CN108707651A - 一种全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法及其应用。本发明可以在全基因组规模筛选获得花生种子特异表达基因，并且可以将种子特异表达基因按表达量的高低进行排列；该方法将植物组织分为种子组织和非种子组织，大大降低了转录组测序花费，增加了获取种子特异表达基因的准确度。本发明提供的全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法在鉴定花生种子特异表达启动子中的应用，有助于基因组规模筛选获取花生种子特异表达启动子。本发明对花生及其他植物高表达种子特异启动子的克隆和鉴定具有重要的应用价值；本发明对获取花生其它组织特异表达基因以及其它植物组织特异表达基因也具有重要的应用价值。

Description

一种全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法及其应用。

背景技术

花生是世界重要的油料作物，其籽仁中蛋白质含量为24%~36%；含油量高达38%~60%，是重要的食用蛋白源和食用植物油源。此外，花生中还富含植物固醇、白藜芦醇、维生素E、维生素C和叶酸等植物活性物质，对促进健康、预防疾病十分有益。随着生物技术的发展，利用基因工程技术对花生籽仁中蛋白质、油脂及其它营养成分进行遗传改良或以花生籽仁作为“生物反应器”异源合成蛋白疫苗等已成为一种非常有效的手段。

花生种子特异启动子作为一类专一性启动子，能指导外源基因在花生种子中特异表达，它不仅能使目的基因的表达产物在种子中积累，增加在种子中的表达量，而且也避免了植物营养的浪费。花生特异性表达启动子是培育精准、安全转基因花生的重要分子工具，具有重要的应用价值和前景。

然而，目前关于花生种子特异启动子的报告尚少。例如：Li等（2009）利用染色体步移技术在‘Shanyou 535’中克隆了油体蛋白AhOleo17.8基因1072 bp的启动子片段（EF695400）。经分析，其序列存在种子启动子特异性的RY元件和G-box。AhOleo17.8启动子能驱动外源报告基因GUS在转基因拟南芥种子中特异表达，而在花、茎和成熟叶片中没有表达。证明它是种子特异表达的启动子。2013年，范乾程等根据Li等（2009）序列设计引物，利用PCR在‘鲁花11号’中克隆了1600 bp的片段，发现该启动子可驱动GUS报告基因在转基因花生种子的油体蛋白中特异表达。Sunkara等（2013）在花生品种‘JL24’克隆了8A4R19G1基因 （DQ450071）523 bp的启动子片段，PlantCARE和PLACE分析发现，该序列含有TATA box、CAAT box等启动子核心元件以及种子特异的AACA motif、ACGT-containing element、Ebox、GCN4 motif以及RY element等元件。借助转基因拟南芥和烟草发现，该启动子只驱动外源报告基因GUS在种子中特异表达，是花生种子特异启动子。Yang等（2015）在‘Shanyou535’中克隆了致敏蛋白Ara h 2.02基因1972 bp的启动子，可驱动GUS报告基因在转基因拟南芥的角果和种子中表达，在14天幼苗的子叶和胚轴也有表达，但是在幼根和幼叶中没有表达，该启动子也是种子特异表达启动子。Fu等（2015）在‘Shanyou 535’中克隆了致敏蛋白Ara h3基因 657 bp的片段，经分析发现除具有TATA box、CAAT box外，还具有G-box、RYelement、legumin-box、AT-rich等种子特异和增强表达的元件。该启动子可驱动GUS报告基因在拟南芥种子中特异表达，并且表达量是CaMV 35S的6倍。Tang等（2015）在‘Luhua 14’克隆了AhLEC1B基因1235 bp的启动子片段，PlantCARE和PLACE分析发现存在种子特异表达的RY-element元件。其可驱动GUS报告基因主要在转基因拟南芥种子中表达。对其不同的顺式作用元件进行了缺失实验，发现65 bp的启动子区域仍能保留启动子活性，但是种子表达的特异性丧失。

以上为数不多的花生种子特异启动子均克隆于已知种子特异表达基因。要想大量克隆鉴定种子特异启动子，可以利用基因的差异表达分析，筛选大量种子特异表达基因，然后对其启动子进行功能鉴定。消减杂交（subtractive hybridization）、抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization）、差异显示PCR（DDRT-PCR，differentialdisplay reverse transcription PCR）、cDNA代表性差异分析（cDNA representationaldifference analysis）等技术被广泛应用于基因的差异表达分析，然而这些方法普遍存在假阳性率高、通量低等缺点。cDNA芯片技术（cDNA microarrays）是一种大规模、高通量的基因表达检测技术。Liu等（2014）利用一套包括玉米14种不同组织及发育时期的芯片表达数据，鉴定出28个胚优先高表达的基因，并对这些基因的启动子进行了克隆鉴定。但是利用该方法只有已知基因能够检测到表达差异。

目前，尚未有基因组规模筛选花生种子特异表达基因的报道。

发明内容

基于目前的研究现状和存在的问题，本发明的目的是提供了一种全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法及其应用。该方法利用比较转录组测序技术，可以在全基因组规模筛选只在花生种子中表达的基因，并且可以按表达量的高低进行排序，最终筛选到花生种子特异高表达基因，对花生高表达种子特异启动子的克隆和鉴定具有重要的应用价值。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案包括以下步骤：

本发明提供了一种全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）分别取花生发芽出苗期的根、幼苗期的茎、开花下针期的叶片、结荚期的花和饱果成熟期的果针、果壳以及果针入土10天、20天、30天、40天、50天、60天和70天种子，液氮冻存，-80℃保存备用；

（2）提取（1）中各组织RNA，将果针入土10天、20天、30天、40天、50天、60天和70天种子相等质量的RNA混合作为样品1，上述根、茎、叶片、花、果针、果壳相等质量的RNA混合作为样品2；

（3）将样品1和样品2分别进行转录组测序，找到只在样品1中检测到而在样品2中未检测到的目标基因；

（4）利用RT-PCR检测目标基因在花生根、茎、叶片、花、果针、果壳以及种子中的表达情况，只在花生种子中检测到表达的基因即为种子特异基因。

进一步的：所述样品1和2中各组织RNA用量在3 μg以上。

进一步的：所述步骤（3）的转录组测序深度至少10 G。

进一步的：所述步骤（4）的RT-PCR反应条件为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30s，58 ℃退火 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃后延伸10 min。

本发明还提供了所述的全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法在筛选和鉴定高等植物种子特异表达启动子中的应用。

进一步的：所述高等植物为花生、玉米、小麦、大豆、棉花和油菜。

进一步的：花生种子特异表达启动子为SSPC4，其具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了花生种子特异表达启动子SSPC4在驱动外源基因在植物的种子中特异表达中的应用。

与现有技术相比，本发明优点和有益技术效果在于：1、本发明可以在全基因组规模筛选获得花生种子特异表达基因，并且可以将种子特异表达基因按表达量的高低进行排列；2、花生各组织取材覆盖花生生长发育的各个时期，并且将花生组织分为两个样品：即种子组织和非种子组织（根、茎、叶、花、果壳和果针），通过比较两个样品的转录组，可全基因组规模获取只在种子组织中表达的基因。降低了实验成本，大大降低了转录组测序花费，并且提高了实验的准确度。

本发明提供了全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法在鉴定花生种子特异表达启动子中的应用，有助于基因组规模筛选获取花生种子特异表达启动子。本发明对花生及其他高等植物高表达种子特异启动子的克隆和鉴定具有重要的应用价值。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是RT-PCR检测目的基因组织特异性的结果。Actin为花生内参基因，SSPC1-11为比较转录组测序得到的在花生种子中表达量前11的目的基因，1-7分别为花生根、茎、叶、花、果针、果壳和种子。

图2是 SSPC4启动子的PCR扩增图。M：分子量标记Marker（Trans2K），1：目的片段。

图3是GUS组织化学染色，其中A：刚萌发的拟南芥种子；B:长出真叶的拟南芥。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

一、材料收集

2016年5月，在山东省花生研究所莱西试验田种植栽培种花生“花育9610”，于5-9月分别取花生发芽出苗期的根、幼苗期的茎、开花下针期的叶片、结荚期的花以及饱果成熟期的果针、果壳以及果针入土10天、20天、30天、40天、50天、60天和70天种子，液氮冻存，-80℃保存备用。

二、转录组测序及结果分析

分别提取上述各组织的RNA，将果针入土10天、20天、30天、40天、50天、60天和70天花生种子的RNA等质量混合作为样品1；花生发芽出苗期的根、幼苗期的茎、开花下针期的叶片、结荚期的花以及饱果成熟期的果针、果壳的RNA等质量混合作为样品2。分别对样品1和样品2进行转录组测序，转录组测序深度至少10 G，以确保能检测到低丰度的基因，保证样品1和2中极微量表达的基因也能检测到，并进行数据分析（由广州基迪奥生物科技有限公司）。保留混合样品2中PFKM值低于5的基因后，将样品1中这些基因按PFKM值降序排列，此时PFKM值最高的基因可能是在花生种子中特异表达最强的基因。根据需要，可以克隆基因ATG上游启动子片段进行植物基因工程应用。

三、RT-PCR检测候选基因的种子特异性

根据比较转录组测序分析，选取在花生种子中表达量前11的基因（SSPC1-11）分别在根、茎、叶片、果针、果壳、花和种子中进行了RT-PCR检测。

其中，RT-PCR反应条件为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃后延伸10 min其中。其中循环数应大于等于40，以保证验证基因表达组织特异性的准确性。结果发现均只在花生种子中特异表达（如图1所示）。这证明了该方法的可行性。

四、SSPC4启动子的功能鉴定

为验证本发明方法的可行性，本发明进一步将SSPC4基因上游2366 bp的启动子片段进行了克隆（图2）和功能鉴定（图3）， SSPC4启动子的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

首先，本发明设计了该片段特异引物：SSPC4-F：5’-CTCTCGAGAGGATCCTTGTTGGAACTTGAGAAAGTTCACACTG-3’（SEQ ID No:2）和SSPC4-R：5’-GGTACCCGGGGATCCATGCTCCTGCTACTACTTATATAG-3’ （SEQ ID No:3），提取花生幼嫩叶片DNA，并以SSPC4-F和SSPC4-R作为引物，在高保真聚合酶GXL（TAKARA公司）作用下进行PCR扩增，得到一个大约2500 bp的条带（图2）。经测序正确后，亚克隆到带有GUS报告基因的植物表达载体pGWB3中；转化农杆菌，对拟南芥进行遗传转化；经筛选获得转基因拟南芥，将T₂代转基因纯合体拟南芥种植于MS培养基，分别取萌发1-10天的幼苗进行GUS组织化学染色。萌发第1天的种子，能染较深的蓝色（图3A）；随着幼苗的长大，GUS染色颜色逐渐变浅，其中幼苗长出真叶后（第8天，此时种子胚性完全丧失），不能再被GUS染色（此时已分化出明显的根、茎和真叶）（图3B）。这证明：SSPC4启动子能驱动外源基因在植物的种子中特异表达，它是一个种子特异表达启动子。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心

<120> 一种全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2366

<212> DNA

<213> 花生(peanut)

<400> 1

ttgttggaac ttgagaaagt tcacactgat gacaatggtg ctgatatgat gacaaaagca 60

ttgtcaagag ataagtttga aacatgttgt ttgatcgccg gaatggcgat ggcctccacc 120

tagtcgagaa gggggagatt tgttgggttt tttctcttct ttgtgagacc caagcccaac 180

attttgaggg tgtcactttg cacttattgt gacacaaccc taatcagatt tttggggtca 240

atttgagaga aagagagtag ccaccaaaga gagaaagaag cgagaaaaca gaattttcgt 300

ttttatcaaa agcagtaaac ttcaaatggt agtttctcat tagttcaccg ttggatcggc 360

ttgaaatttg aactgcgtgt ttctctcatc ttgttcttca ttctggacgg tggagatgtt 420

gattgaaagt ctgcagtgag agaaattggc ttcgcaagag aaaaattagg ttttccattt 480

ttacacagag tagcaatttt tgaacggcag tttctcattt tttcaccgtt ggatcgacgt 540

gaaatttgga cagtaaattc ttcatatctt gttcttcata gttgctgcca cattgtgttg 600

tgagtgcttc catactattg ttgtattgga tatttgtgtt atttttgctg atagactctt 660

tcaataatgt ctaggaaaat agtagataaa caaaagctta attatgaaga aaaagagaaa 720

cttaaacgaa aagataaatg ttggttaaaa ctgttgatta ttccaatctt ttcccaatag 780

aataaattat gccccaatta ttttatcaat atgttaatta ggaatgaaca ttttggagat 840

tgtatcataa gttttaatta agaatgtgat tactttgttt ccatagttgg attatctttt 900

gtagaataac gagggtataa tctctaatat acatttgtcg gccttaggtt gtgttattaa 960

tgcttctcat acggtaccac aactctgtag ctagagcttg cgattatatt gaacagaata 1020

gagatgatat caaaaagaaa gaaggaacaa attaaacgta tgtgatgttt aaatggatat 1080

gaaattttgg tcaatgaaga catgtatgat ttcgcttgtg atacgcagat acgctaaaag 1140

gcaagccaat accgtaaggt aggggtgcat atgtgccggg tgaagtcggg tttgatgtga 1200

cccagacccg atccgaaata tacaccgggt ttatttatta gacccgaacc cgaccctaga 1260

cccgatgaaa ccaatacact ttcgggccac aattataccg ggtaaaaacc gggtgaaaac 1320

cgggccatta acattacatt acgttgatac cttcttgtaa gctagcatgt aaaaatatcc 1380

aaattttcaa gactccaacc attatttaac atggtaaaat tcacttagaa aaatataaca 1440

aaaaccaacc cttctttaaa attaaagcat aaccacaatc catactaaag caaaaccaca 1500

atcaatacta atattgtcta ataataccaa atatttaaat caatacaaat aacacaatat 1560

tatgcattag tctaaagtct tatgcattct aaacataaaa tattaactta tagtcttata 1620

atgactaata aaacaaaata ttaaagttta caatacttaa attccacata agaatagtca 1680

tgatccatca ctaataacac aaaatattaa ttgtgtatga tgaccgggcc accaggccga 1740

cttcgggtga cccgagctat ggcccggacc cgacccgaaa taatgaccgg gtctattttt 1800

gagaccctta cccgacccta aacccgatga aatcatacca aattagcccc taaaatgttc 1860

gggaccgggc cgggccttcg ggccgggccg ggtctgtgca cccctaccgt aaggatagct 1920

gaatgggtga tgatatttta tcaaaagaca aaaggaatcc atcctgtatg tgcagtggaa 1980

ccttttccca gacaatggag tgatgaacat tatatatatc gccgcgtcca tcaccataca 2040

tatccaaagc aaaaaattta acaaatactg aaccccaatt gccatgcata ttaacacgta 2100

cactctctat gtcaatgtgt ccaccatgca ccacaatcca tccatctctt gtttatctct 2160

aagccaagac ctagtgttgt tgccacctca catttctcaa tttcaacact cgtcaacctg 2220

catgccactc caatgcccaa gtgtacatcc atatcatcct aacgcaacta tataaatacc 2280

actcacctcc ctccatcatt tcaccatcca cactcataat aatcatatat attcatcaat 2340

catctatata agtagtagca ggagca 2366

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctctcgagag gatccttgtt ggaacttgag aaagttcaca ctg 43

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtacccggg gatccatgct cctgctacta cttatatag 39

Claims (8)

1.一种全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）分别取花生发芽出苗期的根、幼苗期的茎、开花下针期的叶片、结荚期的花和饱果成熟期的果针、果壳以及果针入土10天、20天、30天、40天、50天、60天和70天种子，液氮冻存，-80℃保存备用；

（2）提取（1）中各组织RNA，将果针入土10天、20天、30天、40天、50天、60天和70天种子相等质量的RNA混合作为样品1，上述根、茎、叶片、花、果针、果壳相等质量的RNA混合作为样品2；

（3）将样品1和样品2分别进行转录组测序，找到只在样品1中检测到而在样品2中未检测到的目标基因；

（4）利用RT-PCR检测目标基因在花生根、茎、叶片、花、果针、果壳以及种子中的表达情况，只在花生种子中检测到表达的基因即为种子特异基因。

2.根据权利要求1所述的全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法，其特征在于：所述样品1和2中各组织RNA用量在3 μg以上。

3.根据权利要求1所述的全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法，其特征在于：所述步骤（3）的转录组测序深度至少10 G。

4.根据权利要求1所述的全基因组规模获取花生种子特异表达基因的方法，其特征在于：所述步骤（4）的RT-PCR反应条件为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火 30s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃后延伸10 min。

5.权利要求1所述的方法在筛选和鉴定高等植物种子特异表达启动子中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述高等植物为花生、玉米、小麦、大豆、棉花和油菜。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：花生种子特异表达启动子为SSPC4，其具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。

8.花生种子特异表达启动子SSPC4在驱动外源基因在植物的种子中特异表达中的应用。