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CN107074962A - 针对her2表位的单克隆抗体及其使用方法 - Google Patents

针对her2表位的单克隆抗体及其使用方法 Download PDF

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CN107074962A CN201580044201.4A CN201580044201A CN107074962A CN 107074962 A CN107074962 A CN 107074962A CN 201580044201 A CN201580044201 A CN 201580044201A CN 107074962 A CN107074962 A CN 107074962A
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seq
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M.J.德维特
E.M.克劳兰
T.B.罗温尔
P.U.朴
B.普林斯
A.V.于尔科维茨基
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Mersana Therapeutics Inc
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Abstract

提供了识别HER2的全人单克隆抗体，在各种治疗、诊断和预防适应症中使用此类单克隆抗体的方法。

Description

针对HER2表位的单克隆抗体及其使用方法
相关申请
本申请要求享有美国临时申请号62/013,944号(于2014年6月18日提交)；62/034,489（于2014年8月7日提交）；62/147,960（于2015年4月15日提交；和62/149,444，（于2015年4月17日提交）的优先权及权益。这些申请各自的内容以其整体通过引用并入。
【技术领域】
本发明通常地涉及产生鉴定人HER2受体的单克隆抗体，涉及鉴定人HER2受体胞外结构域中特定HER2表位的单克隆抗体，以及涉及使用这些单克隆抗体作为治疗法和/或诊断法的方法。
【发明背景】
受体酪氨酸激酶ErbB家族的成员是细胞生长、分化和存活的重要介质。所述受体家族包括4个不同成员，其包括表皮生长因子受体 (EGFR或ErbB1)、HER2 (ErbB2或p185neu)、HER3 (ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。由EGFR家族4个成员形成同二聚体及异二聚体两者，其中HER2是优选的且为其他ErbB受体的有力的二聚化配偶体(Graus-Porta 等人, Embo 31997; 16:1647-1655; Tao 等人, J Cell Sci 2008; 121:3207-3217)。HER2不具有已知配体，但当过表达时可经由同源二聚化或通过与其他配体占据的ErbB受体异二聚化而活化。
HER2基因(也被称为HER2/neu和ErbB2基因)在20-30%的早期乳腺癌中被扩增，使得其在细胞膜中过表达表皮生长因子(EGF)受体(Bange, 等人, Nature Medicine 7 (5):548-552)。除了乳腺癌，HER2表达也与其他人癌类型相关，包括非小细胞肺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、食道癌及头&颈的鳞状细胞癌(Garcia de Palazzo 等人,Int J Biol Markers 1993; 8:233-239；Ross 等人, Oncologist 2003; 8:307-325；Osman 等人, J Urol 2005; 174:2174-2177；Kapitanovic 等人, Gastroenterology1997；112:1103-1113；Turken 等人, Neoplasma 2003; 50:257-261；和Oshima 等人, IntJ Biol Markers 2001; 16:250-254)。
曲妥珠单抗(trastuzumab)(Herceptin®)为针对HER2蛋白质结构域IV的重组人源化单克隆抗体，从而阻断不依赖于配体的HER2同源二聚化，并且使HER2与细胞中具有高HER2过表达的其他家族成员较低程度地异二聚化(Cho 等人, Nature 2003; 421:756-760及Wehrman 等人, Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:19063-19068)。Herceptin®已批准为HER2过表达转移性乳腺癌第一线及辅助治疗，与化疗组合或作为一种或多种化疗方案之后的单一药剂。已发现曲妥珠单抗仅在20-50%的HER2过表达乳肿瘤患者中有效且许多初始应答者在数月后复发(Dinh 等人, Clin Adv Hematol Oncol 2007; 5:707-717)。
帕妥珠单抗(pertuzumab)(Omnitar/Perjeta® 也被称为2C4)为针对HER2蛋白质结构域II的另一种人源化单克隆抗体，其导致抑制配体-诱导的异二聚化(即，HER2与配体结合的ErbB家族的另一成员二聚化)；经报道为不严格需要高HER2表达水平的机制(Franklin 等人, Cancer Cell 2004；5:317-328.)。帕妥珠单抗经批准用于治疗HER2-阳性转移性乳腺癌，与曲妥珠单抗及多西他赛(docetaxel)组合。
HER2抗体药物缀合物(ADC)，曲妥珠单抗艾得辛(emtansine) (ado-曲妥珠单抗艾得辛，贺癌宁(Kadcyla)®)是抗体-药物缀合物，由连接到细胞毒性剂美坦辛(mertansine)(DM1)的单克隆抗体曲妥珠单抗(赫塞汀（Herceptin）)所组成。作为单一药的贺癌宁已批准用于治疗先前分开或组合接受曲妥珠单抗及紫杉烷的具有HER2-阳性(HER2+)、转移性乳腺癌(MBC)的患者。
虽然选择用于HER2标靶疗法的合适的抗体涉及许多因素，但通常如果在抗体结合后HER2-抗体复合物有效地内化，ADC方法有优势。然而，与EGFR相比，HER2内化被弱化。
调控HER2功能的复杂机制值得进一步针对该原癌基因研究新的和最佳的治疗策略。
因此，存在靶向HER2生物活性的疗法的需求。
【发明概述】
本发明提供了特异性鉴定HER2，也被称为(ErbB2、p185neu和/或HER2/neu)的单克隆抗体。本发明的抗体能够且可用于调节，例如，阻断、抑制、降低、拮抗、中和或者以其他方式干扰PI3K-Akt途径(所述途径通过降低磷酸化AKT的水平而促进细胞存活)。本发明的抗体也能够且可用于调节，例如：阻断、抑制、降低、拮抗、中和或者以其他方式干扰HER2的不依赖配体的同源二聚化和/或异源二聚化。本发明的抗体也包括结合可溶性HER2的抗体。
本发明抗体展示了不同于本领域中所述的抗体的HER2结合特征。具体地，本发明的抗体结合到HER2的不同表位，他们彼此(但非曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、Fab37或chA21)交叉阻断与HER2的结合。此外，与已知抗体相反，本发明的抗体可有效内化到HER2-表达细胞中，但不会促进细胞增殖。
本发明的抗体为全人单克隆抗体，其结合到新颖表位和/或具有其他用于治疗用途的有利特性。示例性的特性包括，但不限于对在高或低水平表达人HER2的癌症细胞的有利结合特征、对重组人及食蟹猴HER2的特异性结合、结合至HER2后的有效内化、当作为抗体药物缀合物(ADC)施用时杀伤表达高或低水平HER2的癌症细胞的高度能力、对HER2-表达癌症细胞的增殖无实质上的对抗效应、以及提供有效的抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)介导的HER2-表达细胞的杀伤，以及上述特性的任何组合。
本发明的抗体也包括特异性地结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括人HER2受体胞外结构域的残基452至531，例如，SEQ ID NO: 38的残基474至553或SEQ ID NO: 39的残基452至531。
本发明的抗体包括经分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人HER2受体结构域IV的N端的至少部分但不与结合至人HER2受体的表位4D5的抗体交叉竞争。例如，本文所描述的抗体或其抗原结合片段不与曲妥珠单抗交叉竞争结合至人HER2受体，因为已知曲妥珠单抗结合人HER2受体表位4D5。如本文所用，术语人HER2受体表位4D5指的是人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基529至627，例如SEQ ID NO: 38的残基551至649或SEQ ID NO: 39的残基529至627。在某些实施方案中，经分离的抗体或其抗原结合片段也结合食蟹猴HER2受体的至少一种表位。
本发明的抗体也包括特异性结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括人HER2受体胞外结构域的残基452至500，例如，SEQ ID NO: 38的残基474至522或SEQ ID NO: 39的残基452至500。
本发明的抗体也包括特异性结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少一种氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基E521、L525及R530，例如：SEQ ID NO: 38的残基543、547及552，和SEQ ID NO: 39的残基521、525及530。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少两种氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基E521、L525及R530。本发明的抗体也包括特异性结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括人HER2受体胞外结构域的至少氨基酸残基E521、L525及R530。在某些实施方案中，这些经分离的抗体或其抗原结合片段任一种或全部也结合食蟹猴(cynomolgus monkey)HER2受体的至少一种表位。
本发明的抗体也包括经分离的抗体或其抗原结合片段，其结合至人HER2受体的结构域III的至少部分和结构域IV的N端的至少部分，但不与Fab37单克隆抗体或结合至人HER2受体表位4D5的抗体交叉竞争。例如，本文所描述的抗体或其抗原结合片段不与Fab37单克隆抗体和/或曲妥珠单抗交叉竞争结合至人HER2受体。在某些实施方案中，经分离的抗体或其抗原结合片段也结合食蟹猴HER2受体的至少一种表位。
本发明的抗体也包括特异性结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括人HER2受体胞外结构域的残基520至531，例如，SEQ ID NO: 38的残基542至553或SEQ ID NO: 39的残基520至531。
本发明的抗体也包括特异性结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少一种氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497和W499，例如：SEQ ID NO: 38的残基475、478、495、498、517、518、519和521或SEQ ID NO: 39的残基453、456、473、476、495、496、497和499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少两种氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497和W499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少三种氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少四种氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少五氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少六氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其至少包括人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。在某些实施方案中，任一或全部的这些经分离的抗体或其抗原结合片段也结合食蟹猴HER2受体的至少一种表位。
本发明的抗体也包括特异性结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少一种氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的残基C453、H473、N476、R495、H497及W499，例如：SEQ ID NO: 38的残基475、495、498、517、519及521或SEQ ID NO: 39的残基453、473、476、495、497及499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少两种氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497及W499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少三种氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497及W499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少四个氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497及W499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少五个氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497及W499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的至少六个氨基酸残基：人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497及W499。例如，本发明的抗体包括特异性结合至人HER2受体胞外结构域的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其至少包括人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497及W499。在某些实施方案中，任一或全部的这些经分离的抗体或其抗原结合片段也结合食蟹猴HER2受体的至少一种表位。
在下文中更详细描述了本发明的这些和其他方面。
本发明的示例性单克隆抗体包括，例如，本文所描述的XMT 1517抗体、XMT 1518抗体、XMT 1519抗体及XMT 1520抗体。可选地，单克隆抗体是彼此交叉阻断但不结合至与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、Fab37或chA21 (其分别结合至HER2结构域IV、结构域II、结构域III及结构域I的特定表位)或其生物相似物相同的表位的抗体。这些抗体在本文中分别指为“HER2”抗体。HER2抗体包括全人单克隆抗体，以及人源化单克隆抗体和嵌合抗体。这些抗体显示出对人HER2的特异性，且他们已显示出介导（例如：阻断、抑制、降低、拮抗、中和或者以其他方式干扰）PI3K-Akt途径，所述途径通过降低磷酸化AKT水平促进细胞存活。这些抗体以与曲妥珠单抗或其生物相似物内化相同或基本相似的速率，自HER2-表达细胞的细胞表面内化。例如，这些抗体及抗原结合片段具有在时间0内化4小时后约50%总表面结合的内化速率。
本发明的抗体含有具有与选自以下的序列：SEQ ID NO: 1、3、5和7，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列的重链，和与选自以下的序列：SEQ ID NO: 2、4、6和8，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列的轻链。
本发明的抗体含有选自以下的重链与轻链氨基酸序列组合：（i）与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链氨基酸序列；（ii）与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链氨基酸序列；（iii）与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链氨基酸序列；和（iv）与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链氨基酸序列和与SEQ IDNO: 8的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO: 8的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链氨基酸序列。
本发明的抗体含有分别具有选自以下的氨基酸序列的重链：SEQ ID NO: 1、3、5及7，和具有选自以下的氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO: 2、4、6及8。
本发明的抗体含有选自以下的重链与轻链氨基酸序列的组合：（i）SEQ ID NO: 1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 2的轻链氨基酸序列；（ii）SEQ ID NO: 3的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列；（iii）SEQ ID NO: 5的重链氨基酸序列和SEQ IDNO: 6的轻链氨基酸序列；和（iv）SEQ ID NO: 7的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 8的轻链氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO: 1的重链氨基酸序列和SEQ IDNO: 2的轻链氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO: 3的重链氨基酸序列和SEQ IDNO: 4的轻链氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO: 5的重链氨基酸序列和SEQ IDNO: 6的轻链氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO: 7的重链氨基酸序列和SEQ IDNO: 8的轻链氨基酸序列。
本发明的抗体含有重链可变区，其具有与选自以下的序列：SEQ ID NO: 9、11、13及15至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列，和轻链可变区，其具有与选自以下的序列：SEQ ID NO: 10、12、14及16至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列。
本发明的抗体含有选自以下的重链可变区与轻链可变区氨基酸序列的组合：（i）与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链可变区氨基酸序列和与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链可变区氨基酸序列；（ii）与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链可变区氨基酸序列和与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链可变区氨基酸序列；（iii）与SEQ ID NO: 13的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链可变区氨基酸序列和与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链可变区氨基酸序列；及（iv）与SEQ ID NO: 15的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链可变区氨基酸序列和与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻可变区链氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链可变区氨基酸序列和与SEQ IDNO: 10的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链可变区氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链可变区氨基酸序列和与SEQ IDNO: 12的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链可变区氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有与SEQ ID NO: 13的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链可变区氨基酸序列和与SEQ IDNO: 14的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻链可变区氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有与SEQ ID NO: 15的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重链可变区氨基酸序列和与SEQ IDNO: 16的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的轻可变区链氨基酸序列。
本发明的抗体含有具有选自以下的氨基酸序列的重链可变区：SEQ ID NO: 9、11、13和15，和具有选自以下的氨基酸序列的轻链可变区：SEQ ID NO: 10、12、14和16。
本发明的抗体含有选自以下的重链可变区与轻链可变区氨基酸序列的组合：（i）SEQ ID NO: 9的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO: 10的轻链可变区氨基酸序列；（ii）SEQ ID NO: 11的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO: 12的轻链可变区氨基酸序列；（iii）SEQ ID NO: 13的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO: 14的轻链可变区氨基酸序列；和（iv）SEQ ID NO: 15的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO: 16的轻链可变区氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO: 9的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO: 10的轻链可变区氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO: 11的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO: 12的轻链可变区氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO: 15的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO: 16的轻链可变区氨基酸序列。
本发明的抗体的三个重链CDR包括重链互补决定区1(CDRH1)，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQID NO: 17、25和30；重链互补决定区2(CDRH2)，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQ ID NO: 18、23、26和31；和重链互补决定区3(CDRH3)，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQ ID NO: 19和27。
本发明的抗体的三个轻链CDR包括轻链互补决定区1(CDRL1)，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQID NO: 20和28；轻链互补决定区2(CDRL2)，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQ ID NO: 21和24；以及轻链互补决定区3(CDRL3)，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQ ID NO: 22和29。
抗体包括重链CDR与轻链CDR序列的组合，包括CDRH1，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:17、25和30；CDRH2，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQ ID NO: 18、23、26和31；CDRH3，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQID NO: 19及27；CDRL1，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQ ID NO: 20和28；CDRL2，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQ IDNO: 21和24；和CDRL3，其包括与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列：SEQ ID NO: 22和29。
本发明的抗体的三个重链CDR包括CDRH1，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO: 17、25和30；CDRH2，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 18、23、26和31；以及CDRH3，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 19和27。
本发明的抗体的三个轻链 CDR包括CDRL1，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO: 20和28；CDRL2，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 21和24；以及CDRL3，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 22和29。
本发明的抗体包括重链CDR与轻链CDR序列的组合，包括CDHR1，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 17、25和30；CDRH2，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:18、23、26和31；CDRH3，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 19和27；CDRL1，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 20和28；CDRL2，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQID NO: 21和24；以及CDRL3，其包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 22和29。
本发明的抗体含有选自以下的重链互补决定区及轻链互补决定区氨基酸序列的组合：（i）SEQ ID NO: 17的CDRH1氨基酸序列、SEQ ID NO: 18的CDRH2氨基酸序列、SEQ IDNO: 19的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO: 20的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO: 21的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO: 22的CDRL3氨基酸序列；（ii）SEQ ID NO: 17的CDRH1氨基酸序列、SEQ ID NO: 23的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO: 19的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO: 20的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO: 24的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO: 22的CDRL3氨基酸序列；（iii）SEQ ID NO: 25的CDRH1氨基酸序列、SEQ ID NO: 26的CDRH2氨基酸序列、SEQ IDNO: 27的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO: 28的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO: 21的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO: 29的CDRL3氨基酸序列；以及（iv）SEQ ID NO: 30的CDRH1氨基酸序列、SEQ ID NO: 31的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO: 27的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:28的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO: 21的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO: 29的CDRL3氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO: 17的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO: 18的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO: 19的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO: 20的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO: 21的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO: 22的CDRL3氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO: 17的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO: 23的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO: 19的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO: 20的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO: 24的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO: 22的CDRL3氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO: 25的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO: 26的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO: 27的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO: 28的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO: 21的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO: 29的CDRL3氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有SEQ ID NO: 30的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO: 31的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO: 27的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO: 28的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO: 21的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO: 29的CDRL3氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的HER2抗体也包括与抗体缀合的药剂。在某些实施方案中，所述药剂为治疗剂。在某些实施方案中，所述药剂为抗肿瘤剂。在某些实施方案中，所述药剂为毒素或其片段。在某些实施方案中 所述药剂为(a)奥瑞他汀(auristatin)化合物；(b)卡里奇霉素(calicheamicin)化合物；(c)倍癌霉素(duocarmycin)化合物；(d)SN38、(e)吡咯并苯并二氮杂卓；(f)长春花化合物；(g)微管溶素(tubulysin)化合物；(h)非天然喜树碱化合物；(i)美登木素生物碱化合物；(j)DNA结合药物；(k)激酶抑制剂；(l)MEK抑制剂；(m)KSP抑制剂；(n)拓朴异构酶抑制剂；和其类似物或其相似物。在某些实施方案中，该药剂为经由接头缀合到HER2抗体。在某些实施方案中，接头为可裂解接头。在某些实施方案中，接头为非可裂解接头。在某些实施方案中，所述药剂为本文所描述的任意毒素。
在一个方面中，本文所描述的HER2抗体缀合物包括直接或间接连接到一种或多种治疗剂或诊断剂(D)的经分离的HER2抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，HER2抗体缀合物也包括连接到抗体或其抗原结合片段的一种或多种聚合物支架，其中一种或多种D各自独立地经由一种或多种聚合物支架连接到抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，连接到经分离的HER2抗体或其抗原结合片段的一种或多种聚合物支架各自独立地包含聚(1-羟甲基亚乙基-缩羟甲基甲醛)（poly(1-hydroxymethylethylene hydroxymethyl-formal)）(PHF)，具有分子量范围为约2 kDa至约40 kDa。
在某些实施方案中，一种或多种聚合物支架各自独立地为式(Ic)：
其中：
LD1为含羰基的部分；
中的每次出现独立地为含有生物可降解键的第一接头，使得当所述键断裂时，D以活性形式释放用于其意图的治疗效果；并且在中LD1与D之间的表示D直接或间接连接至LD1；
的每次出现独立地为尚未连接到经分离的抗体或其抗原结合片段的第二接头，其中LP2是含有官能团的部分，其还与经分离的抗体或其抗原结合片段的官能团形成共价键，并且LD1与LP2之间的表示LP2直接或间接连接至LD1，并且第二接头的每次出现不同于第一接头的每次出现；
的每次出现独立地为将各携带D的聚合物支架连接至经分离的抗体或其抗原结合片段的第三接头，其中连接到LP2的端表示在LP2的官能团与经分离的抗体或其抗原结合片段的官能团之间形成共价键后，将LP2直接或间接连接至经分离的抗体或其抗原结合片段；并且所述第三接头的每次出现不同于所述第一接头的每次出现；
m为1至约300的整数，
m1为1至约140的整数，
m2为1至约40的整数，
m3为0至约18的整数，
m4为1至约10的整数；
m、m1、m2、m3及m4的总和范围为约15至约300；并且
连接到经分离的抗体或其抗原结合片段的LP2的总数为10或更少。
本文所描述的缀合物可包括以下特征的一个或多个：
例如，在式(Ic)中，经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段具有40 kDa或更大(例如：60kDa或更大、80 kDa或更大、100 kDa或更大、120 kDa或更大、140 kDa或更大、160 kDa或更大、180 kDa或更大或200 kDa或更大或约40-200 kDa、40-180 kDa、40-140 kDa、60-200kDa、60-180 kDa、60-140 kDa、80-200 kDa、80-180 kDa、80-140 kDa、100-200 kDa、100-180 kDa、100-140 kDa或140-150 kDa)的分子量。在某些实施方案中，经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段(如果为本公开的任意抗体或抗原-结合片段)包括，通过非限制性实例，本文所描述的XMT 1517抗体、XMT 1518抗体、XMT 1519抗体及XMT 1520抗体。
例如，在式(Ic)中，m1为1至约120的整数(例如：约1-90)和/或m3为1至约10的整数(例如：约1-8)。
例如，当PHF在式(Ic)中具有范围为约6 kDa至约20 kDa (即m、m1、m2、m3和m4的总和范围为约45至约150) 的分子量时，m2为2至约20的整数、m3为0至约9的整数、m4为1至约10的整数和/或m1为1至约75的整数 (例如：m1为约4-45)。
例如，当PHF在式(Ic)中具有范围为约8 kDa至约15 kDa(即m、m1、m2、m3及m4的总和范围为约60至约110)时的分子量，则m2为2至约15的整数、m3为0至约7的整数、m4为1至约10的整数和/或m1为1至约5的整数5(例如：m1为约4-30)。
例如，当PHF在式(Ic)中具有范围为约2 kDa至约20 kDa(即m、m1、m2、m3及m4的总和范围为约15至约150)时的分子量，则m2为1至约20的整数、m3为0至约10的整数(例如：m3范围为0至约9)、m4为1至约8的整数和/或m1为1至约70的整数，且LP2连接到经分离的抗体或其抗原结合片段的总数范围为约2至约8(例如：约2、3、4、5、6、7或8)。
例如，当PHF在式(Ic)中具有范围为约3 kDa至约15 kDa(即m、m1、m2、m3及m4的总和范围为约20至约110)的分子量时，则m2为2至约15的整数、m3为0至约8的整数(例如：m3范围为0至约7)、m4为1至约8的整数和/或m1为2至约50的整数，且LP2连接到经分离的抗体或其抗原结合片段的总数范围为约2至约8(例如：约2、3、4、5、6、7或8)。
例如，当PHF在式(Ic)中具有范围为约5 kDa至约10 kDa(即m、m1、m2、m3及m4的总和范围约40至约75)的分子量时，则m2为约2至约10的整数(例如：m2为约3-10)、m3为0至约5的整数(例如：m3范围为0至约4)、m4为1至约8的整数(例如：m4范围为1至约5)和/或m1为约2至约35的整数(例如：m1为约5-35)，且LP2连接到经分离的抗体或其抗原结合片段的总数范围约2至约8(例如：约2、3、4、5、6、7或8)。
例如，D的每次出现独立地为具有分子量≤5 kDa的治疗剂。
例如，D的每次出现独立地为抗癌药物，例如，选自长春花生物碱、奥瑞他汀、微管溶素、倍癌霉素、非天然喜树碱化合物、美登木素生物碱、卡里奇霉素化合物、拓朴异构酶抑制剂、DNA结合药物、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂和其类似物。
例如，当不连接到经分离的抗体或其抗原结合片段时各独立地包含端基WP，其中各WP独立地为：
其中R1K为离去基团(例如：卤化物或RC(O)O-，其中R为氢、脂肪族、杂脂肪族、碳环或杂环烷基部分)，R1A为硫保护基，且环A为环烷基或杂环烷基，且R1J为氢、脂肪族、杂脂肪族、碳环或杂环烷基部分。
例如，各R1A独立地为、、或，其中r为1或2且Rs1、Rs2和Rs3各自为氢、脂肪族、杂脂肪族、碳环或杂环烷基部分。
例如，还与经分离的抗体或其抗原结合片段的官能团形成共价键的LP2的官能团选自
-SRp、-S-S-LG、和卤基，其中LG为离去基团、Rp为H或硫保护基，且Xa和Xb中的一个为H而另一个为水溶性马来酰亚胺基阻断部分，或Xa及Xb与其所连接的碳原子一起形成碳-碳双键。例如，还形成共价键的LP2的官能团是不与经分离的抗体或其抗原结合片段的官能团反应的官能团，例如：作为LP2的官能团，其中Xa和Xb中的一个为H，而另一个为水溶性马来酰亚胺基阻断部分，或Xa和Xb。
例如，LD1包含，具有直接连接到的羰基的X，其中X为CH2、O或NH，且v为1至6的整数。
例如，的每次出现独立地为—C(=O)-X-(CH2)v-C(=O)-NH-(CH2)u-NH-C(=O)-(CH2)w-(OCH2)x-NHC(=O)-(CH2)y—M，其中X为CH2、O或NH，v、u、w、x及y各自独立地为1至6的整数，且M为，其中Xa和Xb中的一个为H，而另一个为水溶性马来酰亚胺基阻断部分，或Xa及Xb与其所连接的碳原子一起形成碳-碳双键。
例如，v、u、w、x及y各自为2。
例如，D与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例为约25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
例如，D与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例为约20：1、15：1、10：1、5：1、2：1或1：1。
例如，D与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例为约16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1或10：1。
例如，D与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例为约15：1、14：1、13：1、12：1或11：1。
例如，D与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例为约15：1、14：1、13：1或12：1。
例如，D与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例为约6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
例如，一个或多个携带D的聚合物支架各自独立地为式(Id)：
其中：
m3a为0至约17的整数，
m3b为1至约8的整数，且
端表示一种或多种聚合物支架与具有40 kDa或更大的分子量的经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段的直接连接。
式(Id)的支架可包括一种或多种以下特征：
m3a与m3b的总和在1与18之间。
当式(Id)中的PHF具有范围为约2 kDa至约40 kDa的分子量时，m、m1、m2、m3a及m3b的总和范围约为15至约300、m1为1至约140的整数、m2为1至约40的整数、m3a为0至约17的整数、m3b为1至约8的整数、m3a与m3b的总和范围为1至约18，且PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例为10或更少。
当式(Id)中的PHF具有范围为约2 kDa至约20 kDa的分子量时，m、m1、m2、m3a及m3b的总和范围约15至约150、m1为1至约70的整数、m2为1至约20的整数、m3a为0至约9的整数、m3b为1至约8的整数、m3a与m3b的总和范围为1至约10，且PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例为2至约8的整数。
当式(Id)中的PHF具有范围为约3 kDa至约15 kDa的分子量时，m、m1、m2、m3a及m3b的总和范围约20至约110、m1为2至约50的整数、m2为2至约15的整数、m3a为0至约7的整数、m3b为1至约8的整数、m3a与m3b的总和范围为1至约8；且PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例为2至约8的整数(例如：约2至约6或约2至约4)。
当式(Id)中的PHF具有范围为约5 kDa至约10 kDa的分子量时，m、m1、m2、m3a及m3b的总和范围约40至约75、m1为约2至约35的整数、m2为约2至约10的整数、m3a为0至约4的整数、m3b为1至约5的整数、m3a与m3b的总和范围为1至约5；以及PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例为2至约8的整数(例如：约2至约6或约2至约4)。
在某些实施方案中，奥瑞他汀 F羟丙基酰胺(“AF HPA”)与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些实施方案中，AF HPA与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在其他实施方案中，AF HPA与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些实施方案中，AF HPA与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1或10：1。
在某些实施方案中，AF HPA与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约15：1、14：1、13：1、12：1或11：1。
在某些实施方案中，AF HPA与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约15：1、14：1、13：1或12：1。
在某些实施方案中，PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在某些实施方案中，PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他实施方案中，PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在其他实施方案中，PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他实施方案中，PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约6：1、5：1、4：1或3：1。
在某些实施方案中，PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约5：1、4：1或3：1。
在某些实施方案中，PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段之间的比例可为约4：1、3：1或2：1。
水可溶性马来酰亚胺基阻断部分(例如：Xa或Xb)为当马来酰亚胺基与式(II)的含硫醇的化合物反应后可共价连接到两个烯烃碳原子之一的部分：
其中：
R90为NHR91、OH、COOR93、CH(NHR91)COOR93或经取代的苯基；
R93为氢或C1-4烷基；
R91为氢、CH3 或CH3CO且
d为1至3的整数。
在一个实施方案中，式(ii)的水可溶性马来酰亚胺基阻断化合物可为半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、半胱氨酸甲基酯、N-甲基半胱氨酸、2-巯基乙醇、3-巯基丙酸、2-巯基乙酸、巯基甲醇(即HOCH2SH)、苄基硫醇（其中苯基经一种或多种亲水取代基取代）或3-胺基丙烷-1-硫醇。苯基上的一种或多种亲水取代基包括OH、SH、甲氧基、乙氧基、COOH、CHO、COC1-4烷基、NH2、F、氰基、SO3H、PO3H等。
在另一个方面中，水可溶性马来酰亚胺基阻断基团为-S-(CH2)d-R90，其中
R90为OH、COOH或CH(NHR91)COOR93；
R93为氢或CH3；
R91为氢或CH3CO；以及
d为1或2。
在另一个实施方案中，水可溶性马来酰亚胺基阻断基团为-S-CH2-CH(NH2)COOH。
在某些实施方案中，本文所描述的缀合物包含一个或多个携带D的PHF，其各自独立地为式(If)，其中PHF具有范围为约2 kDa至约40 kDa的分子量：
其中：
m为1至约300的整数，
m1为1至约140的整数，
m2为1至约40的整数，
m3a为0至约17的整数，
m3b为1至约8的整数；
m3a与m3b的总和范围为1至约18；
m、m1、m2、m3a及m3b的总和范围为约15至约300；
端表示一种或多种PHF聚合物支架与经分离的抗体或其抗原结合片段的连接，所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位且包括可变重链互补决定区1(CDRH1)，其包括氨基酸序列FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 25)；可变重链互补决定区2(CDRH2)，其包括氨基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 26)；可变重链互补决定区3(CDRH3)，其包括氨基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO: 27)；可变轻链互补决定区1(CDRL1)，其包括氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO: 28)；可变轻链互补决定区2(CDRL2)，其包括氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO: 21)；以及可变轻链互补决定区3(CDRL3)，其包括氨基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO: 29)；以及
PHF与抗体的比例为10或更少。
式(If)的支架可包括一种或多种以下特征：
当式(If)中的PHF具有范围为约2 kDa至约20 kDa的分子量时，m、m1、m2、m3a及m3b的总和范围为约15至约150、m1为1至约70的整数、m2为1至约20的整数、m3a为0至约9的整数、m3b为1至约8的整数、m3a与m3b的总和范围为1至约10，且该PHF与该抗体的比例为2至约8的整数。
当式(If)中的PHF具有范围为约3 kDa至约15 kDa的分子量时，m、m1、m2、m3a及m3b的总和范围为约20至约110、m1为2至约50的整数、m2为2至约15的整数、m3a为0至约7的整数、m3b为1至约8的整数、m3a与m3b的总和范围1至约8；以及PHF与抗体的比例为2至约8的整数(例如：约2至约6或约2至约4)。
当式(If)中的PHF具有范围为约5 kDa至约10 kDa的分子量时，m、m1、m2、m3a及m3b的总和范围为约40至约75、m1为约2至约35的整数、m2为约2至约10的整数、m3a为0至约4的整数、m3b为1至约5的整数、m3a与m3b的总和范围为1至约5；以及PHF与抗体之间的比例为2至约8的整数(例如：约2至约6或约2至约4)。
在某些实施方案中，奥瑞他汀 F羟丙基酰胺(“AF HPA”)与抗体之间的比例可为约30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些实施方案中，AF HPA与抗体之间的比例可为约25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在其他实施方案中，AF HPA与抗体之间的比例可为约20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些实施方案中，AF HPA与抗体之间的比例可为约16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1或10：1。
在某些实施方案中，AF与抗体之间的比例可为约15：1、14：1、13：1、12：1或11：1。
在某些实施方案中，AF HPA与抗体之间的比例可为约15：1、14：1、13：1或12：1。
在某些实施方案中，PHF与抗体之间的比例可为约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在某些实施方案中，PHF与抗体之间的比例可为约8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他实施方案中，PHF与抗体之间的比例可为约6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在其他实施方案中，PHF与抗体之间的比例可为约6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他实施方案中，PHF与抗体之间的比例可为约6：1、5：1、4：1或3：1。
在某些实施方案中，PHF与抗体之间的比例可为约5：1、4：1或3：1。
在某些实施方案中，PHF与抗体之间的比例可为约4：1、3：1或2：1。
在另一个方面中，本文所描述的缀合物为式(Ib)：
其中：
HER2抗体表示本文所描述的经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段；
LP2与HER2抗体之间的表示HER2抗体与LP2的直接或间接连接，
HER2抗体的每次出现独立地具有少于200 kDa的分子量，
m为1至约2200的整数，
m1为1至约660的整数，
m2为3至约300的整数，
m3为0至约110的整数，
m4为1至约60的整数；以及
m、m1、m2、m3及m4的总和范围为约150至约2200。
在式(Ib)中，m1为约10至约660的整数(例如：约10-250)。
当式(Ib)中的PHF具有范围为约50 kDa至约100 kDa(即m、m1、m2、m3及m4的总和范围为约370至约740)的分子量时，m2为5至约100的整数、m3为1至约40的整数、m4为1至约20的整数和/或m1为1至约220的整数(例如：m1为约15-80)。
在式(Ib)中，各HER2抗体独立地具有120 kDa或更少、80 kDa或更少、70 kDa或更少、60 kDa或更少、50 kDa或更少、40 kDa或更少、30 kDa或更少、20 kDa或更少或10 kDa或更少，或约4 kDa至80 kDa(例如：4-20 kDa、20-30 kDa或30-70 kDa)的分子量。
本发明的另一个方面特征在于制备本文所描述的缀合物的方法。方法包括将经分离的抗体或其抗原-结合片段与式(Ia)的聚合物支架反应，使得形成缀合物：
其中：
LD1为含羰基的部分；
中的每次出现独立地为含有生物可降解键的第一接头，使得当该键断裂时，D以其活性形式释放用于其意图的治疗效果；以及中的LD1与D之间的表示D至LD1的直接或间接连接；
的每次出现独立地为尚未连接到经分离的抗体或其抗原-结合片段的第二接头，其中LP2为含有官能团的部分，其还与经分离的抗体或其抗原-结合片段的官能团形成共价键，且LD1与LP2之间的表示LP2与LD1的直接或间接连接，且第二接头的每次出现不同于所述第一接头的每次出现；
m为1至约300的整数，
m1为1至约140的整数，
m2为1至约40的整数，
m3为1至约18的整数，及
m、m1、m2及m3的总和范围为约15至约300。
在本发明的聚合物支架的式中，聚缩醛单元之间的断开或间隙指示单元可以以任何顺序彼此连接。换句话说，含有例如D、LP2的附加基团，和经分离的抗体或其抗原-结合片段，可沿聚合物主链随机地分布。
本发明还提供了通过对期望这样的治疗或预防的受试者施用本发明的单克隆抗体、其片段和/或其缀合物，治疗、预防、延迟与异常HER2表达、功能和/或活化相关的一种或多种病理学进展或以其他方式改善与异常HER2表达、功能和/或活化相关的一种或多种病理学的症状或缓解与这样的病理学相关的症状的方法。要被治疗的受试者为例如，人。单克隆抗体、其片段和/或其缀合物以足以治疗、预防或缓解与病理学相关的症状的量施用。
本发明也提供了通过对期望这样的治疗或预防的受试者施用本发明的单克隆抗体、其片段和/或其缀合物，治疗、预防、延迟与HER2表达、功能和/或活化相关的一种或多种病理学的进展或以其他方式改善与HER2表达、功能和/或活化相关的一种或多种病理学的症状或缓解与此病理学相关的症状的方法。要被治疗的受试者为例如，人。单克隆抗体、其片段和/或其缀合物以足以治疗、预防或缓解与病理学相关的症状的量施用。
使用本发明的单克隆抗体、其片段和/或其缀合物所治疗和/或预防的病理学包括，例如，癌症。例如，本发明的抗体、其片段和/或其缀合物可用于治疗选自、预防、延迟选自以下的癌症的进展或以其他方式改善选自以下的癌症的症状：肛门癌、星状细胞瘤、白血病、淋巴瘤、头颈癌、肝癌、睾丸癌、子宫颈癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉癌、口癌、间皮瘤、皮肤癌、骨髓瘤、口腔癌、直肠癌、咽喉癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、胰腺癌、肾癌及胃癌。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段和/或其PBRM-聚合物-药物缀合物可用于治疗乳腺癌、预防乳腺癌、延迟乳腺癌的进展或以其他方式改善乳腺癌的症状。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段和/或其PBRM-聚合物-药物缀合物可用于治疗胃癌、预防胃癌、延迟胃癌的进展或以其他方式改善胃癌的症状。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段和/或其PBRM-聚合物-药物缀合物可用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)、预防非小细胞肺癌(NSCLC)、延迟非小细胞肺癌(NSCLC)的进展或以其他方式改善非小细胞肺癌(NSCLC)的症状。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段和/或其PBRM-聚合物-药物缀合物可用于治疗、预防、延迟卵巢癌的进展或减轻卵巢癌的症状。
在某些实施方案中，用于治疗癌症、预防癌症、延迟癌症的进展或以其他方式改善癌症的症状(例如，选自以下的癌症：肛门癌、星状细胞瘤、白血病、淋巴瘤、头颈癌、肝癌、睾丸癌、子宫颈癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉癌、口癌、间皮瘤、皮肤癌、骨髓瘤、口腔癌、直肠癌、咽喉癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、胰腺癌、肾癌及胃癌)的Her2抗体或其抗原结合片段与以下抗体竞争结合到Her-2的相同表位，所述抗体包括(1)重链可变区CDRH1，其包括氨基酸序列FTFSSYSMN(SEQ IDNO: 25)；CDRH2，其包括氨基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO: 26)；CDRH3，其包括氨基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO: 27)；和轻链可变区CDRL1，其包括氨基酸序列RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28)；CDRL2，其包括氨基酸序列GASSRAT (SEQ ID NO: 21)和CDRL3，其包括氨基酸序列QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29)；(2)重链可变区CDRH1，其包括氨基酸序列FTFSGRSMN (SEQ ID NO: 30)；CDRH2，其包括氨基酸序列YISSDSRTIYYADSVKG (SEQID NO: 31)；CDRH3，其包括氨基酸序列GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27)；轻链可变区CDRL1，其包括氨基酸序列RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28)；CDRL2，其包括氨基酸序列GASSRAT (SEQID NO: 21)；和CDRL3，其包括氨基酸序列QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29)；(3)重链可变区CDRH1，其包括氨基酸序列FTFSSYGMH(SEQ ID NO: 17)；CDRH2，其包括氨基酸序列VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 18)；CDRH3，其包括氨基酸序列EAPYYAKDYMDV (SEQ IDNO: 19)，和轻链可变区CDRL1，其包括氨基酸序列RASQSVSSDYLA(SEQ ID NO: 20)；CDRL2，其包括氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO: 21)；以及CDRL3，其包括氨基酸序列QQYVSYWT(SEQID NO: 22)；或(4)重链可变区CDRH1，其包括氨基酸序列FTFSSYGMH(SEQ ID NO: 17)；CDRH2，其包括氨基酸序列GIWWDGSNEKYADSVKG (SEQ ID NO: 23)；CDRH3，其包括氨基酸序列EAPYYAKDYMDV (SEQ ID NO: 19)；以及轻链可变区CDRL1，其包括氨基酸序列RASQSVSSDYLA (SEQ ID NO: 20)；CDRL2，其包括氨基酸序列GASRRAT (SEQ ID NO: 24)；以及CDRL3，其包括氨基酸序列QQYVSYWT (SEQ ID NO: 22)。
在另一个实施方案中，用于治疗癌症、预防癌症、延迟癌症的进展或以其他方式改善癌症的症状(例如：选自以下的癌症：肛门癌、星状细胞瘤、白血病、淋巴瘤、头颈癌、肝癌、睾丸癌、子宫颈癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉癌、口癌、间皮瘤、皮肤癌、骨髓瘤、口腔癌、直肠癌、咽喉癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、胰腺癌、肾癌及胃癌)的Her2抗体或其抗原结合片段与以下抗体竞争结合到Her-2的相同表位，该抗体包括(1)重链可变区CDRH1，其包括氨基酸序列FTFSSYSMN(SEQID NO: 25)；CDRH2，其包括氨基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO: 26)；CDRH3，其包括氨基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO: 27)；和轻链可变区CDRL1，其包括氨基酸序列RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28)；CDRL2，其包括氨基酸序列GASSRAT (SEQ ID NO: 21)及CDRL3，其包括氨基酸序列QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29)；(2)重链可变区CDRH1，其包括氨基酸序列FTFSGRSMN(SEQ ID NO: 30)；CDRH2，其包括氨基酸序列YISSDSRTIYYADSVKG(SEQ IDNO: 31)；CDRH3，其包括氨基酸序列GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27)；轻链可变区CDRL1，其包括氨基酸序列RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28)；CDRL2，其包括氨基酸序列GASSRAT(SEQ IDNO: 21)；和CDRL3，其包括氨基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO: 29)；(3)重链可变区CDRH1，其包括氨基酸序列FTFSSYGMH(SEQ ID NO: 17)；CDRH2，其包括氨基酸序列VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 18)；CDRH3，其包括氨基酸序列EAPYYAKDYMDV (SEQ IDNO: 19)，和轻链可变区CDRL1，其包括氨基酸序列RASQSVSSDYLA(SEQ ID NO: 20)；CDRL2，其包括氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO: 21)；和 CDRL3，其包括氨基酸序列QQYVSYWT(SEQID NO: 22)；或(4)重链可变区CDRH1，其包括氨基酸序列FTFSSYGMH(SEQ ID NO: 17)；CDRH2，其包括氨基酸序列GIWWDGSNEKYADSVKG (SEQ ID NO: 23)；CDRH3，其包括氨基酸序列EAPYYAKDYMDV (SEQ ID NO: 19)；以及轻链可变区CDRL1，其包括氨基酸序列RASQSVSSDYLA (SEQ ID NO: 20)；CDRL2，其包括氨基酸序列GASRRAT (SEQ ID NO: 24)；以及 CDRL3，其包括氨基酸序列QQYVSYWT (SEQ ID NO: 22)，其中Her2抗体或其抗原结合片段直接或间接地与至少一种治疗剂缀合，其中所述治疗剂是具有分子量≤ 约5 kDa、≤ 约4 kDa、≤ 约3 kDa、≤ 约1.5 kDa，或≤ 约1 kDa的小分子。本发明也提供了用于鉴定或以其他方式提取，例如，分选适合于本发明的HER2抗体或其抗原结合片段和/或其PBRM-聚合物-药物缀合物的治疗性施用的患者群体的试剂盒和/或方法，其通过在使用本发明的HER2抗体或其抗原结合片段和/或其缀合物治疗的前，鉴定具有HER2低表达的患者。低HER2表达代表这些患者具有每细胞少于或等于100,000、少于或等于90,000或少于或等于80,000HER2分子，例如，如在测试细胞群中每细胞测量的。HER2表达水平，即每细胞HER2分子的数目，可使用本领域公认的方法测量，包括但不限于使用本文提供的工作实例中所示的基于细胞的存活力测定(见例如，实施例18)。
本发明也提供用于鉴定或者提取，例如，分选适于治疗施用本发明的HER2抗体或其抗原结合片段和/或其缀合物的患者群体的试剂盒和/或方法，其通过在以本发明的HER2抗体或其抗原结合片段和/或其缀合物治疗的前，鉴定受试者的HER2得分。在某些实施方案中，受试者经鉴定为对HER2表达具有得分为1+或2+。在某些实施方案中，受试者经鉴定为对HER2表达具有得分为1+或2+，如通过在测试细胞群上执行免疫组织化学（IHC）分析所检测的，且其中HER2基因在该测试细胞群中未扩增。在某些实施方案中，测试细胞群为衍生自活检样品的新鲜未冷冻的组织。在某些实施方案中，测试细胞群为衍生自活检样品的冷冻组织。
IHC测试测量癌症组织样品(例如：乳腺癌组织样品或胃癌样品)中细胞表面上HER2受体蛋白质的量，且将细胞表面HER2受体的检测水平分配为0、1+、2+或3+的HER2得分。如果受试者的HER2得分为0至1+的范围，则癌症被认为是“HER2阴性”。如果得分为2+，则癌症被称为“边界”，并且得分3+表示癌症为“HER2阳性”。
在某些实施方案中，该受试者被鉴定为对HER2表达具有得分为1+或2+且为对化疗(包括标准的前线化疗剂)是难治的。如本文所用，术语受试者包括人和其他哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者经鉴定为对HER2表达具有得分为1+或2+且患有乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)或卵巢癌。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段和/或PBRM-聚合物-药物缀合物可用于治疗患者中乳腺癌、预防患者中乳腺癌、延迟患者中乳腺癌的进展或以其他方式改善患者中乳腺癌的症状，所述患者具有HER2 IHC 1+或HER2 IHC 2+而无基因扩增，例如：FISH- (或荧光原位杂交阴性)。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段和/或PBRM-聚合物-药物缀合物可用于治疗患者中乳腺癌、预防患者中乳腺癌、延迟患者中乳腺癌的进展或以其他方式改善患者中乳腺癌的症状，所述患者已具有晚期HER2阳性乳腺癌且所述患者已接受以贺癌宁在前治疗。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段和/或PBRM-聚合物-药物缀合物可用于治疗患者中乳腺癌、预防患者中乳腺癌、延迟患者中乳腺癌的进展或以其他方式改善患者中乳腺癌的症状，所述患者已具有晚期HER2阳性乳腺癌且所述患者先前未接受以贺癌宁在前治疗。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段和/或PBRM-聚合物-药物缀合物可用于治疗患者中胃癌、预防患者中胃癌、延迟患者中胃癌的进展或以其他方式改善患者中胃癌的症状，所述患者已具有HER2 IHC 1+或HER2 IHC 2+而无基因扩增，例如，FISH-。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段和/或PBRM-聚合物-药物缀合物可用于治疗患者中非小细胞肺癌(NSCLC)、预防患者中非小细胞肺癌(NSCLC)、延迟患者中非小细胞肺癌(NSCLC)的进展或以其他方式改善患者中非小细胞肺癌(NSCLC)的症状，所述患者已具有HER2 IHC 2+、HER2 IHC 3+、任意HER2基因扩增或突变状态。
在某些实施方案中，受试者对化疗(包括标准前线化疗剂)是难治的。在某些实施方案中，受试者对贺癌宁治疗有抗性。
在本文所提供的方法及用途的任意实施方案中的HER2抗体或其抗原结合片段和/或经缀合的HER2抗体或其抗原结合片段可在疾病的任何阶段施用。例如，这样的HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体可施用于任何阶段(早期到转移性)的癌症患者。
用于这些方法和用途中的任意实施方案的HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体可单独或与一种或多种化疗剂或其他药剂组合施用。在某些实施方案中，所述药剂为本文所描述的任意毒素。在某些实施方案中，所述药剂为(1)HER2抑制剂、(2)EGFR抑制剂(例如：酪氨酸激酶抑制剂或标靶抗-EGFR抗体)、(3)BRAF抑制剂、(4)ALK抑制剂、(5)激素受体抑制剂、(6)mTOR抑制剂、(7)VEGF抑制剂或(8)癌症疫苗。在某些实施方案中，所述药剂为标准第一线化疗剂，诸如，例如，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗艾得辛(贺癌宁)、拉帕替尼(lapatinib)、阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、依维莫司(everolimus)、氟维司群(fulvestrant)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟羟甲睪酮(fluoxymesterone)、乙炔雌二醇(ethinyl estradiol)、紫杉醇(paclitaxel)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、艾日布林(eribulin)、长春瑞滨(vinorelbine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、卡铂(carboplatin)、多西他赛(docetaxel)、白蛋白结合型紫杉醇、顺铂(cisplatin)、表柔比星(epirubicin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、阿霉素(doxorubicin)、氟脲嘧啶(fluorouracil)、奥沙利铂(oxaliplatin)、氟嘧啶、伊立替康(irinotecan)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、丝裂霉素(mitomycin)、亚叶酸(leucovorin)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、克里唑替尼(crizotinib)、培美曲塞(permetrexed)、色瑞替尼(ceritinib)、依托泊苷(etoposide)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、异环磷酰胺(ifosfamid)、脂质体阿霉素(doxorubicin)、拓扑替康(topotecan)、六甲蜜胺(altretamine)、美法兰(melphalan)或乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)。在某些实施方案中，第二剂为贺癌宁。
在某些实施方案中，所述药剂为特异性结合HER2的至少第二抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体与HER2抗体、HER2二聚化抑制剂抗体或HER2抗体与HER2二聚化抑制剂抗体(诸如，例如，曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或其组合)的组合来组合施用。在某些实施方案中，HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体与曲妥珠单抗的生物相似物或帕妥珠单抗的生物相似物或其组合来组合施用。
HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体的这些组合可用于治疗病理学诸如，例如，癌症。例如，HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体的这些组合，例如：本发明的HER2抗体或其抗原结合片段和/或经缀合的HER2抗体(例如：HER2抗体-聚合物-药物缀合物)组合曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗及帕妥珠单抗两者或曲妥珠单抗的生物相似物、帕妥珠单抗的生物相似物或两个生物相似物可用于治疗癌症、预防癌症、延迟癌症的进展或以其他方式改善癌症的症状(例如：选自以下的癌症：肛门癌、星状细胞瘤、白血病、淋巴瘤、头颈癌、肝癌、睾丸癌、子宫颈癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉癌、口癌、间皮瘤、皮肤癌、骨髓瘤、空腔癌、直肠癌、咽喉癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、胰腺癌、肾癌和胃癌)。
这些组合也可用于当HER2-表达细胞与这些组合接触时增加HER2降解。使用任何本领域公认检测HER2降解的方法检测HER2降解水平，包括但不限于在HER2抗体(或其生物相似物)组合存在或不存在下，检测HER2降解水平，如本文提供的工作实例所示(见例如：实施例14)。例如，与未使用HER2抗体的组合处理的HER2-表达细胞的HER2降解水平相比，使用蛋白印记分析对使用HER2抗体的组合处理的HER2-表达细胞的裂解产物来确定HER2降解水平。
在某些实施方案中，HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体与一种或多种另外的药剂配制成单一治疗组合物，且HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体与另外的药剂同时施用。可选地，HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体与另外的药剂彼此分开，例如，各自配制成分别的治疗组合物，且HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体与另外的药剂同时施用，或HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体与另外的药剂在治疗方案期间在不同时间施用。例如，HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体在施用另外的药剂之前施用，HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体在施用另外的药剂之后施用，或HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体与另外的药剂以交替的方式施用。如本文所描述，HER2抗体和/或经缀合的HER2抗体及另外的药剂以单一剂量或以多剂量施用。
根据本发明的药物组合物可包括本发明的抗体、其片段和/或其缀合物与合适的载体。这些药物组合物可包括在试剂盒，诸如，例如，诊断试剂盒中。
本领域技术人员将了解本发明的抗体具有多种用途。例如，本发明的蛋白质用作为治疗剂。本发明的抗体也用作为在诊断试剂盒或诊断工具中的试剂，或这些抗体可用于竞争测定以产生治疗试剂。
除非另外定义，所有本文所用的技术与科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常了解的相同含义。在说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文中清楚地另外指出。虽然类似或等同于本文所描述的那些的方法与材料可用于实践或测试本发明，但合适的材料与方法描述在下文。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将占主导地位。此外，材料、方法与实例仅为说明性的而非意图限制。
本发明的其他特征及优点将从以下的详述和权利要求而显而易见。
【附图简述】
图1a显示由Octet Red384表位建仓对抗体XMT 1517及XMT 1518进行表位建仓（epitope binning）。
图1b显示由Octet Red384表位建仓对抗体XMT 1519及XMT 1520进行表位建仓。
图2显示抗体XMT 1517、XMT 1518、XMT 1519及XMT 1520对JIMT-1 细胞的细胞表面结合。
图3a显示抗体XMT 1517、XMT 1518对重组人HER2及食蟹猴HER2的结合亲和力。
图3b显示抗体XMT 1519、XMT 1520对重组人HER2及食蟹猴HER2的结合亲和力。
图3c显示XMT 1519及实施例16H对重组人HER2的结合亲和力。
图3d显示XMT 1519与实施例16H对食蟹猴HER2的结合亲和力。
图4显示抗体XMT 1518及XMT 1519竞争结合至HER2。
图5显示对曲妥珠单抗及抗体XMT 1518、XMT 1519及XMT 1520的抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。
图6显示对曲妥珠单抗及抗体HT XMT 1518、XMT 1519及XMT 1520的内化率。
图7显示在SKBR3细胞中HER2抗体的内化。
图8显示抗-HER2抗体的组合所诱导的HER2降解。
图9说明实施例16A，曲妥珠单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))及实施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在NCI-N87小鼠肿瘤异种移植模型中测量的。
图10说明贺癌宁；实施例16A，曲妥珠单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))；以及实施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在JIMT-1小鼠肿瘤异种移植模型中测量的。
图11说明贺癌宁；帕妥珠单抗；贺癌宁与帕妥珠单抗的组合；以及实施例16D，XMT1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在JIMT-1小鼠肿瘤异种移植模型中测量的。
图12说明实施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))；曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合；或曲妥珠单抗的三重组合；帕妥珠单抗与实施例16F，XMT1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在NCI-N87小鼠肿瘤异种移植模型中测量的。
图13说明贺癌宁，实施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))与实施例17B，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在SNU5小鼠肿瘤异种移植模型中测量的。
图14说明贺癌宁与实施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在TOV-21G小鼠肿瘤异种移植模型中测量的。
图15说明贺癌宁，实施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))与实施例17B，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在H522小鼠肿瘤异种移植模型中测量的。
图16说明贺癌宁，实施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))及实施例17B，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在SKOV3小鼠肿瘤异种移植模型中测量的。
图17说明实施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在Calu-3小鼠肿瘤异种移植模型中测量的。
图18说明贺癌宁，实施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))与实施例17B，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在BRE-0333 HER2 1+患者衍生的异种移植模型中测量的。
图19说明贺癌宁，实施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))与实施例17B，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在MAXF_1162 HER2 3+患者衍生的异种移植模型中测量的。
图20说明贺癌宁，实施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))及实施例17C，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗肿瘤功效，如在BT474小鼠肿瘤异种移植模型中测量的。
【发明详述】
本发明提供了以可溶性形式或以膜结合(即当表达在细胞表面上时)特异性结合人HER2的单克隆抗体。本发明进一步提供了特异性结合HER2的单克隆抗体。HER2。这些抗体在本文中统一称为“HER2”抗体。
本发明抗体以平衡解离常数 (Kd或KD)为≤1 μM，例如：≤ 100 nM，优选地≤ 10nM，且更优选地≤ 1 nM结合到HER2表位。例如，本文提供的HER2抗体呈现出大约介于≤ 1nM至约1 pM范围的Kd。
本发明的HER2抗体用作调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其他方式干扰HER2的功能活性。HER2。HER2的功能活性包括例如，调节PI3K-Akt途径活性。例如，HER2抗体通过部分或完全调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其他方式干扰PI3K-Akt途径活性而完全或部份抑制HER2功能活性。使用任意本领域公认的检测PI3K-Akt途径活性的方法评估PI3K-Akt途径活性，包括但不限于在存在或不存在本发明的抗体或抗原结合片段下检测磷酸化Akt的水平。
与不存在与本文所描述的HER2抗体结合的HER2功能活性水平相比，当在HER2抗体存在下HER2功能活性水平降低至少95%，例如：96%、97%、98%、99%或100%时，HER2抗体被认为完全调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其他方式干扰HER2功能活性。与不存在与本文所描述的HER2抗体结合的HER2活性水平相比，当在HER2抗体存在下，HER2活性水平降低少于95%，例如：10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%或90%时，HER2抗体被认为部分调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其他方式干扰HER2功能活性。
定义
除非另有定义，用于与本发明相关的科学与技术术语应具有本领域普通技术人员通常了解的含义。此外，除非上下文中另外要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。通常，与本文所描述的细胞与组织培养、分子生物学、和蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学及杂交相关使用的命名法是本领域中熟知且通常使用的那些。标准技术常用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养与转化(例如：电穿孔、脂质体转染)。根据制造商说明书或本领域中通常实施的或如本文所描述执行酶反应和纯化技术。上述技术与程序根据本领域熟知的和如本说明书中通篇引用并讨论的各种通常的和更特定的参考所描述的常规方法通常地执行。见例如：Sambrook 等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y。(1989))。本文所描述的与分析化学、合成有机化学、和药用与药物化学相关的命名及实验室程序与技术是本领域中熟知且通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送，和患者治疗。
如根据本公开内容使用的，以下术语，除非另外指明，应当应理解为具有以下意义：
如本文所用，术语“HER2”(也被称为ErbB-2、NEU、HER-2和CD340)，当用于本文时指的是人表皮生长因子受体2(SwissProt P04626)且包括由细胞(包括肿瘤细胞)天然表达或在HER2基因转染的细胞上表达的任何HER2的变体、同种型和种同源物。种同源物包括恒河猴HER2 (恒河猕猴（macaca mulatta）；Genbank登录号GI:109114897)。这些术语为同义的且可互换地使用。
如本文所用，术语“HER2抗体”或“抗-HER2抗体”是特异性结合到抗原HER2的抗体。
如本文所用，术语“抗体”指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与之免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与之免疫反应” “或针对”意指抗体与期望的抗原的一个或多个抗原决定簇反应且不与其他多肽反应或以低得多的亲和力 (Kd > 10-6)结合。抗体包括但不限于多克隆的、单克隆的、嵌合的、dAb(结构域抗体)、单链的、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、scFvs、和Fab表达文库。
基本抗体结构单元已知包含四聚体。每个四聚体由两个相同多肽链对构成，每对具有一条“轻”链(约25 kDa)和一条“重”链(约50-70 kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100个至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链羧基端部分定义了主要负责效应子功能的恒定区。通常，得自人的抗体分子涉及类型IgG、IgM、IgA、IgE及IgD中的任意种，其彼此间因存在于分子中的重链的性质而不同。某些类型也具有亚类，诸如：IgG1、IgG2及其他。此外，在人当中，轻链可为κ链或λ链。
本文所用的术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”指的是仅含有抗体分子的一种分子种类的抗体分子群体，所述抗体分子由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。特别地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在群体的所有分子中相同。mAb含有能够与抗原的具体表位免疫反应的抗原结合位点，其特征为对其独特的结合亲和力。
通常，得自人的抗体分子涉及类型IgG、IgM、IgA、IgE及IgD中的任意种，其彼此间因存在于分子中的重链的性质而不同。某些类型也具有亚类，诸如：IgG1、IgG2及其他。此外，在人当中，轻链可为卡帕κ链或λ链。
术语“抗原-结合位点”或“结合部分”指的是参与抗原结合的免疫球蛋白分子的部分。抗原结合位点由重(“H”)链及轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重及轻链的V区中三个高度趋异段(被称为“高变区”)被插入称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼段之间。因此，术语“FR”指的是在免疫球蛋白高变区之间和相邻的天然发现的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区与重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此配置而形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，且重及轻链各自的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。对各结构域氨基酸的分配是根据Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda,Md. (1987及1991))，或Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia等人Nature 342:878-883 (1989)的定义。
使用术语“片段”、“抗体片段”、“抗原-结合片段”及“抗原结合片段”。如本文中可互换地使用，除非另外指定。
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合至免疫球蛋白或其片段或T-细胞受体的任意蛋白质决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合至免疫球蛋白或T-细胞受体的任意蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子(诸如：氨基酸或糖侧链)的化学活性表面分组组成且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。当解离常数≤ 1 μM；例如：≤100 nM、优选地≤ 10 nM且更优选地≤ 1 nM时，抗体被称为特异性结合抗原。
当在本文中在两种或更多种抗体的情况下使用时，术语“竞争”或“交叉竞争”指两种或更多种抗体竞争结合到HER2，例如：在实施例5或8中所述的测定中竞争对HER2结合。如果抗体与一种或多种其他抗体竞争25%或更多时，抗体“阻断”或“交叉阻断”一种或多种其他抗体结合至HER2，而25%-74%表示“部分阻断”而75%-400%表示“完全阻断”，优选地使用实施例5及8的测定进行确定。对一些抗体对而言，实施例5或8的测定中的竞争或阻断仅在当一种抗体包被在板上且另一种用于竞争时观察到，且不是反之亦然。除非上下文中另有定义或否定，当本文使用术语“竞争”、“交叉竞争”、“阻断”或“交叉阻断”也意图涵盖这样的抗体对。
如本文所用，“抑制HER二聚化”的抗体应意为抑制或干扰HER二聚体形成的抗体。优选地，这样的抗体在其异二聚体结合位点结合至HER2。在一个实施方案中，本文的二聚化抑制抗体为帕妥珠单抗或MAb 2C4。抑制HER二聚化的抗体的其他实例包括结合至EGFR且抑制其与一种或多种其他HER受体二聚化的抗体，诸如，例如EGFR单克隆抗体806，MAb 806，其结合至经活化或“未束缚”的EGFR(见Johns 等人, J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004))；结合至HER3且抑制其与一种或多种其他HER受体二聚化的抗体；和结合至HER4且抑制其与一种或多种其他HER受体二聚化的抗体。
如本文所用术语“HER2二聚化抑制剂”应意为抑制包含HER2的二聚体或异二聚体形成的药剂。
如本文所用，术语“内化”当用于HER2抗体的背景时包括任何机制，其中抗体从细胞表面和/或从周围培养基例如：经由胞吞作用被内化到HER2-表达细胞。
如本文所用，术语“免疫结合”和“免疫结合特性”指的是发生在免疫球蛋白分子与对所述免疫球蛋白特异的抗原之间类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可就相互作用的解离常数(Kd)表达，其中较小的Kd代表较高的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可使用本领域熟知的方法定量。一种此类方法意味测量抗原-结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率依赖于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和几何参数，其在两方向平等地影响速率。因此，“结合速率常数”(Kon)及“解离速率常数”(Koff)两者可以通过计算浓度及结合与解离的实际速率进行确定。(见Nature 361:186-87(1993))。Koff/Kon的比率使得消除与亲和力无关的所有参数，且等于解离常数Kd。(见，通常，Davies 等人 (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。当平衡解离常数(Kd或KD)为≤1μM，优选地≤ 100 nM，更优选地≤ 10 nM，且最优选地≤ 100 pM至约1 pM时，称本发明抗体特异性结合至HER2，如通过测定诸如放射性配体结合测定或本领域技术人员已知的类似测定所测量的。
如本文所用的术语“经分离的多核苷酸”应意为基因组的、cDNA或合成来源或其一些组合的多核苷酸，依其来源的属性，“经分离的多核苷酸”(1)不与其中自然界中发现的“经分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或部分相关，(2)为可操作地连接到自然界中其不连接的多核苷酸，或(3)在自然界中不发生为较大序列的部分。根据本发明的多核苷酸包括SEQ ID NO: 34及36的核酸序列，以及编码以SEQ ID NO: 1、3、5及7表示的重链免疫球蛋白分子的核酸分子、和SEQ ID NO: 35与37的核酸序列，以及编码以SEQ ID NO: 2、4、6及8表示的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文所称的术语“经分离的蛋白质”意为cDNA、重组RNA或合成来源或其一些组合的蛋白质，依其来源的属性或衍生来源，“经分离的蛋白质”(1)不与自然界中发现的蛋白质相关，(2)没有来自相同来源的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不在自然界中发生。
本文所用的术语“多肽”为通用术语，意指天然蛋白质、片段或多肽序列的类似物。因此，天然蛋白质片段及类似物为多肽属的种类。根据本发明的多肽包括以SEQ ID NO: 1、3、5及7表示的重链免疫球蛋白分子、和SEQ ID NO: 2、4、6及8表示的轻链免疫球蛋白分子，以及通过组合形成的抗体分子，其包括重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子，诸如：κ轻链免疫球蛋白分子，且反之亦然，以及其片段及类似物。
如本文所用的适用于客体的术语“天然发生的”指的是客体可在自然界发现的事实。例如，存在于有机体(包括病毒)中的可以从自然来源分离且尚未通过实验室中人员或其他方式有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然发生的。
如本文所用的术语“可操作地连接”指的是所述组分的位置处于允许他们以其意图的方式作用的关系。将控制序列“可操作地连接”到编码序列，其是以与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式连接。
本文所用的术语“控制序列”指的是多核苷酸序列，所述多核苷酸序列是实现他们所连接的编码序列的表达和加工所必需的。这样的控制序列的性质在原核生物中取决于宿主有机体而不同，这样的控制序列在真核生物中通常包括启动子、核糖体结合位点、和转录终止序列，通常，这样的控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意图包括（最低限度），其存在是表达和加工所必需的所有组分，且也可以包括其存在为有利的另外的组分，例如，前导序列及融合伴侣序列（fusion partner sequence）。本文的术语“多核苷酸”指的是长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合性硼，为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任意类型的核苷酸的经修饰形式。术语包括DNA单链形式及双链形式。
本文所称的术语“寡核苷酸”包括天然发生，及由天然发生和非天然发生寡核苷酸键合连接在一起的经修饰的核苷酸。寡核苷酸通常为多核苷酸子集，其包括200碱基或更少的长度。优选地，寡核苷酸为长度10至60个碱基且最优选地长度12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个碱基。寡核苷酸通常为单链，例如，对于探针，虽然寡核苷酸可为双链，例如，用于在基因突变体的构建中使用。本发明的寡核苷酸为正义或反义寡核苷酸。
本文所称的术语“天然发生的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。本文所称的术语“经修饰的核苷酸”包括具有经修饰或经取代的糖基等的核苷酸。本文所称的术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselerloate)、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷酸酰胺酯(phosphoronmidate)等。见例如：LaPlanche 等人Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986)；Stec 等人J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein 等人 Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon 等人Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991)；Zon 等人Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F.Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))；Stec 等人U.S.Patent No. 5,151,510；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)。如果期望，寡核苷酸可包括用于检测的标记。
本文所称的术语“选择性杂交”意指可检测地和特异性地结合。根据本发明的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在最小化可检测结合至非特异性核酸的可评估量的杂交和洗涤的条件下选择性杂交至核酸链。可以使用高严苛条件实现本领域所知和在本文中所讨论的选择性杂交条件。通常，本发明的多核苷酸、寡核苷酸和片段和靶标核酸序列之间的核酸序列同源性将为至少80%，且最通常地具有优选地至少85%、90%、95%、99%及100%的增加的同源性。如果二个氨基酸序列之间有部分或完全相同，则他们是同源的。例如，当两条序列为最大匹配进行比对时，85%同源性意为85%的氨基酸是相同的。在最大匹配中允许间隙(匹配的两条序列之一)，长度为5或更少是优选的，而2或更少是更优选的。可选地和优选地，如该术语在本文中所用，如果其使用具有突变数据矩阵和6或更多的间隙罚分的程序ALIGN，两条蛋白质序列（或衍生自他们的长度至少30氨基酸的多肽序列）具有比对得分大于5（以标准偏差单位），则他们是同源的。见Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence andStructure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation(1972))及对此卷的Supplement 2, pp. 1-10。当使用ALIGN程序最优比对时，如果二条序列或其部分的氨基酸大于或等于50%相同，则他们更优选地是同源的。本文所用的术语“对应于”意指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分是同源的(即为相同，非严格进化地相关)，或多肽序列与参考多肽序列相同。对比下，本文所用的术语“互补”意指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源。用于说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”且与参考序列“GTATA”互补。
使用下述术语描述两条或更多条多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”被定义为用作序列比较的基础的序列。参考序列可为较大序列的子集，例如，为序列表中给定的全长cDNA或基因序列的区段或可以包含完整cDNA或基因序列。通常，参考序列长为至少18个核苷酸或6个氨基酸，通常长为至少24个核苷酸或8个氨基酸，且通常至少长为48个核苷酸或16个氨基酸。因为两条多核苷酸或氨基酸序列可以各自(1)包括两分子之间类似的序列(即完整多核苷酸或氨基酸序列的部分)，及(2)可以进一步包括两条多核苷酸或氨基酸序列之间相异的序列，两个(或更多个)分子之间的序列比较通常通过在“比较窗口”比对二个分子的序列来执行，以鉴定和比较局部区的序列相似性。本文所用的“比较窗口”指的是至少18个连续核苷酸位置或6个氨基酸的概念上的区段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列可以与参考序列的至少18个连续核苷酸或6个氨基酸序列比较，且其中当与参考序列(不包括加入或删除)比较两条序列的最佳比对时，比较窗口中部分多核苷酸序列可包括20%或更少的添加、缺失、置换等(即间隙)。比对比较窗口的序列最佳比对可以通过Smith和Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)的局部同源性算法、由Needleman和Wunsch J.Mol. Biol. 48:443 (1970) 的同源性比对算法、由对Pearson和Lipman Proc. Natl.Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)的相似性方法检索、由这些算法 (WisconsinGenetics Software Package Release 7.0中GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，(GeneticsComputer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)，Geneworks，或MacVector软件套件)的计算机化实施或由检查进行，且选择各种方法产生的最佳比对(即在比较窗口导致最高同源性百分比)。
术语“序列同一性”意指在比较窗口两条多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即在核苷酸-对-核苷酸或残基-对-残基基础上)。术语“序列同一性百分比”通过在比较窗口比较两条优化排列的序列进行计算，测定位置数目(其中相同核酸碱基(例如：A、T、C、G、U或I)或残基发生在两条序列中以产生匹配位置数目)、将匹配位置数目除以比较窗口中位置的总数(即窗大小)，且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。如本文所用术语“基本同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中多核苷酸或氨基酸与参考序列在至少个18核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口，常为至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗比较，包括具有至少85%序列同一性、优选地至少90%至95%序列同一性、更常为至少99%序列同一性的序列，其中序列同一性百分比通过在比较窗口比较参考序列与可以包括缺失或添加参考序列的总的20%或更少的序列进行计算计算。参考序列可以是较大序列的子集。
如本文所用，20种常规氨基酸和他们的缩写沿循常规用法。见Immunology - ASynthesis (2nd Edition, E.S. Golub及D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates,Sunderland7 Mass. (1991))。20种常规氨基酸的立体异构(例如：D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如：α-、α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规的氨基酸也可以是本发明多肽合适的组分。非常规的氨基酸的实例包括：4羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸、和其他类似氨基酸与亚氨基酸(例如：4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示法，依照标准用法与惯例，左手方向为氨基端方向而右手方向为羧基-端方向。
同样地，除非另外指定，单链多核苷酸序列左手端为5’端，多核苷酸序列双链左手方向称为5’方向。初生RNA转录物5’至3’添加的方向指的是转录方向，DNA链上具有与RNA相同序列且为RNA转录物的5’端的5’的序列区称为“上游序列”，DNA链上具有与RNA相同序列且为RNA转录物的3’端的3’的序列区称为“下游序列”。
如多肽所适用者，术语“基本同一性”意指当进行最佳比对时（诸如通过程序GAP或使用默认值间隙权重的BESTFIT），两条肽序列共有至少80%序列同一性、优选地至少90%序列同一性、更优选地至少95%序列同一性和最优选地至少99%序列同一性。
优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。
保守氨基酸取代指的是具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸及苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸缬氨酸、谷氨酸-天门冬酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所讨论，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变异被预期由本发明所涵盖，条件是氨基酸序列变异维持至少75%、更优选地至少80%、90%、95%，且最优选地99%。特别地，预期保守氨基酸取代。保守取代是氨基酸家族中发生的那些，其与他们的侧链相关。遗传编码的氨基酸通常被分为以下家族：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和(4)不带电极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸的其他族包括（i）丝氨酸及苏氨酸，其为脂肪族-羟基家族；（ii）天冬酰胺及谷氨酰胺，其为含酰胺家族；（iii）丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸，其为脂肪族家族；和（iv）苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其为芳香族家族。例如，合理预期以异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸分离取代、以谷氨酸对天冬氨酸分离取代、以丝氨酸对苏氨酸分离取代或以结构相关的氨基酸类似取代氨基酸将不会对所得分子的结合或特性具有重大影响，特别是如果取代不涉及框架位置中的氨基酸。氨基酸改变是否导致功能肽可以容易地通过测定多肽衍生物的特异性活性进行确定。本文中详细描述了测定。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以通过本领域技术人员容易地制备。优选片段或类似物的氨基-和羧基-端发生在功能域边界附近。结构域和功能域可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或私人序列数据库比较来鉴定。优选地，使用计算机化比较方法来鉴定序列基序或预测的蛋白质构形域(其发生在已知结构和/或功能的其他蛋白质中)。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie 等人Science 253:164 (1991)。因此，上述实例证实本领域技术人员可以识别可用用于定义根据本发明的结构域及功能域的序列基序和结构构形。
优选的氨基酸取代为以下这些：(1)降低对蛋白酶解的敏感性、(2)降低对氧化的敏感性、(3)改变对形成蛋白质复合物的结合亲和力、(4)改变结合亲和力和(4)给予或修饰此类似物的物化或功能特性。类似物可以包括除了天然发生的肽序列以外的序列的各种突变蛋白。例如，单一或多氨基酸取代(优选地保守氨基酸取代)可在天然发生的序列中进行(优选地在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分中)。保守氨基酸取代不应实质上改变亲代序列的结构特征(例如：取代氨基酸不应当趋于破坏亲代序列中发生的螺旋，或中断表征亲代序列的其他类型的二级结构)。领域内公认的多肽二级与三级结构的实例述于Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freemanand Company, New York (1984))；Introduction to Proteins Structure (C. Brandenand J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))；以及 Thornton等人 Nature 354:105 (1991)中。
本文所用的术语“多肽片段”指的是具有氨基端和/或羧基-端缺失，但其中剩余氨基酸序列与，例如，从全长cDNA序列推导的天然发生的序列的对应位置相同的多肽。片段通常地为至少5、6、8或10个氨基酸长，优选地至少14个氨基酸长，更优选地至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长，且甚至更优选地至少70个氨基酸长。本文所用的术语“类似物”指的是多肽，所述多肽包括至少25个氨基酸的区段，其与推导的氨基酸序列的部分具有基本同一性且在合适的结合条件下其具有对HER2的特异性结合。通常地，多肽类似物相对于天然发生的序列包括保守氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物通常地为至少20个氨基酸长、优选地至少50个氨基酸长或更长、且可以通常与全长天然发生的多肽一样长。
肽类似物通常用于制药业作为具有类似于那些模板肽特性的非肽药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”或“拟肽物”。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986)、Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)；以及 Evans 等人J. Med. Chem.30:1229 (1987)。这样的化合物通常在计算机化分子模拟的协助下开发。结构上类似于治疗有用的肽的肽模拟物可以用于产生相等的治疗或预防效果。通常，拟肽物为结构上类似于范例多肽(即具有生化特性或药物活性的多肽)，诸如人抗体，但通过本领域熟知的方法，具有任选地经选自以下的键取代的一个或多个肽键：--CH2NH--、--CH2S-、--CH2-CH2--、--CH=CH--(顺式和反式)、--COCH2--、CH(OH)CH2--和-CH2SO--。以相同类型的D-氨基酸系统的置换共有序列的一个或多个氨基酸(例如：D-赖氨酸取代L-赖氨酸)可用以产生更稳定的肽。另外，包括共有序列或基本上相同的共有序列变异的限制性肽可以通过本领域中已知的方法产生(Rizo和Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992))；例如，通过添加能够形成环化所述肽的分子内双硫键的内半胱氨酸残基。
术语“药剂”用于本文表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或从生物材料制备的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“经标记的”指的是可检测标记物的掺入，例如，将经放射性标记的氨基酸掺入或将可以通过标记的抗生物素蛋白检测的生物素部分连接到多肽(例如，含有荧光标记物或酶活性的链霉亲和素，其可以通过光学方法或测热方法检测)。在某些情况下，标记或标记物也可以是治疗性的。标记多肽和醣蛋白的各种方法是本领域已知的且可使用。多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧族元素磷光体)、酵标记(例如，辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、通过二级报道分子(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)识别的预定多肽表位。在某些实施方案中，标记通过各种长度的间隔区臂连接以降低潜在的空间位阻。本文所用的术语“药物制剂或药物”指的是当合适地施用至患者时能够诱导期望的治疗效果的化学化合物或组合物。
本文所使用的其他化学术语系根据本领域中常规用法，如The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco(1985))所示例的。
如本文所用，“基本上纯”意指靶标种类为主要存在的种类(即基于摩尔，其比组合物中任何其他个别种类更丰富)，且优选地，基本上纯化的级分是其中靶标种类包括所有存在的大分子种类的至少约50%(基于摩尔)的组合物。
通常，基本上纯的组合物将包括所有存在于组合物的大分子种类的超过约80%，更优选地超过约85%、90%、95%和99%。最优选地，靶标种类经纯化到基本上同质(在组合物中不能通过常规检测方法检测到污染种类)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。
除非本文另外指出或由上下文明确地相矛盾，否则冠词“一个/种”和“所述”在下述文中及权利要求中的使用被理解为涵盖单数与复数两者。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“化学式所示”中的“所示”、“包括”和“含有”被解释为开放性术语(即代表“包括但不限于”)。例如，某式中的聚合物支架包括式中所示的所有单体单元并且还可以包括未在式中显示的另外的的单体单元。另外，不管何时在实施方案中使用的“包含”或其他开放式术语，其被理解为使用中间术语“通常由…组成”或封闭式术语“由…组成”的相同实施方案可以是要求保护范围较窄的。
当与数值相连使用时，术语“约”、“大约地”或“大约”意指包括数值的集合或范围。例如，“约X”包括为X的±20%、±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±0.2%或±0.1%的数值范围，其中X为数值。在一个实施方案中，术语“约”指的是比特定值多或少5%的数值范围。在另一个实施方案中，术语“约”指的是比特定值多或少2%的数值范围。在另一个实施方案中，术语“约”指的是比特定值多或少1%的数值范围。
除非本文另外指出，数值范围的详述仅意图做为个别指各单独值落入范围的速记方法，且各单独值如同其个别主张于本文中般并入说明书中。本文所用的范围，除非另外指定，包括范围的两个限制。例如，表述“x为1和6之间的整数”及“x为1至6的整数”两者意指“x为1、2、3、4、5或6”，即术语“X和Y之间”及“X至Y的范围”，涵盖了X和Y与介于其间的整数。
除非本文另外指出或者上下文中另外清楚地相矛盾，否则本文所描述的所有方法可以任何合适的顺序执行。本文所提供的任一和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意图更好地说明本发明且不被解释为对权利要求范围的限制，除非明确地另外的要求。说明书中没有语言被解释成表示任何非主张的要求对所要求的为必需的。
“基于蛋白质的识别分子”或“PBRM”指的是识别并结合至细胞表面标记物或受体(诸如跨膜蛋白质、表面固定蛋白质或蛋白多糖)的分子。PBRM的实例包括但不限于本文所描述的XMT 1517抗体、XMT 1518抗体、XMT 1519抗体和XMT 1520抗体，以及其他抗体(例如：曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、依帕珠单抗、维托珠单抗、拉贝珠单抗、B7-H4、B7-H3、CA125、CD33、CXCR2、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、HER2、NaPi2b、c-Met、MUC-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PD-L1和抗-5T4)和本文所描述的抗体或其抗原结合片段)或肽(LHRH受体靶向肽、EC-1肽)、脂质运载蛋白，诸如，例如，anticalin、蛋白质诸如，例如，干扰素、淋巴因子、生长因子、群落刺激因子等、肽或肽模拟物等。基于蛋白质的识别分子(除了靶向经修饰的聚合物缀合物至特定细胞、组织或位置)也可具有某些治疗效果诸如，对靶标细胞或途径有抗增殖(抑制细胞生长和/或细胞毒性)活性。基于蛋白质的识别分子包括或可以经工程改造成包括至少一种化学反应性基团，诸如，-COOH、伯胺、仲胺-NHR、-SH或化学反应性氨基酸部分或侧链诸如，例如，酪氨酸、组氨酸、半胱氨酸，或赖氨酸。
本文所用的“生物相容性”意图描述在接触体液或活细胞或组织时，发挥最低破坏性或宿主应答效果的化合物。因此，本文所用的生物相容性基团指的是脂肪族、环烷基、杂脂肪族、杂环烷基、芳基或杂芳基部分，其落入术语生物相容性的定义，如上文及本文限定的。如本文所用的术语“生物相容性”也用于意指与识别蛋白质呈现最低相互作用的化合物，所述识别蛋白质例如：天然发生抗体、细胞蛋白质、细胞及生物系统的其他组分，除非这样的相互作用是特定期望的。因此，特定地意图造成上述最低相互作用的物质及官能团，例如：药物及前药，被视为生物相容性。优选地(例外是意图具有细胞毒性的化合物，诸如例如：抗肿瘤药剂)，如果将化合物添加至体外正常细胞(浓度类似于预期的全身体内浓度)，在等同于化合物体内半衰期(例如：体内施用的化合物的50%被消除/清除所需的那段时间)的时间期间造成少于或等于1%细胞死亡，且他们的体内施用诱导最低且医学上可接受的炎症、异物反应、免疫毒性、化学毒性和/或其他这样的不良效果，则所述化合物具有“生物相容性”。在上述句子中，术语“正常细胞”指的是不意图被所测试的化合物破坏或以其他方式显着地影响的细胞。
“生物可降解”：如本文所用，“生物可降解” 聚合物为易受体内生物处理影响的聚合物。如本文所用，“生物可降解”化合物或部分是当被细胞摄入时，可以通过溶酶体或其他化学方法或者通过水解成细胞可再使用或去除而对细胞没有显着毒性影响的组分的那些。如本文所用的术语“生物可裂解”具有“生物可降解”的相同意义。降解片段优选地诱导少量或没有器官或细胞负担过重或由于这样的负担过重造成的病理过程或其他体内不良影响。生物降解过程的实例包括酶及非酶水解、氧化及还原。对于本文所描述的生物可降解蛋白质-聚合物-药物缀合物(或其组分，例如：生物可降解的聚合载体和载体与抗体或药物分子之间的接头)的非酶水解的合适的条件，例如，包括在溶体胞内间隔的温度及pH下将生物可降解缀合物暴露于水。一些蛋白质-聚合物-药物缀合物(或其组分，例如：可生物降解聚合载体和载体与抗体或药物分子之间的接头)的生物降解也可胞外增强，例如：在动物体的低pH区，例如：发炎区域，在活化的巨噬细胞的附近或其他细胞释放降解促进因子。在某些优选实施方案中，聚合物载体在pH~7.5的有效尺寸在1至7天间不会可检测地改变，且维持在原聚合物尺寸的50%内达至少数周。另一方面，在pH~5，聚合物载体优选地在1至5天间可检测地降解，且在2周到数月的时间范围内完全转形为低分子量片段。在此测试中聚合物完整性可以通过例如，分子筛HPLC测量。虽然较快的降解在某些情况下是优选的，但通常，可以更期望聚合物在细胞中降解的速率不超过细胞代谢或排出聚合物片段的速率。在优选的实施方案中，聚合物及聚合物生物降解副产物是生物相容的。
本文所用的“马来酰亚胺基阻断化合物”：指的是可与马来酰亚胺反应将其转换成琥珀酰亚胺的化合物，且“马来酰亚胺基阻断部分”指的是当转换时连接到琥珀酰亚胺的化学部分。在某些实施方案中，马来酰亚胺基阻断化合物为具有与马来酰亚胺反应的末端硫醇基团的化合物。在一个实施方案中，马来酰亚胺基阻断化合物为半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、半胱氨酸甲基酯、N-甲基半胱氨酸、2-巯基乙醇、3-巯基丙酸、2-巯基乙酸、巯基甲醇(即HOCH2SH)、苄基硫醇，其中苯基经一个或多个亲水取代基取代或3-氨基丙烷-1-硫醇。
“亲水的 ”：术语“亲水的”，如其涉及例如，在聚合物单体单元上或在马来酰亚胺基阻断部分上的取代基使他们为亲水的或水可溶的，基本上不会不同于本领域中该术语的通常含义，且表示包含可电离的、极性的或可极化原子的化学部分，或否则以其他方式可以通过水分子溶剂化的化学部分。因此，本文所用的亲水性基团指的是脂肪族、环烷基、杂脂肪族、杂环烷基、芳基或杂芳基部分，其落入如上文定义的术语亲水性的定义中。特别的亲水性有机部分的实例合适的包括但不限于包含约1个与12个原子之间范围的原子链的脂肪族或杂脂肪族基团、羟基、羟烷基、胺、羧基、酰胺、羧酸酯、硫酯、醛、硝酰、异硝酰、亚硝基、羟基胺、巯基烷基、杂环、氨基甲酸酯、羧酸及其盐、磺酸及其盐、磺酸酯、磷酸及其盐、磷酸酯、聚乙二醇醚、多胺、聚羧酸酯、聚酯和聚硫酯。在某些实施方案中，亲水取代基包含羧基(COOH)、醛基(CHO)、酮基(COC1-4烷基)、羟甲基(CH2OH)或乙二醇(例如，CHOH-CH2OH或CH-(CH2OH)2)、NH2、F、氰基、SO3H、PO3H等。
术语“亲水的”如其涉及本发明的聚合物时通常不会不同于本领域中该术语的使用，且表示包括如上文所定义的亲水官能团的聚合物。在一优选实施方案中，亲水聚合物为水溶性聚合物。聚合物的亲水性可通过测定水合能来直接测量，或通过介于两液相之间的调查确定，或通过具已知疏水性，诸如，例如，C4或C18的固相层析。
“聚合载体”：本文所用的术语聚合载体指的是聚合物或经修饰的聚合物，其适合于共价连接到或可以被共价连接到一个或多个药物分子（其具有指定接头和/或一个或多个具有指定接头的PBRM）。
“生理条件”：术语“生理条件”，如本文所用，涉及活体组织胞外流体中可能遇到的化学(例如：pH、离子强度)和生化(例如：酶浓度)条件范围。对于大部分正常组织而言，生理pH范围为约7.0至7.4。循环血浆及正常间质性流体表示正常生理条件的通常的实例。
“药物”：如本文所用，术语“药物”指的是生物活性的化合物且在施用到有此需求的受试者(例如：活性药物成分)后提供期望的生理效果。
“细胞毒性”：如本文所用，术语“细胞毒性”意指对细胞或对所选的细胞群体(例如：癌症细胞)有毒性。毒性效果可造成细胞死亡和/或裂解。在某些实例中，毒性效果可以是对细胞亚致死的破坏效果，例如：减缓或阻止细胞生长。为了实现细胞毒性效果，药物或前药可以选自以下：DNA损坏剂、微管干扰剂，或细胞毒性蛋白质或多肽、诸如此类。
“抑制细胞生长”：如本文所用，术语“抑制细胞生长”指的是抑制或停止细胞生长和/或繁殖的药物或其他化合物。
“小分子”：如本文所用，术语“小分子”指的是具有相当低分子量的分子(无论是天然发生或人工创造(例如：经由化学合成的)。优选的小分子是生物活性的，其在动物(优选地哺乳动物、更优选地人类)中产生局部或全身效果。在某些优选实施方案中，小分子为药物且所述小分子指的是“药物分子”或“药物”或“治疗剂”。在某些实施方案中，药物分子具有低于或等于约5 kDa的MW。在其他实施方案中，药物分子具有低于或等于约1.5 kDa的MW。在实施方案中，药物分子选自长春花生物碱、奥瑞他汀(auristatin)、倍癌霉素、微管溶素、非天然喜树碱化合物、拓朴异构酶抑制剂、DNA结合药物、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂、卡里奇霉素(calicheamicin)、SN38、吡咯并苯并二氮杂环庚烯基和其类似物。优选地，虽然不是必要的，药物是已经由合适的政府机关或机构例如：FDA认为使用安全且有效的。例如，用于人使用的药物由FDA在21 C.F.R. §§ 330.5,331至361，和440至460中列举；用于兽用的药物由FDA在21 C.F.R. §§ 500至589中列举，通过引用并入本文，全部被认为合适用于与本亲水聚合物一同使用。
本文所用的“药物衍生物”或“经修饰的药物”等指的是包含意图通过本发明的缀合物递送的药物分子和能够将所述药物分子与聚合载体连接的官能团的化合物。
本文所用的“活性形式”指的是呈现意图的体内或体外医学功效的化合物形式。特别是，当将意图通过本发明的缀合物递送的药物分子从所述缀合物释放时，活性形式可为药物本身或其衍生物，其呈现出意图的治疗特性。药物从缀合物释放可以通过裂解接头(其连接药物和聚合载体)的生物可降解键来实现。因此活性药物衍生物可以包含接头的部分。
“PHF”指的是聚(1-羟甲基亚乙基-缩羟甲基甲醛）。
如本文所用，术语“聚合物单元”、“单体的单元”、“单体”、“单体单元”、“单元”全部指聚合物中可重复的结构单元。
如本文所用，聚合物或聚合载体/支架或聚合物缀合物的“分子量”或“MW”指的是未经修饰的聚合物的重量平均分子量，除非另外指明。
本发明意图包括发生在本化合物的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子数但不同质量数的那些原子。通过通常实例且不为限制，氢的同位素包括氚和氘。碳的同位素包括C-13和C-14。
本发明意图包括化合物的所有异构体，其指的是且包括光学异构体和互变异构体，其中光学异构体包括对映异构体及非对映异构体、手性异构体及非手性异构体，且光学异构体包括经分离的光学异构体以及光学异构体的混合物，其包括外消旋及非外消旋混合物；其中异构体可以是经分离的形式或与一种或多种其他异构体的混合物。
HER2抗体
本发明的单克隆抗体具有抑制HER2-介导的PI3K-Akt途径活性的能力。
示例性的本发明的抗体包括，例如，XMT 1517抗体、XMT 1518抗体、XMT 1519抗体和XMT 1520抗体。这些抗体显示对人HER2的特异性且他们已显示出体外抑制HER2的功能活性。
本文所描述的HER2单克隆抗体各自包括重链(HC)、重链可变区(VH)、轻链(LC)和轻链可变区(VL)，如下文呈现的氨基酸和相应的核酸序列显示的。各抗体的可变重链区和可变轻链区在下文氨基酸序列中被划阴影。重链和轻链的互补性决定区(CDR)在下文呈现的氨基酸序列中加下划线。涵盖互补性决定区(CDR)的氨基酸如同E.A. Kabat 等人 (见Kabat, E.A., 等人, Sequences of Protein of immunological interest, FifthEdition, US Department of Health and Human Services, US Government PrintingOffice (1991)) 所定义的。
>XMT 1517重链氨基酸序列(重链可变区(SEQ ID NO: 9) + IgG1重链恒定区(SEQ ID NO: 32))
>XMT 1517重链可变区核酸序列
>XMT 1517轻链氨基酸序列(轻链可变区(SEQ ID NO: 10) + 轻链恒定区(SEQ ID NO:33))
>XMT 1517轻链可变区核酸序列
>XMT 1518重链氨基酸序列(重链可变区(SEQ ID NO: 11) + IgG1重链恒定(SEQ IDNO: 32))
>XMT 1518轻链氨基酸序列(轻链可变区(SEQ ID NO: 12) + 轻链恒定(SEQ ID NO:33))
>XMT 1519 重链氨基酸序列(重链可变区(SEQ ID NO: 13)
+ IgG1重链恒定区(SEQ ID NO: 32))
>XMT 1519重链可变区核酸序列
>XMT 1519轻链氨基酸序列(轻链可变区(SEQ ID NO: 14) + 轻链恒定区(SEQ ID NO:33))
>XMT 1519轻链可变区核酸序列
>XMT 1520重链氨基酸序列(重链可变区(SEQ ID NO: 15) + IgG1重链恒定区(SEQ IDNO: 32))
>XMT 1520 轻链氨基酸序列(轻链可变区(SEQ ID NO: 16) + 轻链恒定区 (SEQ IDNO: 33))
同样包括在本发明中的是与本文所描述的抗体和其抗原结合片段结合至相同表位或交互竞争结合到相同表位的抗体和其抗原结合片段。例如，本发明的抗体和抗原结合片段特异性结合至HER2，其中所述抗体或片段结合至包括人HER2上一个或多个氨基酸残基的表位(例如：GenBank登录号P04626.1)。
本发明的抗体和其抗原结合片段特异性结合至全长人HER2受体的表位，其包含氨基酸序列：
本发明的抗体和其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的胞外结构域(ECD)上的表位，其包含氨基酸序列：
如果单克隆抗体具有如本发明的单克隆抗体(例如：XMT 1517、XMT 1518、XMT 1519和XMT 1520)相同的特异性，本领域技术人员将认可可能通过确定是否前者防止后者结合至天然结合配偶体或其他已知与HER2相关的分子来进行确定（而不需过多的实验）。如果测试的单克隆抗体与本发明的单克隆抗体竞争，如通过降低本发明的单克隆抗体的结合显示，则两种单克隆抗体结合至相同或密切相关的表位。
确定单克隆抗体是否具有本发明的单克隆抗体的特异性的可选方法是将本发明的单克隆抗体与可溶性HER2预温育(其为正常反应)，并随后加入所测试的单克隆抗体以确定所测试的单克隆抗体是否在结合HER2的能力上受到抑制。如果所测试的单克隆抗体受到抑制，则在所有可能性，其具有如本发明的单克隆抗体的相同的或功能上等同的表位特异性。
本发明的单克隆抗体的筛选也可以通过例如，通过测量HER2-介导的PI3K-Akt途径活性，并确定测试单克隆抗体是否能够调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或者干扰PI3K-Akt途径活性来进行。
产生HER2抗体，例如，使用本文提供的实施例所述的方法。可选地或另外地，可使用本领域中已知的各种程序产生针对HER2，或针对其衍生物、片段、类似物、同源物或直向同源物的单克隆抗体。(见，例如，Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, andLane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，通过引用并入本文)。全人抗体是其中轻链和重链两者的整个序列(包括CDR)衍生自人基因的抗体分子。这样的抗体在本文被称为“人抗体”或“全人抗体”。制备人单克隆抗体，例如，使用下文提供的实施例中描述的程序。人单克隆抗体也可使用三源杂交瘤技术；人B-细胞杂交瘤技术(见Kozbor, 等人, 1983 Immunol Today 4: 72)；和EBV杂交瘤技术产生人单克隆抗体(见Cole, 等人, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, AlanR. Liss, Inc., pp. 77-96)来制备。可以使用人单克隆抗体且可以通过使用人杂交瘤(见Cote, 等人, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030)或在体外通过艾巴病毒转化人B-细胞(见Cole, 等人, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 来产生人单克隆抗体。
通过熟知的技术纯化抗体，诸如使用蛋白质A或蛋白质G的亲和层析，其主要提供免疫血清的IgG级分。随后，或可选地，可以将作为免疫球蛋白寻找的标靶的特定抗原，或其表位，固定在柱上以通过免疫亲和层析纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化由，例如，D. Wilkinson (The Scientist, 由The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14,No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28公开)讨论。
调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其他方式干扰HER2介导的PI3K-Akt途径活性的单克隆抗体例如：通过以膜结合和/或可溶性HER2诸如，例如，鼠科、大鼠或人HER2或其免疫原性片段、衍生物或变体来免疫动物产生。可选地，使用含编码HER2的核酸分子的载体转染的细胞免疫动物，使得HER2被表达且与经转染的细胞的表面相连。可选地，通过筛选含有结合至HER2的抗体或抗原结合域序列的文库获得所述抗体。该文库在例如，噬菌体中作为融合至噬菌体外壳蛋白的蛋白质或肽制备，所述噬菌体外壳蛋白表达在组装的噬菌体颗粒表面并且将编码的DNA序列包含在噬菌体颗粒中(即“噬菌体展示文库”)。随后对于针对HER2的反应性筛选得自骨髓瘤/B细胞融合的杂交瘤细胞。另外，抗体选自，如描述于例如：Blaise L, Wehnert A, Steukers MP, van den Beucken T, Hoogenboom HR, HuftonSE. Construction and diversification of yeast cell surface displayedlibraries by yeast mating: application to the affinity maturation of Fabantibody fragments. Gene. 2004 Nov 24;342(2):211-8；Boder ET, Wittrup KD.Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. NatBiotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7；Kuroda K, Ueda M. Cell surface engineeringof yeast for applications in white biotechnology. Biotechnol Lett. 2011 Jan;33(1):1-9. doi: 10.1007/s10529-010-0403-9. Review；Lauer TM, Agrawal NJ,Chennamsetty N, Egodage K, Helk B, Trout BL. Developability index: a rapid insilico tool for the screening of antibody aggregation propensity. J PharmSci. 2012 Jan;101(1):102-15；Orcutt K.D. and Wittrup K.D. (2010), 207-233 doi:10.1007/978-3-642-01144-3_15；Rakestraw JA, Aird D, Aha PM, Baynes BM,Lipovsek D. Secretion-and-capture cell-surface display for selection oftarget-binding proteins. Protein Eng Des Sel. 2011 Jun;24(6):525-30；US 8,258,082；US 6,300,064；US 6,696,248；US 6,165,718；US 6,500,644；US 6,291,158；US 6,291,159；US 6,096,551；US 6,368,805；US 6,500,644中的酵母抗体展示文库和酵母文库展示系统中，并任选地在其中优化。示例性的酵母文库展示系统描述于例如，WO2008118476；WO2009/036379；WO2010105256；和WO2012009568中。在某些实施方案中，这样的酵母抗体展示文库或酵母文库展示系统被设计以模拟或反映人免疫前抗体谱的多样性特征。在某些实施方案中，这样的酵母抗体展示文库多样性或酵母文库展示系统多样性在硅中产生。在某些实施方案中，这样的酵母抗体展示文库或酵母文库展示系统包含酵母属(Saccharomyces)酵母细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)细胞。在某些实施方案中，这样的酵母抗体展示文库或酵母文库展示系统包括毕赤酵母属(Pichia)细胞。
单克隆抗体使用例如，杂交瘤方法诸如由Kohler 和 Milstein, Nature, 256:495 (1975)描述的那些进行制备。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物通常以免疫剂免疫以引发产生或能够产生将特异性结合至免疫剂的抗体的淋巴细胞。可选地，所述淋巴细胞可在体外免疫。
免疫剂会通常包括蛋白质抗原、其片段或其融合蛋白。通常，如果期望人来源细胞，使用外周血淋巴细胞，或如果期望非人哺乳动物来源，使用脾细胞或淋巴结细胞。淋巴细胞随后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,(1986) pp. 59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，运用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在合适的培养基(优选地含有一种或多种抑制未融合、永生化细胞的生长或存活的物质)中培养杂交瘤细胞。例如，如果亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常地将包括次黄嘌呤、胺喋呤和胸苷(“HAT介质”)，其物质避免了HGPRT-缺陷的细胞生长。
优选的永生化细胞系是有效融合、支持所选择抗体-生产细胞的抗体稳定高水平表达、且对介质诸如HAT介质敏感的那些。更优选的永生化细胞系是鼠科骨髓瘤系，其可以例如从Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and theAmerican Type Culture Collection, Manassas, Virginia 获得。人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生单克隆抗体。(见Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984); Brodeur 等人, Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63))。
可以随后对在其中培养杂交瘤细胞的培养基测定针对抗原的单克隆抗体存在。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性由免疫沉淀法或由体外结合测定，诸如放射性免疫测定(RIA)或酶连接免疫吸附测定(ELISA)进行确定。这样的技术和测定是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以通过，例如，Munson 和 Pollard, Anal.Biochem., 107:220 (1980)的Scatchard分析进行确定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，鉴定对标靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体是重要的。
在鉴定期望的杂交瘤细胞后，可以通过有限的稀释程序对克隆进行亚克隆并由标准方法生长。(见Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,Academic Press, (1986) pp. 59-103)。针对该目的的合适的培养基包括，例如，Dulbecco’s改良Eagle’s培养基和RPMI-1640培养基。可选地，杂交瘤细胞可以在如同哺乳动物腹水中体内生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序诸如，例如，蛋白质A-琼脂糖、羟磷石灰层析、凝胶电泳、透析或亲和层析术从培养基或腹水液分离或纯化。
也可以通过重组DNA方法制备单克隆抗体，诸如描述于美国专利号4,816,567的那些。编码本发明的单克隆抗体的DNA可以使用常规程序而容易地分离并测序(例如，通过使用能够特异性结合到编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞作为此类DNA的优选的来源。一旦经分离，DNA可以被置入表达载体，所述表达载体随后被转染至不会以其他方式产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞诸如：猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体合成。DNA也可经修饰，例如，通过人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(见美国专利号4,816,567；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))或通过共价连接全部或部分的非免疫球蛋白多肽编码序列至免疫球蛋白编码序列。这样的非免疫球蛋白多肽可以取代本发明的抗体的恒定结构域，或可取代本发明的抗体的一个抗原-结合位点的可变结构域以创造嵌合二价抗体。
本发明的单克隆抗体包括全人抗体或人源化抗体。这些抗体适合用于施用至人而不会引起由人对抗所施用的免疫球蛋白产生的免疫应答。
产生人源化或全人HER2抗体，例如，使用下文提供的实施例中描述的程序。
在另外的、可选的方法中，开发HER2抗体，例如，使用噬菌体-展示方法，使用仅含有人序列的抗体。这样的方法是本领域熟知的，例如，在WO92/01047和美国专利号6,521,404中，其通过引用并入本文。在该方法中，使用天然或重组来源的HER2或其片段筛选携带轻链和重链随机对的噬菌体组合文库。在另一方法中，HER2抗体可以通过这样的方法产生，其中所述方法的至少一个步骤包括以人HER2蛋白质免疫转基因的、非人动物。在该方法中，该异种非人动物的一些内源性重链和/或κ轻链基因座已失能且不能重排(其是产生编码应答抗原的免疫球蛋白的基因所需的)。另外，至少一个人重链基因座和至少一个人轻链基因座已被稳定地转染至动物中。因此，为应答所施用的抗原，人基因座重排以提供编码对抗原免疫特异的人可变区的基因。因此在免疫后，基因转殖鼠(xenomouse)产生分泌全人免疫球蛋白的B-细胞。
生产异种非人动物的各种技术是本领域熟知的。例如，见美国专利号6,075,181和6,150,584，其整体通过引用并入本文。该通常策略证实与于1994年公开的第一种基因转殖鼠(xenomouse)™品系的产生有关。见Green 等人 Nature Genetics 7:13-21 (1994)，其整体通过引用并入本文。也见美国专利号6,162,963、6,150,584、6、114,598、6,075,181和5,939,598与日本专利号3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2和欧洲专利号EP 0463 151 B1和国际专利申请号WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310与其相关族成员。
在可选方法中，其他还利用了“微基因座(minilocus)”方法，其中通过包含来自Ig基因座的片段(个别基因)模仿了外源性Ig基因座。因此，一种或多种VH基因、一种或多种DH基因、一种或多种JH基因、μ恒定区和第二恒定区(优选地γ恒定区)形成至用于插入动物中的构建体中。见例如，美国专利号5,545,806；5,545,807；5,591,669；5,612,205；5,625,825；5,625,126；5,633,425；5,643,763；5,661,016；5,721,367；5,770,429；5,789,215；5,789,650；5,814,318；5,877；397；5,874,299；6,023,010；和6,255,458；和欧洲专利号0 546073 B1；和国际专利申请号WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884与相关族成员。
在小鼠中产生人抗体，通过微细胞融合、大片段染色体或整个染色体引入的所述小鼠已被介绍、也被验证。见欧洲专利申请号773 288和843 961。
人抗-小鼠抗体(HAMA)应答已经引导产业制备嵌合的或者以其他方式人源化的抗体。当嵌合抗体具有人恒定区域和免疫可变区时，预期将观察到某些人抗-嵌合抗体(HACA)应答，特别是在抗体的长期或多剂量使用中。因此，期望提供针对HER2的全人抗体以削弱或者以其他方式减轻HAMA或HACA应答的顾虑和/或效果。
产生具降低的免疫原性的抗体也通过使用合适的文库的人源化、嵌合化和展示技术完成。将了解鼠抗体或来自其他物种的抗体可使用本领域熟知的技术被人源化或灵长类化。见例如，Winter和Harris Immunol Today 14:43 46 (1993)和Wright 等人 Crit,Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)。目的抗体可以通过重组DNA技术进行工程改造使用相应的人序列取代CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域(见WO 92102190和美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,792；5,714,350；以及5,777,085)。同样地，使用Ig cDNA用于嵌合免疫球蛋白基因的构建是本领域已知的(Liu 等人 P.N.A.S.84:3439 (1987)和J. Immunol. 139:3521 (1987))。将mRNA从杂交瘤或其他生产抗体的细胞分离并用于产生cDNA。目的cDNA可以通过聚合酶链反应使用特定引物扩增(美国专利号4,683,195和4,683,202)。可选地，构建并筛选文库以分离目的序列。编码抗体可变区的DNA序列随后融合到人恒定区域序列。人恒定区基因序列可在Kabat 等人 (1991) Sequencesof Proteins of immunological Interest, N.I.H. 公开号91-3242中发现。人C区域基因可从已知克隆容易地获得。同种型的选择将由期望的效应子功能(诸如：补体结合)，或对抗体-依赖性细胞性细胞毒性的活性所引导。优选的同种型为IgG1、IgG3和IgG4。可使用人轻链恒定区，κ或λ。随后通过常规方法表达嵌合的人源化抗体。
抗体片段，诸如：Fv、F(ab’)2和Fab可以通过裂解完整蛋白质，例如，通过蛋白酶或化学裂解。可选地，设计截短基因。例如，编码F(ab’)2片段的部分的嵌合基因将包括编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列，随后为翻译终止密码子以产生截短分子。
H和L J 区的共有序列可用以设计用作为引物的寡核苷酸，来引入有用的限制位到J区用于后续键合V区区段到人C区区段。可以通过定点诱变修饰C区cDNA来在人序列的类似位置置入限制位点。
表达载体包括质粒、逆转录病毒、YAC、EBV衍生的游离基因等。方便的载体是编码功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体，其具有经工程改造的合适的限制位点使得任何VH或VL序列可容易地插入并表达。在此载体中，剪接通常发生在插入的J区域中的剪接供体位点与在前的人C区域的剪接受体位点之间，且也在发生在人CH外显子中的剪接区。多腺核苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。所得的嵌合抗体可结合到任何强启动子，包括逆转录病毒LTR，例如，SV-40早期启动子、(Okayama 等人 Mol. Cell. Bio.3:280 (1983))、劳斯氏肉瘤病毒LTR(Gorman 等人 P.N.A.S. 79:6777 (1982))和莫洛尼氏鼠白血病病毒LTR(Grosschedl 等人 Cell 41:885 (1985))。同样地，将了解到可使用天然Ig启动子等。
进一步地，可通过展示型技术，包括但不限于噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示和其他技术，使用本领域熟知的技术产生人抗体或来自其他物种的抗体并且可以使所得分子经历另外的成熟，诸如：亲和力成熟，此类技术是本领域熟知的。Wright 等人Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)、Hanes和Plückthun PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (核糖体展示)、Parmley和Smith Gene 73:305-318 (1988) (噬菌体展示),Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992)、Cwirla 等人 PNAS USA 87:6378-6382 (1990)、Russel 等人 Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993)、Hoganboom 等人 Immunol.Reviews 130:43-68 (1992)、Chiswell 和McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992)和美国专利号5,733,743。如果利用展示技术产生不为人的抗体，此类抗体可以如上所述经人源化。
使用这些技术，可产生抗体到HER2表达细胞、可溶性形式的HER2、其表位或肽和其表达文库(见例如，美国专利号5,703,057)，其随后可如上所述经筛选本文所描述的活性。
本发明的HER2抗体可以通过含有编码上述的单链抗体的DNA区段的载体表达。
这些可包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助的DNA、基因枪、导管等。载体包括化学缀合物诸如WO 93/64701中描述的，其具有标靶部分(例如，针对细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如，多赖氨酸)、病毒载体(例如，DNA或RNA病毒载体)、融合蛋白质诸如PCT/US 95/02140 (WO 95/22618)中描述的，其为含有标靶部分(例如，对靶细胞专一的抗体)的融合蛋白和核酸结合部分(例如，鱼精蛋白)、质粒、噬菌体等。载体可为染色体的、非染色体的或合成的。
优选的载体包括病毒载体、融合蛋白质和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼氏鼠白血病病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘载体诸如：正天花或禽痘载体、疱疹病毒载体诸如：单纯疱疹I病毒 (HSV)载体 (见Geller, A. I. 等人, J. Neurochem,64:487 (1995)；Lim, F., 等人, in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover,Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995)；Geller, A. I. 等人, ProcNatl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993)；Geller, A. I., 等人, Proc Natl. Acad.Sci USA 87:1149 (1990), Adenovirus Vectors (见LeGal LaSalle 等人, Science,259:988 (1993)；Davidson, 等人, Nat. Genet 3:219 (1993)；Yang, 等人, J. Virol.69:2004 (1995)和Adeno-associated Virus Vectors (见Kaplitt, M. G. 等人, Nat.Genet. 8:148 (1994)。
痘病毒载体将基因导入至细胞胞质。禽痘病毒载体导致核酸仅短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体优选将核酸引入神经细胞。腺病毒载体造成比腺相关病毒(约4个月)更短期的表达(约2个月)，其因而比HSV载体短。具体载体的选择将取决于靶细胞和所处理的条件。导入可通过标准技术例如，感染、转染、转导或转化。基因转移模式的实例包括例如，裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE聚葡糖、电穿孔、原生质体 融合、脂质体转染、细胞显微注射和病毒载体。
可采用载体靶向基本上任何期望的靶细胞。例如，可使用立体定位注射引导载体(例如，腺病毒、HSV)到期望的位置。此外，可以使用微型泵灌注系统(诸如：SynchroMedInfusion System)通过侧脑室(intracerebroventricular) (icv)输注递送颗粒。根据整体流动的方法，称为对流，也证实对递送大分子到脑的扩张区域是有效的且可用于递送载体到靶细胞。(见Bobo 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994);Morrison 等人, Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994))。可以使用的其他方法包括导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和皮下注射和口服或其他已知的施用途径。
可使用这些载体表达可用于各种方法的大量抗体。例如，检测样品中的HER2存在。也可使用抗体尝试结合并中断HER2-相关的信号传导。
可采用技术产生特异于本发明的抗原性蛋白质的单链抗体(见例如，美国专利号4,946,778)。此外，可采用方法构建Fab表达文库(见例如，Huse, 等人, 1989 Science 246:1275-1281)以使得快速且有效地鉴定单株Fab片段(其具有对蛋白质或其衍生物、片段、类似物或同源物的期望的特异性)。含有对蛋白质抗原的个体基因型(idiotype)的抗体片段可以通过本领域中已知的技术产生，包括但不限于：(i)由胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片段；(ii)由降低F(ab’)2片段的二硫桥产生的Fab片段；(iii)以木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段和(iv)Fv片段。
本发明还包括Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2抗-HER2片段或抗-HER2片段、单链抗-HER2抗体、多特异性抗体(其中至少一个臂结合HER2)和异源缀合抗-HER2抗体。
双特异性抗体为对至少二种不同抗原具有结合特异性的抗体。在此情况中，结合特异性之一为针对HER2。所述第二结合靶标为任何其他抗原，包括细胞表面蛋白质或受体或受体亚基。
制备双特异性抗体的方法为本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重和轻链随机分选，这些杂交瘤(细胞杂交瘤(quadromas))产生潜在的10种不同抗体分子的混合物，其中仅有一者具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤实现。类似程序公开于1993年5月13日公布的WO 93/08829，和在Traunecker 等人, EMBO J., 10:3655-3659 (1991)中。
具有期望的结合特异性 (抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域可融合到免疫球蛋白恒定结构域序列。融合优选地是与免疫球蛋白重链恒定结构域，其包括至少部分的铰链CH2和CH3区。优选具有第一重链恒定区(CH1)，其包含存在于至少一种融合中轻链结合所必需的位置。编码免疫球蛋白重链融合和如需要的免疫球蛋白轻链的DNA插入到分开的表达载体，且共转染到合适的宿主生物体。产生双特异性抗体的进一步细节见，例如，Suresh 等人, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)。
根据WO 96/27011中所述的另一种方法，在一对抗体分子之间的交界面可以经工程改造以最大化异二聚体的百分比，所述异二聚体从重组细胞培养物回收。优选的交界面包括至少一部分抗体恒定结构域的CH3区域。在该方法中，来自第一抗体分子交界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小的氨基酸(例如，丙氨酸或苏氨酸)取代较大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的交界面上创造对大侧链相同或类似大小的补偿“腔室”。这提供了相较其他不期望的终产物诸如：同源二聚体，增加异二聚体的产量的机制。
可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab’)2双特异性抗体)。从抗体片段生成双特异性抗体的技术已述于文献中。例如，双特异性抗体可使用化学键合制备。Brennan 等人, Science 229:81 (1985)描述了其中完整抗体被蛋白水解裂解来生成F(ab’)2片段的程序。这些片段在二硫酚络合剂亚砷酸钠存在下被还原为稳定的邻近二硫酚并且阻止了分子间二硫化物形成。生成的Fab’片段随后转换为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。Fab’-TNB衍生物之一随后通过使用巯基乙基胺还原再转变成Fab’-硫醇，并且与等摩尔量的其他Fab’-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作为酶的选择性固定剂。
此外，Fab’片段可以直接从大肠杆菌回收并化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby 等人, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)描述了全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。各Fab’片段分别地从大肠杆菌分泌并且在体外进行导向性化学偶联以形成双特异性抗体。因此形成的双特异性抗体能够结合至过表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶标的溶胞活性。
还描述了用于直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny 等人, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接至两种不同抗体的Fab’部分。在铰链区域还原抗体同源二聚体以形成单体，并且随后再氧化以形成抗体异二聚体。也可以使用该方法用于产生抗体同源二聚体。由Hollinger 等人, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)描述的“双体(diabody)”技术已提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。片段包含通过接头(所述接头太短以至于不能在相同链上在两个结构域之间配对)连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略。见，Gruber 等人,J. Immunol. 152:5368 (1994)。
考虑了具有超过二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt 等人, J.Immunol. 147:60 (1991)。
示例性的双特异性抗体可以结合至两个不同的表位，其中至少一个来自本发明的蛋白质抗原。可选地，免疫球蛋白分子的抗-抗原性臂可以与结合白细胞触发分子的臂组合(诸如：T-细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)，或结合至对于IgG (FcγR)(诸如：FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)和FcγRIII (CD16)的Fc受体，从而将细胞防御机制集中至表达特定抗原的细胞。双特异性抗体也可以用于引导细胞毒性剂至表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂(诸如：EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。另一种有兴趣的双特异性抗体结合本文所述的蛋白质抗原并进一步结合组织因子(TF)。
杂缀合抗体也于本发明的范畴中。杂缀合抗体由两个共价连接的抗体构成。此类抗体已经例如，提出将免疫系统细胞靶向至不期望的细胞(见美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(见WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。考虑了所述抗体可以在体外使用合成蛋白质化学中已知的方法进行制备，包括涉及交联剂的那些。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于该目的的合适的试剂的实例包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁基酰亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)和在例如美国专利号4,676,980中公开的那些。
可以期望对于效应子功能修饰本发明的抗体，从而增强例如，抗体在治疗与异常HER2表达和/或活性相关的疾病与病症中的功效。例如，可以将半胱氨酸残基导入至Fc区域，从而允许链间二硫键在该区域形成。因此产生的同源二聚体性抗体具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。(见Caron 等人,J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)和Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922(1992))。可选地，抗体可以经工程改造成具有双Fc区且可以因而具有增强的补体溶解与ADCC能力。(见Stevenson 等人, Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989))。
HER2抗体缀合物：
本发明还涉及免疫缀合物，其包括缀合至细胞毒性剂诸如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)，或放射性同位素(即放射缀合物)的抗体。
可以使用的酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、莫迪素(modeccin)A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝裂胶素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和新月毒素(tricothecene)。可以获得各种放射性核素用于产生放射缀合的抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
使用下述各种双功能性蛋白质偶联剂制造抗体和细胞毒性剂的缀合物，诸如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯 (SPDP)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺基酯的双功能性衍生物(诸如：二甲基亚氨酸酯HCL)、活性酯(诸如：二琥珀酰亚胺基栓酸酯)、醛(诸如：戊醛)、双-迭氮基化合物(诸如：双(对迭氮基苯甲酰基)己烷二胺)、双-重氮衍生物 (诸如：双-(p-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如：伸甲苯2,6-二异氰酸酯)、双活性氟化合物(诸如：1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如述于Vitetta 等人, Science 238:1098 (1987)制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-经标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)为示例性螯合剂用以缀合放射性核苷酸至抗体。(见WO94/11026)。
本领域技术人员将认识到可以将众多可能的部分偶联至本发明的所得抗体。(见，例如，“Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J.M. Cruse和R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)，其整体内容通过引用并入本文)。
只要抗体与其他部分维持其各自的活性，偶联可以以通过将结合两分子的任何化学反应完成。该键合可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、插入、配位结合和络合。然而优选的结合为共价结合。共价结合可以通过直接缩合现有侧链或由并入外部桥接分子而实现。许多二价或多价连接剂可以用于将蛋白质分子，诸如本发明的抗体，偶联至其他分子。例如，代表性偶联剂可以包括有机化合物诸如：硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺 酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯与己二胺。该列举不意图穷尽本领域已知的各种类型的偶联剂，而是为例示更常见的偶联剂。(见Killen和Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549(1984)；Jansen 等人, Immunological Reviews 62:185-216 (1982)；和Vitetta 等人,Science 238:1098 (1987)。
优选的接头描述于文献中。(见，例如，Ramakrishnan, S. 等人, Cancer Res.44:201-208 (1984)描述了MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟琥珀酰亚胺酯)的使用。也见美国专利号5,030,719，描述了使用卤素化乙酰肼衍生物通过寡肽接头偶联到抗体。特别地，优选的接头包含：（i）EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；（ii）SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯 (Pierce Chem. Co.,Cat. (21558G)；（iii）SPDP(琥珀酰亚胺基-6 [3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]已酸酯(Pierce Chem. Co., Cat.# 21651G)；（iv）磺基-LC-SPDP (磺基琥珀酰亚胺基6 [3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]已酸酯 (Pierce Chem. Co. Cat.# 2165-G)；和（v）缀合到EDC的磺基-NHS (N-羟磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem. Co., Cat.# 24510)。
上述接头包含具有不同属性的组分，因此导致缀合物具有不同物理化学特性。例如，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳香族羧酸酯的磺基-NHS酯更稳定。含NHS-酯的接头比磺基-NHS酯可溶性更低。此外，接头SMPT包含空间位阻的二硫键，并且可以形成具有增加的稳定性的缀合物。通常，二硫键比其他键不稳定，因为二硫键在体外裂解，导致得到更少的缀合物。特别地，磺基-NHS可以增强碳二亚胺偶联的稳定性。当碳二亚胺偶联(诸如EDC)连同磺基-NHS一起使用时，形成比碳二亚胺单独进行偶联反应对水解作用更具抗性的酯。
本发明的抗体也可以配制为免疫脂质体。通过本领域中已知的方法制备含脂质体的抗体，所述方法描述于诸如Epstein 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688(1985)；Hwang 等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；和美国专利号4,485,045与4,544,545。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556中。
特别有用的脂质体可以通过逆相蒸发方法使用包括卵磷脂、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE)的脂质组合物生成。通过限定孔径的过滤器挤出脂质体以产生具有期望直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可以通过二硫化物-互换反应缀合到脂质体，如Martin 等人, J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)中描述的。
在一个方面中，本文描述的缀合物包括直接或间接连接至一个或多个D-负载聚合物支架的经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段，所述支架独立地包含具有分子量范围约2kDa至约40 kDa的聚(1-羟基甲基乙烯基羟甲基-缩甲醛)(PHF)，其中一个或多个D-负载聚合物支架各自独立地为式(Ic)：
其中：
D的每次出现独立地为治疗剂或诊断剂；
LD1为含羰基部分；
中的每次出现独立地为含有生物可降解键的第一接头，使得当键断裂时，D以活性形式释放用于其意图的治疗效果；并且中LD1与D之间的表示D与LD1直接或间接连接；
的每次出现独立地为尚未连接至经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段的第二接头，其中LP2为含有还未与经分离的抗体或其抗原-结合片段的官能团形成共价键的官能团的部分，且LD1与LP2之间的表示LP2与LD1直接或间接连接，且第二接头的每次出现不同于第一接头的每次出现；
的每次出现独立地为连接各D-负载聚合物支架至经分离的抗体或其抗原-结合片段的第三接头，其中连接到LP2的端表示LP2的官能团与经分离的抗体或其抗原-结合片段的官能团之间形成共价键后，LP2直接或间接连接至经分离的抗体或其抗原-结合片段；并且第三接头的每次出现不同于第一接头的每次出现；
m为1至约300的整数，
m1为1至约140的整数，
m2为1至约40的整数，
m3为0至约18的整数，
m4为1至约10的整数；
m、m1、m2、m3和m4的总和范围约15至约300；并且连接至经分离的抗体或其抗原-结合片段的LP2总数为10或更少。
缀合物可以包括一个或多个下述特征。
例如，在式(Ic)，m1为1至约120的整数(例如，约1-90)和/或m3为1至约10的整数(例如，约1-8)。
例如，当式(Ic)中的PHF具有分子量范围约6 kDa至约20 kDa(即m、m1、m2、m3和m4的总和范围为约45至约150)时，m2为2至约20的整数、m3为0至约9的整数、m4为1至约10的整数和/或m1为1至约75的整数(例如，m1为约4-45)。
例如，当式(Ic)中的PHF具有分子量范围约8 kDa至约15 kDa(即m、m1、m2、m3和m4的总和范围为约60至约110)时，m2为2至约15的整数、m3为0至约7的整数、m4为1至约10的整数和/或m1为1至约55的整数(例如，m1为约4-30)。
例如，当式(Ic)中的PHF具有分子量范围约2 kDa至约20 kDa(即m、m1、m2、m3和m4的总和范围为约15至约150)时，m2为1至约20的整数、m3为0至约10的整数(例如，m3范围为0至约9)、m4为1至约8的整数和/或m1为1至约70的整数和连接到经分离的抗体或其抗原结合片段的LP2总数范围约2至约8(例如，约2、3、4、5、6、7或8)。
例如，当式(Ic)中的PHF具有分子量范围约3 kDa至约15 kDa(即m、m1、m2、m3和m4的总和范围为约20至约110)时，m2为2至约15的整数、m3为0至约8的整数(例如，m3范围为0至约7)、m4为1至约8的整数和/或m1为2至约50的整数，并且连接至经分离的抗体或其抗原结合片段的LP2总数范围约2至约8(例如，约2、3、4、5、6、7或8)。
例如，在式(Ic)中的PHF具有分子量范围约5 kDa至约10 kDa(即m、m1、m2、m3和m4的总和范围约40至约75)时，m2为约2至约10的整数(例如，m2为约3-10)、m3为0至约5的整数(例如，m3范围为0至约4)、m4为1至约8的整数(例如，m4范围为1至约5)和/或m1为约2至约35的整数(例如，m1为约5-35)，且连接到经分离的抗体或其抗原结合片段的LP2总数范围约2至约8(例如，约2、3、4、5、6、7或8)。
例如，当PHF具有分子量范围2 kDa至40 kDa(例如，约6-20 kDa或约8-15 kDa、约2-20 kDa或约3-15 kDa或约5-10 kDa)时，每PHF的药物数量(例如，m2)为1至约40的整数(例如，约1-20，或约2-15或约3-10或约2-10)。该支架可以用于，例如，缀合具有40 kDa或更大的分子量(例如，60 kDa或更大；80 kDa或更大；100 kDa或更大；120 kDa或更大；140 kDa或更大；160 kDa或更大、180 kDa或更大或200 kDa或更大或约40-200 kDa、40-180 kDa、40-140 kDa、60-200 kDa、60-180 kDa、60-140 kDa、80-200 kDa、80-180 kDa、80-140 kDa、100-200 kDa、100-180 kDa、100-140 kDa或140-150 kDa)的经分离的抗体或其抗原-结合片段。在该实施方案中，经分离的抗体或其抗原-结合片段与PHF的比为约1：1至约1：10、约1：1至约1：9、约1：1至约1：8、约1：1至约1：7、约1：1至约1：6、约1：1至约1：5、约1：1至约1：4、约1：1至约1：3、约1：1至约1：2、约1：2至约1：4、约1：2至约1：3、约1：3至约1：4，或约1：3至约1：5。
例如，当PHF具有分子量范围2 kDa至40 kDa(例如，约6-20 kDa或约8-15 kDa、约2-20 kDa或约3-15 kDa或约5-10 kDa)时，每PHF的药物数量(例如，m2)为1至约40的整数(例如，约1-20，或约2-15或约3-10或约2-10)。该支架可以用于，例如，缀合具有分子量为140 kDa至180 kDa或140 kDa至150 kDa的经分离的抗体或其抗原-结合片段。在此实施方案中，经分离的抗体或其抗原-结合片段与PHF的为约1：1至约1：10、约1：1至约1：9、约1：1至约1：8、约1：1至约1：7、约1：1至约1：6、约1：1至约1：5、约1：1至约1：4、约1：1至约1：3、约1：1至约1：2、约1：2至约1：4、约1：2至约1：3、约1：3至约1：4或约1：3至约1：5。
在该分子量范围的经分离的抗体或其抗原-结合片段包括但不限于，例如全长抗体，诸如IgG、IgM。
例如，当PHF具有分子量范围2 kDa至40 kDa时，每PHF的药物数量(例如，m2)为1至约40的整数(例如，约1-20或约2-15或约3-10或约2-10)。该支架可以用于，例如，缀合具有分子量为60 kDa至120 kDa的经分离的抗体或其抗原-结合片段。在该实施方案中，经分离的抗体或其抗原-结合片段与PHF的比为约1：1至约1：10、约1：1至约1：9、约1：1至约1：8、约1：1至约1：7、约1：1至约1：6、约1：1至约1：5、约1：1至约1：4、约1：1至约1：3、约1：1至约1：2、约1：2至约1：4、约1：2至约1：3、约1：3至约1：4或约1：3至约1：5。
在该分子量范围的经分离的抗体或其抗原-结合片段包括但不限于，例如，抗体片段诸如，例如，Fab2和骆驼科的。
在某些实施方案中，D为治疗剂。在某些实施方案中，所述治疗剂为具有分子量≤约5 kDa、≤ 约4 kDa、≤ 约3 kDa、≤ 约1.5 kDa，或≤ 约1 kDa的小分子。
在某些实施方案中，所述治疗剂具有约小于1 nM的IC50。
在另一个实施方案中，治疗剂具有约大于1 nM的IC50，例如，治疗剂具有约1至50nM的IC50。
一些具有IC50大于约1 nM(例如，“较低功效的药物”)的治疗剂不适于使用本领域公认的缀合技术与抗体缀合。不意欲受到理论束缚，此类治疗剂所具有的效力使用常规技术不足以用于靶标抗体-药物缀合物，因为使用本领域认可以技术不能缀合药物的足够的副本(即超过8个)而不导致减少缀合物的药物动力学和物理化学特性。然而，使用本文所描述的缀合策略可以实现这些较低效力药物的充分的高负载，因而产生高负载的治疗剂同时维持期望的药物动力学和物理化学特性。因此，本发明也涉及抗体-聚合物-药物缀合物，其包含经分离的抗体或其抗原-结合片段、PHF和至少8个治疗剂部分，其中D为奥瑞他汀(auristatin)、尾海兔素、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、奥瑞他汀(auristatin)F、AF HPA、苯二胺(AFP)。
例如，倍癌霉素或其类似物为倍癌霉素A、倍癌霉素 B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素 D、倍癌霉素SA、CC-1065、阿多来新(adozelesin)、比折来新(bizelesin)，或卡折来新(carzelesin)。
D的其他实例包括公开于下述者，例如，美国申请公开号2013-0101546和美国专利号8,815,226；和于2014年10月10日提交的美国系列号14/512,316，于2014年5月2日提交的61/988,011，和于2014年6月11日提交的62/010,972的共同未决申请；其中各自公开内容以其整体并入本文。
在某些实施方案中，可以缀合至抗体的D-负载聚合物支架的数量受游离半胱氨酸残基的数量限制。在某些实施方案中，通过本文描述的方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列。本发明的示例性缀合物可以包括具有1、2、3或4个经工程改造的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon, R. 等人(2012) Methods in Enzym. 502:123-138)。在某些实施方案中，一个或多个游离半胱氨酸残基已存在于抗体中（而不需要进行工程改造），在所述情况中存在的游离半胱氨酸残基可以用于将抗体缀合至D-负载聚合物支架。在某些实施方案中，在缀合抗体之前，将抗体暴露于还原条件以生成一个或多个游离半胱氨酸残基。
在某些实施方案中，本文描述的缀合物中，式(Ic)的D-负载聚合物支架为式(Ie)：
其中，
PHF具有分子量范围约2 kDa至约40 kDa；
D的每次出现独立地为具有分子量为≤ 5 kDa的治疗剂，并且在D与羰基之间的表示D至羰基的直接或间接连接，
X为CH2、O或NH；
Xa和Xb之一为H，且另一个为水溶性马来酰亚胺基阻断部分，或Xa和Xb与其所连接的碳原子一起形成碳-碳双键，m1为1至约140的整数，
m7为1至约40的整数，且m1与m7的总和为约2至约180
m为1至约300的整数，
m3a为0至约17的整数，
m3b为1至约8的整数，且m3a与m3b的总和为1至18，和
m、m1、m7、m3a和m3b的总和范围约15至约300。
在某些实施方案中，在本文描述的缀合物，式(Ie)的D-负载聚合物支架为式(Id)：
其中：
Xa和Xb之一为H，且另一个为水溶性马来酰亚胺基阻断部分，或Xa和Xb与其所连接的碳原子一起形成碳-碳双键；
m3a为0至约17的整数，
m3b为1至约8的整数，且m3a与m3b的总和为1至18，和
m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围约15至约300。
例如，m2与m3b的比为大于1：1并小于或等于10：1。
例如，m2与m3b的比为约9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1，或2：1。
例如，m2与m3b的比为2：1至8：1。
例如，m2与m3b的比为约8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1，或2：1。
例如，m2与m3b的比为2：1至4：1。
例如，m2与m3b的比为约4：1、3：1或2：1。
例如，m2与m3b的比为约3：1和5：1。
例如，m2与m3b的比为约3：1、4：1或5：1。
例如，当式(Id)中的PHF具有分子量范围约2 kDa至约20 kDa时，m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围约15至约150，m1为1至约70的整数，m2为1至约20的整数，m3a为0至约9的整数，m3b为1至约8的整数且PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段的间的比例为2至约8的整数。
例如，当式(Id)中的PHF具有分子量范围约3 kDa至约15 kDa时，m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围约20至约110，m1为2至约50的整数，m2为2至约15的整数，m3a为0至约7的整数，m3b为1至约8的整数且PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段的间的比例为2至约8的整数(例如，2至约6的整数或2至约4的整数)。
例如，当式(Id)中的PHF具有分子量范围约5 kDa至约10 kDa时，m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围约40至约75，m1为约2至约35的整数，m2为约2至约10的整数，m3a为0至约4的整数，m3b为1至约5的整数且PHF与经分离的HER2抗体或其抗原-结合片段的间的比例为2至约8的整数(例如，2至约6的整数或2至约4的整数)。
例如，水可溶性马来酰亚胺基阻断部分为当马来酰亚胺基与式(II)的含硫醇化合物反应时，可以共价连接至两个烯烃碳原子之一的部分：
其中：
R90为NHR91、OH、COOR93、CH(NHR91)COOR93或经取代的苯基；
R93为氢或C1-4烷基；
R91为氢、CH3或CH3CO和
d为1至3的整数。
例如，式(II)的水可溶性马来酰亚胺基阻断化合物可以为半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、半胱氨酸甲基酯、N-甲基半胱氨酸、2-巯基乙醇、3-巯基丙酸、2-巯基乙酸、巯基甲醇(即HOCH2SH)、苄基硫醇（其中苯基被一个或多个亲水取代基取代）或3-胺基丙烷-1-硫醇。苯基上的一个或多个亲水性取代基包括OH、SH、甲氧基、乙氧基、COOH、CHO、COC1-4烷基、NH2、F、氰基、SO3H、PO3H等。
例如，水可溶性马来酰亚胺基阻断基团为-S-(CH2)d-R90，其中R90为OH、COOH或CH(NHR91)COOR93；
R93为氢或CH3；
R91为氢或CH3CO；和
d为1或2。
例如，水可溶性马来酰亚胺基阻断基团为-S-CH2-CH(NH2)COOH。
例如，当PHF具有分子量范围2 kDa至40 kDa(例如，约2-20 kDa，或约3-15 kDa，或约5-10 kDa)时，每PHF的药物数量(例如，m2)为1至约40的整数(例如，约1-20或约2-15或约3-10或约2-10)。该支架可以用于，例如，缀合具有40 kDa或更大的分子量(例如，60 kDa或更大；80 kDa或更大；或100 kDa或更大；120 kDa或更大；140 kDa或更大；160 kDa或更大、180 kDa或更大或200 kDa或更大或约40-200 kDa、40-180 kDa、40-140 kDa、60-200 kDa、60-180 kDa、60-140 kDa、80-200 kDa、80-180 kDa、80-140 kDa、100-200 kDa、100-180kDa、100-140 kDa或140-150 kDa)的经分离的抗体或其抗原-结合片段。在该实施方案中，经分离的抗体或其抗原-结合片段与PHF的比为约1：1至约1：10、约1：1至约1：9、约1：1至约1：8、约1：1至约1：7、约1：1至约1：6、约1：1至约1：5、约1：1至约1：4、约1：1至约1：3、约1：1至约1：2、约1：2至约1：8、约1：2至约1：6、约1：2至约1：5、约1：2至约1：4、约1：2至约1：3、约1：3至约1：4或约1：3至约1：5。
例如，当PHF具有分子量范围2 kDa至40 kDa(例如，约2-20 kDa，或约3-15 kDa，或约5-10 kDa)时，每PHF的药物数量(例如，m2)为1至约40的整数(例如，约1-20或约2-15或约3-10或约2-10)。该支架可以用于，例如，缀合具有分子量为140 kDa至180 kDa或140 kDa至150 kDa的经分离的抗体或抗原-结合片段。在该实施方案中，经分离的抗体或其抗原-结合片段与PHF的比为约1：1至约1：10、约1：1至约1：9、约1：1至约1：8、约1：1至约1：7、约1：1至约1：6、约1：1至约1：5、约1：1至约1：4、约1：1至约1：3、约1：1至约1：2、约1：2至约1：8、约1：2至约1：6、约1：2至约1：5、约1：2至约1：4、约1：2至约1：3、约1：3至约1：4或约1：3至约1：5。
在该分子量范围的经分离的抗体或抗原-结合片段包括但不限于，例如，全长抗体，诸如，IgG、IgM。
例如，当PHF具有分子量范围2 kDa至40 kDa(例如，约2-20 kDa，或约3-15 kDa，或约5-10 kDa)时，每PHF的药物数量(例如，m2)为1至约40的整数(例如，约1-20或约2-15或约3-10或2-10)。该支架可以用于，例如，缀合具有分子量为60 kDa至120 kDa的经分离的抗体或抗原-结合片段。在该实施方案中 经分离的抗体或其抗原-结合片段与PHF的比为约1：1至约1：10、约1：1至约1：9、约1：1至约1：8、约1：1至约1：7、约1：1至约1：6、约1：1至约1：5、约1：1至约1：4、约1：1至约1：3、约1：1至约1：2、约1：2至约1：8、约1：2至约1：6、约1：2至约1：5、约1：2至约1：4、约1：2至约1：3、约1：3至约1：4或约1：3至约1：5。
在该分子量范围的经分离的抗体或抗原-结合片段包括但不限于，例如，抗体片段诸如，例如Fab2、scFcFv与骆驼科的。
例如，当PHF具有分子量范围2 kDa至40 kDa(例如，约2-20 kDa、或约3-15 kDa、或约5-10 kDa)时，每PHF的药物数量(例如，m2)为1至约40的整数(例如，约1-20或约2-15或约3-10 or 2-10)。该支架可以用于，例如，缀合具有分子量为40 kDa to 80 kDa的经分离的抗体或其抗原-结合片段。在该实施方案中 经分离的抗体或其抗原-结合片段与PHF的比为约1：1至约1：10、约1：1至约1：9、约1：1至约1：8、约1：1至约1：7、约1：1至约1：6、约1：1至约1：5、约1：1至约1：4、约1：1至约1：3、约1：1至约1：2、约1：2至约1：8、约1：2至约1：6、约1：2至约1：5、约1：2至约1：4、约1：2至约1：3、约1：3至约1：4或约1：3至约1：5。
在该分子量范围内（即约40 kDa至约80 kDa）的经分离的抗体或抗原-结合片段包括但不限于，例如，抗体片段诸如，例如，Fab。
在某些实施方案中，在本文所描述的缀合物中，式(Ie)的D-负载聚合物支架为式(If)，其中聚合物为具有分子量范围约2 kDa至约40 kDa的PHF：
其中：
m为1至约300的整数，
m1为1至约140的整数，
m2为1至约40的整数，
m3a为0至约17的整数，
m3b为1至约8的整数；
m3a与m3b的总和范围1至约18；
m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围约15至约300；
端表示一个或多个聚合物支架连接至特异性结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段且包括可变重链互补决定区1(CDRH1)，其包含氨基酸序列FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 25)；可变重链互补决定区2(CDRH2)，其包含氨基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 26)；可变重链互补决定区3(CDRH3)，其包含氨基酸序列GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27)；可变轻链互补决定区1(CDRL1)，其包含氨基酸序列RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28)；可变轻链互补决定区2(CDRL2)，其包含氨基酸序列GASSRAT (SEQ ID NO: 21)；以及可变轻链互补决定区3(CDRL3)，其包含氨基酸序列QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29)；和
PHF与抗体的比为10或更小。
式(If)的支架可以包括一个或多个下述特征：
当式(If)中的PHF具有分子量范围约2 kDa至约20 kDa时，m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围约15至约150，m1为1至约70的整数，m2为1至约20的整数，m3a为0至约9的整数，m3b为1至约8的整数，m3a与m3b的总和范围1至约10，且PHF与抗体的比为2至约8的整数。
当式(If)中的PHF具有分子量范围约3 kDa至约15 kDa时，m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围约20至约110，m1为2至约50的整数，m2为2至约15的整数，m3a为0至约7的整数，m3b为1至约8的整数，m3a与m3b的总和范围1至约8；且PHF与抗体的比为为2至约8的整数(例如，约2至约6或约2至约4)。
当式(If)中的PHF具有分子量范围约5 kDa至约10 kDa时，m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围约40至约75，m1为约2至约35的整数，m2为约2至约10的整数，m3a为0至约4的整数，m3b为1至约5的整数，m3a与m3b的总和范围1至约5；且PHF与抗体的比为2至约8的整数(例如，约2至约6或约2至约4)。
在某些实施方案中，奥瑞他汀F羟基丙基酰胺(“AF HPA”)与抗体的比例可以为约30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些实施方案中，AF HPA与抗体的比例可以为约25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在其他实施方案中，AF HPA与抗体的比例可以为约20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些实施方案中，AF HPA与抗体的比例可以为约16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1或10：1。
在某些实施方案中，AF与抗体的比例可以为约15：1、14：1、13：1、12：1或11：1。
在某些实施方案中，AF HPA与抗体的比例可以为约15：1、14：1、13：1或12：1。
在某些实施方案中，PHF与抗体的比例可以为约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在某些实施方案中，PHF与抗体的比例可以为约8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他实施方案中，PHF与抗体的比例可以为约6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在其他实施方案中，PHF与抗体的比例可以为约6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他实施方案中，PHF与抗体的比例可以为约6：1、5：1、4：1或3：1。
在某些实施方案中，PHF与抗体的比例可以为约5：1、4：1或3：1。
在某些实施方案中，PHF与抗体的比例可以为约4：1、3：1或2：1。
在该分子量范围内的经分离的抗体或抗原-结合片段包括但不限于，例如，抗体片段，诸如，Fab。
抗体-聚合物药物缀合物的其他实施方案是描述于以下的那些，例如，美国专利号8,815,226；以及于2014年10月10日提交的美国系列号14/512,316，和于2014年5月2日提交的61/988,011；其中各公开内容以其整体并入本文。
本发明也涉及如此经修饰的药物衍生物，其在无聚合载体下可以直接缀合到抗体或其抗原-结合片段和其药物-抗体缀合物。
在某些实施方案中，抗体-药物缀合物包括缀合，即共价连接到药物部分的抗体或其抗原-结合片段。在某些实施方案中，抗体或其抗原-结合片段为通过接头，例如，非聚合性接头共价连接到药物部分。
抗体-药物缀合物(ADC)的药物部分(D)可以包括任何化合物、部分或基团，其具有本文所定义的细胞毒性或细胞抑制效果。在某些实施方案中，抗体-药物缀合物(ADC)包括抗体(Ab)(其靶向肿瘤细胞)、药物部分(D)和接头部分(L)(其连接Ab至D)。在某些实施方案中，抗体通过一个或多个氨基酸残基，诸如：赖氨酸和/或半胱氨酸连接到接头部分(L)。
在某些实施方案中，ADC具有式(Ig)：
其中p为1至约20。
在某些实施方案中，可以缀合到抗体的药物部分的数量受限于游离半胱氨酸残基的数量。在某些实施方案中，通过本文描述的方法将游离半胱氨酸残基引入至抗体氨基酸序列。式Ig的示例性ADC包括但不限于具有1、2、3或4个经工程改造的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon, R. 等人 (2012) Methods in Enzym. 502:123-138)。在某些实施方案中，一个或多个游离半胱氨酸残基已存在于抗体中（而不需进行工程改造），在此情况中存在的游离半胱氨酸残基可以用于将抗体缀合至药物。在某些实施方案中，在抗体缀合之前，抗体暴露于还原条件以生成一个或多个游离半胱氨酸残基。
在某些实施方案中，“接头”(L)为双功能或多功能部分，其可以用于将一个或多个药物部分(D)连接到抗体(Ab)来形成式Ig 的抗体-药物缀合物(ADC)。在某些实施方案中，可以使用具有对药物和抗体共价连接的反应官能性的接头制备抗体-药物缀合物(ADC)。例如，在某些实施方案中，抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头或药物-接头中间物的反应性官能团形成键以制备ADC。
在一个方面中，具有官能性的接头能够与存在于抗体的游离半胱氨酸反应以形成共价键。此类反应性官能性非限制性示例包括马来酰亚胺、卤乙酰胺、α-卤乙酰基、活化的酯诸如：琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。见例如，在Klussman, 等人 (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773的第766页的缀合方法和本文实施例。
在某些实施方案中，具有官能性的接头能够与存在于抗体上的亲电性基团反应。此类亲电性基团示例性包括但不限于醛与酮羰基。在某些实施方案中，接头反应官能性的杂原子可以与抗体上的亲电性基团反应并形成与抗体单元的共价键。此类反应性官能性非限制性示例性包括但不限于酰肼、肟、胺基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。
接头可以包括一个或多个接头组分。示例性的接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基 (“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基 (“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸 (“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄基氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(“MCC”)。各种接头组分为本领域中已知，其中一些描述于下文中。
接头可以为“可裂解接头”，其促进药物释放。非限制性示例性可裂解接头包括酸不稳定接头(例如，包括腙)、蛋白酶敏感(例如，肽酶敏感)接头、光不稳定接头或含二硫化物的接头(Chari 等人, Cancer Research 52:127-131 (1992)；美国专利号5,208,020)。
在某些实施方案中，接头具有下式(IIg)：
其中：
A为“延伸子单元”，且a为0至1的整数;
W为“氨基酸单元”，且w为0至12的整数；
Y为“间隔单元”，且y为整数0、1或2。包括式(IIg)的接头的ADC具有式I(A)：Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p，其中Ab、D和p如上述对式(Ig)所定义的。此类接头的示例性实施方案述于美国专利号7,498,298，其中以其整体通过引用并入本文。
在某些实施方案中，接头组分包括“延伸单元”(A)，其连接抗体到另一接头组分或药物部分。非限制性示例性延伸单元如下所示(其中波浪线指示共价连接至抗体、药物或另外接头组分的位置)：
在某些实施方案中，接头组分包括“氨基酸单元”(W)。在一些此类实施方案中，氨基酸单元允许通过蛋白酶裂解接头，因而在暴露至胞内蛋白酶(诸如：溶体酶)时促进药物从免疫缀合物释放(Doronina 等人 (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784)。示例性氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)；和N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包括天然发生的氨基酸残基和/或次要氨基酸和/或非天然发生氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸单元可以为了通过具体的酶(例如，肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶)酶裂解而经设计和优化。
通常地，肽型接头可以以通过在二个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键而制备。此类肽键可以例如，根据液相合成方法(例如，E. Schrider and K. Lubke (1965)“The Peptides”, volume 1, pp 76-136, Academic Press)进行制备。
在某些实施方案中，接头成分包括“间隔区”单元，其直接或通过延伸子单元和/或氨基酸单元连接抗体至药物部分。间隔区单元可以为“自降解（self-immolative）”或“非自降解”。“非自降解”间隔区单元是在ADC 裂解后其中部分或全部间隔区单元维持结合至药物部分的间隔区单元。非自降解间隔区单元的实例包括但不限于甘氨酸间隔区单元和甘氨酸-甘氨酸间隔区单元。在某些实施方案中，含甘氨酸-甘氨酸间隔区单元的ADC通过肿瘤-细胞相关的蛋白酶的酶裂解导致从ADC剩余物释放甘氨酸-甘氨酸-药物部分。在一些此类实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物部分经历肿瘤细胞中的水解步骤，因此从药物部分裂解甘氨酸-甘氨酸间隔区单元。
“自降解”间隔区单元允许药物部分的释放。在某些实施方案中，接头的间隔区单元包括对氨基苄基单元。在一些此类实施方案，通过酰胺键将对氨基苄基醇连接至氨基酸单元，并在苄基醇与药物之间产生胺甲酸酯、甲基氨甲酸酯或碳酸酯(Hamann 等人 (2005)Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103)。在某些实施方案中，间隔区单元包括对氨基苄基氧基羰基(PAB)。在某些实施方案中，包括自降解接头的ADC具有结构：
其中：
Q为-C1-C8烷基, -O-(C1-C8烷基)、卤素、硝基或氰基；
n6为0至4的整数；
Xa可以事一个或多个另外的间隔区单元或不存在；和
p为1至约20的整数。
在某些实施方案中，p为1至10、1至7、1至5或1至4的整数。非限制性示例性Xa间隔区单元包括：
其中R101与R102独立地选自H和C1-C6烷基。在某些实施方案中，R101与R102各为-CH3。
自降解间隔区的其他实例包括但不限于芳香族化合物，其电子类似于PAB基团，诸如：2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物 (美国专利号7,375,078；Hay 等人 (1999) Bioorg. Med.Chem. Lett. 9:2237)和邻位或对位氨基苄基缩醛。在某些实施方案中，可以使用在酰胺键水解时经历环化的间隔区，诸如经取代和未经取代的4-胺基丁酸酰胺(Rodrigues 等人(1995) Chemistry Biology 2:223)、合适的经取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(Storm 等人 (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815)和2-胺基苯基丙酸酰胺(Amsberry,等人 (1990) J. Org. Chem. 55:5867)。药物至甘氨酸残基的α-碳的键合为自降解间隔区的另一种实例，其可以用于ADC(Kingsbury 等人 (1984) J. Med. Chem. 27:1447)。
在某些实施方案中，接头L可以为树状型接头，用于通过分枝的多功能性接头部分共价连接超过一个药物部分到抗体(Sun 等人 (2002) Bioorganic & MedicinalChemistry Letters 12:2213-2215；Sun 等人 (2003) Bioorganic & MedicinalChemistry 11:1761-1768)。树状接头可以增加药物对抗体的摩尔比，即负载，其与ADC的效力相关。因此，抗体仅具有仅一个反应性半胱氨酸硫醇基团时，可以通过树状接头连接众多药物部分。
对于式(Ig)的ADC，非限制性示例性接头如下所示：
其中R101与R102独立地选自H和C1-C6烷基；
n5为0至12的整数。
在某些实施方案中，n为整数2至10。在某些实施方案中，n为4至8的整数。
在某些实施方案中，R101与R102各为-CH3。
进一步非限制性示例性ADC包括结构：
其中Xa为：
Y为：
各R103独立地为H或C1-C6烷基；以及n7为1至12的整数。
在某些实施方案中，接头被调节溶解度和/或反应性的基团取代。作为非限制性实例，带电取代基诸如磺酸根(-SO3 -)或铵可以增加接头试剂的水溶解度并促进接头试剂与抗体和/或药物部分的偶联反应，或促进Ab-L(抗体-接头中间物)与D或D-L(药物-接头中间物)与Ab的偶联反应，取决于制备ADC制备所采用的途径。在某些实施方案中，接头的部分偶联到抗体且接头的部分偶联到药物，随后Ab-(接头部分)a偶联到药物-(接头部分)b以形成式Ig的ADC。
本发明的化合物明确考虑了，但不限于和以下接头试剂制备的ADC：双-马来酰亚胺基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)-N-羟琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-(ε-马来酰亚胺基己酰基氧基) 琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N-[γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)、1,6-己烷-双-乙烯基砜(HBVS)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸)(LC-SMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟琥珀酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)、琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)胺基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、琥珀酰亚胺基6-[(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)已酸酯](SMPH)、亚胺基硫雑环戊烷(亚胺基硫杂环戊烷)(IT)、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC和磺酸基-SMPB和琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)和包括双-马来酰亚胺的试剂：二硫基双马来酰亚胺基乙烷(DTME)、1,4-双马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟丁烷(BMDB)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、双马来酰亚胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(显示如下)和BM(PEG)3(显示如下)；下述的双功能性衍生物：亚胺基酯(诸如：二甲基亚氨酸酯HCl)、活性酯(诸如：二琥珀酰亚胺基栓酸酯)、醛(诸如：戊二醛)、双-迭氮基化合物(诸如：双-(对迭氮基苯甲酰基)己烷二胺)、双-重氮衍生物(诸如：双-(p-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如：甲苯 2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(诸如：1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在某些实施方案中，双-马来酰亚胺试剂允许抗体中半胱氨酸的硫醇基团连接到含硫醇药物部分、接头，或接头-药物中间物。其他与硫醇基团反应的官能团包括但不限于碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
可以从各种商业来源获得某些有用的接头试剂，诸如：Pierce Biotechnology,Inc. (Rockford, Ill.)、Molecular Biosciences Inc.(Boulder, Colo.)，或依照本领域中描述的程序合成；例如，在Toki 等人 (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872；Dubowchik, 等人 (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60；Walker, M. A. (1995)J. Org. Chem. 60:5352-5355；Frisch 等人 (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186；美国专利号6,214,345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；以及WO 04/032828中。
碳-14-标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。见，例如，WO 94/11026。
制备HER2抗体缀合物的方法：
在某些实施方案中，在数个步骤中形成缀合物。这些步骤包括(1)修饰聚合物，使其含有可以与药物或其衍生物的官能团反应的官能团；(2)经修饰的聚合物与药物或其衍生物反应，使得药物连接至聚合物；(3)修饰聚合物-药物缀合物，使得聚合物含有可以与经分离的抗体或其抗原-结合片段的官能团或其衍生物反应的官能团；和(4)经修饰的聚合物-药物缀合物与抗体或其抗原-结合片段反应，以形成本发明的缀合物。如果步骤(1)产生的经修饰的聚合物包含可以与抗体或其抗原-结合片段的官能团反应的官能团，则步骤(3)可以省略。
在另一个实施方案中，缀合物在数个步骤中形成：(1)修饰聚合物，使得其含有可以与第一药物或其衍生物的官能团反应的官能团；(2)经修饰的聚合物与第一药物或其衍生物反应，使得第一药物连接至聚合物；(3)修饰聚合物-药物缀合物，使得其含有可以与第二药物或其衍生物的官能团反应的不同官能团(4)经修饰的聚合物-药物缀合物与第二药物或其衍生物反应，使得第二药物连接至聚合物-药物缀合物；(5)修饰含有2种不同药物的聚合物-药物缀合物，使得聚合物含有可以与抗体或其抗原-结合片段的官能团反应的官能团；和(6)步骤(5)的经修饰的聚合物-药物缀合物与经分离的抗体或其抗原-结合片段或其衍生物反应，以形成本发明的缀合物。如果2种不同的经分离的抗体或其抗原-结合片段或其衍生物欲缀合以形成聚合物-药物缀合物(其包含两种不同药物和两种不同抗体或其抗原-结合片段)，则可以重复步骤(5)和(6)。
在还另一个实施方案中，缀合物在数个步骤中形成。这些步骤包括(1)修饰聚合物，使得其含有可以与药物或其衍生物的官能团反应的官能团；(2)进一步修饰聚合物，使得其也含有可以与抗体或其抗原-结合片段的官能团反应的官能团；(3)经修饰的聚合物与药物或其衍生物反应，使得药物连接到聚合物；和(4)经修饰的聚合物-药物缀合物与抗体或其抗原-结合片段反应，以形成本发明的缀合物。步骤(1)和(2)的顺序或步骤(3)和(4)的顺序可以相反。此外，如果经修饰的聚合物含有可以与药物或其衍生物的官能团和抗体或其抗原-结合片段的官能团两者反应的官能团，步骤(1)或(2)可以省略。
在另一个实施方案中，缀合物在数个步骤中形成：(1)修饰聚合物，使得其含有可以与第一药物或其衍生物的官能团反应的官能团；(2)进一步修饰聚合物，使得其含有可以与抗体或其抗原-结合片段的官能团反应的官能团；(3)经修饰的聚合物与第一药物或其衍生物反应，使得第一药物连接至聚合物；(4)修饰聚合物-药物缀合物，使得其含有可以与第二药物或其衍生物的官能团反应的不同官能团(5)经修饰的聚合物-药物缀合物与第二药物或其衍生物反应，使得第二药物连接至聚合物-药物缀合物；(6)反应含有2种不同药物的经修饰的聚合物-药物缀合物，使得聚合物与经分离的抗体或其抗原-结合片段或其衍生物形成本发明的缀合物。如果2种不同的经分离的抗体或其抗原-结合片段或其衍生物欲缀合以形成聚合物-药物缀合物(其包含两种不同药物和两种不同抗体或其抗原-结合片段)，则步骤(6)可以重复。步骤(4)可以在步骤(1)随后进行，使得经修饰的聚合物含有可以与两种不同药物或其衍生物反应的两种不同官能团。在该实施方案中，含有可以与两种不同药物或其衍生物反应的两种不同官能团的经修饰的聚合物可以进一步经修饰，使得其含有可以与抗体或其抗原-结合片段的官能团反应的官能团；在经修饰的聚合物与两种不同药物(步骤(3)与步骤(5)或抗体或其抗原-结合片段(步骤(6)反应之前。
在某些示例性实施方案，发现本发明的缀合物在生物医药中的应用，诸如药物递送和组织工程，且聚合载体为生物相容的和生物可降解的。在某些实施方案中，载体为可溶性聚合物、纳米颗粒、凝胶、脂质体、微团、缝线、植入物等。在某些实施方案中，术语“可溶性聚合物”涵盖生物可降解生物相容性聚合物，诸如聚缩羰基化物（polyal）(例如，亲水性聚缩醛或聚缩酮)。在某些其他实施方案中，载体为全合成的、半合成的或天然发生的聚合物。在某些其他实施方案中，载体为亲水性。用于生产本发明的缀合物的合适的聚合载体的实例述于美国专利号8,815,226，其整体内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，聚合载体包含式(IV)的单元：
其中X’指对聚合物主链的羟基的取代基。如式(IV)和本文描述的其他式所示，各聚缩醛单元具有链接到单元的甘油部分的单一羟基和链接到单元的乙醇醛部分的X’基团。这仅是为了方便并且其应当理解为具有式(IV)的单元和其他本文描述的式的聚合物可以含有具有X’基团(或另一个取代基诸如包含马来酰亚胺末端的接头)(链接到单元的乙醇醛部分)的单元和具有单一X’基团(或另一个取代基诸如包含马来酰亚胺末端的接头)(链接到单元的甘油部分)的单元，以及具有两个X’基团(或其他取代基诸如包含马来酰亚胺末端的接头)(其中一个连接到乙醇醛部分且另一个链接到单元的甘油部分)的单元的随机分布。
在一个实施方案中，适合于实施本发明的生物可降解生物相容性聚缩羰基化物具有分子量为约0.5至约300 kDa。例如，生物可降解生物相容性聚缩羰基化物具有分子量为约1至约300 kDa(例如，约1至约200 kDa、约2至约300 kDa、约2至约200 kDa、约5至约100kDa、约10至约70 kDa、约20至约50 kDa、约20至约300 kDa、约40至约150 kDa、约50至约100kDa、约2至约40 kDa、约6至约20 kDa或约8至约15 kDa)。例如，用于本发明的聚合物支架或缀合物的生物可降解生物相容性聚缩羰基化物为具有分子量为约2至约40 kDa(例如，约2-20 kDa、3-15 kDa或5-10 kDa)的PHF。
用于制备适合于缀合到修饰剂的聚合物载体(例如，生物相容性、生物可降解聚合物载体)的方法为本领域已知的。例如，合成指导可以在美国专利号5,811,510；5,863,990；5,958,398；7,838,619；7,790,150；和8,685,383中发现。本领域技术人员将知道如何采用这些方法来制备用于实施本发明的聚合物载体。
在一个实施方案中，形成本发明生物可降解生物相容性聚缩羰基化物缀合物的方法包括合适的多糖与有效量的乙二醇特异性氧化剂组合以来形成醛中间物的过程。醛中间物(为聚缩羰基化物本身)随后可以被还原成对应的多元醇、经琥珀酰化和与一种或多种合适的修饰剂偶联以形成生物可降解生物相容性聚缩羰基化物缀合物(其包含琥珀酰胺的键)。
在另一个优选的实施方案中，用于本发明的全合成生物可降解生物相容性聚缩羰基化物可以通过将合适的引发剂与合适的前体化合物反应来制备。
例如，全合成聚缩羰基化物可以通过使用经保护的取代的二醇缩合乙烯基醚来制备。可以使用其他方法，诸如开环聚合，其中所述方法效力可取决于取代的程度与保护基团的体容度(bulkiness)。
本领域技术人员将了解溶剂系统、催化剂和其他因素可以经优化以获得高分子量产物。
在某些实施方案中，载体为PHF。
在实施方案中，聚合物载体为具有多分散指数(PDI)为≤1.5，例如<1.4、<1.3、<1.2或<1.1的PHF。
例如，为了缀合具有分子量为40 kDa至200 kDa的经分离的抗体或其抗原-结合片段，支架的聚合载体为聚缩醛，例如，具有分子量(即未经修饰的PHF的MW)范围为约2 kDa至约40 kDa (例如约2-20 kDa，或约3-15 kDa，或约5-10 kDa)的PHF。
例如，为了缀合具有分子量为40 kDa至80 kDa的抗体或其抗原-结合片段，本发明的支架的聚合载体为聚缩醛，例如，具有分子量(即未经修饰的PHF的MW)范围为约2 kDa至约40 kDa(例如约2-20 kDa，或约3-15 kDa，或约5-10 kDa)的PHF。例如，PHF具有分子量为约5 kDa、6 kDa、7 kDa、8 kDa、9 kDa、10 kDa、11 kDa、12 kDa、13 kDa、14 kDa或15 kDa。
在该分子量范围的抗体或其抗原-结合片段包括但不限于，例如，抗体片段，诸如，例如，Fab。
例如，为了缀合具有分子量为60 kDa至120 kDa的抗体或其抗原-结合片段，本发明的支架的聚合载体为聚缩醛，例如，具有分子量(即未经修饰的PHF的MW)范围为约2 kDa至约40 kDa (例如，约2-20 kDa，或约3-15 kDa，或约5-10 kDa)的PHF。例如，PHF具有分子量为约5 kDa、6 kDa、7 kDa、8 kDa、9 kDa、10 kDa、11 kDa、12 kDa、13 kDa、14 kDa或15kDa。
在此分子量范围的抗体或其抗原-结合片段包括但不限于，例如，骆驼科的、Fab2、scFvFc等。
例如，为了缀合具有分子量为140 kDa至180 kDa或140 kDa至150 kDa的抗体或其抗原-结合片段，本发明的支架的聚合载体为聚缩醛、例如，具有分子量(即未经修饰的PHF的MW)范围为约2 kDa至约40 kDa (例如，约2-20 kDa，或约3-15 kDa，或约5-10 kDa)的PHF。例如，PHF具有分子量为约5 kDa、6 kDa、7 kDa、8 kDa、9 kDa、10 kDa、11 kDa、12 kDa、13 kDa、14 kDa或15 kDa。
在该分子量范围的抗体或其抗原-结合片段包括但不限于，例如，全长抗体，诸如，IgG、IgM。
可以制备本发明的生物可降解生物相容性缀合物以符合期望的生物降解性和亲水性需求。例如，在生理条件下，可以达到生物降解性和稳定性之间的平衡。例如，已知分子量超过某一阈值(通常，高于40-100 kDa，取决于分子的物理形状)的分子不会通过肾脏排泄，而小分子则会，并且仅可以通过细胞摄入并在胞内区室(最显著为溶酶体)降解而从身体清除。该观察例示了功能稳定且生物可降解材料如何可以通过调节他们在通常生理条件(pH=7.5±0.5)和在溶体pH(pH近5)的稳定性来进行设计。例如，已知缩醛和缩酮基团的水解被酸催化，因此聚缩羰基化物通常在酸性溶体环境将比例如在血浆中较不稳定。技术人员可以设计测试来比较在例如，37℃水性介质中pH=5和pH=7.5下的聚合物降解概况，并因此确定在正常生理环境和在细胞摄入后“消化”溶酶体区室中预期的聚合物稳定性平衡。可以通过例如粒径筛析HPLC测量在此类测试中的聚合物完整性。本领域技术人员可以选择其他合适的方法研究本发明的降解的缀合物的各片段。
在许多情况下，优选地在pH=7.5下聚合物的有效大小在1至7天期间不会有可检测地变化，并且维持初始的50%达至少数周。另一方面，在pH=5下聚合物应优选地在1至5天期间有可检测地降解，并且在两周到数月时期内完全转化为低分子量片段。虽然更快的降解在一些情况下可以是优选的，通常更期望聚合物在细胞中具有不超过细胞代谢或排出聚合物片段速率的速率进行降解。因此，在某些实施方案中，预期本发明的缀合物为生物可降解的，特别是在被细胞摄入后，并且相较生物系统而言为相对“惰性的”。载体降解的产物优选地不带电且不显著改变环境的pH。提议大量的醇基团可以提供低比率的细胞受体(特别是吞噬细胞)的聚合物识别。本发明聚合物主链通常含有几个，（如有）抗原决定簇(特征为，例如，某些多糖和多肽)且通常不包含能够参与体内“钥-与-锁”类型相互作用(除非后者为期望的)的刚性结构。因此，预测本发明的可溶性、交联与固态缀合物具有低毒性和生物黏着性，其使得他们适合于数种生物医药应用。
在本发明某些实施方案中，生物可降解生物相容性缀合物可以形成线性或分支状结构。例如，本发明生物可降解生物相容性聚缩羰基化物缀合物可以为手性的(光学活性)。任选地，本发明生物可降解生物相容性聚缩羰基化物缀合物可以为非外消旋(scalemic)。
在某些实施方案中，本发明的缀合物为水溶性的。在某些实施方案中，本发明的缀合物为水不溶性的。在某些实施方案中，本发明缀合物系呈固体形式。在某些实施方案中，本发明的缀合物为胶体。在某些实施方案中，本发明的缀合物系呈颗粒形式。在某些实施方案中，本发明的缀合物系呈凝胶形式。
下面方案1显示了制备本发明的聚合药物支架的合成方案。在一个实施方案中，缀合物在数个步骤中形成：(1)聚合物，PHF经修饰以含有COOH部分(例如，-C(O)-X-(CH2)2-COOH)；(2)聚合物随后进一步经修饰使得其含有可以与PBRM的官能团反应的马来酰亚胺基部分(例如，EG2-MI)；(3)含有两种不同官能团的经修饰的聚合物与药物或其衍生物(例如，AF-HPA-Ala)的官能团反应以形成聚合物-药物缀合物；(4)还原PBRM的二硫键；(5)经还原的PBRM随后与聚合物-药物缀合物反应以形成蛋白质-聚合物-药物缀合物；和(6)剩余的马来酰亚胺基部分任选地与马来酰亚胺基阻断化合物(例如，半胱氨酸)反应。
在另一个实施方案中，步骤(2)与(3)的顺序可以相反，如下列方案1中右侧途径中所示。
在还另一个实施方案中，同时进行上述步骤(2)与(3)，如下述方案2中所示。
针对HER2的抗体的用途
将了解施用根据本发明的治疗实体将与并入制剂的合适的载体、赋形剂和其他剂施用以提供改善的转移、递送、耐受性等。许多合适的制剂可以在对所有医药化学家已知的处方集中发现：Remington’s Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack PublishingCompany, Easton, PA (1975))，特别是其中的Blaug, Seymour的第 87章。这些制剂包括，例如，粉剂、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油类、脂质类、含脂质(阳离子性或阴离子性)的小囊(诸如：Lipofectin™)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂聚乙二醇 (各种分子量的聚乙二醇)、半固态胶体和含聚乙二醇的半固态混合物。上述混合物的任意可以适于依照本发明的治疗和疗法，前提是制剂中活性成分不被制剂灭活并且制剂与施用途径是生理相容的并且是可耐受的。还见Baldrick P. “Pharmaceutical excipientdevelopment: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid proteinpharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids,lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J PharmSci. 89(8):967-78 (2000), Powell 等人 “Compendium of excipients forparenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)和在其中引证的医药化学家熟知的涉及制剂、赋形剂和载体的另外的信息。
在一个实施方案中，本发明的抗体、其片段和/或其缀合物可以用做治疗药物。此类药物通常将用于诊断、预测、监控、治疗、缓解、预防和/或延迟与例如，受试者中异常HER2活性和/或表达相关的疾病或病理学的进展。治疗方案使用标准方法通过鉴定受试者，例如，患有(或有发展的风险)与异常HER2活性和/或表达相关的疾病或病症，例如，癌症的人患者来进行。将抗体制剂，优选地为具有对其标靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体，施用至受试者并且通常因其与靶标结合而将具有效果。抗体的施用可以消除或抑制或干扰靶标的信号传导功能。抗体的施用可以消除或抑制或干扰靶标与其天然结合的内源性配体的结合。例如，抗体结合至靶标并调制、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或者干扰HER2活性和/或表达。
涉及异常HER2活性和/或表达的疾病或病症包括但不限于癌症。靶标癌症可以为肛门、星状细胞瘤、白血病、淋巴瘤、头与颈、肝、睪丸、子宫颈、肉瘤、血管瘤、食道、眼、喉、口、间皮瘤、皮肤、骨髓瘤、口腔、直肠、咽喉、膀胱、乳房、子宫、卵巢、前列腺、肺、结肠、胰脏、肾或胃癌。
在另一个方面中，疾病或病症为选自以下的癌症：乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌。
通常，疾病或病症的减缓或治疗涉及减轻与疾病或病症相关的一种或多种症状或医疗问题。例如，在癌症的情况中，治疗有效量的药物可以完成以下一个或多个的组合：降低癌症细胞的数量；减小肿瘤尺寸；抑制(即某些程度上减少和/或停止)癌症细胞浸润至外周器官；抑制肿瘤转移；某些程度上抑制肿瘤生长；和/或某些程度上减轻一种或多种与癌症相关的症状。在某些实施方案中，本发明的组合物可以用于预防受试者中疾病或病症的发作或复发。
本发明的抗体、其片段和/或其缀合物的治疗有效量通常涉及实现治疗目标所需的量。如上所述，这可以是抗体和其靶标抗原之间的结合相互作用，其在某些情况中，干扰靶标的作用。需要施用的量将进一步取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和力，且也将取决于所施用抗体从其所施用的自由体积其他受试者耗尽的速率。本发明的抗体或抗体片段和/或其缀合物的治疗有效剂量的通常范围可以为，通过非限制性实例，约0.1 mg/kg体重至约50 mg/kg体重、约0.1 mg/kg体重至约100 mg/kg体重或约0.1 mg/kg体重至约150 mg/kg体重。通常剂量频率可以范围为，例如，每天二次至每月一次(例如，每天一次、每周一次；每隔一周一次；每三周或每月一次)。例如，可以以约0.1 mg/kg至约20 mg/kg(例如，0.2mg/kg、0.5 mg/kg、0.67 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/k或20 mg/kg)施用本发明的XMT 1519缀合物，诸如XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物或XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物(例如，作为每周、每2周、每3周或每月单一剂量)。例如，可以以约0.1 mg/kg至约20 mg/kg(例如，0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、0.67 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg或20 mg/kg)施用本发明的XMT 1519缀合物，诸如XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物或XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物(例如，作为每周、每2周、每3周，或每月单一剂量)，用于治疗低HER2-表达乳腺癌或低HER2-表达胃癌。
治疗功效性根据任何已知诊断或治疗具体HER2相关的病症的方法确定。减缓HER2相关的病症的一个或多个症状指的是抗体赋予了临床效益。
筛选具有期望的特异性的抗体的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和其他本领域已知的免疫介导技术。
在另一个实施方案中，涉及针对HER2的抗体可以用于本领域中已知与HER2的定位和/或定量有关的方法(例如，用于测量在合适的生理样品中HER2的水平、用于诊断方法、用于成像蛋白质等)。在给定的实施方案中，含有抗体衍生的抗原结合域的对HER2特异的抗体或其衍生物、片段、类似物或同源物被用作药理活性化合物(以下指的是“治疗剂”)。
在另一个实施方案中，对HER2特异的抗体被用于分离HER2多肽，通过标准技术，诸如免疫亲和、层析术或免疫沉淀法。针对HER2蛋白质的抗体(或其片段)可以诊断地用于监控组织中的蛋白质水平，其作为临床测试程序的一部分，例如，以确定给定的治疗方案的功效。检测可以通过将抗体偶联(即物理连接)至可检测物质来促进。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基络合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的实例包含鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母素，和合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
在还另一个实施方案中，根据本发明的抗体可以用做为检测HER2蛋白质(或其片段)在样品存在的剂。在某些实施方案中，抗体含有可检测标记。抗体是多克隆的，或更优选地是单克隆的。使用完整抗体，或其片段(例如，Fab、scFv或F(ab)2)。关于探针或抗体的术语“经标记的”意图涵盖通过偶联(即物理连接)可检测物质到探针或抗体而直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂反应而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光-标记的二级抗体检测初级抗体和以生物素末端标记DNA探针，使得其可以以荧光-标记的链霉亲和素检测。术语“生物样品”意图包括分离自受试者的组织、细胞和生物流体，以及存在于受试者中的组织、细胞和流体。包含在术语“生物样品”的使用中，因此为包括血清、血浆或淋巴的血液和血液的级分或组分。也就是说，本发明的检测方法可以用于检测离体生物样品中以及体内的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，检测分析物mRNA的离体技术包括RNA 杂交法和原位杂交法。检测分析物蛋白质的离体技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印记、免疫沉淀法和免疫荧光。检测分析物基因组DNA的离体技术包括DNA杂交。进行免疫测定的程序描述于，例如ELISA: Theory and Practice: Methods inMolecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ,1995；“Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc.,San Diego, CA, 1996；和“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P.Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985。此外，检测分析物蛋白质的体内技术包括向受试者导入经标记的抗-分析物蛋白质抗体。例如，抗体可以经放射性标记物标记，其在受试者中的存在与定位可以以通过标准成像技术检测。
HER2抗体的治疗施用与制剂
本发明的抗体、衍生物、片段、类似物和其同源物和/或其缀合物(本文中也称为“活性化合物”)可以并入适于施用的药物组合物。涉及制备此组合物的原则与考虑，以及选择组分的指导在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences: The Science And PracticeOf Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, 等人, editors) Mack Pub. Co.,Easton, Pa.: 1995；Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities,Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994；和Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4),1991, M. Dekker, New York中提供。
此类组合物通常地包含抗体、其片段和/或其缀合物与药物上可接受的载体。当使用抗体片段时，特异性结合至靶标蛋白质结合结构域的最小抑制片段是优选的。例如，根据抗体的可变-区域序列，可以设计维持结合靶标蛋白质序列的能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/或由重组DNA技术产生。(见，例如，Marasco 等人, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 90: 7889-7893 (1993))。
如本文所用，术语“药物上可接受的载体”意图包括任何和所有与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂等。合适的载体描述于最新版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences，本领域中的标准参考文本，其通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的优选的实例包括但不限于水、盐水、林格氏液(ringer’ssolution)、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物诸如固定油。此类介质和剂对药物活性物质的使用为本领域熟知的。除了活性化合物不相容的任何常规介质或剂之外，预期其在组合物中的使用。
用于体内施用的制剂必需是无菌的。这可以通过无菌过滤膜进行过滤容易地完成。
将本发明的药物组合物配制为与其所意图施用的途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、口服 (例如，吸入)、经皮(即局部)、经黏膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内，或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括下述组分：无菌稀释剂诸如：注射用水、盐水溶液、固定油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂诸如苄醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如：乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调整张力的剂诸如：氯化钠或葡萄糖。可以使用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可以封装于安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制的多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其为水可溶性)或分散液和用于无菌注射溶液或分散液的即用制剂的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。在所有情况中，组合物必需为无菌的且应为存在容易可注射的流体。其在制备与储存条件下必需稳定且必须针对微生物诸如细菌和真菌的污染行为是受保护的。载体可以为溶剂或分散介质，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和其合适的混合物。可以通过使用例如，包衣诸如卵磷脂、在分散液实例中通过维持所需粒子尺寸和通过使用表面活性剂而维持合适的流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现。在许多情况中，优选在组合物中包括等张剂，例如，糖类、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过包括在组合物中的延迟吸收剂(例如，硬脂酸铝和明胶)实现。
无菌注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与一种或上述枚举成份的组合(如需要)掺入合适的溶剂，随后过滤灭菌而制备。通常，通过将活性化合物掺入到无菌媒介物(其含有基本分散介质和上述枚举的所需其他成分)而制备分散液。在用于制备的无菌注射溶液的无菌粉剂的情况中，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上任何另外期望的成分(来自其先前无菌过滤的溶液)。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可以食用载体。其可以包封在明胶胶囊中或压缩成片剂。为了口服治疗剂施用的目的，活性化合物可以与赋形剂掺合并且以片剂、锭剂，或胶囊形式使用。口服组合物也可以使用流体载体(用作为漱口水)而制备，其中流体载体中的化合物口服施用和漱口并吐出或吞入。药物相容结合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的部分而包括。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下任何成分或类似性质的化合物：黏合剂诸如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖，崩解剂诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂诸如胶体二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；或调味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或橘子调味剂。
对于通过吸入施用，以气溶胶喷雾形式从加压的容器或分散器(其含有合适的推进剂，例如，气体诸如二氧化碳)或喷雾器递送化合物。
全身施用也可以以通过经黏膜或经皮方式。对于经黏膜或经皮施用，使用对要穿透的屏障合适的渗透剂用于制剂。此类渗透剂通常为本领域已知的，且包括，例如对于经黏膜施用，去污剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。可以通过使用鼻喷雾或栓剂完成经黏膜施用。对于经皮施用，将活性化合物配制成本领域中通常已知的软膏、油膏、凝胶或霜剂。
也可以将化合物制备成栓剂形式(例如，与常规的栓剂基质诸如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠形式用于直肠递送。
在一个实施方案中，与载体(其将保护化合物防止从体内快速消除)制备活性化合物，诸如：持续/控制释放制剂，其包括植入物与微胶囊包埋递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物诸如：乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员是显而易见的。
例如，可以将活性成分包埋至制备的微胶囊中，例如，通过凝聚技术或通过界面聚合，例如，羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊，分别在胶体药物递送系统(例如、脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳剂中。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含抗体的固态疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形对象形式，例如，膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟丁酸。聚合物诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得分子释放100天期间，而某些水凝胶释放蛋白质时间段较短。
材料也可以从Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc商购获得。脂质体悬浮液(其包括以具有对抗病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以作为药物上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利号4,522,811中描述的。
为了易于施用和剂量的均匀性，配制呈剂量单位形式的口服或肠胃外组合物是特别有利的。本文所用的剂量单位形式指的是物理离散的单位，其适合作为给予要治疗的受试者的单一剂量；计算与所需药物载体结合的含有预定量的活性化合物的各单位，以产生期望的治疗效果。对本发明的剂量单位形式的说明受活性化合物的独特特征和要实现的具体治疗效果，和配制用于个体治疗的此类活性化合物的本领域中的固有限制的指示并直接取决于他们。
药物组合物可以连同施用指示包括在容器、包装或分配器中。
制剂也可以含有超过一种要治疗的具体适应症所需的活性化合物，优选地他们具有不会对彼此有不利影响的互补活性。可选地，或另外，组合物可以包含增强其功能的剂诸如，例如细胞毒性剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制剂。此类分子适于以组合呈现，其量对意图的目的有效。
在一个实施方案中，活性化合物在组合疗法中施用，即与其他药物组合，例如，治疗剂，其可用于治疗病理状况或病症，诸如各种形式的癌症、自体免疫病症和炎症疾病。在上下文中的术语“组合”意指基本上一起地，同时地或依序地给予药物。如果依序给予，在开始施用第二化合物时，两种化合物中的第一个优选地在治疗位置仍可检测到有效浓度。
例如，组合疗法可以包括本发明的一种或多种抗体、其片段和/或其缀合物，其与一种或多种另外的抗体例如HER2抗体、HER2二聚化抑制剂抗体或HER2抗体的组合和HER2二聚化抑制剂抗体诸如，例如，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合，或曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗的生物相似物或生物相似物的组合共配制和/或共施用。
例如，组合疗法可以包括本发明的一种或多种抗体、其片段和/或其缀合物，其与一种或多种另外的治疗剂例如，紫杉烷 (紫杉醇或多西他赛)、蒽环类药物(阿霉素或表柔比星)、环磷酰胺、卡培他滨、他莫昔芬、来曲唑、卡铂、吉西他滨、顺铂、厄洛替尼、伊立替康、氟脲嘧啶，或奥沙利铂共配制和/或共施用。此类组合疗法可以有利地应用较低剂量的所施用治疗剂，因而避免了可能的毒性或与各种单疗法相关的并发症。
在某些实施方案中，用于与本发明的抗体、其片段和/或其缀合物组合的另外的治疗剂是在免疫和/或炎症反应不同阶段干扰的药物。在一个实施方案中，本文所描述的一种或多种抗体可以与一种或多种另外的药物共配制和/或共施用。
诊断和预防制剂
将本发明的HER2抗体、其抗原-结合片段和/或其缀合物用于诊断和预防制剂。在一个实施方案中，将本发明的HER2抗体、其抗原-结合片段和/或其缀合物施用至有发展一种或多种上述疾病(诸如：例如而非限制，癌症)风险的患者。患者或器官对上述适应症的一种或多种倾向体质可以使用基因型、血清学或生物化学标记物来确定。
在本发明另一个实施方案中，将本发明的HER2抗体、其抗原-结合片段和/或其缀合物施用至经诊断具有与上述一种或多种疾病(诸如：例如而非限制，癌症)相关的临床适应症的人个体。诊断后，将本发明的HER2抗体、其抗原-结合片段和/或其缀合物施用以减轻或逆转与上述一种或多种疾病相关的临床适应症的效果。
在本发明另一个实施方案中，鉴定符合使用本发明的缀合物治疗的乳腺癌患者的方法，包括测量从患者所得的肿瘤样品中的某些特征的状态和基于肿瘤样品中某些特征的状态鉴定治疗的患者。
本发明的抗体也可以用于检测患者样品中的HER2，并因此可用作诊断剂。例如，在体外测定例如，ELISA中使用本发明的HER2抗体，以检测患者样品中HER2水平。
在一个实施方案中，本发明的HER2抗体固定在固体支持物(例如，微量滴定板的孔)上。经固定的抗体作为可以存在于测试样品中的任何HER2的捕获抗体。在经固定的抗体与患者样品接触之前，使用阻断剂诸如牛奶蛋白质或白蛋白冲洗和处理固体支持物以防止分析物的非特异性吸附。
随后，使用疑似含有抗原的测试样品，或以含有标准量的抗原的溶液处理孔。此类样品为例如，来自疑似具有被认为是病理学诊断的循环抗原水平的受试者的血清样品。在冲洗掉测试样品或标准品后，使用可检测标记的第二抗体处理固体支持物。经标记的二次抗体作为检测抗体。测量可检测标记的水平，和通过与来自标准样品发展的标准曲线比较来确定测试样品中HER2抗原的浓度。
将了解基于使用本发明的HER2抗体在体外诊断测定中获得的结果，可能基于HER2抗原的表达水平分级受试者中的疾病。对于给定的疾病，从诊断为在疾病进展各种阶段和/或在疾病治疗处理的各个节点的受试者获取血液样品。使用对进展或疗法各阶段提供统计学上显著结果的样品群体，指定可以被认为是各阶段特征的抗原浓度范围。
本文所引用的所有出版物和专利文件通过引用并入本文，如同此公开案或文件各自特定地或个别地被点出通过引用并入本文。公开与专利文件的引用不意图被视为承认其任意为有关的先前技术，也不是构成关于对各自的内容或日期的任何承认。现已以书写说明方式描述的本发明，本领域技术人员将认可以本发明可以在各种实施方案中实施且上述描述与下面的实施例为说明目的而不为随后的权利要求的限制。
实施例
下述工作实施例为接头、药物分子与PBRM和制备其的方法的说明。这些不意图限制且本领域技术人员可以容易地了解可以运用其他试剂或方法。
缩写
以下缩写是用于随后的反应方案和合成实施例。该列表不代表为用于申请案中的所有含括缩写列表，因为有机合成技术领域中具有通常知识者容易了解的另外标准缩写也可以用于合成方案和实施例中。
AF-HPA 奥瑞他汀F-羟丙基酰胺
BSA 牛血清白蛋白
DMEM Dulbecco’s改良Eagle’s培养基
FBS 胎牛血清
HRP 辣根过氧化物酶
PBS 磷酸盐缓冲盐水，0.9 % NaCl
TMB 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。
一般信息
购买Genentech制造的注射用贺癌宁® (ado-曲妥珠单抗艾得辛)。
由Kabat编号方案鉴定CDR。
肿瘤生长抑制(%TGI)定义为在治疗组与对照组的中值肿瘤体积(MTV)的差异百分比。
从研究期间观察的发病率与肿瘤尺寸的消退反应量级确定治疗功效。治疗可以导致动物中肿瘤的部分消退(PR)或完全消退(CR)。在PR反应中，肿瘤体积为其第一天体积的50%或更小(在研究过程中的三次连续测量)，并等于或大于13.5 mm3(针对这三次测量的一次或多次)。在CR反应中，肿瘤体积小于13.5 mm3(在研究过程中的三次连续测量)。在研究终止时具有CR反应的动物被另外分类为无肿瘤存活者(TFS)。监控动物的消退反应。
在Phenomenex Gemini 5 µm 110 Å，250 x 10 mm，5微米，半制备柱进行HPLC纯化。
在Tosoh Biosciences TSK 凝胶 G5000柱 (7.8 mm x 30 cm，10 um)或Superose12柱(GE Healthcare) 进行SEC。
在ProPac WCX-10 (94 mm x 250 mm)柱(ThermoFisher)进行WCX。
只要可能，则分光光度计地确定缀合物的药物含量，或者使用LC/MS或1H-NMR进行定量测定药物量。
蛋白质- 聚合物-药物缀合物的蛋白质含量用分光光度计在280 nm或由ELISA确定。
使用多糖或蛋白质分子量标准品通过SEC确定聚合物缀合物分子量(以表观重量平均分子量或峰分子量报道)。更具体地，对于聚合物或聚合物-药物缀合物，使用多糖分子量标准品，而对于蛋白质-药物-聚合物缀合物，使用蛋白质标准品。除非具体指出，否则所报道的聚合物载体分子量为PHF的重量平均分子量；而聚合物-药物缀合物分子量和蛋白质-聚合物-药物缀合物为峰分子量。HER2-聚合物-药物缀合物具有约170 kDa至约230 kDa的峰分子量。所合成/测量的聚合物和聚合物缀合物通常具有多分散性≤1.5。
由大量渗滤从剩余未反应的药物-聚合物缀合物分离Her2-聚合物-药物缀合物。如需要，进行由粒径筛析层析术和/或WCX层析术另外纯化以移除任何聚集的Her2-聚合物-药物缀合物。通常，Her2-聚合物-药物缀合物通常含有< 5% (w/w，例如，<2% w/w)的聚集片段，如SEC所确定的；<0.5% (w/w，例如，<0.1% w/w)的游离(未缀合)药物，如RP-HPLC或LC-MS/MS所确定的；<1% (w/w)的游离聚合物-药物缀合物，如SEC和/或RP-HPLC所确定的和<2%(w/w，例如，<1% w/w)未缀合的Her2，如HIC-HPLC和/或WCX HPLC所确定的。使用在文献中描述的程序制备还原或部分还原的抗体，见，例如，Francisco 等人, Blood 102 (4): 1458-1465 (2003)。总药物(缀合和未缀合)浓度由LC-MS/MS确定。
一般程序
一般程序A. 聚合物与接头或药物的缀合
通常，聚合物(PHF-BA或PHF-GA)与含胺接头诸如，例如，EG2-马来酰亚胺或含胺接头药物诸如，例如，AF-HPA-Ala、HPA-Ala的缀合在存在活化剂(诸如，例如 EDC.HCl)的水性或10-90%有机/水性溶剂混合物中进行。通常的有机溶剂包括但不限于水可混溶溶剂，诸如，例如，DMSO、DMF、DMA、NMP和ACN。为加速偶联，加入共活化剂诸如，例如，NHS。聚合物首先与含胺基化合物混合，随后加入共活化剂(NHS)，并随后加入活化剂(EDC.HCl)。在0-10℃，pH4.5到7.5，在环境温度下进行反应1至24小时。由渗滤或由SEC纯化所得聚合物缀合产物。浓缩产物到2-50 mg/mL，调整pH到4.5至6.5来确保药物-聚合物接头稳定性并将缀合物在-20至-80℃冷冻储存直到进一步使用。
聚合物与含胺接头或药物的缀合可以以任何顺序依序或同时进行。
一般程序B. 蛋白质(HER2抗体)的部分选择性还原
在与聚合物-药物缀合物缀合的前，使用还原剂诸如，例如，TCEP、DTT或β-巯基乙醇实现在相关HER2抗体中链间二硫化物基团或未配对二硫化物的部分选择性还原。当以过量还原剂进行还原时，在通过SEC缀合前移除还原剂。HER2二硫化物基团的转换为反应性巯基的程度取决于HER2的化学计量、还原剂、pH、温度和/或反应持续时间。当PBRM中部分但非全部的二硫化物基团被还原时，所还原的PBRM为部分还原的HER2。
一般程序C. 部分还原的HER2与聚合物药物缀合物的缀合
在中性或弱碱性条件(pH 6.5-8.5)下，在1-10 mg/mL的PBRM浓度和0.5-10 mg/mL的聚合物-药物缀合物浓度下，进行部分还原的PBRM至聚合物-药物缀合物的缀合。通常以相对于期望的蛋白质-聚合物-药物缀合物化学计量1-5.0倍过量使用聚合物-药物缀合物。当PBRM缀合至聚合物-药物缀合物的马来酰亚胺基时，任选地通过加入水溶性马来酰亚胺基阻断化合物，诸如，例如，N-乙酰基半胱氨酸、半胱氨酸甲基酯、N-甲基半胱氨酸、2-巯基乙醇、3-巯基丙酸、2-巯基乙酸、巯基甲醇(即HOCH2SH)、苄基硫醇等终止缀合。
通常由渗滤纯化所得HER2-聚合物-药物缀合物来移除任何未缀合的聚合物-药物缀合物、未缀合药物和小分子杂质。可选地或另外地，可以使用合适的层析分离程序诸如，例如，粒径筛析层析术、疏水性相互作用层析术、离子层析术诸如，例如，WCX层析术；反相层析术、羟基磷灰石层析术、亲和层析术或其组合来纯化HER2-聚合物-药物缀合物。通常将所得纯化的HER2-聚合物-药物缀合物配制于pH 5.0-6.5的缓冲液中。
实施例1：HER2抗体的FACS选择
本发明的两种HER2抗体，XMT 1517和XMT 1519，使用下述程序进行选择。增殖各为~109多样性的8种初次使用的人合成酵母文库，如先前描述的(见，例如，WO 2009036379；WO2010105256；WO2012/009568；以及Xu 等人, Protein Eng Des Sel. 2013 Oct; 26(10):663-70)。对于前两轮的选择，进行使用Miltenyi MACs系统的磁珠粒分选技术，如(Siegel 等人, J Immunol Methods. 2004 Mar;286(1-2):141-53)所述。简而言之，将酵母细胞 (~1010细胞/文库)与3 ml 200 nM生物素化单体HER2抗原或10 nM生物素化HER2-Fc融合抗原在具有0.1% BSA的FACS洗涤缓冲液PBS (使用EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit, Thermo Scientific, Cat.# 21425完成生物素化)中在室温温育15分钟。在使用50 ml冰冷洗涤缓冲液洗涤一次后，将细胞团再悬浮于40 mL洗涤缓冲液中，并将500 μl 链霉亲和素微珠 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany. Cat.#130-048-101)添加至酵母并在4℃温育15分钟。接着，沉淀酵母，再悬浮于5 mL洗涤缓冲液中，并负载至MACS LS柱(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany. Cat.# 130-042-401)。在负载5 mL后，使用3 ml FACS洗涤缓冲液洗涤柱3次。随后从磁场移出柱，且以5mL的生长培养基洗脱酵母并随后生长过夜。使用流式细胞术进行随后的三轮分选。沉淀大约1×108 酵母，使用洗涤缓冲液洗涤三次，并在室温下分别与200 nM、100 nM或10 nM生物素化HER2温育10分钟。随后将酵母洗涤两次并在4℃下使用山羊抗-人F(ab’)2κ-FITC(经1:100稀释)(Southern Biotech, Birmingham, Alabama, Cat.# 2062-02)与链霉亲和素-Alexa Fluor 633 (Life Technologies, Grand Island, NY, Cat.# S21375)(经1:500稀释)或Extravidin-phycoerthyrin(Sigma-Aldrich, St Louis, Cat.# E4011)(经1:50稀释)，二级试剂染色15分钟。以冰冷洗涤缓冲液洗涤两次后，在0.4 mL洗涤缓冲液中再悬浮细胞团块并转移至过滤器封盖分选管。使用FACS ARIA分选器(BD Biosciences)进行分选并且确定分选门（sort gate）以对两轮选择仅HER2结合的克隆而第三轮为阴性分选以降低试剂结合剂。最后一轮分选后，将酵母铺板并挑选单菌落用于表征。
实施例2：HER2抗体的亲和力成熟
使用下述程序制备本发明的亲和力成熟的HER2抗体，XMT 1518和XMT 1520。使用第5轮结合群用于轻链批次多样化(LCBD)。萃取重链质粒并转化至轻链文库(具1 x 106多样性)。如上文所述以一轮MACS分选和二轮FACS分选，对分别轮次使用10 nM或1 nM生物素化抗原进行选择。
进一步的亲和力成熟在来自LCBD的最佳克隆上进行。来自这些克隆的重链的各自的CDRH3单独地重组到预制文库(具有1 x 108多样性的变体)且如上所述进行选择。通过将抗原抗体酵母复合物与亲代Fab温育来施加亲和力压力达不同次数以选择最高亲和力抗体。
第三轮的亲和力成熟包括重链与轻链的易错PCR。类似于先前循环，对全部三轮使用FACS分选和对Fab压力增加的次数进行选择。
实施例3：抗体产生和纯化
将酵母克隆培养至饱和，并随后在30℃振荡下诱导48 h。温育后，将酵母细胞沉淀并收集上清液用于纯化。使用蛋白质A柱纯化IgG并使用乙酸，pH 2.0洗脱。以木瓜蛋白酶消化生成Fab片段并通过KappaSelect (GE Healthcare LifeSciences, Cat.# 17-5458-01)纯化。
通过亚克隆抗体至新表达载体随后通过瞬时转染并在HEK中表达完成IgG的哺乳动物表达。简而言之，通过与转染试剂络合随后暴露于HEK细胞1小时，并随后通过稀释培养基到每mL 4百万个细胞的终密度将含有目的抗体的表达载体转染。随后培养细胞7天，每48小时更新饲喂培养基。7天后，在离心后收集上清液并使用蛋白质A进行纯化，且如果需要，加入CHT柱纯化以达到> 95 % 单体。
实施例4：HER2抗体亲和力测量
通过测量其KD(用ForteBio或MSD-SET)来确定HER2抗体亲和力。ForteBio亲和力测量通常如先前描述的(Estep 等人, MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):270-8)进行。简而言之，通过在线负载IgG到AHQ传感器进行ForteBio 亲和力测量。在分析缓冲液中传感器脱机平衡达30分钟，并随后在线监控60秒，作为基线建立。将有负载的IgG的传感器暴露到100 nM抗原5分钟，随后其转移到分析缓冲液5分钟，作为离速率测量。使用1：1结合模型分析动力学。
如先前所述进行平衡亲和力测量(Estep等人, 2013)。在PBS + 0.1% IgG-FreeBSA (PBSF)进行溶液平衡滴定(SET)，抗原维持恒定在50 pM，并与从10 nM开始的3至5倍系列稀释的抗体温育。将抗体(20 nM在PBS)包被在标准结合MSD-ECL板上在4℃过夜或室温下30分钟。随后以700 rpm振荡阻断板30分钟，随后使用洗涤缓冲液(PBSF + 0.05% Tween20)洗涤三次。在700 rpm振荡下将SET样品施用并在盘上温育150s，随后进行一次洗涤。使用PBSF中的250ng/mL磺酸基标签-标记的链霉亲和素通过在板上温育3分钟检测在板上捕获的抗原。使用洗涤缓冲液洗涤板三次，并随后在MSD Sector Imager 2400仪器上使用具有表面活性剂的1x Read Buffer T读取。绘出游离抗原百分比作为在Prism中滴定抗体的函数并调整为二次方程式以获取KD。为了改善生产量，在MSD-SET实验过程中(包括SET样品制备)，使用液体操作机器人。表I给出了ForteBio和MSD-SET亲和力测量的结果。
表 I
测试抗体 KD (M)　(ForteBio)1 kon　(1/M/s)　(ForteBio)1 koff　(1/s)　(ForteBio)1 KD (M)　(MSD)2
XMT 1517 8.7 x10-8 2.3 x105 2.0 x10-2 2.4 x10-8
XMT 1518 3.3 x10-9 2.4 x105 7.9 x10-4 8.5 x10-10
XMT 1519 3.5 x10-8 2.7 x105 9.5 x10-3 1.4 x10-8
XMT 1520 2.1 x10-9 1.4 x105 3.1 x10-4 6.1 x10-10
1 在ForteBio 设备上测量。 IgG在尖端且人HER2单体在溶液中
2 在Meso Scale Discovery设备上测量。 IgG针对生物素化的人HER2单体。
实施例5：Octet Red384表位建仓
在Forte Bio Octet Red384系统(Pall Forte Bio Corporation, Menlo Park, CA)使用标准夹心形式的建仓测定进行抗体的表位建仓。负载对照组抗-靶标IgG到AHQ传感器而使用非相关人IgG1抗体阻断在传感器上未占据的Fc-结合位点。随后将传感器暴露于100nM靶标抗原，接着为第二抗-靶标抗体。使用ForteBio’s 数据分析软件7.0处理数据。在抗原缔合后的第二抗体另外结合指示未占据的表位(非竞争者)，而无结合指示表位阻断(竞争者)。对4个对照组抗体重复此过程：（i）曲妥珠单抗，其结合至HER2的结构域IV(Cho 等人, Nature. 2003 Feb 13;421(6924):756-60)；（ii）帕妥珠单抗，其结合至HER2的结构域II(Franklin 等人, Cancer Cell. 2004 Apr; 5(4):317-28)；（iii）Fab37，其结合至HER2的结构域III(Fisher 等人, J Mol Biol. 2010 Sep 10;402(1):217-29)；以及（iv）chA21，其结合至HER2的结构域I (Zhou 等人, J Biol Chem. 2011 Sep 9;286(36):31676-83.; Cheng 等人, Cell Res. 2003 Feb;13(1):35-48)。对照组抗体的序列显示如下：
>曲妥珠单抗重链可变区氨基酸序列
>曲妥珠单抗轻链可变区氨基酸序列
>帕妥珠单抗重链可变区氨基酸序列
>帕妥珠单抗轻链可变区氨基酸序列
>Fab37重链可变区氨基酸序列
>Fab37轻链可变区氨基酸序列
>chA21重链可变区氨基酸序列
>chA21轻链可变区氨基酸序列
选择不与四个对照组抗体竞争的具有最高亲和力的抗体XMT 1519、XMT 1520、XMT1517、XMT 1518。
如图1A所示，XMT 1517和XMT 1518抗体，和在图1B，XMT 1519与XMT 1520抗体不与4个对照组抗体竞争。
实施例6：使用JIMT-1细胞测量抗体结合常数
使用Macsquant流式细胞仪(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)评估HER2抗体至JIMT-1细胞的细胞表面结合。JIMT-1细胞，在具有10%FBS (Gibco®, LifeTechnologies, Grand Island, NY)的DMEM培养基(ATCC, Manassas, VA)中生长过夜至大约90%融合的培养物，使用Accutase细胞分离液(Innovative Cell Technologies, SanDiego, CA)处理将细胞从板表面释放。使用冰冷介质(含6%山羊血清)洗涤分离的细胞一次并再悬浮于相同介质。将100,000个细胞/孔等分在V-底、96-孔板中且在具有6%山羊血清的150 µl DMEM中与HER2抗体浓度范围(0.05-100 nM)在冰上温育3小时。随后使用冰冷PBS洗涤细胞一次并在冰上在具有2%山羊血清和6 µg/ml的二级荧光标记的抗体、Alexa Fluor®647-标记的山羊抗-人IgG (Life Technologies Cat.# A-21445)的100 µl DMEM中再悬浮1小时。以冰冷PBS(Gibco®, Life Technologies, Cat.# 10010049)洗涤细胞一次并在1%聚甲醛的200 µl的冰冷PBS中悬浮。每细胞结合的荧光量在流式细胞仪上对各处理运行5000个细胞来确定。对各处理的中数荧光值作图，并且使用Graphpad Prism软件通过非线性回归使用单一位置、特异结合模型对各抗体计算解离常数，Kd。图2显示HER2抗体结合至JIMT-1细胞。所计算的Kd值对XMT 1517为3.4 nM、对XMT 1518为0.4 nM、对XMT 1519为1.2nM和对XMT 1520为1.1 nM。
实施例7：ELISA的抗体亲和力测量
抗体对重组人与食蟹猴HER2的亲和力由ELISA测定来确定。通过使用50 µl在50mM碳酸氢盐缓冲液中1 µg/ml溶液在室温下对每孔温育2小时，将纯化的重组HER2胞外结构域（其为人衍生(氨基酸23-652，Acro Biosystems Cat.# HE2-H5225)或食蟹猴衍生(氨基酸1-652，Sino Biological, Cat.# 90295-C08H)）包被在96孔板的表面。以TTBS(50 mM Tris-HCl、pH 7.4, 150 mM NaCl和0.05% Tween 20)洗涤孔4次。通过与50µl的TTBS(含5%牛血清白蛋白)温育1小时来阻断孔。随后将在50 µl的TTBS(有3% BSA)中的各测试抗体或实施例16H的范围稀释液(0.005至10 nM，3倍连续稀释)在室温下添加达2小时。以TTBS洗涤(4x)移除未结合的测试抗体。缀合到HRP(Bethyl Laboratories, #A80-115P)的二级抗-人IgG(浓度为0.2 µg/ml在具有3% BSA的TTBS中)在各孔温育1小时。以4次TTBS洗涤移除未结合的二级抗体。将HRP底物(TMB Bethyl Laboratories#E102)加到各孔且温育直到可以看到黄色。加入50 µl的0.2 N硫酸停止反应。在酶标仪(Molecular Devices, Spectramax M5)中测量在450 nm的吸亮度。使用GraphPad Prism软件对值进行作图。由非线性回归使用单一位置、特异结合模型确定Kd。
图3a给出了抗-HER2抗体XMT 1517、XMT 1518结合到人HER2和食蟹猴HER2的结果。图3b给出了抗-HER2抗体XMT 1519、XMT 1529结合到人HER2和食蟹猴HER2的结果。所计算的Kd值在表II中给出。
表 II
测试抗体 人 HER2　Kd (nM) 食蟹猴 HER2　Kd (nM)
XMT 1517 1.2 0.6
XMT 1518 0.3 0.3
XMT 1519 0.1 0.1
XMT 1520 0.1 0.1
4个测试抗体结合到人HER2和食蟹猴HER2的亲和力类似。
图3c与3d显示抗-HER2抗体XMT 1519与实施例16H分别结合到人HER2和食蟹猴HER2的结果。所计算的Kd值在下面表IIA中给出。
表 IIA
测试物 人 HER2　Kd (nM) 食蟹猴 HER2　Kd (nM)
XMT 1519 0.03 0.03
实施例 16H 0.05 0.05
XMT 1519与实施例16H结合到人HER2和食蟹猴HER2的亲和力类似。
实施例8：使用JIMT-1细胞的抗体竞争分析
为了确认XMT 1518和XMT 1519抗体结合至重叠表位，在JIMT-1细胞上的竞争结合测定中分析抗体。如实施例6所述培养JIMT-1细胞。将50 µl中的50,000个细胞/孔等分至V-底、96孔板。随后将30 nM抗体XMT 1519在25 µl的介质中缀合到Alexa Fluor® -647中，其单独加入，或与第二未标记的抗体(XMT 1518、XMT 1519或曲妥珠单抗)(经稀释到浓度范围(0.05-100 nM))混合，且在冰上温育3小时。随后细胞以冰冷PBS洗涤一次并在冰上再悬浮于100 µl DMEM(具有2%山羊血清和6 µg/ml的山羊Alexa Fluor® 647-标记的抗-人IgG(Life Technologies, Cat.# A-21445)中1小时。细胞以冰冷PBS洗涤一次并悬浮于200 µl的冰冷PBS(具有1%多聚甲醛)中。每细胞结合的荧光量由在MacsQuant流式细胞仪(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)上对各处理运行5000个细胞来确定。对各处理的中数荧光值作图，并以GraphPad Prism由非线性回归使用单一位置、特定结合模型对各抗体计算解离常数KD。如图4所示，抗体XMT 1518以类似程度竞争Alexa Fluor®647-标记的XMT 1519的结合，未标记的XMT 1519显示两种抗体在HER2上识别重叠表位，而曲妥珠单抗并未与Alexa Fluor® 647-标记的XMT 1519的结合竞争。
实施例9：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定
抗-HER2抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性可以在BT474细胞中量化。将5000个细胞/孔在DMEM培养基(含10% FBS)中在96孔板中铺板且在37°在5% CO2下生长过夜。将抗体浓度范围从0.001至100 nM(8系列、5倍稀释)的XMT 1518、 XMT 1519、 XMT 1520或曲妥珠单抗加到细胞并使用生物测定试剂盒(来自Promega (Cat.# G7018))(其使用经工程改造以产生荧光素酶作为ADCC活性的报道物效应子细胞)测量ADCC活性。在分光光度计(Molecular Devices, Spectramax M5)测量荧光素酶活性。将值(以各抗体处理的细胞样品的荧光素酶活性与未经抗体处理的细胞样品的荧光素酶活性的比表达)由非线性回归使用激动剂对反应的对数、可变斜率，使用GraphPad Prism软件4参数模型作图。
图5为显示ADCC值的图。XMT 1519和XMT 1520显示类似于曲妥珠单抗的最大活性：有抗体的讯号对无抗体的讯号比对XMT 1519为30.1而对XMT 1520为29.7，而曲妥珠单抗的比为34.6。XMT 1518具有最大活性11.0。对ADCC活性的EC50(半数最大结合)值分别对XMT1518为0.16 nM，对XMT 1519为0.18 nM、对XMT 1520为0.54 nM和对曲妥珠单抗为0.07 nM。
实施例10：在MCF7细胞中的配体依赖性HER2信号传导
通过以HER3配体，神经调节蛋白-β1处理细胞随后测量磷酸化AKT的量确定在MCF7细胞(ATCC, HTB-22)中抗-HER2抗体对配体依赖性HER2信号传导的效果。在6孔培养皿各孔中将300,000个MCF7细胞铺板在具有0.01 mg/ml牛胰岛素和10% FBS的MEM培养基中，并且在37°、5% CO2氛围下生长过夜。移除培养基并替换为含有10 µg/ml的测试抗体的新鲜培养基，并且温育1小时，随后使用40 pM神经调节蛋白-β 1 (R&D Systems, Minneapolis, MN,Cat.# 377-HB-050)处理15分钟。细胞以冰冷PBS洗涤一次并通过加入200µl含有50 mMTris HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、1% Triton X-100、cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche, Indianapolis, IN)和PhosSTOP磷酸酶缓冲液混合物片剂(Roche,Indianapolis, IN)的缓冲液进行裂解。在4°下15,000 rpm离心裂解产物15分钟以移除不可溶碎片。使用Cell Signaling Technology PathScan® Phospho-Akt1 (Ser473) 夹心ELISA试剂盒，依照制造商说明书确定磷酸化Akt的水平。
表III显示MCF7细胞由神经调节蛋白处理所诱导的AKT磷酸化的增加，以在未受刺激的细胞中测量的百分比表示。
表 III
无 曲妥珠单抗 帕妥珠单抗 XMT 1517 XMT 1518 XMT 1519 XMT 1520
AKT 522 ± 86 369 ± 9 127 ± 22 564 ± 55 441 ± 23 381 ± 21 439 ± 49
使用神经调节蛋白处理磷酸化Akt的水平增加五倍(522%，相对于未受刺激的细胞)。XMT 1517、XMT 1518、XMT 1519和XMT 1520导致少量或无降低神经调节蛋白所诱导的AKT磷酸化的增加，分别为564%、441%、381%和439%，类似于由曲妥珠单抗所造成的(369%)。帕妥珠单抗(其已显示抑制配体依赖性信号传导(Franklin 等人, Cancer Cell. 2004April 19; 5:317-28))降低神经调节蛋白刺激至接近未受刺激的细胞(127%)。这些结果表明测试抗体不会通过抑制HER2和HER3的异二聚化(其通过神经调节蛋白促进并且通过帕妥珠单抗抑制)而作用。
实施例11：在MCF7、SKBR3和JIMT-1细胞中配体独立性HER2信号传导
抗-HER2抗体在MCF7(ATCC, HTB-22)、SKBR3(ATCC, HTB-30)、JIMT-1(ATCC, HTB-30)细胞中HER2信号传导的影响，通过测量4小时抗体处理后磷酸化AKT的水平的变化进行确定。在6孔培养皿的各孔中在细胞的特定培养基(具有10% FBS)中将细胞铺板并且在37°、5%CO2氛围下生长过夜。移除培养基并替换为含有10 µg/ml的测试抗体的新鲜培养基并温育4小时。细胞以冰冷PBS洗涤一次且通过加入200µl含有50 mM Tris HCl、pH 7.4、150 mMNaCl、1% Triton X-100、cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche, Indianapolis, IN)和PhosSTOP磷酸酶Inhibitor混合物片剂 (Roche, Indianapolis, IN)的缓冲液裂解。在4°下在15,000 rpm离心裂解产物15分钟以移除不可溶碎片。使用Cell SignalingTechnology PathScan® Phospho-Akt1 (Ser473) 夹心ELISA试剂盒，依照制造商的说明书确定磷酸化Akt的水平。
表IV显示在MCF7、SKBR3和JIMT-1细胞中配体独立HER2信号传导的抑制，通过AKT磷酸化量指示。结果以相对于未处理的细胞的百分比表示。
表 IV
细胞系 曲妥珠单抗 XMT 1517 XMT 1518 XMT 1519 XMT 1520
SKBR3 64 ± 1 43 ± 5 59 ± 2 34 ± 2 29 ± 5
JIMT-1 56 ± 4 66 ± 4 62 ± 1 84 ± 2 69 ± 4
MCF7 98 ± 4 79 ± 5 103 ± 17 76 ± 3 66 ± 3
测试抗-HER2抗体导致在SKBR3细胞中强烈抑制HER2信号传导，其中XMT 1517、XMT1518、XMT 1519和XMT 1520降低磷酸化Akt水平至未经处理的细胞中出现的43%、59%、34%和29%，相较于曲妥珠单抗所导致降低至64%。
抗-HER2抗体抑制在JIMT-1细胞中的HER2信号传导，如分别对XMT 1517、XMT1518、XMT 1519和XMT 1520，磷酸化AKT降低至未经处理细胞中所发生者的66%、62%、84%和69%所示，类似于曲妥珠单抗所导致的降低至56%。
在MCF7细胞中XMT 1518，如曲妥珠单抗，不会抑制HER2信号传导，然而，XMT 1517、XMT 1519和XMT 1520导致信号传导适度降低，降低AKT磷酸化至未经处理细胞中所发生者的79%、76%和66%。
实施例12：在BT474细胞中配体独立性HER2信号传导
抗-HER2抗体对BT474细胞(ATCC, HTB-20)中HER2信号传导的效果，通过4小时抗体处理后测量磷酸化AKT的量的变化来确定。在6孔培养皿各孔中将BT474细胞(300,000个细胞)在具有10% FBS的DMEM培养基中铺板并在37°、5% CO2氛围下生长过夜。移除培养基并且替换为含有10 µg/ml测试抗体的新鲜培养基并温育4小时。细胞以冰冷PBS洗涤一次并且加入200µl的含有50 mM Tris HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、1% Triton X-100、cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche, Indianapolis, IN)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物片剂(Roche, Indianapolis, IN)的缓冲液裂解。在4°下15,000 rpm离心裂解产物15分钟以移除不可溶碎片。以蛋白印迹分析法确定磷酸化Akt的水平。20µl的各萃取物与7 µl的NUPAGE负载染料(Life Technologies, Cat.# NP0007)和2 µl的10x还原剂(Life TechnologiesCat.# NP0004)混合且负载至4-12% Bis-Tris 聚丙烯酰胺胶体(Life Technologies,Cat.# NP0341)上，以120伏特在MOPS电泳缓冲液(Life Technologies Cat.# NP000102)中跑电泳90分钟。以10伏特在含有10%甲醇的转移缓冲液(Life Technologies, Cat.#NP0006)中转移分离的蛋白质到在半干式电泳转移系统(Bio-Rad, Transblot system)的硝化纤维素膜30分钟。在阻断缓冲液 (Li-cor, Cat.# 927-40000)中温育膜1小时，并随后以在相同阻断缓冲液中的小鼠抗体(识别AKT蛋白质)(Cell Signaling Technology, #2920)(经1:1000稀释)、兔抗体(识别在丝氨酸473磷酸化的AKT)(Cell SignalingTechnology, #4060)和兔抗体(识别肌动蛋白)(LiCor, Cat.# 926-42210)(经1:5,000稀释)培养1小时。在温育后使用10 ml TTBS洗涤膜3次，并随后与二级抗体：缀合到IRdye®800CW的山羊抗-兔IgG(Li-Cor, Cat.# 926-32211)和缀合到IRdye® 680RD的山羊抗-小鼠IgG(Li-Cor, Cat.# 926-68070)(两者在阻断缓冲液经1:10,000稀释)温育1小时。再次以10 ml TTBS 洗涤膜3次并且在Li-Cor Odyssey扫描仪上扫描。使用扫描仪软件量化相应的AKT，磷酸-AKT和肌动蛋白的条带。各磷酸-AKT条带归一化为总AKT条带并且表示为未以任何抗-HER2抗体处理的细胞的磷酸-AKT蛋白质的百分比。
在相同实验中同样检验了抗-HER2抗体对HER3磷酸化的效果。上述硝化纤维素印迹也以识别在酪氨酸1289磷酸化的HER3的兔抗体(Cell Signaling Technology, #4791)(在阻断缓冲液中经1:1000稀释)探测1小时。在温育后使用10 ml TTBS洗涤膜3次，并随后与缀合到IRdye® 800CW的山羊抗-兔IgG(Li-Cor, Cat.# 926-32211)(在阻断缓冲液经1:10,000稀释)培养1小时。再次以10 ml TTBS洗涤膜3次并且在Li-Cor Odyssey扫描仪扫描。使用扫描仪软件量化对应磷酸-HER3和肌动蛋白的条带。各磷酸-HER3条带归一化为总AKT条带并且表示为未以任何抗-HER2抗体处理的细胞的磷酸-HER3蛋白质的百分比。
表V给出在BT474细胞中配体独立性HER2信号传导的抑制，其由AKT磷酸化或Her3磷酸化的量所确定。结果相对于未受刺激的细胞的百分比呈现。
表 V
曲妥珠单抗 帕妥珠单抗 XMT 1519 XMT 1520
AKT 31 ± 2 44 ± 3 21± 8 30 ± 5
HER3 80 85 71 76
抗-HER2抗体XMT 1519降低AKT磷酸化至在BT474未经处理的细胞中观察到的约21%和HT19B至在BT474未经处理的细胞中观察到的约30%，并且相较于曲妥珠单抗导致降低至未经处理的细胞的约31%和帕妥珠单抗导致降低至未经处理的细胞的约44%。HER3磷酸化适度地受到所有抗体影响：由XMT 1519、XMT 1520、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗分别为未经处理的细胞中观察到的71%、76%、80%和85%。
实施例13：内化速率测量
各抗体XMT 1518、XMT 1519、XMT 1520和曲妥珠单抗从SKBR3细胞的细胞表面内化的速率通过基于96孔的测定的荧光来确定。将SKBR3细胞接种于96孔板中并允许在DMEM培养基中在37° 5% CO2下贴壁生长过夜(ATCC, Manassas, VA, Cat.# 30-2002)(有10%胎牛血清(FBS)(Gibco®, Life Technologies, Grand Island, NY, Cat.# 16140-071))。细胞在含有10 µg/ml抗体的培养基中在冰上温育1小时，随后以冰冷培养基洗涤且在冰上与75 µl的培养基(其含有1 µg/ml的缀合到Alexa Fluor®-647的山羊抗-人IgG单价Fab片段(Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, Cat.# 809-1102))温育1小时。洗涤后将细胞转移到37°培养箱以允许各时间点的内化。在Odyssey扫描仪(Li-CorBiosciences, Lincoln, NE)使用700nm信道扫描板。随后，通过在冰上与100 mM甘氨酸、20mM MgSO4、50 mM KCl、pH 2.2温育而酸洗板，以移出结合至细胞表面的抗体，以冰冷PBS洗涤并且再次扫描以确定被细胞内化的荧光量。图6显示4小时抗体内化速率。所有抗体内化速率几乎与曲妥珠单抗相同，全部具有在时间0结合4小时内化的总表面的约50%(图6)。
实施例13A：在SKBR3细胞中的HER2内化
通过荧光显微镜研究抗-HER2抗体的组合对SKBR3细胞中HER2内化的影响。曲妥珠单抗与Alexa Fluor-647缀合并且用于显现曲妥珠单抗的位置和推测在细胞中的HER2。将SKBR3细胞接种在4室显微镜载玻片并且允许在含有10%胎牛血清(FBS) (Gibco®, LifeTechnologies, Grand Island, NY, Cat.# 16140-071)的DMEM培养基(ATCC, Manassas,VA, Cat.# 30-2002)中在37° 5% CO2下生长过夜贴壁。在含有（i）曲妥珠单抗-Alexa-647和帕妥珠单抗的组合或（ii）曲妥珠单抗-Alexa-647与帕妥珠单抗与HER2抗体XMT 1519的组合的培养基中将SKRB3细胞温育90分钟。使用荧光显微镜显现曲妥珠单抗的位置。如图7所示，大部分与单独帕妥珠单抗组合的曲妥珠单抗-Alexa Fluor-627与cell mask orange共定位，表明为细胞膜定位，大部分与帕妥珠单抗和XMT 1519两者组合的曲妥珠单抗-Alexa Fluor-647与Lysotracker共定位，表明为溶酶体定位。此结果表明XMT 1519与曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合促进HER2至溶酶体的内化与运输。
实施例13B：抗-HER2抗体组合的内化速率测量
组合多抗-HER2抗体(识别HER2内化速率上不同的表位)的效果通过96孔板为主的测定进行确定，类似于实施例13中的描述。在该实验中，使用单独的测试HER2抗体单独、与曲妥珠单抗组合或与曲妥珠单抗与帕妥珠单抗组合来处理细胞，并且测量在各时间内化的抗-HER2抗体的量。
对于测定，在三个96孔板(具有清晰孔底的黑色板)各孔中在含有10% FBS的DMEM培养基将40,000个SKBR3细胞铺板并且在37° 5% CO2下贴壁过夜。第二天，使用如下抗体处理细胞。以含有5 µg/ml的测试HER2抗体之一或曲妥珠单抗的新鲜、冰冷培养基替换各孔中的培养基，并且在冰上温育1小时。通过冰冷培养基洗涤细胞两次以移除未结合的抗体。为了检测，将5 µg/ml的Alexa 647标记的抗-人IgG Fab片段加到各孔的冰冷培养基中并且在冰上温育1小时。通过使用冰冷培养基洗涤各孔2次来移除未结合的二级抗体。接着，将含5µg/ml曲妥珠单抗、5 µg/ml的曲妥珠单抗与帕妥珠单抗各自或无另外抗体的培养基添加至各孔。一式三次进行各处理。使用Alexa 647标记的抗-人IgG单价Fab片段单独处理一组孔，并且将这些孔中测得的荧光用于减去背景荧光。
对各处理留一板在冰上来确定时间0值，而其他板在37 ℃温育。1.5小时后，将37℃ 的一块板和时间0板使用冰冷PBS洗涤2次并且使用Licor Odyssey扫描仪的680 nm信道扫描。各孔中所测荧光用作各处理的总荧光。随后以100 mM甘氨酸、50 mM KCl和20 mMMgSO4、pH2.2酸洗涤细胞2次，随后以冰冷PBS洗涤2次以移除表面结合的抗体。再次扫描板以确定各孔中内化的荧光量。第二天以相同方式分析24小时板。
各HER2抗体(或对照孔中的曲妥珠单抗)内化的百分比通过减去背景、平均各自的三个重复，随后将各处理的内化荧光除以总荧光并乘以100来计算。
如表VA所示，当与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗两者组合时，80-90%的XMT 1518、XMT1519和XMT 1520在1.5小时内被内化。XMT 1517显示60%内化，可能由于其非常高的解离速率，导致其在温育期间从细胞扩散。当与曲妥珠单抗组合时，各测试抗体的20-40%在1.5小时内经内化，而当各测试抗体单独存在时，则约15%经内化。曲妥珠单抗单独在1.5小时显示约15%内化，而当其与帕妥珠单抗组合时，则约30%。
因此，三种HER2抗体的组合；测试HER2抗体、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的任一种，增加抗体内化速率，最有可能是通过增加HER2胞吞作用速率。
表 VA
实施例14：HER2降解
抗-HER2抗体对SKBR3细胞中HER2降解的效果在抗体处理后通过蛋白质印迹分析确定。在6孔培养皿各孔中在含有10% FBS的DMEM培养基中将300,000个SKBR3细胞铺板并在37°5% CO2氛围下生长过夜。移除培养基并且使用含有10 µg/ml的各抗体的新鲜培养基替换并温育4小时。细胞以冰冷PBS洗涤一次且加入200µl含有50 mM Tris HCl、pH 7.4、150 mMNaCl、1% Triton X-100、cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche, Indianapolis, IN)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物片剂(Roche, Indianapolis, IN)的缓冲液裂解。在4°下15,000 rpm离心裂解产物15分钟以移除不可溶碎片。将20µl的各萃取物与7 µl的NUPAGE负载染料(Life Technologies, Cat.# NP0007)和2 µl的10x还原剂(Life TechnologiesCat.# NP0004)混合并负载至4-12%Bis-Tris聚丙烯酰胺胶体(Life Technologies, Cat.#NP0341)，其以120伏特在MOPS电泳缓冲液(Life Technologies Cat.# NP000102)中跑电泳90分钟。以10伏特在含10%甲醇的转移缓冲液(Life Technologies, Cat.# NP0006)转移分离的蛋白质到在半干式电泳转移系统(Bio-Rad, Transblot system)的硝化纤维素膜30分钟。在阻断缓冲液 (Li-cor, Cat.# 927-40000)中温育膜1小时，随后与在相同阻断缓冲液的兔抗体(识别HER2蛋白质(Cell Signaling Technology, Cat.# 2165)，经1:1,000稀释)和兔抗体(识别肌动蛋白(LiCor, Cat.# 926-42210)，经1:5,000稀释)温育1小时。在温育后，以10 ml TTBS洗涤膜3次，随后以在阻断缓冲液中的二级抗体：缀合到IRdye® 800CW的山羊抗-兔IgG(Li-Cor, Cat.# 926-32211)和缀合到IRdye® 680RD (Li-Cor, Cat.#926-68070)的山羊抗-小鼠IgG(两者经1:10,000稀释)培养1小时。再次以10 ml TTBS洗涤膜3次且在Li-Cor Odyssey扫描仪扫描。使用扫描仪软件量化对应全长HER2蛋白质和对应肌动蛋白的条带。各HER2条带归一化为肌动蛋白条带且表示为未以任何抗-HER2抗体处理的细胞的HER2蛋白质的百分比。
图8显示以测试抗体单独或组合曲妥珠单抗处理的SKBR3细胞对HER2量具有少或无影响，例外为XMT 1518和XMT 1520导致全长HER2分别减少到78%和68%，且导致出现较低分子量降解产物。然而，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和测试HER2抗体之一的三重组合导致大量HER2降解，以及出现HER2降解产物。当XMT 1518或XMT 1520与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合时见到最大量减少，具有20%或31% HER剩余。当抗体XMT 1517或XMT 1519与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合时，减少分别为HER2剩余正常量的40%或42%。
实施例15：表位绘图
通过Integral Molecular Inc., 3711 Market Street, Suite 900, Philadelphia,Pa., USA使用其Shotgun Mutagenesis Technology进行抗体XMT 1517和XMT 1519的表位绘图。Shotgun Mutagenesis使用其专有的高通量细胞表达技术，能够在真核细胞中表达和分析突变靶标蛋白质的大文库。蛋白质中每个残基经个别突变，通常对多个其他氨基酸，以分析功能改变。蛋白质表达在标准哺乳动物细胞系中，因此即使是需要真核转译或转译后修饰的困难蛋白质可以被绘图。
Shotgun Mutagenesis Mapping鉴定了对XMT 1517 结合的6个重要氨基酸(C453、H473、N476、R495、H497和W499)，其指示了XMT 1517结合至HER2的结构域III的C-端与结构域IV的N-端上的区域。在H456和G496的二个次重要突变也可以涉及XMT 1517结合到HER2。
鉴定了对XMT1519结合的三个重要氨基酸(E521、L525和R530)，其指示XMT 1519结合Her2的结构域IV的N-端上的区域。
实施例16：HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的合成
使用在于2014年10月10日提交的美国系列号14/512,316中描述的程序制备HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物。表VI给出了抗体-聚合物药物缀合物的细节。
表 VI
实施例编号 抗体 DAR (药物:抗体比)
16A 曲妥珠单抗 约10:1 至约 15:1
16B 曲妥珠单抗 约16:1 至约 21:1
16C 曲妥珠单抗 约5:1 至约 10:1
16D XMT 1519 约11:1 至约 16.5:1
16E XMT 1519 约13:1 至约 20:1
16F XMT 1519 约12:1 至约 18:1
16G XMT 1517 约 7:1 至约 10.5:1
16H XMT 1519 约11.8:1 至约 17.5:1
16J XMT 1519 约8.9:1 至约 13.3:1
HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物具有约170 kDa至约230kDa的峰分子量。合成的/测量的聚合物和聚合物缀合物通常地具有多分散性 ≤1.5。聚合物-药物缀合物(即连接至抗体的药物-负载聚合物链)含有约27% mol至约33% mol的β-丙氨酸，约6.4 % mol至约9.6 % mol 的AF-HPA-Ala和约1.5 % mol至约4% mol 的EG2-MI。
实施例17：利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的合成
使用描述于2014年10月10日提交的美国系列号14/512,316中的程序制备利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物(非结合对照)。表VII给出了抗体-聚合物药物缀合物的细节。
表 VII
实施例编号 抗体 DAR (药物:抗体比)
17A 利妥昔单抗 约10:1至约15:1
17B 利妥昔单抗 约16:1至约21:1
17C 利妥昔单抗 约10:1至约15:1
HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物具有约170 kDa至约230kDa的峰分子量。合成/测量的聚合物和聚合物缀合物通常地具有多分散性 ≤1.5。聚合物-药物缀合物(即连接到抗体的药物-负载的聚合物链)包含约27% mol至约33% mol 的β-丙氨酸、约6.4 % mol至约9.6 % mol 的AF-HPA-Ala和约1.5 % mol至约4% mol的EG2-MI。
实施例18：HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物的细胞毒性测定
使用Cell Titer-Glo (Promega Corp)评估HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物在体外肿瘤细胞系中的抗增殖特性。在含有10% FBS(Gibco®，LifeTechnologies，Grand Island，NY，Cat.# 16140-071)的DMEM培养基(ATCC，Manassas，VA，Cat.# 30-2002)中培养JIMT-1(HER2中度表达细胞，DSMZ，Braunschweig，Germany，Cat.#ACC589)、MDA-MB-361(HER2中度表达人乳腺癌细胞，ATCC，Cat.# HTB-27)、MDA-MB-453细胞(三阴性乳腺癌细胞系，ATCC，Cat.# HTB-131)。在RPMI-1640培养基中培养(ATCC，Cat.#30-2001)NCI-H522 (非小细胞肺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CRL-5810)和NCI-H2170(非小细胞肺癌细胞系，ATCC，Cat.# CRL-5928)细胞。在DMEM:F12培养基中培养(ATCC，Cat.# 30-2006)NCI-H1581 (非小细胞肺癌中度表达细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CRL-5878)细胞。在含有20% FBS的Iscove’s 改良Dulbecco’s培养基(Invitrogen LifeTechnologies，Cat.# 12440053)中培养SNU5(胃癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CRL-5973)。在含有20% FBS的RPMI培养基中培养OVCAR3(卵巢腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.#HTB-161)。在含有20% FBS的Leibovitz's L-15培养基中培养MDA-MB-175-VII(人乳腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# HTB-25)。在90% ATCC-调配的Eagle's基本培养基中培养CAMA-1(人乳腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# HTB-21)。ZR75-1(人乳腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CRL-1500)培养在RPMI-1640 培养基。在RPMI-1640培养基中培养HCC1187(人乳腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CRL-2322)。在RPMI-1640培养基中培养HCC38(人乳腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CRL-2314)。在RPMI-1640培养基中培养T47D(人乳腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# HTB-133)。在RPMI-1640培养基中培养HCC70(人乳腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CRL-2315)。在DMEM 培养基中培养MDA-MB-231(人乳腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# HTB-26)。在ATCC-调配的Eagle's基本培养基中培养CALU3(人肺腺癌细胞系，ATCC，Cat.# HTB-55)。在F12K培养基中培养A549(人肺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CCL-185)。在RPMI-1640培养基，(ATCC，Cat.# 30-2001)中培养NCI-H2122(人肺腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CRL-5985)。在RPMI-1640培养基，(ATCC，Cat.# 30-2001)中培养NCI-H460(人肺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# HTB-177)。在RPMI-1640培养基，(ATCC，Cat.#30-2001)中培养SHP-77(人小细胞肺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CRL-2195)。在含有20%FBS的Iscove's改良Dulbecco's 培养基中培养KATO III(人胃癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# HTB-103)。在RPMI-1640培养基，(ATCC，Cat.# 30-2001)中培养MKN-45 III(人胃腺癌细胞系，未扩增，DSMZ，Braunschweig，Germany，Cat.# ACC409)。在McCoy's 5a 培养基中培养SKOV3(人卵巢腺癌细胞系ATCC，Cat.# HTB-77)。在MCDB 105介质(含最终浓度为1.5g/L重碳酸钠)和培养基199(含最终浓度为2.2 g/L重碳酸钠)的1:1混合物中培养TOV-21G(人卵巢腺癌细胞系，未扩增，ATCC，Cat.# CRL-11730。在含有10% FBS的DMEM培养基中培养BT474(HER2高表达人乳腺癌细胞，ATCC，Cat.# HTB-20)。在10% FBS 的RPMI-1640培养基中生长NCI-N87(高HER2表达胃癌细胞系，ATCC，Cat.# CRL-5822)。
针对细胞毒性测定，细胞以3000个细胞/孔的密度接种在96孔板中并且在37 ℃5% CO2下温育过夜期间贴壁。随后以含HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物(100 nM至0.1 pM)或贺癌宁(Genentech)的新鲜培养替换培养基并且在37° 5% CO2下温育细胞72小时或6天。如试剂盒说明书所述使用CellTiter-Glo® 发光细胞存活测定(Promega, Madison, WI) 测量细胞存活。细胞生存力归一化为未处理的对照并表示为百分比。将值绘图并且以Graphpad Prism软件(San Diego, CA)使用4参数、可变斜率、剂量反应曲线拟合算法计算IC50值。表VIII给出HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物和贺癌宁的细胞毒性的说明性结果。
细胞系 HER2 分子/细胞 Her2 表达 实施例 16G 实施例 16D 实施例 16B 实施例 16E 贺癌宁
JIMT-1 80,000 2+ 0.1 0.6 0.3b ND 17.5
MDA-MB-453 125,000 2+ ND 0.04 0.04/0.08 0.04 ~100
MDA-MB-361 135,000 2+ ND 0.02 0.005/0.001 ND 0.27/0.33
MDA-MB-175VII 51,000 1+ ND ND 0.1 0.3 1.2
CAMA-1 50,000 1+ ND ND 0.02 0.1 7.8
ZR75-1 40,000 1+ ND ND 1.1 2.7 >100
HCC1187 38,000 2+ ND ND 0.8 1.7 30
HCC38 36,000 2+ ND ND 0.8 4 >100
T47D 20,000 1+ ND ND 4.3 1.2 82.3
HCC70 10,000 1+ ND ND ND 4c 83.4
MDA-MB-231 5400 1+ ND ND 11 6.3c 27
NCI-H522 25,000 1+ ND 0.8 0.18 ND ~100
NCI-H1581 13,000 1+ ND 5.6 2.3 ND ~100
NCI-H2170 660,000 3+ ND ND 0.07 0.08 0.4
CALU3 330,000 3+ ND ND 0.25 0.15 >100
NCI-H2122 12,000 1+ ND ND 0.5 2.5 19
A549 6,000 1+ ND ND 20 10.8c >100
NCI-H460 4,000 1+ ND ND 16 20c 68
SHP-77 0 ND ND 67 22c >100
SNU5 22,000 1+ ND ND 2.9 3.3 >100
KATOIII 19,000 1+ ND ND 19 3.8 >100
MKN45 16,000 1+ ND ND ~80 5.2 >100
OVCAR3 7,200 1+ ND ND 1.6 2.4 ~85
SKOV3 220,000 3+ ND 0.6 0.19 ND 5.6
TOV21G 12,000 1+ ND ND 0.45 8.8 >100
BT474 860,000 3+ ND 0.03 0.1 0.06 1.3
NCI-N87 700,000 3+ ND 0.03 0.03 0.08 0.3
ND = 未确定
b = 在测定中使用实施例16C替代16B
c = 对无关抗体对照的等效效力。
如表VIII所示，在所有测试细胞系中，所有HER2抗体-聚合物-药物缀合物比贺癌宁更有效力。
实施例19：在具有突变体HER2的细胞系中，HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物的细胞毒性测定。
使用Cell Titer-Glo (Promega Corp)评估HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物在体外肿瘤细胞系的抗增殖特性。在含有10% FBS的RPMI-1640培养基中培养NCI-H1781 (HER2突变体表达人肺癌细胞，ATCC，Cat.# CRL-5894)。
对于细胞毒性测定，细胞以3000个细胞/孔接种于96孔板并且在37℃ 5% CO2下温育过夜期间以贴壁。随后以含有HER2-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物(100 nM to 0.1 pM)、实施例17A(利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))或贺癌宁(Genentech)的新鲜培养基替换所述培养基，并在37℃ 5% CO2下温育细胞72小时。如试剂盒说明书所述使用CellTiter-Glo® 发光细胞存活测定 (Promega, Madison,WI)测量细胞存活。细胞生存力归一化为未处理的对照并且以百分比表示。将值进行绘图并以Graphpad Prism软件(San Diego, CA)使用4参数、可变斜率、剂量反应曲线拟合算法计算IC50值。表IX给出这些测定的结果。
表 IX
如表IX所示，在测试细胞系中，所有HER2抗体-聚合物-药物缀合物比利妥昔单抗抗体-聚合物-药物缀合物或贺癌宁更有效力。
实施例20. 施用PBRM-聚合物-药物缀合物的肿瘤生长反应
对雌性CB-17 SCID小鼠使用NCI-N87细胞(对各组n=10)、JIMT-1细胞(对各组n=10)、SNU-5细胞(对各组n=10)、H522细胞(对各组n=10)、SKOV3细胞(对各组n=10)、Calu-3细胞(对各组n=10)、NCI-N87贺癌宁抗性细胞(对各组n=10)、NCI-N87-MSA 贺癌宁抗性细胞(对各组n=10)或BT474肿瘤片段(对各组n=10)进行皮下接种。对雌性NCr nu/nu使用TOV-21G细胞(对各组n=10)进行皮下接种。测试化合物或媒介物以IV给药作为第1天的单一剂量或如所示者。使用数字卡尺在图8至18所示的时间测量肿瘤尺寸。计算肿瘤体积且用于确定肿瘤生长延迟。当肿瘤达到800至1500 mm3尺寸时处死小鼠。报道肿瘤体积为对各组平均值±SEM。
图9提供了在IV施用媒介物；实施例16A，曲妥珠单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67 mg/kg；或实施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67 mg/kg作为第1天的单一剂量后，皮下接种NCI-N87细胞的小鼠中的肿瘤反应结果(对各组n=10)。媒介物和曲妥珠单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))显示增加肿瘤体积。基于第29天肿瘤生长抑制分析，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))显示60%部分消退并且导致潜在治疗活性(TGI 88%)。
图10提供了在IV施用媒介物；贺癌宁，20 mg/kg；实施例16A，曲妥珠单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67 mg/kg；或实施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67 mg/kg作为第1天的单一剂量后，皮下接种JIMT-1细胞的小鼠中的肿瘤反应结果(对各组n=10)。媒介物和贺癌宁显示增加肿瘤体积。曲妥珠单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))和XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物显示出治疗潜力并且分别具有40%与70%消退。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))具有5个部分消退和2个完全消退，其在研究结束的第69天维持无肿瘤的存活者。
图11提供了在IV施用媒介物；贺癌宁，10 mg/kg作为第1天的单一剂量；10 mg/kg的贺癌宁与15 mg/kg的帕妥珠单抗的组合每周给药达3周；或实施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67 mg/kg作为第1天的单一剂量后，经JIMT-1细胞皮下接种的小鼠中的肿瘤反应结果(对各组n=10)。媒介物、贺癌宁和贺癌宁与帕妥珠单抗的组合全部显示增加肿瘤体积。XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物显示60%部分消退且为最有效。
图12提供了在IV施用媒介物；实施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67 mg/kg作为第1天的单一剂量；15 mg/kg的曲妥珠单抗与15 mg/kg的帕妥珠单抗的组合每周给药达3周(即在第1、8和15天)；或15 mg/kg的曲妥珠单抗与15 mg/kg的帕妥珠单抗各每周给药达3周(即在第1、8和15天)连同实施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67 mg/kg作为第1天的单一剂量的三重组合之后，皮下接种NCI-N87 细胞 (对各组n=10)的小鼠中的肿瘤反应结果。媒介物显示增加肿瘤体积。XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))单独或组合全部显示减少肿瘤，而曲妥珠单抗；帕妥珠单抗和实施例16F的三重组合为最有效且导致100%部分消退，而实施例16F单独或曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合各造成10个中一个的部分反应。相较于实施例16F单一疗法或曲妥珠单抗+帕妥珠单抗双联组合，三组合具有数值较高的部分反应率，且导致显著较大的肿瘤体积减少(p<.05，Mann-Whitney测试)。部分反应被定义为消退到少于基线肿瘤体积的50%持续至少3个连续肿瘤测量。
XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))与帕妥珠单抗与曲妥珠单抗的组合的总存活益处显著差异于XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))单独施用(P < 0.011，对数等级检定)且优于帕妥珠单抗与曲妥珠单抗的组合(P < 0.273,对数等级检定)或XMT-1519抗体、帕妥珠单抗与曲妥珠单抗的三重组合(P < 0.05，对数等级检定)所达到的结果。
图13提供了在IV施用媒介物；10 mg/kg的贺癌宁作为单一剂量；实施例16E，5 mg/kg、2 mg/kg或0.67 mg/kg 的XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为单一剂量；或实施例17B，5 mg/kg的利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为第1天的单一剂量后，皮下接种SNU-5细胞的小鼠中的肿瘤反应结果(对各组n=10)。在第18天，媒介物显示增加肿瘤体积。XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物显示肿瘤减少且比贺癌宁或利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))更有效且在5 mg/kg与2 mg/kg剂量导致100 %无肿瘤的存活者而在0.67 mg/kg 剂量导致90%无肿瘤的存活者。
图14提供了在IV施用媒介物；10 mg/kg的贺癌宁作为单一剂量；5 mg/kg或2 mg/kg的实施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为第1天的单一剂量后，皮下接种TOV-21G细胞的小鼠中的肿瘤反应结果(对各组n=10)。XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物显示肿瘤阻滞且比贺癌宁(未达到治疗活性门坎)更有效。
图15提供了在IV施用媒介物；10 mg/kg的贺癌宁作为单一剂量；5 mg/kg的实施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为单一剂量；或5 mg/kg的实施例17B，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为第1天的单一剂量后，皮下接种H522细胞的小鼠中的肿瘤反应结果(对各组n=10)。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物显示肿瘤阻滞且比未达到治疗活性阈值的贺癌宁和利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))更有效。
图16提供了在IV施用媒介物；10 mg/kg的贺癌宁作为单一剂量；5 mg/kg的实施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为单一剂量；或5 mg/kg的实施例17B，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为第1天的单一剂量后，皮下接种SKOV3细胞的小鼠中的肿瘤反应结果(对各组n=10)。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))导致100%消退(由10个完全反应组成)且比未达到治疗活性阈值的贺癌宁或利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)更有效。
图17提供了在IV施用媒介物；或5 mg/kg的实施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala))作为第1天的单一剂量后，皮下接种Calu-3细胞的小鼠中的肿瘤反应结果(对各组n=10)。XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))导致100%消退反应(由2个部分反应与8个完全反应所组成)，其中6个在第60天维持无肿瘤。
图18提供了在IV施用媒介物；10 mg/kg的贺癌宁作为单一剂量；3 mg/kg的实施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为单一剂量或在第一天3 mg/kg的实施例17B，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))后，患者衍生的异种移植模型BRE-0333 HER2 1+中的肿瘤反应结果(对各组n=8)。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物显示肿瘤阻滞且比贺癌宁或利妥昔单抗-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))更有效。
图19提供了在IV施用媒介物；10 mg/kg的贺癌宁作为单一剂量；1或3 mg/kg的实施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))或3 mg/kg的实施例17B，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为第1天的单一剂量后，患者衍生的异种移植模型MAXF_1162 HER2 3+中的肿瘤反应结果(对各组n=10)。1和3 mg/kg的XMT1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))两者导致100%消退反应和无肿瘤的存活者并且比贺癌宁或3 mg/kg的利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))更有效。
图20提供了在IV施用媒介物；5 mg/kg的贺癌宁作为单一剂量；5 mg/kg或2 mg/kg的实施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为第1天的单一剂量；5 mg/kg的实施例17C，利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作为第1天的单一剂量或5 mg/kg的XMT 1519作为单一剂量后，皮下接种BT474肿瘤片段的小鼠中的肿瘤反应结果(对各组n=10)。XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物显示完全肿瘤消退且比贺癌宁、利妥昔单抗-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))或XMT-1519更有效。
单一剂量的1 mg/kg或0.67 mg/kg的XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物在低HER2-表达乳腺癌和胃癌模型中显示完全消退，其中ado-曲妥珠单抗艾得辛(贺癌宁)在剂量10 mg/kg和更高时无活性。在HER2-驱动的肿瘤模型中，XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物与广泛使用的抗-HER2疗法曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合显示出协同功效。XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物证实了优异的药物动力概况且以治疗剂量在非人灵长类动物中为良好耐受。
临床前数据提出XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))缀合物具有潜力大幅地扩大可以受益于HER2-标靶疗法的患者数量。缀合物提供了在癌症(其中有少至10,000个HER2受体，其中其他疗法无活性)中有效的药物递送。
其他实施方案
尽管本发明已经连同其详细说明进行了描述，前述说明仅意图是说明性的且不限制本发明的范围，所述范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修饰在以下权利要求的范围中。

Claims (80)

1.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至人HER2受体的表位，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段结合人HER2受体结构域IV N端的至少部分，但是不与结合至人HER2受体表位4D5的抗体交叉竞争，且其中所述抗体或其抗原结合片段展示出以下一个或多个特征：
(i)所述经分离的抗体或其抗体结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，所述表位包含人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基452至531；
(ii)所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，且所述抗体或其抗原结合片段不与曲妥珠单抗交叉竞争结合至人HER2受体；
(iii)所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体结构域III C端的至少部分和结构域IV N端的至少部分，但不与Fab37单克隆抗体交叉竞争；
(iv)所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体结构域III C端的至少部分和结构域IV N端的至少部分，但是不与Fab37单克隆抗体交叉竞争且不与曲妥珠单抗交叉竞争结合至人HER2受体；
(v)所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，且所述抗体或其抗原结合片段不与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或Fab37单克隆抗体或chA21单克隆抗体竞争结合至人HER2受体；和
(vi)所述经分离的抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的表位。
2.权利要求1所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，所述表位包含人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基520至531。
3.权利要求1或2所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，所述表位包含人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基E521、L525和R530。
4.权利要求1至3中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变重链互补决定区1(CDRH1)，其包含氨基酸序列FTFSSYSMN(SEQ IDNO: 25)；可变重链互补决定区2(CDRH2)，其包含氨基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ IDNO: 26)；可变重链互补决定区3(CDRH3)，其包含氨基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO: 27)；可变轻链互补决定区1(CDRL1)，其包含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO: 28)；可变轻链互补决定区2(CDRL2)，其包含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO: 21)；和可变轻链互补决定区3(CDRL3)，其包含氨基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO: 29)。
5.权利要求1至3中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括了包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的可变轻链。
6.权利要求1至3中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括了包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的轻链。
7.权利要求1所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，所述表位包含人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基452至500。
8.权利要求1或7所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，所述表位包含人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497和W499。
9.权利要求1、7和8中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含CDRH1，其包含氨基酸序列FTFSSYGMH(SEQ ID NO: 17)；CDRH2，其包含氨基酸序列VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 18)；CDRH3，其包含氨基酸序列EAPYYAKDYMDV(SEQ ID NO: 19)；CDRL1，其包含氨基酸序列RASQSVSSDYLA(SEQ ID NO:20)；CDRL2，其包含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO: 21)；和CDRL3，其包含氨基酸序列QQYVSYWT(SEQ ID NO: 22)。
10.权利要求1、7和8中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括了包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的可变轻链。
11.权利要求1、7和8中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括了包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的轻链。
12.权利要求1至11中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、单链可变片段(scFv)、scFv-Fc片段、单链抗体(scAb)、结构域抗体(dAb)、单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体。
13.权利要求1至11中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是兔、小鼠、嵌合、人源化或全人单克隆抗体。
14.权利要求1至11中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG同种型。
15.权利要求1至11中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型。
16.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其与权利要求4至6中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段竞争特异性结合至人HER2受体。
17.权利要求16所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或Fab37单克隆抗体或chA21单克隆抗体竞争结合至人HER2受体。
18.一种经分离的核酸分子，其编码权利要求1至11中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段。
19.一种载体，其包含权利要求18所述的经分离的核酸分子。
20.一种生产经分离的抗体或其抗原结合片段的方法，其通过在导致所述经分离的抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养细胞，其中所述细胞包含权利要求19所述的载体。
21.一种缀合物，其包含特异性结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段和一种或多种治疗剂或诊断剂(D)，其各自独立地直接或间接连接到所述抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段结合人HER2受体结构域IV N端的至少部分，但不与结合至人HER2受体表位4D5的抗体交叉竞争，且其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下一个或多个特征：
(i)所述经分离的抗体或其抗体结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，所述表位包含人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基452至531；
(ii)所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，且所述抗体或其抗原结合片段不与曲妥珠单抗交叉竞争结合至人HER2受体；
(iii) 所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体结构域III C端的至少部分和结构域IV N端的至少部分，但不与Fab37单克隆抗体交叉竞争；
(iv)所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体结构域III C端的至少部分和结构域IVN端的至少部分，但不与Fab37单克隆抗体交叉竞争且不与曲妥珠单抗交叉竞争结合至人HER2受体；
(v)所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，且所述抗体或其抗原结合片段不与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或Fab37单克隆抗体或chA21单克隆抗体竞争结合至人HER2受体；且
(vi)所述经分离的抗体或其抗原结合片段也结合食蟹猴HER2受体的表位。
22.权利要求21所述的缀合物，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，所述表位包含人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基520至531。
23.权利要求21或22所述的缀合物，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人HER2受体的表位，所述表位包含人HER2受体胞外结构域的氨基酸残基E521、L525和R530。
24.权利要求21至23中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含CDRH1，其包含氨基酸序列FTFSSYSMN(SEQ ID NO: 25)；CDRH2，其包含氨基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO: 26)；CDRH3，其包含氨基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO:27)；CDRL1，其包含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO: 28)；CDRL2，其包含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO: 21)；和CDRL3，其包含氨基酸序列QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29)。
25.权利要求21至23中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包括了包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的可变轻链。
26.权利要求21至23中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包括了包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的轻链。
27.权利要求21至26中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scFv-Fc、scAb、dAb、单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体。
28.权利要求21至26中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是兔、小鼠、嵌合、人源化或全人单克隆抗体。
29.权利要求21至26中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG同种型。
30.权利要求21至26中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段为IgG1同种型。
31.权利要求21所述的缀合物，其进一步包含均连接至所述抗体或其抗原结合片段的一个或多个聚合物支架，其中经由所述一个或多个聚合物支架，一种或多种D各自独立地连接至所述抗体或其抗原结合片段。
32.权利要求31所述的缀合物，其中一个或多个聚合物支架各自独立地包含聚(1-羟甲基亚乙基-缩羟甲基甲醛)(PHF)，其具有范围约2 kDa至约40 kDa的分子量。
33.权利要求32所述的缀合物，其中所述一个或多个聚合物支架各自独立地为式(Ic)：
其中：
LD1为含羰基的部分；
中的每次出现独立地为含有生物可降解键的第一接头，使得当所述键断裂时，D以活性形式释放用于其意图的治疗效果；且中LD1与D之间的表示D与LD1的直接或间接连接；
的每次出现独立地为尚未连接到所述经分离的抗体或其抗原结合片段的第二接头，其中LP2为含官能团的部分，其还与所述经分离的抗体或其抗原结合片段的官能团形成共价键，且LD1与LP2之间的表示LP2与LD1的直接或间接连接，且所述第二接头的每次出现不同于所述第一接头的每次出现；
的每次出现独立地为连接各D-负载聚合物支架到所述经分离的抗体或其抗原结合片段的第三接头，其中连接到LP2的端表示在LP2的官能团与所述经分离的抗体或其抗原结合片段的官能团的间形成共价键时，直接或间接连接LP2至所述经分离的抗体或其抗原结合片段；以及所述第三接头的每次出现不同于所述第一接头的每次出现；
m为1至约300的整数，
m1为1至约140的整数，
m2为1至约40的整数，
m3为0至约18的整数，
m4为1至约10的整数；
m、m1、m2、m3和m4的总和范围为约15至约300；以及
连接到所述经分离的抗体或其抗原结合片段的LP2的总数为10或更少。
34.权利要求33的缀合物，其中m、m1、m2、m3和m4的总和范围为15至150，m1为1至70的整数，m2为1至20的整数，m3为0至10的整数且PHF具有范围约2 kDa至约20 kDa的分子量。
35.权利要求33的缀合物，其中m、m1、m2、m3和m4的总和范围为20至110，m1为2至50的整数，m2为2至15的整数，m3为0至8的整数；且PHF具有分子量范围约3 kDa至约15 kDa。
36.权利要求33的缀合物，其中m、m1、m2、m3和m4的总和范围为40至75，m1为2至35的整数，m2为2至10的整数，m3为0至5的整数；且PHF具有分子量范围约5 kDa至约10 kDa。
37.权利要求33的缀合物，其中LP2的官能团系选自-SRp、-S-S-LG、和卤素，其中LG为离去基团，Rp为H或硫保护基，且Xa与Xb之一为H而另一个为水溶性马来酰亚胺基阻断部分，或Xa和Xb与其所连接的碳原子一起形成碳-碳双键。
38.权利要求33的缀合物，其中LD1包含—X-(CH2)v-C(=O)—，具有直接连接到的羰基的X，其中X为CH2、O或NH和v为1至6的整数。
39.权利要求33的缀合物，其中的每次出现独立地为—C(=O)-X-(CH2)v-C(=O)-NH-(CH2)u-NHC(=O)-(CH2)w-(OCH2)x-NHC(=O)-(CH2)y—M，其中X为CH2、O或NH，v、u、w、x和y各自独立地为1至6的整数且M为，其中Xa和Xb之一为H而另一个为水溶性马来酰亚胺基阻断部分，或者Xa和Xb与其所连接的碳原子一起形成碳-碳双键。
40.权利要求39的缀合物，其中v、u、w、x和y各自为2。
41.权利要求21至40中任一项的缀合物，其中一种或多种D各自为具有分子量≤5 kDa的治疗剂。
42.权利要求40的缀合物，其中所述一个或多个聚合物支架各自独立地为式(Id)：
其中：
m3a为0至约17的整数，
m3b为1至约8的整数，和
端表示所述一个或多个聚合物支架与所述经分离的抗体或其抗原结合片段的直接连接。
43.权利要求21至40中任一项的缀合物，其中所述一种或多种D之一为诊断剂。
44.权利要求21至43中任一项的缀合物，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段具有分子量为40 kDa或更大。
45.权利要求21的缀合物，其中所述一种或多种D各自经由非聚合性连接部分独立地连接到所述抗体或其抗原结合片段。
46.权利要求32的缀合物，其中所述一个或多个聚合物支架各自独立地为式(If)：
其中：
m为1至约300的整数，
m1为1至约140的整数，
m2为1至约40的整数，
m3a为0至约17的整数，
m3b为1至约8的整数；
m3a与m3b的总和范围为1至约18；和
m、m1、m2、m3a与m3b的总和范围约15至约300；
端表示一个或多个聚合物支架连接到特异性结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段为经分离的抗-HER2抗体，其包括可变重链互补决定区1(CDRH1)，其包含氨基酸序列FTFSSYSMN(SEQ ID NO:25)；可变重链互补决定区2(CDRH2)，其包含氨基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:26)；可变重链互补决定区3(CDRH3)，其包含氨基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO: 27)；可变轻链互补决定区1(CDRL1)，其包含氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO: 28)；可变轻链互补决定区2(CDRL2)，其包含氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO: 21)；以及可变轻链互补决定区3(CDRL3)，其包含氨基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO: 29)；和
所述PHF与抗体的比为10或更少。
47.权利要求46的缀合物，其中式(If)的PHF具有分子量范围为约2 kDa至约20 kDa，m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围为约15至约150，m1为1至约70的整数，m2为1至约20的整数，m3a为0至约9的整数，m3b为1至约8的整数，m3a与m3b的总和范围为1至约10，且PHF与所述经分离的抗-HER2抗体的间比为2至约8的整数。
48.权利要求46的缀合物，其中式(If)的PHF具有分子量范围为约3 kDa至约15 kDa，m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围为约20至约110，m1为2至约50的整数，m2为2至约15的整数，m3a为0至约7的整数，m3b为1至约8的整数，m3a与m3b的总和范围为1至约8，且PHF与所述经分离的抗-HER2抗体或其抗原-结合片段的间比为2至约8的整数。
49.权利要求46的缀合物，其中式(If)的PHF具有分子量范围为约5 kDa至约10 kDa，m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围为约40至约75，m1为约2至约35的整数，m2为约2至约10的整数，m3a为0至约4的整数，m3b为1至约5的整数，m3a和m3b的总和范围为1至约5，且PHF与所述经分离的抗-HER2抗体的间比为2至约8的整数。
50.权利要求46的缀合物，其中式(If)的PHF具有分子量范围为约5 kDa至约10 kDa，m、m1、m2、m3a和m3b的总和范围为约40至约75，m1为约2至约35的整数，m2为约2至约10的整数，m3a为0至约4的整数，m3b为1至约5的整数，m3a和m3b的总和范围为1至约5，且PHF与所述经分离的抗-HER2抗体的间比为2至约6的整数。
51.权利要求46至50中任一项的缀合物，其中所述经分离的抗-HER2抗体包括了包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的可变轻链。
52.权利要求46至50中任一项的缀合物，其中所述经分离的抗-HER2抗体包括了包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的轻链。
53.一种制备根据权利要求21至52中任一项的缀合物的方法，其包括将特异性结合至人HER2受体的表位的经分离的抗体或其抗原结合片段与式(Ia)的聚合物支架反应，使得形成所述缀合物：
其中：
LD1为含羰基的部分；
中的每次出现独立地为包含生物可降解键的第一接头，使得当所述键断裂时，D以活性形式释放用于其意图的治疗效果；以及中LD1与D之间的表示D与LD1的直接或间接连接；
的每次出现独立地为尚未连接到所述经分离的抗体或其抗原结合片段的第二接头，其中LP2为含官能团的部分，其还与所述经分离的抗体或其抗原结合片段的官能团形成共价键，以及LD1与LP2之间的表示LP2与LD1的直接或间接连接，以及所述第二接头的每次出现不同于所述第一接头的每次出现；
m为1至约300的整数，
m1为1至约140的整数，
m2为1至约40的整数，
m3为1至约18的整数，和
m、m1、m2和m3的总和范围为约15至约300。
54.一种缓解有需要的受试者中癌症症状的方法，所述方法包括施用足以缓解所述癌症症状的量的根据权利要求21至52中任一项的缀合物至所述受试者。
55.权利要求54的方法，其中所述受试者为人。
56.权利要求54的方法，其中所述癌症选自：肛门癌、星状细胞瘤、白血病、淋巴瘤、头颈癌、肝癌、睾丸癌、宫颈癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉癌、口癌、间皮瘤、皮肤癌、骨髓瘤、口腔癌、直肠癌、咽喉癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、胰腺癌、肾癌和胃癌。
57.权利要求54的方法，其中所述癌症选自：乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌。
58.权利要求54的方法，其进一步包括施用第二剂至所述受试者。
59.权利要求58的方法，其中所述第二剂为特异性结合HER2的至少第二抗体或其抗原结合片段。
60.权利要求59的方法，其中所述第二抗体或其抗原结合片段为HER2抗体、HER2二聚化抑制剂抗体或HER2抗体与HER2二聚化抑制剂抗体的组合。
61.权利要求60的方法，其中所述HER2抗体、HER2二聚化抑制剂抗体或HER2抗体与HER2二聚化抑制剂抗体的组合包括曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或其组合。
62.权利要求54的方法，其中所述受试者经鉴定为具有低HER2表达。
63.权利要求54的方法，其中所述受试者经鉴定为对HER2表达具有得分为1+或2+，其通过在测试细胞群上进行免疫组织化学(IHC)分析进行检测，且其中HER2基因在所述测试细胞群中未被放大。
64.权利要求54的方法，其中所述受试者为化疗难治的。
65.权利要求54的方法，其中所述受试者为对贺癌宁治疗有抗性的。
66.权利要求54的方法，其中所述受试者为不对贺癌宁治疗有抗性的。
67.权利要求54的方法，其中所述受试者经鉴定为对HER2表达具有得分为2+或3+，其通过在测试细胞群上进行免疫组织化学(IHC)分析进行检测，且其中HER2基因在所述测试细胞群中经放大或突变。
68.权利要求21至52中任一项的缀合物在制备用于缓解受试者中癌症症状的药物的用途。
69.权利要求68的用途，其中所述癌症选自：肛门癌、星状细胞瘤、白血病、淋巴瘤、头颈癌、肝癌、睾丸癌、宫颈癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉癌、口癌、间皮瘤、皮肤癌、骨髓瘤、口腔癌、直肠癌、咽喉癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、胰腺癌、肾癌和胃癌。
70.权利要求68的用途，其中所述癌症选自：乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌。
71.权利要求68的用途，其进一步包括施用第二剂至所述受试者。
72.权利要求71的用途，其中所述第二剂为特异性结合HER2的至少第二抗体或其抗原结合片段。
73.权利要求72的用途，其中所述第二抗体或其抗原结合片段为HER2抗体、HER2二聚化抑制剂抗体或HER2抗体与HER2二聚化抑制剂抗体的组合。
74.权利要求72的用途，其中所述HER2抗体、HER2二聚化抑制剂抗体或HER2抗体与HER2二聚化抑制剂抗体的组合包括曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或其组合。
75.权利要求68的用途，其中所述受试者经鉴定为具有低HER2表达。
76.权利要求68的用途，其中所述受试者经鉴定为对HER2表达具有得分为1+或2+，其通过在测试细胞群上进行免疫组织化学(IHC)分析进行检测，且其中HER2基因在所述测试细胞群中未被放大。
77.权利要求68的用途，其中所述受试者为化疗难治的。
78.权利要求68的用途，其中所述受试者为对贺癌宁治疗有抗性的。
79.权利要求68的用途，其中所述受试者为不对贺癌宁治疗有抗性的。
80.权利要求68的用途，其中所述受试者经鉴定为对HER2表达具有得分为2+或3+，其通过在测试细胞群上进行免疫组织化学(IHC)分析进行检测，且其中HER2基因在所述测试细胞群中经放大或突变。
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