CN107058334B - 一种花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法 - Google Patents
一种花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107058334B CN107058334B CN201611019808.XA CN201611019808A CN107058334B CN 107058334 B CN107058334 B CN 107058334B CN 201611019808 A CN201611019808 A CN 201611019808A CN 107058334 B CN107058334 B CN 107058334B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ahj11
- gene
- far1
- peanut
- peanuts
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 title claims abstract description 52
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 title claims abstract description 35
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 title claims abstract description 35
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 title claims abstract description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 241001553178 Arachis glabrata Species 0.000 title claims abstract 15
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title abstract description 10
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 37
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 4
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000220438 Arachis Species 0.000 description 3
- 235000003911 Arachis Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 235000016682 Arachis ipaensis Nutrition 0.000 description 2
- 241000886191 Arachis ipaensis Species 0.000 description 2
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 2
- 208000028982 Nestor-Guillermo progeria syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 2
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 1
- XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N Aflatoxin G Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1C1C=COC1O2 XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 101100390724 Arabidopsis thaliana FHY3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150048253 PHYA gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 101150081158 crtB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明涉及生物基因工程领域，具体地说是花生转录因子AhJ11‑FAR1‑5基因的克隆及功能表达方法。本发明通过材料的准备与处理、RNA的提取和cDNA的合成、RACE克隆技术，合成出了AhJ11‑FAR1‑5。本发明还通过使用荧光定量RT‑PCR对AhJ11‑FAR1‑5基因干旱胁迫下的表达进行分析，并最终得出AhJ11‑FAR1‑5基因在花生对干旱胁迫的适应性中发挥重要作用。本发明将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株比对照组具有明显的抗旱特性，说明AhJ11‑FAR1‑5基因能显著提高花生抗旱性。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物基因工程领域，具体地说是一种花生转录因子 AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法。
【背景技术】
我国是世界花生生产大国，种植面积居世界第二位，而总产量占世界花生总产量的40％以上，居世界第一位。但是，花生产业的进一步发展受到旱灾的威胁。据统计，我国每年因干旱引起的花生减产达30％～50％。除产量下降外，干旱还有可能导致花生黄曲霉毒素污染、品质下降等一系列后果。此外，随着干旱气候出现频率的增加，如果在逆境胁迫下保持甚至增加花生的产量，成为科学研究的一个方向。
随着科技的发展，利用转基因技术提高植物胁迫耐受能力的研究取得了巨大进步。当胁迫信号产生后，花生会启动一系列相应信号，最后传导到相关基因，启动该基因表达以协助花生适应或抵御逆境。转录因子是调控这些基因表达的重要因素。转录因子是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，调控基因的表达。
FARl作为phyA信号通路的正调控因子，1999年通过图位克隆得到(Hudson eta1.1999)。在随后的研究中发现，该转录因子含有一个与玉米Mutator家族的转座酶MuRA(Hudsonet a1.2003)以及转座酶Jittery相似的序列(Lisch，2002； Xu et al.2004)。作为一个起源进化于转座子的基因新家族，FARl能够稳定地存在于拟南芥基因组中，且没有检测到显著的末端反向重复序列(TIR)和其他的转座子类似结构(Hudsonet a1.2003)。FARl和Mutator类似的转座子拥有相似的结构，包括N端C2H2锌指结构域，中部推测的转座子核心结构域以及C端SWIM 锌指结构域。其中N端C2H2结构域具有DNA结合活性，C端结构域具有转录激活活性。基于这种进化过程，FARl成为了一种新型的转录因子，能够特异的识别FBS(FHY3-binding motif，CACGCGC)顺式作用元件(Linet a1.2007)，因此能够与启动子上含有FBS序列的基因特异性结合，调控它们的表达，行使生物学功能。到目前为止，花生中FARl基因的研究报道较少，关于其功能的研究报道更少。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种花生转录因子 AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法，显著提高花生的抗干旱能力。
本发明提供了一种花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因的克隆方法，主要包括以下步骤：
(a)材料的准备与处理，其包括花生种子的萌发、生长以及干旱胁迫处理。具体步骤如下：材料选择花生品种J11，花生种子在Hoagland培养液培养萌发，萌发及幼苗生长条件为14h光照/10h黑暗，温度为26-28℃，生长12天用于后续的干旱胁迫处理；
干旱胁迫用PEG6000处理，花生根浸泡在15％PEG6000溶液中，在处理 0h、6h、12h、18h、24h、36h和48h时取花生的根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。
(b)花生幼苗的RNA的提取和cDNA的合成
其具体步骤如下：用TAKARA的MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 试剂盒方法分离提取花生幼苗RNA，将得到的RNA去除DNA污染后再进行 cDNA合成，用SMART-RACE试剂盒方法进行cDNA合成，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用，以上所用器皿都需经过去除RNA酶处理。器皿用0.1％的DEPC浸泡12小时，然后高压灭菌去除。溶液试剂用0.1％的DEPC 处理(37℃放置12小时后高压消毒)，不耐高温的试剂直接用DEPC-H2O配制。
(c)通过RACE进行克隆
具体步骤如下:
RACE所用试剂盒为Clontech的SMART-RACE试剂盒，RACE扩增基因全长所用引物为3-GPS-AhJ11-FAR1-5:5’-CGTGCTGAGGGTGCAGAAATGA-3’、 5-1-AhJ11-FAR1-5:5’-TGTTGCCCGCCGAGAAAGATG-3’、5-2-AhJ11-FAR1-5: 5’-CGTAGCAACGCCCTTGATCTGTT-3’、5-3-AhJ11-FAR1-5:5’ -ATCCGACATCATCTCACCATCCAC-3’和NGPS-AhJ11-FAR1-5：5’-GTATAATCAGTCACTGGGAAG-3。
RACE克隆产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用UNIQ-10PCR Purification Kit试剂盒(上海生工)回收纯化。纯化产物与pGEM-T Easy载体(北京全是金生化科技有限公司)连接后转化至感受态大肠杆菌(北京全是金生化科技有限公司) 中，LB培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液PCR扩增预检测是否有插入片段并测序。
将测序的结果进行拼接后设计全长PCR扩增产物，用UNIQ-10PCR PurificationKit试剂盒纯化，纯化产物与pGEM-T Easy载体连接后转化至感受态大肠杆菌中，LB培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液PCR 扩增预检测是否有插入片段并测序，扩增引物为AhJ11-FAR1-5-S1：5’ -CGCAGTGGTTTCCAATGGATTT-3’和AhJ11-FAR1-5-S2：5’-GCCACACCTGGGTTGGTGGACCCC-3’。
进一步的，所述全长PCR扩增所用聚合酶为TAKARA PCR MIX，在20μL 体系中加入以下成分：10μLTAKARA PCR MIX、1μL总cDNA、0.5μL AhAP2ER-S1、0.5μL AhAP2ER-S2和8μL无菌双蒸水；
全长PCR扩增反应条件：a)94℃5min；(b)94℃1min；57℃1min； 72℃4min；共30cycles；(c)72℃10min。
进一步的，本发明所述的AhJ11-FAR1-5基因开放阅读框为2727bp，共编码 908个氨基酸。
进一步的，本发明所述的AhJ11-FAR1-5基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与Arachis ipaensis的FAR1-5蛋白 (XP_016184350.1)的相似性为94％、Arachis duranens相关蛋白 (XP_015950391.1))的相似性为68％，见图1。
进一步的，本发明所述的AhJ11-FAR1-5基因的核苷酸序列是序列表中SEQUENCE1。
进一步的，本发明所述的AhJ11-FAR1-5基因的氨基酸序列是序列表中SEQUENCE2。
进一步的，本发明还提供了所述花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因的功能表达方法，其使用荧光定量RT-PCR对AhJ11-FAR1-5基因干旱下的表达进行分析，其方法如下：
荧光定量RT-PCR所用cDNA模板稀释到8ng/μL，用的聚合酶是SYBR Green，采用的仪器是7500FAST荧光定量PCR仪，每反应体系加2μL稀释的 cDNA；
PCR反应程序如下：(a)95℃，10s；(b)95℃，5s；(c)60℃，30s；(d) 72℃，10s；40个循环；绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10s增加0.5℃， Actin为RT-PCR的内参基因。
所述的AhJ11-FAR1-5荧光定量用的引物序列为：AhJ11-FAR1-5-R：5’-AGGACTACTTCAAGATGTG-3’和AhJ11-FAR1-5-F:5’- GCTGTTACTTCATTATTACGA-3’。
所述的内参基因Actin所用引物序列为：Actin-F:5’- GAGGAGAAGCAGAAGCAAGTTG-3’和Actin-R:5’- AGACAGCATATCGGCACTCATC-3’。
本发明通过荧光定量PCR验证了AhJ11-FAR1-5基因在干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因干旱胁迫下转录水平均有明显升高。从图2可以看出，该基因在干旱胁迫处理后相对表达量一直处于上升的趋势。以上结果表明 AhJ11-FAR1-5基因在花生对干旱胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株具有明显的抗旱特性，说明AhJ11-FAR1-5 基因能显著提高花生抗旱性。
【附图说明】
图1 中的图1a和图1b是花生AhJ11-FAR1-5蛋白与其他花生中FAR1-5类蛋白氨基酸序列比较；
图2是花生AhJ11-FAR1-5基因在干旱胁迫下的表达模式分析。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明，但并不是对本发明的进一步限定。
1.1实施材料：
材料准备与处理：材料选择花生品种J11，花生种子在Hoagland培养液培养萌发，萌发及幼苗生长条件为14h光照/10h黑暗，温度为26℃，生长12 天用于后续的干旱胁迫处理。干旱胁迫用PEG6000处理。花生根浸泡在15％PEG6000溶液中，在处理0h，6h，12h，18h，24h，36h和48h时取花生的根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。
1.2 RNA的提取和cDNA的合成
所用器皿都需经过去除RNA酶处理。器皿用0.1％的DEPC浸泡12小时，然后高压灭菌去除。溶液试剂用0.1％的DEPC处理(37℃放置12小时后高压消毒)，不耐高温的试剂直接用DEPC-H2O配制。总RNA提取按TAKARA的 MiniBEST Universal RNA Extraction Kit的操作要求单链cDNA合成，具体参照 Clontech的SMART-RACE试剂盒方法。反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用。
1.3 AhJ11-FAR1-5基因克隆
通过RACE进行克隆，RACE所用试剂盒为Clontech的SMART-RACE试剂盒方法参照试剂盒说明。RACE扩增基因全长所用引物为3-GPS- AhJ11-FAR1-5:5’-CGTGCTGAGGGTGCAGAAATGA-3’、5-1-AhJ11-FAR1-5: 5’-TGTTGCCCGCCGAGAAAGATG-3’、5-2-AhJ11-FAR1-5:5’ -CGTAGCAACGCCCTTGATCTGTT-3’、5-3-AhJ11-FAR1-5:5’ -ATCCGACATCATCTCACCATCCAC-3’和NGPS-AhJ11-FAR1-5：5’- GTATAATCAGTCACTGGGAAG-3。
RACE克隆产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用UNIQ-10PCR Purification Kit试剂盒(上海生工)回收纯化。纯化产物与pGEM-T Easy载体(北京全是金生化科技有限公司)连接后转化至感受态大肠杆菌(北京全是金生化科技有限公司) 中，LB培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液PCR扩增预检测是否有插入片段并测序(Sangon，Shanghai)。
将测序的结果进行拼接后设计全长PCR扩增产物，PCR扩增所用的聚合酶为TAKARAPCR MIX，在20μL体系中加入以下成分10μLTAKARAPCR MIX， 1μL总cDNA，0.5μL AhAP2ER-S1，0.5μL AhAP2ER-S2，8μL无菌双蒸水。反应条件：94℃5min→(94℃1min→57℃1min→72℃4min)30cycles→72℃ 10min。UNIQ-10PCR Purification Kit试剂盒(上海生工)回收纯化。纯化产物与 pGEM-T Easy载体(北京全是金生化科技有限公司)连接后转化至感受态大肠杆菌(北京全是金生化科技有限公司)中，LB培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液PCR扩增预检测是否有插入片段并测序(Sangon, Shanghai)。
扩增引物：AhJ11-FAR1-5-S1：5’-CGCAGTGGTTTCCAATGGATTT-3’和 AhJ11-FAR1-5-S2：5’-GCCACACCTGGGTTGGTGGACCCC-3’。
1.4荧光定量PCR
用荧光定量PCR对AhAP2ER基因进行功能表达：荧光定量PCR所用 cDNA模板稀释到8ng/μL，用的聚合酶是SYBR Green，用的仪器是7500FAST 荧光定量PCR仪(ABI公司)，每反应体系加2μL稀释的cDNA；PCR反应程序如下：95℃10s；95℃5s，60℃30s，72℃10s，40个循环；绘制溶解曲线，温度每10s升高0.5℃。以2-ΔΔCT计算相对表达量。Actin为RT-PCR的内参基因。
AhJ11-FAR1-5基因荧光定量RT-PCR用的引物序列为： AhJ11-FAR1-5-R：5’-AGGACTACTTCAAGATGTG-3’和AhJ11-FAR1-5-F:5’ -GCTGTTACTTCATTATTACGA -3’。
内参基因Actin所用引物序列为：Actin-F: 5′-GAGGAGAAGCAGAAGCAAGTTG-3′；和Actin-R: 5′-AGACAGCATATCGGCACTCATC-3′。
2试验结果
2.1AhJ11-FAR1-5核苷酸全长及其编码的氨基酸序列
通过PCR扩增及测序，得到了目的基因，该基因开放阅读框为2727bp，共编码908个氨基酸。图1显示了将该基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过 Blast分析后发现该基因氨基酸序列与Arachis ipaensis的FAR1-5蛋白(XP_016184350.1)的相似性为94％、Arachisduranens相关蛋白(XP_015950391.1) 的相似性为68％，故将该基因命名为AhJ11-FAR1-5(Arachis hypogaea J11 FAR1-5-like transcription factor)。
图2是花生AhJ11-FAR1-5基因在干旱胁迫下的表达模式分析。本发明通过荧光定量PCR验证了AhJ11-FAR1-5在干旱胁迫下的表达模式，结果表明：该基因干旱胁迫下转录水平均有明显升高。从图2可以看出，干旱胁迫处理后相对表达量一直处于上升的趋势。以上结果表明AhJ11-FAR1-5基因在花生对干旱胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株比对照具有明显的抗旱特性，说明AhJ11-FAR1-5基因能显著提高花生抗旱性。
以上所述，仅是本发明的最佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，利用上述揭示的方法内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，均属于权利要求书保护的范围。
Claims (4)
1.一种花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因在提高花生抗干旱胁迫中的用途，其特征在于：所述AhJ11-FAR1-5基因开放阅读框为2727bp，共编码908个氨基酸，AhJ11-FAR1-5基因的核苷酸序列是序列表中SEQUENCE1,AhJ11-FAR1-5基因的氨基酸序列是序列表中SEQUENCE2，将所述AhJ11-FAR1-5基因通过转基因技术导入花生中，用于提高花生的抗旱性。
2.根据权利要求1所述花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因在提高花生抗干旱胁迫中的用途，其特征在于：使用荧光定量RT-PCR对转录因子AhJ11-FAR1-5基因干旱下的表达进行分析，其方法如下：
将荧光定量RT-PCR所用cDNA模板稀释到8ng/μL，采用SYBR Green聚合酶；
PCR反应程序如下：(a)95℃，10s；(b)95℃，5s；(c)60℃，30s；(d)72℃，10s；40个循环；绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10s增加0.5℃，RT-PCR的内参基因为Actin。
3.根据权利要求2所述花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因在提高花生抗干旱胁迫中的用途，其特征在于：荧光定量RT-PCR用的引物序列为：AhJ11-FAR1-5-R：5’-AGGACTACTTCAAGATGTG-3’和AhJ11-FAR1-5-F:5’-GCTGTTACTTCATTATTACGA-3’。
4.根据权利要求2所述花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因在提高花生抗干旱胁迫中的用途，其特征在于：所述Actin所用引物序列为：Actin-F:5’-GAGGAGAAGCAGAAGCAAGTTG-3’和Actin-R:5’-AGACAGCATATCGGCACTCATC-3’。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611019808.XA CN107058334B (zh) | 2016-11-18 | 2016-11-18 | 一种花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611019808.XA CN107058334B (zh) | 2016-11-18 | 2016-11-18 | 一种花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107058334A CN107058334A (zh) | 2017-08-18 |
| CN107058334B true CN107058334B (zh) | 2021-04-13 |
Family
ID=59619444
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611019808.XA Active CN107058334B (zh) | 2016-11-18 | 2016-11-18 | 一种花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107058334B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113584052B (zh) * | 2021-08-24 | 2023-04-14 | 山东省花生研究所 | 一种花生转录因子AhbHLH10基因及其克隆与功能表达方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001077161A2 (en) * | 2000-04-07 | 2001-10-18 | Basf Plant Science Gmbh | Gtp binding stress-related proteins and methods of use in plants |
| CN101235380A (zh) * | 2007-02-02 | 2008-08-06 | 山东省花生研究所 | 花生△12－脂肪酸脱氢酶突变基因及其编码的蛋白质以及克隆方法 |
| CN101386863A (zh) * | 2008-08-15 | 2009-03-18 | 山东省花生研究所 | 花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因及其编码的蛋白质以及基因克隆方法 |
| CN105462989A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-04-06 | 山东省花生研究所 | 一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆及功能表达方法 |
-
2016
- 2016-11-18 CN CN201611019808.XA patent/CN107058334B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001077161A2 (en) * | 2000-04-07 | 2001-10-18 | Basf Plant Science Gmbh | Gtp binding stress-related proteins and methods of use in plants |
| EP1294912A2 (en) * | 2000-04-07 | 2003-03-26 | BASF Plant Science GmbH | Gtp binding stress-related proteins and methods of use in plants |
| CN101235380A (zh) * | 2007-02-02 | 2008-08-06 | 山东省花生研究所 | 花生△12－脂肪酸脱氢酶突变基因及其编码的蛋白质以及克隆方法 |
| CN101386863A (zh) * | 2008-08-15 | 2009-03-18 | 山东省花生研究所 | 花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因及其编码的蛋白质以及基因克隆方法 |
| CN105462989A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-04-06 | 山东省花生研究所 | 一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆及功能表达方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《PREDICTED:Arachis ipaensis protein FAR1-RELATED SEQUENCE 5-like (LOC107626086),transcript variant X2,mRNA》;NO;《NCBI Reference Sequence:XM_016328865.2》;20160422;参见对比文件1序列及其注释 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107058334A (zh) | 2017-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104946665B (zh) | GmMYB62在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用 | |
| CN105037521B (zh) | 一种与植物抗逆性相关蛋白TaWrky48及其编码基因与应用 | |
| CN117230107B (zh) | 一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统及其应用 | |
| CN106957355B (zh) | 一种与植物耐低光和耐低温相关的ppr蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN111118005A (zh) | 一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用 | |
| CN109825510B (zh) | 一种岷江百合LrWRKY2基因及应用 | |
| CN112608928B (zh) | 一种龙眼单果重性状调控基因DlCNR8及其蛋白与应用 | |
| CN105585623B (zh) | 抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用 | |
| CN107058334B (zh) | 一种花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法 | |
| CN112626069A (zh) | 大豆gma-miR4359b基因、其表达载体、制备方法及其应用 | |
| CN107574169A (zh) | 一种苹果MdNRT2,4‑1基因及其制备方法和应用 | |
| CN115786366B (zh) | 一种茄子抗寒调控基因、蛋白及其应用 | |
| CN113584052B (zh) | 一种花生转录因子AhbHLH10基因及其克隆与功能表达方法 | |
| CN100381571C (zh) | 新的植物衰老特异性基因及其启动子 | |
| CN1239702C (zh) | 水稻根系磷饥饿诱导特异表达启动子及其培养植物的方法 | |
| CN105039279A (zh) | 一个拟南芥蛋白激酶及其编码基因与应用 | |
| CN112048507B (zh) | 一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用 | |
| CN108148849B (zh) | 一种苹果MdPHR1基因及其制备方法和应用 | |
| CN114540381A (zh) | 一种苹果组蛋白脱乙酰化酶MdHDA6基因及其应用 | |
| TOMBULOĞLU et al. | Genome-wide analysis of response to low sulfur (LSU) genes in grass species and expression profiling of model grass species Brachypodium distachyon under S deficiency | |
| WO2011010639A1 (ja) | 乳管形成マーカー遺伝子、乳管形成促進剤のスクリーニング方法、及び植物体の乳管形成促進方法 | |
| CN113684217A (zh) | PpWRKY40a基因在调控桃流胶病抗性中的应用 | |
| CN113774066A (zh) | 高效促进丹参酮积累的基因SmWRKY61及其用途 | |
| CN113061602A (zh) | 一种高通量启动子变异创制方法 | |
| CN118460601B (zh) | 一种miRNA在调控植物耐盐胁迫中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |