CN103403022A - 来自玉米的植物基因表达调节序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来自玉米的基因表达调控序列，具体地涉及启动子序列和内含子序列，其可用于在转基因植物中表达转基因。本发明还公开了组合物、多核苷酸构建体、转化的宿主细胞、包含具有所述启动子和内含子序列的重组构建体的转基因植物和种子、以及制备和使用以上这些的方法。
Description
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2010年12月21日的印度专利申请3060/DELNP/2010和提交于2011年3月23日的美国临时申请61/466480的权益；其各自全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程的领域。更具体地，本发明涉及调控序列诸如启动子和内含子序列的组合物以及使用它们调控植物基因表达的方法。
背景技术
植物基因工程近来的进步已打开了工程化植物以具有改善的特性或性状的新的大门。这些转基因植物特征性地在其基因组中具有重组DNA构建体，所述重组DNA构建体具有所关注的多核苷酸，其可操作地连接至少一种调控区，例如，实现转基因表达的启动子。所关注的多核苷酸的表达水平还可受到其它调控元件调节，诸如内含子和增强子。已有报道内含子影响基因表达的水平（内含子介导的基因表达增强（Lu等人，Mol GenetGenomics（2008）279:563–572））。
启动子可以是强启动子或弱启动子，或者可以是组成型或可通过时间空间性方式或可诱导的方式加以调控。因此，启动子使转基因表达受到调控、限制和精细调节，从而实现更精确地控制所述转基因表达的方式以及由此更精确地控制该转基因所产生的表型表达的方式。植物基因工程已发展至将多种性状导入商业上重要的植物中，也叫基因堆积。这是通过多基因转化实现的，多种基因在其中被转化，以产生可能表达复合表型或多种表型的转基因植物。但是，重要的在于最优地调节或控制各个转基因的表达，而且所述调控元件需要有所不同，从而避免导入相同的转基因植物重复序列，相同的重复序列的导入已被与对转基因的表达和稳定性的不可取的负面影响相关联（Peremarti等人（2010）Plant Mol Biol73:363-378；Mette等人（1999）EMBO J18:241-248；Mette等人（2000）EMBO J19:5194-5201；Mourrain等人（2007）Planta225:365-379、美国专利7632982、美国专利7491813、美国专利7674950、PCT专利申请PCT/US2009/046968）。因此，发现和表征能被用于在重要的农作物物种中表达异源性核酸的新的调控元件是重要的。具有所需表达特征的不同的启动子可用于最优地控制各个转基因。
发明内容
本发明公开了来自玉米的新型调控序列，其可用于在转基因植物中调控异源多核苷酸的表达。本文公开了玉米启动子和玉米内含子序列，其可用于调控异源多核苷酸的植物基因表达。
本发明的一个实施例是重组DNA构建体，所述构建体包含在植物细胞中有功能的启动子，所述启动子可操作地连接至分离的多核苷酸，其中所述启动子包含选自下列的核酸序列：（a）SEQ ID NO:3的核酸序列，（b）与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列，和（c）包含（a）或（b）的功能片段的核酸序列。在一个相关的实施例中，所述启动子是组成型启动子。
在另一个实施例中，所述重组构建体可包含可操作地连接至启动子和分离的多核苷酸二者的内含子，其中所述内含子包含与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少95%的同一性的核酸序列。所述内含子还可包含SEQ IDNO:6的核酸序列。相关的实施例中，当在与包含可操作地连接至所述分离的多核苷酸的启动子的对照重组DNA构建体相比时，所述可操作地连接至内含子和启动子二者的分离的多核苷酸的表达增强，所述对照重组DNA构建体中的启动子和分离的多核苷酸二者均没有可操作地连接至所述内含子。
本发明的另一个实施例是调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：（a）将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含在植物细胞中有功能的启动子，所述启动子可操作地连接至分离的多核苷酸，其中所述启动子包含选自下列的核酸序列：（i）SEQ ID NO:3的核酸序列，（ii）与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列，和（iii）包含（i）或（ii）的功能片段的核酸序列；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体并且表现出所述多核苷酸的表达。
本发明的另一个实施例是调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：（a）将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至启动子和分离的多核苷酸二者的内含子序列，其中所述内含子序列与SEQ ID NO:6表现出至少95%的序列同一性；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体，并且在与包含可操作地连接至所述分离的多核苷酸的启动子的对照重组DNA构建体相比时，所述子代植物表现出增强的转基因表达，所述对照重组DNA构建体中的启动子和分离的多核苷酸二者均没有可操作地连接至所述内含子。
本发明的另一个实施例是调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：（a）将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含在植物细胞中有功能的启动子，所述启动子可操作地连接至内含子和分离的多核苷酸二者，其中所述启动子包含SEQID NO:3的核酸序列，并且其中所述内含子包含SEQ ID NO:6的核酸序列；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体并且表现出所述多核苷酸的表达。
本发明的一个实施例是SEQ ID NO:3的功能片段，其包含从SEQ IDNO:3的多核苷酸序列的3'端开始至少50、100、200、300、400、500、1000或1500个邻接的核苷酸。
本发明的一个实施例是SEQ ID NO:3的功能片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:3的3'端的120bp（SEQ ID NO:12）、172bp（SEQ ID NO:13）、328bp（SEQ ID NO:17）、518bp（SEQ ID NO:21）或1036bp（SEQ ID NO:25）。
本发明的另一个实施例是重组构建体，其包含可操作地连接至分离的多核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段，其中所述功能片段包含选自下列的核苷酸序列：（a）SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列；和（b）与SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列。
本发明的另一个实施例是重组构建体，其包含可操作地连接至分离的多核苷酸和内含子二者的SEQ ID NO:3的功能片段，其中所述功能片段包含选自下列的核苷酸序列：（a）SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列；和（b）与SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列。此外，所述内含子还可包含SEQ ID NO:6的核酸序列。
本发明的另一个实施例是调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：（a）将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至分离的多核苷酸和内含子的SEQ ID NO:3的功能片段，其中所述功能片段包含选自下列的核苷酸序列：（i）SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列；和（ii）与SEQID NO:12、13、17、21或25的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体并且表现出所述多核苷酸的表达。此外，所述内含子还可包含SEQ ID NO:6的序列。
本发明的另一个实施例是调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：（a）将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至分离的多核苷酸的SEQ IDNO:3的功能片段，其中所述功能片段包含选自下列的核苷酸序列：（i）SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列；和（ii）与SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体并且表现出所述多核苷酸的表达。
在另一个实施例中，本发明的组合物和方法可用于双子叶植物或单子叶植物。具体地，本发明的组合物和方法可用于单子叶植物。
在另一个实施例中，本发明包括转化的植物细胞、组织、植物和种子。本发明包括再生的、成熟的和能繁殖的转基因植物、从其产生的转基因种子、T1和后续的世代。所述转基因的植物细胞、组织、植物和种子可以包含所关注的至少一种重组DNA构建体。
附图说明和序列表
根据以下的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。
图1示出了用于测试启动子的PHP31993载体的图谱。载体PHP31993的“GUSINT”区标出了β-葡糖苷酸酶编码区，其被内含子中断以阻止GUS在细菌中的表达。使用前体载体PHP31993来产生两种表达载体PHP39158和PHP38694，其中将具有P72内含子的P72启动子（PHP39158）或具有Zm-Ubi内含子的Zm-Ubi启动子（PHP38694）克隆于AscI和NcoI限制性位点之间。所述AcsI和NcoI位点处于GUSINT区的5'端。
图2A示出了在使用农杆菌（Agrobacterium）进行感染的玉米胚中的GUS组织化学染色，所述农杆菌使用PHP39158构建体进行了转化。将非转基因对照标记为NTC。
图2B示出了在使用携带待测构建体的转化农杆菌进行感染的玉米胚中对GUS报告基因表达的定量分析。各自的构建体为具有克隆于Asc1和NcoI位点之间的Zm-Ubi启动子（具有Zm-Ubi内含子）的PHP38694和具有待测的P72启动子（具有P72内含子）的PHP39158。
图3A示出了受PHP39158（通过P72启动子和P72内含子驱动表达了GUS）转化的8组独立的转基因玉米愈伤组织事件中的GUS组织化学染色。
图3B示出了来自使用PHP39158（通过P72启动子和P72内含子驱动表达了GUS）转化的转基因玉米植物和来自使用PHP38694（通过Ubi启动子和Ubi内含子驱动表达了GUS）转化的转基因玉米植物的叶和花粉组织中GUS蛋白表达的定量数据。数据描述了对于P72的三组单拷贝事件的平均值和对于玉米Ubi启动子对照的一组单拷贝事件。
图4A示出了7组独立的转基因水稻愈伤组织事件的GUS组织化学染色，所述愈伤组织通过P72启动子和P72内含子（PHP39158）驱动而表达GUS报告基因。
图4B示出了针对GUS表达进行染色的四组非转基因对照愈伤组织。
图5A示出了来自采集自PHP39158T1玉米事件的叶、茎、根、雄穗、花粉和穗丝的组织化学（GUS）数据。对于所分析的每一组织显示了代表性的图像。
图5B示出了来自采集自PHP39158T1玉米事件的未成熟玉米穗的组织化学（GUS）数据。
图6示出了来自使用PHP39158构建体进行转化的T1玉米事件的MUG数据。数据为5组独立的单拷贝事件的平均值±SE。
图7A-7E示出了来自1月龄水稻植株的组织化学数据，其来自以下组织：叶（图7A）、茎（图7B）、旗叶（图7C）、圆锥花序（图7D）和花药（图7E），所述组织采集自使用PHP39158转化的稳定T0转基因事件。
图8示出了来自使用PHP39158和PHP38694转化的稳定转基因T0株系的MUG数据。数据为6组独立的单拷贝事件的平均值±SE。
SEQ ID NO:1是Zm-Ubi启动子和内含子序列的序列，其用作为测试启动子活性的对照。
SEQ ID NO:2是载体PHP31993的序列，其用于测试启动子。
SEQ ID NO:3是P72启动子的序列。
SEQ ID NO:4和5分别是用于扩增P72启动子的正向和反向引物的序列。
SEQ ID NO:6是P72内含子的序列。
SEQ ID NO:7和8分别是用于扩增SEQ ID NO:6的正向和反向引物的序列。
SEQ ID NO:9是P72启动子和P72内含子的序列。
SEQ ID NO:10和11分别是用于扩增SEQ ID NO:9的正向和反向引物的序列。
SEQ ID NO:12是120-bp的P72启动子片段的序列。
SEQ ID NO:13是172-bp的P72启动子片段的序列。
SEQ ID NO:14是具有P72内含子的172-bp的P72启动子片段的序列。
SEQ ID NO:15和16分别是用于扩增SEQ ID NO:14的正向和反向引物的序列。
SEQ ID NO:17是328-bp的P72启动子片段的序列。
SEQ ID NO:18是具有P72内含子的328-bp的P72启动子片段的序列。
SEQ ID NO:19和20分别是用于扩增SEQ ID NO:18的正向和反向引物的序列。
SEQ ID NO:21是518-bp的P72启动子片段的序列。
SEQ ID NO:22是具有P72内含子的518-bp的P72启动子片段的序列。
SEQ ID NO:23和24分别是用于扩增SEQ ID NO:22的正向和反向引物的序列。
SEQ ID NO:25是1036-bp的P72启动子片段的序列。
SEQ ID NO:26是具有P72内含子的1036-bp的P72启动子片段的序列。
SEQ ID NO:27和28分别是用于扩增SEQ ID NO:26的正向和反向引物的序列。
SEQ ID NO:29和30是GUS正向和反向引物的序列。
SEQ ID NO:31和32是GR5正向和反向引物的序列。
SEQ ID NO:33和34是ADH正向和反向引物的序列。
SEQ ID NO:35、36和37分别是针对GUS、GR5和ADH的探针序列。
序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所列出的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。
此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如NucleicAcids Res.13:3021-3030（1985）和Biochemical J.219（No.2）:345-373（1984）中所描述的IUPAC-IUBMB标准所规定，它们引入本文以供参考。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。
具体实施方式
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。
如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株此类植物，“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及本领域的技术人员已知的等同物等等。
本发明公开了来自玉米的新型调控序列，其可用于在转基因植物中调控异源多核苷酸的表达。其公开了可用于调控异源多核苷酸的植物基因表达的玉米启动子和玉米内含子序列。
术语“单子叶植物”和“单子叶的”植物本文互换使用。本发明的单子叶植物包括禾本科植物。
术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”本文互换使用。本发明的双子叶植物包括以下家族：十字花科植物、豆科植物、和茄科植物。
术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”本文互换使用，指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100%互补的。
“表达序列标签”（“EST”）是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”（“FIS”）。“重叠群”序列是由选自但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”（“CGS”），该序列能得自FIS或重叠群。
“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学、或物理学特征。在某些情况下，这种特征是人眼可见的，例如种子或植物大小，或者能够通过生物化学技术测量，例如检测种子或叶的蛋白质、淀粉、或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，如通过测量缺水耐受性或特定盐或糖浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农学观察如渗透胁迫耐受性或产量。
“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于低温胁迫下的绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长耐盐性、早期幼苗活力和出苗
“转基因”指其基因组因异源核酸（如重组DNA构建体）的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组（染色体基因组或染色体外基因组）改变。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分（如线粒体、质粒）中的细胞器DNA。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如，异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸（通常以它们的5'-单磷酸形式存在）可以用它们的单字母名称指代如下：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸（分别对应RNA或DNA），“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤（A或G），“Y”表示嘧啶（C或T），“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA（mRNA）”指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。
“编码区”是指编码蛋白质或多肽的信使RNA部分（或另一核酸分子诸如DNA分子的对应部分）。“非编码区”是指信使RNA或其它核酸分子并非编码区的部分，其包括但不限于：例如，启动子区、5'非翻译区（“UTR”）、3'UTR、内含子和终止子。术语“编码区”和“编码序列”在本文可互换使用。术语“非编码区”和“非编码序列”在本文可互换使用。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组体”是指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过导入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件（如自发突变、自然转化/转导/转座）对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。
术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录（如生成mRNA或功能RNA的转录）和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“表型”是指细胞或生物体的可检测的特征。
术语“导入”指将核酸（例如表达构建体）或蛋白质提供至细胞中的手段。导入包括指将核酸整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可整合进细胞的基因组内，并且包括指将核酸或蛋白质暂时提供给细胞。导入包括指稳定的或瞬时的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段（例如重组DNA构建体/表达构建体）插入细胞内的情况下的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组（如染色体、质粒、质体或线粒体DNA）内、转变成自主的复制子或瞬时表达（例如转染的mRNA）。
“转化细胞”是将核酸片段（如重组DNA构建体）导入其中的任何细胞。
在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而无基因稳定遗传。
“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白至功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括而且不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。
如对于本领域的技术人员应是显而易见的，任何受关注的分离的多核苷酸均能够操作地连接至本发明中描述的调控序列。能够操作地连接至本发明中描述的调控元件的受关注的多核苷酸的例子包括但不限于包含其它调控元件的多核苷酸，所述其它调控元件诸如内含子、增强子、多腺苷酸化信号、翻译前导序列，蛋白质编码区如疾病和昆虫抗性基因、赋予营养价值的基因、赋予产量和杂种优势的提高的基因、赋予雄性和/或雌性不育性的基因、抗真菌、抗菌或抗病毒基因等等。同样，本发明中描述的启动子和内含子序列可用于调节任何核酸的表达以控制基因表达。能够被用于控制基因表达的核酸的例子包括但不限于反义寡核苷酸、抑制性DNA构建体或编码转录因子的核酸。
本发明中描述的启动子可操作地连接至其它调控序列。这类调控序列的例子包括但不限于内含子、终止子、增强子、多腺苷酸信号序列、非转录引导序列。本发明中描述的启动子序列可操作地连接至本文所述的内含子序列，但是也可操作地连接至其它内含子序列。本领域中已知可增强基因表达的其它内含子，这类内含子的例子包括但不限于来自Adh1基因的第一内含子、来自Shrunken-1基因的第一内含子（Callis等人，Genes Dev.19871:1183-1200，Mascarenkas等人，Plant Mol.Biol.，1990，15:913-920）。
调控序列：
本发明的重组DNA构建体（包括抑制DNA构建体）可包含至少一种调控序列。在本发明的一个实施例中，本文所公开的调控序列可操作地连接至任何其它调控序列。
“调控序列”或“调控元件”可互换使用，并且指位于编码序列的上游（5'非编码序列）、中间或下游（3'非编码序列），并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可以互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，但是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。
可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如通过化合物（化学诱导剂），或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子的例子包括但不限于受光、热、胁迫、水涝或干旱、病原体、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。
最小的或基础的启动子是能够募集并结合基础转录复合物的多核苷酸序列。在真核细胞中，基础转录复合物的一个例子是RNA聚合酶II复合物及其附属蛋白质。
植物RNA聚合酶II启动子像其它更高等的真核生物的那些一样，由多种不同的“顺式作用转录调控元件”（或简称为“顺式元件”）组成，每一种似乎赋予对基因表达的总体控制的不同方面。此类顺式作用元件的例子包括但不限于例如TAT框和CCAAT或AGGA框。启动子能够被粗略地分为两部分：被称为核心的近端部分，和远端部分。近端部分据信负责RNA聚合酶II复合物在正确位置的正确组装，和指导基础水平的转录，也被称为“最小启动子”或“基础启动子”。启动子的远端部分据信包含调控时空表达的那些元件。除近端和远端部分外，其它调控区也已被描述，所述其它调控区包含增强子和/或阻遏子元件。后一类元件可见于转录起始位点上游数千碱基对处、内含子内或甚至在它们调控的基因的3'侧（Rombauts，S.等人（2003）Plant Physiology132:1162-1176，Nikolov和Burley，（1997）Proc Natl Acad Sci USA94:15–22），Tjian和Maniatis（1994）Cell77:5–8；Fessele等人，2002Trends Genet18:60–63，Messing等人，（1983）Genetic Engineering of Plants:an Agricultural Perspective，Plenum Press，NY，第211-227页）。
当操作地连接至异源性多核苷酸序列时，启动子控制所连接的多核苷酸序列的转录。
在本发明的一个实施例中，来自本文所公开的启动子序列的“顺式作用转录调控元件”能够被操作地连接至来自任何异源性启动子的“顺式作用转录调控元件”。此类嵌合启动子分子能够被工程化以具有所期望的调控特性。在本发明的一个实施例中，既能够作为顺式调控序列或远端调控序列又能够作为增强子序列或阻遏子序列起作用的所公开的启动子序列的片段，可以与来自异源性启动子序列的顺式调控或远端调控的、或增强子序列或阻遏子序列、或任何这些的任何组合相结合。
在相关的实施例中，所公开的启动子的顺式元件可以赋予特定的特异性，例如赋予操作地连接的多核苷酸分子在特定组织中增强的表达，并因此也能够调控操作地连接的多核苷酸分子的转录。因此，包含SEQ ID NO:3中示出的多核苷酸序列的启动子的任何片段、部分或区可用作为调控性多核苷酸分子。
包含调控元件的启动子片段能够被添加至另一具有其自身部分或完整调控序列的启动子，例如融合至其5'端或插入其内部（Fluhr等人，Science232:1106-1112，1986；Ellis等人，EMBO J.6:11-16，1987；Strittmatter和Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA84:8986-8990，1987；Poulsen和Chua，Mol.Gen.Genet.214:16-23，1988；Comai等人，Plant Mol.Biol.15:373-381，1991；1987；Aryan等人，Mol.Gen.Genet.225:65-71，1991）。
顺式元件能够通过多种技术被鉴定，包括删除分析，即从启动子的5'端或内部删除一个或多个核苷酸；使用DNase I足迹法进行DNA结合蛋白分析；甲基化干扰作用；电泳迁移率变化检测，通过连接介导的PCR的体内基因组足迹法；和其它常规检测法；或通过采用常规序列比对方法得到的与已知的顺式元件基序的序列相似性。顺式元件的精细结构能够通过一个或多个核苷酸的诱变（或替换）或通过其它常规方法而被进一步研究（参见，例如，Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology，Dashek编辑，CRC Press，1997，第397-422页；和Methods in PlantMolecular Biology，Maliga等人编辑，Cold Spring Harbor Press，1995年，第233-300页）。
顺式元件能够通过化学合成或通过从包含此类元件的启动子克隆而获得，并且它们能够被合成为带有附加的侧翼序列，所述侧翼序列包含有利于后续操作的有用的限制性酶位点。启动子片段还可以包含其它调控元件，例如增强子结构域，其可以进一步被用于构建嵌合分子。
用于构建本发明的嵌合的或变体启动子的方法包括但不限于组合不同启动子的控制元件或重复启动子的部分或区（参见，例如，4990607USA美国专利4,990,607；5110732USA美国专利5,110,732；以及5097025USA美国专利5,097,025）。本领域的技术人员熟悉描述用于构建、操作、和分离大分子（例如，多核苷酸分子和质粒）、以及重组生物的产生和多核苷酸分子的筛选与分离的特定条件和程序的标准源资料。
在本发明的一个实施例中，本文所公开的启动子可受到改进。本领域的技术人员能够构建在多核苷酸序列中具有变异的启动子。可对SEQ IDNO:3中示出的本发明的启动子的多核苷酸序列进行改进或变动以增强它们的控制特性。如本领域的普通技术人员将会知道的，启动子序列的修改或改变也能够发生而不会在本质上影响启动子的功能。所述方法是本领域的技术人员所熟知的。序列能够被修改，例如在基于PCR的DNA修改方法中通过模板序列的插入、删除、或替换。
本发明涵盖本文所公开的启动子序列的功能片段和变体。
“功能片段”在本文中被定义为本文所公开的启动子序列的连续核苷酸子集，其能够实施与本文所公开的全长启动子序列相同或基本上相似的功能。具有与本文所公开的全长启动子基本上相似的功能的“功能片段”，是指在很大程度上保持了与全长启动子序列相同水平的活性，并且表现出与全长启动子序列相同的表达模式的功能片段。本文公开的启动子序列的“功能片段”表现出组成型表达。
如本文所用，“变体”是包含改变的启动子的序列或启动子的功能片段的序列，在其中原始序列的一个或多个核苷酸被删除、添加、和/或替换，同时基本上维持了启动子的功能。一个或多个碱基对能够在启动子内部被插入、删除、或替换。就启动子片段的情况而言，变体启动子能够包括影响操作地与其连接的最小启动子的转录的改变。变体启动子能够通过，例如，标准的DNA诱变技术或用化学方法合成所述变体启动子或其部分而产生。
可将替换、缺失、插入和它们的任何组合加以结合来产生最终构建体。
“增强子序列”是指能够提高基因表达的序列。这些序列能够位于转录区的上游、内含子内、或下游。转录区由外显子和居间的内含子组成，从启动子直到转录终止区。基因表达的增强能够通过多种机制实现，包括但不限于提高转录效率、成熟mRNA的稳定化和翻译的强化。
“内含子”是基因的居间序列，其被转录至RNA，然后在产生成熟mRNA的过程中被切除。该术语也用于切除的RNA序列。“外显子”是被转录的基因序列的一部分，存在于得自该基因的成熟信使RNA中，并且不是编码最终基因产物的序列的必需部分。
许多基因当在转录区包括内含子时表现出增强的表达，尤其是当所述内含子存在于转录起始位点的最初1kb内时。基因表达由于内含子的存在的升高既能够是在mRNA（转录物丰度）水平又能够是在蛋白质水平。这种内含子介导的增强（IME）的机制在植物中不是很为人所了解（Rose等人，Plant Cell，20:543-551（2008），Le-Hir等人，Trends Biochem Sci..28:215-220（2003），Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.（1988）8:4395-4405；Callis等人，Genes Dev.1（1987）:1183-1200）。
“增强型内含子”是存在于基因的转录区中的内含子序列，其能够增强所述基因与其它方面相同的基因的无内含子版本相比的表达。增强型内含子序列当位于基因的转录区外部时可能也能够作为增强子起作用，并且能够作为不依赖于位置或取向的基因表达调节子起作用（Chan等人，（1999）Proc.Natl.Acad.Sci.96:4627-4632；Flodby等人（2007）Biochem.Biophys.Res.Commun.356:26-31）。
内含子序列可以加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信使的量。
所述内含子序列可操作地连接至启动子和所关注的基因。
使用大规模平行信号测序（Massively Parallel Signature Sequencing，MPSSTM)的RNA表达谱数据库能够确定基因的组织表达模式。该专有数据库包含超过250个文库和来自广泛的组织类型的深度RNA表达谱。MPSSTM转录谱技术是定量表达分析，通常每一cDNA库涉及1-2百万种转录物（Brenner S.等人，（2000）.Nat Biotechnol18：630-634，Brenner S.等人（2000）Proc Natl Acad Sci USA97:1665-1670）。它产生17个碱基的高质量的通常为基因特异性的序列，通常捕获自每一表达的基因的转录物中的3'-端DpnII限制性位点。MPSS数据的使用，包括统计分析、重复等此前已被描述（Guo M等人（2008）Plant Mol Biol66:551-563）。
本发明包括多核苷酸，其包含：（i）核酸序列，其基于Clustal V比对方法，使用默认参数KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、以及DIAGONALS SAVED=4，在与SEQ ID NO:3进行比较时具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；或（ii）核酸序列，其基于Clustal V比对方法，使用默认参数KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、以及DIAGONALSSAVED=4，在与SEQ ID NO:3的功能片段进行比较时具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；或（iii）（i）或（ii）的核酸序列的全长互补序列，其中所述多核苷酸在植物细胞中作为基因表达的调节子起作用。
本发明包括多核苷酸，其包含：（i）核酸序列，其基于Clustal V比对方法，使用默认参数KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、以及DIAGONALS SAVED=4，在与SEQ ID NO:6进行比较时具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；或（ii）（i）的核酸序列的全长互补序列，其中所述多核苷酸在植物细胞中作为基因表达的调节子起作用。
本发明的实施例包括以下：
本发明的一个实施例是重组DNA构建体，所述DNA构建体包含在植物细胞中有功能的启动子，其可操作地连接至分离的多核苷酸，其中所述启动子包含选自下列的核酸序列：（a）SEQ ID NO:3的核酸序列，（b）与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列，和（c）包含（a）或（b）的功能片段的核酸序列。在相关的实施例中，所述启动子是组成型启动子。
在另一个实施例中，所述重组构建体可包含可操作地连接至启动子和分离的多核苷酸二者的内含子，其中所述内含子包含与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少95%的同一性的核酸序列。所述内含子还可包含SEQ IDNO:6的核酸序列。此外，在与包含可操作地连接至所述分离的多核苷酸的启动子的对照重组DNA构建体相比时，所述分离多核苷酸的表达增强，所述对照重组DNA构建体中的启动子和分离的多核苷酸二者均没有可操作地连接至所述内含子。
本发明的另一个实施例是调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：（a）将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含在植物细胞中有功能的启动子，所述启动子可操作地连接至分离的多核苷酸，其中所述启动子包含选自下列的核酸序列：（i）SEQ ID NO:3的核酸序列，（ii）与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列，和（iii）包含（i）或（ii）的功能片段的核酸序列。（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来自步骤（b）的转基因植物或来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述转基因植物或子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且表现出所述多核苷酸的表达。
本发明的另一个实施例是调节分离的多核苷酸在植物中表达的方法，其包括以下步骤：（a）将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至启动子和分离的多核苷酸二者的内含子序列，其中所述内含子序列与SEQ ID NO:6表现出至少95%的序列同一性；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来自步骤（b）的转基因植物或来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述转基因植物或子代植物包含所述重组DNA构建体，并且在与包含可操作地连接至所述分离的多核苷酸的启动子的对照重组DNA构建体相比时，所述子代植物表现出增强的转基因表达，所述对照重组DNA构建体中的启动子和分离的多核苷酸二者均没有可操作地连接至所述内含子。
本发明的另一个实施例是调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：（a）将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含在植物细胞中有功能的启动子，所述启动子可操作地连接至内含子和分离的多核苷酸二者，其中所述启动子包含SEQID NO:3的核酸序列，并且其中所述内含子包含SEQ ID NO:6的核酸序列；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来自步骤（b）的转基因植物或来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述转基因植物或子代植物包含所述重组DNA构建体并且表现出所述多核苷酸的表达。
本发明的另一个实施例是调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：（a）将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至分离的多核苷酸的SEQ IDNO:3的功能片段，其中所述功能片段包含选自下列的核苷酸序列：（i）SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列；和（ii）与SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列；（b）在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及（c）获得来自步骤（b）的转基因植物或来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述转基因植物或子代植物包含所述重组DNA构建体并且表现出所述多核苷酸的表达。
本发明的另一个实施例是所公开的启动子序列的任何片段，其以与所公开的启动子序列相同或基本相似的方式在宿主细胞中驱动了操作地连接的多核苷酸的表达。
本发明的另一个实施例是SEQ ID NO:3的功能片段，其包含从SEQID NO:3的多核苷酸序列的3'端开始至少50、100、200、300、400、500、1000或1500个邻接的核苷酸。
本发明的另一个实施例是SEQ ID NO:3的功能片段，其中所述片段包含SEQ ID NO:3的3'端的120bp（SEQ ID NO:12）、172bp（SEQ ID NO:13）、328bp（SEQ ID NO:17）、518bp（SEQ ID NO:21）或1036bp（SEQ ID NO:25）。
本发明的另一个实施例包括可操作地连接至增强子元件的功能片段。例子包括但不限于CaMV35S增强子。
本发明的另一个实施例是重组构建体，其包含可操作地连接至分离的多核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段，其中所述功能片段包含选自下列的核苷酸序列：（a）SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列；和（b）与SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列。
在另一个实施例中，本发明包括重组构建体，其包含可操作地连接至分离的多核苷酸和内含子二者的SEQ ID NO:3的功能片段，其中所述功能片段包含选自下列的核苷酸序列：（a）SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列；和（b）与SEQ ID NO:12、13、17、21或25的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列。此外，所述内含子还可包含SEQ IDNO:6的核酸序列。
在另一个实施例中，本发明的组合物和方法可用于双子叶植物或单子叶植物。具体地，本发明的组合物和方法可用于单子叶植物。
在另一个实施例中，本发明包括转化的植物细胞、组织、植物和种子。本发明包括再生的、成熟的和能繁殖的转基因植物、从其产生的转基因种子、T1和后续的世代。所述转基因的植物细胞、组织、植物和种子可以包含所关注的至少一种重组DNA构建体。
在一个实施例中，本发明涵盖了通过本文所述的方法获得的植物和种子。
在另一个实施例中，本发明包括转基因微生物或细胞，其包含所述重组DNA构建体。所述微生物和细胞可以是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或者是原核细胞，例如细菌细胞。
序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于
生物信息计算包（
Inc.，Madison，WI）的
程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法（Higgins和Sharp（1989），CABIOS.5:151-153），采用默认参数（GAP PENALTY=10，GAP LENGTH PENALTY=10）进行。使用Clustal V方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1、GAPPENALTY=3、WINDOW=5、以及DIAGONALS SAVED=5。对于核酸，这些参数为KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、以及DIAGONALS SAVED=4。用Clustal V程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算的。
在另一个实施例中，本发明涵盖了分离的多核苷酸，其在植物中发挥启动子的功能，其中所述多核苷酸具有可以在严苛条件下与SEQ ID NO:3的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。所述多核苷酸还可在植物中发挥组成型启动子的功能。所述多核苷酸在长度上还可包含至少50、100、200、300、400、500、1000或1500个核苷酸。所述多核苷酸基于Clustal V比对方法，使用默认参数KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、以及DIAGONALS SAVED=4，在与SEQ ID NO:3进行比较时，还可具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。
术语“在严格条件下”指两个序列在中或高严格条件下杂交。更具体地讲，中严格可由本领域的普通技术人员通过例如根据DNA长度来容易地测定。基本条件如Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第三版，第6章和第7章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001所示，并且包括使用硝化纤维滤膜的预洗涤溶液5xSSC，0.5%SDS，1.0mM EDTA（pH8.0），杂交条件为约50%的甲酰胺，2xSSC至6xSSC，在约40-50℃下进行（或其它类似的杂交溶液，例如Stark溶液，在约50%的甲酰胺中，在约42℃下进行）并且洗涤条件为例如约40-60℃，0.5-6xSSC，0.1%SDS。优选地，中严格条件包括在约50℃和6xSSC条件下杂交（并洗涤）。高严格条件也可由本领域的技术人员通过例如根据DNA长度来容易地测定。
一般来讲，此类条件包括在比中严格条件更高的温度和/或更低的盐浓度下杂交和/或洗涤（例如在约65℃，6xSSC至0.2xSSC，优选地6xSSC，更优选地2xSSC，最优选地0.2xSSC条件下杂交）。例如，高严格条件可包括如上所述杂交并在大约65-68℃，0.2xSSC，0.1%SDS条件下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中可以用SSC（1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠）取代SSPE（1xSSPE为0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mMEDTA，pH7.4）；在完成杂交后洗涤15分钟。
使用可商购获得的杂交试剂盒也是可能的，所述试剂盒无放射性的底物作为探针。特异性的例子包括与ECL直接标记和检测系统杂交（Amersham）。严格条件包括，例如，使用所述试剂盒包括的杂交缓冲液在42℃杂交4小时，所述缓冲液补充有5%（w/v）封闭液和0.5M NaCl，并在0.4%SDS，0.5xSSC中，在55℃下洗涤两次，每次20分钟，然后在2xSSC中，在室温下洗涤一次，时间5分钟。
在另一个实施例中，本发明涵盖了分离的多核苷酸，其在植物中发挥启动子的功能，并且包含通过一个或多个核苷酸变异而衍生自SEQ ID NO:3的核苷酸序列，所述变体通过选自下列的至少一种方法进行：删除、替换、插入和缺失。所述多核苷酸还可在植物中发挥组成型启动子的功能。所述多核苷酸在长度上还可包含至少50、100、200、300、400、500、1000或1500个核苷酸。所述多核苷酸基于Clustal V比对方法，使用默认参数KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、以及DIAGONALSSAVED=4，在与SEQ ID NO:3进行比较时，还可具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。
在另一个实施例中，本发明涵盖了包含核苷酸序列的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列对应于SEQ ID NO:3的一个等位基因。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在以下文献中更全面地描述：Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor LaboratoryPress:Cold Spring Harbor，1989（下文称为“Sambrook”）。
实例
本发明将在下面的实例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出各种变化和修改以使其适用于各种用法和条件。此外，除了那些本文所示和所述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在涵盖于所附权利要求书的范围内。
实例1
通过MPSS样品选择组成型启动子的描述
使用在由Lynx Therapeutics提供的MPSS（大规模平行信号测序）技术平台上运行的一组241个专有表达谱实验，鉴定了候选启动子。来自玉米的241份样品由多种组织样品组成，涵盖了大多数种类的玉米组织和发育阶段。每一实验从单个组织样品产生了大约20,000个17bp长度的单一序列标签。通常这些标签能够与来自专有的“Unicorn”EST组装集合的一种或少数几种转录物序列匹配。对MPSS数据库进行了查询，以寻找在241份样品中的240份或更多中观察到的标签。我们鉴定了111种符合上述标准的标签，并选择了在全部241个实验中以1或更高的PPM（份每一百万份标签）的表达水平被观察到的22种用于进一步的开发。22种标签中的21种被定位至基于上述转录物集合的单基因上。
我们从这一列表中采用了在多个组织类型中表现出强表达的最佳候选物之一，并且鉴定出包含所述启动子和第一内含子的约1500bp的区，所述第一内含子定义为所述转录物中从5'端开始的第一内含子。这些调控元件命名为为P72启动子和P72内含子。
实例2
启动子和内含子扩增和克隆
在皮氏培养皿中使玉米B73（Zea mays B73）种子发芽，并用
Plant Maxi试剂盒
按照制造商的说明从幼苗的叶组织分离了基因组DNA。以基因组DNA作为模板，用表1中所示的引物和
DNA聚合酶（New England Biolabs Inc.）扩增了DNA产物。将所得的DNA片段克隆进入启动子测试载体PHP31993（图1；SEQ ID NO:2）的AscI-NcoI限制性位点之间，其使用标准的分子生物学技术（Sambrook等人）或使用来自（Clontech Inc.）的In-fusionTM克隆来实施行，并且进行完整测序。包含P72启动子和内含子的表达载体被称为PHP39158。还将玉米ubi启动子及其5’UTR内含子（SEQ ID NO:1）克隆入相同的载体并且用于比较GUS报告基因表达水平。包含玉米ubi启动子和内含子的表达载体被称为PHP38694。已知玉米ubi启动子和内含子在单子叶植物中产生高水平的组成型表达（Christensen，A.H.、Sharrock，R.A.和Quail，P.H.，Plant Mol.Biol.18，675-89，1992）。
表1
用于扩增P72启动子和内含子的引物
将全部构建体导入农杆菌属菌株LBA4404/pSB1，并在奇放线菌素和四环素上进行选择。分离了农杆菌属转化子，通过再转化至大肠杆菌或PCR分析确认了质粒的完整性。
实例3
对玉米胚中启动子和内含子活性的瞬时分析
农杆菌悬浮液的制备
从-80℃冻存的等分试样将农杆菌划线接种至包含PHI-L培养基的平板上，并在黑暗中于28℃培养3天。所述PHI-L培养基包含890ml H2O和琼脂（HIMEDIA-CR301）9g/l；50ml/l原液A[K2HPO4（Sigma-P2222）60g/l；NaH2PO4（Sigma-S8282）20g/l；使用KOH（HIMEDIA-RM1015）将pH调节至7.0]；50ml/l原液B[NH4Cl（HIMEDIA-RM730）20g/l；MgSO4.7H2O（HIMEDIA-RM683）6g/l；KCl（HIMEDIA-RM683）3g/l；CaCl2（Sigma-5080）0.2g/l；FeSO4.7H2O（Sigma-F8048）50mg/l]；10ml/l原液C[葡萄糖（Sigma-G8270）0.5g/l，并进行过滤灭菌]；四环素（Sigma-T3383）5mg/l和奇放线菌素（Sigma-56501）50mg/l。原液A、B和C以及抗生素在经灭菌后加入。平板能够被储存于4℃和使用通常约1个月。
从主平板挑出单个菌落并划线至包含PHI-M培养基[酵母提取物（BDDifco-212750）5g/l；蛋白胨（BD Difco-211677）10g/l；NaCl（HIMEDIA-RM031）5g/l；琼脂（HIMEDIA-CR301）15g/l；使用KOH（HIMEDIA-RM1015）将pH调节至6.8]；添加四环素（Sigma-T3383）5mg/l和奇放线菌素（Sigma-56501）50mg/l，并且在黑暗中在28℃下孵育过夜。
在操作柜中将5ml的PHI-A培养基[CHU（N6）基础盐（Sigma C-1416）4g/l；Eriksson's维生素溶液（1000X，PhytoTechnology-E330）1ml/l；盐酸硫胺素（Sigma-T4625）0.5mg/l；2,4-二氯苯氧基乙酸（Sigma-D7299）1.5mg/l；L-脯氨酸（PhytoTechnology-P698）0.69g/l；蔗糖（Sigma-S5390）68.5g/l；葡萄糖（Sigma-G8270）36g/l；pH用KOH（HIMEDIA-RM1015）调节至5.2]加入14ml falcon管中。从所述划线接种平板收集约3个满接种环（5mm环大小）的农杆菌并且通过涡旋混合在所述管内悬浮。将所述悬浮液调至550nm下0.35的吸光度。最终的农杆菌悬浮液被等分至2ml微量离心管中，每一管包含1ml的悬浮液。然后尽快使用悬浮液。
胚分离、感染和共培养
将使用消毒的刮刀从消毒的玉米穗上分离的未成熟胚直接浸入微量离心管中的2ml PHI-A培养基。在本实验中使用了大小介于1.3至1.9mm的胚。倒出全部培养基并将1ml的农杆菌悬浮液加至所述胚，并将该管涡旋混合30秒。在5分钟孵育后，将农杆菌和胚的悬浮液倒入皮氏平板中，其包含共培养培养基PHI-B[MS基础盐（PhytoTechnology-M524）4.3g/l；来自1000X原液的1ml B5维生素{烟酸（Sigma-G7126）1g/l，盐酸吡哆醇（Sigma-P9755）1g/l，盐酸硫胺素（Sigma-T4625）10g/l）}；肌醇（Sigma-13011）0.1g/l；盐酸硫胺素（Sigma-T4625）0.5mg/l；2,4-二氯苯氧基乙酸（Sigma-D7299）1mg/l；L-脯氨酸（PhytoTechnology-P698）0.69g/l；不含维生素的酸水解酪蛋白（Sigma-C7970）0.3g/l；蔗糖（Sigma-S5390）30g/l；
（Sigma-G1910）3g/l；使用KOH（HIMEDIA-RM1015）将pH调节至5.2；经消毒后，在所述培养基冷却至45℃后加入硝酸银（Sigma-57276）0.85mg/l和来自100mM原液的1ml乙酰丁香酮（Sigma-D134406）]。使用无菌刮刀将残留在管内的任何胚转移至培养皿中。将农杆菌悬浮液倒掉，并将胚轴线侧向下置于培养基上。用
密封平板，并在黑暗中于21℃孵育3天。
共培养的胚的休眠
就休眠步骤而言，将全部的胚转移至新的平板，其包含PHI-C培养基[MS基础盐（PhytoTechnology-M524）4.3g/l；来自1000X原液的1ml B5维生素{烟酸（Sigma-G7126）1g/l，盐酸吡哆醇（Sigma-P9755）1g/l，盐酸硫胺素（Sigma-T4625）10g/l）}；肌醇（Sigma-13011）0.1g/l；盐酸硫胺素（Sigma-T4625）0.5mg/l；2,4-二氯苯氧基乙酸（Sigma-D7299）2mg/l；L-脯氨酸（PhytoTechnology-P698）0.69g/l；不含维生素的酸水解酪蛋白（Sigma-C7970）0.3g/l；蔗糖（Sigma-S5390）30g/l；MES缓冲液（Fluka-69892）0.5g/l；
（Sigma-G1910）3g/l；使用KOH（HIMEDIA-RM1015）将pH调节至5.8；经消毒后，在所述培养基冷却至45℃后加入硝酸银（Sigma-57276）0.85mg/l和羧苄青霉素（Sigma-C3416）0.1g/l]。用
密封平板，并在黑暗中于28℃孵育。
组织化学和荧光GUS分析
在休眠3天后在胚中分析瞬时GUS表达。对于各构建体使用十组胚来以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）进行组织化学GUS染色，染色采用标准规程（Janssen和Gardner，Plant Mol.Biol.（1989）14:61–72，），并且将两个5胚组用于定量MUG分析，其采用标准规程（Jefferson，R.A.，Nature.342，837-8（1989）；Jefferson，R.A.，Kavanagh，T.A.&Bevan，M.W.EMBO J.6:3901-3907（1987））。在使用P72启动子和内含子构建体感染的胚中观察到了高水平的GUS表达，这显示P72启动子和内含子在一起能够在玉米胚中驱动GUS报告基因的表达（图2A和2B）。使用P72启动子（SEQ ID NO:3）和内含子（SEQ IDNO:6）构建体感染的玉米胚中的GUS表达超过使用玉米Ubi启动子和内含子（SEQ ID NO:1）所观察到的表达。非转基因对照是指并未使用农杆菌感染但是进行了与经农杆菌感染的测试样品相同的处理的胚或愈伤组织。
实例4
通过农杆菌进行的玉米愈伤组织转化和再生
为获得稳定表达具有P72启动子（SEQ ID NO:3）和内含子（SEQ IDNO:6）的重组构建体（PHP39158）以及对照重组载体的转基因玉米植物，将根据实例3中描述获得的共培养的胚进行如下所述的处理。
在休眠12天后，将全部共培养的胚转移至包含PHI-D培养基[PHI-C培养基，补充以双丙氨磷（Gold Bio-B0178）1.5mg/l]的新平板三周来选择稳定的转基因事件。对于剩余的选择时期，将双丙氨磷浓度提高至3mg/l。密封所述平板并且在黑暗中于28℃孵育。以两周为间隔将所述胚转移至新鲜的选择培养基中，持续进行约2个月。随后通过在相同的培养基中生长另外两周直至所述愈伤组织的直径为约1.5-2cm，从而将抗双丙氨磷的愈伤组织“聚堆”。
为了成熟，随后将所述愈伤组织在PHI-E培养基[MS盐（PhytoTechnology-M524）4.3g/l；来自200x原液的MS维生素5ml{甘氨酸（Sigma-7126）0.4g/l；烟酸（Sigma-G7126）0.1g/l；盐酸吡哆醇（Sigma-P9755）0.1g/l；盐酸硫胺素（Sigma-T4625）0.02g/l}；肌醇（Sigma-13011）0.1g/l；玉米素（Sigma-Z0164）0.5mg/l；蔗糖（Sigma-S5390）60.0g/l；超纯的琼脂-琼脂（EMD-1.01613.1000）6.0g/l；经灭菌后，加入吲哚乙酸（IAA，Sigma-15148）0.1mg/l；脱落酸（Sigma-A4906）26微克/l；双丙氨磷（Gold Bio B0178）1.5mg/l；羧苄青霉素（Sigma-C3416）0.1g/l并将pH调节至pH5.6]中在黑暗中于28℃下培养1-3周以使体细胞胚成熟。随后将所述成熟愈伤组织在PHI-F培养基[MS盐（PhytoTechnology-M524）4.3g/l；来自200x原液的MS维生素5ml{甘氨酸（Sigma-7126）0.4g/l；烟酸（Sigma-G7126）0.1g/l；盐酸吡哆醇（Sigma-P9755）0.1g/l；盐酸硫胺素（Sigma-T4625）0.2g/l}；肌醇（Sigma-13011）0.1g/l；蔗糖（Sigma-S5390）40.0g/l；琼脂（Sigma-A7921）6g/l；双丙氨磷1.5g/l；pH5.6]中培养以进行再生，其在25℃使用16小时光照（270uE m-2秒-1）和8小时黑暗的日照时间表进行，直至发育出幼苗和根。随后将各组小植物体转移至包含PHI-F的25×150mm的管中并且在相同的条件下生长大约另外一周。将所述植物移栽入温室内的土壤混合物中。
在所述再生植物中测定表达GUS报告基因的植物。在来自使用P72启动子和内含子产生的全部稳定转基因事件的叶组织以及花粉中观察到了强GUS报告基因表达（图3A和3B）。
可以使用表达任何所关注的多核苷酸的重组构建体（所述表达受到P72启动子和内含子驱动）来转化玉米植物，并且可如实例3和实例4中所述获得转基因植物。
实例5
通过农杆菌感染转化和再生水稻愈伤组织
将来自新鲜划线接种平板的农杆菌菌落接种于YEB液体培养基中[酵母提取物（BD Difco-212750）1g/l；蛋白胨（BD Difco-211677）5g/l；牛肉膏（Amresco-0114）5g/l；蔗糖（Sigma-S5390）5g/l；硫酸镁（Sigma-M8150）0.3g/l，pH-7.0]中，其补充以四环素（Sigma-T3383）2.5mg/l和奇放线菌素（Sigma-5650）50mg/l。培养物在黑暗中于28℃以220rpm连续振荡生长过夜。在次日将所述培养物在补充有200μM乙酰丁香酮（Sigma-D134406）的PHI-A培养基（参见实例2的PHI-A组成）中调至550nm下0.5的吸光度，并且在28℃下以220rpm连续震荡孵育1小时。
将粳稻日本晴变种（Japonica rice var nipponbare）的种子在无水乙醇中消毒10分钟，随后以水洗涤三次并且在70%的次氯酸钠[Fisher Scientific-27908]中孵育30分钟。然后用水洗涤种子5次并使其完全干燥。干燥的种子被接种至NB-CL培养基[CHU（N6）基础盐（PhytoTechnology-C416）4g/l；Eriksson's维生素溶液（1000X PhytoTechnology-E330）1ml/l；盐酸硫胺素（Sigma-T4625）0.5mg/l；2,4-二氯苯氧基乙酸（Sigma-D7299）2.5mg/l；BAP（Sigma-B3408）0.1mg/l；L-脯氨酸（PhytoTechnology-P698）2.5g/l；不含维生素的酸水解酪蛋白（Sigma-C7970）0.3g/l；肌醇（Sigma-13011）0.1g/l；蔗糖（Sigma-S5390）30g/l；
（Sigma-G1101.5000）3g/l；pH5.8）]并且使其在光照下与28℃生长。
将15-21天龄的增殖中的愈伤组织转移至无菌培养瓶中，将如上文所述制备的农杆菌溶液添加至所述瓶中。在25℃下孵育所述悬浮液20分钟，每5分钟进行轻柔地振荡。小心地倒净农杆菌悬浮液，并将愈伤组织置于Whatman4号滤纸上。立即将愈伤组织转移至NB-CC培养基[补充了200μM乙酰丁香酮（Sigma-D134406）的NB-CL]并于21℃孵育72小时。
培养终止和选择
将共培养的愈伤组织置于干燥、无菌的培养瓶中，并用1升包含头孢噻肟（Duchefa-C0111.0025）0.250g/l和羧苄青霉素（Sigma-C0109.0025）0.4g/l的无菌蒸馏水洗涤。洗涤重复4次，或直到溶液显得澄清。小心地倒干水，并将愈伤组织置于Whatman4号滤纸上，于室温干燥30分钟。将干燥的愈伤组织转移至NB-RS培养基[补充了头孢噻肟（Duchefa-C0111.0025）0.25g/l；和羧苄青霉素（Sigma-C0109.0025）0.4g/l的NB-CL]并于28℃孵育4天。
然后将愈伤组织转移至NB-SB培养基[补充了双丙氨磷（Meiji SeikaK.K.，Tokyo，Japan）5mg/l的NB-RS]并于28℃孵育并每14天传代培养至新鲜培养基中。在35-40天的选择、增殖之后能够容易地观察到双丙氨磷抗性的愈伤组织事件。使用来自各愈伤组织事件的小块以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）进行组织化学GUS染色，染色采用标准规程（Janssen和Gardner，Plant Mol.Biol.（1989）14:61–72）。.在使用具有内含子的P72启动子的构建体获得的稳定愈伤组织事件中观察到了高水平的GUS报告基因表达，这表明P72启动子（SEQ ID NO:3）和内含子（SEQID NO:6）在一起能够在稳定的水稻愈伤组织事件中驱动GUS报告基因的表达（图4）。
实例6
稳定的水稻植物从转化的水稻愈伤组织中的再生
如实例5中所述获得的转化的愈伤组织事件可进一步传代以获得稳定的转基因植物。可将剩余的愈伤组织事件转移至NB-RG培养基[CHU(N6)基础盐（PhytoTechnology-C416）4g/l；N6维生素1000x1ml{甘氨酸（Sigma-47126）2g/l；盐酸硫胺素（Sigma-T4625）1g/l；盐酸吡哆醇（Sigma-P9755）0.5g/l；烟酸（Sigma-N4126）0.5g/l}；激动素（Sigma-K0753）0.5mg/l；不含维生素的酸水解酪蛋白（Sigma-C7970）0.5g/l；蔗糖（Sigma-S5390）20g/l；山梨醇（Sigma-S1876）30g/l，pH被调节至5.8并添加了4g/l 
（Sigma-G1101.5000）。灭菌后加入0.1ml/l的CuSo4（100mM浓度，Sigma-C8027）和100ml/l AA氨基酸{10x甘氨酸（Sigma-G7126）75mg/l；L-天冬氨酸（Sigma-A9256）2.66g/l；L-精氨酸（Sigma-A5006）1.74g/l；L-谷氨酰胺（Sigma-G3126）8.76g/l}并于32℃在光照下孵育。15-20天后，可将再生的幼苗转移至包含NB-RT培养基[MS基础盐（PhytoTechnology-M524）4.33g/l；来自1000x原液的1ml/l B5维生素{烟酸（Sigma-G7126）1g/l，盐酸吡哆醇（Sigma-P9755）1g/l，盐酸硫胺素（Sigma-T4625）10g/l）}；肌醇（Sigma-13011）0.1g/l；蔗糖（Sigma-S5390）30g/l；和IBA（Sigma-I5386）0.2mg/l；pH调节至5.8]的品红盒子中。在10-15天后获得的生根的植株，在转移至温室之前能够在液体Y培养基[原液A-F各1.25ml，用水补足至1000ml。各种原液的组成：原液（A）硝酸铵（HIMEDIA-RM5657）9.14g/l，（B）磷酸氢二钠（HIMEDIA-58282）4.03g，（C）硫酸钾（HIMEDIA-29658-4B），（D）氯化钙（HIMEDIA-C5080）8.86g，（E）硫酸镁（HIMEDIA-RM683）3.24g，（F）（微量元素）四水氯化镁（HIMEDIA-10149）15mg，钼酸铵（HIMEDIA-271974B）6.74mg/l，硼酸（Sigma-136768）9.34g/l，七水硫酸锌（HIMEDIA-RM695）0.35mg/l，七水硫酸铜（HIMEDIA-C8027）0.31mg/l，六水氯化铁（Sigma-236489）0.77mg/l，一水柠檬酸（HIMEDIA-C4540）0.119g/l]，在转移至温室前在28℃下放置10-15天。将各个独立的事件转移至各个花盆中并且可在所述转基因植物的不同组织中分析GUS报告基因表达。
实例7
转基因玉米和水稻植株中的拷贝数分析
使用基于Taqman的定量实时PCR（qPCR）分析来分析转基因植物的拷贝数。全部的单拷贝事件被转移至单独的盆中，仅对它们进行进一步的分析。
通过定量PCR测定转基因拷贝数
采用基于TaqMan的定量实时PCR（qPCR）分析，对使用包含P72的PHP39158构建体产生的转基因玉米和水稻植株进行了分析，以测定转基因拷贝数。使用
Plant Maxi试剂盒（
Inc.），按照制造商的说明，从收集自10天龄的T0玉米和水稻植株的叶组织分离了基因组DNA。DNA浓度被调节至100ng/μl，并作为模板被用于qPCR反应，以测定拷贝数。通过设计针对靶基因和针对内源性谷胱甘肽还原酶5（GR5）和乙醇脱氢酶（ADH）基因的PCR引物和TaqMan探针，进行了拷贝数分析。内源GR5基因用作为水稻的内部对照，而ADH基因用作为玉米的内部对照，以此对不同样品间的靶基因所获得的Ct数值进行归一化。为了确定靶基因的相对定量（RQ）值，来自已知的单拷贝和双拷贝校准子的基因组DNA也被包括在实验中。测试样品和校准子被重复两次以保证准确性。非转基因对照物和无模板对照物也被包括在反应中。对于靶基因和内源性基因，反应混合物（就20μl反应体积而言）包含10μl的2XTaqMan通用型PCR预混液（Applied Biosystems）、0.5μl的10μM PCR引物和0.5μl的10μM TaqMan探针。用无菌Milli Q水将体积调节至19μl，适当地混合反应组分，迅速离心以使液体流至管的底部。向包含1μl基因组DNA的反应板的每一孔加入19μl反应混合物，以获得20μl的终体积。用MicroAmp透明粘合带（Applied Biosystems）正确地密封反应板并短暂离心，然后加载至实时PCR系统（7500实时PCR系统，AppliedBiosystems）上。所使用的扩增程序是：1个循环的50℃2:00分钟和95℃10:00分钟，然后是40个循环的95℃15秒和58℃1:00分钟。在PCR反应完成之后，使用SDS v2.1软件（Applied Biosystems）计算了以单拷贝校准子为基准的在测试样品中的RQ值。
设计用于GUS报告基因和用于内源GR5和ADH基因的PCR引物和Taqman探针列于下表中。
表2
引物序列
| 引物ID | 序列（5'至3'） | SEQ ID NO: |
| GUS正向引物 | CTTACGTGGCAAAGGATTCGA | 29 |
| GUS反向引物 | GCCCCAATCCAGTCCATTAA | 30 |
| GR5正向引物 | GGCAGTTTGGTTGATGCTCAT | 31 |
| GR5反向引物 | TGCTGTATATCTTTGCTTTGAACCAT | 32 |
| ADH正向引物 | CAAGTCGCGGTTTTCAATCA | 33 |
| ADH反向引物 | TGAAGGTGGAAGTCCCAACAA | 34 |
表3
探针序列
| SEQ ID NO: | 探针 | 淬灭基团 | |
| GUS | SEQ ID NO:35 | Fam | Tamra |
| GR5 | SEQ ID NO:36 | VIC | MGB |
| ADH | SEQ ID NO:37 | VIC | MGB |
将全部单拷贝事件转移进入各个花盆中并且对从T0和T1玉米以及T0水稻植株上采集的不同组织实施进一步分析。
实例8
对GUS报告基因的定性和定量分析
在稳定的玉米和水稻事件中的表达
定性和定量GUS报告基因表达分析均在至少5组独立的单拷贝事件上重复三次实施。采集不同的组织样品以使用以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）进行组织化学GUS染色，染色采用标准规程（Janssen和Gardner，Plant Mol.Biol.（1989）14:61-72），对于定量的MUG检测采用了标准规程（Jefferson，R.A.，Nature.342，837-8（1989）；Jefferson，R.A.、Kavanagh，T.A.和Bevan，M.W.，EMBO J.6，3901-3907（1987））。
在T1玉米植株中测定了GUS报告基因表达。在来自T1玉米事件的叶、茎、根、雄穗、花粉、穗丝和未成熟穗中观察到了强GUS报告基因表达（图5A、5B和6）。
在水稻中，在采集自T0事件的不同组织中测量的GUS报告基因表达与采集自携带Zm-Ubi启动子和内含子的水稻事件的数据进行了比较，所述Zm-Ubi启动子和内含子在转基因水稻植株中驱动了GUS的表达（图7A-7E和8）。在花药和根中，具有P72启动子和内含子的GUS报告基因表达的水平相比Zm-Ubi启动子和内含子显著更高（图8）。
实例9
启动子截短构建体以及对截短启动子强度的测试
可从5'端截短P72启动子的序列以鉴定依然能够驱动下游基因的高水平转录的最小序列。为对此进行测试，可设计引物以扩增并克隆不同的P72启动子截短物。还可测试无内含子的启动子和无启动子的内含子构建体启动子截短物可使用不同长度的所述启动子制成，诸如所述内含子序列上游0kb（仅有内含子）、0.172kb、0.328kb、0.518kb和1.036kb的P72启动子序列。这些序列可使用
DNA聚合酶（New England BiolabsInc.）进行扩增并且克隆进入启动子测试载体PHP31993（图1）的AscI-NcoI限制性位点之间，其使用标准分子生物学技术（Sambrook等人）或使用来自Clontech Inc.的In-FusionTM克隆而进行。
表4
用于克隆P72启动子和内含子的不同片段的引物
全部所得构建体可导入农杆菌属菌株LBA4404/pSB1并根据实例3的说明在奇放线菌素和四环素进行选择。可分离农杆菌属转化子，并可通过再转化至大肠杆菌或PCR分析确认质粒的完整性。可产生稳定的转基因水稻植株并且可根据实例8中的说明通过在不同组织中分析靶基因表达来测定不同的P72截短物的活性。
实例10
对具有异源元件的启动子和内含子的测试
P72启动子和内含子序列在驱动靶基因表达中的强度可通过克隆具有异源内含子的P72启动子和具有异源启动子的P72内含子来加以测试。所得的构建体可在稳定的转基因水稻植株中测试以根据实例8中的说明检验不同组织中的靶基因表达的强度。
Claims (18)
1.重组DNA构建体，包含在植物细胞中有功能的启动子，所述启动子可操作地连接至分离的多核苷酸，其中所述启动子包含选自下列的核酸序列：
(a)SEQ ID NO:3的核酸序列，
(b)与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列，和
(c)包含（a）或（b）的功能片段的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述启动子和所述分离的多核苷酸各自可操作地连接至内含子，并且此外其中所述内含子包含与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列。
3.重组DNA构建体，包含可操作地连接至启动子和分离的多核苷酸二者的内含子，其中所述内含子包含与SEQ ID NO:6具有至少95%的序列同一性的核酸序列。
4.根据权利要求2或3所述的重组DNA构建体，其中所述内含子包含SEQ ID NO:6的核酸序列。
5.根据权利要求2、3或4所述的重组DNA构建体，其中在与包含可操作地连接至所述分离的多核苷酸的启动子的对照重组DNA构建体相比时，所述重组DNA构建体的分离的多核苷酸在植物中的表达增强，所述对照重组DNA构建体中的启动子和分离的多核苷酸二者均没有可操作地连接至所述内含子。
6.根据权利要求1或2所述的重组DNA构建体，其中所述启动子是组成型启动子。
7.包含权利要求1、2或3的重组DNA构建体的植物。
8.包含权利要求1、2或3的重组DNA构建体的种子。
9.包含权利要求4的重组DNA构建体的植物。
10.包含权利要求4的重组DNA构建体的种子。
11.包含权利要求5的重组DNA构建体的植物。
12.包含权利要求5的重组DNA构建体的种子。
13.包含权利要求6的重组DNA构建体的植物。
14.包含权利要求6的重组构建体的种子。
15.调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，包括以下步骤：
(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含在植物细胞中有功能的启动子，所述启动子可操作地连接至分离的多核苷酸，其中所述启动子包含选自下列的核酸序列：
(i)SEQ ID NO:3的核酸序列，
(ii)与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少95%的序列同一性的核酸序列，和
(iii)包含（i）或（ii）的功能片段的核酸序列；
(b)在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及
(c)获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体并且表现出所述多核苷酸的表达。
16.调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，包括以下步骤：
(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至在植物细胞中有功能的启动子和分离的多核苷酸二者的内含子序列，其中所述内含子序列与SEQ IDNO:6表现出至少95%的同一性；
(b)在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及
(c)获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体，并且在与包含对照重组DNA构建体的植物相比时，所述子代植物表现出增强的分离的多核苷酸的表达，所述对照重组DNA构建体包含可操作地连接至所述分离的多核苷酸的启动子，所述对照重组DNA构建体中的启动子和分离的多核苷酸二者均没有可操作地连接至所述内含子。
17.调节分离的多核苷酸在植物中的表达的方法，包括以下步骤：
(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含在植物细胞中有功能的启动子，所述启动子可操作地连接至内含子和分离的多核苷酸二者，其中所述启动子包含SEQID NO:3的核酸序列，并且其中所述内含子包含SEQ ID NO:6的核酸序列；
(b)在步骤（a）之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体；以及
(c)获得来源于步骤（b）的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重组DNA构建体并且表现出所述多核苷酸的表达。
18.根据权利要求19、20或21所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131120 |