됨을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 모노아실글리세롤 리파아제의 투여가 제2형 당뇨병과 같은 대사증후군 치료에 연결될 수 있음을 보여준다.
도 15a 및 15b 또한 도 13a 실험의 연장선으로, 도 15a는 BSA 투여 그룹과 MGL 투여 그룹의 마우스의 피하지방(subcutaneous fat tissue)이라 할 수 있는 서혜부 지방부(inguinal fat)에서 중성지방 합성 유전자와 지방산 합성 유전자의 발현 변화를 나타낸 것이고, 도 15b는 서혜부 지방부(inguinal fat)에서 지방산 수송 유전자, 전사 유전자 및 산화 유전자의 발현 변화를 나타낸 것이다. 이를 통해, MGL 투여 그룹에서 중성지방 합성 및 지방산 합성 유전자의 발현은 변화가 없거나, MGL 그룹에서 오히려 증가한다는 것을 알 수 있고, 지방산 수송 유전자도 유사한 패턴을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 MGL 투여군에서 지방 축적이 감소하는 것이 소화관에서 흡수가 적어지거나 소모된 것이기 때문이지 중성지방 합성이나 수송 또는 지방산 합성이 감소한 결과가 아님을 의미한다. 특이한 점은 PGC1과 UCP1의 발현이 MGL 투여군에서 두드러지게 증가해 있다는 것이며, 이는 백색 지방의 갈색화가 일어나고 있음을 의미하고 에너지 소모가 증가하였음을 의미한다.
도 16a 내지 16g는 고지방 식이를 공급한 C57BL/6 마우스에 MGL을 투여한 후, 체중 변화(도 16b 및 16e), 식이량 변화(도 16c), 대변의 지방량(16d), 포도당 부하검사 결과(도 16f) 및 간(liver)과 내장지방(epididymal fat, Epi-WAT)의 무게(도 16g)를 측정한 결과를 보여준다. 비만을 유발한 ob/ob 마우스에서의 결과(도 13b 내지 13g)와 마찬가지로, MGL 투여는 총 체중의 약 15% 정도의 체중 감소 효과를 나타내고, 식이량에 변화를 나타내지 않으며, 지방변과 같은 부작용도 나타내지 않음을 확인하였다. 또한, 포도당 부하 검사에서 내당 능력이 향상되었고, 간의 무게와 지방 조직의 무게도 상당히 감소한 것을 확인하였다.
도 17a 내지 도 17g는 도 16a 실험의 연장선으로, 고지방 식이를 공급한 C57BL/6 마우스에 MGL을 투여한 후, 간의 모습(도 17a), 상기 간의 중성 지방과 콜레스테롤 수준(도 17b), 부고환 지방 조직의 모습(도 17c) 및 상기 지방 조직의 지방 세포 평균 크기(도 17d), 혈중 중성지방과 콜레스테롤 수치(도 17e), 간수치인 ALT와 AST 수치(도 17f) 및 혈중 GLP 변화를 측정한 결과이다. 이를 통해, BSA 투여군에 비해 MGL 투여군에서 지방간이 현저하게 개선되었고, 간의 중성 지방량이 크게 감소하였으며, 콜레스테롤 수치도 감소한 것을 알 수 있다. 또한, 지방 조직 및 지방세포의 크기가 감소하였고, 평균 지방세포 크기도 감소하였으며, 혈중 중성지방이 감소한 것을 확인할 수 있었다. ALT 및 AST와 같은 간수치도 상당히 감소하였으며, 식이에 영향을 미칠 수 있다고 알려진 GLP-1에는 변화가 없었다.
도 18은 본 발명의 MGL 투여 그룹과 종래 비만 치료제로 알려진 제니칼(ORL) 투여 그룹의 비교 실험을 나타낸 결과로, MGL 투여 그룹과 ORL 투여군에서 유사한 정도의 체중 감소 효과가 관찰되었으나, 대변의 지방량 및 콜레스테롤량은 ORL 투여군에서 현저하게 높게 나타남을 확인하였다. 추가로, ORL 투여 그룹에서 실험 중 사망한 4마리의 마우스를 부검한 결과, 도 19에 나타난 바와 같이 담낭이 까맣게 변한 소견을 보였으며, 이는 제니칼의 부작용으로 보고된 증상들 중 색소침착 담석(pigmented gall stone)인 것으로 판단된다.
이상의 결과를 통해, 본 발명의 MGL 투여는 탁월한 항비만 효과 및 지방간 치료효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 특히, 본 발명의 MGL은 4주 투여 시 총 체중의 15% 감량에 해당하는 체중 감소효과를 나타내며, 현재 개발되어 사용되고 있는 항비만제를 1년 동안 투여하였을 때 8~11%의 체중 감량 효과를 나타내면 좋은 약물로 간주하는 것을 고려한다면, 본 발명의 마우스 실험에서 입증된 결과는 거의 최대치의 효과로 판단되며, 매우 우수한 체중 감소효과를 나타내는 것으로 판단된다. 추가로, 현재 비만 치료제로 사용되고 있는 제니칼과의 효과를 비교하면, MGL과 제니칼은 성상이 서로 다른 약물로서 최적의 용량을 정의할 수 없기 때문에 체중 감량 효과에 대한 비교 우위는 파악할 수 없으나, 본 발명의 MGL은 제니칼의 치명적인 단점인 지방변 및 담낭 병변이 전혀 나타나지 않아, 종래의 비만 치료제를 대체할 수 있는 우수한 약물임을 시사한다.
본 발명에 따른 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구를 통해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 여러 가지 제형으로 제제화할 수 있다. 제제화할 경우에는 2-모노아실글리세롤 절단 효소의 활성을 저해하지 않는 범위에서 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 모노아실글리세롤 리파아제에 적어도 하나 이상의 부형제(예를 들면, 전분, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴) 등이 섞여 조제될 수 있다. 바람직하게는, 2-모노아실글리세롤 절단 효소의 활성이 위산과 위액에 의해 파괴되는 것을 방지하기 위해 코팅제제를 사용할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있다. 비수용성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 약학적 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 1 내지 500 unit/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 1 unit은 pH 7.4, 37 조건에서 1시간 동안 모노아실글리세롤 1 μmole이 완전히 분해되는 양을 의미한다. 또한 모노아실글리세롤 리파아제를 포함하는 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 2-모노아실글리세롤을 절단 효소를 포함하는 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 포함하는 건강기능식품의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있다.
상기 건강식품은 상기 모노아실글리세롤 리파아제 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 비알코올성 지방간 예방용 음료는 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 것 이외에 칼슘, 가시오가피 농축액, 액상과당, 정제수 등을 첨가 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조할 수 있다. 또한, 상기 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 포함하는 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만 예방용 건강보조제는 모노아실글리세롤 리파아제에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올, 정제수를 첨가 혼합하여 과립상으로 성형하여 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형하여 정제 또는 분말로 하거나 경질캡슐에 충전하여 경질캡슐제품으로 제조할 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 상기 2-모노아실글리세롤을 절단 효소의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명에 있어서, ‘개체’는 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기간 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자일 수 있다.
본 발명은 간지방증(hepatic steatosis), 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만의 치료용 약제의 제조를 위한 2-모노아실글리세롤 절단 효소의 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 모노아실글리세롤 리파아제 단백질의 제조 및 정제
1-1 : 재조합 벡터 및 재조합 미생물 제조
본 발명에서는 모노아실글리세롤 리파아제 단백질을 제조하기 위해 단백질을 대량 발현할 수 있는 E. coli 시스템 및 His-tag을 이용하였으며, 사람 유래 모노아실글리세롤 리파아제 mRNA(Genebank Number: NM_001003794) 및 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제 mRNA(Genebank Number: NM_011844)의 전사해독틀(open reading frame; ORF) 부분을 pT7-HMT(His-Myc-TEVprotease) 벡터(Geisbrecht BV et al., Protein Expression Purif 46:23-32, 2006)에 클로닝하였다.
상기 pT7-HMT 벡터는 6개의 His-tag과 목적단백질을 융합하여 박테리아에서 발현시키는 벡터이며, 발현되는 단백질을 쉽게 정제할 수 있는 특징이 있고, TEV protease를 이용해서 필요시에 tag을 분리해낼 수 있는 장점이 있다.
먼저, 사람 또는 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제 mRNA의 ORF 부분(ATG 시작 코돈 제외)을 증폭할 수 있는 프라이머를 하기 표 1과 같이 제작하였으며, 증폭된 유전자를 벡터에 삽입할 수 있도록 제한효소 사이트가 포함되도록 제작하였다.
프라이머 서열
유전자 프라이머 서열 제한효소 서열번호
사람MGL forward 5'-GCCATATGccagaggaaagttccccagg-3' NdeI 서열번호 1
reverse 5'-CGCTCGAGtcagggtggggacgcagttc-3' XhoI 서열번호 2
마우스MGL forward 5'-GCGTCGACcctgaggcaagttcacccagg-3' SalI 서열번호 3
reverse 5'-CGCTCGAGtcagggtggacacccagctc-3' XhoI 서열번호 4
(밑줄 친 부분은 제한효소가 작용하는 부분을 표시한 것임)
사람 또는 마우스 유래 총 RNA를 지방조직으로부터 추출하고, 이를 주형으로 하여 상기 표 1의 각각의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR증폭 산물의 서열을 확인한 결과, 사람의 모노아실글리세롤 리파아제 유전자는 서열번호 5로, 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 것을 확인하였다 (표 2).
유전자 서열 정보
유전자 유전자 염기서열 서열번호
사람MGL GCCATATGccagaggaaagttcccccaggcggaccccgcagagcattccctaccaggacctccctcacctggtcaatgcagacggacagtacctcttctgcaggtactggaaacccacaggcacacccaaggccctcatctttgtgtcccatggagccggagagcacagtggccgctatgaagagctggctcggatgctgatggggctggacctgctggtgttcgcccacgaccatgttggccacggacagagcgaaggggagaggatggtagtgtctgacttccacgttttcgtcagggatgtgttgcagcatgtggattccatgcagaaagactaccctgggcttcctgtcttccttctgggccactccatgggaggcgccatcgccatcctcacggccgcagagaggccgggccacttcgccggcatggtactcatttcgcctctggttcttgccaatcctgaatctgcaacaactttcaaggtccttgctgcgaaagtgctcaaccttgtgctgccaaacttgtccctcgggcccatcgactccagcgtgctctctcggaataagacagaggtcgacatttataactcagaccccctgatctgccgggcagggctgaaggtgtgcttcggcatccaactgctgaatgccgtctcacgggtggagcgcgccctccccaagctgactgtgcccttcctgctgctccagggctctgccgatcgcctatgtgacagcaaaggggcctacctgctcatggagttagccaagagccaggacaagactctcaagatttatgaaggtgcctaccatgttctccacaaggagcttcctgaagtcaccaactccgtcttccatgaaataaacatgtgggtctctcaaaggacagccacggcaggaactgcgtccccaccctgaCTCGAGCG 서열번호 5
마우스MGL GCGTCGACcctgaggcaagttcacccaggcgaactccacagaatgttccctaccaggacctgcctcacctggtcaatgcagacggacagtacctcttttgtagatactggaagcccagtggcacacccaaggccctcatctttgtgtcccatggagctggggaacactgtggccgttatgatgagctggctcatatgttgaaggggctggacatgctggtatttgcccatgaccatgttggccatgggcagagtgagggagagaggatggtggtgtcggacttccaagtttttgtcagagatgtgctgcaacacgtggacaccatccagaaggactaccccgacgtccccatcttcctcctgggccactccatgggcggtgccatctccatcctagtggctgcagagaggccaacctacttttctggcatggtcctgatttcacctctggtccttgccaatccggaatctgcatcgactttgaaggtccttgctgccaaactgctcaattttgtcctgccaaatatgaccttggggcgcattgactccagcgtgctgtctcggaacaagtcggaggttgacctgtacaactctgacccactcgtctgccgagcagggctgaaggtgtgctttggcatacagctgctgaatgccgtcgcaagagtggagcgagcaatgcccaggctgacactgccattcctgctgctgcagggttctgctgaccggctttgcgacagcaaaggtgcctacctgctcatggaatcatcccggagtcaggacaaaacactcaagatgtatgaaggtgcctatcacgtcctccacagggagcttccggaagtgaccaactccgtcctccatgaagtaaactcgtgggtgtctcacaggatagcagcagcaggagctgggtgtccaccctgaCTCGAGCG 서열번호 6
상기 증폭시킨 사람 또는 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제 유전자를 NdeI(Cat. No. R0111S; New England BioLabs, 미국) 혹은 SalI(Cat. No. R0138S; New England BioLabs, 미국) 및 XhoI(Cat. No. R0146S; New England BioLabs, 미국)로 절단한 다음, 동일한 제한 부위를 전달한 pT7-HMT 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 이 경우 6개의 His-tag은 단백질의 정제에, Myc-tag은 향후 웨스턴 분석법에 의한 단백질 검출에 이용될 수 있도록 하였다. 또한 필요시 TEV protease를 적용하여 His-Myc-tag을 제거할 수 있도록 디자인하였다.
1-2 : 모노아실글리세롤 리파아제 단백질 생산 및 정제
그 다음, 상기 재조합 벡터를 대장균인 BL21(DE3)pCodon plus 균주(Cat. No. #230245; Agilent, 미국)에 형질전환하였다. 이 균주를 카나마이신(kanamycin) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)과 2%의 에탄올이 함유된 LB 배지 500 ㎖에 접종하여 600 nm의 흡광도가 0.5~0.6이 될 때까지 키운 다음, 단백질 발현을 위해 IPTG를 1 mM로 첨가하여 섭씨 16도에서 16시간 동안 더 배양하였다.
배양액에서 균을 원심분리로 수확하여 Lysis buffer(50mM Tris-Cl, pH8.0, 500mM NaCl, 5mM imidazole, pH8.0)에 부유하고, Triton X-100을 1%로 첨가한 다음 lysozyme을 포함한 냉동-해동 방법으로 균을 깨뜨려 단백질 균등액을 만들었다. 초음파 분쇄법으로 핵산을 분해하고 원심분리 후 Ni-NTA agarose bead (Cat. No. 30210, Qiagen, 미국)을 이용하여 His-Myc-MGL 융합 단백질을 컬럼에 결합하였다. 박테리아 용해에 따른 내독소(endotoxin)를 제거하기 위하여 컬럼을 Triton X-114가 0.1%로 포함된 washing buffer를 이용하여 50 컬럼부피로 씻어내고, 그 후 Triton X-114가 없는 washing buffer를 이용하여 10 컬럼부피로 씻어내었다.
컬럼에 부착된 단백질의 용출은 여러 테스트 결과 imidazole이 아닌 EDTA를 이용하여 용출하였다. 용출용액(150 mM EDTA, pH 8.0, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 8.0)을 사용하여 수확한 단백질은 이후 200배의 50 mM Tris-Cl, pH 8.0으로 투석을 실시하여 "crude MGL"이라 하여 실험에 이용하였다.
도 6은 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 분리 정제 후 SDS-PAGE를 시행한 결과를 나타낸 데이터로, 본 발명에서 정제한 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제(MGL)의 크기는 약 33kDa인 것을 확인하였으며, 실제 마우스 모노아실글리세롤과 동일한 크기를 가지는 것을 확인하였다.
동물에 투여할 모노아실글리세롤 리파아제는 상기 crude MGL을 도 7과 같은 공정을 통해 HiTrap Phenyl HP, HiTrap SP, HiTrapQ 컬럼을 순차적으로 적용하여 더욱 순수하게 정제하였다.
[실시예 2] 모노아실글리세롤 리파아제 단백질의 활성 측정
본 발명에서는 실시예 1에서 정제한 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제의 활성을 측정하기 위해 분리한 단백질과 그 기질인 oleoyl-rac-glycerol (Cat. No. M7765, Sigma, 미국)을 반응시키고, 그에 의해 유리되는 glycerol을 Glycerol assay kit(Cat. No. MAK117, Sigma, 미국)를 사용하여 키트에 첨부된 매뉴얼을 참고로 측정하였다. 1 unit은 pH 7.4, 37 조건에서 1시간 동안 모노아실글리세롤 1 μmole이 완전히 분해되는 양으로 정의하였다. 이 활성 측정법은 glycerol standard를 참고로 하여 그 양을 계산하였다.
또한 단백질의 농도는 Pierce™ BCA assay kit(Cat. No. 23225, ThermoFisher Scientific, 미국)를 이용하여 측정하였으며, 이를 통하여 mg 당 활성도를 계산하였다.
단백질에 남아있을 수 있는 내독소(endotoxin)는 Pierce™ LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit (Cat. No. 88282, ThermoFisher Scientific, 미국)을 이용하여 측정하였다.
위와 같이 측정한 마우스 유래 모노아실글리세롤 리파아제는 다음과 같은 결과를 보였다.
농도 3~5 mg/ml, total 300~500 mg / 40 liter culture
활성도 30~100 units/mg protein
내독소 <10 EU/ml (*EU, endotoxin unit)
[실시예 3] 2-모노아실글리세롤의 절단과 비만 감소 효과
본 실시예에서는 2-모노아실글리세롤 절단 효소에 의한 비만 감소 효과를 확인하였다. 구체적으로, 1,3-특이적 리파아제로 돼지 췌장의 리파아제(L3126, Sigma, 미국)를 대조군으로 하고 비특이적 리파아제로 Candida rugosa 리파아제(L1756, Sigma, 미국)를 선택하여 ob/ob 마우스(중앙실험동물, 한국)에 7주간 가베지로 투여하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 비특이적 리파아제인 C. rugosa의 리파아제는 대조군에 비하여 체중이 의미있게 감소하였으며, 이는 2-모노아실글리세롤을 절단하는 단백질 또는 화합물 등이 비만 치료에 이용될 수 있음을 의미한다.
[ 실시예 4] 모노아실글리세롤 리파아제 투여에 의한 혈중 중성지방 감소 효과
본 발명에서는 실시예 1에서 제조한 마우스 모노아실글리세롤 리파아제에 의해 실제 혈중 중성지방이 감소하는지 확인하기 위해 마우스에 모노아실글리세롤 리파아제를 경구 투여하였으며, 실시예 2의 활성 측정결과를 바탕으로 마우스에 단위(unit)만큼 투여하였다.
먼저, C57BL6/J 마우스를 4시간 이상 금식한 후에 올리브 오일 250 ㎕를 튜브를 이용한 가베지(gavage) 방법으로 투여하였으며, 동시에 대조군은 식염수 250 ㎕를, 실험군은 250 ㎕의 모노아실글리세롤 리파아제 단백질을 투여하였다.
2시간 후에 마우스를 희생하여 혈액을 채취한 다음 혈중 중성지방의 양을 분석하였으며, Triglyceride Colorimetric Assay Kit(Cat No 10010303, Cayman, 미국)를 사용하여 키트에 포함된 매뉴얼에 따라 흡광도 500nm에서 측정하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 모노아실글리세롤 리파아제를 투여한 마우스 군에서 혈중 중성지방이 크게 감소한 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 모노아실글리세롤 리파아제는 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시키는 효과가 있다는 것을 확인하였다.
또한, 상기와 같은 실험을 시간 별로 측정한 결과 도 10에 나타난 바와 같이 생리식염수 투여 그룹보다 모노아실글리세롤 리파아제 투여 그룹에서 지방의 흡수가 매우 낮았으며(도 10의 왼쪽), 타일록사폴(Tyloxopol)을 투여하여 지방조직에 혈중 지방이 유리되는 것을 방지한 실험에서 더욱 확실히 나타났다(도 10의 오른쪽).
[실시예 5] 소장에서의 모노아실글리세롤 리파아제 활성도 측정
본 실시예에서는 상기 실시예 4에서 입증된 지방 흡수 감소 효과가 실제로 모노아실글리세롤 리파아제가 작용한 결과임을 증명하기 위하여 경구 투여한 마우스 모노아실글리세롤 리파아제의 활성도를 소장에서 측정하였다.
생리식염수 혹은 모노아실글리세롤 리파아제를 투여한 후에 1시간 또는 2시간 이후 마우스를 희생하여 소장 중 공장(jejunum) 부위를 근위부(proximal)와 원위부(distal)로 나누어 해부하고, 이를 PBS에 담가 소장 내의 물질이 PBS에 용출되도록 하였다. 여기에 존재하는 모노아실글리세롤 리파아제의 활성을 실시예 2에서의 방법을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 11에서 나타낸 바와 같이 모노아실글리세롤(MGL)을 투여한 그룹은 경구 투여 후 1시간 후 근위부에서 2시간 후 원위부로 이용하는 것을 볼 수 있으며, 여기에 남아 있는 단백질의 총 활성은 경구 투여한 단백질의 1/5~1/10에 해당하였다. 이는 투여한 모노아실글리세롤 리파아제가 위산과 위액에 의해 파괴되지만 적어도 1/10에 해당하는 효소 활성이 소장에서 작용하고 있음을 의미한다. 따라서 마우스 실험에는 체내 필요량보다 과량을 투여할 필요가 있음을 말해준다. 향후 코팅제제 등의 방법으로 모노아실글리세롤 리파아제를 위산과 위액으로부터 보호할 수 있다.
[ 실시예 6] 모노아실글리세롤 리파아제에 의한 소장세포의 중성지방 재결합 지연 효과
본 실시예에서는 상기 실시예 4와 실시예 5에서 확인된 중성지방 흡수 지연 효과가 실제로 소장세포의 중성지방 재결합 및 혈중 유리 과정을 지연함으로써 나타남을 증명하기 위하여 사람의 소장세포주인 Caco-2 세포(Cat No. HTB37, ATCC, 미국)를 이용하여 실험하였다. 이 배양 시스템은 도 12에 나타낸 바와 같이 소장관 쪽을 apical side로 놓아 소화 지방과 실시예 1에서 제조한 마우스 모노아실글리세롤 리파아제 단백질을 투여하고, 혈액 쪽을 basolateral side로 놓아 이 사이에 놓인 소장상피세포가 소화관에서 지방을 흡수하여 혈액으로 유리할 수 있는지를 검사하는 시스템이다. Caco-2 세포를 21일 동안 분화시키고 양측 배지가 세포를 통하지 않고서는 섞일 수 없도록 분화 후 세포간 연결이 잘 되어있는지를 저항 측정법으로 확인한 다음, 소장관 쪽에 oleic acid와 monooleoylglycerol을 투여하고, 생리식염수 혹은 모노아실글리세롤 리파아제를 투여하였다. 17시간 동안 배양기에 둔 다음 혈액 쪽 배지를 회수하여 이 배지에 포함되어 있는 지단백 표면 단백질인 ApoB 단백질을 ELISA 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 12의 오른쪽 그래프에 나타난 바와 같이 모노아실글리세롤 리파아제 투여군에서 ApoB의 검출량이 매우 낮아졌음을 확인하였고, 이는 이 효소에 의해 모노아실글리세롤의 흡수를 저해하면 소장 상피세포의 혈중 지방 유리를 지연 또는 감소시킬 수 있다는 직접적인 증명이다.
[실시예 7] 비만 유발 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제의 투여 효과
7-1. 모노아실글리세롤 리파아제 투여에 따른 체중, 식이량 변화 및 지방변 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 마우스 모노아실글리세롤 리파아제를 4주간 투여한 비만 ob/ob 마우스에서 체중 감소 혹은 체중 증가 지연 효과가 나타나는지 확인하였다. 렙틴 유전자의 돌연변이로 식욕억제가 둔화되어 비만 형질을 나타내는 ob/ob 마우스(중앙실험동물, 한국)를 대상으로 8주령 마우스에 약 100 units/day의 모노아실글리세롤 리파아제를 경구 가배지(oral gavage)로 4주간 매일 투여하였다. 사료의 섭취와 모노아실글리세롤 리파아제의 작용 시점을 동일화하기 위하여 낮 주기(light cycle)에 금식을 시킨 다음 밤 주기(dark cycle)에 식이를 시작하기 전에 MGL을 투여하였다(도 13a).
그 결과, 도 13b 및 13e에 나타난 바와 같이 모노아실글리세롤 리파아제 투여 후 체중이 의미있게 감소하여 4주 후 총 체중의 15% 감량 효과가 나타남을 확인하였다.
소장 내에서 모노아실글리세롤을 절단하여 지방 흡수가 지연되면 식이량도 변화할 수 있고 대변으로 지방이 과다 배출되어 지방변이 유발될 가능성을 생각할 수 있는데, 이를 조사하기 위해 모노아실글리세롤 리파아제를 투여하는 중에 식이량을 측정하고, 또한 무작위로 변을 채취하여 지방 함량을 조사하였다. 그 결과, MGL 투여 그룹과 BSA 투여 그룹 간의 식이량과 대변의 지방량은 유사하여(도 13c 및 13d), 모노아실글리세롤 리파아제의 투여로 인한 식이량 변화는 나타나지 않았으며, 지방변과 같은 부작용도 나타나지 않음을 확인하였다. 이는 지방 흡수를 저해하는 작용이 소장에서의 에너지 소모를 촉진하는 것과 동반됨을 의미하며, 제니칼(성분명 orlistat)과 같은 약물이 지방 흡수를 억제하는 것과는 메커니즘이 다르고 지방변 부작용도 없음을 보여주고 있다.
상기 결과를 실시예 4 내지 6의 결과와 종합하면, 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제의 투여가 소장 상피세포의 중성지방 재결합을 지연 혹은 감소시키고, 이에 따라 혈중에 유리되어 지방조직에 축적되는 지방량이 감소되어 체중 감소로 이어짐을 나타낸다. 이는 이 효소에 의해 모노아실글리세롤 흡수가 저해되므로, 모노아실글리세롤 리파아제를 비만 치료제로 이용할 수 있다는 것을 의미한다.
7-2. 포도당 부하검사
상기 실시예 7-1에서 BSA 또는 모노아실글리세롤 리파아제를 투여한 마우스를 대상으로 포도당 부하검사를 실시하였다. 모노아실글리세롤 리파아제가 투여된 마우스에 포도당 1.5 mg/g 체중 복강주사로 투여하였으며, 부하 전, 부하 후 15분, 30분, 60분 및 120분에 채혈하여 혈당치를 측정하였다.
그 결과, 도 13f에 나타난 바와 같이 포도당 부하검사가 크게 향상된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 모노아실글리세롤 리파아제가 당뇨병과 같은 대사증후군 치료에 사용될 수 있음을 시사한다.
7-3. 모노아실글리세롤 리파아제 투여에 따른 지방간 개선 및 지방 감소 효과
상기 실시예 7-1에서 BSA 또는 모노아실글리세롤 리파아제를 투여한 마우스를 에테르로 마취하여 개복하였으며, 간과 부고환 주변 지방조직(epididymal fat tissue)을 적출하여 관찰하였다.
그 결과, MGL 투여 그룹에서 간 무게와 지방 조직의 무게가 상당히 감소하였으며(도 13g), 지방간이 현저하게 개선되었고(도 14a), 간의 중성 지방량 및 콜레스테롤 수치도 크게 낮아졌음을 확인하였다(도 14b). 또한, MGL 투여에 따라, 부고환 주변 지방 조직은 크기가 감소하였고, 조직 현미경으로 관찰한 결과 지방세포의 크기가 매우 작아짐을 확인하였다(도 14c). 도 14d는 지방세포의 평균 크기를 그래프로 나타낸 것으로, BSA 투여 그룹에 비해 MGL 투여 그룹에서 지방세포의 평균 크기가 현저하게 작아진 것을 확인할 수 있었다.
7-4. 서혜부 지방에서의 유전자 발현 변화
실시예 7-3의 마우스로부터 피하지방(subcutaneous fat tissue)이라 할 수 있는 서혜부 지방(inguinal fat)을 분리하여 중성지방 합성 유전자(DGAT1, GPAT2, MGAT1, Lipin2 및 Lipin3), 지방산 합성 유전자(SCD1, FAS 및 ME1), 지방산 수송 유전자(CD36 및 FATP1), 지방산 전사 유전자(PPARγ2, PPARα 및 PGC1), 지방산 산화 유전자(L-CPT1, ACOX1 및 UCP1)의 발현 변화를 관찰하였다.
구체적으로, 마우스를 희생한 후 서혜부 지방을 분리하고 100 mg 조직을 Trizol reagent(Cat. No. 15596, Invitrogen, 미국) 1 ml에 갈아넣고 원심분리하여 기름 층을 제거하고 상층액을 취한 다음, 여기에서 RNA를 추출하였다. 분리된 RNA 2 ug에서 SuperScript III reverse transcriptase (Cat. No. 18-080-044, Invitrogen, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성하고 이를 바탕으로 Real-time qPCR을 SYBR Green Master mix (Cat. No. 4309155, Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 시행하였다. 각 유전자의 발현은 rRNA의 발현으로 보정하여 그래프로 나타내었다. 유전자 발현 검출을 위한 프라이머 서열은 하기 표 3과 같다.
유전자 서열 서열번호
rRNA forward 5’- GCAGG TGTTT GACAA CGGCA-3’ 서열번호 9
reverse 5’- GATGA TGGAG TGTGG CACCG-3’ 서열번호 10
PPARα forward 5'-GTGTA CGACA AGTGT GATCG-3' 서열번호 11
reverse 5'-GATTT GAGGT CTGCA GTTTC-3' 서열번호 12
ACOX1 forward 5'- CCACA TATGA CCCCA AGACC-3' 서열번호 13
reverse 5'- AGGCA TGTAA CCCGT AGCAC-3' 서열번호 14
Me1 forward 5'-AGAGG TGTTT GCCCA TGAAC-3' 서열번호 15
reverse 5'-GAAGG CAGCC ATATC CTTGA-3' 서열번호 16
L-CPT1a forward 5'- CTCAG TGGGA GCGAC TCTTC-3' 서열번호 17
reverse 5'- GGCCT CTGTG GTACA CGACA-3' 서열번호 18
FATP1 forward 5'-CAGTG CCACC AACAA GAAGA-3' 서열번호 19
reverse 5'-CTGCG GTCAC GGAAA TACAT-3' 서열번호 20
CD36 forward 5'-TGCAC CACAT ATCTA CCAAA-3' 서열번호 21
reverse 5'-TTGTA ACCCC ACAAG AGTTC-3' 서열번호 22
FAS forward 5'- AAGCC GTTGG GAGTG AAAGT-3' 서열번호 23
reverse 5'-CAATC TGGAT GGCAG TGAGG-3' 서열번호 24
MGAT1 forward 5'-CTGGT TCTGT TTCCC GTTGT-3' 서열번호 25
reverse 5'-TGGGT CAAGG CCATC TTAAC-3' 서열번호 26
DGAT1 forward 5'- TTCCG CCTCT GGGCA TT-3' 서열번호 27
reverse 5'- AGAAT CGGCC CACAA TCCA-3' 서열번호 28
SCD1 forward 5'-TTCTC AGAAA CACAC GCCGA-3' 서열번호 29
reverse 5'-AGCTT CTCGG CTTTC AGGTC-3' 서열번호 30
AGPAT2 forward 5'- AGCGG ACAGA AGAAA CTGGA-3' 서열번호 31
reverse 5'- TGAAG TAGAC ACCCC CAAGG-3' 서열번호 32
LIPIN2 forward 5'-CCGTT GAGTC CTGGG TTAAA-3' 서열번호 33
reverse 5'-CATTG GAAGG CAGGT CATTT-3' 서열번호 34
LIPIN3 forward 5'-GCCCA TGATT CTTTC TCTGC-3' 서열번호 35
reverse 5'-TCTCC AGGAA AACCA CCATC-3' 서열번호 36
PPARδ2 forward 5'- CTCTG GGAGA TTCTC CTGTT-3’ 서열번호 37
reverse 5’- GGTGG GCCAG AATGG CATCT-3’ 서열번호 38
PGC1a forward 5’- TTTTT GGTGA AATTG AGGAAT-3’ 서열번호 39
reverse 5’- CGGTA GGTGA TGAAA CCATA-3’ 서열번호 40
UCP1 forward 5’- GGTAT AAAGG TGTCC TAGGG-3’ 서열번호 41
reverse 5’- CAAGC TTTCT GTGGT GGCTA-3’ 서열번호 42
그 결과, 도 15a에 나타난 바와 같이 중성지방 합성 유전자 및 지방산 합성의 유전자의 발현은 변화가 없거나 MGL 투여 그룹에서 오히려 증가하였고, 지방산 수송 유전자, 지방산 전사 유전자 및 지방산 산화 유전자도 유사한 패턴을 나타냈다. 특이한 점은 MGL 투여 그룹에서 PGC1와 UCP1의 발현이 두드러지게 증가한 것이며, 이는 백색 지방의 갈색화가 일어나고 있음을 의미하고, 에너지 소모가 증가하였음을 의미한다.
[ 실시예 8] 고지방 식이를 공급한 마우스에서 모노아실글리세롤 리파아제의 투여 효과
8-1. 모노아실글리세롤 리파아제 투여에 따른 체중, 식이량 변화 및 지방변 확인
5주령의 C57BL/6 마우스(중앙실험동물, 한국)에 총 13주간 45% 지방량의 고지방 식이를 공급하였으며, 고지방 식이를 시작한 7주경부터 상기 실시예 1에서 제조한 모노아실글리세롤 리파아제를 투여하여 체중 감소 혹은 체중 증가 지연 효과가 나타나는지 확인하였다(도 16a). 그 결과, 도 16b 및 16e에 나타난 바와 같이 모노아실글리세롤 리파아제 투여 후 체중이 유의적으로 감소하여 총 체중의 15% 감량 효과가 나타남을 확인하였다.
또한, 도 16c 및 16d에 나타난 바와 같이 MGL 투여 그룹과 BSA 투여 그룹 간의 식이량과 대변의 지방량은 유사하여 모노아실글리세롤 리파아제의 투여로 인한 식이량 변화 및 지방변과 같은 부작용은 나타나지 않음을 확인하였다.
8-2. 포도당 부하검사
상기 실시예 8-1에서 BSA 또는 모노아실글리세롤 리파아제를 투여한 마우스를 대상으로 포도당 부하검사를 실시하였다. 모노아실글리세롤 리파아제가 투여된 마우스에 포도당 1.5 mg/g 체중 복강주사로 투여하였으며, 부하 전, 부하 후 15분, 30분, 60분 및 120분에 채혈하여 혈당치를 측정하였다.
그 결과, 도 16f에 나타난 바와 같이 포도당 부하검사가 크게 향상되었으며, 이를 통해 본 발명의 MGL이 당뇨병 치료제로 활용될 수 있음을 다시 한번 확인하였다.
8-3. 모노아실글리세롤 리파아제 투여에 따른 지방간 개선 및 지방 감소 효과
상기 실시예 8-1에서 BSA 또는 모노아실글리세롤 리파아제를 투여한 마우스를 에테르로 마취하여 개복하였으며, 간과 부고환 주변 지방조직(epididymal fat tissue)을 적출하여 관찰하였다.
그 결과, MGL 투여 그룹에서 간 무게와 지방 조직의 무게가 상당히 감소하였으며(도 16g), 적출한 간의 육안적 모습 및 H&E 염색 또는 오일-레드 오(oil-red O) 염색을 통한 조직 현미경 사진에서 지방간이 현저하게 개선된 것을 확인하였다(도 16a). 또한, 간의 중성 지방량은 현저하게 감소하였고 콜레스테롤 수치도 낮아졌으며(도 16b), 부고환 주변 지방 조직은 크기가 감소하였고, 상기 지방 조직을 조직 현미경으로 관찰한 결과 지방세포의 크기가 작아짐을 확인하였다(도 16c). 도 16d는 지방세포의 평균 크기를 그래프로 나타낸 것으로, BSA 투여 그룹에 비해 MGL 투여 그룹에서 지방세포의 평균 크기가 현저하게 작아진 것을 확인할 수 있었다.
8-4. 모노아실글리세롤 리파아제 투여에 따른 혈중 중성지방과 콜레스테롤 수치 변화, 간 수치 변화 및 GLP 변화의 확인
상기 실시예 8-1에서 BSA 또는 모노아실글리세롤 리파아제를 투여한 마우스로부터 혈액을 채취하여 혈중 중성지방 및 콜레스테롤의 양을 분석하였다. 그 결과, 도 16e에 나타난 바와 같이 MGL 투여로 인해 혈중 중성지방은 감소하였고, 혈중 콜레스테롤은 BSA 투여 그룹과 유사함을 확인하였다. 혈중 중성지방의 감소는 본 발명의 MGL이 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써 중성지방의 혈중 흡수를 감소시키기 때문에 나타나는 것으로, 이를 통해 MGL이 고지혈증 치료제로서 효과가 있음을 다시 한번 확인하였다.
또한, MGL 투여 그룹에서 간 수치인 ALT 및 AST가 상당히 감소하여 MGL이 간 기능을 회복시키는데 기여한다는 것을 알 수 있었다(도 16f). 마지막으로, MGL 투여 그룹에서 식이에 영향을 미칠 수 있다고 알려진 혈중 GLP의 변화가 나타나지 않아, MGL 투여로 인해 식이량의 변화가 나타나지 않음을 다시 한번 확인하였다.
[실시예 9] 본 발명의 MGL과 제니칼의 효과 비교
본 발명의 MGL과 현재 비만 치료제로 사용 중인 제니칼의 효과를 비교하기 위해, C57BL/6 마우스에 상기 실시예 1에서 제조된 인간 MGL을 100 units 혹은 제니칼(orlistat, ORL, Sigma) 100 nmole을 3주간 매일 가베지로 투여하여 하고 체중 및 대변의 지방량과 콜레스테롤량을 측정하였다.
그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이 체중은 MGL과 ORL이 비슷하게 총 체중의 15% 정도 감소하였으나, MGL과 ORL은 서로 다른 성상의 약물로서 최적 용량의 정의를 내릴 수 없기 때문에 이를 토대로 MGL 혹은 ORL이 우수한지는 비교할 수 없다. 그러나, 도 18에 나타난 바와 같이 대변의 지방량은 MGL 투여 그룹과 BSA 투여 그룹이 거의 비슷한 정도였지만, ORL 투여 그룹은 현저한 지방변을 나타내어 큰 차이를 나타냈다. 또한, 대변의 콜레스테롤도 ORL 투여 그룹에서 현저하게 증가되었다. 한 가지 특이한 점은 3주 투여 실험 중 ORL 투여 그룹에서 5마리 중 4마리의 마우스가 사망하였으며, 부검 결과 도 19에 나타난 바와 같이 담당이 까맣게 변한 소견을 보였다. 이는 색소침착 담석의 소견으로 생각되며, ORL의 보고된 부작용 중의 하나이다. 본 실시예의 결과를 통해 MGL은 제니칼과 달리 지방변이 전혀 나타나지 않는 범위에서도 상당한 체중 감량 효과가 있으며, 특히 지방변 및 담낭 병변과 같은 제니칼의 부작용이 나타나지 않는 탁월한 항비만제 및 지방간 치료제임을 파악할 수 있다.
본 발명의 2-모노아실글리세롤을 절단 효소를 포함하는 조성물은 소화관에서 중성지방을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해함으로써 지방 흡수를 지연시키고, 중성지방의 혈중 흡수를 감소시키는 효과가 있으며, 소화관에서 2-모노아실글리세롤을 특이적 또는 비특이적 리파아제로 분해할 경우, 흡수가 되더라도 소화상피세포에서의 중성지방 재결합을 지연하거나 이 과정에서 에너지 소모를 촉진할 수 있으므로, 간지방증, 비알코올성 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및/또는 비만 등을 예방, 개선 또는 치료하는 의약품 및 건강기능식품에 활용할 수 있다.

Claims (27)

  1. 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 간지방증(hepatic steatosis) 또는 비알코올성 지방간의 치료방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소는 2-모노아실글리세롤을 특이적 또는 비특이적으로 절단하는 리파아제인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 절단하는 효소는 사람, 마우스, 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 2-위치 특이적 리파아제(2-position specific lipase)인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 치료방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 균주에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤을 비특이적으로 절단하는 리파아제는 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 위치 비특이적 리파아제(positional non-specific lipase)인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤 절단 효소는 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해하여, 2-모노아실글리세롤의 소화상피세포로의 흡수량을 저감하는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  9. 간지방증(hepatic steatosis) 또는 비알코올성 지방간의 치료용 약제의 제조를 위한 2-모노아실글리세롤 절단 효소의 용도.
  10. 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 치료방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 효소는 2-모노아실글리세롤을 특이적 또는 비특이적으로 절단하는 리파아제인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 절단하는 효소는 사람, 마우스, 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 2-위치 특이적 리파아제(2-position specific lipase)인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 치료방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 균주에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤을 비특이적으로 절단하는 리파아제는 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 위치 비특이적 리파아제(positional non-specific lipase)인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤 절단 효소는 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해하여, 2-모노아실글리세롤의 소화상피세포로의 흡수량을 저감하는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  18. 고지혈증 또는 제2형 당뇨병의 치료용 약제의 제조를 위한 2-모노아실글리세롤 절단 효소의 용도.
  19. 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 비만의 치료방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 효소는 2-모노아실글리세롤을 특이적 또는 비특이적으로 절단하는 리파아제인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤을 특이적으로 절단하는 효소는 사람, 마우스, 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 2-위치 특이적 리파아제(2-position specific lipase)인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 치료방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 2-위치 특이적 리파아제는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 균주에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤을 비특이적으로 절단하는 리파아제는 효모, 곰팡이 및 박테리아로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 위치 비특이적 리파아제(positional non-specific lipase)인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  26. 제19항에 있어서, 상기 2-모노아실글리세롤 절단 효소는 2-모노아실글리세롤을 지방산과 글리세롤로 완전히 분해하고,
    상기 분해된 지방산과 글리세롤이 소화상피세포로 흡수되어 중성지방으로 재합성되는 과정으로 인해 에너지 소비가 증가하며,
    이때, 상기 에너지 소비 증가는 소화상피세포 내에서 모노아실글리세롤 및 지방산이 중성지방으로 재합성되는 과정에 비해 3 내지 4개의 ATP가 더 소모되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  27. 비만 치료용 약제의 제조를 위한 2-모노아실글리세롤 절단 효소의 용도.
PCT/KR2017/007585 2016-07-19 2017-07-14 2-모노아실글리세롤 절단 효소를 이용한 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 치료방법 WO2018016806A1 (ko)

Priority Applications (3)

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