CN101386863A

CN101386863A - 花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因及其编码的蛋白质以及基因克隆方法

Info

Publication number: CN101386863A
Application number: CNA2008101474372A
Authority: CN
Inventors: 禹山林; 陈明娜; 杨庆利; 潘雨娟; 任增凯; 曹玉良
Original assignee: Shandong Peanut Research Institute
Current assignee: Shandong Peanut Research Institute
Priority date: 2008-08-15
Filing date: 2008-08-15
Publication date: 2009-03-18

Abstract

本发明公开了花生籽粒中脂肪酸脱饱和反应过程中花生硬脂酰－载体蛋白脱饱和酶如SEQ ID NO：1所示的基因及其编码蛋白质，该基因采用以下方法克隆：用琼脂糖凝胶电泳检测花生种子中的总RNA、以总RNA为模板反转录合成5'－RACE－Ready cDNA、PCR扩增、PCR产物与pMD18－T simple vector连接，转化，筛选阳性克隆。本发明基因表达可提高花生中不饱和脂肪酸的含量，并且还可能增强花生的耐寒性，从而实现对花生品质及抗逆性的改良。

Description

花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因及其编码的蛋白质以及基因克隆方法

技术领域

本发明属于脂肪酸代谢工程领域，具体涉及花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因及其编码的蛋白质以及基因克隆方法。

背景技术

植物硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶(SAD)，催化硬脂酰-载体蛋白脱饱和反应，在脂肪酸链的C9-C10间引入一个双键形成油酰-载体蛋白。油酰基运出质体可进一步脱饱和形成多不饱和脂酰基，这些脂酰基可形成甘油脂等，成为生物膜的组成成分，或贮存起来成为贮脂。因为多不饱和脂肪酸的形成主要以油酰基的脱饱和为基础，所以SAD催化的脱饱和作用是植物典型不饱和脂肪酸生物合成的第一步，在很大程度上决定饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例(罗通，邓骛远，张富丽.植物硬脂酰一酰基载体蛋白脱饱和酶[J].生命的化学，2006)。研究表明，这一比例和生物膜系统的流动性、选择透性以及植物的多种生理功能有密切的关系，并决定着贮脂的成分和含量(Los D A，Murata N.Structure andexpression of fatty acid desaturases.Biochimiea et Biophysica Acta，1998，1394：3-15)。

SAD的结构分析：对红花(Carthamus tinctorius)中分离纯化到的SAD进行分析，推断SAD是一个同源二聚体；Lindqvist等用X-射线晶体衍射分析描述了蓖麻SAD的晶体结构。亚基的二级结构除了在其C末端有一个“发夹环”外，主要由11个α螺旋组成一个较大的螺旋结构区。该蛋白主要由4个螺旋束结构组成，中间埋藏着一个由两个铁原子组成的二铁中心，两铁原子之间通过一个氧原子相联，形成非常对称的Fe-O-Fe二铁氧簇，并主要由二铁中心及四螺旋束的氨基酸侧链形成酶活性中心，金属铁离子在打断脂肪酸链上的稳定的C-H键时起重要作用(Lindqvist Y，Huang W，Schneider G，et al.Crystal structure of delta9stearoyl-acyl carrier protein desaturase from castor seed and its relationship to otherdi-iron proteins[J].EMBO J，1996，15(16)：4081-4092)。

SAD的功能分析：目前已经从蓖麻、大红花、油菜等多种植物中分离获得SAD的cDNA片段(张羽航，鲍时翔，郑学勤等.脂肪酸饱和酶的研究进展[J].生物技术通报，1998，4：1-8)。Kodama(Kodama H，et al.Fatty acid desaturationduring chilling acclimation is one of the factors involved in conferring lowtemperature tolerance to young tobacco leaves[J].Plant Physiology，1995，107(4)：1177-1185.)将酵母的SAD基因编码的硬脂酰基辅酶A去饱和酶导入烟草，Los等(Hightower R，et al.Expression of antifreeze protein in transgenic plants[J].PlantMol Biol.，1991，17：1013-1021.)将菠菜的SAD基因编码的硬脂酰基辅A去饱和酶导入烟草都可提高烟草的抗冻力。Los D等(Los D et al.Cloning of atemperature-dependent expression of desaturase desA gene in SynechocystiPCC6803[J].FEBS，1993，318(1)：57-60.)将SAD基因有义链或反义链插入到植物转化载体pBI121中，对基因工程的模式植物烟草进行了转化，对转基因烟草的抗寒性分析表明正向表达SAD基因的转基因烟草抗寒性明显增强，反向表达SAD基因的转基因烟草抗寒性明显减弱。由此也证明了脂肪酸去饱和酶高表达时可增强植物抗寒性。另外，SAD催化的硬脂酰载体蛋白脱饱和作用在很大程度上决定了饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例(罗通，邓骛远，张富丽.植物硬脂酰一酰基载体蛋白脱饱和酶[J].生命的化学，2006)。

但是，现有技术中没有关于花生SAD基因的报道，因此在花生SAD研究领域仍属空白。而花生的SAD基因的获得，能够为下一步花生品质改良的研究和抗寒性的研究奠定一个良好的基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种首次从花生中获得的花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶(SAD)全长基因及其编码蛋白的氨基酸序列。

花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶是脂肪酸脱饱和过程的关键酶，催化硬脂酰-ACP脱饱和形成油酰-ACP的反应，在脂肪酸链的C9-C10间引入一个双键，油酰基运出质体可进一步脱饱和形成多不饱和脂酰基。

本发明的第二个目的是提供花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶编码的氨基酸序列及编码蛋白性质的生物信息学预测。

同时，本发明还提供该花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因的克隆方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明所提供的花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶，从花生(Arachis hypogaea)中克隆，命名为AhSAD基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶编码的蛋白质，命名为AhSAD蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶(AhSAD)基因的克隆方法，包括如下步骤：

(1)选用E11花生种子作为实验材料，采用Pbiozol植物组织RNA提取试剂盒提取花生种子中的总RNA，RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)以获得的总RNA为模板，采用SMARTTM RACE Amplification Kit(Clontech)反转录合成5’-RACE-Ready cDNA；

(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计AhSAD全长基因引物RSAD-5A5′-CGAAGACGCAACACGAAAAATGGC-3′和RSAD-3B5′-AGGAAAAAAAGGGACACCACACCG-3′，以5’-RACE-Ready cDNA为模板，用LA Taq(Takara)进行PCR扩增，反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，58℃复性60s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃10min；

(4)PCR产物回收后与pMD18-T simple vector连接，连接产物转化E.coliTop10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得花生AhSAD全长基因序列。

本发明的AhSAD基因全长1499bp，开放阅读框为1218bp，位于20-1237aa。DNAssist软件分析表明AhSAD共编码406个氨基酸。根据PROSITE数据库分析花生AhSAD基因编码的406个氨基酸，发现此段序列含有一个脂肪酸去饱和酶家族2的活性标记，位于326-345aa(USERSEQ1，SAvaqRIgvytakDYadILE)。另外还包含6种其它功能位点，分别为蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinase C phosphorylation site，PS00005)，N-端十四烷酰化位点(N-myristoylation site，PS00008)，酪蛋白激酶II磷酸化位点(Caseinkinase II phosphorylation site，PS00006)，酪氨酸激酶磷酸化位点(Tyrosine kinasephosphorylation site，PS00007)，N-端糖基化位点(N-glycosylation site，PS00001)，酰胺化位点(Amidation site，PS00009)。

用Protparam预测编码蛋白的物理化学性质，推测分子式为C₁₇₉₇H₂₈₂₀N₄₉₈O₅₄₂S₂₀，分子量为46251.6，等电点为6.24，理论推导半衰期为30h，不稳定参数是45.07，属于不稳定蛋白。该蛋白中含量相对较多的氨基酸是Leu(9.9％)，Glu(8.1％)，Ser(7.9％)，Arg(7.4％)，Ala(7.1％)；该蛋白中不含Pyl和Sec。总的带正电荷的残基为(Arg+Lys)：53；总的带负电荷的残基为(Asp+Glu)：56。该蛋白亲水性平均数为-0.508，预测该蛋白为水溶性蛋白。采用SignalP3.0 Server进行信号肽预测，表明该蛋白不含信号肽序列，为非分泌性蛋白。以TMHMM2 program为基础的跨膜结构预测表明该蛋白不含跨膜结构。亚细胞定位预测表明该蛋白可能位于细胞质体中。

采用PredictProtein预测花生AhSAD蛋白的二级结构，表明该蛋白含有50.49％的α-螺旋，5.91％β-折叠以及43.60％的无规则卷曲。利用3D-JIGSAW预测花生AhSAD蛋白三级结构，结果表明该蛋白呈紧密的球状结构。

本发明公开了花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶(AhSAD)基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质。该基因来自花生(Arachis hypogaea)，其超量表达可提高花生中不饱和脂肪酸的含量，并且还可能增强花生的耐寒性，从而实现对花生品质及抗逆性的改良。

花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶是调控花生脂肪酸脱饱和过程的关键酶，该酶活性的增加也能够使花生中不饱和脂肪酸含量增加，增强花生的耐寒性。

附图说明

图1为位于326-345aa位点的脂肪酸去饱和酶家族2的活性标记；

图2为花生AhSAD蛋白三级结构。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步详细的描述。

花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶(AhSAD)基因的分子克隆

选用E11花生种子作为实验材料，提取花生种子中的总RNA。以获得的总RNA为模板，反转录合成5’RACE-Ready cDNA。根据NCBI数据库中的EST信息设计花生AhSAD全长基因引物RSAD-5A5′-CGAAGACGCAACACGAAAAATGGC-3′和RSAD-3B5′-AGGAAAAAAAGGGACACCACACCG-3′。以5’-RACE-Ready cDNA为模板，用LA Taq(Takara)进行PCR扩增，反应过程为：94℃预变性3min，94℃变性45s，58℃复性60s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃10min。PCR产物回收后与pMD18-T simple vector连接，连接产物转化E.coli Top 10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，最终获得AhSAD全长基因及其序列。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1499bp，

(B)类型：核苷酸，

(C)链性：单链，

(D)拓扑结构：线性；

(ii)分子类型：核苷酸；

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1。

(2)SEQ ID NO.2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：406a.a，

(B)类型：氨基酸，

(C)链性：单链，

(D)拓扑结构：线性；

(ii)分子类型：蛋白质；

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2。

序列表

<110>山东省花生研究所

<120>花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因及其编码的蛋白质以及基因克隆方法

<160>2

<210>1

<211>1499

<212>DNA

<213>花生

<400>1

<210>2

<211>406

<212>PRT

<213>花生

<400>2

Claims

1.花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因，其特征在于，基因全长1499bp，开放阅读框为1218bp，位于20-1237aa。

3.根据权利要求1所述的花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因，其特征在于，该基因编码的406个氨基酸，发现此段序列含有一个脂肪酸去饱和酶家族2的活性标记，位于326-345aa。

4.根据权利要求1或3所述的花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因，其特征在于，还包含6种其它功能位点，分别为蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinaseC phosphorylation site，PS00005)，N-端十四烷酰化位点(N-myristoylation site，PS00008)，酪蛋白激酶II磷酸化位点(Casein kinase II phosphorylation site，PS00006)，酪氨酸激酶磷酸化位点(Tyrosine kinase phosphorylation site，PS00007)，N-端糖基化位点(N-glycosylation site，PS00001)，酰胺化位点(Amidation site，PS00009)。

5.花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

6.根据权利要求5所述的花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸的含量是Leu9.9％，Glu 8.1％，Ser7.9％，Arg 7.4％，Ala7.1％。

7.根据权利要求5或6所述的花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因编码的蛋白质，其特征在于，该蛋白为非分泌性蛋白。

8.一种花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因的克隆方法，包括如下步骤：

(2)以获得的总RNA为模板，采用SMARTTM RACE Amplification Kit反转录合成5’-RACE-Ready cDNA；

(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶全长基因引物RSAD-5A5′-CGAAGACGCAACACGAAAAATGGC-3′和RSAD-3B5′-AGGAAAAAAAGGGACACCACACCG-3′，以5’-RACE-ReadycDNA为模板，用LA Taq(Takara)进行PCR扩增，反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，58℃复性60s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃ 10min；

(4)PCR产物回收后与pMD18-T simple vector连接，连接产物转化E.coliTop 10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得花生SAD全长基因序列。