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CN108601795A - 用于治疗serpinc1相关病症的方法和组合物 - Google Patents

用于治疗serpinc1相关病症的方法和组合物 Download PDF

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CN108601795A
CN108601795A CN201680081199.2A CN201680081199A CN108601795A CN 108601795 A CN108601795 A CN 108601795A CN 201680081199 A CN201680081199 A CN 201680081199A CN 108601795 A CN108601795 A CN 108601795A
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CN
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nucleotides
double
rnai agent
stranded rnai
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CN201680081199.2A
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A·埃金
B·索伦森
P·加格
G·罗比
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Genzyme Corp
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Genzyme Corp
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Abstract

本发明涉及iRNA例如双链核糖核酸(dsRNA)、靶向Serpinc1基因的组合物和使用这样的iRNA例如dsRNA、组合物来抑制Serpinc1的表达和治疗具有Serpinc1相关疾病例如出血病症诸如血友病的受试者的方法。

Description

用于治疗SERPINC1相关病症的方法和组合物
相关申请
本申请要求于2015年12月7日提交的美国临时专利申请号62/264,013、于2016年3月30日提交的美国临时专利申请号62/315,228、于2016年7月25日提交的美国临时专利申请号62/366,304和于2016年12月2日提交的美国临时专利申请号62/429,241的优先权的权益。前述专利申请各自的全部内容通过引用由此并入本文。
本申请涉及于2014年5月12日提交的美国临时专利申请号61/992,057、于2014年12月8日提交的美国临时专利申请号62/089,018、于2015年1月12日提交的美国临时专利申请号62/102,281和于2015年5月12日提交的PCT专利申请号PCT/US2015/030337。前述专利申请各自的全部内容通过引用由此并入本文。
另外，本申请涉及于2012年4月26日提交的美国临时专利申请号61/638,952、于2012年7月9日提交的美国临时专利申请号61/669,249、于2012年12月7日提交的美国临时专利申请号61/734,573、于2013年3月15日提交的美国临时专利申请号13/837,129、现在的美国专利号9,127,274、于2015年7月22日提交的美国专利申请号14/806,084、现在的美国专利号9,376,680、于2016年3月15日提交的美国专利申请号15/070,358和于2013年4月25日提交的PCT专利申请号PCT/US2013/038218。本申请还涉及于2012年11月16日提交的PCT专利申请号PCT/US2012/065601。前述专利申请各自的全部内容通过引用由此并入本文。
序列表
本申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交且通过引用以其整体由此并入。创建于2016年12月6日的所述ASCII拷贝被命名为121301-05220_SL.TXT且大小为21,140字节。
背景技术
Serpinc1为丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)超家族的成员。Serpinc1为血浆蛋白酶抑制剂，其抑制凝血酶及凝血系统中其他活化的丝氨酸蛋白酶诸如因子X、IX、XI、XII和VII且因此调节血液凝集级联。Serpinc1的抗凝活性通过肝素和催化凝血酶:抗凝血酶(TAT)复合物形成的其他相关糖胺聚糖的存在而得以增强。
遗传性或获得性出血病症为其中有血液凝固不足的病况。例如，血友病为一组遗传性遗传出血病症，其损害身体控制血液凝固或凝集的能力。A型血友病为阴性X伴性的遗传病症，其涉及缺乏功能性凝血因子VIII并占80％的血友病案例。B型血友病为阴性X伴性的遗传病症，其涉及缺乏功能性凝血因子IX。其占约20％的血友病案例。C型血友病为自体遗传病症，其涉及缺乏功能性凝血因子XI。C型血友病不是完全阴性的，这是因为杂合的个体也显示出增加的出血。
尽管现在没有治愈血友病，但是可以用常规输注缺乏的凝血因子(例如A型血友病中的因子VIII)来控制。然而，一些血友病患者形成针对给予他们的替代因子的抗体(抑制剂)且因此变得对替代凝集因子抗拒。因此，不能适当控制这样的受试者中的出血。
形成例如因子VIII和其他凝血因子的高效价抑制剂为血友病治疗的最严重的并发症且使出血的治疗非常具有挑战性。目前，在这样的受试者中止血的唯一策略是使用“旁路药剂”诸如因子8抑制剂旁路活性(FEIBA)和活化的重组因子VII(rFVIIa)、血浆去除、连续因子替代和免疫耐受治疗，它们没有一个完全有效。因此，本领域中有对于具有出血病症(诸如血友病)的受试者的替代治疗的需要。
发明内容
本发明提供使用iRNA组合物(其影响RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的Serpinc1基因的RNA转录物的切割以抑制Serpinc1基因的表达)治疗具有会受益于抑制或减少Serpinc1基因表达的病症(例如出血病症诸如血友病)的受试者的方法。
本发明至少部分基于令人惊奇地发现了极低剂量(例如比本领域中教导的剂量低至少约30倍的剂量)的GalNAc连接的包含特定化学修饰的双链RNAi剂对抑制Serpinc1的表达显示出特别效力及特别持久地抑制Serpinc1表达。具体地，低剂量的包含GalNAc配体及有义链和反义链的RNAi剂(其中基本上所有的核苷酸都是经修饰的)诸如包含在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个或多个基序(包括在药剂的切割位点或附近的一个这样的基序)、六个硫代磷酸酯键和GalNAc配体的RNAi剂在本文中被证实在沉默Serpinc1基因的活性方面特别有效和持久。
因此，在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用剂量约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的双链RNAi剂，其包含形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸且反义链包含与SEQ IDNO:5的核苷酸序列的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与配体缀合，例如配体附接在有义链的3’-末端。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用剂量约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的双链RNAi剂，其中双链RNAi剂包含形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸且反义链包含与SEQ ID NO:5的核苷酸序列的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
在一个实施方案中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在另一个实施方案中，有义链和反义链包含互补性区域，其包含与表2和3的任何一个所列的任何一个序列的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的核苷酸独立地选自2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸基团的核苷酸和与胆固醇衍生物或十二烷酸二癸基酰氨基团连接的末端核苷酸。在进一步的实施方案中，经修饰的核苷酸选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基修饰的核苷酸、2’-C-烯丙基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯和非天然碱基的核苷酸。
在双链RNAi剂的另一个实施方案中，至少一条链包含至少一个核苷酸的3’突出端。在另一个实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的3’突出端。在其他实施方案中，RNAi剂的至少一条链包含至少一个核苷酸的5’突出端。在某些实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的5’突出端。在其他实施方案中，RNAi剂的一条链的3’和5’-端都包含至少一个核苷酸的突出端。
在某些实施方案中，配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。配体可为通过一价、二价或三价支化接头附接于RNAi剂的一个或多个GalNAc。配体可与双链RNAi剂的有义链的3’-端、双链RNAi剂的有义链的5’-端、双链RNAi剂的反义链的3’-端或双链RNAi剂的反义链的5’-端缀合。
在一些实施方案中，本发明的双链RNAi剂包含多个例如2、3、4、5或6个GalNAc，其通过多个单价接头各自独立地附接于双链RNAi剂的多个核苷酸。
在某些实施方案中，配体为
在另一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用剂量约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的双链RNAi剂，其中双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中反义链包含与编码Serpinc1的mRNA的部分互补的区域，其中每条链为约14至约30个核苷酸的长度，其中双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
有义：5’-Na-YYY-Na-3’
反义：3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-5’ (IIIe)
其中
np’为2个核苷酸突出端且np’中的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接；
每个Na和Na’独立地表示包含经修饰的或未经修饰的或其组合的0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y’Y’Y’各自独立地表示在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个基序且其中所述修饰为2’-O-甲基或2’-氟修饰；
其中有义链和反义链各自独立地包含两个在5’-末端的硫代磷酸酯键；和
其中有义链与至少一个配体缀合，其中配体为通过一价、二价或三价支化接头附接的一个或多个GalNAc衍生物，
由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用剂量约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的双链RNAi剂，其中双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中反义链包含与编码Serpinc1的mRNA的部分互补的区域，其中每条链为约14至约30个核苷酸的长度，其中双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
有义：5’-Na-YYY-Na-3’
反义：3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-5’ (IIIe)
其中
np’为2个核苷酸突出端且np’中的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接；
每个Na和Na’独立地表示包含经修饰的或未经修饰的或其组合的0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y’Y’Y’各自独立地表示在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个基序且其中所述修饰为2’-O-甲基或2’-氟修饰；
其中有义链和反义链各自独立地包含两个在5’-末端的硫代磷酸酯键；和
其中有义链与至少一个配体缀合，其中配体为通过一价、二价或三价支化接头附接的一个或多个GalNAc衍生物，
由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在一个实施方案中，双链RNAi剂以单剂或两剂或更多剂例如以3、4、5或6剂向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂每月一次、每6周一次、每2月一次或每季度一次或按需向受试者施用。
双链RNAi剂可例如以约0.200至约1.825mg/kg、0.200至约1.800mg/kg、约0.200至约1.700mg/kg、约0.200至约1.600mg/kg、约0.200至约1.500mg/kg、约0.200至约1.400mg/kg、约0.200至约1.400mg/kg、约0.200至约1.200mg/kg、约0.200至约1.100mg/kg、约0.200至约1.000mg/kg、约0.200至约0.900mg/kg、约0.200至约0.800mg/kg、约0.200至约0.700mg/kg、约0.200至约0.600mg/kg、约0.200至约0.500mg/kg、约0.200至约0.400mg/kg、约0.225至约1.825mg/kg、约0.225至约1.800mg/kg、约0.225至约1.700mg/kg、约0.225至约1.600mg/kg、约0.225至约1.500mg/kg、约0.225至约1.400mg/kg、约0.225至约1.400mg/kg、约0.225至约1.200mg/kg、约0.225至约1.100mg/kg、约0.225至约1.000mg/kg、约0.225至约0.900mg/kg、约0.225至约0.800mg/kg、约0.225至约0.700mg/kg、约0.225至约0.600mg/kg、约0.225至约0.500mg/kg、约0.225至约0.400mg/kg、约0.250至约1.825mg/kg、约0.250至约1.800mg/kg、约0.250至约1.700mg/kg、约0.250至约1.600mg/kg、约0.250至约1.500mg/kg、约0.250至约1.400mg/kg、约0.250至约1.400mg/kg、约0.250至约1.200mg/kg、约0.250至约1.100mg/kg、约0.250至约1.000mg/kg、约0.250至约0.900mg/kg、约0.250至约0.800mg/kg、约0.250至约0.700mg/kg、约0.250至约0.600mg/kg、约0.250至约0.500mg/kg、约0.250至约0.400mg/kg、约0.425至约1.825mg/kg、约0.425至约1.800mg/kg、约0.425至约1.700mg/kg、约0.425至约1.600mg/kg、约0.425至约1.500mg/kg、约0.425至约1.400mg/kg、约0.425至约1.400mg/kg、约0.425至约1.200mg/kg、约0.425至约1.100mg/kg、约0.425至约1.000mg/kg、约0.425至约0.900mg/kg、约0.425至约0.800mg/kg、约0.425至约0.700mg/kg、约0.425至约0.600mg/kg、约0.425至约0.500mg/kg、约0.450至约1.825mg/kg、约0.450至约1.800mg/kg、约0.450至约1.700mg/kg、约0.450至约1.600mg/kg、约0.450至约1.500mg/kg、约0.450至约1.400mg/kg、约0.450至约1.400mg/kg、约0.450至约1.200mg/kg、约0.450至约1.100mg/kg、约0.450至约1.000mg/kg、约0.450至约0.900mg/kg、约0.450至约0.800mg/kg、约0.450至约0.700mg/kg、约0.450至约0.600mg/kg、约0.450至约0.500mg/kg、约0.475至约1.825mg/kg、约0.475至约1.800mg/kg、约0.475至约1.700mg/kg、约0.475至约1.600mg/kg、约0.475至约1.500mg/kg、约0.475至约1.400mg/kg、约0.475至约1.400mg/kg、约0.475至约1.200mg/kg、约0.475至约1.100mg/kg、约0.475至约1.000mg/kg、约0.475至约0.900mg/kg、约0.475至约0.800mg/kg、约0.475至约0.700mg/kg、约0.475至约0.600mg/kg、约0.475至约0.500mg/kg、约0.875至约1.825mg/kg、约0.875至约1.800mg/kg、约0.875至约1.700mg/kg、约0.875至约1.600mg/kg、约0.875至约1.500mg/kg、约0.875至约1.400mg/kg、约0.875至约1.400mg/kg、约0.875至约1.200mg/kg、约0.875至约1.100mg/kg、约0.875至约1.000mg/kg、约0.875至约0.900mg/kg、约0.900至约1.825mg/kg、约0.900至约1.800mg/kg、约0.900至约1.700mg/kg、约0.900至约1.600mg/kg、约0.900至约1.500mg/kg、约0.900至约1.400mg/kg、约0.900至约1.400mg/kg、约0.900至约1.200mg/kg、约0.900至约1.100mg/kg、约0.900至约1.000mg/kg、约0.925至约1.825mg/kg、约0.925至约1.800mg/kg、约0.925至约1.700mg/kg、约0.925至约1.600mg/kg、约0.925至约1.500mg/kg、约0.925至约1.400mg/kg、约0.925至约1.400mg/kg、约0.925至约1.200mg/kg、约0.925至约1.100mg/kg或约0.925至约1.000mg/kg的月剂量作为例如1、2、3、4、5、6、7、8个月或更久的月剂量向受试者施用。
受试者可为人诸如具有出血病症诸如获得性出血病症或遗传性出血病症例如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病的人。
在一个实施方案中，受试者具有A型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有B型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有C型血友病且为抑制剂受试者。
在一个实施方案中，向受试者施用双链RNAi剂导致血液凝固的增加和/或Serpinc1蛋白积累的减少。
在一个实施方案中，该方法进一步包括测量受试者中的凝血酶水平。
双链RNAi剂可皮下或静脉内施用。
在一个实施方案中，RNAi剂的反义链的基本上所有核苷酸和有义链的基本上所有核苷酸包含选自下组的修饰：2’-O-甲基或2’-氟修饰。在一个实施方案中，RNAi剂的有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，YYY基序在有义链的切割位点或附近出现。
在一个实施方案中，Y’Y’Y’在反义链的从5’-端开始的11、12和13位出现。
双链区域可以是15-30个核苷酸对的长度、17-23个核苷酸对的长度、17-25个核苷酸对的长度、23-27个核苷酸对的长度、19-21个核苷酸对的长度或21-23个核苷酸对的长度。
每条链可具有15-30个核苷酸或19-30个核苷酸。
在一个实施方案中，有义链具有总共21个核苷酸且反义链具有总共23个核苷酸。
在一个实施方案中，配体为
在一个实施方案中，配体附接于有义链的3’-端。
在一个实施方案中，RNAi剂如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，在双链体的反义链的5’-端的1位的碱基对为AU碱基对。
在一个实施方案中，RNAi剂为AD-57213((有义(5’至3’):GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf(SEQ ID NO:13)；反义(5’至3’):usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键))。
在一个实施方案中，该药剂作为药物组合物施用。在一个实施方案中，RNAi剂在无缓冲的溶液(诸如盐水或水)中施用。
在一个实施方案中，siRNA与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用剂量约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，该反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
在一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用剂量约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，该反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
双链RNAi剂可按两剂或更多剂向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂每月一次向受试者施用。在另一个实施方案中，双链RNAi剂每6周一次向受试者施用。在一个实施方案中，双链RNAi剂每2月一次向受试者施用。在另一个实施方案中，双链RNAi剂每季度一次向受试者施用。
双链RNAi剂可例如以约0.200至约1.825mg/kg、0.200至约1.800mg/kg、约0.200至约1.700mg/kg、约0.200至约1.600mg/kg、约0.200至约1.500mg/kg、约0.200至约1.400mg/kg、约0.200至约1.400mg/kg、约0.200至约1.200mg/kg、约0.200至约1.100mg/kg、约0.200至约1.000mg/kg、约0.200至约0.900mg/kg、约0.200至约0.800mg/kg、约0.200至约0.700mg/kg、约0.200至约0.600mg/kg、约0.200至约0.500mg/kg、约0.200至约0.400mg/kg、约0.225至约1.825mg/kg、约0.225至约1.800mg/kg、约0.225至约1.700mg/kg、约0.225至约1.600mg/kg、约0.225至约1.500mg/kg、约0.225至约1.400mg/kg、约0.225至约1.400mg/kg、约0.225至约1.200mg/kg、约0.225至约1.100mg/kg、约0.225至约1.000mg/kg、约0.225至约0.900mg/kg、约0.225至约0.800mg/kg、约0.225至约0.700mg/kg、约0.225至约0.600mg/kg、约0.225至约0.500mg/kg、约0.225至约0.400mg/kg、约0.250至约1.825mg/kg、约0.250至约1.800mg/kg、约0.250至约1.700mg/kg、约0.250至约1.600mg/kg、约0.250至约1.500mg/kg、约0.250至约1.400mg/kg、约0.250至约1.400mg/kg、约0.250至约1.200mg/kg、约0.250至约1.100mg/kg、约0.250至约1.000mg/kg、约0.250至约0.900mg/kg、约0.250至约0.800mg/kg、约0.250至约0.700mg/kg、约0.250至约0.600mg/kg、约0.250至约0.500mg/kg、约0.250至约0.400mg/kg、约0.425至约1.825mg/kg、约0.425至约1.800mg/kg、约0.425至约1.700mg/kg、约0.425至约1.600mg/kg、约0.425至约1.500mg/kg、约0.425至约1.400mg/kg、约0.425至约1.400mg/kg、约0.425至约1.200mg/kg、约0.425至约1.100mg/kg、约0.425至约1.000mg/kg、约0.425至约0.900mg/kg、约0.425至约0.800mg/kg、约0.425至约0.700mg/kg、约0.425至约0.600mg/kg、约0.425至约0.500mg/kg、约0.450至约1.825mg/kg、约0.450至约1.800mg/kg、约0.450至约1.700mg/kg、约0.450至约1.600mg/kg、约0.450至约1.500mg/kg、约0.450至约1.400mg/kg、约0.450至约1.400mg/kg、约0.450至约1.200mg/kg、约0.450至约1.100mg/kg、约0.450至约1.000mg/kg、约0.450至约0.900mg/kg、约0.450至约0.800mg/kg、约0.450至约0.700mg/kg、约0.450至约0.600mg/kg、约0.450至约0.500mg/kg、约0.475至约1.825mg/kg、约0.475至约1.800mg/kg、约0.475至约1.700mg/kg、约0.475至约1.600mg/kg、约0.475至约1.500mg/kg、约0.475至约1.400mg/kg、约0.475至约1.400mg/kg、约0.475至约1.200mg/kg、约0.475至约1.100mg/kg、约0.475至约1.000mg/kg、约0.475至约0.900mg/kg、约0.475至约0.800mg/kg、约0.475至约0.700mg/kg、约0.475至约0.600mg/kg、约0.475至约0.500mg/kg、约0.875至约1.825mg/kg、约0.875至约1.800mg/kg、约0.875至约1.700mg/kg、约0.875至约1.600mg/kg、约0.875至约1.500mg/kg、约0.875至约1.400mg/kg、约0.875至约1.400mg/kg、约0.875至约1.200mg/kg、约0.875至约1.100mg/kg、约0.875至约1.000mg/kg、约0.875至约0.900mg/kg、约0.900至约1.825mg/kg、约0.900至约1.800mg/kg、约0.900至约1.700mg/kg、约0.900至约1.600mg/kg、约0.900至约1.500mg/kg、约0.900至约1.400mg/kg、约0.900至约1.400mg/kg、约0.900至约1.200mg/kg、约0.900至约1.100mg/kg、约0.900至约1.000mg/kg、约0.925至约1.825mg/kg、约0.925至约1.800mg/kg、约0.925至约1.700mg/kg、约0.925至约1.600mg/kg、约0.925至约1.500mg/kg、约0.925至约1.400mg/kg、约0.925至约1.400mg/kg、约0.925至约1.200mg/kg、约0.925至约1.100mg/kg或约0.925至约1.000mg/kg的月剂量向受试者施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂的剂量以约0.200mg/kg至约0.250mg/kg的月剂量；或以约0.425mg/kg至约0.475mg/kg的月剂量；或以约0.875mg/kg至约0.925mg/kg的月剂量；或以约1.775mg/kg至约1.825mg/kg的月剂量向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂以0.225mg/kg的月剂量向受试者施用。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂以0.450mg/kg的月剂量向受试者施用。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂以0.900mg/kg的月剂量向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂以1.800mg/kg的月剂量向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的Serpinc1活性降低约70％至约95％。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的峰值凝血酶水平增加到不具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的峰值凝血酶水平的范围内。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以使受试者中的峰值凝血酶生成水平大致达到通过向受试者施用因子VIII所达到的相同水平。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以达到比受试者中的峰值凝血酶生成水平高约40％的峰值凝血酶生成水平。
在另一个实施方案中，与具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的没有施用双链RNAi剂的受试者的中位数历史按需ABR比较，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者的年出血率(ABR)降低约80％至约95％。
在一个实施方案中，双链RNAi剂与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中，受试者为人。
病症可为出血病症诸如获得性出血病症或遗传性出血病症例如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病。
在一个实施方案中，受试者具有A型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有B型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有C型血友病且为抑制剂受试者。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，经修饰的核苷酸独立地选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯和非天然碱基的核苷酸。
互补性区域可以是至少17个核苷酸的长度或19个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，互补性区域为19-21个核苷酸的长度。在另一个实施方案中，互补性区域为21-23个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，每条链为不多于30个核苷酸的长度。
双链RNAi剂的至少一条链可包含至少1个核苷酸的3’突出端或至少2个核苷酸的3’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5’突出端。在某些实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的5’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的一条链的3’和5’-端都包含至少一个核苷酸的突出端。
在某些实施方案中，配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。配体可为通过一价、二价或三价支化接头附接于RNAi剂的一个或多个GalNAc。配体可与双链RNAi剂的有义链的3’-端、双链RNAi剂的有义链的5’-端、双链RNAi剂的反义链的3’-端或双链RNAi剂的反义链的5’-端缀合。
在一些实施方案中，本发明的双链RNAi剂包含多个例如2、3、4、5或6个GalNAc，其通过多个单价接头各自独立地附接于双链RNAi剂的多个核苷酸。
在某些实施方案中，配体为
在一个实施方案中，RNAi剂如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，X为O。
在一个实施方案中，互补性区域由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)构成。
在一个实施方案中，双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键。
在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约25mg至约100mg的固定剂量的双链RNAi剂，其包含形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸且反义链包含与SEQ ID NO:5的核苷酸序列的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约25mg至约100mg的固定剂量的双链RNAi剂，其中双链RNAi剂包含形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸且反义链包含与SEQ ID NO:5的核苷酸序列的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
在一个实施方案中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在另一个实施方案中，有义链和反义链包含互补性区域，其包含与表2和3的任何一个所列的任何一个序列的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的核苷酸独立地选自2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸基团的核苷酸和与胆固醇衍生物或十二烷酸二癸基酰氨基团连接的末端核苷酸。在进一步的实施方案中，经修饰的核苷酸选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基修饰的核苷酸、2’-C-烯丙基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯和非天然碱基的核苷酸。
在双链RNAi剂的另一个实施方案中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。在另一个实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5’突出端。在某些实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的5’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的一条链的3’和5’-端都包含至少一个核苷酸的突出端。
在另一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约25mg至约100mg的固定剂量的双链RNAi剂，其中双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中反义链包含与编码Serpinc1的mRNA的部分互补的区域，其中每条链为约14至约30个核苷酸的长度，其中双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
有义：5’-Na-YYY-Na-3’
反义：3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-5’ (IIIe)
其中
np’为2个核苷酸突出端且np’中的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接；
每个Na和Na’独立地表示包含经修饰的或未经修饰的或其组合的0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y’Y’Y’各自独立地表示在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个基序且其中所述修饰为2’-O-甲基或2’-氟修饰；
其中有义链和反义链各自独立地包含两个在5’-末端的硫代磷酸酯键；和
其中有义链与至少一个配体缀合，其中配体为通过一价、二价或三价支化接头附接的一个或多个GalNAc衍生物，
由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约25mg至约100mg的固定剂量的双链RNAi剂，其中双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链，其中反义链包含与编码Serpinc1的mRNA的部分互补的区域，其中每条链为约14至约30个核苷酸的长度，其中双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
有义：5’-Na-YYY-Na-3’
反义：3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-5’ (IIIe)
其中
np’为2个核苷酸突出端且np’中的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接；
每个Na和Na’独立地表示包含经修饰的或未经修饰的或其组合的0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y’Y’Y’各自独立地表示在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个基序且其中所述修饰为2’-O-甲基或2’-氟修饰；
其中有义链和反义链各自独立地包含两个在5’-末端的硫代磷酸酯键；和
其中有义链与至少一个配体缀合，其中配体为通过一价、二价或三价支化接头附接的一个或多个GalNAc衍生物，
由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在一个实施方案中，双链RNAi剂以单剂或两剂或更多剂例如以3、4、5或6剂向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂每月一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每2月一次、每季度一次或按需向受试者施用。
双链RNAi剂可例如以约25mg至约100mg、例如约25mg至约95mg、约25mg至约90mg、约25mg至约85mg、约25mg至约80mg、约25mg至约75mg、约25mg至约70mg、约25mg至约65mg、约25mg至约60mg、约25mg至约50mg、约50mg至约100mg、约50mg至约95mg、约50mg至约90mg、约50mg至约85mg、约50mg至约80mg、约30mg至约100mg、约30mg至约90mg、约30mg至约80mg、约40mg至约100mg、约40mg至约90mg、约40mg至约80mg、约60mg至约100mg、约60mg至约90mg、约25mg至约55mg、约25mg至约65mg、约30mg至约95mg、约30mg至约85mg、约30mg至约75mg、约30mg至约65mg、约30mg至约55mg、约40mg至约95mg、约40mg至约85mg、约40mg至约75mg、约40mg至约65mg、约40mg至约55mg或约45mg至约95mg的固定剂量作为例如1、2、3、4、5、6、7、8个月或更久的固定剂量向受试者施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂可按约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg或约100mg的固定剂量向受试者施用。
受试者可为人诸如具有出血病症诸如获得性出血病症或遗传性出血病症例如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病的人。
在一个实施方案中，受试者具有A型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有B型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有C型血友病且为抑制剂受试者。
在一个实施方案中，向受试者施用双链RNAi剂导致血液凝固的增加和/或Serpinc1蛋白积累的减少。
在一个实施方案中，该方法进一步包括测量受试者中的凝血酶水平。
双链RNAi剂可皮下或静脉内施用。
在一个实施方案中，RNAi剂的反义链的基本上所有核苷酸和有义链的基本上所有核苷酸包含选自下组的修饰：2’-O-甲基或2’-氟修饰。在一个实施方案中，RNAi剂的有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，YYY基序在有义链的切割位点或附近出现。
在一个实施方案中，Y’Y’Y’在反义链的从5’-端开始的11、12和13位出现。
双链区域可以是15-30个核苷酸对的长度、17-23个核苷酸对的长度、17-25个核苷酸对的长度、23-27个核苷酸对的长度、19-21个核苷酸对的长度或21-23个核苷酸对的长度。
每条链可具有15-30个核苷酸或19-30个核苷酸。
在一个实施方案中，有义链具有总共21个核苷酸且反义链具有总共23个核苷酸。
在一个实施方案中，配体为
在一个实施方案中，配体附接于有义链的3’-端。
在一个实施方案中，RNAi剂如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，在双链体的反义链的5’-端的1位的碱基对为AU碱基对。
在一个实施方案中，RNAi剂为AD-57213((有义(5’至3’):GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf(SEQ ID NO:13)；反义(5’至3’):usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键))。
在一个实施方案中，该药剂作为药物组合物施用。在一个实施方案中，RNAi剂在无缓冲的溶液(诸如盐水或水)中施用。
在一个实施方案中，siRNA与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约25mg至约100mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，该反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约25mg至约100mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，该反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
双链RNAi剂可按两剂或更多剂向受试者施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂每月一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每2月一次、每季度一次或按需向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂每月一次向受试者施用。在另一个实施方案中，双链RNAi剂每6周一次向受试者施用。在一个实施方案中，双链RNAi剂每2月一次向受试者施用。在另一个实施方案中，双链RNAi剂每季度一次向受试者施用。
双链RNAi剂可例如以约25mg至约100mg、例如约25mg至约95mg、约25mg至约90mg、约25mg至约85mg、约25mg至约80mg、约25mg至约75mg、约25mg至约70mg、约25mg至约65mg、约25mg至约60mg、约25mg至约50mg、约50mg至约100mg、约50mg至约95mg、约50mg至约90mg、约50mg至约85mg、约50mg至约80mg、约30mg至约100mg、约30mg至约90mg、约30mg至约80mg、约40mg至约100mg、约40mg至约90mg、约40mg至约80mg、约60mg至约100mg、约60mg至约90mg、约25mg至约55mg、约25mg至约65mg、约30mg至约95mg、约30mg至约85mg、约30mg至约75mg、约30mg至约65mg、约30mg至约55mg、约40mg至约95mg、约40mg至约85mg、约40mg至约75mg、约40mg至约65mg、约40mg至约55mg或约45mg至约95mg的固定剂量向受试者施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂可按约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg或约100mg的固定剂量施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂可以约25mg的固定剂量；以约50mg的固定剂量；以约80mg的固定剂量；或以约100mg的固定剂量向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的Serpinc1活性降低约70％至约95％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约95％或多于95％。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的峰值凝血酶水平增加到不具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的峰值凝血酶水平的范围内。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以使受试者中的峰值凝血酶生成水平大致达到通过向受试者施用因子VIII所达到的相同水平。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以达到比受试者中的峰值凝血酶生成水平高约40％、45％、50％、55％或约60％的峰值凝血酶生成水平。
在另一个实施方案中，与具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的没有施用双链RNAi剂的受试者的中位数历史按需ABR比较，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者的年出血率(ABR)降低约80％至约95％、约80至约85％、约85至约90％或约90至约95％。
在一个实施方案中，双链RNAi剂与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中，受试者为人。
病症可为出血病症诸如获得性出血病症或遗传性出血病症例如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病。
在一个实施方案中，受试者具有A型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有B型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有C型血友病且为抑制剂受试者。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，经修饰的核苷酸独立地选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯和非天然碱基的核苷酸。
互补性区域可以是至少17个核苷酸的长度或19个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，互补性区域为19-21个核苷酸的长度。在另一个实施方案中，互补性区域为21-23个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，每条链为不多于30个核苷酸的长度。
双链RNAi剂的至少一条链可包含至少1个核苷酸的3’突出端或至少2个核苷酸的3’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5’突出端。在某些实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的5’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的一条链的3’和5’-端都包含至少一个核苷酸的突出端。
在某些实施方案中，配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。配体可为通过一价、二价或三价支化接头附接于RNAi剂的一个或多个GalNAc。配体可与双链RNAi剂的有义链的3’-端、双链RNAi剂的有义链的5’-端、双链RNAi剂的反义链的3’-端或双链RNAi剂的反义链的5’-端缀合。
在一些实施方案中，本发明的双链RNAi剂包含多个例如2、3、4、5或6个GalNAc，其通过多个单价接头各自独立地附接于双链RNAi剂的多个核苷酸。
在某些实施方案中，配体为
在一个实施方案中，RNAi剂如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，X为O。
在一个实施方案中，互补性区域由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)构成。
在一个实施方案中，双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键；且其中有义链如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，该药剂作为药物组合物施用。在一个实施方案中，RNAi剂在无缓冲的溶液(诸如盐水或水)中施用。
在另一个实施方案中，siRNA与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在另一个方面，本发明提供进行本发明的方法的试剂盒。该试剂盒包括本发明的RNAi剂和使用说明书及任选的用于向受试者施用RNAi剂的工具。
在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约50mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，该反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约50mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，该反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约80mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，该反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约80mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，该反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的Serpinc1活性降低约70％至约95％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约95％或多于95％。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的峰值凝血酶水平增加到不具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的峰值凝血酶水平的范围内。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以使受试者中的峰值凝血酶生成水平大致达到通过向受试者施用因子VIII所达到的相同水平。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以达到比受试者中的峰值凝血酶生成水平高约40％、45％、50％、55％或约60％的峰值凝血酶生成水平。
在另一个实施方案中，与具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的没有施用双链RNAi剂的受试者的中位数历史按需ABR比较，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者的年出血率(ABR)降低约80％至约95％、约80至约85％、约85至约90％或约90至约95％。
在一个实施方案中，双链RNAi剂与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中，受试者为人。
病症可为出血病症诸如获得性出血病症或遗传性出血病症例如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病。
在一个实施方案中，受试者具有A型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有B型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有C型血友病且为抑制剂受试者。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者长期施用。
在一个实施方案中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，经修饰的核苷酸独立地选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯和非天然碱基的核苷酸。
互补性区域可以是至少17个核苷酸的长度或19个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，互补性区域为19-21个核苷酸的长度。在另一个实施方案中，互补性区域为21-23个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，每条链为不多于30个核苷酸的长度。
双链RNAi剂的至少一条链可包含至少1个核苷酸的3’突出端或至少2个核苷酸的3’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5’突出端。在某些实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的5’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的一条链的3’和5’-端都包含至少一个核苷酸的突出端。
在某些实施方案中，配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。配体可为通过一价、二价或三价支化接头附接于RNAi剂的一个或多个GalNAc。配体可与双链RNAi剂的有义链的3’-端、双链RNAi剂的有义链的5’-端、双链RNAi剂的反义链的3’-端或双链RNAi剂的反义链的5’-端缀合。
在一些实施方案中，本发明的双链RNAi剂包含多个例如2、3、4、5或6个GalNAc，其通过多个单价接头各自独立地附接于双链RNAi剂的多个核苷酸。
在某些实施方案中，配体为
在一个实施方案中，RNAi剂如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，X为O。
在一个实施方案中，互补性区域由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)构成。
在一个实施方案中，双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键；且其中有义链如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，该药剂作为药物组合物施用。在一个实施方案中，RNAi剂在无缓冲的溶液(诸如盐水或水)中施用。
在另一个实施方案中，siRNA与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在另一个方面，本发明提供进行本发明的方法的试剂盒。该试剂盒包括本发明的RNAi剂和使用说明书及任选的用于向受试者施用RNAi剂的工具。
在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约50mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约50mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约80mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约80mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的Serpinc1活性降低约70％至约95％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约95％或多于95％。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的峰值凝血酶水平增加到不具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的峰值凝血酶水平的范围内。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以使受试者中的峰值凝血酶生成水平大致达到通过向受试者施用因子VIII所达到的相同水平。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以达到比受试者中的峰值凝血酶生成水平高约40％、45％、50％、55％或约60％的峰值凝血酶生成水平。
在另一个实施方案中，与具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的没有施用双链RNAi剂的受试者的中位数历史按需ABR比较，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者的年出血率(ABR)降低约80％至约95％、约80至约85％、约85至约90％或约90至约95％。
在一个实施方案中，双链RNAi剂与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中，受试者为人。
病症可为出血病症诸如获得性出血病症或遗传性出血病症例如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病。
在一个实施方案中，受试者具有A型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有B型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有C型血友病且为抑制剂受试者。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者长期施用。
在一个实施方案中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，经修饰的核苷酸独立地选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯和非天然碱基的核苷酸。
在一个实施方案中，每条链为不多于30个核苷酸的长度。
双链RNAi剂的至少一条链可包含至少1个核苷酸的3’突出端或至少2个核苷酸的3’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5’突出端。在某些实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的5’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的一条链的3’和5’-端都包含至少一个核苷酸的突出端。
在某些实施方案中，配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。配体可为通过一价、二价或三价支化接头附接于RNAi剂的一个或多个GalNAc。配体可与双链RNAi剂的有义链的3’-端、双链RNAi剂的有义链的5’-端、双链RNAi剂的反义链的3’-端或双链RNAi剂的反义链的5’-端缀合。
在一些实施方案中，本发明的双链RNAi剂包含多个例如2、3、4、5或6个GalNAc，其通过多个单价接头各自独立地附接于双链RNAi剂的多个核苷酸。
在某些实施方案中，配体为
在一个实施方案中，RNAi剂如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，X为O。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键；且其中有义链如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在另一个实施方案中，siRNA与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在另一个方面，本发明提供进行本发明的方法的试剂盒。该试剂盒包括本发明的RNAi剂和使用说明书及任选的用于向受试者施用RNAi剂的工具。
在一个方面，本发明提供预防具有血友病(例如A型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)、B型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)或C型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下))的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约50mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ IDNO:15)，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有血友病(例如A型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)、B型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)或C型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下))的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约50mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在一个方面，本发明提供预防具有血友病(例如A型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)、B型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)或C型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下))的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约80mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ IDNO:15)，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有血友病(例如A型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)、B型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)或C型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下))的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约80mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在一个方面，本发明提供预防具有血友病(例如A型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)、B型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)或C型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下))的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约50mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有血友病(例如A型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)、B型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)或C型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下))的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约50mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在一个方面，本发明提供预防具有血友病(例如A型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)、B型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)或C型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下))的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约80mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有血友病(例如A型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)、B型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下)或C型血友病(在有抑制剂或没有抑制剂的情况下))的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约80mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中固定剂量的双链RNAi剂约每月一次向受试者施用，其中双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键且其中有义链与附接于3’-末端的配体缀合，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的Serpinc1活性降低约70％至约95％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约95％或多于95％。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的峰值凝血酶水平增加到不具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的峰值凝血酶水平的范围内。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以使受试者中的峰值凝血酶生成水平大致达到通过向受试者施用因子VIII所达到的相同水平。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以达到比受试者中的峰值凝血酶生成水平高约40％、45％、50％、55％或约60％的峰值凝血酶生成水平。
在另一个实施方案中，与具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的没有施用双链RNAi剂的受试者的中位数历史按需ABR比较，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者的年出血率(ABR)降低约80％至约95％、约80至约85％、约85至约90％或约90至约95％。
在一个实施方案中，双链RNAi剂与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中，受试者为人。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者长期施用。
在某些实施方案中，配体为
在一个实施方案中，RNAi剂如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，X为O。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键；且其中有义链如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在另一个实施方案中，siRNA与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在另一个方面，本发明提供进行本发明的方法的试剂盒。该试剂盒包括本发明的RNAi剂和使用说明书及任选的用于向受试者施用RNAi剂的工具。
在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用约40mg至约90mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用约40mg至约90mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
双链RNAi剂可按两剂或更多剂向受试者施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂每月一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每2月一次、每季度一次或按需向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂每月一次向受试者施用。在另一个实施方案中，双链RNAi剂每6周一次向受试者施用。在一个实施方案中，双链RNAi剂每2月一次向受试者施用。在另一个实施方案中，双链RNAi剂每季度一次向受试者施用。
双链RNAi剂可例如以约50mg至约90mg、约50mg至约85mg、约50mg至约80mg、约40mg至约80mg、约60mg至约90mg、约25mg至约55mg、约25mg至约65mg、约40mg至约85mg、约40mg至约75mg、约40mg至约65mg或约40mg至约55mg的固定剂量向受试者施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂可以约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg或约90mg的固定剂量施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂以约40mg的固定剂量；或以约50mg的固定剂量；或以约80mg的固定剂量；或以约90mg的固定剂量向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的Serpinc1活性降低约70％至约95％。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的峰值凝血酶水平增加到不具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的峰值凝血酶水平的范围内。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以使受试者中的峰值凝血酶生成水平大致达到通过向受试者施用因子VIII所达到的相同水平。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以达到比受试者中的峰值凝血酶生成水平高约40％的峰值凝血酶生成水平。
在另一个实施方案中，与具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的没有施用双链RNAi剂的受试者的中位数历史按需ABR比较，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者的年出血率(ABR)降低约80％至约95％。
在一个实施方案中，双链RNAi剂与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中，受试者为人。
病症可为出血病症诸如获得性出血病症或遗传性出血病症例如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病。
在一个实施方案中，受试者具有A型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有B型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有C型血友病且为抑制剂受试者。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，经修饰的核苷酸独立地选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯和非天然碱基的核苷酸。
互补性区域可以是至少17个核苷酸的长度或19个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，互补性区域为19-21个核苷酸的长度。在另一个实施方案中，互补性区域为21-23个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，每条链为不多于30个核苷酸的长度。
双链RNAi剂的至少一条链可包含至少1个核苷酸的3’突出端或至少2个核苷酸的3’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5’突出端。在某些实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的5’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的一条链的3’和5’-端都包含至少一个核苷酸的突出端。
在某些实施方案中，配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。配体可为通过一价、二价或三价支化接头附接于RNAi剂的一个或多个GalNAc。配体可与双链RNAi剂的有义链的3’-端、双链RNAi剂的有义链的5’-端、双链RNAi剂的反义链的3’-端或双链RNAi剂的反义链的5’-端缀合。
在一些实施方案中，本发明的双链RNAi剂包含多个例如2、3、4、5或6个GalNAc，其通过多个单价接头各自独立地附接于双链RNAi剂的多个核苷酸。
在某些实施方案中，配体为
在一个实施方案中，RNAi剂如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，X为O。
在一个实施方案中，互补性区域由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)构成。
在一个实施方案中，双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键；且其中有义链如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，该药剂作为药物组合物施用。在一个实施方案中，RNAi剂在无缓冲的溶液(诸如盐水或水)中施用。
在另一个实施方案中，siRNA与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在另一个方面，本发明提供进行本发明的方法的试剂盒。该试剂盒包括本发明的RNAi剂和使用说明书及任选的用于向受试者施用RNAi剂的工具。
在一个方面，本发明提供抑制受试者中的Serpinc1表达的方法。该方法包括向受试者施用约40mg至约90mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
在另一个方面，本发明提供抑制受试者中的Serpinc1表达的方法。该方法包括向受试者施用约40mg至约90mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中双链RNAi剂包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中双链RNAi剂包含配体，例如双链RNAi剂的有义链与附接在有义链的3’-末端的配体缀合。
双链RNAi剂可按两剂或更多剂向受试者施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂每月一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每2月一次、每季度一次或按需向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂每月一次向受试者施用。在另一个实施方案中，双链RNAi剂每6周一次向受试者施用。在一个实施方案中，双链RNAi剂每2月一次向受试者施用。在另一个实施方案中，双链RNAi剂每季度一次向受试者施用。
双链RNAi剂可例如以约50mg至约90mg、约50mg至约85mg、约50mg至约80mg、约40mg至约80mg、约60mg至约90mg、约25mg至约55mg、约25mg至约65mg、约40mg至约85mg、约40mg至约75mg、约40mg至约65mg或约40mg至约55mg的固定剂量向受试者施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂可以约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg或约90mg的固定剂量施用。
在一些实施方案中，双链RNAi剂以约40mg的固定剂量；或以约50mg的固定剂量；或以约80mg的固定剂量；或以约90mg的固定剂量向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的Serpinc1活性降低约70％至约95％。
在一个实施方案中，受试者为人。
在一个实施方案中，受试者具有会受益于Serpinc1表达减少的病症。病症可为出血病症诸如获得性出血病症或遗传性出血病症例如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病。
在一个实施方案中，受试者具有A型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有B型血友病且为抑制剂受试者。在另一个实施方案中，受试者具有C型血友病且为抑制剂受试者。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者中的峰值凝血酶水平增加到不具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的峰值凝血酶水平的范围内。
在一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以使受试者中的峰值凝血酶生成水平大致达到通过向受试者施用因子VIII所达到的相同水平。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用足以达到比受试者中的峰值凝血酶生成水平高约40％的峰值凝血酶生成水平。
在另一个实施方案中，与具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的没有施用双链RNAi剂的受试者的中位数历史按需ABR比较，双链RNAi剂的剂量向受试者的施用使受试者的年出血率(ABR)降低约80％至约95％。
在一个实施方案中，双链RNAi剂与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个实施方案中，双链RNAi剂向受试者皮下施用。
在一个实施方案中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，经修饰的核苷酸独立地选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯和非天然碱基的核苷酸。
互补性区域可以是至少17个核苷酸的长度或19个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，互补性区域为19-21个核苷酸的长度。在另一个实施方案中，互补性区域为21-23个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，每条链为不多于30个核苷酸的长度。
双链RNAi剂的至少一条链可包含至少1个核苷酸的3’突出端或至少2个核苷酸的3’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5’突出端。在某些实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的5’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi剂的一条链的3’和5’-端都包含至少一个核苷酸的突出端。
在某些实施方案中，配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。配体可为通过一价、二价或三价支化接头附接于RNAi剂的一个或多个GalNAc。配体可与双链RNAi剂的有义链的3’-端、双链RNAi剂的有义链的5’-端、双链RNAi剂的反义链的3’-端或双链RNAi剂的反义链的5’-端缀合。
在一些实施方案中，本发明的双链RNAi剂包含多个例如2、3、4、5或6个GalNAc，其通过多个单价接头各自独立地附接于双链RNAi剂的多个核苷酸。
在某些实施方案中，配体为
在一个实施方案中，RNAi剂如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，X为O。
在一个实施方案中，互补性区域由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)构成。
在一个实施方案中，双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ IDNO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键；且其中有义链如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
在一个实施方案中，该药剂作为药物组合物施用。在一个实施方案中，RNAi剂在无缓冲的溶液(诸如盐水或水)中施用。
在另一个实施方案中，siRNA与缓冲溶液(诸如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合的缓冲溶液)一起施用。在一个实施方案中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在另一个方面，本发明提供进行本发明的方法的试剂盒。该试剂盒包括本发明的RNAi剂和使用说明书及任选的用于向受试者施用RNAi剂的工具。
附图说明
图1A是描绘单一皮下0.03mg/kg剂量的AD-57213对一个健康人类受试者中的血浆凝血酶生成水平的作用的图。
图1B是描绘单一皮下0.03mg/kg剂量的AD-57213对一个健康人类受试者中的血浆凝血酶生成水平的作用的图。
图1C是描绘单一皮下0.03mg/kg剂量的AD-57213对一个健康人类受试者中的血浆凝血酶生成水平的作用的图。
图1D是描绘单一皮下0.03mg/kg剂量的AD-57213对一个健康人类受试者中的血浆凝血酶生成水平的作用的图。
图2A是描绘单一皮下0.03mg/kg剂量的AD-57213对一个健康人类受试者中的血浆AT(Serpinc1)蛋白水平的作用的图。
图2B是描绘单一皮下0.03mg/kg剂量的AD-57213对一个健康人类受试者中的血浆AT(Serpinc1)蛋白水平的作用的图。
图3是描绘在施用单一皮下0.03mg/kg剂量的AD-57213的健康受试者中敲减AT(Serpinc1)的百分比与峰值凝血酶生成增加的百分比之间的关联的图。
图4是描绘多个0.015mg/kg、0.045mg/kg或0.075mg/kg剂量的AD-57213对具有A或B型血友病的人类受试者中的血浆AT(Serpinc1)蛋白水平的作用的图。
图5A是描绘多个0.225mg/kg、0.450mg/kg、0.900mg/kg、1.800mg/kg或80mg剂量的AD-57213对具有A或B型血友病的人类受试者中的血浆AT(Serpinc1)蛋白水平的作用的图。
图5B是描绘AD-57213对人类受试者中的血浆AT(Serpinc1)蛋白水平的剂量依赖性作用的图。
图6A是描绘多个0.015mg/kg或0.045mg/kg剂量的AD-57213对具有A或B型血友病的人类受试者中的峰值凝血酶水平的作用的图。
图6B是描绘多个0.015mg/kg或0.045mg/kg剂量的AD-57213对具有A或B型血友病的人类受试者中的凝血酶生成的作用相对于组基线的百分比变化的图。
图7是描绘多个0.045mg/kg剂量的AD-57213对一个具有A型血友病的人类受试者(受试者101-009)中的凝块形成时间和凝血时间的作用的图。
图8是描绘通过月相等剂量降低平均最大AT的图。
图9是描绘多个剂量的AD-57213通过AT降低四分位数对凝血酶生成的作用的图。
图10A是描绘用如在施用225mcg/kg qm的AD-57213的受试者中所确定的因子VIII获得的相对AT活性相对于百分比峰值凝血酶生成的图。
图10B是描绘用如在施用1800mcg/kg qm的AD-57213的受试者中所确定的因子VIII获得的相对AT活性相对于百分比峰值凝血酶生成的图。
图10C是描绘用如在施用80mg qm的AD-57213的受试者中所确定的因子VIII获得的相对AT活性相对于百分比峰值凝血酶生成的图。
图11是描绘多个剂量的AD-57213通过AT降低四分位数对出血事件的作用。
图12是显示在AD-57213的I期临床试验的C部分登记的受试者的出血事件数据的表。
图13A是显示AD-57213的I期临床试验的C部分中的所有给药组的在研究开始前、在研究的开始部分和在研究的观察部分期间的中位数年出血率(ABR)的图。
图13B是显示AD-57213的I期临床试验的C部分中的每月80mg(80mg qm×3)组的在研究开始前、在研究的开始部分和在研究的观察部分期间的中位数年出血率(ABR)的图。
图14A是描绘用如在施用固定每月50mg剂量的AD-57213的抑制剂受试者中所确定的因子VIII获得的相对AT活性相对于百分比峰值凝血酶生成的图。
图14B是描绘用如在施用固定每月50mg剂量的AD-57213的抑制剂受试者中所确定的因子VIII获得的相对AT活性相对于百分比峰值凝血酶生成的图。
图14C是描绘用如在施用固定每月50mg剂量的AD-57213的抑制剂受试者中所确定的因子VIII获得的相对AT活性相对于百分比峰值凝血酶生成的图。
图14D是描绘用如在施用固定每月50mg剂量的AD-57213的抑制剂受试者中所确定的因子VIII获得的相对AT活性相对于百分比峰值凝血酶生成的图。
图14E是描绘用如在施用固定每月50mg剂量的AD-57213的抑制剂受试者中所确定的因子VIII获得的相对AT活性相对于百分比峰值凝血酶生成的图。
图14F是描绘用如在施用固定每月50mg剂量的AD-57213的抑制剂受试者中所确定的因子VIII获得的相对AT活性相对于百分比峰值凝血酶生成的图。
图15是描绘多个50mg或80mg剂量的AD-57213对使用抑制剂的具有A或B型血友病的人类受试者中的相对于基线的平均AT(Serpinc1)活性的作用的图。
图16是描绘多个50mg剂量的AD-57213的AT降低作用与具有A型血友病的受试者中的增加的凝血酶生成有关的图。
图17A是显示在AD-57213的I期临床试验的D部分登记的受试者的出血事件数据的表。
图17B是显示AD-57213的I期临床试验的D部分中的所有受试者的在研究开始前、在研究的开始部分和在研究的观察部分期间的中位数年出血率(ABR)的图。
图18是描绘多个80mg剂量的AD-57213对在AD-57213的II期开放标签扩展(OLE)研究中不使用抑制剂的具有血友病的人类受试者中的相对于基线的平均AT(Serpinc1)活性的作用的图。
图19A是描绘多个50mg或80mg剂量的AD-57213对在AD-57213的II期开放标签扩展(OLE)研究中不使用抑制剂的具有A或B型血友病的人类受试者中的相对于基线的平均AT(Serpinc1)活性的作用的图。
图19B是描绘多个50mg或80mg剂量的AD-57213对在AD-57213的II期开放标签扩展(OLE)研究中不使用抑制剂的具有A或B型血友病的人类受试者中的峰值凝血酶生成的作用的图。该图的阴影部分表示在实施例1中描述的AD-57213的I期试验中的施用AD-57213并具有小于25％AT敲减的健康人类志愿者(HV)中观察到的峰值凝血酶水平的范围。通过HV范围的短划线表示健康人类志愿者(HV)中观察到的中位数峰值凝血酶水平且在实施例1中描述的AD-57213的I期试验中的施用AD-57213的AT敲减小于25％。
图20A是显示在AD-57213的II期OLE临床试验中登记的受试者的出血事件数据的表。
图20B是显示AD-57213的II期OLE临床试验中的所有受试者的在研究开始前、在研究的开始部分和在研究的观察部分期间的中位数年出血率(ABR)的图。
具体实施方式
本发明至少部分基于令人惊奇地发现了极低剂量(例如比本领域中教导的剂量低至少约30倍的剂量)的GalNAc连接的包含特定化学修饰的双链RNAi剂对抑制Serpinc1的表达显示出特别效力及特别持久的抑制Serpinc1表达。具体地，低剂量的包含GalNAc配体的RNAi剂(其中基本上所有的核苷酸都是经修饰的)诸如包含在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个或多个基序(包括在药剂的切割位点或附近的一个这样的基序)、六个硫代磷酸酯键和GalNAc配体的RNAi剂在本文中显示为在沉默Serpinc1基因的活性方面的特别有效和持久。
因此，本发明提供使用iRNA组合物(其影响RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的Serpinc1基因的RNA转录物的切割)预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症(例如Serpinc1相关疾病诸如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病)的受试者中的至少一个症状(例如出血)的方法。本发明进一步提供使用iRNA组合物(其影响RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的Serpinc1基因的RNA转录物的切割)治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症(例如出血病症诸如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病)的受试者的方法。
用于本发明的方法的iRNA剂通常包含具有约30个核苷酸或更少的长度例如15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸的长度的区域的RNA链(反义链)，该区域与Serpinc1基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。
在其他实施方案中，本发明的双链RNAi剂的一条或两条链为多达66个核苷酸的长度例如36-66、26-36、25-36、31-60、22-43、27-53个核苷酸的长度，其中至少19个邻接核苷酸的区域与Serpinc1基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。在一些实施方案中，有义链和反义链形成18-30个邻接核苷酸的双链体。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的iRNA剂包含RNA链(反义链)，其可以是高达66个核苷酸的长度例如36-66、26-36、25-36、31-60、22-43、27-53个核苷酸的长度，其中至少19个邻接核苷酸的区域与Serpinc1基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。在一些实施方案中，这样的具有较长反义链的iRNA剂可包含20-60个核苷酸长度的第二RNA链(有义链)，其中有义链和反义链形成18-30个邻接核苷酸的双链体。
以下详细的描述公开了如何制备并使用含有iRNA的组合物来抑制Serpinc1基因的表达及用于治疗具有会受益于抑制和/或减少该基因表达的疾病或病症的受试者的组合物、用途和方法。
I.定义
为了更轻而易举地理解本发明，首先定义某些术语。另外，应该注意的是，每当列举参数的值或值的范围时，意图是列举的值的中间的值和范围也意图成为本发明的一部分。
本文所使用的冠词“一”和“一个”指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法上的对象。例如，“元件”意指一个元件或多于一个元件例如多个元件。
本文所使用的术语“包括”意指词组“包括但不限于”并与其互换使用。
如本文所使用的术语“或”意指术语“和/或”并与其互换使用，除非上下文另有明确说明。
如本文所使用的“Serpinc1”指在细胞中表达的特定多肽。Serpinc1还称为serpin肽酶抑制剂，clade C(抗凝血酶；AT)，成员1；抗凝血酶III；AT3；抗凝血酶；和肝素辅因子1。人Serpinc1 mRNA转录的序列可在例如GenBank登录号GI:254588059(NM_000488；SEQ IDNO:1)中找到。恒河猴Serpinc1 mRNA的序列可在例如GenBank登录号GI:157167169(NM_001104583；SEQ ID NO:2)中找到。小鼠Serpinc1 mRNA的序列可在例如GenBank登录号GI:237874216(NM_080844；SEQ ID NO:3)中找到。大鼠Serpinc1 mRNA的序列可在例如GenBank登录号GI:58865629(NM_001012027；SEQ ID NO:4)中找到。
如本文所使用的术语“Serpinc1”还指在细胞中由天然存在的Serpinc1基因的DNA序列变异(诸如Serpinc1基因中的单核苷酸多态性)表达的特定多肽。Serpinc1基因中的许多SNP已经被鉴定且可在例如NCBI dbSNP(参见例如www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)中找到。Serpinc1基因中的SNP的非限制性实例可在NCBI dbSNP登录号rs677；rs5877；rs5878；rs5879；rs941988；rs941989；rs1799876；rs19637711；rs2008946和rs2227586中找到。
如本文所使用的“受试者”为动物，诸如哺乳动物，包括灵长目动物(诸如人)，非人灵长目动物，例如猴子和黑猩猩)，非灵长类动物(诸如牛、猪、骆驼、羊驼、马、山羊、兔子、绵阳、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、马和鲸)或禽(例如鸭子或鹅)。在一个实施方案中，受试者为人，诸如会受益于Serpinc1表达减少的接受疾病、病症或病况治疗或评估的人；会受益于Serpinc1表达减少的处于疾病、病症或病况风险的人；会受益于Serpinc1表达减少的具有疾病、病症或病况的人；和/或会受益于Serpinc1表达减少的接受疾病、病症或病况治疗的人，如本文所述。
如本文所使用的术语“治疗”指有利的或希望的结果，包括但不限于缓解或改善一个或多个症状，减少出血的程度，出血的稳定(即不恶化的)状态，出血的改善和减轻，无论可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意指与没有治疗时的预期的存活比延长存活。在本发明的方法中，治疗包括出血发作的按需治疗和控制、出血的围手术期管理和常规预防以减少出血发作的频率。
在受试者或疾病标记或症状中的Serpinc1水平的上下文中的术语“降低”指该水平的统计学显著降低。降低可以是例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多且优选地低至在没有这样的病症的个体的正常范围内接受的水平。
如本文所使用的“预防”，当用于指疾病、病症或其病况时，其会受益于Sertpinc1基因的表达减少，指受试者会患与这样的疾病、病症或病况(例如症状，诸如出血)有关的症状的可能性的降低。例如当具有出血的一个或多个风险因素的个体相对于具有相同危险因素且没有接受如本文所述的治疗的人群，未患出血或患严重程度较低的出血时，患出血的可能性减小。未患疾病、病症或病况或减小患有与这样的疾病、病症或病况有关的症状(例如为在疾病或病症的临床上可接受的量表上的至少约10％)或延迟症状的显示延迟(例如几天、几周、几个月或几年)被认为是有效的预防。
如本文所使用的术语“出血病症”是一种疾病或病症，其导致不良凝血和/或过度出血。出血病症可以是遗传性的病症，诸如血友病或冯威里氏病或获得性病症，其与例如弥散性血管内凝集、妊娠有关的子痫、维生素K缺乏、自身免疫病症、炎性肠病、溃疡性结肠炎、皮肤病学病症(例如银屑病、天疱疮)、呼吸系统疾病(例如哮喘，慢性阻塞性肺病)、过敏药物反应(例如药物诸如阿司匹林、肝素和华法林的结果)、糖尿病、急性乙型肝炎感染、急性丙型肝炎感染、恶性肿瘤或实体瘤(如前列腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、黑素瘤、肾癌和/或血液恶性肿瘤)有关。在一个实施方案中，具有遗传性出血病症(例如血友病)的受试者已经形成了替代凝血治疗的抑制剂(例如同种抗体抑制剂)且在本文中被称为“抑制剂受试者”。在一个实施方案中，抑制剂受试者具有A型血友病。在另一个实施方案中，抑制剂受试者具有B型血友病。在另一个实施方案中，抑制剂受试者具有C型血友病。
如本文所使用的“治疗有效量”意欲包括当向具有出血病症并出血的受试者施用时，足以有效治疗该疾病(例如通过减少、改善或保持现有疾病或疾病的一个或多个症状)的RNAi剂的量。“治疗有效量”可根据RNAi剂，如何施用该药剂，疾病和其严重程度及待治疗的受试者的历史、年龄、体重、家族病史、基因构成、先前或同时治疗的类型(如果有的话)和其他个体特征而改变。
如本文所使用的“预防有效量”意图包括当向具有出血病症但没有出血(例如具有出血病症并安排外科手术，例如围手术期治疗)的受试者施用时，足以预防或改善疾病或疾病的一个或多个症状的iRNA的量。改善疾病包括显示病程或减小晚发性疾病的严重程度。“预防有效量”可根据iRNA，如何施用该剂，疾病的风险的程度和待治疗的患者的历史、年龄、体重、家族病史、基因构成、先前或同时治疗的类型(如果有的话)和其他个体特征而改变。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括RNAi剂的量，其以适用于任何治疗的合理利益/风险比例产生希望的局部或系统效果。用于本发明的方法的iRNA可足够量施用以产生适合于这样的治疗的合理利益/风险比例。
短语“药用”用于本文指适合于与人受试者和动物受试者的组织接触使用而没有过量毒性、刺激、过敏反应或与合理利益/风险比相当的其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所使用的短语“药用载体”指药用材料、组合物或运载体，诸如液体或固体填充物、稀释剂、赋形剂、制造附注五(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂封包材料，涉及将本申请化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的一部分。从与制剂的其他成分的相容性的意义上说每个载体必须是“可接受的”且对接受治疗的受试者没有伤害。可用作药用载体的材料的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)黄蓍胶粉末；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，诸如镁态、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酐；(22)增量剂，诸如多肽和氨基酸(23)血清组分，诸如血清白蛋白、HDL和LDL；和(22)药物制剂中采用的其他无毒相容物质。
如本文所使用的“靶序列”指在Serpinc1基因的转录期间形成的mRNA分子的邻接部分的核苷酸序列，包括mRNA，即初级转录产物的RNA加工的产物。在一个实施方案中，序列的靶部分至少会足够长以在Serpinc1基因的转录期间形成的mRNA分子的部分的核苷酸序列处或附近用作iRNA指导的切割的底物。
靶序列可以是约9-36个核苷酸的长度，例如约15-30个核苷酸的长度。例如，靶序列可以是15-30个核苷酸、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸的长度。在上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。
如本文所使用的术语“包含序列的链”指包含核苷酸的链的寡核苷酸，其通过使用标准核苷酸命名提及的序列描述。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”每个通常表示核苷酸，其分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基。然而，应该理解的是术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可指经修饰的核苷酸，如以下进一步详述的或代替的替代基序(参见例如表1)。技术人员很好地意识到鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可以通过其他基序代替而基本上不改变包含具有这样的替代基序的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如，在没有限制的情况下，包含次黄嘌呤作为其碱基的核苷酸可与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可在本发明表征的dsRNA的核苷酸序列中通过含有例如次黄嘌呤的核苷酸替代。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别用鸟嘌呤和尿嘧啶替代以形成与靶mRNA碱基配对的G-U摆动碱基。含有这样的替代继续的序列适合于在本发明中表征的组合物和方法。
如在本文中互换使用的术语“iRNA”、“RNAi剂”、“iRNA剂”、“RNA干扰剂”指含有如本文所定义的RNA的剂且其经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径介导了RNA转录物的切割。iRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。iRNA调节(例如抑制)细胞(例如受试者(诸如哺乳动物受试者)中的细胞)中的Serpinc1的表达。
在一个实施方案中，本发明的RNAi剂包括与靶RNA序列(例如Serpinc1靶mRNA序列)相互作用的单链RNA以指导靶RNA的切割。在不希望受理论束缚的情况下，据信引入到细胞中的长双链RNA通过称为Dicer的III型内切核酸酶分解成siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15:485)。Dicer，一种核糖核酸酶III样酶，将dsRNA加工成具有特有的2个碱基3’突出端的19-23个碱基对短干扰RNA(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。然后将siRNA合并到RNA诱导的沉默复合物中，其中一个或多个螺旋酶解开siRNA双链体，这使互补反义链能够指导靶识别(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107:309)。当与适当靶mRNA结合时，RISC中的一个或多个内切核酸酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir,et al.,(2001)GenesDev.15:188)。因此，在一个方面，本发明涉及细胞中生成的单链RNA(siRNA)且其促进RISC复合物的形成以引起靶基因(例如Serpinc1基因)的沉默。因此，本文中也使用术语“siRNA”指RNAi，如上所述。
在另一个实施方案中，RNAi剂可以是单链siRNA，其被引入到细胞或生物体中以抑制靶mRNA。单链RNAi剂结合RISC内切核酸酶Argonaute 2，然后裂解靶mRNA。单链siRNA通常是15-30个核苷酸并是化学修饰的。在美国专利号8,101,348和Lima et al.,(2012)Cell150:883-894中描述了单链siRNA的设计和测试，其每一个的全部内容通过引用并入本文。本文所述的任何反义核苷酸序列可以用作如本文所述的单链siRNA或通过Lima et al.,(2012)Cell 150:883-894中所述的方法进行化学修饰。
在另一个实施方案中，用于本发明的组合物、用途和方法中的“iRNA”是双链RNA且在本文中称为“双链RNAi剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，其具有包含两条反平行且基本上互补的核酸链的双链体结构，相对于靶RNA(即Serpinc1基因)被称为具有“有义”和“反义”方向。在本发明的一些实施方案中，双链RNA(dsRNA)通过本文称为RNA干扰或RNAi的转录后基因沉默机制触发靶RNA(例如mRNA)的降解。
一般地，dsRNA分子的每条链的大部分核苷酸是核糖核苷酸，但是如本文详细描述的，每条或两条链还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。另外，如本说明书中所使用的，“RNAi剂”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi剂可以包括在多个核苷酸处的实质性修饰。
如本文所使用的术语“经修饰的核苷酸”指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷酸间键和/或经修饰的核碱基的核苷酸。因此，术语经修饰的核苷酸涵盖取代、添加或去除例如官能团或原子与核苷间键、糖部分或核碱基。适用于本发明的药剂的修饰包括本文公开的或本领域已知的所有类型的修饰。为了本说明书和权利要求书的目的，如在siRNA型分子中使用的任何这样的修饰均被“RNAi剂”所涵盖。
双链体区域可以是允许通过RISC途径特异性降解希望的靶RNA的任何长度且范围可以是约9至36个碱基对的长度，例如约15至30个碱基对的长度，例如约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对的长度，诸如约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对的长度。在上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。
形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分或者它们可以是单独的RNA分子。当两条链是一个较大分子的一部分并因此通过形成双链体结构的一条链的3’-端和相应另一条链的5’-端之间的不间断核苷酸链连接时，连接RNA链被称为“发夹环”。发夹环可以包含至少一个未配对的核苷酸。在一些实施方案中，发夹环可以包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对的核苷酸。
在dsRNA的两条基本互补的链由单独的RNA分子包含的情况下，那些分子不需要，但可以共价连接。在两条链通过除形成双链体结构的一条链的3’-端和相应另一条链的5’-端之间的不间断核苷酸链以外的手段共价连接时，连接结构被称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA的最短链中的核苷酸数量减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构之外，RNAi可以包含一个或多个核苷酸突出端。
在一个实施方案中，本发明的RNAi剂是具有24-30个核苷酸的dsRNA，其与靶RNA序列(例如Serpinc1靶mRNA序列)相互作用以指导靶RNA的切割。在不希望被理论束缚的情况下，被称为Dicer的III型内切核酸酶将引入细胞中的长双链RNA分解成siRNA(Sharp etal.(2001)Genes Dev.15:485)。Dicer，一种核糖核酸酶III样酶，将dsRNA加工成具有有两个碱基3’突出端特征的19-23个碱基对短干扰RNA(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。然后将siRNA合并到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一个或多个解旋酶解开siRNA双链体，使互补的反义链能够指导靶识别(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107:309)。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一个或多个内切核酸酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188)。
如本文所使用的术语“核苷酸突出端”指从iRNA的双链体结构(例如dsRNA)突出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3’-端延伸超过另一条链的5’-端时或反之亦然，有核苷酸突出端。dsRNA可以包含至少一个核苷酸的突出端；或突出端可包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包含核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由核苷酸/核苷类似物组成。突出端可以位于有义链、反义链或它们的任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5’-端、3’-端或两端。
在一个实施方案中，dsRNA的反义链在3’-端和/或5’-端具有1-10个核苷酸例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸突出端。在一个实施方案中，dsRNA的有义链在3’-端和/或5’-端具有1-10个核苷酸例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸突出端。在另一个实施方案中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
在某些实施方案中，有义链或反义链或两者上的突出端可包括长于10个核苷酸例如10-30个核苷酸、10-25个核苷酸、10-20个核苷酸或10-15个核苷酸长度的延伸长度。在某些实施方案中，延伸突出端位于双链体的有义链上。在某些实施方案中，延伸突出端存在于双链体的有义链的3’-端。在某些实施方案中，延伸突出端存在于双链体的有义链的5’-端。在某些实施方案中，延伸突出端位于双链体的反义链上。在某些实施方案中，延伸突出端存在于双链体的反义链的3’-端。在某些实施方案中，延伸突出端存在于双链体的反义链的5’-端。在某些实施方案中，延伸突出端中的一个或多个核苷酸用核苷硫代磷酸酯替代。
“平端”意指在双链RNAi剂的末端没有未配对的核苷酸即没有核苷酸突出端。“平端”RNAi剂是在其整个长度上是双链的dsRNA，即在分子的任一末端没有核苷酸突出端。本发明的RNAi剂包括在一端具有核苷酸突出端的RNAi剂(即具有一个突出端和一个平端的药剂)或在两端具有核苷酸突出端。
术语“反义链”或“引导链”是指iRNA(例如dsRNA)的链，其包括与靶序列基本互补的区域，例如Serpinc1 mRNA。如本文所使用的术语“互补性区域”指与序列(例如靶序列，例如Serpinc1核苷酸序列，如本文所定义的)基本互补的反义链上的区域。在互补性区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可以在分子的内部或末端区域中。一般地，最能容忍的错配位置在例如iRNA的5’和/或3’-末端的5、4、3或2个核苷酸内的末端区域。
如本文所用的术语“有义链”或“过客链”是指包括与该术语在本文中定义的反义链的区域基本上互补的区域的iRNA链。
如本文所使用的术语“切割区域”指位于紧邻切割位点的区域。切割位点是切割发生的靶标上的位点。在一些实施方案中，切割区域在切割位点的任一端上且紧邻切割位点包含三个碱基。在一些实施方案中，切割区域在切割位点的任一末端且紧邻切割位点包含两个碱基。在一些实施方案中，切割位点特异性地存在于反义链的核苷酸10和11结合的位点处且切割区域包含核苷酸11、12和13。
如本文所使用的且除非另有说明，术语“互补”在用于描述关于第二核苷酸序列的第一核苷酸序列时，指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并在一定条件下用包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸形成双链体结构的能力，如本领域技术人员会理解的。这样的条件可以是例如严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl,40mMPIPES pH 6.4,1mM EDTA,50℃或70℃持续12-16小时，然后洗涤(参见例如“MolecularCloning:A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press)。其他条件，诸如生物体内可能遇到的生理相关条件，可以适用。根据杂交核苷酸的最终应用，技术人员将能够确定最适合于两个序列的互补性测试的一组条件。
iRNA内(例如本文所述的dsRNA内)的互补序列包括在一个或两个核苷酸序列的全长之内使包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸碱基配对。这样的序列在本文可以相对于彼此被称为“完全互补”。然而，在第一序列相对于本文第二序列被称为“基本上互补”的情况下，这两个序列可以完全互补或者它们可以形成一个或多个(但在杂交高达30个碱基对的双链体时，通常不多于5、4、3或2个)错配碱基对，同时在与其最终应用(例如经由RISC途径抑制基因表达)最相关的条件下保留杂交的能力。然而，当两个寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出端时，这样的突出端不应被认为是关于确定互补性的错配。例如，包含一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和长度为23个核苷酸的另一个寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，但为了本文描述的目的，还可称为“完全互补”。
如本文所使用的“互补”序列还可包括由非天然和经修饰的核苷酸形成的非沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对和/或碱基对或完全由其形成，只要满足上述有关其杂交能力的要求。这样的非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摆动或Hoogstein碱基配对。
本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可用于dsRNA的有义链和反义链之间或iRNA剂的反义链和靶序列之间的碱基匹配，如从其用途的上下文中将理解的那样。
如本文所使用的“与信使RNA(mRNA)的至少一部分基本上互补的”多核苷酸指与感兴趣的mRNA(例如编码Serpinc1的mRNA)的邻接部分基本互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码Serpinc1的mRNA的非中断部分基本上互补，则多核苷酸与Serpinc1 mRNA的至少一部分互补。
因此，在一些实施方案中，本文公开的反义链多核苷酸与靶Serpinc1序列完全互补。在其他实施方案中，本文公开的反义链多核苷酸与靶Serpinc1序列基本上互补且包含邻接核苷酸序列，在其整个长度之内与SEQ ID NO:1的核苷酸序列或SEQ ID NO:1的片段的等同区至少约80％互补或诸如约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约90％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
在一个实施方案中，本发明的RNAi剂包括与反义多核苷酸基本上互补的有义链，继而与靶Serpinc1序列互补且其中有义链多核苷酸包含在其整个长度之内与SEQ ID NO:5的核苷酸序列的等同区域或SEQ ID NO:5的任一个的片段至少约80％互补，诸如约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补的邻接核苷酸序列。
在本发明的一个方面，用于本发明的方法和组合物的药剂是经由反义抑制机制抑制靶mRNA的单链反义RNA分子。单链反义RNA分子与靶mRNA内的序列互补。单链反义寡核苷酸可以通过与mRNA的碱基配对以化学计量方式抑制翻译且物理地阻碍翻译运转部分，参见Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1:347-355。单链反义RNA分子可以是约15至约30个核苷酸的长度且具有与靶序列互补的序列。例如，单链反义RNA分子可以包含来自本文所述的任何一种反义序列的至少约15、16、17、18、19、20或更多个邻接核苷酸的序列。
如本文所使用的术语“抑制”与“减少”、“沉默”、“下调”、“压制”和其他类似术语可互换使用且包括任何水平的抑制。
如本文所使用的短语“抑制Serpinc1的表达”包括抑制任何Serpinc1基因(诸如例如小鼠Serpinc1基因、大鼠Serpinc1基因、猴Serpinc1基因或人Serpinc1基因)的表达及编码Serpinc1蛋白的Serpinc1基因的变体或突变体。
“抑制Serpinc1基因的表达”包括Serpinc1基因的任何水平的抑制，例如至少部分抑制Serpinc1基因的表达，诸如抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
Serpinc1基因的表达可基于与Serpinc1基因表达(例如Serpinc1 mRNA水平、Serpinc1蛋白水平或例如凝血酶:抗凝血酶复合物水平)有关的任何变量的水平作为凝血酶生成趋势、出血时间、凝血酶原时间(PT)、血小板计数和/或活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的量度来评估。可以通过与对照水平相比这些变量中的一个或多个的绝对或相对水平的降低来评估抑制。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或由类似受试者、细胞或未经处理的或用对照处理的样品确定的水平(诸如例如缓冲液仅对照或无活性剂对照)。
在一个实施方案中，至少部分抑制Serpinc1基因的表达通过减少Serpinc1 mRNA的量来评估，所述Serpinc1 mRNA可以从其中转录Serpinc1基因的第一细胞或细胞组中分离或检测到，与已经过或未经过如此处理的与第一细胞或细胞组基本相同的第二细胞或细胞组(对照细胞)相比，已经或已经进行过处理，从而抑制Serpinc1基因的表达。抑制的程度可以在以下方面表达
如本文所使用的短语“使用RNAi剂(诸如dsRNA)接触细胞”包括通过任何可能的方式接触细胞。使细胞与RNAi剂接触包括使细胞与iRNA在体外接触或使细胞与iRNA在体内接触。接触可以直接或间接完成。因此，例如可以通过实施该方法的个体将RNAi剂置于与细胞进行物理接触或者，可以将RNAi剂置于允许或导致其随后与细胞接触的情况中。
例如，可以通过将细胞与RNAi剂温育来完成体外接触细胞。例如，通过将RNAi剂注入到细胞所在的组织中或附近或通过将RNAi剂注入到另外的区域(例如血流或皮下空间)中可以完成体内接触细胞，从而药剂会随后到达要接触的细胞所在的组织。例如，RNAi剂可以含有和/或与配体偶联，例如GalNAc3，其将RNAi剂指向感兴趣的部位，例如肝脏。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以与RNAi剂在体外接触并随后移植到受试者体内。
在一个实施方案中，使细胞与iRNA接触包括通过促进或引起摄取或吸收到细胞中而“引入”或“将iRNA递送到细胞中”。iRNA的吸收或摄取可以通过无帮助的扩散或活性细胞过程或通过辅助剂或装置发生。将iRNA引入细胞可以是体外和/或体内的。例如，对于体内引入，可将iRNA注射到组织部位中或系统施用。体内递送也可以通过β-葡聚糖递送系统完成，诸如美国专利号5,032,401和5,607,677及美国公开号2005/0281781中所述的那些，其全部内容通过引用由此并入本文。体外引入细胞包括本领域已知的方法，诸如电穿孔和脂质转染。其他方法在下文中描述和/或是本领域中已知的。
II.本发明的方法
本发明提供治疗性和预防性方法，其包括向患有Serpinc1相关疾病(例如出血病症例如血友病例如A型血友病、B型血友病或C型血友病)施用iRNA剂或包含本发明的iRNA剂的药物组合物。在本发明的一些方面，所述方法进一步包括向所述受试者施用另外的治疗剂。
在本发明的某些实施方案中，例如当双链RNAi剂包含在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个或多个基序(包括在药剂的切割位点或附近的一个这样的基序)、六个硫代磷酸酯键和GalNAc配体时，这样的药剂以约0.200至约1.825mg/kg、0.200至约1.800mg/kg、约0.200至约1.700mg/kg、约0.200至约1.600mg/kg、约0.200至约1.500mg/kg、约0.200至约1.400mg/kg、约0.200至约1.400mg/kg、约0.200至约1.200mg/kg、约0.200至约1.100mg/kg、约0.200至约1.000mg/kg、约0.200至约0.900mg/kg、约0.200至约0.800mg/kg、约0.200至约0.700mg/kg、约0.200至约0.600mg/kg、约0.200至约0.500mg/kg、约0.200至约0.400mg/kg、约0.225至约1.825mg/kg、约0.225至约1.800mg/kg、约0.225至约1.700mg/kg、约0.225至约1.600mg/kg、约0.225至约1.500mg/kg、约0.225至约1.400mg/kg、约0.225至约1.400mg/kg、约0.225至约1.200mg/kg、约0.225至约1.100mg/kg、约0.225至约1.000mg/kg、约0.225至约0.900mg/kg、约0.225至约0.800mg/kg、约0.225至约0.700mg/kg、约0.225至约0.600mg/kg、约0.225至约0.500mg/kg、约0.225至约0.400mg/kg、约0.250至约1.825mg/kg、约0.250至约1.800mg/kg、约0.250至约1.700mg/kg、约0.250至约1.600mg/kg、约0.250至约1.500mg/kg、约0.250至约1.400mg/kg、约0.250至约1.400mg/kg、约0.250至约1.200mg/kg、约0.250至约1.100mg/kg、约0.250至约1.000mg/kg、约0.250至约0.900mg/kg、约0.250至约0.800mg/kg、约0.250至约0.700mg/kg、约0.250至约0.600mg/kg、约0.250至约0.500mg/kg、约0.250至约0.400mg/kg、约0.425至约1.825mg/kg、约0.425至约1.800mg/kg、约0.425至约1.700mg/kg、约0.425至约1.600mg/kg、约0.425至约1.500mg/kg、约0.425至约1.400mg/kg、约0.425至约1.400mg/kg、约0.425至约1.200mg/kg、约0.425至约1.100mg/kg、约0.425至约1.000mg/kg、约0.425至约0.900mg/kg、约0.425至约0.800mg/kg、约0.425至约0.700mg/kg、约0.425至约0.600mg/kg、约0.425至约0.500mg/kg、约0.450至约1.825mg/kg、约0.450至约1.800mg/kg、约0.450至约1.700mg/kg、约0.450至约1.600mg/kg、约0.450至约1.500mg/kg、约0.450至约1.400mg/kg、约0.450至约1.400mg/kg、约0.450至约1.200mg/kg、约0.450至约1.100mg/kg、约0.450至约1.000mg/kg、约0.450至约0.900mg/kg、约0.450至约0.800mg/kg、约0.450至约0.700mg/kg、约0.450至约0.600mg/kg、约0.450至约0.500mg/kg、约0.475至约1.825mg/kg、约0.475至约1.800mg/kg、约0.475至约1.700mg/kg、约0.475至约1.600mg/kg、约0.475至约1.500mg/kg、约0.475至约1.400mg/kg、约0.475至约1.400mg/kg、约0.475至约1.200mg/kg、约0.475至约1.100mg/kg、约0.475至约1.000mg/kg、约0.475至约0.900mg/kg、约0.475至约0.800mg/kg、约0.475至约0.700mg/kg、约0.475至约0.600mg/kg、约0.475至约0.500mg/kg、约0.875至约1.825mg/kg、约0.875至约1.800mg/kg、约0.875至约1.700mg/kg、约0.875至约1.600mg/kg、约0.875至约1.500mg/kg、约0.875至约1.400mg/kg、约0.875至约1.400mg/kg、约0.875至约1.200mg/kg、约0.875至约1.100mg/kg、约0.875至约1.000mg/kg、约0.875至约0.900mg/kg、约0.900至约1.825mg/kg、约0.900至约1.800mg/kg、约0.900至约1.700mg/kg、约0.900至约1.600mg/kg、约0.900至约1.500mg/kg、约0.900至约1.400mg/kg、约0.900至约1.400mg/kg、约0.900至约1.200mg/kg、约0.900至约1.100mg/kg、约0.900至约1.000mg/kg、约0.925至约1.825mg/kg、约0.925至约1.800mg/kg、约0.925至约1.700mg/kg、约0.925至约1.600mg/kg、约0.925至约1.500mg/kg、约0.925至约1.400mg/kg、约0.925至约1.400mg/kg、约0.925至约1.200mg/kg、约0.925至约1.100mg/kg或约0.925至约1.000mg/kg的剂量施用。上述列举的值中间的值和范围也是本发明的一部分，例如RNAi剂可以约0.015mg/kg至约0.45mg/mg的剂量向受试者施用。
例如，RNAi剂例如药物组合物中的RNAi剂可以约0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg、约0.5mg/kg、0.525mg/kg、0.55mg/kg、0.575mg/kg、约0.6mg/kg、0.625mg/kg、0.65mg/kg、0.675mg/kg、约0.7mg/kg、0.725mg/kg、0.75mg/kg、0.775mg/kg、约0.8mg/kg、0.925mg/kg、0.95mg/kg、0.975mg/kg、约1.0mg/kg、1.025mg/kg、1.05mg/kg、1.075mg/kg、约1.1mg/kg、1.125mg/kg、1.15mg/kg、1.175mg/kg、约1.2mg/kg、1.225mg/kg、1.25mg/kg、1.275mg/kg、约1.3mg/kg、1.325mg/kg、1.35mg/kg、1.375mg/kg、约1.4mg/kg、1.425mg/kg、1.45mg/kg、1.475mg/kg、约1.5mg/kg、1.525mg/kg、1.55mg/kg、1.575mg/kg、约1.6mg/kg、1.625mg/kg、1.65mg/kg、1.675mg/kg、约1.7mg/kg、1.725mg/kg、1.75mg/kg、1.775mg/kg或约1.8mg/kg的剂量施用。上述列举的值中间的值也是本发明的一部分。
因此，在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症(例如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用预防有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)(例如包含本发明的dsRNA的药物组合物)，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症(例如出血病症例如血友病)的受试者的方法，其包括向受试者(例如人)施用治疗有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.800mg/kg的剂量)的靶向Serpinc1基因的iRNA剂或包含靶向Serpinc1基因的iRNA剂的药物组合物，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在另一个方面，本发明提供预防有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的本发明的iRNA(例如dsRNA)用于预防患有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(例如出血病症例如血友病)的受试者的至少一个症状的用途。
在另一个方面，本发明提供预防有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的本发明iRNA剂在制造用于预防患有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(例如出血病症例如血友病)的受试者的至少一个症状的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供治疗有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的本发明的iRNA剂用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者)的用途。
在另一个方面，本发明提供靶向Serpinc1基因的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)或包含治疗有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的靶向Serpinc1基因的iRNA剂的药物组合物在制造用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者诸如具有出血病症例如血友病的受试者)的药物中的用途。
在本发明的一些实施方案中，例如当双链RNAi剂包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合时，这样的药剂以约0.200至约1.825mg/kg的剂量例如以约0.200mg/kg至约0.250mg/kg的剂量或以约0.425mg/kg至约0.475mg/kg的剂量或以约0.875mg/kg至约0.925mg/kg的剂量或以约1.775mg/kg至约1.825mg/kg的剂量施用。
因此，在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症(例如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的方法。所述方法包括向受试者施用预防有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合(例如包含RNAi剂的药物组合物)，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症(例如出血病症例如血友病)的受试者的方法，其包括向受试者(例如人)施用治疗有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合或包含靶向Serpinc1基因的iRNA剂的药物组合物，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在另一个方面，本发明提供预防有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，用于预防具有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(诸如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的用途。
在另一个方面，本发明提供预防有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，在制造用于预防具有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(诸如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供治疗有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者)的用途。
在另一个方面，本发明提供靶向Serpinc1基因的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)或包含治疗有效剂量(例如约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂的药物组合物，所述RNAi剂包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，在制造用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者诸如具有出血病症例如血友病的受试者)的药物中的用途。
在一些实施方案中，本发明的iRNA剂以固定剂量向受试者施用。“固定剂量”(例如mg的剂量)意指对于所有受试者使用一个剂量的iRNA剂，而不管与任何具体的受试者相关的因素诸如体重。在一个特定的实施方案中，本发明的iRNA剂的固定剂量基于预定的体重或年龄。
在一些实施方案中，iRNA剂以约25mg至约100mg例如约25mg至约95mg、约25mg至约90mg、约25mg至约85mg、约25mg至约80mg、约25mg至约75mg、约25mg至约70mg、约25mg至约65mg、约25mg至约60mg、约25mg至约50mg、约50mg至约100mg、约50mg至约95mg、约50mg至约90mg、约50mg至约85mg、约50mg至约80mg、约30mg至约100mg、约30mg至约90mg、约30mg至约80mg、约40mg至约100mg、约40mg至约90mg、约40mg至约80mg、约60mg至约100mg、约60mg至约90mg、约25mg至约55mg、约25mg至约65mg、约30mg至约95mg、约30mg至约85mg、约30mg至约75mg、约30mg至约65mg、约30mg至约55mg、约40mg至约95mg、约40mg至约85mg、约40mg至约75mg、约40mg至约65mg、约40mg至约55mg或约45mg至约95mg的固定剂量施用。
在一些实施方案中，iRNA剂以约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg或约100mg的固定剂量施用。
因此，在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症(例如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用预防有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)(例如包含本发明的dsRNA的药物组合物)，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用预防有效剂量(例如约50mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)(例如包含本发明的dsRNA的药物组合物)，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用预防有效剂量(例如约80mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)(例如包含本发明的dsRNA的药物组合物)，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症(例如出血病症例如血友病)的受试者的方法，其包括向受试者(例如人)施用治疗有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的靶向Serpinc1基因的iRNA剂或包含靶向Serpinc1基因的iRNA剂的药物组合物，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量(例如约50mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)(例如包含本发明的dsRNA的药物组合物)，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量(例如约80mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)(例如包含本发明的dsRNA的药物组合物)，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
在另一个方面，本发明提供预防有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的本发明的iRNA(例如dsRNA)用于预防患有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(诸如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的用途。在一个实施方案中，本发明提供预防有效剂量(例如约50mg的固定剂量)的本发明的iRNA(例如dsRNA)用于预防患有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(诸如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的用途。在另一个实施方案中，本发明提供预防有效剂量(例如约80mg的固定剂量)的本发明的iRNA(例如dsRNA)用于预防患有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(诸如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的用途。
在另一个方面，本发明提供预防有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂在制造用于预防患有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(诸如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的药物中的用途。在一个实施方案中，本发明提供预防有效剂量(例如约50mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂在制造用于预防患有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(诸如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供预防有效剂量(例如约80mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂在制造用于预防患有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(诸如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供治疗有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者)的用途。在一个实施方案中，本发明提供治疗有效剂量(例如约50mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者)的用途。在另一个实施方案中，本发明提供治疗有效剂量(例如约80mg的固定剂量)的本发明的iRNA剂用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者)的用途。
在另一个方面，本发明提供靶向Serpinc1基因的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)或包含治疗有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的靶向Serpinc1基因的iRNA剂的药物组合物在制造用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者诸如具有出血病症例如血友病的受试者)的药物中的用途。在一个实施方案中，本发明提供靶向Serpinc1基因的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)或包含治疗有效剂量(例如约50mg的固定剂量)的靶向Serpinc1基因的iRNA剂的药物组合物在制造用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者诸如具有出血病症例如血友病的受试者)的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供靶向Serpinc1基因的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)或包含治疗有效剂量(例如约80mg的固定剂量)的靶向Serpinc1基因的iRNA剂的药物组合物在制造用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者诸如具有出血病症例如血友病的受试者)的药物中的用途。
在本发明的一些实施方案中，例如当双链RNAi剂包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合时，这样的药剂以约25mg至约100mg的固定剂量例如以约25mg的固定剂量或以约50mg的固定剂量或以约80mg的固定剂量或以约100mg的固定剂量施用。在一个实施方案中，固定剂量为50mg。在另一个实施方案中，固定剂量为80mg。
因此，在一个方面，本发明提供预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症(例如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的方法。该方法包括向受试者施用预防有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合(例如含有RNAi剂的药物组合物)，由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。在一个实施方案中，固定剂量为50mg。在另一个实施方案中，固定剂量为80mg。
在另一个方面，本发明提供治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症(例如出血病症例如血友病)的受试者的方法，其包括向受试者(例如人)施用治疗有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合或包含靶向Serpinc1基因的RNAi剂的药物组合物，由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。在一个实施方案中，固定剂量为50mg。在另一个实施方案中，固定剂量为80mg。
在另一个方面，本发明提供预防有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，用于预防患有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(诸如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的用途。在一个实施方案中，固定剂量为50mg。在另一个实施方案中，固定剂量为80mg。
在另一个方面，本发明提供预防有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，在制造用于预防患有会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的病症(诸如出血病症例如血友病)的受试者中的至少一个症状的药物中的用途。在一个实施方案中，固定剂量为50mg。在另一个实施方案中，固定剂量为80mg。
在另一个方面，本发明提供治疗有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者)的用途。在一个实施方案中，固定剂量为50mg。在另一个实施方案中，固定剂量为80mg。
在另一个方面，本发明提供靶向Serpinc1基因的本发明的iRNA剂(例如dsRNA)或包含治疗有效剂量(例如约25mg至约100mg的固定剂量)的双链核糖核酸(RNAi)剂的药物组合物，所述双链核糖核酸(RNAi)剂包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，在制造用于治疗受试者(例如会受益于Serpinc1表达减少和/或抑制的受试者诸如具有出血病症例如血友病的受试者)的药物中的用途。在一个实施方案中，固定剂量为50mg。在另一个实施方案中，固定剂量为80mg。
本发明的方法和用途包括施用本文所述的组合物从而降低靶Serpinc1基因的表达历经诸如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或约80天。在一个实施方案中，降低靶Serpinc1基因的表达历经延长的持续时间例如至少约7天或更久例如约1周、2周、3周、约4周、约5周、约6周、约2个月、约一个季度或更久。
基因表达的降低可通过本领域中已知的任何方法评估。例如，使用对本领域普通技术人员常规的方法(例如RNA印迹、qRT-PCR)通过Serpinc1的mRNA表达水平，使用对本领域普通技术人员常规的方法(诸如蛋白质印迹、免疫学技术)通过Serpinc1的蛋白质水平，和/或通过确定Serpinc1的生物学活性，诸如影响与细胞凝血机制有关的一个或多个分子(或在体内环境中，凝血本身)来确定Serpinc1的表达减少。在一个实施方案中，确定凝血酶生成时间，凝块形成时间和/或凝血时间以使用例如全血的血栓弹性测定法分析评估Serpinc1表达。
根据本发明的方法和用途施用dsRNA可导致患有与Serpinc1有关的疾病的患者中这样的疾病或病症的严重程度、体征、症状和/或标记的减少。上下文中的“减少”是意指这样的水平的统计学显著下降。减少可以是例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％。
治疗或预防疾病的功效可例如通过测量疾病进展、疾病缓和、症状严重程度、出血的频率、疼痛的减少、生活的质量、维持治疗效果需要的药物的剂量、疾病标记的水平或适合于接受治疗或针对性预防的给定疾病的任何其他可测量参数来评估。通过测量这样的参数中的任何一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，可以通过例如定期监测凝血酶:抗凝血酶水平来评估治疗出血病症的功效。后面的读数与初始读数的比较为医生提供治疗是否有效的指示。通过测量这样的参数中的任何一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。关于靶向Serpinc1的iRNA或其药物组合物的施用，“有效抗”出血病症表明以临床上适当的方式施用对于至少统计上显著部分的患者导致有益效果，诸如改善症状、治愈、减少疾病、延长生命、改善生活的质量或或熟悉治疗出血病症及相关原因的医生通常认为是阳性的其他效果。
当疾病状态的一个或多个参数在统计学上显著改善时或者由于未能恶化或在其他情况下预期会出现症状时，治疗或预防效果是明显的。例如，在可测量的疾病参数中，至少10％的有利变化，优选至少20％、30％、40％、50％或更多，可以指示有效治疗。给定的iRNA药物或该药物制剂的功效也可以使用本领域已知的给定疾病的实验动物模型来判断。当使用实验动物模型时，当观察到标记物或症状的统计学显著减少时，证明治疗的功效。
或者，基于临床上接受的疾病严重程度分级量表，可以通过诊断由本领域技术人员确定的疾病严重程度的降低来测量功效。导致例如使用合适的量表测量的疾病严重程度减轻的任何阳性变化代表使用如本文所述的iRNA或iRNA制剂的适当治疗。
iRNA(或包含iRNA的药物组合物)可以约每周一次、约每月两次、约每6周一次、约每2月一次或每季度一次向受试者施用。
双链iRNA剂可以作为一个或多个剂量向受试者施用。例如，双链iRNA剂可以约0.200mg/kg至约1.825mg/kg的月剂量向受试者施用。或者，双链iRNA剂可以约25mg至约100mg的固定剂量向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，以约0.200mg/kg至约0.250mg/kg(例如约0.225mg/kg)的月剂量向受试者施用。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，以约0.425mg/kg至约0.475mg/kg(例如约0.450mg/kg)的月剂量向受试者施用。
在另一个实施方案中，双链RNAi剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，以约0.875mg/kg至约0.925mg/kg(例如约0.900mg/kg)的月剂量向受试者施用。
在一个实施方案中，双链RNAi剂，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，以约1.775mg/kg至约1.825,mg/kg(例如约1.800mg/kg)的月剂量向受试者施用。
在一个实施方案中，其包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合，以约25至约100mg(例如约25mg、50mg、80mg或100mg)的固定剂量向受试者施用。在一个实施方案中，固定剂量为50mg。在另一个实施方案中，固定剂量为80mg。
可以例如定期(诸如每月)重复施用一个月、两个月、三个月、四个月或更长时间。在初始治疗方案后，可以不太频繁地施用治疗。例如，在每月一次施用3个月后，可以每季度一次重复施用一年或更长时间。
因此，在一些实施方案中，RNAi剂以包括在“保持阶段”后的紧密间隔施用的“负荷阶段”的给药方案施用，其中RNAi剂以更长间隔的间隔施用。
负荷给药计划和/或保持给药计划可以可选地重复一次或多次迭代。迭代的次数可以取决于实现希望的效果，例如抑制Serpinc1基因，和/或实现治疗或预防效果，例如增加凝血、减少凝块形成时间，和/或减少凝血时间。
施用iRNA可降低例如患者的细胞、组织、血液、尿液或其他区室中的Serpinc1水平至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或更多。
iRNA可以历经一段时间诸如历经5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或约25分钟的静脉内输注施用。
在施用全剂量的iRNA前，患者可以被施用较小剂量诸如5％输注且监测其不良作用诸如过敏反应。在另一个实例中，可以监测患者的不想要的免疫刺激作用诸如增加的细胞因子(例如TNF-α或INF-α)水平。
由于对Serpinc1表达的抑制作用，根据本发明的组合物或由其制备的药物组合物可以提高生活的质量。
本发明的iRNA可以“裸露的”形式或作为“游离iRNA”施用。在不存在药物组合物的情况下施用裸iRNA。裸iRNA可处于合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可以包含乙酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合。在一个实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可调节含有iRNA的缓冲溶液的pH和同渗容摩，从而其适合于向受试者施用。
或者，本发明的iRNA可以作为药物组合物(诸如dsRNA脂质体制剂)施用。
会受益于Serpinc1基因表达的减少和/或抑制的受试者是具有出血病症(例如本文所述的遗传性出血病症或获得性出血病症)的那些受试者。在一个实施方案中，具有遗传性出血病症的受试者具有血友病，例如A、B或C型血友病A。在一个实施方案中，具有遗传性出血病症(例如血友病)的受试者是抑制剂受试者(一种已经变得难以替代凝血因子的受试者)。在一个实施方案中，抑制剂受试者具有A型血友病。在另一个实施方案中，抑制剂受试者具有B型血友病。在另一个实施方案中，抑制剂受试者具有C型血友病。治疗会受益于Serpinc1基因表达的减少和/或抑制的受试者包括治疗性(例如按需服用，例如受试者出血(自发性出血或由于创伤引起的出血)和不能凝集)和预防性(例如受试者不出血和/或要进行手术)治疗。
本发明进一步提供使用iRNA或其药物组合物与其他药物和/或其他治疗方法(例如与已知的药物和/或已知的治疗方法，诸如例如目前用于治疗这些病症的方法)组合，例如用于治疗会受益于Serpinc1表达的减少和/或抑制的受试者(例如具有出血病症的受试者)的方法和用途。
例如，在某些实施方案中，靶向Serpinc1的iRNA与例如用于治疗本文其他地方所述的出血病症的药剂组合施用。例如，适用于治疗会受益于Serpinc1表达减少的受试者(例如具有出血病症的受试者)的其他治疗剂和治疗方法包括新鲜冷冻的血浆(FFP)；重组FVIIa；重组FIX；FXI浓缩物；病毒灭活的含vWF的FVIII浓缩物；可包括大剂量的FVIII或FIX的脱敏疗法及类固醇或静脉内免疫球蛋白(IVIG)和环磷酰胺；血浆置换联合免疫抑制和输注FVIII或FIX，有或没有抗纤维蛋白溶解疗法；免疫耐受诱导(ITI)，有或没有免疫抑制治疗(例如环磷酰胺、泼尼松和/或抗CD20)；乙酸去氨加压素[DDAVP]；抗纤维蛋白溶解剂，如氨基己酸和氨甲环酸；活化的凝血酶原复合物浓缩物(PCC)；抗血友病剂；皮质类固醇类；免疫抑制剂；和雌激素。
iRNA和另外的治疗剂和/或治疗可以同时和/或以相同的组合施用，例如胃肠外施用或者另外的治疗剂可以作为单独的组合物的一部分施用或在单独的时间施用和/或通过本领域已知或本文所述的另一种方法施用。
在一个实施方案中，本发明提供通过以约0.200mg/kg至约1.800mg/kg的剂量例如约0.200mg/kg至约0.250mg/kg、约0.425mg/kg至约0.475mg/kg、约0.875mg/kg至约0.925mg/kg或约1.775mg/kg至约1.825mg/kg的月剂量皮下施用本申请化合物AD-57213(有义链：5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)；和反义链：5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键)来治疗患有出血病症(例如血友病)的受试者的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供通过以约25mg至约100mg的固定剂量例如约25mg、约50mg、约80mg或约100mg的固定剂量皮下施用本申请化合物AD-57213(有义链：5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)；和反义链：5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键)来治疗患有出血病症(例如血友病)的受试者的方法。在一个实施方案中，固定剂量为50mg。在另一个实施方案中，固定剂量为80mg。
III.用于本发明方法中的iRNA
本文描述了使用改进的双链RNAi剂的方法，所述双链RNAi剂抑制细胞中的Serpinc1基因(诸如受试者，例如哺乳动物，诸如具有Serpinc1相关病症(例如出血病症例如血友病)的人中的细胞)的表达。
因此，本发明提供具有能够在体内抑制靶基因(即Serpinc1基因)的表达的化学修饰的双链RNAi剂。在本发明的某些方面，基本上本发明的iRNA的所有核苷酸是经修饰的。在本发明的其他实施方案中，本发明的iRNA的所有核苷酸是经修饰。本发明的iRNA(其中“基本上所有核苷酸是经修饰的”)大部分但不完全是经修饰的且可包括不多于5、4、3、2或1个未经修饰的核苷酸。
RNAi剂包含有义链和反义链。RNAi剂的每条链可以在12-30个核苷酸的长度的范围内。例如，每条链可以是14-30个核苷酸的长度、17-30个核苷酸的长度、19-30个核苷酸的长度、25-30个核苷酸的长度、27-30个核苷酸的长度、17-23个核苷酸的长度、17-21个核苷酸的长度、17-19个核苷酸的长度、19-25个核苷酸的长度、19-23个核苷酸的长度、19-21个核苷酸的长度、21-25个核苷酸的长度或21-23个核苷酸的长度。
有义链和反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”)，在本文中也称为“RNAi剂”。RNAi剂的双链体区域可以是12-30个核苷酸对的长度。例如，双链体区域可以是14-30个核苷酸对的长度、17-30个核苷酸对的长度、27-30个核苷酸对的长度、17-23个核苷酸对的长度、17-21个核苷酸对的长度、17-19个核苷酸对的长度、19-25个核苷酸对的长度、19-23个核苷酸对的长度、19-21个核苷酸对的长度、21-25个核苷酸对的长度或21-23个核苷酸对的长度。在另一个实例中，双链体区选自长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，RNAi剂可以在一条或两条链的3’-端、5’-端或两端包含一个或多个突出端区域和/或封端基团。突出端可以是1-6个核苷酸的长度、例如2-6个核苷酸的长度、1-5个核苷酸的长度、2-5个核苷酸的长度、1-4个核苷酸的长度、2-4个核苷酸的长度、1-3个核苷酸的长度、2-3个核苷酸的长度或1-2个核苷酸的长度。突出端可以是一条链比另一条长的结果或者相同长度的两条链是交错的结果。突出端可以与靶mRNA形成错配或者可以与被靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。第一和第二链也可以例如通过另外的碱基连接以形成发夹或者通过其他非碱基接头连接。
在一个实施方案中，RNAi剂的突出端区域中的核苷酸可各自独立地是经修饰或未经修饰的核苷酸，其包括但不限于2’-糖修饰的，诸如2-F、2’-O-甲基、胸苷(T)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2’-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)和它们的任意组合。例如，TT可以是任一链上任一端的突出端序列。突出端可以与靶mRNA形成错配或者其可与被靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。
RNAi剂的有义链、反义链或两条链上的5’-或3’-突出端可以被磷酸化。在一些实施方案中，突出端区域含有在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯的两个核苷酸，其中两个核苷酸可以是相同的或不同的。在一个实施方案中，突出端存在于有义链、反义链或两条链的3’-端。在一个实施方案中，该3’-突出端存在于反义链中。在一个实施方案中，该3’突出端存在于有义链中。
RNAi剂可能只含有一个突出端，其可以增强RNAi的干扰活性，而不会影响其整体稳定性。例如，单链突出端可位于有义链的3’-末端或者可选地，位于反义链的3’-末端。RNAi也可以具有平端，其位于反义链的5’-端(或有义链的3’-端)或反之亦然。一般地，RNAi的反义链在3’-端具有核苷酸突出端且5’-端是平的。虽然不希望受理论束缚，但反义链的5’-端的不对称平端和反义链的3’-端突出端有利于引导链加载到RISC过程中。
本发明中所表征的任何核酸可以通过本领域中完全建立的方法合成和/或修饰，诸如“Current protocols in nucleic acid chemistry,”Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA，其通过引用由此并入本文。修饰包括例如末端修饰，例如5’-端修饰(磷酸化、缀合、反向连接)或3’-端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰，例如用稳定化碱基替代，去稳定化碱基或与扩展的同伴集(repertoire)碱基配对的碱基，去除碱基(无碱基核苷酸)或缀合的碱基；糖修饰(例如在2’-位或4’-位)或置换糖；和/或主链修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代。可用于本文所述实施方案的iRNA化合物的具体实例包括但不限于含有经修饰的主链或无天然核苷间键的RNA。具有经修饰的主链的RNA，此外还有，主链中不具有磷原子的RNA。为了本说明书的目的且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可被认为是寡核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的iRNA将在其核苷间主链中具有磷原子。
经修饰的RNA主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(其包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(其包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3’-5’连接的硼烷基磷酸酯，这些的2’-5’-连接类似物及具有反向极性的那些，其中相邻的核苷单元对以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接。还包括多种盐、混合的盐和游离酸形式。
教导上述含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和US专利RE39464，其每一个的全部内容通过引用由此并入本文。
其中不包含磷原子的经修饰的RNA主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有吗啉代键的那些(部分由核苷的糖部分形成的)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；含烯烃主链；氨基磺酸主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸盐和磺酰胺主链；酰胺主链；和其他具有混合的N、O、S和CH2组分组分。
教导制备上述寡核苷的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，其每一个的全部内容通过引用由此并入本文。
在其他实施方案中，考虑将合适的RNA模拟物用于iRNA中，其中核苷酸单元的糖和核苷间键，即主链均被新的基团替代。保持碱基单位与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，即已经显示出具有优异杂交性质的RNA模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖主链被含酰胺主链，特别是氨乙基甘氨酸主链替代。核碱基被保留并直接或间接连接到主链酰胺部分的氮杂氮原子上。教导制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其每一个的全部内容通过引用由此并入本文。适用于本发明的iRNA的另外的PNA化合物在例如在Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500中描述。
本发明所表征的一些实施方案包括具有硫代磷酸酯主链和具有杂原子主链的寡核苷酸的RNA且特别是以上提及的美国专利号5,489,677中的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯主链表示为--O--P--O--CH2--]，和以上提及的美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施方案中，本文所表征的RNA具有以上提及的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构。
经修饰的RNA也可以含有一个或多个取代的糖部分。本文所表征的iRNA(例如dsRNA)可以包括在2’-位的以下的一种：OH；F；O-，S-或N-烷基；O-，S-或N-烯基；O-，S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基，烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性的合适修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。在其他实施方案中，dsRNA包括在2’位的以下的一种：C1至C10低级烷基，取代的低级烷基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或O-芳烷基，SH，SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，杂环烷基，杂环烷基芳基，氨基烷基氨基，聚烷基氨基，取代的甲硅烷基，RNA切割基团，报道基因基团，嵌入剂，用于改善iRNA的药代动力学性质的基团或用于改善iRNA的药效学性质的基团及具有类似性质的其他取代基。在一些实施方案中，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3,也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一示例性修饰是2’-二甲基氨基氧乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE，如下文实施例中所述的，和2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中还称为2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其他修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。类似的修饰也可以在iRNA的RNA的其他位置，特别是3’-末端核苷酸上的糖的3’位或2’-5’连接的dsRNA和5’-末端核苷酸的5’位进行。iRNA也可以具有糖模拟物，诸如环丁基部分代替戊呋喃糖基糖。教导制备这样的经修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中的某些是本申请共同拥有的。上述每一个的全部内容通过引用由此并入本文。
iRNA还可以包括核碱基(本领域通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所使用的“未经修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，诸如腺嘌呤的脱氧胸腺嘧啶(dT)，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲基和其他烷基衍生物的腺嘌呤和鸟嘌呤，2-丙基和其他烷基衍生物的腺嘌呤和鸟嘌呤，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基肛、其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代，特别是5-溴，5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-氮杂腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他核碱基包括美国专利号3,687,808中公开的那些，在Modified Nucleosides inBiochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008中公开的那些；在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley&Sons,1990中公开的那些，通过Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613公开的这些和通过Sanghvi,YS.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.andLebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993公开的那些。这些核碱基中的某些对于提高本发明所表征的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.andLebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)且是示例性的碱基置换，甚至更特别地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰结合时。
教导制备某些上述经修饰的核碱基及其他修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于上述美国专利号3,687,808,4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088,其每一个的全部内容通过引用由此并入本文。
iRNA的RNA也可以被修饰以包括一个或多个双环糖部分。“双环糖”是通过桥接两个原子而修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，其包含连接糖环的两个碳原子的桥，由此形成双环系统。在某些实施方案中，桥连接糖环的4’-碳和2’-碳。因此，在一些实施方案中，本发明的药剂可以包括iRNA的RNA也可以被修饰以包括一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包含连接2’和4’碳的额外的桥。换言之，LNA是包含含有4’-CH2-O-2’桥的双环糖部分的核苷酸。这种结构有效地“锁定”了3’-内结构构象中的核糖。已经显示出向siRNA添加锁核酸增加血清中的siRNA稳定性并减少脱靶效应(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1):439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。
用于本发明的多核苷酸的双环核苷的实例包括但不限于包含4’和2’核糖基环原子之间的桥的核苷。在某些实施方案中，本发明的反义多核苷酸试剂包括一种或多种包含4’至2’桥的双环核苷。这样的4’至2’桥连双环核苷的实例包括但不限于4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’(也称为“束乙基”或“cEt”)和4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(及其类似物；参见例如美国专利号7,399,84)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(及其类似物；参见例如美国专利号8,278,283)；4’-CH2-N(OCH3)-2’(及其类似物；参见例如美国专利号8,278,425)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(参见例如美国专利公开号2004/0171570)；4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R是H，C1-C12烷基或保护基团(参见例如美国专利号7,427,672)；4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(参见例如Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和4’-CH2-C(＝CH2)-2’(及其类似物；参见例如美国专利号8,278,426)。上述每一个的全部内容通过引用由此并入本文。
教导锁核酸核苷酸的制备的其他代表性美国专利和美国专利公开包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US 2008/0039618；和US 2009/0012281，其每一个的全部内容通过引用由此并入本文。
任何前述的双环核苷可以制备为具有一个或多个立体化学糖构型，其包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
还可以修饰iRNA的RNA以包括一个或多个约束性乙基核苷酸。如本文所使用的“约束性乙基核苷酸”或“cEt”是包含含有4’-CH(CH3)-0-2’桥的双环糖部分的锁核酸。在一个实施方案中，约束性乙基核苷酸处于本文称为“S-cEt”的S构象。
本发明的iRNA还可包括一个或多个“构象限制的核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2’和C4’碳或核糖的C3和C5’碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定为稳定的构象并增加与mRNA的杂交亲和力。接头具有足够的长度以将氧置于稳定性和亲和性的最佳位置，导致较少的核糖环皱褶。
教导制备某些上述CRN的代表性出版物包括但不限于美国专利公开号2013/0190383；和PCT公开WO2013/036868，其每一个的全部内容通过引用由此并入本文。
本发明的iRNA的一个或多个核苷酸还可以包括羟甲基取代的核苷酸。“羟甲基取代的核苷酸”是非环状的2’-3’-闭联核苷酸，也称为“解锁核酸”(“UNA”)修饰。
教导UNA制备的代表性美国出版物包括但不限于美国专利号8,314,227；和美国专利公开号2013/0096289；2013/0011922；和2011/0313020，其每一个的全部内容通过引用由此并入本文。
对RNA分子末端的可能稳定修饰可包括N-(乙酰基氨基己酰)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2’-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二烷酰基尿苷-3"-磷酸酯、反向碱基dT(idT)等。可以在PCT公开号WO2011/005861中找到所述修饰的公开。
A.包含本发明基序的经修饰的iRNA
在本发明的某些方面，本发明的双链RNAi剂包括具有化学修饰的试剂，如，例如于2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710或于2012年11月16日提交的PCT/US2012/065691中公开的，其全部内容通过引用由此并入本文。
如本文所示，在临时申请号61/561,710和PCT/US2012/065691中，可通过将三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个或多个基序引入RNAi剂的有义链和/或反义链中，特别是在切割位点或附近而获得优异的结果。在一些实施方案中，RNAi剂的有义链和反义链可以另外被完全修饰。这些基序的引入中断了有义链和/或反义链的修饰模式(如果存在的话)。RNAi剂可任选地，例如在有义链上缀合与GalNAc衍生物配体缀合。所得RNAi剂具有优异的基因沉默活性。
更具体地，令人惊讶地发现，当双链RNAi剂的有义链和反义链被修饰成在RNAi剂的至少一条链的切割位点或附近的三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序时，RNAi剂的基因沉默活性极大的增强。
在一个实施方案中，RNAi剂是19个核苷酸的长度的双端平末端(bluntmer)，其中有义链在距5’-端的7、8、9位处的3个连续核苷酸上含有3个2’-F修饰的至少一个基序。反义链在5’-端的11、12、13位处的3个连续核苷酸上含有3个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。
在另一个实施方案中，RNAi剂是20个核苷酸的长度的双端平末端，其中有义链在距5’-端的8、9、10位处的3个连续核苷酸上含有3个2’-F修饰的至少一个基序。反义链在距5’-端的11、12、13位处的3个连续核苷酸上含有3个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。
在另一个实施方案中，所述RNAi剂是21个核苷酸的长度的双端平末端，其中有义链在距5’-端的9、10、11位处的3个连续核苷酸上含有3个2’-F修饰的至少一个基序。反义链在距5’-端的11、12、13位处的3个连续核苷酸上含有3个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。
在一个实施方案中，RNAi剂包含21个核苷酸的有义链和23个核苷酸的反义链，其中有义链在距5’-端的9、10、11位处的3个连续的核苷酸上含有3个2’-F修饰的至少一个基序；反义链在距5’-端的11、12、13位处的3个连续核苷酸上含有3个2’-O-甲基修饰的至少一个基序，其中RNAi剂的一端是平的，而另一端包含2个核苷酸突出端。优选地，2个核苷酸突出端位于反义链的3’-端。当2个核苷酸突出端位于反义链的3’-端时，末端三个核苷酸之间可能存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸且第三个核苷酸是在突出端核苷酸旁边的配对的核苷酸。在一个实施方案中，RNAi剂在有义链的5’-端和反义链的5’-端处的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方案中，RNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包括作为基序的一部分的核苷酸，是经修饰的核苷酸。在一个实施方案中，每个残基用2’-O-甲基或3’-氟代，例如以交替基序独立地修饰。任选地，RNAi剂进一步包含配体(优选GalNAc3)。
在一个实施方案中，RNAi剂包含有义链和反义链，其中RNAi剂包含具有至少25个且至多29个核苷酸的长度的第一链和具有至少30个核苷酸的长度的第二链，在5’-端的11、12、13位处的3个连续核苷酸上的3个2’-O-甲基修饰的一个基序；其中第一链的3’-端和第二链的5’-端形成平端且第二链在其3’-端比第一链长1-4个核苷酸，其中双链体区域是至少25个核苷酸的长度且第二链与第二链长度的至少19个核苷酸处的靶mRNA充分互补以在将RNAi剂引入哺乳动物细胞中时减少靶基因表达且其中RNAi剂的dicer切割优先产生包含第二链3’-端的siRNA，由此减少哺乳动物中靶基因的表达。任选地，RNAi剂进一步包含配体。
在一个实施方案中，RNAi剂的有义链在3个连续的核苷酸上含有3个相同修饰的至少一个基序，其中基序中的一个出现在有义链的切割位点处。
在一个实施方案中，RNAi剂的反义链还可以在3个连续核苷酸上含有3个相同修饰的至少一个基序，其中基序中的一个出现在反义链中的切割位点或附近。
对于具有17-23个核苷酸的长度的双链体区域的RNAi剂，反义链的切割位点通常在距5’-端的10、11和12位附近。因此，三个相同修饰的基序可以出现在9、10、11位；10、11、12位；11、12、13位；12、13、14位；或反义链的13、14、15位，从反义链的5’-端的第1个核苷酸开始的计数或从反义链的5’-端的双链体区域中的第1个配对的核苷酸开始的计数。反义链中的切割位点也可以根据距5’-端的RNAi双链体区域的长度而变化。
RNAi剂的有义链可以在链的切割位点的3个连续核苷酸上含有3个相同修饰的至少一个基序；且反义链可以在链的切割位点或附近的3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的至少一个基序。当有义链和反义链形成dsRNA双链体时，有义链和反义链可以如此比对，从而有义链上的3个核苷酸的一个基序和反义链上的3个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即有义链中基序的3个核苷酸中的至少一个与反义链中基序的3个核苷酸中的至少一个形成碱基对。或者，至少两个核苷酸可以重叠或者全部三个核苷酸可以重叠。
在一个实施方案中，RNAi剂的有义链可以在3个连续的核苷酸上含有3个相同修饰的多于一个基序。第一个基序可以出现在链的切割位点或附近且其他基序可以是侧翼修饰。本文中的术语“侧翼修饰”是指在相同链的切割位点或附近与基序分开的链的另一部分处出现的基序。侧翼修饰位于第一基序的附近或被至少一个或多个核苷酸分离。当基序彼此紧接相邻时，基序的化学性质彼此不同且当基序被一个或多个核苷酸分离时，化学性质可以相同或不同。可能存在两个或更多个侧翼修饰。例如，当存在两个侧翼修饰时，每个侧翼修饰可以发生在相对于位于或接近切割位点或位于引导基序两侧的第一基序的一端。
与有义链一样，RNAi剂的反义链可在3个连续核苷酸上含有3个相同修饰的多于一个基序，至少一个基序出现在链的切割位点或附近。该反义链还可以在对齐中包含一个或多个侧翼修饰，其类似于可能存在于有义链上的侧翼修饰。
在一个实施方案中，RNAi剂的有义链或反义链上的侧翼修饰通常不包括链的3’-端、5’-端或两端的前一个或两个末端核苷酸。
在另一个实施方案中，RNAi剂的有义链或反义链上的侧翼修饰通常不包括在链的3’-端，5’-端或两端的双链体区域内的前一个或两个配对的核苷酸。
当RNAi剂的有义链和反义链各自含有至少一个侧翼修饰时，侧翼修饰可落在双链体区域的相同端且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
当RNAi剂的有义链和反义链各自含有至少两个侧翼修饰时，有义链和反义链可以如此排列，从而各自来自一条链的两个修饰落在双链体区域的一端，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在双链体区域的另一端，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；一条链的两个修饰落在引导基序的每一侧，在双链体区域中具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
在一个实施方案中，可以修饰RNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包括作为基序一部分的核苷酸。每个核苷酸可以用相同或不同的修饰进行修饰，所述修饰可以包括一个或两个非连接磷酸氧和/或一个或多个连接磷酸氧的一个或多个改变；改变核糖的构成，例如核糖上的2’羟基；用“去磷酸”接头批量替代磷酸盐部分；修改或替代天然存在的碱基；和核糖-磷酸主链的替代或修饰。
由于核酸是亚基的聚合物，许多修饰发生在核酸内重复的位置，例如碱基的修饰或磷酸部分的修饰或磷酸部分的非连接O。在一些情况下，修饰将发生在核酸中的所有主题位置，但在许多情况下不会。举例来说，修饰可能仅发生在3’或5’-末端位置，可能仅发生在末端区域中，例如在末端核苷酸上的位置或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸处。修饰可以在双链体区域、单链区域或两者中发生。修饰可仅发生在RNA的双链区域中或可仅发生在RNA的单链区域中。例如，非连接O位置的硫代磷酸酯修饰可以仅发生在一个或两个末端，可以仅发生在末端区域，例如末端核苷酸上的位置或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸处或者可以发生在双链和单链区域中，特别是在末端。5’-端或末端可以被磷酸化。
在突出端包括特定碱基或包括经修饰的核苷酸或核苷酸替代物，单链突出端，例如5’或3’突出端或两者，这可能例如增强稳定性。例如，可能希望在突出端包括嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3’或5’突出端中的全部或一些碱基可例如用本文所述的修饰来修饰。修饰可以包括例如使用本领域已知的修饰在核糖的2’位置使用修饰，例如使用脱氧核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修饰而不是核碱基的核糖及磷酸基团的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不需要与靶序列同源。
在一个实施方案中，有义链和反义链的每个残基用LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-羟基或2’-氟独立地修饰。链可包含多于一种修饰。在一个实施方案中，有义链和反义链的每个残基用2’-O-甲基或2’-氟独立地修饰。
有义链和反义链上通常存在至少两种不同的修饰。这两种修饰可以是2’-O-甲基或2’-氟修饰或其他。
在一个实施方案中，Na和/或Nb包含交替模式的修饰。如本文所用的术语“交替基序”是指具有一个或多个修饰的基序，每个修饰在一条链的交替核苷酸上发生。交替核苷酸可以指每个其他核苷酸一个或每三个核苷酸一个或类似的模式。例如，如果A、B和C各表示对核苷酸的一种类型的修饰，交替基序可以是“ABABABABABAB…,”“AABBAABBAABB…,”“AABAABAABAAB…,”“AAABAAABAAAB…,”“AAABBBAAABBB…,”或“ABCABCABCABC…,”等。
包含在交替基序中的修饰的类型可以是相同的或不同的。例如，如果A，B、C、D各自表示对核苷酸的一种类型的修饰，则交替模式，即对每个其他核苷酸的修饰可以是相同的，但是可以从交替基序诸如“ABABAB…”,“ACACAC…”“BDBDBD…”或“CDCDCD…,”等中的几种修改的可能性选择有义链或反义链中的每一个。
在一个实施方案中，本发明的RNAi剂包含有义链上的交替基序的修饰模式，其相对于反义链上的交替基序的修饰模式被转移。该转移可以使得有义链的经修饰的核苷酸组对应于反义链的经不同修饰的核苷酸组，反之亦然。例如，有义链与dsRNA双链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以以“ABABAB”从链的5’-3’开始且反义链中的交替基序可以以“BABABA”从双链体区域内的链的5’-3’开始。作为另一个实例，有义链中的交替基序可以“AABBAABB”从链的5’-3’的开始且反义链中的交替基序可以“BBAABBAA”从双链体区域内的链的5’-3’的开始，从而有义链和反义链之间有修饰模式的完全或部分转移。
在一个实施方案中，RNAi剂包含2’-O-甲基修饰的交替基序的模式且最初在有义链上的2’-F修饰具有相对于2’-O-甲基修饰的交替基序的模式和最初在反义链上的2’-F修饰位移，即有义链上的2’-O-甲基修饰的核苷酸与反义链上的2’-F修饰的核苷酸碱基配对且反之亦然。有义链的1位可以2’-F修饰开始，和反义链的1位可以2’-O-甲基修饰开始。
将在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个或多个基序引入有义链和/或反义链中断了有义链和/或反义链中存在的初始修饰模式。通过将在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个或多个基序引入有义和/或反义链的有义链和/或反义链的这种中断的修饰模式令人惊奇地增强了对靶基因的基因沉默活性。
在一个实施方案中，当将在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的基序引入任何链时，基序旁边的核苷酸的修饰是与基序的修饰不同的修饰。例如，含有基序的序列部分是“…NaYYYNb…，”其中“Y”表示3个连续核苷酸上的3个相同修饰基序的修饰且“Na”和“Nb”表示对与Y的修饰不同的基序“YYY”旁边的核苷酸的修饰且其中Na和Nb可以是相同的或不同的修饰。或者，当存在侧翼修饰时，Na和/或Nb可以存在或不存在。
RNAi剂可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以发生在有义链或反义链的任何核苷酸上或在链的任何位置上的两条链上。例如，核苷酸间键修饰可以发生在有义链和/或反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键修饰可以在有义链和/或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链可以以交替模式包含两种核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与反义链相同或不同且有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以具有相对于反义链上的核苷酸间键修饰的交替模式的移位。
在一个实施方案中，RNAi包含突出端区域中的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，突出端区域可含有两个核苷酸，其在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。还可以进行核苷酸间键修饰以将突出端核苷酸与双链体区域内的末端配对的核苷酸连接。例如，至少2、3、4或所有突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接且任选地，可以有另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键，其将突出端核苷酸与突出端核苷酸旁边的配对的核苷酸连接。例如，在末端三个核苷酸之间可以有至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，第三个是与突出端核苷酸旁边的配对的核苷酸。这些末端三个核苷酸可位于反义链的3’-端、有义链的3’-端、反义链的5’-端和/或反义链的5’-端。
在一个实施方案中，2个核苷酸的突出端位于反义链的3’-端且在末端3个核苷酸之间有两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，第三个核苷酸是突出核苷酸旁边的配对的核苷酸。任选地，RNAi剂可另外在有义链的5’-端和反义链的5’-端的末端3个核苷酸之间具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一个实施方案中，RNAi剂包含与靶标、双链体内或它们的组合的错配。“错配”可以是非规范碱基配对或不同于核苷酸的规范配对。错配可能发生在突出端区域或双链体区域中。碱基对可以基于它们促进解离或融解的倾向来排列(例如基于特定配对的结合或解离的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配对，尽管可以使用下一个邻居或类似的分析)。就促进解离而言：A:U优于G:C；G:U优于G:C；和I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非规范或非规范配对(如本文其他地方所述的)优于规范(A:T、A:U、G:C)配对；且包括通用碱基的配对优于规范配对。“通用碱基”是表现能够替换任何四种正常碱基(G、C、A和U)而没有显著破坏相邻碱基对相互作用或破坏经修饰寡核苷酸的预期功能性生物化学效用的能力的碱基。通用碱基的非限制性实例包括2’-脱氧肌苷(次黄嘌呤脱氧核苷酸)或其衍生物、硝唑类似物和疏水性芳族非氢键碱基。
在一个实施方案中，所述RNAi剂包含独立地选自下组的反义链的5’-端的双链体区域中的第1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个：A:U、G:U、I:C和错配的对，例如非规范的或不同于规范的配对或包括通用碱基的配对，以促进反义链在双链体的5’-端的解离。
在一个实施方案中，来自反义链中的5’-端双链体区域内1位的核苷酸选自A、dA、dU、U和dT。或者，来自反义链的5’-端的双链体区域内的最初1个、2个或3个碱基对的至少一个是AU碱基对。例如，来自反义链的5’-端的双链体区域内的第一个碱基对是AU碱基对。
在另一个实施方案中，有义链的3’-端的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。在另一个实施方案中，反义链的3’-端的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。在一个实施方案中，存在短序列的脱氧胸腺嘧啶核苷酸，例如有义和/或反义链的3’-端上的两个dT核苷酸。
在一个实施方案中，有义链序列可以由式(I)表示：
5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3’ (I)
其中
i和j各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
每个Na独立地表示包含0-25个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包含0-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同的修饰；和
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个基序。优选地，YYY全部是2’-F修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，Na和/或Nb包含交替模式的修饰。
在一个实施方案中，YYY基序发生在有义链的切割位点或附近。例如，当RNAi剂具有17-23个核苷酸的长度的双链体区域时，YYY基序可以发生在有义链的切割位点或附近(例如可以发生在6、7、8、7、8、9、8、9、10、9、10、11、10、11,12或11、12、13位)，从5’-端的第一个核苷酸开始计数；或任选地，从5’-端开始，在双链体区域内的第1对核苷酸处开始计数。
在一个实施方案中，i为1且j为0或i为0且j为1或i和j均为1。因此，有义链可由下式表示：
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’ (Ib)；
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3’ (Ic)；或
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’ (Id)。
当有义链由式(Ib)表示时，Nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Ic)时，Nb表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Id)时，每个Nb独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
在其他实施方案中，i为0且j为0且有义链可由下式表示：
5’np-Na-YYY-Na-nq3’ (Ia)。
当有义链由式(Ia)表示时，每个Na可独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施方案中，RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
5’nq’-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-N’a-np’3’ (II)
其中
k和l各自独立地是0或1；
p’和q’各自独立地是0-6；
每个Na’独立地表示包含0-25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
每个Nb’独立地表示包含0-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np’和nq’独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb’和Y’不具有相同的修饰；和
X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地表示在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个基序。
在一个实施方案中，Na’和/或Nb’包含交替模式的修饰。
Y’Y’Y’基序发生在反义链的切割位点或附近。例如，当RNAi剂具有17-23个核苷酸的长度的双链体区域时，Y’Y’Y’基序可发生在反义链的9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15位，从5’-末端的第1个核苷酸开始计数；或任选地，从5’-端开始，在双链体区域内的第1对核苷酸处开始计数。优选地，Y’Y’Y’基序发生在11、12、13位。
在一个实施方案中，Y’Y’Y’基序全部是2’-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，k为1且l为0或k为0且l为1或k和l均为1。
因此，反义链可以由下式表示：
5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’3’ (IIb)；
5’nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’3’ (IIc)；或
5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-Na’-np’3’ (IId)。
当反义链由式(IIb)表示时，Nb’表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链表示为式(IIc)时，Nb’表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链表示为式(IId)时，每个Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施方案中，k为0且l为0且反义链可由下式表示：
5’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3’ (Ia)。
当反义链由式(IIa)表示时，每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X’、Y’和Z’中的每一个可以彼此相同或不同。
有义链和反义链的每个核苷酸可以用LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基或2’-氟独立地修饰。例如，有义链和反义链的每个核苷酸用2’-O-甲基或2’-氟独立地修饰。特别地，每个X、Y、Z、X’、Y’和Z’可表示2’-O-甲基修饰或2’-氟修饰。
在一个实施方案中，当双链体区域为21nt时，RNAi剂的有义链可含有在链的9、10和11位发生的YYY基序，从5’-端的第1个核苷酸开始计数或任选地，从5’-端开始，在双链体区域内的第1对核苷酸处开始计数；且Y表示2’-F修饰。有义链可另外含有XXX基序或ZZZ基序，作为双链体区域相对端的侧翼修饰；和XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一个实施方案中，反义链可含有在链的第11、12、13位发生的Y’Y’Y’基序，从5’-端的第1个核苷酸开始计数或任选地，从5’-端开始，在双链体区域内的第1个配对的核苷酸处开始计数；且Y’表示2’-O-甲基修饰。反义链可以另外含有X’X’X’基序或Z’Z’Z’基序，作为在双链体区域相对端的侧翼修饰；和X’X’X’和Z’Z’Z’各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
由上式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的任一个表示的有义链分别与由式(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)中的任一个表示的反义链形成双链体。
因此，用于本发明的方法的RNAi剂可以包含有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸，RNAi双链体由式(III)表示：
有义：5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
反义：3’np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’5’ (III)
其中
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p’、q和q’各自独立地是0-6；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
每个np’、np、nq’和nq，其每个可以存在或不存在，独立地表示突出端核苷酸；和
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地表示在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个基序。
在一个实施方案中，i为0且j为0；或i为1且j为0；或i为0且j为1；或i和j都是0；或i和j都是1。在另一个实施方案中，k为0且l为0；或k为1且l为0；k为0且l为1；或k和l都是0；或k和l都是1。
形成RNAi双链体的有义链和反义链的示例性组合包括下式：
5’np-Na-YYY-Na-nq3’
3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’nq’5’ (IIIa)
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’
3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na’nq’5’ (IIIb)
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3’
3’np’-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-nq’5’ (IIIc)
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’
3’np’-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na-nq’5’ (IIId)
5’-Na-YYY-Na-3’
3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’5’ (IIIe)
当RNAi剂由式(IIIa)表示时，每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIIb)表示时，每个Nb独立地表示包含1-10、1-7、1-5或1-4个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂表示为式(IIIc)时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂表示为式(IIId)时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb和Nb’中的每一个独立地包含交替模式的修饰。
当RNAi剂表示为式(IIId)时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb和Nb’中的每一个独立地包含交替模式的修饰。
当RNAi剂表示为式(IIIe)时，每个Na和Na’独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，其为经修饰的或未经修饰或它们的组合，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)和(IIIe)中的X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
当RNAi剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)和(IIIe)表示时，至少一个Y核苷酸可与一个Y’核苷酸形成碱基对。或者，至少两个Y核苷酸与相应的Y’核苷酸形成碱基对；或所有三个Y核苷酸都与相应的Y’核苷酸形成碱基对。
当RNAi剂由式(IIIb)或(IIId)表示时，至少一个Z个核苷酸可以与一个Z’核苷酸形成碱基对。或者，至少两个Z核苷酸与相应的Z’核苷酸形成碱基对；或所有三个Z核苷酸都与相应的Z’核苷酸形成碱基对。
当RNAi剂表示为式(IIIc)或(IIIc)时，至少一个X核苷酸可与一个X’核苷酸形成碱基对。或者，至少两个X个核苷酸与相应的X’核苷酸形成碱基对；或所有三个X核苷酸都与相应的X’核苷酸形成碱基对。
在一个实施方案中，对Y核苷酸的修饰不同于对Y’核苷酸的修饰，对Z核苷酸的修饰不同于对Z’核苷酸的修饰，和/或对X核苷酸的修饰不同于对X’核苷酸的修饰。
在一个实施方案中，当RNAi剂由式(IIIc)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰。在另一个实施方案中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰且np’>0且至少一个np’经由硫代磷酸酯键与邻近的核苷酸连接。在另一个实施方案中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’>0且至少一个np’经由硫代磷酸酯键与邻近的核苷酸连接且有义链与通过一价、二价或三价支化接头附接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。在另一个实施方案中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’>0且至少一个np’经由硫代磷酸酯键与邻近的核苷酸连接，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键且有义链与通过一价、二价或三价支化接头附接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。
在一个实施方案中，当RNAi剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’>0且至少一个np’经由硫代磷酸酯键与邻近的核苷酸连接，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键且有义链与通过一价、二价或三价支化接头附接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。
在一个实施方案中，RNAi剂是含有由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)和(IIIe)表示的至少两个双链体的多聚体，其中双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体进一步包含配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同靶位点的相同基因。
在一个实施方案中，RNAi剂是含有由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)和(IIIe)表示的三、四、五、六或更多个双链体的多聚体，其中双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体进一步包含配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同靶位点的相同基因。
在一个实施方案中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)和(IIIe)表示的两种RNAi剂在5’-端和一个或两个3’-端彼此连接并任选地与配体缀合。每种药剂可以靶向相同的基因或两种不同的基因；或每种药剂可以靶向两个不同靶位点的相同基因。
多种公开描述了可用于本发明的方法的多聚体RNAi剂。这些公开包括WO2007/091269、美国专利号7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520，其全部内容通过引用由此并入本文。
含有一个或多个碳水化合物部分与RNAi剂缀合的RNAi剂可优化RNAi剂的一个或多个性质。在许多情况下，碳水化合物部分将附着于RNAi剂的修饰的亚基。例如，dsRNA试剂的一个或多个核糖核苷酸亚基的核糖可以被另外的部分(例如与碳水化合物配体附接的非碳水化合物(优选环状)载体)替代。其中已经如此替换亚基的核糖的核糖核苷酸亚基在本文中称为核糖替代修饰亚基(RRMS)。环状载体可以是碳环系统，即所有环原子都是碳原子或杂环系统，即一个或多个环原子可以是杂原子，例如氮、氧、硫。该环状载体可以是单环系统或可以含有两个或更多个环，例如稠环。该环状载体可以是完全饱和的环系统或者它可以含有一个或多个双键。
配体可以经由载体附接于多核苷酸。载体包括(i)至少一个“主链附接点”，优选两个“主链附接点”和(ii)至少一个“系链附接点”。本文所用的“主链附接点”指官能团，例如羟基或一般地，可用于且适合于将载体合并到主链中，例如磷酸盐或修饰的磷酸盐，例如含硫的核糖核酸主链的键。在一些实施方案中，“系链附接点”(TAP)指连接选择部分的环状载体的组成环原子，例如碳原子或杂原子(不同于提供主链附接点的原子)。该部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。任选地，选择的部分通过介于系链与环状载体之间来连接。因此，环状载体通常会包括官能团，例如氨基或一般地提供适合于将另一种化学实体(例如配体)合并到或系链到组成环上的键。
RNAi剂可以经由载体与配体缀合，其中载体可以是环状基团或非环状基团；优选地，环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢化萘；优选地，非环状基团选自丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
在某些具体的实施方案中，用于本发明方法的RNAi剂是AD-57213(有义链：5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)和反义链：5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，其中A、C、G和U是核糖A、C、G或U；a、c、g和u是2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf是2’-氟A、C、G或U；且s是硫代磷酸酯键。
这些药剂可以进一步包含配体。
配体
本发明的双链RNA(dsRNA)试剂可以任选地与一个或多个配体缀合。配体可在3’-端、5’-端或两端附接于有义链、反义链或两条链。例如，配体可以与有义链缀合。在优选的实施方案中，配体与有义链的3’-端缀合。
在一个实施方案中，配体是碳水化合物缀合物例如单糖。在一个实施方案中，配体是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)GalNAc或GalNAc衍生物。在本发明的某些实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物经由单价接头附接于本发明的iRNA剂。在一些实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物经由二价接头附接于本发明的iRNA剂。在本发明的其他实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物经由三价接头附接于本发明的iRNA剂。
在一个实施方案中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物选自：
在一个实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物是GalNAc3：
在一些实施方案中，配体(例如GalNAc配体)附着于RNAi剂的3’-端。在一个实施方案中，RNAi剂如下所示与配体(例如GalNAc配体)缀合：
其中X是O或S。
在一个实施方案中，X是O。
多种实体可以与本发明的RNAi剂偶联。优选的部分是配体，其优选共价地，经由介于系链之间直接或间接偶联。
在优选的实施方案中，配体改变其所合并的分子的分布、靶向或寿命。在优选的实施方案中，当例如与没有这样的配体的物种比较时，配体为选择的靶标(例如分子、细胞或细胞类型、区室、受体，例如身体的细胞或器官区室、组织、器官或区域)提供增强的亲和力。为选择的靶标提供增强的亲和力的配体也称为靶向配体。
一些配体可具有内体溶解特性。内体溶解配体促进内体裂解和/或将本发明组合物或其组分从内体转运至细胞的细胞质。内体溶解配体可以是显示pH依赖性膜活性和融合性的聚阴离子肽或肽模拟物。在一个实施方案中，内体溶解配体在内体pH下呈现其活性构象。“活性”构象是内体溶解配体促进内体裂解和/或将本发明组合物或其组分从细胞内体转运至细胞的细胞质的构象。示例性的内体溶解配体包括GALA肽(Subbarao et al.,Biochemistry,1987,26:2964-2972),the EALA peptide(Vogel et al.,J.Am.Chem.Soc.,1996,118:1581-1586),及其衍生物(Turk et al.,Biochem.Biophys.Acta,2002,1559:56-68)。在一个实施方案中，内体溶解组分可含有化学基团(例如氨基酸)，其响应于pH的变化会经历电荷或质子化的变化。内体裂解组分可以是直链或支链的。
配体可以改善转运、杂交和特异性性质且还可以改善所得天然或经修饰的寡核糖核苷酸或包含本文所述单体和/或天然或经修饰的核糖核苷酸的任何组合的聚合物分子的核酸酶抗性。
配体通常可包括治疗改性剂，例如用于增强摄取；诊断化合物或报道基团，例如用于监测分布；交联剂；和核酸酶抗性赋予部分。一般实例包括脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多胺和肽模拟物。
配体可包括天然存在的物质，例如蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖、支链淀粉、甲壳质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，诸如合成聚合物，例如合成聚氨基酸，寡核苷酸(例如适体)。聚氨基酸的实例包括聚氨基酸是聚赖氨酸(PLL)、聚L天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。多胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、拟肽多胺、树枝状聚合物多胺、精氨酸、脒、精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可包括靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体，其结合特定细胞类型，诸如肾细胞。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、二膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物或适体。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶类)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、Texaphyrin、Sapphyrin)，多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人造内切核酸酶或螯合剂(例如EDTA)、亲脂性分子(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰)石胆酸、O3-(油酰)胆碱酸、二甲氧基三苯甲基或吩恶嗪)和肽缀合物(例如触角肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白或肽，例如对共配体具有特异性亲和力的分子或抗体，例如结合特定细胞类型(例如癌细胞、内皮细胞或骨细胞)的抗体。配体还可包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽物种，诸如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖或适体。配体可以是例如脂多糖、p38MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。
配体可以是可例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝而破坏细胞的细胞骨架来增加iRNA剂的摄入细胞的物质，例如药物。药物可以是例如分类单位、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑、japlakinolide、拉春库林A、鬼笔环肽、swinholide A、indanocine或myoservin。
配体可以通过例如激活炎症反应来增加将寡核苷酸吸收到细胞中。具有这样的作用的示例性配体包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-1β或γ干扰素。
在一个方面，配体是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许缀合物分布到靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。其他可以结合HSA的分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运至靶细胞或细胞膜，和/或(c)可用来调节与血清蛋白(例如HSA)的结合。
基于脂质的配体可用来调节，例如控制缀合物与靶组织的结合。例如，更强烈地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体会不太可能靶向肾且因此不太可能从身体清除。与HAS不太强烈地结合的脂质或基于脂质的配体可用于使缀合物靶向肾。
在优选的实施方案中，基于脂质的配体结合HSA。优选地，它以足够的亲和力结合HSA，从而缀合物会优选分布到非肾组织。然而，优选的是，亲和力不会太强以至于不能逆转HSA-配体结合。
在另一个优选的实施方案中，基于脂质的配体微弱地结合HSA或根本不结合HSA，从而缀合物会优选分布于肾。也可以使用靶向肾细胞的其他部分代替基于脂质的配体或除基于脂质的配体以外也可以使用靶向肾细胞的其他部分。
在另一个方面，配体是被靶细胞例如增殖细胞吸收的部分，例如维生素。这些对于治疗以例如恶性或非恶性类型的不想要的细胞(例如癌细胞)增殖为特征的病症特别有用。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或癌细胞摄入的其他维生素或营养素。还包括HAS、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。
在另一个方面，配体是细胞渗透剂，优选螺旋细胞渗透剂。优选地，该药剂是两亲性的。示例性药剂是诸如tat或触角的肽。如果该药剂是肽，则其可以被修饰，包括肽模拟物、逆转录酶、非肽或假肽键及使用D-氨基酸。螺旋剂优选是α-螺旋剂，其优选具有亲脂相和疏脂相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的确定的三维结构的分子。肽或肽模拟物部分可以是约5-50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状聚合物肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性的含疏水性MTS的肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:9)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:10))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，其可以跨细胞膜携带大的极性分子，包括肽、寡核苷酸和蛋白质。例如，已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:11))和果蝇触角蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:12))的序列能够起递送肽的用作。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，诸如从噬菌体展示文库或单珠粒-单化合物(OBOC)组合文库(Lam etal.,Nature,354:82-84,1991)鉴定的肽。优选地，经由合并的单体单元连接至iRNA剂的肽或肽模拟物是细胞靶向肽，诸如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度范围可为约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，诸如增加稳定性或直接构象性质。可利用下述任何结构修饰。RGD肽部分可用来靶向肿瘤细胞，诸如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(Zitzmann et al.,Cancer Res.,62:5139-43,2002)。RGD肽可以促进iRNA剂靶向多种其他组织(包括肺、肾、脾或肝)的肿瘤(Aoki et al.,Cancer GeneTherapy 8:783-787,2001)。优选地，RGD肽将促进iRNA剂靶向肾。RGD肽可以是线性的或环状的且可以是经修饰的，例如糖基化的或甲基化的以促进靶向特定组织。例如，糖基化的RGD肽可以将iRNA剂递送至表达αVβ3的肿瘤细胞(Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42:326-336,2001)。可以使用靶向富含增殖细胞的标记的肽。例如，含有肽和肽模拟物的RGD可靶向癌细胞，特别是表现整联蛋白的细胞。因此，可以使用RGD肽，含有RGD的环状肽，包括D-氨基酸的RGD肽及合成的RGD模拟物。除了RGD，可以使用靶向整联蛋白配体的其他部分。一般地，这样的配体可用来控制增殖细胞和血管生成。这类配体的优选缀合物靶向PECAM-1、VEGF或其他癌症基因，例如本文所述的癌症基因。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如微生物细胞，诸如细菌或真菌细胞或哺乳动物细胞，诸如人类细胞。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如LL-37或CeropinP1)，含二硫键的肽(例如α-防御素、β-防御素或bactenecin)或仅含有一种或两种主要氨基酸的肽(例如PR-39或吲哚素)。细胞渗透肽还可包括核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽诸如MPG，其衍生自HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31:2717-2724,2003)。
在一个实施方案中，靶向肽可以是两亲性α-螺旋肽。示例性的两亲性α-螺旋肽包括但不限于天蚕素、霉菌毒素、paradoxin、buforin、CPF、铃蟾抗菌肽样肽(BLP)、穿孔素、ceratotoxins、柄海鞘肽、盲鳗肠道抗微生物肽(HFIAP)、magainines、brevinins-2、皮抑菌肽、蜂毒素类、美洲拟鲽抗菌肽、H2A肽、非洲爪蟾肽、esculentinis-1和caerins。优选考虑许多个因素以保持螺旋稳定性的完整性。例如，会利用最大数量的螺旋稳定化残基(例如leu、ala或lys)且会利用最小数量的螺旋去稳定化残基(例如脯氨酸或环状单体单元。会考虑封端残基(例如Gly是示例性的N-封端残基和/或C-末端酰胺化可以用来提供额外的H-键以稳定螺旋。在由i±3或i±4位分开的具有相反电荷的残基之间形成盐桥可以提供稳定性。例如，阳离子残基如赖氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸或组氨酸可与阴离子残基谷氨酸或天冬氨酸形成盐桥。
肽和肽模拟物配体包括具有天然存在的或经修饰的肽的那些，例如D或L肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽；具有用一个或多个脲、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰脲键代替的一个或多个酰胺(即肽)键的肽；或环状肽。
靶向配体可以是能够靶向特定受体的任何配体。实例是：叶酸、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、糖簇例如GalNAc簇、甘露糖簇、半乳糖簇或者适体。一个簇是两个或更多个糖单位的组合。靶向配体还包括整联蛋白受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素、LDL和HDL配体。配体也可以基于核酸，例如适体。适体可以是未经修饰的或具有本文公开的修饰的任何组合。
内体释放剂包括咪唑、多聚或寡聚咪唑、PEI、肽、融合肽、聚羧酸酯、聚阳离子、掩蔽的寡聚或多聚阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚缩醛、原酸酯、带掩蔽或未掩蔽阳离子或阴离子电荷的聚合物，带有掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的树状聚合物。
PK调节剂表示药代动力学调节剂。PK调节剂包括亲脂体、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。还已知包含许多硫代磷酸酯键的寡核苷酸与血清蛋白结合，因此在主链中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸，例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，作为配体(例如作为PK调节配体)也适用于本发明。
此外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适体作为PK调节配体也适用于本发明。
适用于本发明的其他配体缀合物在于2004年8月10日提交的美国专利申请USSN:10/916,185；于2004年9月21日提交的USSN:10/946,873；于2007年8月3日提交的USSN:10/833,934；于2005年4月27日提交的USSN:11/115,989和于2007年11月21日提交的USSN:11/944,227中描述，出于所有目的通过引用以它们的整体并入。
当存在两种或更多种配体时，配体可以全部具有相同的性质，都具有不同的性质或者一些配体具有相同的性质，而另一些配体具有不同的性质。例如，配体可以具有靶向性质，具有内体裂解活性或具有PK调节性质。在优选的实施方案中，所有配体具有不同的性质。
配体可以在各种位置(例如3’-端、5’-端和/或内部位置)与寡核苷酸偶联。在优选的实施方案中，配体经由插入的系链(例如本文所述的载体)附接于寡核苷酸。当单体合并到生长链中时，配体或系链的配体可以存在于单体上。在一些实施方案中，可以在将“前体”单体合并到生长链中后，经由与“前体”单体偶联来合并配体。例如，可以将具有例如氨基末端系链(即不具有缔合配体)的单体例如TAP-(CH2)nNH2合并到生长核苷酸链中。在随后的操作中，即在将前体单体合并到该链中后，具有亲电基团例如五氟苯基酯或醛基的配体随后可以通过将配体的亲电子基团与前体单体系链的末端亲核基团偶联附接于前体单体。
在另一个实例中，可以合并具有适于参与点击化学反应的化学基团的单体，例如叠氮化物或炔末端的系链/接头。在随后的操作中，即在将前体单体合并到链中后，具有互补化学基团的配体，例如炔烃或叠氮化物可通过将炔烃和叠氮化物偶联在而附接于前体单体。
对于双链寡核苷酸，配体可以附接于一条或两条链。在一些实施方案中，双链iRNA剂含有与有义链缀合的配体。在其他实施方案中，双链iRNA剂含有与反义链缀合的配体。
在一些实施方案中，配体可以与核酸分子的核碱基、糖部分或核苷间键缀合。嘌呤核碱基或其衍生物的偶联可以发生在任何位置，包括内环和外环原子。在一些实施方案中，嘌呤核苷碱基的2-、6-、7-或8-位附接于缀合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的偶联也可以发生在任何位置。在一些实施方案中，嘧啶核碱基的2-、5-和6-位可以被缀合物部分取代。与核苷的糖部分的缀合可以发生在任何碳原子上。可以附接于缀合物部分的糖部分的碳原子的实例包括2’、3’和5’碳原子。1’位也可以附接于缀合部分，诸如在无碱残基中。核苷间键也可以带有共轭部分。对于含磷键(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯等)，缀合物部分可以直接附接于磷原子或附接于与磷原子结合的O、N或S原子。对于含胺或酰胺的核苷间键(例如PNA)，缀合物部分可附接于胺或酰胺的氮原子或附接于相邻的碳原子。
尽管配体通常是碳水化合物例如单糖(诸如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、多糖，但是可以使用RNA干扰领域中的任何适合的配体。
将配体与核酸缀合的接头包括上面讨论的那些。例如，配体可以是通过一价、二价或三价支化接头附接的一个或多个GalNAc(N-乙酰葡糖胺)衍生物。
在一个实施方案中，本发明的dsRNA与二价和三价支化接头缀合，包括式(IV)-(VII)中的任一个所示的结构：
其中
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C在每次出现时独立地表示0-20且其中所述重复单元可以相同或不同；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C各自在每次出现时独立地为不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C在每次出现时独立地为不存在、亚烷基、取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被一个或多个O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)中断或终止；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C各自在每次出现时独立地为不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体；即各自在每次出现时独立地表示单糖(诸如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；和
Ra是H或氨基酸侧链。
三价缀合GalNAc衍生物特别适用于与RNAi剂一起用于抑制靶基因表达，诸如式(VII)的那些：
其中L5A、L5B和L5C表示单糖诸如GalNAc衍生物。
缀合GalNAc衍生物的合适的二价和三价支化接头基团的实例包括但不限于以下化合物：
教导制备RNA缀合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928and 5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022,其每一个的全部内容通过引用由此并入本文。
对于给定化合物中的所有位置不必均匀地被修饰且实际上不止一种上述修饰可以合并到单一化合物中或甚至合并到iRNA内的单个核苷内。本发明还包括iRNA化合物即嵌合化合物。
在本发明的上下文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，优选dsRNA，其含有两个或更多个化学上不同的区域，每个由至少一个单体单元组成，即在dsRNA化合物的情况下的核苷酸。这些iRNA通常含有至少一个区域，其中RNA被修饰以赋予iRNA增加的对核酸酶降解的抗性，增加的细胞摄取和/或对靶核酸的增加的结合亲和力。iRNA的另外的区域可以作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。举例来说，RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶标的切割，由此大大增强了iRNA抑制基因表达的效率。因此，当使用嵌合dsRNA时，与相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，使用较短的iRNA通常可以获得可比较的结果。可以通过凝胶电泳常规检测RNA靶标的切割且如果必要的话，可以通过本领域已知的相关核酸杂交技术检测。
在某些情况下，iRNA的RNA可以被非配体基团修饰。许多非配体分子已经与iRNA缀合以增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取且在科学文献中可以获得进行这样的缀合的步骤。这样的非配体部分包括脂质部分，诸如胆固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1):54-61；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553)，胆酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan etal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765)，硫代胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20:533)，脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10:111；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259:327；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75:49)，磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18:3777)，多元胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969)或金刚烷乙酸(Manoharan et al.,TetrahedronLett.,1995,36:3651)，棕榈基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)或十八胺或己氨基-羰基-氧胆固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923)。以上列出了教导制备这样的RNA缀合物的代表性美国专利。典型的缀合方案涉及在序列的一个或多个位置合成具有氨基接头的RNA。然后使用适当的偶联或活化试剂使氨基与被缀合的分子反应。缀合反应可以在溶液相中与仍然与固体支持物结合的RNA或在切割RNA后进行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常提供纯的缀合物。
在一些实施方案中，本发明的双链RNAi剂是AD-57213。
VI.本发明的iRNA的递送
将本发明的iRNA递送至细胞，例如受试者，诸如人受试者(例如有此需要的受试者，诸如具有出血病症的受试者)内的细胞，可以在许多不同的方式实现。例如，可以通过体外或体内使细胞与本发明的iRNA接触来进行递送。可以通过向受试者施用包含iRNA(例如dsRNA)的组合物直接进行体内递送。或者，可以通过施用编码和指导iRNA表达的一个或多个载体间接进行体内递送。以下进一步讨论这些替代方案。
一般地，递送核酸分子的任何方法(体外或体内)可适用于本发明的iRNA(参见例如Akhtar S.and Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5):139-144和WO94/02595，其通过引用以其整体并入本文。为了体内递送，为了递送iRNA分子而考虑的因素包括例如递送的分子的生物学稳定性、防止非特异性效应和递送的分子在靶组织中的积聚。iRNA的非特异性效应可通过局部施用，例如通过直接注射或植入组织或局部施用制剂来最小化。对治疗部位的局部施用使药剂的局部浓度最大化，限制了药剂暴露于否则可被该药剂损害或可降解该药剂的全身组织且允许施用较低总剂量的iRNA分子。几项研究表明当iRNA在局部施用时成功敲减基因产物。例如，通过食蟹猴的玻璃体内注射(Tolentino,MJ.,et al(2004)Retina 24:132-138)和小鼠的视网膜下注射(Reich,SJ.,et al(2003)Mol.Vis.9:210-216)进行VEGF dsRNA的眼内递送都显示出在年龄相关性黄斑变性的实验模型中预防新血管形成。此外，在小鼠中直接瘤内注射dsRNA减少肿瘤体积(Pille,J.,et al(2005)Mol.Ther.11:267-274)且可以延长具有肿瘤的小鼠的存活(Kim,WJ.,et al(2006)Mol.Ther.14:343-350；Li,S.,et al(2007)Mol.Ther.15:515-523)。RNA干扰也显示出成功通过直接注射局部递送至CNS(Dorn,G.,et al.(2004)Nucleic Acids 32:e49；Tan,PH.,etal(2005)Gene Ther.12:59-66；Makimura,H.,et al(2002)BMC Neurosci.3:18；Shishkina,GT.,et al(2004)Neuroscience 129:521-528；Thakker,ER.,et al(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:17270-17275；Akaneya,Y.,et al(2005)J.Neurophysiol.93:594-602)和通过鼻内给药递送至肺(Howard,KA.,et al(2006)Mol.Ther.14:476-484；Zhang,X.,et al(2004)J.Biol.Chem.279:10677-10684；Bitko,V.,et al(2005)Nat.Med.11:50-55)。为了系统地施用iRNA用于治疗疾病，可以使用药物递送系统修饰或交替递送RNA；两种方法都起到防止体内内和外核酸酶快速降解dsRNA的作用。RNA或药物载体的修饰还可以允许iRNA组合物靶向靶组织且避免不希望的脱靶效应。iRNA分子可以通过化学缀合至亲脂基团诸如胆固醇来修饰以增强细胞摄取并防止降解。例如，将针对与亲脂性胆固醇部分缀合的ApoB的iRNA全身注射到小鼠中并导致肝脏和空肠中apoB mRNA的敲减(Soutschek,J.,et al(2004)Nature432:173-178)。已显示iRNA与适体的缀合抑制肿瘤生长并介导前列腺癌的小鼠模型中的肿瘤消退(McNamara,JO.,et al(2006)Nat.Biotechnol.24:1005-1015)。在一个替代实施方案中，可以使用药物递送系统，诸如纳米颗粒、树状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送系来统递送iRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进iRNA分子(带负电荷的)的结合且也增强带负电荷的细胞膜上的相互作用以允许细胞有效摄取iRNA。阳离子脂质、树状聚合物或聚合物可以与iRNA结合或诱导形成囊泡或胶束(参见例如Kim SH.,et al(2008)Journal of Controlled Release 129(2):107-116)，其包含iRNA。囊泡或胶束的形成进一步防止了系统施用时iRNA的降解。制备和施用阳离子-iRNA复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如Sorensen,DR.,etal(2003)J.Mol.Biol 327:761-766；Verma,UN.,et al(2003)Clin.Cancer Res.9:1291-1300；Arnold,AS et al(2007)J.Hypertens.25:197-205，其通过引用以其整体并入本文)。可用于系统递送iRNA的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP((Sorensen,DR.,etal(2003),supra；Verma,UN.,et al(2003),同上)，Oligofectamine，“固体核酸颗粒”(Zimmermann,TS.,et al(2006)Nature 441:111-114)，心磷脂(Chien,PY.,et al(2005)Cancer Gene Ther.12:321-328；Pal,A.,et al(2005)Int J.Oncol.26:1087-1091)，聚乙烯亚胺(Bonnet ME.,et al(2008)Pharm.Res.Aug 16Epub ahead of print；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)，Arg-Gly-Asp(RGD)肽Arg-Gly-Asp(RGD)和聚酰胺胺(Tomalia,DA.,et al(2007)Biochem.Soc.Trans.35:61-67；Yoo,H.,et al(1999)Pharm.Res.16:1799-1804)。在一些实施方案中，iRNA与环糊精形成复合物用于系统施用。用于iRNA和环糊精的施用方法和药物组合物可在美国专利号7,427,605中找到，其通过引用以其整体并入本文。
A.本发明的载体编码iRNA
靶向Serpinc1基因的iRNA可以从插入DNA或RNA载体的转录单元表达(参见例如Couture,A,et al.,TIG.(1996),12:5-10；Skillern,A.,et al.,PCT国际公开号WO 00/22113,Conrad,PCT国际公开号WO 00/22114,和Conrad,美国专利号6,054,299)。表达可以是短暂的(数小时至数周)或持续的(数周至数月或更长)，取决于使用的特定构成和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，其可以是整合载体或非整合载体。还可构建转基因以允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:1292)。
iRNA的单条链或多条链可以从表达载体上的启动子转录。当要表达两条单独的链以生成例如dsRNA时，可以将两个单独的表达载体共引入(例如通过转染或感染)到靶细胞中。或者，dsRNA的每条单链可以通过两者均位于相同表达质粒上的启动子转录。在一个实施方案中，dsRNA表达为通过接头多核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸，从而dsRNA具有茎和环结构。
iRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体，优选与脊椎动物细胞相容的那些，可用来产生用于表达iRNA的重组构建体，如本文所述的。真核细胞表达载体在本领域中是公知的且可以从许多商业来源获得。一般地，提供这样的载体，其含有用于插入所希望的核酸区段的方便的限制性位点。iRNA表达载体的递送可以是系统性的，诸如通过静脉内或肌肉内施用，通过施用于从患者外植的靶细胞然后再引入患者内或通过允许引入希望的靶细胞的任何其他手段。
可以将iRNA表达质粒作为与阳离子脂质载体(例如Oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(例如Transit-TKOTM)的复合物转染到靶细胞中。本发明还考虑到在一周或更长时期内靶向靶RNA的不同区域的iRNA介导的敲减的多个脂质转染。可以使用多种已知的方法监测载体向宿主细胞的成功引入。例如，可以用报道分子(诸如荧光标记，诸如绿色荧光蛋白(GFP))发信号通知瞬时转染。使用提供转染的细胞对特定环境因子(例如抗生素和药物)的抗性的标记(例如潮霉素B抗性)可以确保体外稳定转染细胞。
可以与本文描述的方法和组合物一起利用的病毒载体系统包括但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头状瘤病毒载体；(h)小RNA病毒载体；(i)痘病毒载体，诸如正痘病毒，例如痘苗病毒载体或禽痘病毒载体，例如金丝雀痘或鸡痘；和(j)辅助依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可能是有利的。不同的载体将会或不会合并到细胞的基因组中。如果需要的话，构建体可包括用于转染的病毒序列。或者，可以将构建体合并到能够附加体复制的载体(例如EPV和EBV载体)中。用于重组表达iRNA的构建体通常会需要调节元件，例如启动子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。以下将进一步描述针对载体和构建体考虑的其他方面。
用于递送iRNA的载体会包括足以用于在希望的靶细胞或组织中表达iRNA的调节元件(启动子、增强子等)。可以选择调节元件来提供组成型或调节型/诱导型表达。
可以例如通过使用对某些生理调节器(例如循环葡萄糖水平或激素)敏感的诱导型调节序列来精确调节iRNA的表达(Docherty et al.,1994,FASEB J.8:20-24)。适用于控制细胞或哺乳动物中dsRNA表达的这样的诱导型表达系统包括例如通过蜕皮激素、通过雌激素、黄体酮、四环素、二聚化学诱导剂和异丙基-β-D1-硫代半乳糖苷(IPTG)的调节。本领域技术人员将能够基于iRNA转基因的预期用途来选择合适的调节/启动子序列。
可以使用含有编码iRNA的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller et al.,Meth.Enzymol.217:581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组并整合到宿主细胞DNA中所必需的组分。编码iRNA的核酸序列被克隆到一个或多个载体中，这有助于将核酸递送到患者体内。关于逆转录病毒载体的更多细节可见于例如Boesen et al.,Biotherapy 6:291-302(1994)，其描述了使用逆转录病毒载体将mdr1基因递送至造血干细胞以使干细胞对化疗更具抗性。说明逆转录病毒载体在基因治疗中的用途的其他参考文献是：Clowes et al.,J.Clin.Invest.93:644-651(1994)；Kiem etal.,Blood 83:1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg,Human Gene Therapy 4:129-141(1993)；and Grossman and Wilson,Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114(1993)。考虑使用的慢病毒载体包括例如在美国专利号6,143,520；5,665,557；和5,981,276中描述的基于HIV的载体，其通过引用并入本文。
还预期腺病毒用于递送本发明的iRNA。腺病毒是特别有吸引力的运载体，例如用于将基因递送至呼吸道上皮细胞。腺病毒自然感染呼吸道上皮，引起轻微的疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky and Wilson,Current Opinion in Genetics andDevelopment 3:499-503(1993)提出了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout et al.,HumanGene Therapy 5:3-10(1994)证明了使用腺病毒载体将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮。在基因治疗中使用腺病毒的其他例子可以在Rosenfeld et al.,Science 252:431-434(1991)；Rosenfeld et al.,Cell 68:143-155(1992)；Mastrangeli et al.,J.Clin.Invest.91:225-234(1993)；PCT Publication WO94/12649；和Wang,et al.,GeneTherapy 2:775-783(1995)找到。Xia H et al.(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010中描述了用于表达本发明表征的iRNA的合适AV载体，构建重组AV载体的方法及将载体递送入靶细胞的方法。
腺相关病毒(AAV)载体也可用于递送本发明的iRNA(Walsh et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300(1993)；U.S.Pat.No.5,436,146)。在一个实施方案中，iRNA可以表达为来自具有例如U6或H1RNA启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子的重组AAV载体的两个单独的互补单链RNA分子。用于表达本发明表征的dsRNA的合适的AAV载体，用于构建重组AV载体的方法和将载体递送到靶细胞中的方法在Samulski R et al.(1987),J.Virol.61:3096-3101；Fisher K J et al.(1996),J.Virol,70:520-532；Samulski R etal.(1989),J.Virol.63:3822-3826；美国专利号5,252,479；U.S.Pat.No.5,139,941；国际专利申请号WO 94/13788；和国际专利申请号WO 93/24641(其全部公开内容通过引用并入本文)中描述。
适用于递送本发明的iRNA的另外的病毒载体是痘病毒，诸如痘苗病毒，例如减毒的痘苗诸如改良的安卡拉(MVA)或NYVAC，禽痘例如鸡痘或金丝雀痘。
病毒载体的趋向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原假型化载体或通过用适当的替代不同的病毒衣壳蛋白来改良。例如，慢病毒载体可以用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉病毒、莫科拉病毒等的表面蛋白假型化。可以通过工程改造载体以表达不同的衣壳蛋白血清型来使AAV载体靶向不同的细胞；参见例如RabinowitzJ E et al.(2002),J Virol 76:791-801，其全部公开内容通过引用并入本文。
载体的药物制剂可以将载体包括在可接受的稀释剂中或者可以包括其中嵌入基因递送载体的缓释基质。或者，当完整的基因递送载体可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整产生时，药物制剂可以包括产生基因递送系统的一种或多种细胞。
V.本发明的药物组合物
本发明还提供包括本发明的iRNA的药物组合物和制剂。在一个实施方案中，本文提供含有iRNA的药物组合物和药用载体，如本文所述的。含有iRNA的药物组合物可用于治疗与Serpinc1基因的表达或活性有关的疾病或病症，例如Serpinc1相关疾病。基于递送模式配制这样的药物组合物。一个实例是配制用于经由胃肠外递送(例如通过皮下(SC)或静脉内(IV)递送)系统施用的组合物。另一个例子是配制用于直接递送到脑实质中(例如通过输注到脑中，诸如通过连续泵输注)的组合物。本发明的药物组合物可以足以抑制Serpinc1基因表达的剂量施用。
在本发明的某些实施方案中，例如当药物组合物包含双链RNAi剂时，包括在3个连续核苷酸上具有3个相同修饰的一个或多个基序，包括在该试剂的切割位点或附近的一个这样的基序、六个硫代磷酸酯键和GalNAc配体，这样的组合物以0.200至约1.825mg/kg、0.200至约1.800mg/kg、约0.200至约1.700mg/kg、约0.200至约1.600mg/kg、约0.200至约1.500mg/kg、约0.200至约1.400mg/kg、约0.200至约1.400mg/kg、约0.200至约1.200mg/kg、约0.200至约1.100mg/kg、约0.200至约1.000mg/kg、约0.200至约0.900mg/kg、约0.200至约0.800mg/kg、约0.200至约0.700mg/kg、约0.200至约0.600mg/kg、约0.200至约0.500mg/kg、约0.200至约0.400mg/kg、约0.225至约1.825mg/kg、约0.225至约1.800mg/kg、约0.225至约1.700mg/kg、约0.225至约1.600mg/kg、约0.225至约1.500mg/kg、约0.225至约1.400mg/kg、约0.225至约1.400mg/kg、约0.225至约1.200mg/kg、约0.225至约1.100mg/kg、约0.225至约1.000mg/kg、约0.225至约0.900mg/kg、约0.225至约0.800mg/kg、约0.225至约0.700mg/kg、约0.225至约0.600mg/kg、约0.225至约0.500mg/kg、约0.225至约0.400mg/kg、约0.250至约1.825mg/kg、约0.250至约1.800mg/kg、约0.250至约1.700mg/kg、约0.250至约1.600mg/kg、约0.250至约1.500mg/kg、约0.250至约1.400mg/kg、约0.250至约1.400mg/kg、约0.250至约1.200mg/kg、约0.250至约1.100mg/kg、约0.250至约1.000mg/kg、约0.250至约0.900mg/kg、约0.250至约0.800mg/kg、约0.250至约0.700mg/kg、约0.250至约0.600mg/kg、约0.250至约0.500mg/kg、约0.250至约0.400mg/kg、约0.425至约1.825mg/kg、约0.425至约1.800mg/kg、约0.425至约1.700mg/kg、约0.425至约1.600mg/kg、约0.425至约1.500mg/kg、约0.425至约1.400mg/kg、约0.425至约1.400mg/kg、约0.425至约1.200mg/kg、约0.425至约1.100mg/kg、约0.425至约1.000mg/kg、约0.425至约0.900mg/kg、约0.425至约0.800mg/kg、约0.425至约0.700mg/kg、约0.425至约0.600mg/kg、约0.425至约0.500mg/kg、约0.450至约1.825mg/kg、约0.450至约1.800mg/kg、约0.450至约1.700mg/kg、约0.450至约1.600mg/kg、约0.450至约1.500mg/kg、约0.450至约1.400mg/kg、约0.450至约1.400mg/kg、约0.450至约1.200mg/kg、约0.450至约1.100mg/kg、约0.450至约1.000mg/kg、约0.450至约0.900mg/kg、约0.450至约0.800mg/kg、约0.450至约0.700mg/kg、约0.450至约0.600mg/kg、约0.450至约0.500mg/kg、约0.475至约1.825mg/kg、约0.475至约1.800mg/kg、约0.475至约1.700mg/kg、约0.475至约1.600mg/kg、约0.475至约1.500mg/kg、约0.475至约1.400mg/kg、约0.475至约1.400mg/kg、约0.475至约1.200mg/kg、约0.475至约1.100mg/kg、约0.475至约1.000mg/kg、约0.475至约0.900mg/kg、约0.475至约0.800mg/kg、约0.475至约0.700mg/kg、约0.475至约0.600mg/kg、约0.475至约0.500mg/kg、约0.875至约1.825mg/kg、约0.875至约1.800mg/kg、约0.875至约1.700mg/kg、约0.875至约1.600mg/kg、约0.875至约1.500mg/kg、约0.875至约1.400mg/kg、约0.875至约1.400mg/kg、约0.875至约1.200mg/kg、约0.875至约1.100mg/kg、约0.875至约1.000mg/kg、约0.875至约0.900mg/kg、约0.900至约1.825mg/kg、约0.900至约1.800mg/kg、约0.900至约1.700mg/kg、约0.900至约1.600mg/kg、约0.900至约1.500mg/kg、约0.900至约1.400mg/kg、约0.900至约1.400mg/kg、约0.900至约1.200mg/kg、约0.900至约1.100mg/kg、约0.900至约1.000mg/kg、约0.925至约1.825mg/kg、约0.925至约1.800mg/kg、约0.925至约1.700mg/kg、约0.925至约1.600mg/kg、约0.925至约1.500mg/kg、约0.925至约1.400mg/kg、约0.925至约1.400mg/kg、约0.925至约1.200mg/kg、约0.925至约1.100mg/kg或约0.925至约1.000mg/kg的剂量施用。上述列举值中间的值和范围也是本发明的一部分，例如RNAi剂可以约0.015至约0.45mg/mg的剂量向受试者施用。
例如，RNAi剂，例如药物组合物中的RNAi剂，可以约0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg、约0.5mg/kg、0.525mg/kg、0.55mg/kg、0.575mg/kg、约0.6mg/kg、0.625mg/kg、0.65mg/kg、0.675mg/kg、约0.7mg/kg、0.725mg/kg、0.75mg/kg、0.775mg/kg、约0.8mg/kg、0.925mg/kg、0.95mg/kg、0.975mg/kg、约1.0mg/kg、1.025mg/kg、1.05mg/kg、1.075mg/kg、约1.1mg/kg、1.125mg/kg、1.15mg/kg、1.175mg/kg、约1.2mg/kg、1.225mg/kg、1.25mg/kg、1.275mg/kg、约1.3mg/kg、1.325mg/kg、1.35mg/kg、1.375mg/kg、约1.4mg/kg、1.425mg/kg、1.45mg/kg、1.475mg/kg、约1.5mg/kg、1.525mg/kg、1.55mg/kg、1.575mg/kg、约1.6mg/kg、1.625mg/kg、1.65mg/kg、1.675mg/kg、约1.7mg/kg、1.725mg/kg、1.75mg/kg、1.775mg/kg或约1.8mg/kg的剂量施用。上述列举值中间的值也是本发明的一部分。
在本发明的一些实施方案中，例如当双链RNAi剂包含有义链和反义链，反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸且其中有义链与附接在3’-末端的配体缀合时，药物组合物中的这样的药剂以约0.200至约1.825mg/kg、0.200至约1.800mg/kg、约0.200至约1.700mg/kg、约0.200至约1.600mg/kg、约0.200至约1.500mg/kg、约0.200至约1.400mg/kg、约0.200至约1.400mg/kg、约0.200至约1.200mg/kg、约0.200至约1.100mg/kg、约0.200至约1.000mg/kg、约0.200至约0.900mg/kg、约0.200至约0.800mg/kg、约0.200至约0.700mg/kg、约0.200至约0.600mg/kg、约0.200至约0.500mg/kg、约0.200至约0.400mg/kg、约0.225至约1.825mg/kg、约0.225至约1.800mg/kg、约0.225至约1.700mg/kg、约0.225至约1.600mg/kg、约0.225至约1.500mg/kg、约0.225至约1.400mg/kg、约0.225至约1.400mg/kg、约0.225至约1.200mg/kg、约0.225至约1.100mg/kg、约0.225至约1.000mg/kg、约0.225至约0.900mg/kg、约0.225至约0.800mg/kg、约0.225至约0.700mg/kg、约0.225至约0.600mg/kg、约0.225至约0.500mg/kg、约0.225至约0.400mg/kg、约0.250至约1.825mg/kg、约0.250至约1.800mg/kg、约0.250至约1.700mg/kg、约0.250至约1.600mg/kg、约0.250至约1.500mg/kg、约0.250至约1.400mg/kg、约0.250至约1.400mg/kg、约0.250至约1.200mg/kg、约0.250至约1.100mg/kg、约0.250至约1.000mg/kg、约0.250至约0.900mg/kg、约0.250至约0.800mg/kg、约0.250至约0.700mg/kg、约0.250至约0.600mg/kg、约0.250至约0.500mg/kg、约0.250至约0.400mg/kg、约0.425至约1.825mg/kg、约0.425至约1.800mg/kg、约0.425至约1.700mg/kg、约0.425至约1.600mg/kg、约0.425至约1.500mg/kg、约0.425至约1.400mg/kg、约0.425至约1.400mg/kg、约0.425至约1.200mg/kg、约0.425至约1.100mg/kg、约0.425至约1.000mg/kg、约0.425至约0.900mg/kg、约0.425至约0.800mg/kg、约0.425至约0.700mg/kg、约0.425至约0.600mg/kg、约0.425至约0.500mg/kg、约0.450至约1.825mg/kg、约0.450至约1.800mg/kg、约0.450至约1.700mg/kg、约0.450至约1.600mg/kg、约0.450至约1.500mg/kg、约0.450至约1.400mg/kg、约0.450至约1.400mg/kg、约0.450至约1.200mg/kg、约0.450至约1.100mg/kg、约0.450至约1.000mg/kg、约0.450至约0.900mg/kg、约0.450至约0.800mg/kg、约0.450至约0.700mg/kg、约0.450至约0.600mg/kg、约0.450至约0.500mg/kg、约0.475至约1.825mg/kg、约0.475至约1.800mg/kg、约0.475至约1.700mg/kg、约0.475至约1.600mg/kg、约0.475至约1.500mg/kg、约0.475至约1.400mg/kg、约0.475至约1.400mg/kg、约0.475至约1.200mg/kg、约0.475至约1.100mg/kg、约0.475至约1.000mg/kg、约0.475至约0.900mg/kg、约0.475至约0.800mg/kg、约0.475至约0.700mg/kg、约0.475至约0.600mg/kg、约0.475至约0.500mg/kg、约0.875至约1.825mg/kg、约0.875至约1.800mg/kg、约0.875至约1.700mg/kg、约0.875至约1.600mg/kg、约0.875至约1.500mg/kg、约0.875至约1.400mg/kg、约0.875至约1.400mg/kg、约0.875至约1.200mg/kg、约0.875至约1.100mg/kg、约0.875至约1.000mg/kg、约0.875至约0.900mg/kg、约0.900至约1.825mg/kg、约0.900至约1.800mg/kg、约0.900至约1.700mg/kg、约0.900至约1.600mg/kg、约0.900至约1.500mg/kg、约0.900至约1.400mg/kg、约0.900至约1.400mg/kg、约0.900至约1.200mg/kg、约0.900至约1.100mg/kg、约0.900至约1.000mg/kg、约0.925至约1.825mg/kg、约0.925至约1.800mg/kg、约0.925至约1.700mg/kg、约0.925至约1.600mg/kg、约0.925至约1.500mg/kg、约0.925至约1.400mg/kg、约0.925至约1.400mg/kg、约0.925至约1.200mg/kg、约0.925至约1.100mg/kg或约0.925至约1.000mg/kg的剂量施用。上述列举值中间的值和范围也是本发明的一部分，例如RNAi剂可以约0.015mg/kg至约0.45mg/kg的剂量向受试者施用。
例如，RNAi剂，例如药物组合物中的RNAi剂，可以约0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg、约0.5mg/kg、0.525mg/kg、0.55mg/kg、0.575mg/kg、约0.6mg/kg、0.625mg/kg、0.65mg/kg、0.675mg/kg、约0.7mg/kg、0.725mg/kg、0.75mg/kg、0.775mg/kg、约0.8mg/kg、0.925mg/kg、0.95mg/kg、0.975mg/kg、约1.0mg/kg、1.025mg/kg、1.05mg/kg、1.075mg/kg、约1.1mg/kg、1.125mg/kg、1.15mg/kg、1.175mg/kg、约1.2mg/kg、1.225mg/kg、1.25mg/kg、1.275mg/kg、约1.3mg/kg、1.325mg/kg、1.35mg/kg、1.375mg/kg、约1.4mg/kg、1.425mg/kg、1.45mg/kg、1.475mg/kg、约1.5mg/kg、1.525mg/kg、1.55mg/kg、1.575mg/kg、约1.6mg/kg、1.625mg/kg、1.65mg/kg、1.675mg/kg、约1.7mg/kg、1.725mg/kg、1.75mg/kg、1.775mg/kg或约1.8mg/kg的剂量施用。上述列举值中间的值也是本发明的一部分。
在一些实施方案中，包含iRNA剂的药物组合物以固定剂量向受试者施用。“固定剂量”(例如mg的剂量)意指对于所有受试者使用一个剂量的iRNA剂，而不管任何具体受试者相关的因素诸如体重。在一个特定的实施方案中，本发明的iRNA剂的固定剂量基于预定的体重或年龄。
在一些实施方案中，包含iRNA剂的药物组合物以约25mg至约100mg，例如约25mg至约95mg、约25mg至约90mg、约25mg至约85mg、约25mg至约80mg、约25mg至约75mg、约25mg至约70mg、约25mg至约65mg、约25mg至约60mg、约25mg至约50mg、约50mg至约100mg、约50mg至约95mg、约50mg至约90mg、约50mg至约85mg、约50mg至约80mg、约30mg至约100mg、约30mg至约90mg、约30mg至约80mg、约40mg至约100mg、约40mg至约90mg、约40mg至约80mg、约60mg至约100mg、约60mg至约90mg、约25mg至约55mg、约30mg至约95mg、约30mg至约85mg、约30mg至约75mg、约30mg至约65mg、约30mg至约55mg、约40mg至约95mg、约40mg至约85mg、约40mg至约75mg、约40mg至约65mg、约40mg至约55mg或约45mg至约95mg的固定剂量施用。
在一些实施方案中，包含iRNA剂的药物组合物以约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg或约100mg的固定剂量施用。
包含iRNA的药物组合物可以约每月一次、约每5周一次、约每6周一次、约每2个月一次或每季度一次向受试者施用。
包含iRNA剂的药物组合物可作为一个或多个剂量向受试者施用。在一些实施方案中，可将包含双链iRNA剂的药物组合物以约0.200mg/kg至约0.250mg/kg的月剂量、约0.425mg/kg至约0.475mg/kg的月剂量、约0.875mg/kg至约0.925mg/kg的月剂量或约1.775mg/kg至约1.825mg/kg的月剂量向受试者施用。在一些实施方案中，包含双链iRNA剂的药物组合物可以约25mg至约100mg，例如约25mg、约50mg、约80mg或约100mg的固定剂量向受试者施用。
药物组合物可以通过静脉内输注施用一段时间例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21、22、23、24或约25分钟。例如，可以定期重复施用，诸如每周一次、每两周一次(即每两周)、每月一次、每两个月、每三个月、每四个月或更长时间。在最初的治疗方案后，治疗可以较低的频率基础施用。例如，在每周一次或每两周一次施用三个月后，可以每月重复施用一次，持续六个月或一年或更长。
药物组合物可以每天施用一次或者iRNA可以在一天内以适当的间隔以两次、三次或更多次亚剂量施用或甚至使用连续输注或通过控释制剂递送。在这种情况下，为了达到总日剂量，每个亚剂量中所含的iRNA必须相应较小。剂量单位也可以配制用于在几天以内递送，例如使用常规持续释放制剂，其在几天时间以内提供iRNA的持续释放。持续释放制剂是本领域中公知的且特别适用于在特定部位递送药剂，诸如可以与本发明的药剂一起使用。在该实施方案中，剂量单位含有日剂量的相应倍数。
在其他实施方案中，单剂量的药物组合物可以是持久的，从而后续剂量以不超过1、2、3、4、5、6、7或8周的间隔施用。在本发明的一些实施方案中，本发明的药物组合物的单剂量每月施用一次。
本领域技术人员将认识到，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。本发明所涵盖的个体iRNA的有效剂量和体内半衰期的估计可以使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试进行，如本文其他地方所述。
小鼠遗传学的进展已经生成了许多用于研究多种人类疾病的小鼠模型，诸如会受益于Serpinc1表达减少的出血病症。这样的模型可以用于iRNA的体内测试及确定治疗有效剂量。合适的小鼠模型是本领域已知的且包括例如A型血友病小鼠模型和B型血友病小鼠模型，例如含有凝血因子基因敲除的小鼠，诸如在Bolliger,et al.(2010)Thromb Haemost103:1233-1238,Bi L,et al.(1995)Nat Genet 10:119-21,Lin et al.(1997)Blood 90:3962-6,Kundu et al.(1998)Blood 92:168-74,Wang et al.(1997)Proc Natl Acad SciU S A 94:11563-6,and Jin,et al.(2004)Blood 104:1733中描述的。
根据是否希望局部或系统治疗及待治疗的区域，本发明的药物组合物可以以多种方式施用。施用可以是局部的(例如通过透皮贴剂)、肺部的，例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过雾化器；气管内、鼻内、表皮和透皮，口服或胃肠外。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；皮下，例如经由植入装置；或颅内，例如通过脑实质内、鞘内或心室内施用。
iRNA可以靶向特定组织例如肝脏(例如肝脏的肝细胞)的方式递送。
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体和粉末。常规的药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可能是必需的或希望的。带涂层的避孕套、手套等也可能是有用的。合适的局部制剂包括其中本发明表征的iRNA与局部递送剂诸如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。局部制剂在美国专利号6,747,014中详细描述，其通过引用并入本文。
A.其他制剂
i.乳液
本发明的组合物可以制备并配制成乳液。乳液通常是一种液体以直径通常超过0.1m的液滴的形式分散在另一种液体中的非均相系统(参见例如Ansel’s PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335；Higuchi et al.,in Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常是双相系统，包括彼此紧密混合和分散的两种不混溶的液相。一般地，乳液可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)种类。当水相细分成微小液滴并分散到大量油相中时，所得组合物称为油包水(w/o)乳液。或者，当将油相细分成微小液滴并分散到大量水相中时，所得组合物称为水包油(o/w)乳液。除分散相外，乳液还可含有其他组分且活性药物可作为溶液存在于水相，油相或其自身中作为分离相。药物赋形剂诸如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂也可按需要存在于乳液中。药物乳液也可以是由多于两相组成的多重乳液，诸如例如，在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况下。这样的复杂的制剂通常提供简单的二元乳液不具有的某些优点。其中o/w乳液的个体油滴包围小水滴的多重乳液构成w/o/w乳液。同样地，封闭在稳定在油性连续相中的水珠中的油滴系统提供o/w/o乳液。
乳液的特征在于很少或没有热力学稳定性。通常，乳液的分散或不连续相很好地分散到外部或连续相中并通过乳化剂或配制剂的粘度保持在这种形式。乳液的任一相都可以是半固体或固体，如乳液型软膏基质和乳霜的情况。稳定乳液的其他手段需要使用可以合并到乳液任一相中的乳化剂。乳化剂可大体分为四类：合成表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质和精细分散的固体(参见例如Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,LippincottWilliams&Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成表面活性剂，也称为表面活性剂，已经发现广泛应用于乳液的配制且已经在文献中进行了综述(参见例如Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,LippincottWilliams&Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,inPharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger andBanker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。表面活性剂通常是两亲性的且包含亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水性与疏水性性质的比率被称为亲水性/亲油性平衡(HLB)且是在制剂制备中对表面活性剂进行分类和选择的有价值的工具。基于亲水基团的性质，可以将表面活性剂分为不同种类：非离子型、阴离子型、阳离子型和两性型(参见例如Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Riegerand Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
乳液制剂中使用的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶。吸收基质具有亲水性质，从而它们可以吸水形成w/o乳液，但仍保持其半固体稠度，诸如无水羊毛脂和亲水凡士林。精细分开的固体也被用作良好的乳化剂，特别是与表面活性剂和粘性制剂组合使用。这些包括极性无机固体诸如重金属氢氧化物，非膨胀性粘土诸如膨润土、绿坡缕石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱石，胶体硅酸铝和胶体硅酸镁铝，颜料和非极性固体诸如碳或甘油三硬脂酸酯。
乳液制剂中还包括多种非乳化材料并有助于乳液的性质。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水性胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block,inPharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical DosageForms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
亲水性胶体或亲水胶体包括天然存在的树胶和合成聚合物，诸如多糖(例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、角叉菜胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶和黄蓍胶)、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成的聚合物(例如卡波姆(carbomers)、纤维素醚和羧基乙烯基聚合物)。它们在水中分散或溶胀形成胶体溶液，其通过在分散相液滴周围形成强有力的界面膜并通过增加外相的粘度来稳定乳液。
由于乳剂通常含有许多成分，诸如碳水化合物、蛋白质、甾醇和磷脂等，可以很容易地支持微生物的生长，所以这些制剂通常含有防腐剂。包括在乳液制剂中的常用防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸的酯和硼酸。通常还将抗氧化剂添加到乳液制剂中以防止制剂变质。使用的抗氧化剂可以是自由基清除剂诸如例如生育酚、烷基没食子酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯或还原剂诸如抗坏血酸和偏亚硫酸氢钠，和抗氧化剂增效剂诸如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
经由皮肤、口服和胃肠外途径应用乳液制剂及其制备方法已在文献中进行了综述(参见例如Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),NewYork,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。用于口服递送的乳剂制剂由于容易配制及从吸收和生物利用度的角度考虑的功效已被非常广泛地使用(参见例如Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),NewYork,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Idson,inPharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。矿物油基质的泻药，油溶性维生素和高脂肪营养制剂是通常作为o/w乳剂口服施用的材料之一。
ii.微乳液
在本发明的一个实施方案中，iRNA和核酸的组合物被配制成微乳液。微乳液可以定义为水、油和两亲物的系统，其是单一光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),NewYork,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。一般地，微乳液是通过首先将油分散在水性表面活性剂溶液中，然后添加足够量的第四组分，通常是中等链长的醇以形成透明系统而制备的系统。因此，微乳液也被描述为两种不混溶液体的热力学稳定、各向同性透明的分散体，其通过表面活性分子的界面膜稳定(Leung and Shah,in:Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。微乳液通常经由三至五种组分的组合制备，所述组分包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质。微乳液是油包水(w/o)还是水包油(o/w)型取决于所使用的油和表面活性剂的性质及表面活性剂分子的极性头和碳氢化合物尾的结构和几何包装(Schott,in Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
利用相图的现象学方法已被广泛研究且已经为本领域技术人员提供如何配制微乳液的综合知识(参见例如Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Riegerand Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335)。与常规乳液相比，微乳液提供将水不溶性药物溶解于自发形成的热力学稳定液滴的制剂中的优点。
用于制备微乳液的表面活性剂包括但不限于离子表面活性剂、非离子表面活性剂、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(SO750)、十聚甘油十油酸酯(DAO750)、单独或与助表面活性剂组合。助表面活性剂，通常是短链醇，诸如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，通过渗入表面活性剂膜中起到增加界面流动性的作用且因此由于表面活性剂分子之间生成的空隙空间而产生无序膜。然而，可以在不使用助表面活性剂的情况下制备微乳液且本领域已知无醇自乳化微乳液系统。水相通常可以是但不限于水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇的衍生物。油相可包括但不限于诸如Captex 300，Captex355，Capmul MCM，脂肪酸酯，中链(C8-C12)单、二和三甘油酯，聚氧乙烯化甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、饱和聚乙二醇化C8-C10甘油酯，植物油和硅油的物质。
从药物溶解和增强药物吸收的观点来看，微乳液尤其令人感兴趣。已经提出了基于脂质的微乳液(o/w和w/o)以增强药物(包括肽)的口服生物利用度(参见例如美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides et al.,PharmaceuticalResearch,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供改善药物溶解性、保护药物免受酶水解、由于表面活性剂诱导的膜流动性和渗透性改变而可能增强药物吸收、容易制备、相对于固体剂型容易口服施用、临床效能提高及降低毒性(参见例如美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385；Ho et al.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。当在环境温度下将其组分集中在一起时，微乳液常常可以自发形成。这在配制热不稳定药物、肽或iRNA时可能特别有利。在化妆品和药物应用中，微乳液在透皮递送活性组分方面也是有效的。预期本发明的微乳液组合物和制剂会促进来自胃肠道的iRNA和核酸的增加的系统吸收及改善iRNA和核酸的局部细胞摄取。
本发明的微乳液还可含有其他组分和添加剂，诸如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol和渗透增强剂，以改善制剂的性质并增强本发明的iRNA和核酸的吸收。用于本发明微乳液中的渗透增强剂可分为属于五个大体类别--表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂中的一种(Lee et al.,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上面已经讨论过这些种类的每一种。
iii.微粒
本发明的RNAi剂可以合并到颗粒例如微粒中。微粒可以通过喷雾干燥产生，但也可以通过其他方法(包括冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合)产生。
iv.渗透增强剂
在一个实施方案中，本发明使用多种渗透增强剂来实现核酸，特别是iRNA向动物皮肤的有效递送。大多数药物都以离子化和非离子化形式存在于溶液中。但是，通常只有脂溶性或亲脂性药物容易穿越细胞膜。已经发现，如果用渗透增强剂处理待穿越的膜，即使非亲脂性药物也可以穿越细胞膜。除了帮助非亲脂性药物穿越细胞膜扩散之外，渗透增强剂还增强了亲脂性药物的渗透性。
可以将渗透增强剂分类为属于五个大体类别中的一种，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(参见例如Malmsten,M.Surfactants and polymersin drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。以下更详细地描述了上述渗透增强剂的类型的每一种。
表面活性剂(或“表面活性药剂”)是化学实体，当其溶解在水溶液中时，降低溶液的表面张力或水溶液与另外的液体之间的界面张力，结果是通过粘膜的iRNA的吸收增强。除胆汁盐和脂肪酸外，这些渗透增强剂还包括例如月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚)(参见例如Malmsten,M.Surfactants and polymers in drugdelivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)；and perfluorochemical emulsions,such as FC-43.Takahashi et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
用作渗透增强剂的多种脂肪酸及其衍生物包括例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸(1-单油酰-外消旋-甘油)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如甲基、异丙基和叔丁基)和它们的单-和二-甘油酯(参见例如Touitou,E.,et al.Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；El Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
胆汁的生理作用包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(参见例如Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,NewYork,NY,2002；Brunton,Chapter 38in:Goodman&Gilman’s ThePharmacological Basisof Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.Eds.,McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。多种天然胆汁盐及其合成衍生物起渗透增强剂的作用。因此，术语“胆汁盐”包括胆汁的任何天然存在的组分及它们的任何合成衍生物。合适的胆汁盐包括例如胆酸(或其药用钠盐、胆酸钠)，脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)，脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)，葡糖酸(葡糖酸钠)，甘醇酸(甘氨胆酸钠)，甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)，牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)，牛磺酸脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)，鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)，乌索氧胆酸(UDCA)，牛磺酸钠-24,25-二氢-夫西地酸钠(STDHF)，糖苷二氢呋苷钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(参见例如Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,NewYork,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Swinyard,Chapter 39In:Remington’s Pharmaceutical Sciences,18thEd.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,pages 782-783；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Yamamoto etal.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
结合本发明使用的螯合剂可以定义为通过与其形成复合物从溶液中除去金属离子的化合物，结果增强了通过粘膜的iRNA的吸收。关于它们在本发明中作为渗透增强剂的用途，螯合剂还具有用作DNA酶抑制剂的附加优点，因为大多数表征的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化并因此被螯合剂抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐类(例如水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和高香兰酸盐)、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如Katdare,A.et al.,Excipient development forpharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Leeet al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur et al.,J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
如本文所使用的非螯合非表面活性剂渗透增强化合物可定义为表现出作为螯合剂或作为表面活性剂的微不足道的活性，但仍增强通过消化道粘膜的iRNA的吸收的化合物(参见例如Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。这类渗透增强剂包括例如不饱和环脲、1-烷基-和1-链烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page92)；和非甾体抗炎药剂诸如双氯芬酸钠、吲哚美辛(indomethacin)和保泰松(phenylbutazone)(Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
在细胞水平上增强iRNA摄取的药剂也可以添加到本发明的药物和其他组合物中。例如，还已知阳离子脂质诸如lipofectin(Junichi et al,美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子诸如聚赖氨酸(Lollo et al.,PCT申请WO 97/30731)增强dsRNA的细胞摄取。市售转染试剂的实例包括例如LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA),Lipofectamine 2000TM(Invitrogen；Carlsbad,CA),293fectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA),CellfectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA),DMRIE-CTM(Invitrogen；Carlsbad,CA),FreeStyleTMMAX(Invitrogen；Carlsbad,CA),LipofectamineTM2000 CD(Invitrogen；Carlsbad,CA),LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA),RNAiMAX(Invitrogen；Carlsbad,CA),OligofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA),OptifectTM(Invitrogen；Carlsbad,CA),X-tremeGENE Q2 Transfection Reagent(Roche；Grenzacherstrasse,Switzerland),DOTAP Liposomal Transfection Reagent(Grenzacherstrasse,Switzerland),DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Grenzacherstrasse,Switzerland),or Fugene(Grenzacherstrasse,Switzerland),Reagent(Promega；Madison,WI),TransFastTMTransfection Reagent(Promega；Madison,WI),TfxTM-20 Reagent(Promega；Madison,WI),TfxTM-50Reagent(Promega；Madison,WI),DreamFectTM(OZ Biosciences；Marseille,France),EcoTransfect(OZ Biosciences；Marseille,France),TransPassa D1 Transfection Reagent(NewEngland Biolabs；Ipswich,MA,USA),LyoVecTM/LipoGenTM(Invitrogen；San Diego,CA,USA),PerFectin Transfection Reagent(Genlantis；San Diego,CA,USA),NeuroPORTERTransfection Reagent(Genlantis；San Diego,CA,USA),GenePORTER Transfectionreagent(Genlantis；San Diego,CA,USA),GenePORTER 2Transfection reagent(Genlantis；San Diego,CA,USA),Cytofectin Transfection Reagent(Genlantis；SanDiego,CA,USA),BaculoPORTER Transfection Reagent(Genlantis；San Diego,CA,USA),TroganPORTERTMtransfection Reagent(Genlantis；San Diego,CA,USA),RiboFect(Bioline；Taunton,MA,USA),PlasFect(Bioline；Taunton,MA,USA),UniFECTOR(B-BridgeInternational；Mountain View,CA,USA),SureFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)或HiFectTM(B-Bridge International,Mountain View,CA,USA)等。
其他试剂可用于增强所施用的核酸的渗透，包括二醇类诸如乙二醇和丙二醇，吡咯诸如2-吡咯，氮酮和萜烯诸如柠檬烯和薄荷酮。
v.载体
本发明的某些组合物还在制剂中合并载体化合物。如本文所使用的“载体化合物”或“载体”可指核酸或其类似物，其是惰性的(即本身不具有生物活性)，但通过藉由例如降解生物活性核酸或促进其从循环中除去来减少具有生物活性的核酸的生物利用度的体内过程被识别为核酸。核酸和载体化合物的共施用，通常与过量的后一种物质一起，可导致在肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量显著减少，可能是由于由于载体化合物和核酸之间竞争共同受体。例如，当与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4’异硫氰基-二苯乙烯-2,2’-二磺酸共施用时，可以减少肝组织中部分硫代磷酸酯dsRNA的回收。(Miyao et al.,DsRNA Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura et al.,DsRNA&Nucl.AcidDrug Dev.,1996,6,177-183。
vi.赋形剂
与载体化合物相反，“药物载体”或“赋形剂”是药用溶剂，悬浮剂或用于将一个或多个核酸递送至动物的任何其他药理学惰性载体。赋形剂可以是液体或固体且考虑到计划的施用方式进行选择，以便当与核酸和给定药物组合物的其他组分组合时提供所需的体积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于结合剂(例如预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填料(例如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸盐或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、羟基乙酸淀粉钠等)；和润湿剂(例如月桂基硫酸钠等)。
适用于非胃肠外施用但不与核酸有害反应的药用有机或无机赋形剂也可用于配制本发明的组合物。合适的药用载体包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部施用核酸的制剂可包括无菌和非无菌水溶液，普通溶剂(诸如醇)中的非水溶液或核酸在液体或固体油基质中的溶液。溶液还可含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。可以使用适合于非胃肠外施用的药用有机或无机赋形剂，其不与核酸有害地反应。
合适的药用赋形剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他组分
本发明的组合物可以另外含有药物组合物中常规存在的其他辅助组分，以其本领域确立的用量水平。因此，例如组合物可含有另外的、相容的药学活性物质，诸如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂或可含有可用于物理配制本发明的组合物的多种剂型的其他物质，诸如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。但是，这些物质在添加时不应过度干扰本发明组合物的组分的生物活性。制剂可以灭菌且如果需要，可以与助剂(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)混合，而不是与制剂的核酸有害地相互作用。
水性悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液也可含有稳定剂。
在一些实施方案中，本发明表征的药物组合物包括(a)一个或多个iRNA化合物和(b)一个或多个药剂，其通过非RNAi机制起作用并可用于治疗溶血病症。这样的药剂的实例包括但不限于抗炎剂、抗脂肪变性剂、抗病毒剂和/或抗纤维化剂。此外，通常用于保护肝脏的其他物质，诸如水飞蓟素，也可以与本文所述的iRNA联合使用。用于治疗肝脏疾病的其他药剂包括替比夫定、恩替卡韦和蛋白酶抑制剂诸如替拉瑞韦和其他例如Tung et al.,美国申请公开号2005/0148548,2004/0167116和2003/0144217；及在Hale et al.,美国申请公开号2004/0127488中公开的。
这样的化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)的标准制药程序来确定。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数且可以表示为比例LD50/ED50。表现高治疗指数的化合物是优选的。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。在本发明中本文表征的组合物的剂量通常在包括ED50的循环浓度范围内，毒性很小或没有毒性。剂量可在该范围内变化，这取决于采用的剂型和利用的施用途径。对于本发明表征的方法中使用的任何化合物，最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以实现化合物的循环血浆浓度范围或者在适当时，实现包括ISERPINC10的靶序列的多肽产物(例如实现降低的多肽浓度)(即实现对症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)，如在细胞培养中测定的。这样的信息可用来更准确地确定人体中的有用剂量。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。
除了它们的施用之外，如上所述，本发明中表征的iRNA可以与有效治疗由SERPINC1表达介导的病理过程的其他已知药剂组合施用。在任何情况下，施用医师可以基于使用本领域已知的或本文所述的标准功效测量观察到的结果来调节iRNA施用的量和时间。
VI.试剂盒
本发明还提供用于实施本发明任何方法的试剂盒。这样的试剂盒包括一个或多个RNAi剂和使用说明书，例如用于施用预防或治疗有效量的RNAi剂的说明书。该试剂盒可任选地进一步包含用于施用RNAi剂的工具(例如注射装置)或用于测量Serpinc1抑制的工具(例如用于测量Serpinc1 mRNA、Serpinc1蛋白和/或Serpinc1活性的抑制的装置)。这样的用于测量Serpinc1抑制的方法可包括用于从受试者获得样品(诸如血浆样品)的手段。本发明的试剂盒可任选地进一步包括用于确定治疗有效量或预防有效量的手段。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明表征的iRNA和方法，但下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用以其整体并入。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不意欲是限制性的。
实施例
表1：核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写。应当理解当这些单体存在于寡核苷酸中时，其通过5’-3’-磷酸二酯键相互连接。
实施例1：向健康人受试者施用单剂量的AD-57213
3:1(活性的:安慰剂)的组中的24名健康人志愿者施用0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.6mg/kg或1.0mg/kg的单剂量的AD-57213(有义(5’至3’)：GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96(SEQ ID NO:13)；反义(5’至3’)：usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO:14))。在施用后第0、1、2、3、7、10、14、21、28、42、56和70天收集血浆样品以监测AT蛋白水平、AT活性和AT蛋白沉默的持续时间。使用ELISA监测AT蛋白水平并使用校准的自动化凝血酶镜(组织因子＝1pM)通过生成凝血酶生成曲线监测AT活性水平。相对于每个受试者的两个给药前值的平均峰值凝血酶值计算峰值凝血酶的倍数变化。
没有严重的不良事件，3个轻微的不良事件与药剂的施用无关，1个轻微不良事件(头痛)可能与药剂的施用有关。也没有注射部位反应，所有受试者的体格检查、生命体征和心电图均在正常界限内。此外，所有肝功能检查、总胆红素水平、凝血酶原时间的国际标准化比率(PT/INR)、血小板计数、血红蛋白水平和凝血试验(即活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原水平和纤维蛋白D-二聚体水平)在研究过程中没有变化且在正常界限内。
图1A-D和2A-B显示0.03mg/kg的单剂量的AD-57213导致AT蛋白水平降低约20％和高达33％(图2A和2B)且AT活性相应降低(图1A-D)，其中降低的持续性大于60天。
图3进一步证明了AT敲减和峰值凝血酶生成之间有显著关联。具体地，观察到峰值凝血酶生成增加高达152％，峰值凝血酶的平均最大增加为138％±8.9％(平均值±SEM)。另外且与随着增加的AT敲减增加的凝血酶生成一致，因子VIII或IX的水平是正常的。
实施例2：向患有A或B型血友病的人类患者施用多剂量的AD-57213
一期-B、C和D部分临床试验
在AD-57213(有义(5’至3’)：GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96(SEQ IDNO:13)；反义(5’至3’)：usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO:14))的I期临床试验的B部分中，3名患有A(n＝2)或B(n＝1)型血友病的患者每周皮下施用0.015mg/kg的AD-57213历时3周(15微克/kg qw×3；15mcg/kg)；6名患有A型血友病的患者每周皮下注射0.045mg/kg的AD-57213历时3周(45微克/kg qw×3；45mcg/kg)；3名患有A(n＝2)或B(n＝1)型血友病的患者每周皮下施用0.075mg/kg的AD-57213历时3周(75微克/kg qw×3；75mcg/kg)。
在AD-57213(有义(5’至3’)：GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96(SEQ IDNO:13)；反义(5’至3’)：usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO:14))的I期临床试验的C部分中，3名患有A(n＝2)或B(n＝1)型血友病的患者每月皮下施用0.225mg/kg剂量的AD-57213历时3个月(225微克/kg qm×3；225mcg/kg)；3名患有A(n＝2)或B(n＝1)型血友病的患者每月皮下施用0.450mg/kg剂量的AD-57213历时3个月(450微克/kg qm×3；450mcg/kg)；3名患有A型血友病的患者每月皮下施用0.900mg/kg剂量的AD-57213历时3个月(900微克/kg qm×3；900mcg/kg)；3名患有A型血友病的患者每月皮下施用1.800mg/kg剂量的AD-57213历时3个月(1800微克/kg qm×3；1800mcg/kg)；6名患有A(n＝3)或B(n＝3)型血友病的患者每月皮下施用80mg的固定剂量的AD-57213历时3个月(80mg qm×3)。
在AD-57213(有义(5’至3’)：GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96(SEQ IDNO:13)；反义(5’至3’)：usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO:14))的I期临床试验的D部分中，6名患有A(n＝5)或B(n＝1)型血友病且利用旁路药剂(BPA)进行出血管理的抑制剂患者每月皮下施用50mg的固定剂量的AD-57213历时3个月(50mg qm×3)；10名患有A型血友病并使用旁路药剂(BPA)进行出血管理的患者每月皮下施用80mg的固定剂量的AD-57213历时3个月(80mg qm×3)。
在施用AD-57213后收集血浆样品以监测AT蛋白水平、AT活性和AT蛋白沉默的持续时间。使用ELISA监测AT蛋白水平并使用校准的自动化凝血酶镜(组织因子＝1pM)通过生成凝血酶生成曲线监测AT活性水平。相对于每个受试者的两个给药前值的平均峰值凝血酶值计算峰值凝血酶的倍数变化。
表2中提供参与研究的B、C和D部分的患者的人口统计学和基线特征。
表2.研究参与者的人口统计学和基线特征
对于研究的B、C和D部分，没有严重的不良事件，没有中止，没有注射部位反应且所有患者的体格检查、生命体征和心电图均在正常界限内。另外，所有肝功能检查和所有患者的全血细胞计数在研究过程中没有变化且在正常界限内。在该研究过程中也没有血栓栓塞事件且在任何患者中没有临床上显著的纤维蛋白D-二聚体水平增加。使用标准替代因子或旁路药剂施用成功管理任何出血事件。此外，没有抗药物抗体(ADA)形成的情况。
15mcg/kg、45mcg/kg和75mcg/kg组的AT水平的敲减，显示为相对于基线的平均AT敲减，在图4中描绘。图4证明了每周剂量为0.015mg/kg的AD-57213历时3周，导致平均最大AT敲减为29％±12％(平均值±SEM)。最大AT敲减高达53％。图4还证明了每周剂量为0.045mg/kg的AD-57213历时3周，导致平均最大AT敲减为55±9％(平均值±SEM)且最大AT敲减为86％。另外，图4还证明了每周剂量为0.075mg/kg的AD-57213历时3周，导致平均最大AT敲减为61±8％(平均值±SEM)且最大AT敲减为74％。
图5A中描绘了225mcg/kg、450mcg/kg、900mcg/kg、1800mcg/kg和80mg组中AT水平的敲减，显示为相对于基线的平均AT敲减。图5A证明了每月剂量为0.225mg/kg的AD-57213历时3个月，导致平均最大AT敲减70％±9％(平均值±SEM)。最大AT敲减高达80％。图5A还证明了每月剂量为0.450mg/kg的AD-57213历时3个月，导致平均最大AT敲减为77±5％(平均值±SEM)且最大AT敲减为85％。另外，图5A还证明了每月剂量为0.900mg/kg的AD-57213历时3个月，导致平均最大AT敲减为78±7％(平均值±SEM)且最大AT敲减为88％。此外，图5A证明了每月剂量为1.800mg/kg的AD-57213历时3个月，导致平均最大AT敲减为79±3％(平均值±SEM)且最大AT敲减为84％。图5A还证明了每月剂量为80mg的AD-57213历时3个月，导致平均最大AT敲减为87±1％(平均值±SEM)。
如图5B所示，其用图表表示了AD-57213的剂量与AT蛋白水平的相对最低点的关系，向人类患者施用AD-57213以剂量依赖性方式降低AT蛋白水平。
对健康人志愿者(实施例1)和患有A或B型血友病的患者的凝血酶生成的评价表明每周剂量的AD-57213导致血友病患者凝血酶生成增加高达334％(相对于基线)，其中当AT被敲减≥50％时，相对于基线，凝血酶生成平均增加112±38％(p<0.05)(图6B)。图6A证明了在施用每周剂量的AD-57213的A或B型血友病患者中达到的最大峰值凝血酶在正常受试者的凝血酶生成的低范围内。
来自一名受试者(受试者101-009)的全血的血栓弹力测定分析(参见例如Young,et al.(2013)Blood 121:1944)证明了以0.045mg/kg每周施用AD-57213历时3周，不仅导致了凝血酶峰值生成的增加，而且还导致了全血凝块形成的显著和持久的改善，如通过凝块形成时间和凝血时间的减少所证明的(图7)。自第2天起，受试者101-009没有出血事件，目前没有出血47天。
通过AT降低四分位数(B和C部分)对凝血酶生成的事后分析表明在最高AT降低四分位数(降低AT>75％)时，相对于基线，平均凝血酶生成增加289％(图9)。这种凝血酶生成水平在健康志愿者中观察到的凝血酶生成的范围内。
一项针对三名患者的子研究探索了AD-57213施用和因子VIII施用的等效性。简言之，将因子VIII向三名患者中的每一名施用并在施用后-0.5、1、2、6、24和48小时从患者收集血浆。分析来自每个受试者的样品的因子VIII水平和凝血酶生成水平并用来建立个体化的因子VIII-峰值凝血酶生成关系。然后将该数据用于与施用AD-57213实现的峰值凝血酶生成水平比较。如图10A-10C所示，AD-57213的施用足以使受试者中的峰值凝血酶生成水平达到与施用因子VIII的受试者所达到的水平相同的水平且足以达到比受试者高约40％的峰值凝血酶生成水平。
通过AT降低四分位数(B和C部分)对出血事件的事后分析证明了随着AT降低水平的增加，出血倾向减少，其中平均估计年出血率(ABR)在最高的AT降低四分位数为5±2(中位数＝1)(图11)。该分析包括16名患者的超过1100个累积日，其中AT降低>75％。
还对C部分组中的出血事件进行了事后分析。图12提供用于该分析的患者数据。如图13A所示，在组C中登记和接受预防性(PPx)替代因子的所有患者的历史中位数ABR为2且所有在组C中登记且接受按需(OD)替代因子的患者的历史中位数ABR为28。向这些患者施用AD-57213导致中位数ABR显著降低。特别地，AD-57213施用导致在观察期间(第29天至最后一次研究访视或最后剂量+56天，以较早者为准)53％的患者报道没有出血且在观察期间中位数为82％的患者报道没有自发性出血。图13B证明了对于在组C中每月接受80mg剂量的AD-57213并接受预防性(PPx)替代因子的患者，中位数历史ABR为6。然而，在施用AD-57213后，在观察期间的中位数ABR为0。
I期研究的D部分评价了在患有A或B型血友病的患者中AD-57213施用的效果，所述患者已经产生针对给予他们的替代因子的抗体(抑制剂)并因此已经变得对替代凝血因子抗拒。因此，为了评估这些患者的峰值凝血酶反应，在施用AD-57213前，对在50mg组中登记的患者施用其标准旁路药剂(BPA)(例如活化的凝血酶原复合物浓缩物(APCC)和/或重组活化的FVII(rFVIIa))，在BPA施用后-1、2、6和24小时收集血浆样品并分析样品的凝血酶生成。如图14A-14F所示，施用AD-57213的抑制剂患者中AT降低和凝血酶生成与在非抑制剂患者中施用具有相似剂量的AD-57213后观察到的AT降低和凝血酶生成相当。此外，图14A-14F证明了施用AD-57213后凝血酶生成始终超过用BPA施用所达到的瞬时水平。
如图15中所示，AD-57213以50mg和80mg每月一次皮下给药在具有抑制剂的血友病患者中实现剂量依赖性AT降低约80％。此外，如图16所示，在施用AD-57213的患者中实现的AT降低效果与凝血酶生成增加相关。
还进行了研究D部分中患者的出血事件的探索性事后分析。图17A显示以50mg或80mg的剂量每月一次向患有A或B型血友病的抑制剂患者施用AD-57213，导致研究前ABR的显著降低。此外，如图17B所示，对于在该I期研究的D部分中施用AD-57213的所有抑制剂患者，中位数年出血率(ABR)为零且56％的患者是无出血的且69％的患者经历过零自发性出血。
总之，AD-57213在有或没有抑制剂的A和B型血友病患者中具有良好的耐受性。没有与研究药物相关的SAE且没有血栓栓塞事件。数据证明了在非抑制剂患者中有临床活性和血友病表型纠正。数据进一步证明了每月一次皮下剂量方案有剂量依赖性AT降低和凝血酶生成增加且施用固定的50mg或80mg剂量的AD-57213提供一致的AT降低为约80％。
此外，数据证明了向抑制剂患者施用AD-57213导致与非抑制剂患者一致的AT降低和凝血酶生成增加且凝血酶生成增加始终超过用BPA施用瞬时实现的那些。
实施例3：向患有A或B型血友病的人类患者施用多剂量的AD-57213
二期开放标签扩展(OLE)临床试验
在AD-57213(有义(5’至3’)：GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96(SEQ IDNO:13)；反义(5’至3’)：usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO:14))的二期OLE研究中，在上述I期B和C部分临床试验中事先施用AD-57213的无抑制剂的患者有资格在II期开放标签扩展(OLE)研究中登记。患有A或B型血友病的来自I期B部分研究的12名患者，其已经每周皮下施用0.015mg/kg的AD-57213历时3周(15微克/kg qw×3；15mcg/kg)；或已经每周皮下施用0.045mg/kg的AD-57213历时3周(45微克/kg qw×3；45mcg/kg)；或已经每周皮下施用0.075mg/kg的AD-57213历时3周(75微克/kg qw×3；75mcg/kg)；和患有A或B型血友病的来自I期C部分研究的18名患者，其已经每月皮下施用0.225mg/kg剂量的AD-57213历时3个月(225微克/kg qm×3；225mcg/kg)；或已经每月皮下施用0.450mg/kg剂量的AD-57213历时3个月(450微克/kg qm×3；450mcg/kg)；或已经每月皮下施用0.900mg/kg剂量的AD-57213历时3个月(900微克/kg qm×3；900mcg/kg)；或已经每月皮下施用1.800mg/kg剂量的AD-57213历时3个月(1800微克/kg qm×3；1800mcg/kg)；或已经每月皮下施用80mg的固定剂量的AD-57213历时3个月(80mg qm×3)，有资格在该研究中登记。
登记了16名患者。8名患有A(n＝6)或B(n＝2)型血友病的患者每月皮下施用50mg的固定剂量的AD-57213历时3个月(50mg qm×3)；且8名患有A(n＝7)或B(n＝1)型血友病的患者每月皮下施用80mg的固定剂量的AD-57213历时3个月(50mg qm×3)。在该研究中登记的患者的人口统计学和基线特征示于下表3。
表3.研究参与者的人口统计学和基线特征
对于II期OLE中没有抑制剂的患者，AD-57213通常耐受良好，其中最长暴露期长达14个月的连续治疗且没有药物相关的严重不良事件(SAE)，没有由于不良事件的中止，没有血栓栓塞事件或病理性凝块形成的实验室证据。所有不良事件(AE)的严重程度为轻度或中度，其中最常见的AE由4/16(25％)患者的轻度注射部位反应(ISR)构成。在3名患者中观察到无症状丙氨酸氨基转移酶(ALT)增加超过正常上限(ULN)的3倍伴有胆红素并发升高不超过ULN的2倍，所述患者均有丙型肝炎感染病史。所有突破性出血事件均用替代因子成功管理。此外，没有抗药物抗体(ADA)形成的情况。
图19A和19B进一步证明了AD-57213施用的临床活性。具体地，如图19A所示，AD-57213以50mg或80mg每月一次皮下给药实现了剂量依赖性AT降低～80％且如图19B所示，AD-57213以50mg或80mg每月一次皮下给药实现了凝血酶生成水平接近正常范围的下限。
还进行了II期OLE研究中非抑制剂患者的出血事件的探索性事后分析。图20A显示出以50mg或80mg的剂量向患有A或B型血友病的患者每月一次施用AD-57213，导致研究前ABR显著降低。此外，如图20B所示，以50mg或80mg的剂量向患有A或B型血友病的患者每月一次施用AD-57213，将中位数年出血率(ABR)降低至1并将中位数年化自发性出血率(AsBR)降低至零。
另外，在II期OLE期间，一名患者(受试者C1-3)经历了选择性外科手术。具体地，每月接受50mg AD-57213的患有严重A型血友病的患者经历选择性鼻中隔成形术。该程序成功进行而没有相关的不良事件。此外，如研究者经由个人交流所报道的，重组因子VIII的累积围手术期利用比研究者在严重A型血友病患者中对该类型手术通常使用的小约5倍。基于国际血栓形成和止血学会(ISTH)止血功效评分，研究者将术中、术后24小时和手术后7天时期的止血控制评定为全部“优异”。
总之，AD-57213在患有A和B型血友病而没有抑制剂的患者中通常具有良好的耐受性。没有SAE，也没有与AD-57213给药相关的血栓栓塞事件。此外，数据表明AD-57213具有临床活性，即以50mg和80mg每月一次皮下给药实现了剂量依赖性AT降低～80％且凝血酶生成水平接近正常范围的下限。此外，对患有A和B型血友病而没有抑制剂的患者的出血事件的探索性事后分析证明了AD-57213的施用使中位数ABR降低至1且使中位数年化自发性出血率(AsBR)降低至零。16名患者中的8名(50％)无出血，16名患者中的11名(69％)经历了零自发性出血。此外，在患有严重A型血友病且施用AD-57213的受试者的第一外科手术病例期间，利用替代因子的显著减少来保持受试者的止血。
序列表
<110> 建新公司
<120> 用于治疗SERPINC1相关病症的方法和组合物
<130> 121301-05220
<140>
<141>
<150> 62/429,241
<151> 2016-12-02
<150> 62/366,304
<151> 2016-07-25
<150> 62/315,228
<151> 2016-03-30
<150> 62/264,013
<151> 2015-12-07
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1599
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
tctgccccac cctgtcctct ggaacctctg cgagatttag aggaaagaac cagttttcag 60
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acaccatatc tgagaaaaca tctgatcaga tccacttctt ctttgccaaa ctgaactgcc 600
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<212> DNA
<213> 恒河猴
<400> 2
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<213> 小家鼠
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cacctggcct ctggacctct cagatttagg ggaaagaacc agttttcgga gtgatcgtct 180
cagtcagcac catctctgta ggagcatcgg ccatgtattc ccctggggca ggaagtgggg 240
ctgctggtga gaggaagctt tgtctcctct ctctgctcct catcggtgcc ttgggctgtg 300
ctatctgtca cggaaaccct gtggacgaca tctgcatagc gaagccccga gacatccccg 360
tgaatccctt gtgcatttac cgctcccctg ggaagaaggc caccgaggag gatggctcag 420
agcagaaggt tccagaagcc accaaccggc gggtctggga actgtccaag gccaattcgc 480
gatttgccac taacttctac cagcacctgg cagactccaa gaatgacaac gacaacattt 540
tcctgtcacc cttgagcatc tccactgctt ttgctatgac caagctgggt gcctgtaacg 600
acactctcaa gcagctgatg gaggttttta aatttgatac catctccgag aagacatccg 660
accagatcca cttcttcttt gccaaactga actgccgact ctatcgaaaa gccaacaagt 720
cctctgactt ggtatcagcc aaccgccttt ttggagacaa atccctcacc ttcaacgaga 780
gctatcaaga tgttagtgag gttgtctatg gagccaagct ccagcccctg gacttcaagg 840
agaatccgga gcaatccaga gtgaccatca acaactgggt agctaataag actgaaggcc 900
gcatcaaaga tgtcatccca cagggcgcca ttaacgagct cactgccctg gttctggtta 960
acaccattta cttcaagggc ctgtggaagt caaagttcag ccctgagaac acaaggaagg 1020
aaccgttcta taaggtcgat gggcagtcat gcccagtgcc tatgatgtac caggaaggca 1080
aattcaaata ccggcgcgtg gcagagggca cccaggtgct agagctgccc ttcaaggggg 1140
atgacatcac catggtgctc atcctgccca agcctgagaa gagcctggcc aaggtggagc 1200
aggagctcac cccagagctg ctgcaggagt ggctggatga gctgtcagag actatgcttg 1260
tggtccacat gccccgcttc cgcaccgagg atggcttcag tctgaaggag cagctgcaag 1320
acatgggcct cattgatctc ttcagccctg aaaagtccca actcccaggg atcgttgctg 1380
gaggcaggga cgacctctat gtctccgacg cattccacaa agcatttctt gaggtaaatg 1440
aggaaggcag tgaagcagca gcgagtactt ctgtcgtgat tactggccgg tcactgaacc 1500
ccaatagggt gaccttcaag gccaacaggc ccttcctggt tcttataagg gaagttgcac 1560
tgaacactat tatattcatg gggagagtgg ctaatccttg tgtgaactaa aatattctta 1620
atctttgcac cttttcctac tttggtgttt gtgaatagaa gtaaaaataa atacgactgc 1680
cacctcacga gaatggactt ttccacttga agacgagaga ctggagtaca gatgctacac 1740
cacttttggg caagtgaagg gggagcagcc agccacggtg gcacaaacct atatcctggt 1800
gcttttgaag gtagaagcag ggcggtcagg agttaaggcc agttgaggct gggctgcaga 1860
gtgaaagacc atgtctcaag atggtctttc tcctccccaa agtagaaaag aaaaccataa 1920
aaacaagagg taaatatatt actatttcat cttagaggat agcaggcatc ttgaaagggt 1980
agagggacct taaattctca ttattgcccc catactacaa actaaaaaac aaacccgaat 2040
caatctccca taaagacaga gattcaaata agagtattaa acgttttatt tctcaaacca 2100
ctcacatgca taatgttctt atacacagtg tcaaaataaa gagaaatgca tttttataca 2160
aaaaaaaaaa a 2171
<210> 4
<211> 1561
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 4
cggagggatt gctcagcact gtctccacgg cttctctgca gaagcgtcca ccatgtattc 60
cccgggaata ggaagtgcgg ttgctggaga gaggaagctt tgtctcctct ctctgctact 120
cattggtgcc ttgggctgtg ctgtctgtca tggaaaccct gtggacgaca tctgcatagc 180
gaagccccga gacatccccg tgaaccccat gtgcatttac cgctcccctg cgaagaaggc 240
cacggaggag gatgtcctag agcagaaggt tccggaagcc accaaccggc gggtctggga 300
actgtccaag gccaattctc gatttgccac taacttctat cagcacctgg cagactccaa 360
gaacgacaac gacaacattt tcctgtcacc cttgagcatc tccacggcgt ttgctatgac 420
caagctgggt gcttgtaata acaccctcaa gcagctgatg gaggttttta aatttgatac 480
catctccgag aagacatccg accagatcca cttcttcttt gccaaactga actgccgact 540
ctatcgaaaa gccaacaagt cctctaactt ggtgtcagcc aaccgccttt ttggagacaa 600
atcccttacc ttcaatgaga gctatcaaga cgttagtgag attgtctatg gagccaagct 660
tcagcccctg gacttcaagg agaatccgga gcaatccaga gtgaccatca acaactgggt 720
agctaataag actgaaggcc gcatcaaaga cgtcatcccc caaggagcca ttgatgagct 780
cactgccctg gtgctggtta acaccattta cttcaagggc ctgtggaagt caaagttcag 840
ccctgagaac acaaggaagg aaccattcca caaagttgat gggcagtcat gcctggtgcc 900
catgatgtac caggaaggca aattcaaata caggcgtgtg ggagagggta cccaggtgct 960
agagatgccc ttcaaggggg acgacatcac catggtgctc atcctgccca agcctgagaa 1020
gagcctggct aaggtggagc aggaactcac cccggagctg ctgcaggagt ggctggatga 1080
gctgtcggag gtcatgcttg tggtccacgt gccccgcttc cgcatcgagg acagcttcag 1140
tctgaaggag cagctgcaag acatgggcct tgttgatctc ttcagccctg agaagtccca 1200
actcccaggg atcattgctg aaggcaggga cgacctcttt gtctccgatg cattccacaa 1260
agcgtttctt gaggtaaatg aggaaggcag tgaagcagca gcgagtactt ctgtcgtgat 1320
tactggccgg tcactgaacc ccagtagggt gaccttcaag gccaacaggc ccttcctggt 1380
tcttataagg gaagtcgcac tgaacactat tatattcatg gggagagtgt ctaatccttg 1440
tgtgaactaa aatattctta atctttgcac cttttcctat ctcggtgttt gttaatggaa 1500
gtaaaaataa atatgactgc cacctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
a 1561
<210> 5
<211> 1599
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
taatgtgaga tggaagtagt ttgtatttat ttttacttct gttcacaaac caaaaatagg 60
aagaggtgca aagaataaga acattttact taacacaagg gttggctact ctgcccatga 120
agataatagt gttcagagga acttctctta taaaaaccag gaaaggcctg ttggccttga 180
aagtcaccct gttggggttt agcgaacggc cagcaatcac aacagcggta cttgcagctg 240
cttcactgcc ttcttcattt acctcaagaa atgccttatg gaatgcatct gagacataga 300
ggtcatctcg gccttctgca acaatacctg ggagtttgga cttttcaggg ctgaacagat 360
cgacaaggcc catgtcttgc agctgctcct tcaaactgaa gccgtcctca atgcggaagc 420
ggggcatgtg gaccaccagc atcatctcct ccaattcatc cagccactct tgcagcacct 480
ctggggtgag ttccttctct accttggcca ggctcttctc aggcttgggc aagatgagga 540
ccatggtgat gtcatcacct ttgaagggca actcaagcac ctgggtgcct tcagccacgc 600
gccgataacg gaacttgcct tcctggtaca tcatagatgc tgaacacgac tctccatcag 660
ccttgtagaa cagttccttc cttgtgttct cagggctgaa ctttgacttc cacaggccct 720
tgaagtaaat ggtgttaacc agcaccagaa cagtgagctc attgatggct tccgagggaa 780
tgacatcggt gattcggcct tcggtcttat tggacaccca tttgttgatg gccgctctgg 840
attgctctgc attttccttg aagtccaggg gctggagctt ggctccatat accaactcac 900
tgatgtcctg gtaggtctca ttgaaggtaa gggatttgtc tccaaaaagg cgattggctg 960
atactaactt ggaggatttg ttggcttttc gatagagtcg gcagttcagt ttggcaaaga 1020
agaagtggat ctgatcagat gttttctcag atatggtgtc aaacttaaat acctccatca 1080
gttgctggag ggtgtcatta caggcaccca gcttggtcat agcaaaagcc gtggagatac 1140
tcaggggtga caggaaaatg ttatcattgt cattcttgga atctgccagg tgctgataga 1200
aagtggtagc aaagcgggaa ttggccttgg acagttccca gacacgccgg ttggtggcct 1260
ccgggatctt ctgttctgag ccctcatcct cagttgcctt cttctccggg gagcggtaaa 1320
tgcacatggg attcatggga atgtcccgcg gcttggctgt gcagatgtcc acagggctcc 1380
cgtgacaggt cacgcagtcc cagaagccaa tgagcagcaa ggacaaaaga taaaccttcc 1440
tttttccaga ggttacagtt cctatcacat tggaatacat ggccgctaat cttccacagg 1500
gctgggcaag tggagatagt gtgatctgag gcaatccgcc tgaaaactgg ttctttcctc 1560
taaatctcgc agaggttcca gaggacaggg tggggcaga 1599
<210> 6
<211> 1545
<212> DNA
<213> 恒河猴
<400> 6
tttttttttt ttttttttta atgtaagatg ggagtagttg tatttatttt tacttctatt 60
cacaaaccaa aataggaaga ggtacaaaga ataagaacag tttagctcac acaagggttg 120
gctactctgc ccatgaagat aatagtgttc agaggaactt ctcttataaa aaccaggaaa 180
ggcctgttgg ccttgaaggt caccctgttg gggtttagcg aacggccagc aatcccaatg 240
gcggtacttg cagctgcttc actgccttct tcatttacct caagaaatgc cttatggaat 300
gcatcggaga catagaggtc atcccggcct tctgcaacaa tacctgggag tttggacttt 360
tcagggctga acagatcgac aaggcccatg tcttgcagct gctccttcaa actgaagccg 420
tcctcaatgc ggaagcgggg catgtgaacc accagcatca tctcctccaa ctcatccagc 480
cactcctgca gcacctctgg ggtgagttcc tgctccacct tggtcaggct cttctcaggc 540
ttgggcagga tgagcaccat ggtgatgtca tcacccttga agggcaactc aagcacctgg 600
gtgccttcag ccacgcgccg ataacagaac ttgccttcct ggtacatcat agacgctgaa 660
cacgactctc catcagcctt gtagaacggt tccatccttg tgttctcagg gctaaacttt 720
gacttccaca ggcccttgaa gtaaatggtg ttaaccagca ccagaacagt gagctcgttg 780
atggcttccg ggggaatgac atcggtgatt cggccttcgg tcttattgga cacccatttg 840
ttgatggccg ctctggattg ctctgcattt tccttgaagt ccaggggctg gagcttggct 900
ccgtatacca actcactgat gtcctggtag gtctcattga aggtaaggga tttgtctcca 960
aaaaggcgat tggctgatac taacttggag gatttgttgg cttttcgata gagtcggcag 1020
ttcagtttgg caaagaagaa gtggatctga tcagatgttt tctcagatat ggtgtcaaac 1080
ttaaatacct ccatcagttg cttgagggtg tcattacagg cacccagctt ggtcatagca 1140
aaagccgtgg agacactcag gggtgacagg aaaatgttat ccttgtcgtt cttggaatct 1200
gccaggtgct gatagaaagt ggtagcaaag cgggaattgg ccttggacag ttcccagacg 1260
cgccggttgg tggcctcggg gatcttctgt tctgagccct catcctcagt tgccttcttc 1320
tccggggagc ggtaaatgca catgggattc atgggaatgt cccgcggctt ggctgtgcag 1380
atgtccacag ggctcccgtg acaggtcata cagtcccaga ggccaatgag cagcaaggac 1440
agaagataaa ccttcctttt tccagaggct acggttccta tcacattgga atacatggtc 1500
gctaatcttc cacagggctg ggcaagtgga gatggtcctc gtgcc 1545
<210> 7
<211> 2171
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 7
tttttttttt ttgtataaaa atgcatttct ctttattttg acactgtgta taagaacatt 60
atgcatgtga gtggtttgag aaataaaacg tttaatactc ttatttgaat ctctgtcttt 120
atgggagatt gattcgggtt tgttttttag tttgtagtat gggggcaata atgagaattt 180
aaggtccctc taccctttca agatgcctgc tatcctctaa gatgaaatag taatatattt 240
acctcttgtt tttatggttt tcttttctac tttggggagg agaaagacca tcttgagaca 300
tggtctttca ctctgcagcc cagcctcaac tggccttaac tcctgaccgc cctgcttcta 360
ccttcaaaag caccaggata taggtttgtg ccaccgtggc tggctgctcc cccttcactt 420
gcccaaaagt ggtgtagcat ctgtactcca gtctctcgtc ttcaagtgga aaagtccatt 480
ctcgtgaggt ggcagtcgta tttattttta cttctattca caaacaccaa agtaggaaaa 540
ggtgcaaaga ttaagaatat tttagttcac acaaggatta gccactctcc ccatgaatat 600
aatagtgttc agtgcaactt cccttataag aaccaggaag ggcctgttgg ccttgaaggt 660
caccctattg gggttcagtg accggccagt aatcacgaca gaagtactcg ctgctgcttc 720
actgccttcc tcatttacct caagaaatgc tttgtggaat gcgtcggaga catagaggtc 780
gtccctgcct ccagcaacga tccctgggag ttgggacttt tcagggctga agagatcaat 840
gaggcccatg tcttgcagct gctccttcag actgaagcca tcctcggtgc ggaagcgggg 900
catgtggacc acaagcatag tctctgacag ctcatccagc cactcctgca gcagctctgg 960
ggtgagctcc tgctccacct tggccaggct cttctcaggc ttgggcagga tgagcaccat 1020
ggtgatgtca tcccccttga agggcagctc tagcacctgg gtgccctctg ccacgcgccg 1080
gtatttgaat ttgccttcct ggtacatcat aggcactggg catgactgcc catcgacctt 1140
atagaacggt tccttccttg tgttctcagg gctgaacttt gacttccaca ggcccttgaa 1200
gtaaatggtg ttaaccagaa ccagggcagt gagctcgtta atggcgccct gtgggatgac 1260
atctttgatg cggccttcag tcttattagc tacccagttg ttgatggtca ctctggattg 1320
ctccggattc tccttgaagt ccaggggctg gagcttggct ccatagacaa cctcactaac 1380
atcttgatag ctctcgttga aggtgaggga tttgtctcca aaaaggcggt tggctgatac 1440
caagtcagag gacttgttgg cttttcgata gagtcggcag ttcagtttgg caaagaagaa 1500
gtggatctgg tcggatgtct tctcggagat ggtatcaaat ttaaaaacct ccatcagctg 1560
cttgagagtg tcgttacagg cacccagctt ggtcatagca aaagcagtgg agatgctcaa 1620
gggtgacagg aaaatgttgt cgttgtcatt cttggagtct gccaggtgct ggtagaagtt 1680
agtggcaaat cgcgaattgg ccttggacag ttcccagacc cgccggttgg tggcttctgg 1740
aaccttctgc tctgagccat cctcctcggt ggccttcttc ccaggggagc ggtaaatgca 1800
caagggattc acggggatgt ctcggggctt cgctatgcag atgtcgtcca cagggtttcc 1860
gtgacagata gcacagccca aggcaccgat gaggagcaga gagaggagac aaagcttcct 1920
ctcaccagca gccccacttc ctgccccagg ggaatacatg gccgatgctc ctacagagat 1980
ggtgctgact gagacgatca ctccgaaaac tggttctttc ccctaaatct gagaggtcca 2040
gaggccaggt gggggaggga gctctcccct taaagtcttc aggtagatat gtcttctgat 2100
tatgtcttat atctcaccac ttcactaaaa tgtctcagat acaaatcaga tctatttcta 2160
aaattaccta t 2171
<210> 8
<211> 1561
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 8
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttgaggt ggcagtcata tttattttta 60
cttccattaa caaacaccga gataggaaaa ggtgcaaaga ttaagaatat tttagttcac 120
acaaggatta gacactctcc ccatgaatat aatagtgttc agtgcgactt cccttataag 180
aaccaggaag ggcctgttgg ccttgaaggt caccctactg gggttcagtg accggccagt 240
aatcacgaca gaagtactcg ctgctgcttc actgccttcc tcatttacct caagaaacgc 300
tttgtggaat gcatcggaga caaagaggtc gtccctgcct tcagcaatga tccctgggag 360
ttgggacttc tcagggctga agagatcaac aaggcccatg tcttgcagct gctccttcag 420
actgaagctg tcctcgatgc ggaagcgggg cacgtggacc acaagcatga cctccgacag 480
ctcatccagc cactcctgca gcagctccgg ggtgagttcc tgctccacct tagccaggct 540
cttctcaggc ttgggcagga tgagcaccat ggtgatgtcg tcccccttga agggcatctc 600
tagcacctgg gtaccctctc ccacacgcct gtatttgaat ttgccttcct ggtacatcat 660
gggcaccagg catgactgcc catcaacttt gtggaatggt tccttccttg tgttctcagg 720
gctgaacttt gacttccaca ggcccttgaa gtaaatggtg ttaaccagca ccagggcagt 780
gagctcatca atggctcctt gggggatgac gtctttgatg cggccttcag tcttattagc 840
tacccagttg ttgatggtca ctctggattg ctccggattc tccttgaagt ccaggggctg 900
aagcttggct ccatagacaa tctcactaac gtcttgatag ctctcattga aggtaaggga 960
tttgtctcca aaaaggcggt tggctgacac caagttagag gacttgttgg cttttcgata 1020
gagtcggcag ttcagtttgg caaagaagaa gtggatctgg tcggatgtct tctcggagat 1080
ggtatcaaat ttaaaaacct ccatcagctg cttgagggtg ttattacaag cacccagctt 1140
ggtcatagca aacgccgtgg agatgctcaa gggtgacagg aaaatgttgt cgttgtcgtt 1200
cttggagtct gccaggtgct gatagaagtt agtggcaaat cgagaattgg ccttggacag 1260
ttcccagacc cgccggttgg tggcttccgg aaccttctgc tctaggacat cctcctccgt 1320
ggccttcttc gcaggggagc ggtaaatgca catggggttc acggggatgt ctcggggctt 1380
cgctatgcag atgtcgtcca cagggtttcc atgacagaca gcacagccca aggcaccaat 1440
gagtagcaga gagaggagac aaagcttcct ctctccagca accgcacttc ctattcccgg 1500
ggaatacatg gtggacgctt ctgcagagaa gccgtggaga cagtgctgag caatccctcc 1560
g 1561
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注释="未知的描述:
RFGF肽"
<400> 9
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注释="未知的描述:
RFGF类似物肽"
<400> 10
Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒
<400> 11
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 果蝇
<400> 12
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成寡核苷酸"
<400> 13
gguuaacacc auuuacuuca a 21
<210> 14
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成寡核苷酸"
<400> 14
uugaaguaaa ugguguuaac cag 23
<210> 15
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成寡核苷酸"
<400> 15
uugaaguaaa ugguguuaac cag 23
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成寡核苷酸"
<400> 16
gguuaacacc auuuacuuca a 21

Claims (84)

1.预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法，其包括向所述受试者施用约25mg至约100mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，
其中所述双链RNAi剂包含有义链和反义链，所述反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中所述有义链与附接在3’-末端的配体缀合，
由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
2.治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用约25mg至约100mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，
其中所述双链RNAi剂包含有义链和反义链，所述反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中所述有义链与附接在3’-末端的配体缀合，
由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
3.权利要求1或2的方法，其中所述固定剂量的所述双链RNAi剂每月一次、每6周一次、每2月一次或每季度一次向所述受试者施用。
4.权利要求1或2的方法，其中所述双链RNAi剂以约25mg的固定剂量向所述受试者施用。
5.权利要求1或2的方法，其中所述双链RNAi剂以约50mg的固定剂量向所述受试者施用。
6.权利要求1或2的方法，其中所述双链RNAi剂以约80mg的固定剂量向所述受试者施用。
7.权利要求1或2的方法，其中所述双链RNAi剂以约100mg的固定剂量向所述受试者施用。
8.权利要求4-7中任一项的方法，其中所述双链RNAi剂向所述受试者皮下施用。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中向所述受试者施用所述双链RNAi剂使所述受试者中的Serpinc1活性降低约70％至约95％。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中向所述受试者施用所述双链RNAi剂使所述受试者中的峰值凝血酶水平增加到不具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的峰值凝血酶水平的范围内。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中向所述受试者施用所述双链RNAi剂足以使所述受试者中的峰值凝血酶生成水平大致达到通过向所述受试者施用因子VIII所达到的相同水平。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中向所述受试者施用所述双链RNAi剂足以达到比所述受试者中的峰值凝血酶生成水平高约40％的峰值凝血酶生成水平。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中与具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的没有施用所述双链RNAi剂的受试者的中位数历史按需ABR比较，向所述受试者施用所述双链RNAi剂使所述受试者的年出血率(ABR)降低约80％至约95％。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述受试者为人。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述病症为出血病症。
16.权利要求15的方法，其中所述出血病症为获得性出血病症或遗传性出血病症。
17.权利要求15的方法，其中所述出血病症为血友病。
18.权利要求17的方法，其中所述血友病为A型血友病、B型血友病或C型血友病；所述血友病为A型血友病且所述受试者为抑制剂受试者；所述血友病为B型血友病且所述受试者为抑制剂受试者；或所述血友病为C型受试者且所述受试者为抑制剂受试者。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述双链RNAi剂向所述受试者皮下施用。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述经修饰的核苷酸独立地选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯和非天然碱基的核苷酸。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述互补性区域为至少17个核苷酸的长度。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述互补性区域为19-21个核苷酸的长度。
24.权利要求23的方法，其中所述互补性区域为19个核苷酸的长度。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中每条链为不多于30个核苷酸的长度。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述配体为
30.权利要求29的方法，其中所述双链RNAi剂如下所示与所述配体缀合
其中X为O或S。
31.权利要求30的方法，其中所述X为O。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述互补性区域由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)构成。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中所述双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)。
34.权利要求33的方法，其中所述有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且所述反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，
其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键。
35.权利要求1-34中任一项的方法，其中所述有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且所述反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，
其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键；和
其中所述有义链如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
36.权利要求1-35中任一项的方法，其中所述双链RNAi剂作为药物组合物向所述受试者施用。
37.权利要求36的方法，其中所述双链RNAi剂在无缓冲的溶液中施用。
38.权利要求37的方法，其中所述无缓冲的溶液为盐水或水。
39.权利要求36的方法，其中所述双链RNAi剂与缓冲溶液一起向所述受试者施用。
40.权利要求39的方法，其中所述缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合。
41.权利要求40的方法，其中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
42.用于进行权利要求1-41中任一项的方法的试剂盒，其包含
a)所述双链RNAi剂；和
b)使用说明书；和
c)任选的用于向所述受试者施用所述双链RNAi剂的工具。
43.预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状的方法，其包括向所述受试者施用约40mg至约90mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，
其中所述双链RNAi剂包含有义链和反义链，所述反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中所述有义链与附接在3’-末端的配体缀合，
由此预防具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的至少一个症状。
44.治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用约40mg至约90mg的固定剂量的双链核糖核酸(RNAi)剂，
其中所述双链RNAi剂包含有义链和反义链，所述反义链包含互补性区域，其包含与核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)的不同在于不多于3个核苷酸的至少15个邻接核苷酸，其中有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸且其中所述有义链与附接在3’-末端的配体缀合，
由此治疗具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者。
45.权利要求43或44的方法，其中所述固定剂量的所述双链RNAi剂每月一次、每6周一次、每2月一次或每季度一次向所述受试者施用。
46.权利要求43或44的方法，其中所述双链RNAi剂以约25mg的固定剂量向所述受试者施用。
47.权利要求43或44的方法，其中所述双链RNAi剂以约50mg的固定剂量向所述受试者施用。
48.权利要求43或44的方法，其中所述双链RNAi剂以约80mg的固定剂量向所述受试者施用。
49.权利要求43或44的方法，其中所述双链RNAi剂以约100mg的固定剂量向所述受试者施用。
50.权利要求46-49中任一项的方法，其中所述双链RNAi剂向所述受试者皮下施用。
51.权利要求43-50中任一项的方法，其中向所述受试者施用所述双链RNAi剂使所述受试者中的Serpinc1活性降低约70％至约95％。
52.权利要求43-51中任一项的方法，其中向所述受试者施用所述双链RNAi剂使所述受试者中的峰值凝血酶水平增加到不具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的受试者中的峰值凝血酶水平的范围内。
53.权利要求43-52中任一项的方法，其中向所述受试者施用所述双链RNAi剂足以使所述受试者中的峰值凝血酶生成水平大致达到通过向所述受试者施用因子VIII所达到的相同水平。
54.权利要求43-53中任一项的方法，其中向所述受试者施用所述双链RNAi剂足以达到比所述受试者中的峰值凝血酶生成水平高约40％的峰值凝血酶生成水平。
55.权利要求43-54中任一项的方法，其中与具有会受益于Serpinc1表达减少的病症的没有施用所述双链RNAi剂的受试者的中位数历史按需ABR比较，向所述受试者施用所述双链RNAi剂使所述受试者的年出血率(ABR)降低约80％至约95％。
56.权利要求43-55中任一项的方法，其中所述受试者为人。
57.权利要求43-56中任一项的方法，其中所述病症为出血病症。
58.权利要求57的方法，其中所述出血病症为获得性出血病症或遗传性出血病症。
59.权利要求57的方法，其中所述出血病症为血友病。
60.权利要求59的方法，其中所述血友病为A型血友病、B型血友病或C型血友病；所述血友病为A型血友病且所述受试者为抑制剂受试者；所述血友病为B型血友病且所述受试者为抑制剂受试者；或所述血友病为C型受试者且所述受试者为抑制剂受试者。
61.权利要求43-60中任一项的方法，其中所述双链RNAi剂向所述受试者皮下施用。
62.权利要求43-61中任一项的方法，其中所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
63.权利要求43-62中任一项的方法，其中所述经修饰的核苷酸独立地选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯和非天然碱基的核苷酸。
64.权利要求43-63中任一项的方法，其中所述互补性区域为至少17个核苷酸的长度。
65.权利要求43-64中任一项的方法，其中所述互补性区域为19-21个核苷酸的长度。
66.权利要求65的方法，其中所述互补性区域为19个核苷酸的长度。
67.权利要求43-66中任一项的方法，其中每条链为不多于30个核苷酸的长度。
68.权利要求43-67中任一项的方法，其中至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。
69.权利要求43-68中任一项的方法，其中至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端。
70.权利要求43-69中任一项的方法，其中所述配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
71.权利要求43-70中任一项的方法，其中所述配体为
72.权利要求71的方法，其中所述双链RNAi剂如下所示与所述配体缀合
其中X为O或S。
73.权利要求72的方法，其中所述X为O。
74.权利要求43-31中任一项的方法，其中所述互补性区域由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)构成。
75.权利要求43-74中任一项的方法，其中所述双链RNAi剂包含有义链，其包含核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’(SEQ ID NO:16)；和反义链，其包含核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’(SEQ ID NO:15)。
76.权利要求75的方法，其中所述有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且所述反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，
其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键。
77.权利要求43-76中任一项的方法，其中所述有义链包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO:13)且所述反义链包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO:14)，
其中A、C、G和U为核糖A、C、G或U；a、c、g和u为2’-O-甲基(2’-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf为2’-氟A、C、G或U；且s为硫代磷酸酯键；和
其中所述有义链如下所示与配体缀合
其中X为O或S。
78.权利要求43-77中任一项的方法，其中所述双链RNAi剂作为药物组合物向所述受试者施用。
79.权利要求78的方法，其中所述双链RNAi剂在无缓冲的溶液中施用。
80.权利要求79的方法，其中所述无缓冲的溶液为盐水或水。
81.权利要求78的方法，其中所述双链RNAi剂与缓冲溶液一起向所述受试者施用。
82.权利要求81的方法，其中所述缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合。
83.权利要求82的方法，其中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
84.用于进行权利要求43-83中任一项的方法的试剂盒，其包含
a)所述双链RNAi剂；和
b)使用说明书；和
c)任选的用于向所述受试者施用所述双链RNAi剂的工具。
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