CN106459954A - 用于具有免疫抑制功能的细胞的t细胞重定向的抗原结合分子 - Google Patents

Abstract

本文发现了包含(i)结合具有免疫应答抑制功能的细胞表面上表达的分子的结构域，和(ii)T细胞受体复合体结合结构域的抗原结合分子通过将T细胞与具有免疫应答抑制功能的细胞交联，和破坏具有免疫应答抑制功能的细胞，呈现比常规抗原结合分子更优越的抗肿瘤效应。

Description

用于具有免疫抑制功能的细胞的T细胞重定向的抗原结合 分子

技术领域

本发明涉及能够通过破坏具有免疫应答抑制功能的细胞治疗癌症的抗原结合分子；包含所述抗原结合分子的用于治疗各种癌的药物组合物；或使用药物组合物治疗癌症的方法。

背景技术

抗体作为药物引入注意，因为它们在血浆中高度稳定并且具有较少副作用。尤其是，很多IgG-类型抗体药物可在市场上获得，并且目前开发很多抗体药物(非专利文献1和2)。

作为使用抗体药物的癌症治疗剂，迄今已经批准针对CD20抗原的美罗华(Rituxan)，针对EGFR抗原的西妥昔单抗(Cetuximab)，针对HER2抗原的赫赛汀(Herceptin)等(非专利文献3)。这些抗体分子结合表达在癌细胞上的抗原，并且通过ADCC等呈现对癌细胞的细胞毒活性。

与这样的呈现直接针对癌细胞的细胞毒活性的抗体药物相反，近来确认易普利单抗(Ipilimumab)(其是针对CTLA4的IgG1-type抗体)有效针对转移性黑素瘤，并且在2011年得到FDA批准。在实体癌微环境中，已知识别肿瘤的效应T细胞被癌症微环境中的多种子抑制(非专利文献4)。它们当中，已知CTLA4(其是免疫检查点分子)具有抑制T细胞活化的功能，并且强烈表达在活化的效应T细胞和调节性T细胞上。在癌症微环境中，认为肿瘤识别效应T细胞被CTLA4抑制。易普利单抗是针对CTLA4的中和抗体，并且认为其通过抑制对效应T细胞-活化的抑制和活化肿瘤识别效应T细胞呈现抗肿瘤效应(非专利文献5)。类似地，近来报道nivolumab(其是针对免疫检查点分子PD1的中和抗体)通过激活被PD1抑制的肿瘤识别效应T细胞也对转移性黑素瘤高度有效(非专利文献6)。此外，已知不仅调节性T细胞而且耗竭的T细胞存在于癌症微环境中，并且已知耗竭的T细胞不仅缺乏细胞毒活性(抗肿瘤活性)，而且促进肿瘤中的免疫抑制(非专利文献7)。

因此，认为针对免疫检查点分子的抗体药物通过抑制免疫检查点分子的T-细胞抑制效应发挥抗肿瘤效应。然而，近来报道，对于抗-CTLA4抗体如易普利单抗呈现抗肿瘤效应，不仅对CTLA4的中和效应是重要的，而且针对表达CTLA4的细胞的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)也是重要的(非专利文献8和9)。已知在肿瘤微环境中调节性T细胞和耗竭的T细胞强烈表达CTLA4，并且认为具有ADCC活性的抗-CTLA4抗体能够杀伤调节性T细胞和耗竭的T细胞。在非专利文献8和9中，尽管在具有ADCC活性的抗-CTLA4抗体能够消除肿瘤中的调节性T细胞并在小鼠中发挥强的抗肿瘤效应，其ADCC活性通过氨基酸置换被移除的抗-CTLA4抗体不能消除肿瘤中的调节性T细胞并且不能发挥抗肿瘤效应。

因此，已经发现，ADCC活性在抗-CTLA4抗体的抗肿瘤效应中发挥重要作用，并且通过ADCC活性杀伤调节性T细胞是重要的作用机制。

另一方面，抗体的ADCC活性通过将其Fc区结合于Fcγ受体呈现。例如，已经报道，置换(修饰)IgG1抗体的Fc区的氨基酸以增加对Fcγ受体的结合使得能够增强ADCC活性(非专利文献10)。实际上，由于Fc区修饰具有增强的ADCC活性的抗-CD19抗体，发挥比天然抗-CD19抗体更强的抗肿瘤效应(非专利文献10)。

因此，如果抗-CTLA4抗体的ADCC活性可以通过修饰其Fc-区得到增强，抗-CTLA4抗体可能更强有力地消除肿瘤中的调节性T细胞，并且可以呈现更强的抗肿瘤效应。

现有技术文献

[非专利文献]

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发明概述

[发明要解决的问题]

根据上述情形实现本发明。本发明的一个目的是提供抗原结合分子，所述抗原结合分子通过破坏具有免疫应答抑制功能的细胞发挥较好抗肿瘤效应，和提供药物组合物，所述药物组合物包含所述抗原结合分子作为活性成分，或提供使用所述药物组合物治疗癌症的方法。

[解决问题的手段]

本发明人发现，包含结合具有免疫应答抑制功能的细胞表面上表达的分子的结构域和结合T-细胞受体(TCR)复合体的结构域的抗原结合分子，破坏具有免疫应答抑制功能的细胞，并且比结合调节性T细胞和耗竭的T细胞的表面上表达的分子和还具有ADCC活性的常规抗原结合分子发挥更优越的抗肿瘤活性。此外，本发明人发现可以通过具有所述抗原结合分子作为活性成分能够治疗各种癌的药物组合物。

更具体地，本发明提供以下各项：

[1]抑制具有免疫应答抑制功能的细胞的免疫应答抑制活性的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：

(i)结合具有免疫应答抑制功能的细胞的表面上表达的分子的结构域；和

(ii)T细胞受体复合体结合结构域；

[2][1]所述的抗原结合分子，其中所述具有免疫应答抑制功能的细胞是调节性T细胞或耗竭的T细胞；

[3][1]所述的抗原结合分子，其中所述具有免疫应答抑制功能的细胞的表面上表达的分子是是选自CTLA4、PD1、TIM3、LAG3、CD244(2B4)、CD160、GARP、OX40、CD137(4-1BB)、CD25、VISTA、BTLA、TNFR25、CD57、KLRG1、CCR2、CCR5、CCR6、CD39、CD73、CD4、CD18、CD49b、CD1d、CD5、CD21、TIM1、CD19、CD20、CD23、CD24、CD38、CD93、IgM、B220(CD45R)、CD317、PD-L1、CD11b、Ly6G、ICAM-1、FAP、PDGFR、Podoplanin和TIGIT中的任意分子；

[4][3]所述的抗原结合分子，其中所述具有免疫应答抑制功能的细胞的表面上表达的分子是选自CTLA4、TIM3、LAG3、CD137(4-1BB)、CD25、CCR5、CCR6、CD38、TIGIT和OX40中的任意分子；

[5][1]至[4]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述T细胞受体复合体结合结构域是T细胞受体结合结构域；

[6][1]至[4]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述T细胞受体复合体结合结构域是CD3结合结构域；

[7][1]至[6]中任一项所述的抗原结合分子，所述抗原结合分子还包含FcRn结合结构域；

[8][7]所述的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域是抗体的Fc区；

[9][8]所述的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域是具有降低的Fcγ受体结合活性的抗体的Fc区；

[10][1]至[9]中任一项所述的抗原结合分子，其是多特异性抗体；

[11]药物组合物，其包含[1]至[10]中任一项所述的抗原结合分子作为活性成分；

[12]用于抑制免疫应答抑制活性的药物组合物，其包含[1]至[10]中任一项所述的抗原结合分子作为活性成分；

[13][12]所述的药物组合物，其中对免疫应答抑制活性的抑制是由T细胞引起的抑制；

[14][13]所述的药物组合物，其中所述由T细胞引起的抑制是由T细胞的细胞毒活性造成的抑制；

[15][12]至[14]中任一项所述的药物组合物，其中所述免疫应答抑制活性是由调节性T细胞或耗竭的T细胞导致的活性；

[16][12]至[14]中任一项所述的药物组合物，其中所述免疫应答抑制活性是表达选自CTLA4、PDl、TIM3、LAG3、CD244(2B4)、CD160、GARP、OX40、CD137(4-1BB)、CD25、VISTA、BTLA、TNFR25、CD57、KLRG1、CCR2、CCR5、CCR6、CD39、CD73、CD4、CD18、CD49b、CD1d、CD5、CD21、TIM1、CD19、CD20、CD23、CD24、CD38、CD93、IgM、B220(CD45R)、CD317、PD-L1、CD11b、Ly6G、ICAM-1、FAP、PDGFR、Podoplanin和TIGIT中的任意分子的细胞的活性；

[17][11]至[16]中任一项所述的药物组合物，其是癌症治疗剂；

[18]17所述的药物组合物权利要求，其是用于选自卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、乳腺癌、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、成胶质细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、慢性淋巴细胞白血病、甲状腺乳头状癌、结直肠癌、霍奇金淋巴瘤和子宫内膜异位中的任意癌症的治疗剂；

[19]诱导细胞毒性、抑制细胞增殖、激活针对癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织的免疫，或治疗或预防癌症的方法，所述方法包括施用[1]至[10]中任一项所述的抗原结合分子或[11]至[18]中任一项所述的药物组合物的步骤；

[20][1]至[10]中任一项所述的抗原结合分子或[11]至[18]中任一项所述的药物组合物，其用于诱导细胞毒性，抑制细胞增殖，激活针对癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织的免疫，或治疗或预防癌症；

[21][1]至[10]中任一项所述的抗原结合分子在制造[11]至[18]中任一项所述的药物组合物中的用途；和

[22]生产[11]至[18]中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括使用[1]至[10]中任一项所述的抗原结合分子的步骤。

此外，本发明涉及治疗或预防癌症，或抑制对免疫应答的抑制的方法，所述方法包括向需要治疗的患者施用本发明的抗原结合分子或本发明的药物组合物。本发明还涉及用于本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗原结合分子。本发明还涉及本发明的抗原结合分子在生产抑制免疫应答抑制的药物组合物中的用途。此外，本发明涉及本发明的抗原结合分子或本发明的药物组合物，其用于本发明的方法。

附图简述

图1提供显示通过靶向癌细胞上表达的癌症抗原和T细胞上表达的CD3的双特异性抗体针对癌细胞的细胞毒活性的示意图。

图2-1提供显示通过经由抗-CD3抗体在不同T细胞上的CD3之间交联引起T细胞之间交联的示意图。

图2-2提供显示经由抗-CD3抗体将相同T细胞上CD3之间交联的示意图。

图3提供示意图表明：抗-CTLA4/CD3双特异性抗体引起相同调节性T细胞上CTLA4和CD3之间交联，并且因此，不引起效应T细胞和调节性T细胞之间的细胞间交联。该示意图表明，调节性T细胞作为靶细胞并且CTLA4作为抗原，但靶细胞和抗原不限于此。

图4提供显示通过抗-CTLA4/CD3双特异性抗体在效应T细胞上的CD3和调节性T细胞上的CTLA4之间交联引起的细胞间交联的示意图。该示意图表明，调节性T细胞作为靶细胞并且CTLA4作为抗原，但靶细胞和抗原不限于此。

图5提供显示抗-小鼠CTLA4抗体hUH02hUL01-mFa55对表达小鼠的CTLA4的细胞的ADCC活性的图。

图6提供显示抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)对表达小鼠CTLA4的细胞的细胞毒活性的图。

图7-1提供显示通过抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体在小鼠CTLA4结合的珠子和小鼠CD3结合的珠子之间交联的示意图。

图7-2提供显示通过抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体在小鼠CTLA4结合的珠子和小鼠CD3结合的珠子之间交联的实验结果的图(N＝3)。该图显示对于每个测量结果的平均值和标准差。

图7-3提供显示通过抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体在小鼠CTLA4/小鼠CD3结合的珠子和小鼠CD3结合的珠子之间交联的实验结果的图。该图显示对于每个测量结果的平均值和标准差。

图7-4提供显示通过抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体在小鼠CTLA4/小鼠CD3结合的珠子和小鼠CD3结合的珠子之间交联的示意图。

图8提供显示通过肿瘤内(i.t.)施用抗-小鼠CTLA4抗体(hUH02hUL01-mFa55，ADCC-增强的抗体)和抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760，T细胞重定向抗体)获得的对小鼠结直肠癌细胞系CT26.WT的体内抗肿瘤效应的图(对于每组n＝2；图表显示每个个体的肿瘤体积)。

图9提供显示通过肿瘤内(i.t.)施用和静脉内(i.v.)施用抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760，T细胞重定向抗体)获得的对小鼠结直肠癌细胞系CT26.WT的体内抗肿瘤效应的图(对于每组n＝5；图显示各组的平均肿瘤体积+标准差)。

图10-1提供显示在源自健康人的PBMC与对照抗体(对照)和抗-人CTLA4/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应七天后，基于CD25和CD45RA的表达分析CD4-阳性细胞的结果的图。

图10-2提供显示在源自健康人的PBMC与对照抗体(对照)和抗-人CTLA4/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应七天后，CD4-阳性T细胞中调节性T细胞(Treg)的比例的图(基于CD25和CD45RA的表达计算)。

图10-3提供显示在源自健康人的PBMC与对照抗体(对照)和抗-人CTLA4/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应七天后，基于CD25和CD45RA的表达计算的效应T细胞(Teff)与调节性T细胞(Treg)的比例(Teff/Treg)的图。

图11-1提供显示在源自健康人的PBMC与对照抗体(对照)和抗-人CTLA4/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应七天后，基于FoxP3和CD45RA的表达分析CD4-阳性细胞的结果的图。

图11-2提供显示在源自健康人的PBMC与对照抗体(对照)和抗-人CTLA4/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应七天后，基于FoxP3和CD45RA的表达计算的CD4-阳性T细胞中调节性T细胞(Treg)的比例的图。

图11-3提供显示在源自健康人的PBMC与对照抗体(对照)和抗-人CTLA4/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应七天后，基于FoxP3和CD45RA的表达计算的效应T细胞(Teff)与调节性T细胞(Treg)的比例(Teff/Treg)的图。

图12提供显示构成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区的氨基酸残基之间的关系，和Kabat’s EU编号(在本文中，其也称为EU INDEX)的示意图。

图13提供显示在源自健康人的PBMC与抗-人LAG3/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应四或六天后，基于CD25和CD45RA的表达分析CD4-阳性细胞的结果的图。

图14提供显示在源自健康人的PBMC与抗-人LAG3/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应四或六天后，基于CD25和CD45RA的表达计算的CD4-阳性T细胞中调节性T细胞(Treg)的比例的图。

图15提供显示在源自健康人的PBMC与抗-人LAG3/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应四或六天后，基于CD25和CD45RA的表达计算的CD4-阳性T细胞中效应T细胞(Teff)与调节性T细胞(Treg)的比例(Teff/Treg)的图。

图16提供显示在源自健康人的PBMC与抗-人OX40/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应七天后，基于CD25和CD45RA的表达分析CD4-阳性细胞的结果的图。

图17提供显示在源自健康人的PBMC与抗-人OX40/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应七天后，基于CD25和CD45RA的表达计算的CD4-阳性T细胞中调节性T细胞(Treg)的比例的图。

图18提供显示在源自健康人的PBMC与抗-人OX40/抗-人CD3双特异性抗体(TRAB)反应七天后，基于CD25和CD45RA的表达计算的CD4-阳性T细胞中效应T细胞(Teff)与调节性T细胞(Treg)的比例(Teff/Treg)的图。

实施本发明的方式

提供以下定义以促进理解本说明书中描述的本发明。

抗原结合分子

在本发明中，“抗原结合分子”没有特别限定，只要其是包含本发明的“结合结构域”的分子即可，并且它们可以进一步包含具有约5个氨基酸以上的长度的肽或蛋白质。肽和蛋白质不限于来源于活体生物的那些，并且例如，它们也可以是从人工设计的序列生产的多肽。另外，其也可以是天然存在的多肽、或合成的多肽、重组多肽等中的任一种。

本发明的抗原结合分子的优选例可以是含有抗体的Fc区中包含的FcRn结合结构域的抗原结合分子。作为延长活体内施用的蛋白质的血中半衰期的方法，向目的蛋白质加入抗体的FcRn结合结构域并利用FcRn介导的再循环功能的方法是公知的。

在本发明中，“FcRn结合结构域”没有特比限定，只要其具有对FcRn的结合活性，并且其可以是直接或间接结合FcRn的结构域。直接结合FcRn的结构域的实例包括其抗原是FcRn的抗体可变区，Fab和抗体Fc区，其片段，白蛋白，白蛋白结构域3，人血清白蛋白(HSA)，转铁蛋白等。此外，间接结合FcRn的结构域的实例包括对前述直接结合FcRn的结构域具有结合活性的结构域。本发明的优选实施方案包括抗体Fc区、或者含有Fc区中的FcRn结合区域的片段。此处，来自天然存在的IgG的Fc区可用作“Fc区”。天然存在的IgG意味着，包含与天然发现的IgG相同的氨基酸序列、并属于由免疫球蛋白γ基因实质上编码的抗体种类的多肽。例如，天然存在的人IgG意味着天然存在的人IgG1、天然存在的人IgG2、天然存在的人IgG3、天然存在的人IgG4等。天然存在的IgG中也包含由其自然产生的突变体等。对于人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗体的恒定区，基因多态性引起的多数同种异型序列在Sequences of Proteins of Immunological Interest，NIH Publication No.91-3242中记载，本发明中可应用其中任一种。特别地，对于人IgG1的序列，根据EU编号第356～358位的氨基酸序列可以是DEL或EEM。

存在的抗体的Fc区是例如IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM型的Fc区。例如，源自天然存在的人IgG抗体的Fc区可以用作本发明的抗体Fc区。源自天然存在的IgG的恒定区，或更具体的，源自天然存在的人IgG1的恒定区(SEQ ID NO：1)，源自天然存在的人IgG2的恒定区(SEQ ID NO：2)，源自天然存在的人IgG3的恒定区(SEQ ID NO：3)，和源自天然存在的人IgG4的恒定区(SEQ ID NO：4)，可以用作本发明的Fc区。天然存在的IgG恒定区中也包含天然由其产生的突变体等。

这种抗体的Fc区可以如下适当获得，例如，通过将抗体如单克隆抗体用蛋白酶如胃蛋白酶部分消化，随后将得到的片段吸附在蛋白A柱或蛋白G柱，并且随后使用适当的洗脱缓冲液等洗脱。所述蛋白酶没有特别限定，只要其能够通过适当设定酶反应条件如pH消化抗体如单克隆抗体即可，并且实例包括胃蛋白酶、无花果蛋白酶等。

抗体的同种型由恒定区的结构决定。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型的恒定区分别称为Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。构成人Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4的Fc区的多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO：5、6、7和8中示例。构成这些氨基酸序列中的每个的氨基酸残基与kabat的EU编号(本说明书中也称为EU INDEX)的关系在图12中示出。

Fc区指除去F(ab′)₂的区域，其包含二条轻链、以及包含使得链间二硫键在2个重链间形成的CH1结构域和CH2结构域间的恒定区的一部分的二条重链。构成本文中公开的抗原结合分子的Fc区可以通过将IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4单克隆抗体等用蛋白酶如胃蛋白酶部分消化，并且随后将吸附在蛋自A柱上的级分再洗脱而适当获得。所述蛋白酶没有特别限定，只要其能够通过适当设定酶反应条件如pH限制性地消化全长抗体产生F(ab′)₂即可，例如，这样的蛋白酶包括胃蛋白酶、无花果蛋白酶。

具有降低的Fcγ受体结合活性的结构域优选为本发明的FcRn结合结构域。此处，Fcγ受体(本说明书中也称为Fcγ受体、FcγR或者FcgR)指能够与IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc区结合的受体，并且包括属于基本上由Fcγ受体基因编码的蛋白质家族中的所有成员。在人中，该家族包括但不限于，包含同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；包含同种型FcγRIIa(包含同种异型H131(H型)和R131(R型))、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；和包含同种型FcγRIIIa(包含同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包含同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)、以及所有未发现的人FcγR或者FcγR同种型或者同种异型。FcγR包括但不限于源自人、小鼠、大鼠、兔和猴子的那些，也可由任意生物衍生。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRiII(CD16)和FcγRIII-2(CDl6-2)、以及任意未发现的小鼠FcγR或者FcγR同种型或者同种异型。这样的Fcγ受体的适当例子包括人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)和/或FcγRIIIb(CD16)。

FcγR中存在携带基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的活性型受体和携带基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的抑制型受体。FcγR分类为FcγRI、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa和FcγRIIIb的活性型FcγR、与FcγRIIb的抑制型FcγR。

FcγRI的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别在NM_000566.3以及NP_000557.1中显示；FcγRIIa的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别在BC020823.1以及AAH20823.1中显示；FcγRIIb的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别在BC146678.1以及AAI46679.1中显示；FcγRIIIa的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别在BC033678.1以及AAH33678.1中显示；以及FcγRIIIb的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别在BC128562.1以及AAI28563.1中显示(RefSeq登录号)。另外，对于FcγRIIa存在2种基因多态性，其中FcγRIIa的第131号氨基酸置换为组氨酸(H型)或精氨酸(R型)(J.Exp.Med，172，19-25，1990)。另外，对于FcγRIIb存在2种基因多态性，FcγRIIb的第232号氨基酸置换为异亮氨酸(I型)或苏氨酸(T型)(Arthritis.Rheum.46：1242-1254(2002))。另外，对于FcγRIIIa存在2种基因多态性，FcγRIIIa的第158号氨基酸置换为缬氨酸(V型)或苯丙氨酸(F型)(J.Clin.Invest.100(5)：1059-1070(1997))。另外，对于FcγRIIIb存在NA1型、NA2型2种基因多态性(J.Clin.Invest.85：1287-1295(1990))。

对Fcγ受体的结合活性是否降低可通过如FACS、ELISA形式、扩增发光接近均匀试验(ALPHA)筛选、基于表面等离子体共振(SPR)现象的BIACORE法的公知的法确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010)。

ALPHA筛选通过使用供体和受体2种珠的ALPHA技术基于下述原理实施。仅在与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子生物学相互作用、并且2种珠近接时，检测到发光信号。供体珠内激光激发的光敏剂将周边的氧转化为激发状态的单线态氧。单线态氧在供体珠周边扩散，并且当到达接近的受体珠时引起珠内的化学发光反应，最终发出光。与供体珠结合的分子不和与受体珠结合的分子相互作用时，由于供体珠产生的单线态氧不到达受体珠，不引起化学发光反应。

例如，在抗原结合分子含有抗体的Fc区作为FcRn结合结构域的情况下，制备具有野生型Fc区的抗原结合分子、与具有通过加入用于改变与Fcγ受体的结合的氨基酸突变而成的突变Fc区的抗原结合分子，使生物素标记的抗原结合分子与供体珠结合，并且使用谷胱甘肽S转移酶(GST)标签化的Fcγ受体与受体珠结合。在具有突变Fc区的抗原结合分子存在下，具有野生型Fc区的抗原结合分子与Fcγ受体相互作用生成520-620nm的信号。在具有突变Fc区的抗原结合分子不进行标签化的情况下，其与具有野生型Fc区的抗原结合分子竞争与Fcγ受体间的相互作用。通过对作为竞争的结果观察到的荧光的减少进行定量，能够确定相对结合亲和性。应用Sulfo-NHS-生物素等对抗原结合分子生物素化是公知的。作为用GST对Fcγ受体标签化的方法，可以适当采用使编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸符合读框地融合而产生的融合基因在携带能够表达它们的载体的细胞等中表达，并应用谷胱甘肽柱纯化的方法。得到的信号通过拟合于应用如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)的软件利用非线形回归分析的一站竞争(one-site competition)模型而适当分析。

对于相互作用观察的物质中的一种(配体)固定在传感器芯片上的金薄膜上，从传感器芯片的背侧照射光使得在金薄膜与玻璃的界面发生全反射，则在反射光的一部分中形成反射强度降低的部分(SPR信号)。对于相互作用观察的物质中的另一种(分析物)在传感器芯片表面流过且当配体与分析物结合时，则固定化的配体分子的质量增加，并且传感器芯片表面的溶剂的折射率改变。通过该折射率的改变，SPR信号的位置移动(相反，如果该结合解离则信号的位置返回)。Biacore系统表示上述的移动量，或更具体为质量的时间变化，以纵轴上传感器芯片表面的质量变化为作为测定数据绘制(传感器图)。从传感器图的曲线确定动力学参数：如结合速度常数(ka)和解离速度常数(kd)，并且从这些常数的比确定亲和力(KD)。在BIACORE法中，也适当应用抑制测定方法。抑制测定方法的例子在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010中记载。

本说明书中，“与Fcγ受体的结合活性降低”是指，例如，基于上述的分析方法，与作为对照的具有Fc区的抗原结合分子的结合活性比较，被测抗原结合分子的结合活性为50％以下，优选地45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、15％以下，或特别优选地10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下。

作为对照的抗原结合分子可以适当使用例如具有包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体的Fc区的结构域的抗原结合分子。该Fc区的结构在SEQ ID NO：1(RefSeq登录号AAC82527.1的N末端添加A)、SEQ ID NO：2(RefSeq登录号AAB59393.1的N末端添加A)、SEQID NO：3(RefSeq登录号CAA27268.1的N末端添加A)、和SEQ ID NO：4(RefSeq登录号AAB59394.1的N末端添加A)中记载。另外，当使用具有特定同种型的抗体的Fc区的突变体的抗原结合分子作为被测物质时，通过应用具有该特定同种型的抗体的Fc区的抗原结合分子作为对照，验证该突变体具有的突变引起的对于与Fcγ受体的结合活性的效果。如上述，验证了与Fcγ受体的结合活性降低的具有Fc区的突变体的抗原结合分子得以适当制备。

作为这种突变体的例子包括具有氨基酸231A-238S的缺失(WO2009/011941)、或C226S、C229S、P238S、(C220S)(J.Rheumatol(2007)34，11)、C226S、C229S(Hum.Antibod.Hybridomas(1990)1(1)，47-54)、C226S、C229S、E233P、L234V、或L235A(Blood(2007)109，1185-1192)的突变体，其中氨基酸按照EU编号指定。

也即，适当的例子包括具有Fc区的抗原结合分子，其中在构成特定同种型的抗体的Fc区的氨基酸之中，按照EU编号指定的在下述位置的任一氨基酸被置换：220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位。Fc区起源的抗体的同种型没有特别限定，可适当利用源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体的Fc区，适当利用源自天然存在的人IgG1抗体的Fc区。

例如，也可以适当使用具有下列Fc区的抗原结合分子：在构成IgG1抗体的Fc区的氨基酸之中，按照EU编号进行下述指定的任一的置换(其中数字表示按照EU编号指定的氨基酸残基的位置，位于数字前的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字母氨基酸密码表示置换后的氨基酸残基)的Fc区：

(a)L234F、L235E、P331S

(b)C226S、C229S、P238S

(c)C226S、C229S

(d)C226S、C229S、E233P、L234V、L235A，

或从231位至238位的氨基酸序列缺失的Fc区。

另外，也可以适当使用具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成IgG2抗体的Fc区的氨基酸之中，进行按照EU编号进行下述指定的任一的置换(数字是按照EU编号指定的氨基酸残基的位置，分别地，位于数字前的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字母氨基酸密码表示置换后的氨基酸残基)的Fc区：

(e)H268Q、V309L、A330S、P331S

(f)V234A

(g)G237A

(h)V234A、G237A

(i)A235E、G237A

(j)V234A、A235E、G237A。

另外，也可以适当使用具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成IgG3抗体的Fc区的氨基酸之中，进行按照EU编号进行下述指定的任一的置换(数字是按照EU编号指定的氨基酸残基的位置，分别地，位于数字前的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字母氨基酸密码表示置换后的氨基酸残基)的Fc区：

(k)F241A

(1)D265A

(m)V264A。

另外，也可以适当使用具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成IgG4抗体的Fc区的氨基酸之中，进行按照EU编号进行下述指定的任一的置换(数字是按照EU编号指定的氨基酸残基的位置，分别地，位于数字前的单字母氨基酸密码表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字母氨基酸密码表示置换后的氨基酸残基)的Fc区：

(n)L235A、G237A、E318A

(o)L235E

(p)F234A、L235A。

其它的优选例包括具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成天然存在的人IgG1抗体的Fc区的氨基酸之中，按照EU编号指定的下述任一氨基酸置换为对应的IgG2或者IgG4中该EU编号对应的氨基酸：233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位和331位。

其它的优选例包括具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成天然存在的人IgG1抗体的Fc区的氨基酸之中，按照EU编号指定的下述任一或一个以上的氨基酸置换为其它氨基酸：234位、235位和297位。置换后存在的氨基酸的种类没有特别限定，具有234位、235位和297位的任一或一个以上的氨基酸置换为丙氨酸的Fc区的抗原结合分子是特别优选的。

其它的优选例包括具有下列Fc区的抗原结合分子，在构成IgGl抗体的Fc区的氨基酸之中，按照EU编号指定的265位的氨基酸置换为其它氨基酸。置换后存在的氨基酸的种类没有特别限定，具有265位的氨基酸置换为丙氨酸的Fc区的抗原结合分子是特别优选的。

本发明的抗原结合分子中包括的“与在细胞表面上表达的分子结合的具有免疫应答抑制功能的结构域”和“T细胞受体复合体结合结构域”(下文中，这些结合结构域共同称为抗原结合结构域)意为与它们各自的抗原的全部或一部分特异结合的区域。结合结构域的实例是包含抗体的抗原结合区的区域。当抗原的分子量大时，抗体的抗原结合区可以仅结合抗原的特定部分。该特定部分称为表位。抗体可变结构域中的一个或多个可以提供抗原结合结构域。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。这样的抗原结合结构域的合适的实例包括“单链Fv(scFv)”，“单链抗体”，“Fv”，“单链Fv2(scFv2)”，“Fab”，“F(ab’)₂”，等。

本文中，“具有免疫应答抑制功能的细胞”没有特别限定，只要其具有抑制免疫应答的功能即可，实例包括调节性T细胞(Treg)，耗竭的T细胞，多发性骨髓瘤基质细胞(MDSC)，肿瘤-相关巨噬细胞(TAM)，诱导的调节性T细胞(Tr1)，肿瘤-相关树突状细胞(TADC)，肿瘤-相关中性粒细胞(TAN)，癌症-相关成纤维细胞(CAF)，调节性B细胞(Breg)等。尤其是，调节性T细胞和耗竭的T细胞优选为研究的细胞。具有免疫应答抑制功能的细胞表面表达的分子的具体实例包括CTLA4，PD1，TIM3，LAG-3，CD244(2B4)，CD160，GARP，OX40，CD137(4-1BB)，CD25，VISTA，VISATA，BTLA，TNFR25，CD57，KLRG1，CCR2，CCR5，CCR6，CD39，CD73，CD4，CD18，CD49b，CD1d，CD5，CD21，TIM1，CD 19，CD20，CD23，CD24，CD38，CD93，IgM，B220(CD45R)，CD317，PD-L1，CD11b，Ly6G，ICAM-1，FAP，PDGFR，Podoplanin，TIGIT等。这些分子中，用于本发明的结合结构域的靶的有利分子的实例包括CTLA4，TIM3，LAG3，CD137(4-1BB)，CD25，CCR5，CCR6，CD38，和TIGIT，其是在已经报道具有高免疫应答抑制功能的细胞级分(CD4⁺，CD25^高，和CD45RA-)中特异表达的细胞表面分子。用于本发明的结合结构域的靶点的有利分子的实例尤其包括CTLA4，LAG3，和OX40.

在本发明，“调节性T细胞”负责抑制性调节免疫应答的T细胞类型。该细胞在用于抑制过度免疫应答的负调节机制和免疫稳态中发挥重要作用，并且分为两类调节性T细胞(Tregs)，其表达CD4或CD8。CD4Tregs分为组成型表达CD25和FoxP3的内源性Treg细胞(天然Tregs或nTregs)，和具有低自识别能力的适应性或诱导性Tregs(iTregs)，并且其与天然CD4-阳性T细胞相区分。存在的iTregs包括Foxp3⁺Treg和Fop3^-Treg，并且Fop3^-Treg称为I型Treg(Tr1)。CD4⁺CD25⁺LAG3⁺Treg确定为具有与Tr1非常相似的性质的Treg(Proc Natl AcadSci USA.2009)。此外，已知CD127表达在Treg细胞中增加，并且含有CD127^loCD25^hi-int的级分(显示低CD127表达和高至中等CD25表达的群体)包括所有Foxp3-阳性Treg群体。CD8Tregs还可以分为内源性Tregs和诱导性Tregs。前者归类为CD8⁺CD122⁺Treg，并且后者归类为Qa-1a-限制性CD8⁺Treg。已知Tregs表达调节性分子，并且具有增加的CTLA4，PD1，TIM3，LAG3表达水平等，并且这样的分子作为本发明的抗原结合分子的结合结构域结合的分子是有利的。

此外，在本发明中，“耗竭的T细胞”意为细胞因子产生功能和效应功能由于抗原的连续刺激显著降低，并且增殖能力和长期存活能力变低的T细胞。这些耗竭的T细胞产生调节性受体如PD1和调节性细胞因子；因此，它们不仅变得功能失调，而且对免疫应答产生抑制性。在耗竭的T细胞中，PD1的表达主要增加(Nature 439，682-687(2006))。除了PD1，如LAG-3，CD244(2B4)，CD160，TIM-3和CTLA-4的分子的表达也增加Nature Immunology第12卷，第492-499页，(2011))。这些分子作为本发明的抗原结合分子的结合结构域结合的分子是有利的。

另外，“T细胞受体复合物”可以是T细胞受体自身，也可以是构成T细胞受体连同T细胞受体复合物的衔接头分子。作为衔接头分子的适当分子是CD3。

作为T细胞受体，T细胞受体结合结构域结合的表位可以是可变区或恒定区，但优选是恒定区中存在的表位。作为恒定区的序列的实例包括RefSeq登录号CAA26636.1的T细胞受体α链(SEQ ID NO：9)、RefSeq登录号C25777的T细胞受体β链(SEQ ID NO：10)、RefSeq登录号A26659的T细胞受体γ1链(SEQ ID NO：11)、RefSeq登录号AAB63312.1的T细胞受体γ2链(SEQ ID NO：12)、和RefSeq登录号AAA61033.1的T细胞受体δ链(SEQ ID NO：13)的序列。

本发明中，在“CD3结合结构域”用作T细胞受体复合物结合结构域的情况下，CD3结合结构域可以通过一个或多个抗体可变结构域提供。优选地，CD3结合结构域包含CD3抗体的轻链可变区(VL)和CD3抗体的重链可变区(VH)。这种CD3结合结构域的适当例子包括“scFv(单链Fv)”、“单链抗体(single chain antibody)”、“Fv”、“scFv2(单链Fv 2)”、“Fab”或者“F(ab′)₂”等。

本发明所述的CD3结合结构域可以是与任一表位结合的那些，只要是所述表位存在于构成人CD3的γ链、δ链或ε链序列中即可。本发明中，优选地，与人CD3复合物的ε链的细胞外区域中存在的表位结合的包含CD3抗体的轻链可变区(VL)和CD3抗体的重链可变区(VH)的CD3结合结构域被适当使用。对于这种CD3结合结构域，包含OKT3抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4914-4917)、各种公知的CD3抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的CD3结合结构域被适当使用。通过用前述方法构成人CD3的γ链、δ链或ε链免疫期望的动物获得的具有期望性质的CD3抗体所衍生的CD3结合结构域可适当使用。作为CD3结合结构域的来源的CD3抗体适当使用如下述适当人源化的抗体、人抗体。对于构成CD3的γ链、δ链或ε链的结构，其多核苷酸序列在SEQ ID NO：14(NM_000073.2)、16(NM_000732.4)以及18(NM_000733.3)中记载，其多肽序列在SEQ ID NO：15(NP_000064.1)、17(NP_000723.1)以及19(NP_000724.1)中记载(括号内表示RefSeq登录号)。

本发明的“抗原结合分子”的优选实施方案包括包含本发明的抗体的可变区的抗体。

抗体

本说明书，抗体是指天然存在的免疫球蛋白、或者通过部分或完全合成制备的免疫球蛋白。抗体可以从天然资源如天然存在的血浆和血清或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清分离。备选地，抗体可以通过利用如基因重组的技术部分或完全合成。抗体的适当例子可以包括免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚类的抗体。已知人免疫球蛋白包括以下9种类型(同种型)的那些：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM。这些同种型之中，本发明的抗体包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

制备具有期望的结合活性的抗体的方法是本领域技术人员公知的，并且所述抗体可以以多克隆或者单克隆抗体获得。作为本发明的抗体，可以适当制备来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体包含通过杂交瘤产生的抗体和通过遗传工程技术由携带抗体基因的表达载体转化的宿主细胞产生的抗体。

为了获得抗体而免疫的哺乳动物不限于特定的动物，优选地，通过考虑与用于制备杂交瘤的细胞融合中使用的亲本细胞的相容性而选择。一般地，适当使用兔、猴以及啮齿类动物例如小鼠、大鼠和仓鼠。

按照公知的方法用敏化抗原免疫上述动物。例如，作为一般的方法，通过向哺乳动物的腹腔内或者皮下注射而施用敏化抗原，实施免疫。具体地，用磷酸缓冲盐水(PBS)、生理盐水等以适当稀释敏化抗原。如果需要，将常规的佐剂例如弗式完全佐剂与抗原混合，并将混合物乳化。然后将该敏化抗原以4至21日间隔向哺乳动物施用数次。在免疫时可以将适当的载体与敏化抗原一起使用。特别地，当小分子量部分肽用作敏化抗原时，有时期望用与载体蛋白质如白蛋白、匙孔血蓝蛋白缀合该敏化抗原肽，用于免疫。

备选地，产生期望抗体的杂交瘤可以使用如下所述DNA免疫制备。DNA免疫是这样的免疫方法，将可使得表达编码该抗原蛋白质的基因而构建的载体DNA的施用于免疫动物中，造成在该免疫动物体内表达敏化抗原，而赋予免疫刺激。与向免疫动物施用蛋白质抗原的一般的免疫方法相比，DNA免疫如下述预期是优异的：

-在维持膜蛋白质的结构的同时能够给予免疫刺激

-无需纯化抗原用于免疫。

为了使用DNA免疫得到本发明的单克隆抗体，首先，向要免疫动物施用表达抗原蛋白质的DNA。编码抗原蛋白质的DNA可以通过公知的方法如PCR合成。得到的DNA插入适当的表达载体中，并且随后将其向免疫动物施用。优选使用的表达载体包括例如市售的表达载体如pcDNA3.1。载体向生物体的施用方法可以利用一般应用的方法。例如，通过将表达载体包被的的金粒子用基因枪向要免疫动物个体内细胞中导入，进行DNA免疫。

如上述免疫哺乳动物后，确认血清中与抗原结合的抗体效价升高。然后从哺乳动物收集免疫细胞，并随后进行细胞融合。尤其是，脾细胞特别用作免疫细胞。

哺乳动物的骨髓瘤细胞用作与前述免疫细胞融合的细胞。骨髓瘤细胞优选具有用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物赋予细胞在特定的培养条件下存活(或死亡)的性质。次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺失(以下简称为HGPRT缺失)、或胸苷激酶缺失(以下简称为TK缺失)已知为选择标记物。具有HGPRT或TK缺失的细胞具有次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞在HAT选择培养基中不能进行DNA合成并因此被杀灭。但是，当细胞与正常细胞融合时，它们则能够利用正常细胞的补救途径继续DNA合成，并且因而即使在HAT选择培养基中也能增殖。

HGPRT缺失和TK缺失的细胞可以在包含6-硫代鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下简称为8AG)、或5′-溴脱氧尿苷的培养基中选择。因为在DNA中掺入这些嘧啶类似物，正常细胞死亡。同时，因为没有掺入这些嘧啶类似物，缺失这些酶的细胞能够在选择培养基中生存。此外，称为G418抗性的选择标记物通过新霉素抗性基因赋予对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。适于细胞融合的各种类型骨髓瘤细胞是公知的。

例如，可以优选使用包括以下细胞的骨髓瘤细胞：

P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4)，1548-1550)；

P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)；

NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7)，511-519)；

MPC-11(Cell(1976)8(3)，405-415)；

SP2/0(Nature(1978)276(5685)，269-270)；

FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2)，1-21)；

S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1)，313-323)；

R210(Nature(1979)277(5692)，131-133)等。

基本上使用已知方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Methods Enzymol.(1981)73，3-46)，进行免疫细胞与骨髓瘤细胞之间的细胞融合。

更具体地，例如，在细胞融合促进剂存在下在常规的培养液中，可以实施前述细胞融合。融合促进剂包括例如聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)。如果需要，为了进一步提高融合效率，还添加辅助物质如二甲亚砜等。

免疫细胞与骨髓瘤细胞的比例可以任意设定。优选地，相对于骨髓瘤细胞，免疫细胞为1至10倍。用于细胞融合的培养基，包括例如，适于骨髓瘤细胞系的增殖的培养基，如RPMI1640培养液和MEM培养液以及用于这种类型的细胞培的其他常规培养基。进一步地，可以优选添加血清补充物，如胎牛血清(FCS)至培养基中。

对于细胞融合，将预定量的前述免疫细胞与骨髓瘤细胞在前述培养液中充分混合。然后将预先加温至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)以通常30至60％(w/v)的浓度添加于其中。将混合溶液轻轻混合，以产生期望的融合细胞(杂交瘤)。随后，向细胞逐渐添加上述适当的培养液，并且然后反复离心除去上清。这样，能够除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。

如此得到的杂交瘤可以通过常规的选择培养基例如HAT培养液(包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基)培养而选择。应用上述HAT培养基继续培养足够时期以杀死期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)。通常，所述足够时期是数日至数周。随后，通过常规的有限稀释法，进行产生期望抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。

如此得到的杂交瘤可以利用根据用于细胞融合的骨髓瘤具有的选择标记物的选择培养基选择。例如，HGPRT或TK缺失的细胞可以通过使用HAT培养基(包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基)培养而选择。具体而言，在HAT敏感性骨髓瘤细胞用于细胞融合的情况下，在HAT培养基中，与正常细胞成功进行细胞融合的细胞可以选择性增殖。应用上述HAT培养液继续培养足够时期以杀死期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)。具体地，一般通过数日至数周的培养，可以选择期望的杂交瘤。随后，通过常规的有限稀释法，可以进行产生期望抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。

期望抗体的筛选和单一克隆可以通过基于已知的抗原抗体反应的筛选方法适当实施。期望抗体可以例如通过荧光激活细胞分选术(FACS)筛选。FACS是这样的系统，其通过用激光束分析与荧光抗体接触的细胞并测定各个细胞发出的荧光而能够测定抗体与细胞表面的结合。

为了通过FACS筛选产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤，首先配制表达由产生的抗体结合的抗原的细胞。用于筛选的优选细胞是强制表达该抗原的哺乳动物细胞。通过使用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞作为对照，能够选择性检测抗体对细胞表面的抗原的结合活性。也即，通过选择产生不与宿主细胞结合、与强制表达抗原的细胞结合的抗体的杂交瘤，能够获得产生期望单克隆抗体的杂交瘤。

备选地，将表达研究的抗原的细胞固定，并且能够基于ELISA的原理评价抗体对该抗原表达细胞的结合活性。例如，在ELISA板的孔中固定抗原表达细胞。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定细胞接触，检测与固定细胞结合的抗体。在单克隆抗体衍生自小鼠的情况下，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检测。通过这些筛选选择的产生对抗原具有结合能力的期望抗体的杂交瘤可以通过有限稀释法等克隆。

如此制备的产生单克隆抗的杂交瘤可以在常规的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。

按照常规方法培养上述杂交瘤，能够从该培养上清获得期望的单克隆抗体。备选地，将杂交瘤施用于与其具有相容性的哺乳动物并增殖，能够从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适于得到高纯度的抗体。

也可以适当应用从抗体产生细胞如杂交瘤克隆抗体基因所编码的抗体。通过将克隆的抗体基因掺入适当的载体导入宿主，表达该基因所编码的抗体。用于抗体基因的分离、所述基因向载体的导入、以及宿主细胞的转化的方法例如，已经由Vandamme等确立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3)，767-775)。如下述的重组抗体的制备方法也是另外已知的。

为了获得编码抗体的可变区(V区)的cDNA，通常，首先从杂交瘤提取总RNA。用于从细胞提取mRNA的方法可以利用例如如下的方法：

-胍超速离心法(Biochemistry(1979)18(24)，5294-5299)，和

-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1)，156-159)。

提取的mRNA可以使用例如mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience制)等纯化。或者，如QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience制)等的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒也是市售的。应用这样的试剂盒，能够从杂交瘤获得mRNA。从得到的mRNA，可以用逆转录酶合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可以通过AMVReverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工业公司制)等合成。另外，为了cDNA的合成和扩增，可以适当利用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech制)和应用PCR的5′-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23)，8998-9002、NucleicAcids Res.(1989)17(8)，2919-2932)。进一步，在这样的cDNA合成过程中，可以在cDNA的两个末端导入后述的适当限制酶位点。

从得到的PCR产物纯化目的cDNA片段，随后与载体DNA连接。如此制备重组载体，并导入大肠杆菌等重。克隆选择后，可以从形成该克隆的大肠杆菌配制期望的重组载体。随后，关于该重组载体是否具有目的cDNA的核苷酸序列，通过已知方法例如双脱氧核苷酸链终止法确认。

为了分离编码可变区的基因，使用引物扩增可变区基因的5′-RACE法是方便使用的。首先，使用由杂交瘤细胞提取的RNA为模板通过合成cDNA，得到5′-RACE cDNA文库。5′-RACE cDNA文库的合成中适当应用市售的试剂盒如SMART RACE cDNA扩增试剂盒。

以得到的5′-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于已知的抗体基因序列，可以设计用于小鼠抗体基因扩增的引物。这些引物的核苷酸序列按照免疫球蛋白的亚类不同。因此，期望预先用市售试剂盒如Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(Roche Diagnostics)等确定亚类。

具体地，例如，利用允许扩增编码γ1、γ2a、γ2b和γ3重链以及κ链和λ链轻链的基因的引物，来分离编码小鼠IgG的基因。为了扩增IgG的可变区基因，一般地，利用与靠近可变区的恒定区位点退火的引物作为3′侧的引物。另一方面，利用5′RACE cDNA文库构建试剂盒所附带的引物作为5′侧的引物。

利用如此扩增的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合形成的免疫球蛋白。以重构的免疫球蛋白对抗原的结合活性为指标，可筛选期望抗体。例如可以通过以下步骤进行筛选；

(1)使含有由杂交瘤得到的cDNA编码的V区的抗体与期望的抗原表达细胞接触；

(2)检测该抗原表达细胞与抗体的结合；和

(3)选择与该抗原表达细胞结合的抗体。

检测抗体与该抗原表达细胞的结合的方法是已知的。具体地，通过前述技术如FACS，能够检测抗体与该抗原表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可以适当利用该抗原表达细胞的固定样本。

对于使用结合活性作为指标的抗体筛选方法，也适当应用利用使用噬菌体载体的淘选方法。在从作为重链和轻链的亚类的文库的多克隆抗体表达细胞群获得抗体基因的情况下，利用噬菌体载体的筛选方法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因可以通过用适当的接头序列连接形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与研究的抗原接触。然后，通过收集与抗原结合的噬菌体，能够分离编码具有目的结合活性的scFv的DNA。能够通过按照需要重复该操作，富集具有期望结合活性的scFv。

得到编码目的抗体的V区的cDNA后，利用识别在该cDNA的两个末端插入的限制酶位点的限制酶消化该cDNA。优选的限制酶识别并消化构成抗体基因的核苷酸序列中出现频率低的核苷酸序列。此外，为了以正确方向在载体中插入1个拷贝的消化片段，优选插入产生粘性末端的限制酶。通过将编码如上述消化的抗体的V区的cDNA插入适当的表达载体，能够获得抗体表达载体。此时，如果编码抗体恒定区(C区)的基因与编码前述V区的基因符合读框地融合，则获得嵌合抗体。此处，“嵌合抗体”指恒定区与可变区的来源不同的抗体。因此，除小鼠/人等异种嵌合抗体之外，人/人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过在已经具有恒定区的表达载体中插入前述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如，在携带编码期望抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5′侧，可以适当配置消化前述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。通过由相同组合限制酶消化的两个基因符合读框地融合，构建嵌合抗体表达载体。

为了产生单克隆抗体，将抗体基因插入表达载体从而在表达调节区域的控制下表达基因。用于表达抗体的表达调节区域包含例如增强子和启动子。另外，可以在氨基末端添加适当的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。信号序列从表达的多肽的羧基末端切断，并且得到的抗体可分泌到细胞外。随后，利用表达载体转化适当的宿主细胞，能够获得表达编码抗体的DNA的重组细胞。

为了抗体基因的表达，将编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA分别插入不同的表达载体。利用插入H链和L链的载体，通过同时转化相同的宿主细胞(共转染)，能够表达具有H链和L链的抗体分子。或者，通过将编码H链和L链的DNA插入单一的表达载体，能够转化宿主细胞(参考国际公开WO 94/11523)。

存在和多用于通过将分离的抗体基因引入适当的宿主制备抗体的宿主细胞和表达载体的组合。所有这些表达系统可用于分在本发明的具有免疫应答抑制功能的细胞的表面上表达的分子的结构域和T细胞受体复合体结合结构域。

用作宿主细胞的适当真核细胞，包括动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体地，动物细胞，包括例如下列细胞。

(1)哺乳类细胞：CHO、COS、骨髓瘤、幼仓鼠肾(BHK)、Hela、Vero等

(2)两栖类细胞：爪蟾卵母细胞等

(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。

或者，作为植物细胞，已知应用源自烟草(Nicotiana)属如普通烟草(Nicotianatabacum)的细胞的抗体基因表达体系。植物细胞的转化可适当应用愈伤组织培养细胞。

此外，真菌细胞可利用下列细胞。

-酵母：酵母(Saccharomyces)属如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母属如毕赤酵母(Pichia pastoris)；和

-丝状真菌：曲霉菌(Aspergillus)属如黑曲霉(Aspergillus niger)。

此外，利用原核细胞的抗体基因的表达系统也是已知的。例如，在应用细菌细胞的情况下，可以适当地在本发明中利用大肠杆菌(E.coli)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)等细菌细胞。在这些细胞中通过转化导入包含目的抗体基因的表达载体。通过体外培养转化细胞，并且能够从该转化细胞的培养物获得期望抗体。

除上述宿主细胞之外，也可以利用转基因动物产生重组抗体。也即，从导入了编码期望抗体的基因的动物，可以得到该抗体。例如，抗体基因可以通过符合读框地插入编码乳汁中固有地产生的蛋白质的基因的内部而作为融合基因构建。乳汁中分泌的蛋白质可以利用例如，山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎中，将该注射的胚胎导入雌性山羊。从接受胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁，可以获得期望抗体，其为与乳汁蛋白质的融合蛋白质。另外，为了增加从转基因山羊产生的包含期望抗体的乳汁量，可以对转基因山羊施用激素(Bio/Technology(1994)，12(7)，699-702)。

在对人施用本说明书中记载的抗原结合分子的情况下，例如，作为该分子中的各种结合结构域，在应用包含抗体的可变区的结构域的情况下，为了降低对人的异种抗原性等，可以适当采用人为改变的基因重组型抗体衍生的抗原结合结构域。基因重组型抗体中包含例如人源化(Humanized)抗体。这些改变的抗体应用已知的方法适当制备。

用于制备本说明书中记载的抗原结合分子中的各种结合结构域的抗体可变区通常由被4个构架区(FR)分开的3个互补决定区(complementarity-determining region，CDR)构成。CDR是实质上决定抗体的结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富于多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即使在具有不同的结合特异性的抗体之间也常常显示高同一性。因此，一般地，通过CDR的移植，某一抗体的结合特异性可以移植到其它抗体中。

人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体。具体地，人以外的动物、例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体的人源化抗体等是已知的。用于获得人源化抗体的一般的基因重组技术也是已知的。具体地，作为用于将小鼠的抗体的CDR移植到人的FR的方法，例如重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR)是已知的。在重叠延伸PCR中，在用于合成人抗体的FR的引物中，添加编码要移植的小鼠抗体的CDR的核苷酸序列。对4个FR各自制备引物。一般地，在将小鼠CDR移植到人FR中，选择与小鼠FR同一性高的人FR对于CDR的功能的维持是有利的。也即，一般地，优选利用包含与要移植的小鼠CDR邻接的FR的氨基酸序列同一性高的氨基酸序列的人FR。

设计连接的核苷酸序列使其互相符合读框地连接。利用各自的引物个别合成人FR。其结果是，得到其中编码小鼠CDR的DNA与各FR编码DNA连接的产物。设计编码各产物的小鼠CDR的核苷酸序列使其互相重叠。随后，进行使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR区域退火的互补链合成反应。通过该反应，人FR经由小鼠CDR的序列连接。

使用与其5′末端或3′末端退火的附加了适当限制酶识别序列的引物，扩增最终3个CDR与4个FR连接的全长V区基因。通过使如上述得到的DNA和编码人抗体C区的DNA符合读框地融合地插入表达载体中，能够制备人源化抗体表达用载体。将该重组载体导入宿主建立重组细胞之后，培养该重组细胞，并且表达编码该人源化抗体的DNA，该人源化抗体在该细胞培养物中产生(参考欧洲专利公开号EP 239400和国际专利公开号WO1996/002576)。

通过对如上述制备的人源化抗体与抗原的结合活进行定性或定量测定、评价，能够适当选择人抗体的FR，其在经由CDR连接时允许该CDR形成良好的抗原结合部位。按照需要，也可以置换FR的氨基酸残基，使得重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。例如，通过应用用于将小鼠CDR向接枝入人FR的PCR方法，可以在FR中导入氨基酸序列的突变。更具体地，与FR退火的引物中可以导入部分核苷酸序列突变。在通过使用该引物合成的FR中，导入核苷酸序列突变。通过用上述方法测定和评价置换了氨基酸的突变型抗体与抗原的结合活性，能够选择具有期望性质的突变FR序列(Sato，K.等，Cancer Res，1993，53，851-856)。

另外，通过利用DNA免疫免疫具有人抗体基因的整体组库(repertoire)的转基因动物，可以获得所需的人抗体(参见WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)。

进一步地，已知使用人抗体文库，通过淘选获取人抗体的技术。例如，人抗体的V区作为单链抗体(scFv)通过噬菌体展示法在噬菌体表面表达。可选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对所选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区序列与所需的人抗体C区的序列符合读框地融合，然后插入适当的表达载体，由此可制备表达载体。将该表达载体导入上述例举的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，由此可获得该人抗体。这些方法已知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。

除噬菌体展示法以外，作为应用人抗体文库通过淘选获得人抗体的技术，已知使用无细胞翻译系统的技术、在细胞或病毒表面展示抗原结合分子的技术、使用乳剂的技术等。例如，作为使用无细胞翻译系统的技术，可以使用通过终止密码子除去等经由核糖体形成mRNA与翻译的蛋白质的复合物的核糖体展示法、应用嘌呤霉素等化合物使基因序列和翻译的蛋白质共价结合的cDNA展示法、mRNA展示法、应用核酸的结合蛋白质形成基因和翻译的蛋白质的复合物的CIS展示法等。另外，作为在细胞或者病毒表面展示抗原结合分子的技术，除噬菌体展示法以外，也可使用大肠杆菌展示法、革兰氏阳性菌展示法、酵母展示法、哺乳类细胞展示法、病毒展示法等。作为使用乳剂的技术，可以使用通过在乳剂中包入基因以及翻译相关分子的体外病毒展示法等。这些方法是已知的(Nat Biotechnol.2000Dec；18(12)：1287-92、Nucleic Acids Res.2006；34(19)：e127、Proc Natl Acad Sci U SA.2004Mar 2；101(9)：2806-10、Proc Natl Acad Sci U S A.2004Jun 22；101(25)：9193-8、Protein Eng Des Sel.2008Apr；21(4)：247-55、ProcNatl Acad Sci U S A.2000Sep26；97(20)：10701-5、MAbs.2010Sep-Oct；2(5)：508-18、Methods Mol Biol.2012；911：183-98)。

本发明中“特异性”是指特异性结合的分子中的一个分子对其一个或多个结合配偶体分子以外的分子不显示任何有意义结合的状态。另外，也用于抗原结合结构域对于某一抗原中包含的多个表位之中的特定表位具有“特异性”的情况。另外，在抗原结合结构域结合的表位包含在多个不同的抗原中的情况下，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子能够与包含该表位的各种抗原结合。

另外，意味着抗原中存在的抗原决定簇的“表位”是指本说明书中公开的抗原结合分子中的各种结合结构域结合的抗原上的部位。因此，例如，表位可以根据其结构定义。另外，也可以根据识别该表位的抗原结合分子中对抗原的结合活性定义该表位。在抗原是肽或多肽的情况下，也可以根据构成表位的氨基酸残基指定表位。另外，在表位是糖链的情况下，也可以根据特定的糖链结构指定表位。

线性表位是包含识别氨基酸一级序列的表位的表位。线性表位典型地在固有序列中包含至少3个和最普通至少5个、例如约8～约10个、6～20个氨基酸。

与线性表位相比，构象表位是包含表位的氨基酸的一级序列不是识别的表位的单一决定成分的表位(例如，氨基酸的一级序列不一定被决定表位的抗体识别的表位)。构象表位可能包含与线性表位相比增加数目的氨基酸。关于构象表位的识别，抗体识别肽或者蛋白质的三维结构。例如，在蛋白质分子折叠形成三维结构的情况下，形成构象表位的某些氨基酸和/或者多肽主链并列，使得抗体识别表位成为可能。确定表位的构象的方法中包含例如，X线结晶学、二维核磁共振光谱学以及位点特异性自旋标记和电子顺磁共振光谱学，但不限于这些。例如，参考Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology(1996)、第66卷、Morris(编辑)。

评价具有免疫应答抑制功能的细胞表面上表达的分子中的表位被测试抗原结合分子的结合的方法的实例在下文显示。根据下列示例，也可适当实施其它结合结构域与对象抗原中的表位的结合的确认方法。

例如，当选择CTLA4作为具有免疫应答抑制功能的细胞的表面上表达的分子时，用于分子的包含抗原结合结构域的测试抗原结合分子是否识别抗原分子中的线性表位可以例如如下所述确认。例如，为了上述目的，合成包含构成CTLA4的细胞外结构域的氨基酸序列的线状肽。该肽可以化学合成。或者，利用CTLA4的cDNA中的编码与细胞外结构域相应的氨基酸序列的区域，通过遗传工程技术得到。随后，评价包含构成细胞外结构域的氨基酸序列的线状肽、与包含对CTLA4的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性。例如，以固定的线状肽作为抗原，通过ELISA，能够评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对表达CTLA4的细胞的结合中线状肽产生的抑制水平，能够阐明对线状肽的结合活性。通过这些试验，能够阐明该抗原结合分子对线状肽的结合活性。

包含对上述抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别构象表位可以如下确认。例如可列举，上述包含对CTLA4的抗原结合结构域的抗原结合分子与CTLA4表达细胞接触时与该细胞强结合，另一方面，该抗原结合分子与固定化的包含构成CTLA4的细胞外结构域的氨基酸序列的线状肽实质上不结合等。此处，实质上不结合是指对抗原表达细胞的结合活性的80％以下、通常50％以下、优选地30％以下、特别优选地15％以下的结合活性。

作为测定包含抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原表达细胞的结合活性的方法，可列举例如Antibodies A Laboratory Manual记载的方法(Ed Harlow，DavidLane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。也即，能够以抗原表达细胞为抗原通过ELISA、FACS(荧光激活细胞分选术)的原理评价。

在ELISA形式中，包含抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原表达细胞的结合活性通过比较由酶反应生成的信号水平定量地评价。也即，在固定了抗原表达细胞的ELISA板中加入被测抗原结合分子，与该细胞结合的被测抗原结合分子利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体检测。或者，在FACS中，制备被测抗原结合分子的稀释系列，确定对抗原表达细胞的抗体结合效价(titer)，从而能够比较被测抗原结合分子对抗原表达细胞的结合活性。

被测抗原结合分子对在缓冲液等中悬浮的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测。流式细胞仪已知例如下列装置：

FACSCanto^TM II

FACSAria^TM

FACSArray^TM

FACSVantage^TM SE

FACSCalibur^TM(均为BD Biosciences公司的商品名)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCLADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter的商品名)。

例如，作为包含上述抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原的结合活性的适当测定方法的一个例子，可以列举下列方法。首先，用识别与表达抗原的细胞反应的被测抗原结合分子的FITC标记的二次抗体染色。通过将被测抗原结合分子经适当缓冲液适当稀释，将该抗原结合分子配制为期望浓度应用。例如，可以以10μg/ml至10ng/ml之间的任一浓度使用。随后，通过FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体与该细胞的结合量反映在通过应用CELL QUEST Software(BD公司)的分析得到的荧光强度、也即几何均值(Geometric Mean)中。也即，通过得到该几何均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。

包含本发明的抗原结合结构域的被测抗原结合分子与某一抗原结合分子共享表位可以通过这两者对相同表位的竞争确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断分析等检测。例如，竞争ELISA分析是优选的交叉阻断分析。

具体地，在交叉阻断分析中，将微量滴定板的孔上包被的抗原在候选的竞争抗原结合分子存在下或者不存在下预温育后，添加被测抗原结合分子。与孔中的抗原结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接相关。也即，对于同一表位竞争抗原结合分子的亲和性越大，被测抗原结合分子与包被抗原的孔的结合活性越低。

经由抗原与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子而容易地测定。例如，生物素标记的抗原结合分子可以通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物和适当的底物测定。特别地，利用过氧化物酶等的酶标记的交叉阻断分析称为“竞争ELISA分析”。抗原结合分子可以用能够检测或测定的其它标记物质标记。具体地，放射标记或荧光标记等是公知的。

与候选的竞争抗原结合分子不存在下实施的对照试验中得到的结合活性比较，如果竞争抗原结合分子可以阻断包含抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合至少20％、优选地至少20～50％、进一步优选地至少50％，则该被测抗原结合分子是结合与竞争抗原结合分子实质上相同的表位、或竞争结合相同表位的抗原结合分子。

在包含本发明的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构被鉴定的情况下，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共享表位可以通过比较这两个抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而成的肽的结合活性而评价。

作为测定该结合活性的方法，例如，可以通过在前述ELISA形式中比较被测抗原结合分子以及对照抗原结合分子对导入了突变的线状肽的结合活性而测定。作为ELISA以外的方法，对与柱结合的该突变肽的结合活性也可以通过使被测抗原结合分子和对照抗原结合分子流过该柱后对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量而测定。将突变肽作为例如与GST的融合肽吸附于柱的方法是公知的。

另外，在鉴定的表位是立体表位的情况下，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共享表位可以用下列方法评价。首先，配制表达作为抗原结合结构域的对象的抗原的细胞和表达在表位中导入突变的抗原的细胞。对于将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液的细胞悬浮液，添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。随后，对于用适当缓冲液洗涤的细胞悬浮液，添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的FITC标记的抗体。利用标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur(BD公司)测定。对于被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度，通过适当缓冲液适当稀释配制为期望浓度应用。例如，以10μg/ml至10ng/ml之间的任一浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量反映在通过利用CELL QUEST Software(BD公司)的分析得到的荧光强度、也即几何均值中。也即，通过该几何均值，能够测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。

另外，本发明的“抗原结合分子”包含在单一多肽链内形成本发明的“抗体可变区”的重链和轻链两者，也可为缺乏恒定区的抗体片段。该抗体片段例如也可为双抗体(diabody；Db)、scFv、单链抗体、sc(Fv)₂、sc(Fab′)₂。

Db是由2条多肽链构成的二聚体(Holliger P et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)、EP404,097、W093/11161等)，对于各自的多肽链，相同链中L链可变区(VL)以及H链可变区(VH)通过短至不能彼此缔合的接头、例如5个残基左右的接头连接。

同一多肽链上编码的VL和VH由于其间的接头短不能形成单链可变区片段，其通过二聚化而形成2个抗原结合部位。

另外，本说明书中，术语“scFv”、“单链抗体”、或者“sc(Fv)₂”指单一多肽链内包含来自重链和轻链两者的可变区、但缺乏恒定区的抗体片段。一般地，单链抗体还包含能够形成认为允许抗原结合的期望结构的、VH结构域和VL结构域间的多肽接头。单链抗体在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，269～315(1994)中由Pluckthun详细论述。同样地，参考国际专利申请公开WO1988/001649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号。在特定实施方式中，单链抗体还可以是双特异性和/或人源化的。

scFv是构成Fv的VH和VL通过肽接头连接而成的抗原结合结构域(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85(16)，5879-5883)。通过该肽接头VH和VL可以保持为接近的状态。

sc(Fv)₂是二个VL和二个VH的4个可变区通过肽接头等接头连接的构成单链的单链抗体(J Immunol.Methods(1999)231(1-2)，177-189)。这二个VH和VL可以从不同的单克隆抗体衍生。例如，可以适当列举如Journal of Immunology(1994)152(11)，5368-5374中公开的识别单个抗原中存在的二种表位的双特异性sc(Fv)₂。sc(Fv)₂可由本领域技术人员通过公知方法制备。例如，可将scFv用肽接头等接头连接而制备sc(Fv)₂。

本说明书中构成sc(Fv)₂的抗原结合结构域的组成方式可列举特征在于二个VH和二个VL以单链多肽的N末端侧为起点按照VH、VL、VH、VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序排列的抗体，但二个VH和二个VL的顺序不特别限于上述组成方式，可以以任何顺序排列。例如，也可列举如下顺序的组成方式。

[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]

[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]

[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]

[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]

[VL]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VH]。

sc(Fv)₂的分子形态在WO2006/132352中也详细记载，本领域技术人员根据这些记载，可以适当制备用于制备本说明书中公开的抗原结合分子的期望sc(Fv)₂。

此处，术语“可变片段(Fv)”意味着抗体的轻链可变区(VL(light chain variableregion))和抗体的重链可变区(VH(heavy chain variable region))对组成的抗体衍生的抗原结合结构域的最小单位。1988年Skerra和Pluckthun发现，通过细菌信号序列下游插入抗体基因在大肠杆菌中诱导该基因的表达，能够从大肠杆菌的周质级分制备均一和活性抗体(Science(1988)240(4855)，1038-1041)。对于从周质级分配制的Fv，VH和VL以具有与抗原结合的方式缔合。

另外，本发明的抗原结合分子也可以缀合PEG等载体聚合物、抗癌剂等有机化合物。另外，可以插入糖基化序列，以获得期望效果为目的适当插入糖基化链。

作为连接抗体可变区的接头，可以应用能够通过遗传工程导入的任意肽接头、合成接头和例如，参考Protein Engineering，9(3)，299-305，1996中公开的接头等，但本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，可按照目的由本领域技术人员适当选择，优选长度是5个氨基酸以上(上限没有特别限定，通常是30氨基酸以下、优选地20氨基酸以下)，特别优选地15个氨基酸。在sc(Fv)₂中包含3个肽接头的情况下，可以应用完全相同长度的肽接头，也可以应用不同长度的肽接头。

例如，在肽接头的情况，可以列举：

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：20)

Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：21)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：22)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：23)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：24)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：25)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：26)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：27)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：22))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：23))n

其中n是1以上的整数]。但是，肽接头的长度、序列可按照目的由本领域技术人员适当选择。

合成接头(化学交联剂)是在肽的交联中常规应用的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基丁二酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基丁二酸酯)(磺基-EGS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基-DST)、双(2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基)砜(BSOCOES)、双(2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基)砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂是市售的。

在连接4个抗体可变区的情况下，通常需要3个接头，可以应用完全相同的接头，也可以应用不同的接头。

另外，“Fab”由一条轻链、以及一条重链的CH1结构域和可变区构成。Fab分子的重链不能与其它重链分子形成二硫键。

“F(ab′)₂”以及“Fab′”通过用作为蛋白酶的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等处理免疫球蛋白(单克隆抗体)而制备，意味着在铰链区中2条H链间存在的二硫键的附近消化生成的抗体片段。例如，通过用木瓜蛋白酶切割IgG，可以制备包含在铰链区中2条H链中每个之间存在的二硫键的上游切割的VL(L链可变区)和CL(L链恒定区)的L链、以及包含VH(H链可变区)和CHγ1(H链恒定区中的γ1区域)的H链片段通过C末端区的二硫键结合而成的2个同源性抗体片段。这2个同源性抗体片段分别称为Fab′。

“F(ab′)₂”包含二条轻链和二条重链，含有CH1结构域和CH2结构域的一部分的恒定区，使得链间二硫键在2条重链间形成。构成本说明书中公开的抗原结合分子的F(ab％₂可以如下优选获得，将具有期望抗原结合结构域的全长单克隆抗体等用胃蛋白酶等蛋白酶部分消化后，将Fc片段在蛋白A柱上吸附除去。所述蛋白酶没有特别限定，能够通过适当设定pH等酶反应条件限制性地消化全长抗体而生成F(ab′)₂即可，可示例例如胃蛋白酶、无花果蛋白酶等。

本发明的“抗原结合分子”的优选实施方式之一包括多特异性抗体。在多特异性抗体的Fc区应用对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区的情况下，也适当使用源自多特异性抗体的Fc区。本发明的多特异性抗体特别优选双特异性抗体。

对于多特异性抗体的缔合，可以应用在抗体H链的第二恒定区(CH2)或H链的第三恒定区(CH3)的界面导入电荷斥力来抑制非目的H链彼此缔合的技术(WO2006/106905)。

在CH2或CH3的界面导入电荷斥力来抑制不希望的H链彼此缔合的技术中，作为在H链的其它恒定区的界面接触的氨基酸残基，可列举例如，CH3区域中EU编号第356号的残基、EU编号第439号的残基、EU编号第357号的残基、EU编号第370号的残基、EU编号第399号的残基、EU编号第409号的残基相对的区域。

更具体地，例如，可制备在包含2种H链CH3区域的抗体中，选自第一H链CH3区中以下(1)～(3)中示出氨基酸残基的组的1对至3对的氨基酸残基具有同种电荷的抗体；(1)H链CH3区域中包含的氨基酸残基、即EU编号第356位和439位的氨基酸残基、(2)H链CH3区域中包含的氨基酸残基、即EU编号第357位和370位的氨基酸残基、(3)H链CH3区域中包含的氨基酸残基、即EU编号第399位和409位的氨基酸残基。

进一步，可制备抗体使得作为选自与上述第一H链CH3区域不同的第二H链CH3区域中前述(1)～(3)中示出氨基酸残基的组的氨基酸残基的组，前述第一H链CH3区域中具有同种电荷的前述(1)～(3)中示出氨基酸残基的组对应的1组至3组的氨基酸残基具有与前述第一H链CH3区域中对应的氨基酸残基相反的电荷。

上述(1)～(3)中记载的各自氨基酸残基在缔合时互相接近。本领域技术人员能够对于期望的H链CH3区域或者H链恒定区用市售软件通过同源模建等发现与上述(1)～(3)中记载的氨基酸残基对应的部位，可适当地对该部位的氨基酸残基进行改变。

上述抗体中，“具有电荷的氨基酸残基”优选选自例如以下(a)或者(b)中任一组中包含的氨基酸残基：

(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；和

(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。

在上述抗体中，“具有同种电荷”意味着例如，2个以上的氨基酸残基都具有上述(a)或者(b)的任一组中包含的氨基酸残基。“具有相反电荷”意味着例如，在2个以上的氨基酸残基中至少1个氨基酸残基具有上述(a)或者(b)的任一组中包含的氨基酸残基的情况下，剩余的氨基酸残基具有在不同组中包含的氨基酸残基。

在优选实施方式中，对于上述抗体，第一H链CH3区域和第二H链CH3区域也可通过二硫键交联。

作为本发明中进行改变的氨基酸残基，不限于上述抗体的可变区或者抗体的恒定区的氨基酸残基。本领域技术人员能够对于多肽突变体或者异源多聚体用市售软件通过同源模建等发现形成界面的氨基酸残基，能够对该部位的氨基酸残基进行改变而控制缔合。

另外，本发明的多特异性抗体的缔合中也可应用另外其它的公知技术。通过将抗体的一个H链的可变区中存在的氨基酸侧链置换为更大的侧链(knob；突起)、另一H链的相对可变区中存在的氨基酸侧链置换为更小的侧链(hole；孔洞)，可将突起配置在孔洞中，从而能够有效地引起具有Fc区的具有不同氨基酸的多肽彼此缔合(WO1996/027011、RidgwayJB et al.，Protem Engineering(1996)9，617-621，Merchant AM et al.NatureBiotechnology(1998)16，677-681、US20130336973)。

此外，本发明的多特异性抗体的形成中也可应用另外其它的公知技术。应用将抗体的一个H链的CH3的一部分制成与该部分对应的IgA来源的序列、另一H链的CH3的互补部分中导入与该部分对应的IgA来源的序列的链交换工程化结构域CH3，可通过CH3的互补缔合有效引起具有不同序列的多肽的缔合(Protein Engineering Design&Selection，23；195-202，2010)。应用该公知技术也可有效形成目的多特异性抗体。

此外，在多特异性抗体的形成中，也可应用如下技术，WO2011/028952、WO2014/018572、Nat Biotechnol.2014Feb；32(2)：191-8.中记载的利用抗体的CH1与CL的缔合、VH、VL的缔合的抗体制备技术，WO2008/119353、WO2011/131746中记载的使用分别配制的单克隆抗体制备双特异性抗体的技术(Fab Arm Exchange)，WO2012/058768、WO2013/063702中记载的控制抗体重链的CH3间的缔合的技术，WO2012/023053中记载的制备由二种轻链和一种重链构成的双特异性抗体的技术，Christoph等人(Nature Biotechnology Vol.31，p753-758(2013))中记载的利用分别表达包含1条H链和1条L链的抗体的一条链的2个细菌细胞株的制备双特异性抗体的技术等。

多特异性抗体的形成的一个实施方式可列举，如上述的，将二种单克隆抗体在还原剂存在下混合，使核心铰链的二硫键断裂，随后再缔合并异二聚化而获得双特异性抗体的方法(FAE)，通过在CH3区的相互作用界面导入静电相互作用(WO2006/106905)，能够诱导再缔合时进一步有效的异二聚化(WO2015/046467)。在应用天然型IgG的FAE中，再缔合随机发生，因此理论上仅以50％的效率得到双特异性抗体，但是，在该方法中可以以高收率制备双特异性抗体。

另外，即使在无法有效形成目的多特异性抗体的情况下，通过从产生的抗体中分离、纯化目的多特异性抗体，也可得到本发明的多特异性抗体。例如，报告了通过在2种H链可变区中导入氨基酸置换产生等电点差异、可将2种同源体与目的异源抗体通过离子交换层析而纯化的方法(WO2007114325)。另外，作为纯化异源体的方法，迄今报告了，将包含与蛋白A结合的小鼠IgG2a的H链和不与蛋白A结合的大鼠IgG2b的H链的异源二聚化抗体利用蛋白A纯化的方法(WO98050431、WO95033844)。另外，通过应用将IgG与蛋白A的结合部位的EU编号第435位和436位的氨基酸残基置换为Tyr、His等与蛋白A的结合力不同的氨基酸的H链，使各H链与蛋白A的相互作用变化，通过应用蛋白A柱，也可有效纯化单独的异源二聚化抗体。

另外，也可以获得能够赋予对不同的多数H链的结合能力的共同L链，并将其用作多特异性抗体的共同L链。通过将这样的共同L链和不同的多数H链基因导入细胞表达IgG，能够有效表达多特异性IgG(Nature Biotechnology(1998)16，677-681)。选择共同H链时，也可以利用选择对任意不同的H链显示高结合能力的共同L链的方法(WO2004/065611)。

另外，作为本发明的Fc区，可以适当使用Fc区的C末端的异质性改善的Fc区。更具体地，提供了在构成来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的二条多肽的氨基酸序列之中以EU编号指定的446位甘氨酸以及447位赖氨酸缺失的Fc区。

这些技术也可以组合应用多个，例如2个以上。另外，这些技术也可以对要缔合的2个H链适当地分别应用。进一步地，这些技术也可以与上述对Fcγ受体结合活性降低的Fc区组合应用。另外，本发明的抗原结合分子也可以是基于加入上述改变的抗原结合分子单独制备的具有同一氨基酸序列的抗原结合分子。

本发明的抗原结合分子可以是任意分子，只要其包含以下各项即可：

(i)与具有免疫应答抑制功能的细胞表面表达的分子结合的结构域；和

(ii)上文所述的T细胞受体复合体结合结构域，并且其结构不受限制。通过包含这两种结合结构域，抗原结合分子可以通过由(i)中所述的表达分子的细胞抑制免疫应答抑制效应活化免疫应答，并且对癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织引起极好的细胞毒性。本发明的(i)和(ii)中所述的结合结构域可以适当地选自分别属于T细胞受体复合体上述表达在具有免疫应答抑制功能或抗原的细胞的表面上的分子。这些结合结构域可以直接由肽键或经由街头连接。

本发明的抗原结合分子还可以包含FcRn结合结构域。当使用上述抗体的Fc区作为FcRn结合结构域时，有选具有降低的Fcγ受体结合活性的Fc区。降低Fcγ受体结合活性使得能够抑制系统性免疫活化产生的副作用，如表达Fcγ受体的细胞和表达T细胞受体复合体的细胞之间的交联引起的细胞因子释放。

本发明的抗原结合分子可以使用上述已知方法产生。

例如，当(i)F(ab′)₂用作与具有免疫应答抑制功能的细胞表面表达的分子结合的结构域，(ii)F(ab′)₂用作T细胞受体复合体结合结构域，和(iii)包含具有降低的Fcγ受体结合活性的Fc区的结构域用作FcRn结合结构域时，并且当(i)和(ii)中描述的抗原结合结构域和(iii)中描述的包含Fc区的结构域直接通过肽键连接时，连接的多肽形成抗体结构。为了制备这样的抗体，除了从前述杂交瘤的培养液纯化，还可以从稳定地携带编码构成该抗体的多肽的多核苷酸的期望宿主细胞的培养液纯化该抗体。

除此之外，在通过接头连接各结构域的情况下，除上述示例的接头之外，采用的接头还可以适当使用具有例如His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等肽标签的接头。另外，可以另外适当利用氢键、二硫键、共价键、离子相互作用或者这些的组合产生的互相结合的性质。例如，利用抗体的CH1和CL间的亲和性，以及异源Fc区缔合时应用源自前述多特异性抗体的Fc区。

另外，本发明涉及编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸。本发明的抗原结合分子可以掺入任意表达载体。用表达载体转化适当的宿主，能够产生表达抗原结合分子的细胞。培养表达抗原结合分子的细胞，从培养上清回收表达产物，则能够获得由该多核苷酸编码的抗原结合分子。也即，本发明涉及包含编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸的载体、携带该载体的细胞和包含培养该细胞并从培养上清回收抗原结合分子的制备抗原结合分子的方法。这些可以通过例如与前述重组抗体同样的技术获得。

药物组合物

从其他视角，本发明提供药物组合物，其包含上述抗原结合分子作为活性成分。此外，本发明涉及抑制免疫应答抑制活性(抑制免疫应答抑制活性的药剂)，免疫应答活化剂，引起细胞毒性的药剂，细胞增殖抑制剂(细胞增殖抑制剂)，和抗癌剂的药物组合物，其包含抗原结合分子作为活性成分(下文中，药物组合物等)。本发明的药物组合物可以用作治疗癌症的药剂或预防癌症的药剂。本发明的抑制免疫应答抑制活性的药剂，免疫应答活化剂，引起细胞毒性的治疗剂，细胞增殖抑制剂，和抗癌剂优选施用给患有癌症的人，或可能复发的受试者。

此外，在本发明中，可以提供抑制免疫应答抑制活性的药剂，免疫应答活化剂，引起细胞毒性的治疗剂，细胞增殖抑制剂，和抗癌剂(其包含上述抗原结合分子作为活性成分)作为抑制免疫应答抑制活性的方法，活化免疫应答的方法，引起细胞毒性的方法，抑制细胞增殖的方法，活化针对癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织的免疫的方法，或作为预防或治疗癌症的方法，其包括将抗原结合分子施用于受试者的步骤；或提供它们作为在生产以下各项中的抗原结合分子的用途，用于抑制免疫应答抑制活性的药物组合物，活化免疫应答的药物组合物，引起细胞毒性的药物组合物，细胞增殖抑制剂，和抗癌剂；或备选地，作为用于以下各项的抗原结合分子提供：抑制免疫应答抑制活性，活化免疫应答，引起细胞毒性，抑制细胞增殖，活化针对癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织的免疫，或治疗或预防癌症。

本发明中，“包含抗原结合分子作为有效成分”意味着包含该抗原结合分子作为主要活性成分，不限制该抗原结合分子的含有率。

进一步，本发明中的药物组合物等可以按照需要组合多种抗原结合分子应用。例如，通过应用与相同抗原结合的多个本发明的抗原结合分子的混合物，能够强化对表达该抗原的细胞的细胞的作用。

另外，本发明的抗原结合分子可以按照需要包封在微胶囊(羟甲基纤维素、明胶、聚甲基丙烯酸甲酯等微胶囊)中，制成胶体药物递送系统(脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒子和纳米胶囊等)(参考″Remington′s Pharmaceutical Science第16版″，Oslo编辑(1980)等)。进一步地，将药剂制成持续释放药剂的方法也是公知的，该方法可适用于本发明的抗原结合分子(J.Biomed.Mater.Res.(1981)15，267-277，Chemtech.(1982)12，98-105、美国专利第3773719号、欧洲专利公开公报EP58481号·EP133988号、Biopolymers(1983)22，547-556)。

本发明的药物组合物、免疫应答激活剂、细胞毒性引发剂、细胞增殖抑制剂(细胞增殖抑制物)或抗癌剂可以通过经口、非经口施用中的任一施用于患者。优选非经口施用。所述施用方法可具体地列举注射施用、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等。注射施用可列举例如，静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等。例如，通过注射施用可以全身或者局部施用本发明的药物组合物、或细胞毒性诱导治疗剂、细胞增殖抑制剂和抗癌剂。另外，可以根据患者的年龄、症状选择适当的施用方法。作为施用量，例如，可以在一次施用每1kg体重0.0001mg至1000mg的范围内选择施用量。或者，例如，可以在每个患者0.001mg/机体至100000mg/机体的范围内选择施用量。但是，本发明的药物组合物不限于这些施用量。

本发明的药物组合物可以按照常规方法配成制剂(例如，Remington′sPharmaceutical Science，latest edition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)，也可以共同包含药学上相容的载体、添加剂。例如，可以列举表面活性剂、赋形剂、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂、矫味剂等。进一步，不限于这些，可适当使用其它常用载体。具体地，载体可举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。

此外，本发明提供通过将具有抑制某些免疫应答的功能的细胞和与这些细胞的表面表达的分子结合的本发明的抗原结合分子接触并破坏细胞，对癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织引起破坏的方法，或抑制癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织的增殖的方法。成为本发明的抗原结合分子的靶标的癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织没有特别限定，但它们优选为其中具有免疫应答抑制活性的细胞参与癌症发展的，或肿瘤中调节性T细胞或耗竭T细胞的数量与预后关联的癌。报道的这样的癌的实例包括卵巢癌(非专利文献11和12)，胃癌(非专利文献13和14)，食管癌(非专利文献14)，胰腺癌(非专利文献15)，肾细胞癌(非专利文献16)，肝细胞癌(非专利文献17)，乳腺癌(非专利文献18和19)，恶性黑素瘤(非专利文献20)，非小细胞肺癌(非专利文献21)，宫颈癌(非专利文献22)，成胶质细胞瘤(非专利文献23)，前列腺癌(非专利文献24)，成神经细胞瘤(非专利文献25)，慢性淋巴细胞白血病(非专利文献26)，甲状腺乳头状癌(非专利文献27)，结直肠癌(非专利文献28)，以及B-细胞非霍奇金淋巴瘤(非专利文献29和30)，并且它们是本发明的癌的适当的实例。本文中使用的术语“癌症”不仅意为上皮恶性肿瘤如卵巢癌或胃癌，还意为非上皮恶性肿瘤，包括血液器官癌症如慢性淋巴细胞白血病和霍奇金淋巴瘤。

本发明中的“接触”通过例如在体外培养的表达靶标抗原的细胞的培养液中添加与该抗原结合的本发明的抗原结合分子而进行。在该情况下，添加的抗原结合分子的形状可以适当使用溶液或通过冷冻干燥等获得的固体等形状。在以水溶液添加的情况下，可为仅纯粹地包含本发明的抗原结合分子的水溶液，也可为包含例如上述记载的表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂、矫味剂等的溶液。添加的浓度没有特别限定，培养液中的最终浓度可适当使用优选地1pg/ml至1g/ml的范围、更优选地1ng/ml至1mg/ml、更优选地1μg/ml至1mg/ml。

此外，在另一实施方案中，本发明的“接触”，例如，通过向移植有研究的癌细胞的非人动物体内施用本发明的具有抑制非人动物的免疫应答的功能的细胞表面表达的分子的抗原结合分子；或通过将研究的癌细胞系移植入表达人源的具有免疫应答抑制功能的细胞的非人动物，并且然后向动物施用与所述人源的细胞表面表达的分子结合的本发明的分子来进行。施用方法可以是口服或肠胃外的，肠胃外施用是特别优选的。施用方法的具体实例包括通过注射施用、经鼻施用、经肺施用和经皮施用。注射施用的实例包括静脉内注射，肌肉内注射，腹膜内注射，和皮下注射。本发明的药物组合物，或抑制免疫应答抑制活性的药物组合物，活化免疫应答的药物组合物，或引起细胞毒性的药物组合物，细胞增殖抑制剂(细胞增殖抑制物)，或抗癌剂可以系统或局部施用，例如，通过注射施用。另外，可以根据被测动物的年龄、症状选择适当的施用方法。在以水溶液施用的情况下，可为仅纯粹地包含本发明的抗原结合分子的水溶液，也可为包含例如上述记载的表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂、矫味剂等的溶液。作为施用量，例如，可以在一次施用每1kg体重0.0001mg至1000mg的范围选择施用量。或者，例如，可在每个患者0.001至100000mg/机体的范围选择施用量。但是，本发明的抗原结合分子施用量不限于这些剂量。

作为将靶细胞或组织与本发明的抗原结合分子接触的结果，以下方法适当地用作评价或测量在癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织中引起的细胞毒性的方法。作为体外评价或测定该细胞毒性活性的方法，可列举细胞毒性T细胞活性等的测定法。本发明的抗原结合分子是否具有T细胞毒性活性可以通过公知方法测定(例如，Current protocols inImmunology，Chapter7.Immunologic studies in humans，Editor，John E，Coligan等，John Wiley&Sons，Inc.，(1993)等)。对于活性测量，结合与本发明的抗原结合结构域结合的抗原不同的抗原的抗原结合分子(并且在用于检测的抗原细胞中不表达)可以以与本发明的抗原结合分子相同的方式用作对照，并且当本发明的抗原结合分子显示比用作对照的抗原结合分子的细胞毒活性更强的细胞毒活性时，可以确定存在活性。

为了评价或测定体内的细胞毒性活性，例如，将本发明的抗原结合分子靶向的癌细胞或包含癌细胞的肿瘤组织皮内或皮下移植到非人被测动物，之后，从当日或第二日起以每日或数日间隔静胍或腹腔内施用被测抗原结合分子。通过每日测定肿瘤的大小，该肿瘤大小的变化的差异可限定为细胞毒性活性。与体外评价同样地施用作为对照的抗原结合分子，通过本发明的抗原结合分子的施用组中肿瘤的大小显著小于对照抗原结合分子的施用组中肿瘤的大小，可确定本发明的抗原结合分子具有细胞毒性活性。

作为评估或测量对表达构成本发明的抗原结合分子的结构域结合的抗原的细胞的增殖的移植性效果的方法(通过与抗原结合分子接触，所述结构域结合具有免疫应答抑制功能的细胞表面表达的分子)，可以适当应用同位素标记的胸苷向细胞中的摄取的测定或MTT方法。作为评价或测定体内细胞增殖抑制活性的方法，可以适当应用与上述记载的评价或测定体内细胞毒性活性的方法相同的方法。

另外，本发明提供包含本发明的抗原结合分子或者通过本发明的制备方法制备的抗原结合分子的、用于在本发明的方法中使用的试剂盒。该试剂盒中，还可以包装药学上相容的载体、溶剂、记载使用方法的说明书等。

另外，本发明涉及用于在本发明的方法中使用的、本发明的抗原结合分子或者通过本发明的制备方法制备的抗原结合分子。

本领域技术人员当然理解，本说明书中记载的1个或多个实施方式的任意组合也包含在本发明中，只要根据本领域技术人员的技术常识在技术上不矛盾。

另外，本说明书中引用的所有现有技术文献都通过引用并入本说明书中。

实施例

[实施例1]靶向调节性T细胞的细胞表面标志物的T细胞重定向抗体的构思

(1-1)抗-CTLA4抗体通过消除调节性T细胞的抗肿瘤效应

如以上背景技术中所述的，认为易普利单抗通过抑制效应T-细胞活化抑制效应T细胞表面上表达的CTLA4，并且因此呈现抗肿瘤效应。然而，近来，还报道针对表达CTLA4的T细胞的抗体-依赖性的细胞的细胞毒活性(ADCC活性)是重要的，并且已经发现肿瘤中调节性T细胞的消除和ADCC活性对于抗-CTLA4抗体的抗肿瘤效应是重要的作用机制。

另一方面，IgG1抗体导致的ADCC活性通过抗体恒定区结合NK细胞或巨噬细胞的FcγR诱导细胞毒活性，并且已知具有进行修饰以增强该结合的恒定区的抗体诱导更强的细胞毒活性并表现抗肿瘤效应。

如上文提及的，发现在癌症微环境中结合调节性T细胞或耗竭的T细胞，和通过细胞毒活性消除调节性T细胞或耗竭的T细胞发挥强抗肿瘤效应。因此，如果调节性T细胞或耗竭的T细胞可以被更有力地或更特异地消除，如果可以呈现更强的细胞毒活性，可以预期发挥更强的抗肿瘤效应。

(1-2)T细胞重定向抗体

增强前述ADCC活性，增加在血液中的保留，改善抗原结合活性，和降低免疫原性风险作为用于改善抗体的技术进行。通常，抗体识别和结合抗原的单个表位，因此甚至当将该用于改善的技术用于抗体时，仅一种类型的抗原成为靶点。作为抑制多个靶点的分子，已经研究了由一种分子结合两种以上类型抗原的抗体(称为双特异性抗体)。因为双特异性抗体与两种以上类型的抗原相互作用，它们不仅具有用一种分子中和两种以上类型抗原的效应，而且还具有通过交联具有细胞毒活性的细胞与癌细胞增强抗肿瘤活性的效应。

已知Blinatumomab(其是BiTE分子)和Catumaxomab为识别T细胞上表达的蛋白(CD3ε或TCR)和癌细胞上表达的蛋白(癌症抗原)的双特异性抗体。这些分子可以用它们的两个抗原结合结构域(scFv或Fab)中的每个结合癌症抗原和T细胞上表达的CD3ε链，并且在T细胞和表达癌症抗原的细胞之间形成细胞间交联(图1)。这种方式，该T细胞重定向抗体可以使用T细胞作为效应细胞针对表达癌症抗原的细胞的诱导强烈的细胞毒活性。

同时，迄今尚未报道使用T细胞作为效应细胞并且诱导强烈的针对T细胞的细胞毒活性的抗体。例如，因为CD3ε是标准T细胞标志物，使用两个臂(两个Fab)的结合CD3ε的IgG抗体(不具有FcgR结合活性)可以能够通过在表达CD3g的T细胞(其将成为效应细胞)和表达CD3ε的T细胞之间形成细胞间交联(如图2-1中所示)，引起T细胞诱导强烈的针对T细胞的细胞毒活性，但这在实际中几乎不发生。这是因为，由于通过双价结合形成的亲合力，使用两个臂(两个Fab)的结合CD3ε的IgG抗体强烈结合同一细胞上表达的CD3ε，在表达CD3ε的T细胞之间不形成细胞间交联(图2-2)。

因为CD3是标准T细胞标志物并且其在将成为效应细胞的T细胞和将成为靶标的T细胞(例如，调节性T细胞和耗竭的T细胞)中表达，认为T细胞重定向抗体不能发挥针对靶T细胞的细胞毒活性。更具体地，针对表达抗原X(特定T细胞群体的表面标志物)的T细胞的T细胞重定向抗体(针对CD3g和抗原X的双特异性抗体)通过双价结合利用亲合力强烈结合靶T细胞(例如，调节性T细胞和耗竭的T细胞)，因为CD3ε和抗原X在靶T细胞上表达。因此，认为细胞间交联不与将成为效应细胞的T细胞一起发生(图3)。实际上，尚没有针对T细胞抗原的T细胞重定向抗体的报道。

因此，认为针对在调节性T细胞和耗竭的T细胞上表达的CTLA4的T细胞重定向抗体(针对CD3ε和CTLA4的双特异性抗体)(如图4中所示)不能诱导强烈的针对调节性T细胞和耗竭的T细胞的细胞毒活性，因为CD3ε和CTLA4在调节性T细胞和耗竭的T细胞(其是靶T细胞)上表达，并且将成为效应细胞的T细胞不与调节性T细胞和耗竭的T细胞交联。迄今，尚没有关于针对调节性T细胞或耗竭的T细胞的T细胞重定向抗体的报道。

更具体地，未知针对CTLA4的T细胞重定向抗体(抗-CTLA4/抗-CD3ε双特异性抗体)是否实际上可以通过诱导细胞间交联破坏调节性T细胞并表现出体内抗肿瘤效应。因此，我们实际上生产了针对CTLA4和CD3的双特异性抗体并且测试它们是否可以在小鼠体内和人体内实现效果。

针对标准癌症抗原，已知T细胞重定向抗体具有比具有中和NK细胞ADCC活性的抗体更强的抗肿瘤效应；然而，尚未知针对CTLA4的T细胞重定向抗体是否显示比具有增强的ADCC活性的抗-CTLA4抗体更强的抗肿瘤效应。

[实施例2]靶向调节性T细胞的ADCC活性-增强的抗体的制备和评估

(2-1)特异结合小鼠CTLA4的ADCC活性-增强的抗体(hUH02hUL01-mFa55)的表达和 纯化

将编码抗-小鼠CTLA4抗体hUH02hUL01的可变区的基因(重链可变区UH02是SEQ IDNO：28，并且轻链可变区UL01是SEQ ID NO：29)分别插入小鼠IgG2a/κ质粒，用于在动物中表达。本文中，使用修饰以增强对小鼠FcγR的结合的恒定区(重链恒定区mFa55是SEQ ID NO：30，并且轻链恒定区mk1是SEQ ID NO：31)。

通过下文所述方法表达抗体。将人胚肾细胞-来源的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)的细胞以1.33x 10⁶细胞/mL的密度细胞悬浮在FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen)中，并且以3mL/孔种在6孔板的每个孔中。通过脂转染方法将制备的质粒引入细胞。将细胞在CO₂温箱(37℃，8％CO₂，90rpm)中培养四天。使用rProtein A Sepharose^TMFast Flow(Amersham Biosciences)，通过本领域技术人员已知的方法从培养上清纯化抗体。使用分光光度计测量纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。使用通过PACE方法计算的消光系数从确定的值计算纯化的抗体的浓度(Protein Science(1995)4：2411-2423)。

(2-2)抗-小鼠CTLA4抗体(hUH02UL01-mFa55)对各种小鼠FcgR的结合的评价

使用Biacore T200(GE Healthcare)对通过实施例2-1的方法纯化和制备的抗-小鼠CTLA4抗体hUH02hUL01-mFa55和对照抗体hUH02hUL01-mIgG2a(重链可变区UH02是SEQ IDNO：28，轻链可变区UL01是SEQ ID NO：29，重链恒定区mIgG2a是SEQ ID NO：32，并且轻链恒定区mk1是SEQ ID NO：31)分析其与小鼠FcgR(mFcgRI、II、III和IV)的抗原-抗体反应。使用的运行缓冲液是20mmol/LACES，150mmol/L NaCl，0.05％(w/v)Tween20，pH7.4，并且测量在25℃进行。通过胺偶联将蛋白A/G固定在Sensor Chip CM7上。hUH02hUL01-mFa55捕获到传感器芯片上，并且然后允许FcgR作为分析物相互作用120秒，并且观察结合量的改变。运行缓冲液用于稀释hUH02hUL01-mFa55。使用Biacore T200评价软件(GE Healthcare)通过曲线匹配分析测量结果，计算结合速率常数ka(1/Ms)和解离速率常数kd(1/s)。从这些值确定解离常数K_D(M)。测量结果在表1中显示。

表1

(2-3)作为ADCC活性-增强的抗体的抗-小鼠CTLA4抗体(hUH02UL01-mFa55)的评价

通过实施例2-1的方法纯化和制备的抗-小鼠CTLA4抗体hUH02hUL01-mFa55是否对表达小鼠CTLA4的细胞(通过本领域技术人员已知的方法，通过将全长小鼠CTLA4基因引入CHO细胞生产表达小鼠CTLA4的细胞)发挥ADCC活性根据参考实施例1的方法检查。测量结果以抗体浓度-依赖的方式显示ADCC活性(图5)。

[实施例3]识别调节性T细胞和效应T细胞的表面抗原的双特异性的制备和评估.

(3-1)特异结合小鼠CTLA4和小鼠CD3的双特异性抗体的表达和纯化

将编码抗-小鼠CTLA4抗体hUH02hUL01的可变区(重链可变区UH02是SEQ ID NO：28，并且轻链可变区UL01是SEQ ID NO：29)的基因各自插入人IgG1/κ质粒，用于在动物中表达。在本文中，使用为了降低对Fcγ受体的结合和产生两条重链的异源关联而修饰的恒定区(重链恒定区F760nN17是SEQ ID NO：33，并且轻链恒定区k0是SEQ ID NO：34)。

将编码抗-小鼠CD3抗体2C11的可变区(重链可变区是SEQ ID NO：35，并且轻链可变区是SEQ ID NO：36)的基因各自插入人IgG1/κ质粒，用于在动物中表达。在本文中，使用为了降低对Fcγ受体的结合和产生两条重链的异源关联而修饰的恒定区(重链恒定区F760nP17是SEQ ID NO：37，并且轻链恒定区k0是SEQ ID NO：34)。

通过实施例2中所示方法表达和纯化hUH02hUL01-F760nN17和2C11-F760nP17中的每一种。将纯化的同源形式中的每种通过本领域技术人员已知的方法混合，所述方法使用恒定区的电荷的不同(Proc.Natl.Acad.Sci.，110，5145-5150，2013)以生产研究的双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)。

(3-2)对于抗原(mCTLA4和mCD3)结合性质评价特异结合小鼠CTLA4和小鼠CD3的双 特异性抗体

使用Biacore T200(GE Healthcare)对通过实施例3-1的方法纯化和制备的抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)分析其与每种抗原(mCTLA4和mCD3)的抗原-抗体反应。使用的运行缓冲液是HBS-EP+，pH7.4，并且在37℃进行测量。通过胺偶联将蛋白A/G固定在传感器芯片CM4上。将hUH02UL01/2C11-F760捕获到传感器芯片上，并且随后让抗原(小鼠CTLA4或小鼠CD3)作为分析物相互作用(对于小鼠CTLA4为120秒并且对于小鼠CD3为90秒)，观察结合的量的改变。运行缓冲液用于稀释hUH02UL01/2C11-F760。使用Biacore T200评价软件(GE Healthcare)通过曲线匹配分析测量结果以计算结合速率常数ka(1/Ms)和解离速率常数kd(1/s)。从这些值，确定解离常数K_D(M)。结果显示在表2中

标2

编号	分析物	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
					1	小鼠CTLA4	4.30E+05	5.30E-04	1.23E-09
2	小鼠CD3	6.16E+04	7.12E-02	1.16E-06

(3-2)抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)导致的细 胞毒活性的评价

根据参考实施例2的方法检查通过实施例3-1的方法纯化和制备的抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)是否对表达小鼠CTLA4的细胞系发挥细胞毒活性。测量结果显示抗体浓度-依赖的方式的细胞毒活性(图6)。

[实施例4]通过抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)在固定有CD3和CTLA4的珠子和CD3结合的珠子之间交联的评估

抗-CTLA4/抗-CD3双特异性抗体是否识别调节性T细胞(表达CTLA4和CD3)和效应T细胞(表达CD3)的表面抗原并且在所述两种细胞之间形成交联通过理化实验验证。

首先，本发明人，使用来自Perkin Elmer Inc.的Alpha技术，研究可以评价使用通过实施例3-1的方法纯化和制备的抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)在小鼠CD3-固定的珠子和小鼠CTLA4-固定的珠子之间交联的系统的构建。更具体地，使用100nmol/L的生物素化的小鼠CTLA4；0，20，100，或500nmol/L的hUH02UL01/2C11-F760；50μg/mL的AlphaScreen(注册的商标)链霉亲和素-包被的供体珠子(PerkinElmer)；和通过将50μg/mL的小鼠CD3缀合于AlphaScreen(注册的商标)制备的小鼠CD3-接纳体珠子，未缀合的接纳体珠子(PerkinElmer)。在该条件下，认为结合于AlphaScreen(注册的商标)链霉亲和素-包被的供体珠子的生物素化的小鼠CTLA4和小鼠CD3-接纳体珠子可以通过hUH02UL01/2C11-F760交联，如图7-1中所示，并且可以化学发光。Alpha 384(PerkinElmer)用作板，并且使用Envision进行测量。所有实验进行三次。结果，观察到珠子之间hUH02UL01/2C11-F760浓度-依赖性的交联，如图7-2中所示。

接着，将100nmol/L的生物素化的小鼠CTLA4和10nmol/L的生物素化的小鼠CD3加入至AlphaScreen(注册的商标)链霉亲和素-包被的供体珠子(PerkinElmer)，以产生模拟表达CTLA4和CD3的调节性T细胞的供体珠子。检查在50μg/mL小鼠CD3-接纳体珠子(模拟效应T细胞的接纳体珠子)的存在下，加入100nmol/L的hUH02UL01/2C11-F760是否可以引起供体珠子和接纳体珠子之间的交联。使用这样的条件作为对照：其中不将hUH02UL01/2C11-F760加入至100nmol/L的生物素化的小鼠CTLA4；50μg/mL的AlphaScreen(注册的商标)链霉亲和素-包被的供体珠子(PerkinElmer)；和50μg/mL的小鼠CD3-接纳体珠子，其中不在每种珠子之间引起交联。所有实验进行三次。从实验获得图7-3中所示结果，并且确认，甚至在其中生物素化的小鼠CD3和小鼠CTLA4可以存在于同一珠子上的情况下，抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体交联供体珠子和接纳体珠子，如图7-4中所示。

认为生物素化的小鼠CD3和小鼠CTLA4结合在供体珠子上的情况模拟调节性T细胞(表达CTLA4和CD3)，并且认为小鼠CD3-缀合的接纳体珠子模拟效应T细胞(表达CD3)。确认在该条件下，抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体也将供体珠子与接纳体珠子交联，这提示，甚至对于调节性T细胞和效应T细胞，抗-CTLA4/抗-CD3双特异性抗体可能能够以类似方式在两种细胞之间形成交联。

[实施例5]使用抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)的体内药物效力评价(肿瘤内施用)

验证通过实施例2-1的方法纯化和制备的抗-小鼠CTLA4抗体hUH02hUL01-mFa55和通过实施例3-1的方法纯化和制备的抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)是否显示针对小鼠结直肠癌细胞系的体内药物效力。将1x 10⁶个小鼠结直肠癌细胞系CT26.WT细胞(ATCC)皮下移植入BALB/c小鼠(Japan Charles River)的右腹，建立实体肿瘤。移植后十天，hUH02hUL01-mFa55以200μg/小鼠的剂量肿瘤内(i.t.)施用并且hUH02UL01/2C11-F760以100μg/小鼠的剂量肿瘤内(i.t.)施用(对于每组n＝2)。结果说明，与hUH02hUL01-mFa55相比，hUH02UL01/2C11-F760显示更强的抗肿瘤效应，并且显示显著的体内抗肿瘤效应(图8)。更具体地，结果提示，hUH02UL01/2C11-F760识别调节性T细胞(表达CTLA4和CD3)和效应T细胞(表达CD3)的表面抗原，并且引起两种细胞在体内交联。

[实施例6]抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)的体内药物效力评价(在肿瘤内施用和静脉内施用之间进行比较)

对通过实施例3-1的方法纯化和制备的抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)评估其是否显示对实施例5中所述小鼠结直肠癌细胞系CT26.WT-移植模型的药物效力(甚至当静脉内(i.v.)施用时)。将1x 10⁶ CT26.WT细胞(ATCC)皮下移植入BALB/c小鼠(Japan Charles River)的右腹，建立实体肿瘤。移植后八天，将hUH02UL01/2C11-F760以100μg/小鼠的剂量肿瘤内(i.t.)或静脉内(i.v.)施用(对于每组n＝5)。结果说明，在肿瘤内和静脉内施用中，hUH02UL01/2C11-F760显示相当的抗肿瘤效应，并且不论是局部施用还是系统施用，显示体内抗肿瘤效应(图9)。

[实施例7]抗-人CTLA4/抗-人CD3双特异性抗体的体外药物效力评价

(7-1)特异结合人CTLA4和人CD3的双特异性抗体的表达和纯化

将编码抗-人CTLA4抗体MDX10-F760nN17的可变区(重链可变区MDX10H是SEQ IDNO：38，并且轻链可变区MDX10L是SEQ ID NO：39)的基因各自插入人IgG1/κ质粒，用于在动物中表达。在本文中，使用修饰以降低对Fcγ受体的结合和产生两条重链的异源关联的恒定区(重链恒定区F760nN17是SEQ ID NO：33，并且轻链恒定区k0是SEQ ID NO：34)。

将编码抗-人CD3抗体TR01H113-F760mG3P17的可变区(重链可变区TR01H113是SEQID NO：40，并且轻链可变区L0011是SEQ ID NO：41)的基因各自插入人IgG1/κ质粒中，用于在动物中表达。在本文中，使用修饰以降低对Fcγ受体的结合和产生两条重链的异源关联的恒定区(重链恒定区F760nG3P17是SEQ ID NO：42，并且轻链恒定区k0是SEQ ID NO：34)。

MDX10-F760nN17和TR01H113-F760nG3P17中的每个通过实施例2中所示方法表达和纯化。将每种纯化的同源形式以表3中所示组合混合，并且将研究的双特异性抗体通过本领域技术人员已知的方法生产(WO2015/046467)。

表3

编号	克隆名称	抗体1	抗体2
				1	MDX10//TR01H113	MDX10-F760nN17	TR01H113-F760nG3P17

此外，存在其他形成双特异性抗体的技术。实例包括：使用抗体CH1和CL的关联，和VH和VL的关联的抗体生产方法，如WO 201I/028952，WO2014/018572，和NatBiotechnol.2014Feb；32(2)：191-8中所述；使用CH1和CL或VH和VL的关联的方法，其在ProcNatl Acad Sci U S A.2011Jul5；108(27)：11187-92，WO2009/080251，WO2009/080252，和WO2009/080253中描述；调节抗体重链CH3之间的关联的方法，其在WO2012/058768和WO2013/063702中描述；利用CH1和CL的电荷调节的方法，其在WO2006/106905中描述；和利用VH和VL的电荷调节的方法，其在WO2013/065708中描述。研究的双特异性抗体可以通过将上述技术用于抗-人CTLA4抗体(重链可变区MDX10H是SEQ ID NO：38，并且轻链可变区MDX10L是SEQ ID NO：39)和抗-人CD3抗体(重链可变区TR01H113是SEQ ID NO：40，并且轻链可变区L0011是SEQ ID NO：41)来生产。

(7-2)抗-人CTLA4/抗-人CD3双特异性抗体对调节性T细胞的体外细胞毒活性

使用来自两名健康供体肝素收集血液。将每个血液样品用含有5％FBS(MoregateBioTech)的HBSS(GIBCO)稀释，并且随后放置在Ficoll-Paque Plus(GE healthcare)上。将其在400x g离心30分钟以分离外周血单核细胞(PBMC)级分。以5x 10⁵细胞/孔，使用含有10％FBS，和100单位/mL青霉素-100μg/mL链霉素(GIBCO)的RPMI 1640(Nacalai Tesque)培养基，将获得的PBMC种在96-孔圆底平板(Corning)上。

将对照抗体(抗-KLH人IgG1重链可变区IC17H是SEQ ID NO：43，轻链可变区IC17L是SEQ ID NO：44，重链恒定区hIgG1d是SEQ ID NO：45，并且轻链恒定区k0是SEQ ID NO：34)或MDX10//TR01H113用培养基稀释以分别产生0.1μg/mL，1μg/mL，或10μg/mL的终浓度，并加入孔中。将细胞在设为37℃和5％CO₂的CO₂温箱中培养七天。

七天后，将细胞转入V-底平板(Corning)，并在400x g离心五分钟以移除上清液。将细胞重悬在用含有1％FBS和2mM EDTA(Sigma)的PBS(FACS缓冲液)稀释十倍的100μL的FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)中。在室温孵育十分钟后，将2.5μL的PerCP-Cy5.5小鼠抗-人CD4(BDPharmingen)，5μL的PE小鼠抗-人CD25(BD Pharmingen)，和2.5μL的PE-Cy7小鼠抗-人CD45RA(BD Pharmingen)加入每个孔中。在4℃孵育一小时后，加入100μL的FACS缓冲液。在400x g进行离心五分钟以移除上清。

基于细胞内固定和渗透缓冲液套件(Intracellular Fixation andPermeabilization buffer set)(eBioscience)的方案，依次加入100μL人FoxP3缓冲液，在黑暗中将其在室温孵育十分钟。随后，在400x g进行离心五分钟，移除上清。依次加入100μL渗透缓冲液，在黑暗中将其在室温孵育30分钟。接着，依次加入100μL的FACS缓冲液，以400xg进行离心五分钟，移除上清。再次进行该洗涤步骤。

将细胞重悬在100μL FACS缓冲液中，依次加入5μL的Alexa Fluor488抗-人FoxP3(BioLegend)，在暗处将其在室温孵育30分钟。加入100μL的FACS缓冲液，并且在400x g进行离心五分钟以移除上清。再次进行该洗涤步骤。将细胞重悬在200μL的FACS缓冲液中，并且在FACSCantoII流式细胞仪(BD)上分析。

使用FACSDiva软件(BD)进行表达分析。从进行分析的细胞群圈出(gate)CD4-阳性细胞并分析CD25和CD45RA的表达。CD25^高CD45RA-级分和CD25-CD45RA+级分分别认为是调节性T细胞(Treg)和效应T细胞(Teff)。此外，FoxP3^高CD45RA-级分和FoxP3-CD45RA+级分分别认为是Treg和Teff。从CD4-阳性细胞中存在的Treg和Teff的比例计算Teff/Treg比例。

显示基于CD25和CD45RA的表达分析CD4-阳性细胞的结果(图10-1)。在供体1中，用1μg/mL和10μg/mL的MDX10//TR01H113治疗显示Treg的减少。在供体2中，1μg/mL的治疗显示Treg的减少的趋势，并且以10μg/mL治疗显示Treg的显著降低(图10-2)。在两个供体中，用1μg/mL和10μg/mL的MDX10//TR01H113治疗增加Tefff/Treg比例(图10-3)。

此外，基于FoxP3和CD45RA的表达分析Treg的结果在图11-1中显示。类似于使用CD25和CD45RA的分析，用MDX10//TR01H113治疗减少Treg并且增加Teff/Treg比例(图11-2和11-3)。

根据这些检查，就针对表达CTLA4的调节性T细胞在小鼠体内的细胞毒活性而言，显示更强抗肿瘤效应的TRAB(针对CTLA4和CD3的双特异性抗体)，还显示针对调节性T细胞的在人体外的强烈的细胞毒活性；因此，预期TRAB表现出针对癌症患者的强烈的抗肿瘤效应。

[实施例8]已经报道具有高免疫应答抑制功能的细胞级分(CD4⁺，CD25^高，CD45RA^-)中表达的表面分子的分析

已经报道，具有免疫应答抑制功能的细胞，基于CD25和CD45RA表达计算的CD4-阳性T细胞中的调节性T细胞(Treg)(其是CD4⁺CD25^高CD45RA^-细胞级分)具有高的免疫应答抑制功能(Immunity，2009，30(6)，899-911)。基于该信息，使用RNA-seq鉴别编码在CD4-阳性细胞中的CD25^高CD45RA-细胞级分中显示显著高表达的细胞表面分子的基因。结果，在CTLA4、PD1、TIM3、LAG3、CD244(2B4)、CD160、GARP、OX40、CD137(4-1BB)、CD25、VISTA、BTLA、TNFR25、CD57、KLRG1、CCR2、CCR5、CCR6、CD39、CD73、CD4、CD18、CD49b、CD1d、CD5、CD21、TIM1、CD19、CD20、CD23、CD24、CD38、CD93、IgM、B220(CD45R)、CD317、PD-L1、CD11b、Ly6G、ICAM-1、FAP、PDGFR、Podoplanin和TIGIT(其是具有免疫应答抑制功能的细胞表面上表达的分子)中，发现九种分子(其是CTLA4、TIM3、LAG3、CD137(4-1BB)、CD25、CCR5、CCR6、CD38和TIGIT)是特别在已经报道具有高免疫应答抑制功能的细胞级分(CD4⁺、CD25^高、CD45RA-)中高表达的细胞表面分子。

[实施例9]抗-人LAG3/抗-人CD3双特异性抗体的体外药物效力评价

(9-1)特异结合人LAG3和人CD3的双特异性抗体的表达和纯化

将编码抗-人LAG3抗体25F7-F760nN17的可变区(重链可变区25F7H是SEQ ID NO：46，并且轻链可变区25F7L是SEQ ID NO：47)的基因各自插入人IgG1/κ质粒中，用于在动物中表达。在本文中，使用修饰以降低对Fcγ受体的结合和产生两条重链的异源关联的恒定区(重链恒定区F760nN17是SEQ ID NO：33，并且轻链恒定区k0是SEQ ID NO：34)。

将编码抗-人CD3抗体TR01H113-F760nG3P17的可变区(重链可变区TR01H113是SEQID NO：40，并且轻链可变区L0011是SEQ ID NO：41)的基因各自插入人IgG1/κ质粒中，用于在动物中表达。在本文中，使用修饰以降低对Fcγ受体的结合和产生两条重链的异源关联的恒定区(重链恒定区F760nG3P17是SEQ ID NO：42，并且轻链恒定区k0是SEQ ID NO：34)。

将25F7-F760nN17和TR01H113-F760nG3P17中的每种通过实施例2中所示方法表达和纯化。将每种纯化的同源形式以表4中所示组合混合，并且通过本领域技术人员已知的方法生产研究的双特异性抗体(WO2015/046467)。

表4

编号	克隆名称	抗体1	抗体2
				1	25F7//TR01H113	25F7-F760nN17	TR01H113-F760nG3P17

(9-2)抗-人LAG3/抗-人CD3双特异性抗体对调节性T细胞的体外细胞毒活性

使用来自健康供体的肝素收集血液。将每种血液样品用PBS稀释并且随后与Ficoll-Paque Plus(GE healthcare)一起置于Leucosep tube(greiner bio-one)中。将其在1000x g离心10分钟以分离外周血单核细胞(PBMC)级分。使用含有10％FBS，和100单位/mL青霉素-100μg/mL链霉素(GIBCO)的RPMI 1640(Nacalai Tesque)培养基，以1x 10⁶细胞/孔将获得的PBMC种在96-孔圆底平板(Corning)中。

将TRAB(25F7//TR01H113)以1μg/mL或10μg/mL的终浓度用培养基稀释，并加入孔中。将细胞在设为37℃和5％CO₂的CO₂温箱中培养四或六天。

四或六天之后，将细胞转至用于FACS分析的管中，并在400x g离心五分钟以移除上清。制备含有0.2％BSA(Wako)的CELL WASH(BD Biosciences)，并将其用作FACS缓冲液。为了完全移除培养基成分，通过将2mL的FACS缓冲液加入至细胞进行洗涤，由此移除上清并在400x g再次进行离心五分钟以移除上清。

制备用FACS缓冲液稀释十倍的FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)(向其中加入1/1000体积的用于将死细胞染色的eFluor780(eBioscience))并用作染色缓冲液。将通过将5μL的PerCP小鼠抗-人CD4(BD Pharmingen)，2.5μL的PE-Cy^TM7小鼠抗-人CD45RA(BDPharmingen)，和5μL的PE小鼠抗-人CD25加入至50μL的染色缓冲液产生的溶液置于每个管中。在4℃孵育一小时后，加入2mL的FACS缓冲液，并且在400xg进行离心五分钟以移除上清。然后，作为洗涤步骤，加入另外2mL的FACS缓冲液，并且在400x g进行离心五分钟以移除上清。将细胞重悬在400μL的FACS缓冲液中并在FACSVerse^TM流式细胞仪(BD)上分析。

使用FACSDiva软件(BD)进行表达分析。从进行分析的细胞群(从中移除死细胞)圈出CD4-阳性细胞，并分析CD25和CD45RA的表达。CD25^高CD45RA^-级分和CD25^-CD45RA⁺级分分别认为是调节性T细胞(Treg)和效应T细胞(Teff)。从CD4-阳性细胞中存在的Treg和Teff的比例计算Teff/Treg比例。

显示基于CD25和CD45RA的表达分析CD4-阳性细胞的结果(图13)。用1μg/mL和10μg/mL的TRAB(25F7//TR01H113)治疗显示，在治疗后4和六天，Treg以TRAB抗体剂量-依赖的方式减少(图14)。用1μg/mL和10μg/mL的TRAB(25F7//TR01H113)治疗增加Teff/Treg比例(图15)。

[实施例10]抗-人OX40/抗-人CD3双特异性抗体的体外药物效力评价

(10-1)特异结合人OX40和人CD3的双特异性抗体的表达和纯化

将编码抗-人OX40抗体12H3-F760nN17的可变区(重链可变区12H3VH是SEQ ID NO：48，并且轻链可变区12H3VL是SEQ ID NO：49)的基因各自插入人IgG1/κ质粒中，用于在动物中表达。在本文中，使用修饰以降低对Fcγ受体的结合和产生两条重链的异源关联的恒定区(重链恒定区F760nN17是SEQ ID NO：33，并且轻链恒定区k0是SEQ ID NO：34)。

将编码抗.人CD3抗体TR01H113-F760nG3P17的可变区(重链可变区TR01H113是SEQID NO：40，并且轻链可变区L0011是SEQ ID NO：41)的基因各自插入人IgG1/κ质粒中，用于在动物中表达。在本文中，使用修饰以降低对Fcγ受体的结合和产生两条重链的异源关联的恒定区(重链恒定区F760nG3P17是SEQ ID NO：42，并且轻链恒定区k0是SEQ ID NO：34)。

将12H3-F760nN17和TR01H113-F760nG3P17中的每种通过实施例2中所示方法表达和纯化。将每种纯化的同源形式以表5中所示组合混合，并且通过本领域技术人员已知的方法生产研究的双特异性抗体(WO2015/046467)。

表5

编号	克隆名称	抗体1	抗体2
				1	12H3//TR01H113	12H3-F760nN17	TR01H113-F760nG3P17

(10-2)抗-人OX40/抗-人CD3双特异性抗体对调节性T细胞的体外细胞毒活性

使用来自健康供体的肝素收集血液。将每种血液样品用PBS稀释并且随后与Ficoll-Paque Plus(GE healthcare)一起置于Leucosep tube(greiner bio-one)中。将其在1000xg离心10分钟以分离外周血单核细胞(PBMC)级分。使用含有10％FBS，和100单位/mL青霉素-100μg/mL链霉素(GIBCO)的RPMI 1640(Nacalai Tesque)培养基，以1x10⁶细胞/孔将获得的PBMC种在96-孔圆底平板(Corning)中。

将TRAB(12H3//TR01H113)以1μg/mL或10μg/mL的终浓度用培养基稀释，并加入孔中。将细胞在设为37℃和5％CO₂的CO₂温箱中培养七天。

七天之后，将细胞转至用于FACS分析的管中，并在400x g离心五分钟以移除上清。制备含有0.2％BSA(Wako)的CELL WASH(BD Biosciences)，并将其用作FACS缓冲液。为了完全移除培养基成分，通过将2mL的FACS缓冲液加入至细胞进行洗涤，由此移除上清并在400xg再次进行离心五分钟以移除上清。

制备用FACS缓冲液稀释十倍的FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)(向其中加入1/1000体积的用于将死细胞染色的eFluor780(eBioscience))并用作染色缓冲液。将通过将5μL的PerCP小鼠抗-人CD4(BD Pharmingen)，2.5μL的PE-Cy^TM7小鼠抗-人CD45RA(BDPharmingen)，和5μL的PE小鼠抗-人CD25加入至50μL的染色缓冲液产生的溶液置于每个管中。在4℃孵育一小时后，加入2mL的FACS缓冲液，并且在400x g进行离心五分钟以移除上清。然后，作为洗涤步骤，另外加入2mL的FACS缓冲液，并且在400x g进行离心五分钟以移除上清。将细胞重悬在400μL的FACS缓冲液中并在FACSVerse^TM流式细胞仪(BD)上分析。

使用FACSDiva软件(BD)进行表达分析。从进行分析的细胞群(从中移除死细胞)圈出CD4-阳性细胞，并分析CD25和CD45RA的表达。CD25^高CD45RA^-级分和CD25-CD45RA+级分分别认为是调节性T细胞(Treg)和效应T细胞(Teff)。从CD4-阳性细胞中存在的Treg和Teff的比例计算Teff/Treg比例。

显示基于CD25和CD45RA的表达分析CD4-阳性细胞的结果(图16)。用1μg/mL和10μg/mL的TRAB(12H3//TR01H113)治疗显示Treg以TRAB抗体剂量-依赖的方式的减少(图17)。用1μg/mL和10μg/mL的TRAB(12H3//TR01H113)治疗增加Teff/Treg比例(图18)。

[参考实施例1]使用表达小鼠FcgR4的人NK细胞系NK-92作为效应细胞的测试抗体的ADCC活性

关于抗-小鼠CTLA4抗体，通过以下所述方法，使用表达小鼠FcgR4的人NK细胞系NK-92(下文也称为mFcgR4-NK92)作为效应细胞，测量测试抗体的抗体浓度-依赖性ADCC活性。

(1)mFcgR4-NK92溶液的制备

在用含有10％FBS的RPMI-1640(nacalai tesque)(下文也称为10％FBS/RPMI)洗涤mFcgR4-NK92后，将细胞以4x 10⁵细胞/ml的细胞密度悬浮在10％FBS/RPMI中。在后续实验中将该细胞悬浮液用作mFcgR4-NK92溶液。

(2)靶细胞的制备

向2x 10⁶ CHO/小鼠CTLA4细胞(其是促使表达小鼠CTLA4的CHO细胞)中加入3.7MBq的Cr-51。将加入Cr-51的细胞在5％二氧化碳气体温箱中在37℃孵育一小时，然后用10％FBS/RPMI洗涤三次，并随后以2x10⁵细胞/ml的细胞密度悬浮在10％FBS/RPMI中。在后续实验中将该细胞悬浮液用作靶细胞。

(3)铬释放测定(ADCC活性)

根据铬释放方法，从具体铬释放速率评价ADCC活性。首先，将以每个浓度(0，0.04，0.4，4，和40μg/ml)制备的抗体溶液以50μl/孔加入至96-孔U-形底平板中。接着，在(2)中制备的靶细胞以50μl/孔接种(1x 10⁴细胞/孔)。此外，以50μl/孔加入10％FBS/RPMI，并且让平板在室温静置15分钟。将(1)中制备的mFcgR4-NK92溶液以50μl/孔加入(2x 10⁴细胞/孔)，将平板在5％二氧化碳气体温箱中在37℃静置四小时，并且将产物离心。使用γ计数器测量平板的每个孔中100μl培养上清的放射活性。基于以下公式确定具体铬释放率。

铬释放率(％)＝(A-C)x 100/(B-C)

在该公式中，“A”表示每个孔中100μl培养上清的放射活性(cpm)的平均值；“B”表示其中已经将50μl的4％NP-40水溶液(Nonidet P-40，Nacalai Tesque)和100μl的10％FBS/RPMI加入至靶细胞的孔中100μl培养上清的放射活性(cpm)的平均值；并且“C”表示其中已经将150μl的10％FBS/RPMI加入至靶细胞的孔中100μl的培养上清的放射活性(cpm)的平均值。一式两份进行检测并且计算测试抗体的具体铬释放速率(％)的平均值。

[参考实施例2]使用小鼠脾细胞作为效应细胞测量测试抗体的细胞毒活性的

关于抗-小鼠CTLA4/抗-小鼠CD3双特异性抗体(hUH02UL01/2C11-F760)，使用小鼠脾细胞作为效应细胞，并通过下述方法测量测试抗体的抗体浓度-依赖性细胞毒活性。

(1)小鼠脾细胞溶液的制备

将10mL的10％FBS/RPMI加入至从BALB/c小鼠切下的脾。将脾切成小块并通过细胞滤器。离心(在室温2，150rpm十分钟)后，使用小鼠红细胞裂解试剂盒(R&D Systems)进行溶血步骤。用10％FBS/RPMI洗涤一次后，将细胞在10％FBS/RPMI中以6x 10⁶细胞/ml的细胞密度悬浮。在后续实验中将该细胞悬浮液用作小鼠脾细胞溶液。

(2)细胞毒活性评价测定

使用xCELLigence实时细胞分析仪(Roche Diagnostics K.K.)通过细胞增殖抑制率评价细胞毒活性。CHO/mCTLA4(其是促使表达小鼠CTLA4的CHO)用作靶细胞。将细胞悬浮在含有10％FBS的CHO-S-SFM II(Life technologies)中，并以100μl的等分部分以5x 10³细胞/孔种入E-Plate 96平板(Roche Diagnostics K.K.)。活细胞的测量使用xCELLigence实时细胞分析仪开始。次日，将板从xCELLigence实时细胞分析仪移开，并将50ul的以各个浓度(0.04，0.4，4，或40μg/ml)制备的各个抗体加入板中。让其在室温静置15分钟后，加入50μl的(1)中制备的小鼠脾细胞溶液(3x 10⁵细胞/孔)。通过再次将平板置于xCELLigence实时细胞分析仪中，起始活细胞的测量。在5％二氧化碳气体温箱中在37℃进行反应，并且从在加入小鼠脾细胞溶液后72小时获得的细胞指数值(Cell Index value)，使用以下公式确定细胞增殖抑制率(％)。用于计算的细胞指数值是标准化的值，其中恰好在加入抗体之前的细胞指数值定义为1。

细胞增殖抑制率(％)＝(A-B)x 100/(A-1)

“A”表示不加入抗体(仅含有靶细胞和人PBMC)的孔中的细胞指数值的平均值，并且“B”表示每个孔中的细胞指数值的平均值。检测一式两份进行。

工业实用性

本发明提供具有优异的抗肿瘤活性的新的抗原结合分子或药物组合物。包含本发明所述的抗原结合分子作为活性成分的药物组合物抑制免疫应答抑制功能，并且因此活化细胞毒性作用并使得能够治疗和预防各种癌症。

序列表

<110> 中外制药株式会社

国立大学法人大阪大学

<120> 用于具有免疫抑制功能的细胞的T细胞重定向的抗原结合分子

<130> C1-A1402P

<150> JP 2014-099707

<151> 2014-05-13

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 3

<211> 377

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

115 120 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

130 135 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

145 150 155 160

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

165 170 175

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

180 185 190

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

195 200 205

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

210 215 220

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225 230 235 240

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

245 250 255

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

260 265 270

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

275 280 285

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

290 295 300

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305 310 315 320

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

325 330 335

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

340 345 350

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

355 360 365

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 4

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

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Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

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Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 5

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 5

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 6

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

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Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

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260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

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Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 7

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

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Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 8

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

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Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

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<212> PRT

<213> 智人

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Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

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Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

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Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

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<212> PRT

<213> 智人

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Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

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Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

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la Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

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Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

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65 70 75 80

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100 105 110

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Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

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Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

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Ser Arg Gly

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<212> PRT

<213> 智人

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Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu

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Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys

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Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr

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Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu

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Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu

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Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

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<212> PRT

<213> 智人

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Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro

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Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Ile Ile Lys Ile His Trp Gln Glu Lys

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Gly Ile Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val Thr

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Thr Val Asp Pro Lys Tyr Asn Tyr Ser Lys Asp Ala Asn Asp Val Ile

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<212> PRT

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Pro Ser Tyr Thr Gly Gly Tyr Ala Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly

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Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser

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Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile

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Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe

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Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe

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Leu

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<212> DNA

<213> 智人

<400> 14

atggaacagg ggaagggcct ggctgtcctc atcctggcta tcattcttct tcaaggtact 60

ttggcccagt caatcaaagg aaaccacttg gttaaggtgt atgactatca agaagatggt 120

tcggtacttc tgacttgtga tgcagaagcc aaaaatatca catggtttaa agatgggaag 180

atgatcggct tcctaactga agataaaaaa aaatggaatc tgggaagtaa tgccaaggac 240

cctcgaggga tgtatcagtg taaaggatca cagaacaagt caaaaccact ccaagtgtat 300

tacagaatgt gtcagaactg cattgaacta aatgcagcca ccatatctgg ctttctcttt 360

gctgaaatcg tcagcatttt cgtccttgct gttggggtct acttcattgc tggacaggat 420

ggagttcgcc agtcgagagc ttcagacaag cagactctgt tgcccaatga ccagctctac 480

cagcccctca aggatcgaga agatgaccag tacagccacc ttcaaggaaa ccagttgagg 540

aggaattga 549

<210> 15

<211> 182

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu

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Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys

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Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala

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Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe

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Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp

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Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro

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Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala

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Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln

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Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr

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Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly

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180

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<211> 516

<212> DNA

<213> 智人

<400> 16

atggaacata gcacgtttct ctctggcctg gtactggcta cccttctctc gcaagtgagc 60

cccttcaaga tacctataga ggaacttgag gacagagtgt ttgtgaattg caataccagc 120

atcacatggg tagagggaac ggtgggaaca ctgctctcag acattacaag actggacctg 180

ggaaaacgca tcctggaccc acgaggaata tataggtgta atgggacaga tatatacaag 240

gacaaagaat ctaccgtgca agttcattat cgaatgtgcc agagctgtgt ggagctggat 300

ccagccaccg tggctggcat cattgtcact gatgtcattg ccactctgct ccttgctttg 360

ggagtcttct gctttgctgg acatgagact ggaaggctgt ctggggctgc cgacacacaa 420

gctctgttga ggaatgacca ggtctatcag cccctccgag atcgagatga tgctcagtac 480

agccaccttg gaggaaactg ggctcggaac aagtga 516

<210> 17

<211> 171

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu

1 5 10 15

Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg

20 25 30

Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val

35 40 45

Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile

50 55 60

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys

65 70 75 80

Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys

85 90 95

Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val

100 105 110

Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His

115 120 125

Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg

130 135 140

Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr

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Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

165 170

<210> 18

<211> 624

<212> DNA

<213> 智人

<400> 18

atgcagtcgg gcactcactg gagagttctg ggcctctgcc tcttatcagt tggcgtttgg 60

gggcaagatg gtaatgaaga aatgggtggt attacacaga caccatataa agtctccatc 120

tctggaacca cagtaatatt gacatgccct cagtatcctg gatctgaaat actatggcaa 180

cacaatgata aaaacatagg cggtgatgag gatgataaaa acataggcag tgatgaggat 240

cacctgtcac tgaaggaatt ttcagaattg gagcaaagtg gttattatgt ctgctacccc 300

agaggaagca aaccagaaga tgcgaacttt tatctctacc tgagggcaag agtgtgtgag 360

aactgcatgg agatggatgt gatgtcggtg gccacaattg tcatagtgga catctgcatc 420

actgggggct tgctgctgct ggtttactac tggagcaaga atagaaaggc caaggccaag 480

cctgtgacac gaggagcggg tgctggcggc aggcaaaggg gacaaaacaa ggagaggcca 540

ccacctgttc ccaacccaga ctatgagccc atccggaaag gccagcggga cctgtattct 600

ggcctgaatc agagacgcat ctga 624

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<211> 207

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

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Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg

180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 20

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 21

Ser Gly Gly Gly

1

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 23

Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 24

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 24

Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 25

Ser Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 26

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 27

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 28

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Gly Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Phe Ile Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Ile

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

eu Gln Val Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 29

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser

20 25 30

Asn Ala Lys Thr Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Trp Tyr Asp Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 30

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 30

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

145 150 155 160

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

165 170 175

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

180 185 190

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

195 200 205

Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

210 215 220

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

245 250 255

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu

260 265 270

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

275 280 285

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

290 295 300

er Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

305 310 315 320

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

325 330

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 31

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

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Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 32

<211> 330

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 32

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

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Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

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Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

145 150 155 160

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

165 170 175

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

180 185 190

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

195 200 205

Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

210 215 220

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

245 250 255

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu

260 265 270

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

275 280 285

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

290 295 300

Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

305 310 315 320

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

325 330

<210> 33

<211> 328

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 33

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

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<210> 35

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Lys

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Ser Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Thr Ser Ser Ser Ile Asn Ile Lys Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Leu Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ile Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Asp Trp Asp Lys Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Asn Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Ser Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 328

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 37

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

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Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 38

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 39

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 39

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser

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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

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Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 41

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Pro Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

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Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 42

<211> 328

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 42

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 43

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 43

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

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Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Met Ile Asp Pro Ser Tyr Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 44

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile

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65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

100 105

<210> 45

<211> 328

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 45

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 46

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 46

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 47

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 48

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro

115 120

<210> 49

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 49

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims (18)

1.抑制具有免疫应答抑制功能的细胞的免疫应答抑制活性的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：

(i)结合具有免疫应答抑制功能的细胞表面上表达的分子的结构域；和

(ii)T细胞受体复合体结合结构域。

2.权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述具有免疫应答抑制功能的细胞是调节性T细胞或耗竭的T细胞。

3.权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述具有免疫应答抑制功能的细胞表面上表达的分子是选自CTLA4、PD1、TIM3、LAG3、CD244(2B4)、CD160、GARP、OX40、CD137(4-1BB)、CD25、VISTA、BTLA、TNFR25、CD57、KLRG1、CCR2、CCR5、CCR6、CD39、CD73、CD4、CD18、CD49b、CDld、CD5、CD21、TIM1、CD19、CD20、CD23、CD24、CD38、CD93、IgM、B220(CD45R)、CD317、PD-L1、CD11b、Ly6G、ICAM-1、FAP、PDGFR、Podoplanin和TIGIT的任意分子。

4.权利要求3所述的抗原结合分子，其中所述具有免疫应答抑制功能的细胞表面上表达的分子是选自CTLA4、TIM3、LAG3、CD137(4-1BB)、CD25、CCR5、CCR6、CD38、TIGIT和OX40的任意分子。

5.权利要求1至4中任一项所述的抗原结合分子，其中所述T细胞受体复合体结合结构域是T细胞受体结合结构域。

6.权利要求1至4中任一项所述的抗原结合分子，其中所述T细胞受体复合体结合结构域是CD3结合结构域。

7.权利要求1至6中任一项所述的抗原结合分子，所述抗原结合分子还包含FcRn结合结构域。

8.权利要求7所述的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域是抗体的Fc区。

9.权利要求8所述的抗原结合分子，其中所述FcRn结合结构域是具有降低的Fcγ受体结合活性的抗体的Fc区。

10.权利要求1至9中任一项所述的抗原结合分子，所述抗原结合分子是多特异性抗体。

11.药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子作为活性成分。

12.用于抑制免疫应答抑制活性的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至10中任一项所述的抗原结合分子作为活性成分。

13.权利要求12所述的药物组合物，其中对免疫应答抑制活性的抑制是由T细胞引起的抑制。

14.权利要求13所述的药物组合物，其中所述由T细胞引起的抑制是由T细胞的细胞毒活性造成的抑制。

15.权利要求12至14中任一项所述的药物组合物，其中所述免疫应答抑制活性是由调节性T细胞或耗竭的T细胞导致的活性。

16.权利要求12至14中任一项所述的药物组合物，其中所述免疫应答抑制活性是表达选自以下任意分子的细胞的活性：CTLA4、PD1、TIM3、LAG3、CD244(2B4)、CD160、GARP、OX40、CD137(4-1BB)、CD25、VISTA、RTLA、TNFR25、CD57、KLRG1、CCR2、CCR5、CCR6、CD39、CD73、CD4、CD18、CD49b、CD1d、CD5、CD21、TIM1、CD19、CD20、CD23、CD24、CD38、CD93、IgM、B220(CD45R)、CD317、PD-L1、CD11b、Ly6G、ICAM-1、FAP、PDGFR、Podoplanin和TIGIT。

17.权利要求11至16中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物是癌症治疗剂。

18.权利要求17所述的药物组合物，其是用于选自以下任意癌症的治疗剂：卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、乳腺癌、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、成胶质细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、慢性淋巴细胞白血病、甲状腺乳头状癌、结直肠癌、霍奇金淋巴瘤和子宫内膜异位。