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CN106432493A - 抗‑cd40抗体及其用途 - Google Patents

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CN106432493A
CN106432493A CN201510634642.1A CN201510634642A CN106432493A CN 106432493 A CN106432493 A CN 106432493A CN 201510634642 A CN201510634642 A CN 201510634642A CN 106432493 A CN106432493 A CN 106432493A
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S·祖拉夫斯基
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Abstract

本发明包括用于新组合物的表达、分泌及使用的组合物和方法，所述的新组合物用作例如疫苗和抗体递送载体，从而将抗原递送到抗原呈递细胞中。在一个实施方案中，所述的载体是抗‑CD40抗体或其片段，以及一种或多种连接到抗‑CD40抗体或者其片段的抗原肽，所述抗体包括人源化抗体。

Description

抗-CD40抗体及其用途
本申请是申请日为2010年3月5日、申请号为201080020544.4、发明名称为“抗-CD40抗体及其用途”的中国专利申请的分案申请。
发明技术领域
总地来说，本发明涉及免疫领域，以及更具体地，涉及新的抗-CD40抗体和基于抗-CD40抗体的疫苗。
背景技术
在不限制本发明的范围的前提下，本发明的背景与抗原呈递结合描述。授予Ledbetter等人的第7,118,751号美国专利中教导了抗原呈递的疫苗和方法的一个实例，其涉及DNA疫苗，该DNA疫苗编码氨基端抗原，所述的氨基端抗原连接到结合CD40的羧基端功能域。总地来说，教导了将一种或多种抗原靶向细胞表面受体，从而提高抗原特异性的体液及细胞免疫应答的疫苗。将连接到结合于细胞表面受体的功能域的抗原(或多种抗原)内在化，从而将抗原(或多种抗原)转移到细胞内结构(intracellular compartment)中，在所述的细胞内结构中，所述的抗原(或多种抗原)被分解成为肽，并负载到MHC分子上。对所述的肽抗原具有特异性的T细胞被活化，从而导致增强的免疫应答。所述的疫苗可以包括连接到结合至少一种受体的功能域的抗原(或多种抗原)，或者包括编码连接到结合于至少一种受体的功能域的抗原(或多种抗原)的DNA质粒。本发明优选的实施方案将HIV-1 env抗原靶向CD40受体，导致将抗原向CD40阳性细胞的传送，以及选择性地活化将HIV-1 env抗原呈递到T细胞的细胞上的CD40受体。
另一个实例见于Li等人递交的第20080254026号美国专利申请，其涉及抗-CD40单克隆抗体拮抗剂，及其应用的方法。总地来说，公开了用于治疗在表达CD40的细胞上通过激发CD40信号转导所介导的疾病的疗法的组合物和方法。所述的方法包括将治疗上有效量的抗-CD40抗体或其抗原结合片段的拮抗剂给予对其有需要的患者。所述的抗-CD40抗体或其抗原结合片 段的拮抗剂没有显著的激动剂活性，但是当该抗体结合于表达人类CD40的细胞上的CD40抗原时显示拮抗剂活性。所述的抗-CD40抗体或其抗原结合片段的拮抗剂活性有利地抑制表达人类CD40的细胞的增殖和/或分化，所述的表达人类CD40的细胞如B细胞。
由Delucia递交的第20080241139号美国专利申请中教导了再另一个实例，其涉及包含微生物TLR激动剂、CD40或者4-1BB激动剂以及可选地包含抗原的佐剂组合，及其在细胞免疫中诱导协同增强(synergistic enhancement)的用途。总地来说，本申请据称教导了至少包含一种微生物TLR激动剂，CD40或者4-1BB激动剂，以及可选地抗原的佐剂组合；所述的微生物TLR激动剂如整个的病毒、细菌或者酵母或者其部分如膜、原生质球、胞质或者形骸细胞；所述的抗原的所有三个部分可以为分开的，或者公开了其包含同样的重组微生物或者病毒。还提供了这些免疫佐剂在治疗不同的慢性疾病中的用途，所述的慢性疾病如癌症和HIV感染。
由Bernett等人递交的第20080199471号美国专利申请涉及经优化的CD40抗体及使用其的方法。总地来说，该申请据称示教了靶向CD40的抗体，其中所述的抗体包括与亲代抗体相关的至少一种修饰，其中所述的修饰改变对FcγR的亲和性或者与亲代抗体相比，改变效应子的功能。还公开了使用该发明的抗体的方法。
最后，由Tripp等人递交的第20080181915号美国专利申请涉及用于呼吸道合胞体病毒的CD40配体佐剂。总地来说，该申请据称教导了用于增强对宿主中RSV的免疫应答的方法和佐剂，其中所述的方法和佐剂包括CD40结合蛋白的来源。优选地，所述的CD40结合蛋白质是CD40L，并且所述的来源是包括可操作地连接到CD40L编码区域的启动子的载体。由该发明的佐剂和方法产生的提高的免疫应答包括增加的Th1细胞因子表达和增加的抗体产生。
发明内容
在一个实施方案中，本发明是重组抗体或其抗原结合片段，其二者均与CD40结合，所述重组抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区；以及SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区。在一个方面，所述抗体还包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含γ-1、γ-2、γ-3或γ-4人重链恒定区或人重链恒定区的变体。 在一个方面，所述抗体还包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含λ或κ人轻链恒定区。在另一个方面，所述的结合片段选自Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2和双链抗体。在另一个方面，所述抗体包含SEQ ID NO:1、3或6的多肽序列，和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽序列。在另一个方面，所述抗体由杂交瘤抗-CD40_12E12.3F3(ATCC登记号PTA-9854)、抗-CD40_12B4.2C10(保藏提交号HS446,ATCC登记号___)和抗-CD4011B6.1C3(保藏提交号HS440,ATCC登记号____)产生。在另一个方面，在不预先活化树突细胞的前提下，所述抗体能够单独地引起树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IL-12p40或TNFα的至少之一。在一个方面，所述抗体能够引起使用GM-CSF和干扰素α活化的树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IP-10或IL-12p40的至少之一。在另一个方面，所述重组抗体包含与SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区以及与SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区具有至少90％、95％、99％或100％的序列同源性。在另一个方面，所述抗体是人源化的。
本发明的另一个实施方案是包含抗体或其抗原结合片段的组合物，所述组合物与药学上可接受的载体或稀释剂组合，其中所述抗体是权利要求1所述的抗体。
本发明的另一个实施方案是人源化重组抗体或其抗原结合片段，所述人源化重组抗体或其抗原结合片段两者均与CD40结合，所述人源化重组抗体或其抗原结合片段包含：a)SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区；以及b)SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区。在一个方面，所述抗体还包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含γ-1、γ-2、γ-3或γ-4人重链恒定区或所述人重链恒定区的变体。在一个方面，所述抗体还包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含λ或κ人轻链恒定区。在另一个方面，所述的结合片段选自Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2和双链抗体。在另一个方面，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1、3或6的多肽序列，和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽序列。在另一个方面，所述抗体至少包含抗-CD40_12E12.3F3(ATCC登记号PTA-9854)、抗-CD40_12B4.2C10(保藏提交号HS446,ATCC登记号____)和抗-CD4011B6.1C3(保藏提交号HS440,ATCC登记号____)的可变区。在另一个方面，所述人源化抗体包含互补决定区，所述互补决定区为人类抗体构架上的：a)SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区； 以及b)SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区。
本发明的另一个实施方案是包含抗体或其抗原结合片段的组合物，所述组合物与药学上可接受的载体或稀释剂组合，其中所述抗体是权利要求中要求的重组抗体或其抗原结合片段，所述的重组抗体或其抗原片段二者均与CD40结合，所述重组抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区；以及SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区。在另一个方面，所述抗体至少包含抗-CD40_12E12.3F3(ATCC登记号PTA-9854)、抗-CD40_12B4.2C10(保藏提交号HS446,ATCC登记号____)和抗-CD4011B6.1C3(保藏提交号HS440,ATCC登记号____)的可变区。在另一个方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的重链可变区具有90％、95％、99％或100％序列同源性的至少一个可变区。
本发明的另一个实施方案是分离的核酸，所述分离的核酸编码SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽。在一个方面，所述核酸还包含来自对抗体进行人源化的人类抗体的核酸序列。在另一个方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的重链可变区具有90％、95％、99％或100％序列同源性的至少一个可变区。
本发明的另一个实施方案是包含分离的核酸的表达载体，所述分离的核酸编码SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽，所述的核酸与控制序列可操作地连接，所述控制序列由使用该载体转染的宿主细胞识别。在另一个方面，所述抗体包含与SEQID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的重链可变区具有90％、95％、99％或100％序列同源性的至少一个可变区。
本发明的另一个实施方案是包含编码分离的核酸的载体的宿主细胞，所述分离的核酸编码SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽。在另一个方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的重链可变区具有90％、95％、99％或100％序列同源性的至少一个可变区。
本发明的另一个实施方案是生产多肽的方法，所述方法包括：在表达核酸序列的条件下，培养包含分离的核酸的宿主细胞，从而生产多肽，所述分离的核酸编码SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽；和从宿主细胞中回收多肽。在另一个方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的重链可变区具有90％、95％、99％或100％序列同源性的至少一个可变区。
本发明的另一个实施方案是包含分离的核酸的表达载体，所述分离的核酸编码SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽，所述核酸与控制序列可操作地连接，所述控制序列由使用该载体转染的宿主细胞识别。在另一个方面，所述抗体包含与SEQ IDNO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的重链可变区具有90％、95％、99％或100％序列同源性的至少一个可变区。
本发明的另一个实施方案是生产多肽的方法，所述方法包括：在表达核酸序列的条件下，培养包含载体的宿主细胞从而生产多肽，所述的载体包含分离的核酸，所述分离的核酸编码SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽；和从宿主细胞中回收多肽。
本发明的另一个实施方案是分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码对CD40特异性的抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO:9、10、11、12或14的核酸序列的轻链和具有SEQID NO:8、10或13的核酸序列的重链。在一个方面，所述结合片段是选自Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2和双链抗体的抗体片段。在另一个方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的重链可变区具有90％、95％、99％或100％序列同源性的至少一个可变区。
本发明的另一个实施方案是用于鉴定人源化抗体的受体种系序列的方法，所述方法包括步骤：a)鉴定具有需要的生物活性的非人类抗体，所述抗体选自SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区，以及SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区；b)确定非人类抗体VH和VL区的氨基酸序列；和c)将非人类抗体序列与一组人类种系序列进行比较，其中所述比较包括以下子步骤：1)指出非人类VH和VL区序列的序列残基数；2)标出序列中的CDR和FR区；3)在非人类和人类种系序列相同的每个残基位置指定预定的数值分数；和4)将残基的分数加和从而得到对于各个人类种系序列的总分数；以及d)将具有最高总残基分数的人类种系序列确定为受体种系序列。在一个方面，所述非人类抗体对CD40具有特异性。在另一个方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的重链可变区具有90％、95％、99％或100％序列同源性的至少一个可变区。
本发明的另一个实施方案是通过以下所述的方法产生的抗体，所述方法包括a)鉴定具有需要的生物活性的非人类抗体，所述抗体选自SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区，以及SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区；b)确定非人类抗体VH和VL区的氨基酸序列；和c)将非人类抗体序列与一组人类种系序列进行比较，其中所述比较包括以下子步骤：1)指出非人类VH和VL区序列的序列残基数；2)标出序列中的CDR和FR区；3)在非人类和人类种系序列相同的每个残基位置指定预定的数值评分；和4)将残基的分数加和从而得到对于各个人类种系序列的总分数；以及d)将具有最高总残基分数的人类种系序列鉴定为受体种系序列。在一个方面，所述非人类抗体对CD40具有特异性。在另一个方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的重链可变区具有90％、95％、99％或100％序列同源性的至少一个可变区。
本发明的另一个实施方案是制备抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达重组抗体或其抗原结合片段，所述重组抗体和其抗原结合片段二者均与CD40结合，所述重组抗体包含SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区；和SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区。在一个方面，所述宿主细胞是细菌、真菌、昆虫或哺乳动物细胞。在另一个方面，所述抗体是人源化抗体。在另一个方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:1、3或6和/或SEQ ID NO:2、4、5或7的重链可变区具有90％、95％、99％或100％序列同源性的至少一个可变区。
本发明的另一个实施方案是与CD40结合的重组抗体或其抗原结合片段，其中不预先活化树突细胞的前提下，所述抗体单独地能够引起树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IL-12p40或TNFα的至少之一。在一个方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区以及与SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区具有90％的序列同源性的至少一个可变区。在另一个方面，所述抗体包含SEQ ID NO:1、3或6的多肽序列，SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽序列，或者SEQ ID NO:1、3或6和SEQ ID NO:2、4、5或7两者的多肽序列。在另一个方面，所述抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤选自抗-CD40_12E12.3F3(ATCC登记号PTA-9854)、抗-CD40_12B4.2C10(保藏提交号HS446，登记号____)和抗-CD4011B6.1C3(保藏提交号HS440，登记号____)。在另一个方面， 所述抗体是人源化的。在另一个方面，所述抗体能够引起使用GM-CSF和干扰素α活化的树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IL-10或IL-12p40的至少一种。在另一个方面，所述抗体单独地能够引起B细胞增殖至少10％、20％、25％、28％、30％或35％。
本发明的另一个实施方案是与CD40结合的重组抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体单独地能够引起B细胞增殖至少10％的B细胞。在一个方面，增殖的B细胞的百分比为至少15％、20％、25％、28％、30％或35％。在一个方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区具有90％的序列同源性的至少一个可变区；以及与SEQ ID NO:1、3或7的一个抗体重链可变区具有90％的序列同源性的至少一个可变区。在另一个方面，所述抗体包含SEQ ID NO:1、3或6的多肽序列，SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽序列，或者SEQID NO:1、3或6和SEQ ID NO:2、4、5或7两者的多肽序列。在另一个方面，所述抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤选自抗-CD40_12E12.3F3(ATCC登记号PTA-9854)、抗-CD40_12B4.2C10(ATCC提交号HS446，登记号____)和抗-CD4011B6.1C3(ATCC提交号HS440，登记号____)。在另一个方面，所述抗体是人源化的。在另一个方面，在不预先活化树突细胞的前提下，所述抗体单独地能够引起树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IL-12p40或TNFα的至少一种。在另一个方面，所述抗体能够引起使用GM-CSF和干扰素α活化的树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IP-10、IL-10或IL-12p40的至少一种。
附图说明
为了更完整地理解本发明的特征和优点，在此参考本发明的详细描述及所附的图，并且其中：
图1显示了与不同的HIV肽融合的蛋白质A亲和性重组抗体(第1至5泳道)，所述的重组抗体由经转染的293F细胞分泌，经还原性SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析。
图2显示了与不同的HIV肽融合的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第1和第2泳道)，所述的重组抗体由经转染的293F细胞分泌，随后通过还原性SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析。
图3显示了与不同的HIV肽链融合的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第1到第5泳道)，所述的抗体从转染的293F细胞中分泌，并经还原性 SDS.PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
图4显示了与不同的HIV肽链融合的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第1到第6泳道)，所述的抗体从转染的293F细胞中分泌，然后经还原性SDS.PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
图5描述了在体外使用的方案，用于分析αCD40.LIPO5HIV肽融合重组抗体(αCD40.LIPO5rAb)在PBMC培养物的环境下引发抗原特异性的T细胞扩增的效力。
图6A-C显示了在来自HIV患者的PBMC中，HIV肽特异性的IFNγ的产生，所述的PBMC与不同浓度的抗CD40.LIPO5肽链疫苗进行温育。C是对照组，其未接受疫苗，并且限定了培养物对各个肽的基线反应。
图7是αCD40.LIPO5肽疫苗针对来自8例HIV患者的5个肽区域的反应的总结。
图8A-B显示了αCD40.LIPO5HIV肽疫苗引发能分泌多种细胞因子的HIV肽特异性T细胞的扩增-疫苗的希望得到的特征。图8A-B还显示了αCD40.LIPO5HIV肽引发gag253、nef66、nefl16和po1325肽特异性反应，该反应的特征在于多种细胞因子的产生(患者A5)。
图9显示了用于检测αCD40.LIPO5HIV肽疫苗指导抗原特异性T细胞扩增的能力的方案，所述的T细胞由DC靶向的摄取及呈递在其表面MHC复合物上的肽表位得到。
图10A-B显示了对来自DC-T细胞共培养物的HIV肽作出响应的细胞因子分泌，所述的DC-T细胞共培养物使用不同剂量的αCD40.LIPO5HIV肽疫苗进行处理(患者A10)。
图11A-B显示了用αCD40.LIPO5HIV肽疫苗处理的来自患者A4的PBMC引发对gag253区域具有特异性，而对可变的接头序列无特异性的抗原-特异性T细胞的扩增。
图12A是显示了加粗的可变接头区域，下划线的连接序列和灰色阴影的HIV肽区域的αCD40.LIPO5HIV肽疫苗重链序列。图12A显示了使用αCD40.LIPO5HIV肽疫苗处理的来自患者A3的PBMC引发了抗原特异性T细胞的增殖，所述的抗原特异性T细胞对gag253、nef66和nef116具有特异性，而对可变接头序列没有特异性。图12B-1和B-2显示了由HIV患者A17PBMC与30nM的三种不同的HIV5肽DC靶向疫苗温育所引起的HIV抗原特异性T细胞应答。图12C-1和C-2是与图12B-1和B-2中显示类似的研 究，除了PBMC是来自不同的HIV患者(A2)外。图12D显示了15个不同的HIV肽应答[从3例患者中取样的5个肽区域]，发现抗-CD40.HIV5pep疫苗在引发广泛的HIV肽特异性CD8+和CD4+T应答方面，优于抗-DCIR.HIV5pep、抗-LOX-1.HIV5pep和非-LIPO5的混合物。
图13显示了抗-CD40mAb：IL-4DC的内在化。使用500ng/ml的抗-CD40-Alexa 568处理IL-4DC。
图14显示了由抗-CD40HA1靶向的DC增殖的CD4和CD8T细胞。将负载2ug/m1的抗-CD40-HA或者对照Ig-HA1的5x10e3IFNDC与CFSE标记的自体CD4+或CD8+T细胞(2x10e5)共培养7天。随后使用抗-CD4或者抗-CD8抗体对细胞进行染色。通过测定CFSE的稀释度来检测细胞增殖。
图15显示了HA1融合蛋白对CD4+T增殖的滴定。将负载了融合蛋白的IFNDC(5K)与CFSE标记的CD4+T细胞(200K)共培养7天。
图16显示了由抗-CD40-HA1靶向的IFNDC激活HA1-特异性的CD4+T细胞。使用负载5μM的标记肽的DC再刺激CD4+T细胞，并且随后进行细胞外IFNγ染色。
图17显示了由抗-CD40-HA1靶向的IFNDC激活HA1-特异性的CD4+T细胞。使用负载5μM的标记肽的DC再活化CD4+T细胞36小时，并且随后分析培养物上清液以测定IFNγ。
图18显示了靶向CD40导致了MAR T-1特异性的CD8+T细胞的交叉敏化(crosspriming)增强。将负载融合蛋白的IFNDC(5K/孔)与经纯化的CD8+T细胞共培养10天。使用抗-CD8和四聚体对细胞进行染色。细胞来自健康的供体(HLA-A*0201+)。
图19显示了靶向CD40导致MART-1特异性的CD8+T细胞的交叉敏化增强(使用来自不同的健康供体的细胞进行8次重复实验的总结)。
图20显示了使用抗-CD40-MART-1靶向的IFNDC诱导的CD8+CTL是有功能的。将使用融合蛋白靶向的IFNDC共培养的CD8+T细胞与负载了10μM肽表位的T2细胞混合。
图21显示了使用IFNDC诱导的CD8+CTL是有功能的，所述的IFNDC使用抗-CD40-FluM1进行靶向。将与融合蛋白靶向的IFNDC共培养的CD8+T细胞与负载了1.0nM肽表位的T2细胞混合。
图22显示了测试由连接到PSA(前列腺特异性抗原)的抗-CD4012E12组成的疫苗引发原态T细胞群体扩增的能力的方案的概括。PSA特异性 CD4+T细胞对应于宽范围的PSA表位。总地来说，将与来自健康供体的单核细胞的IFNα和GM-CSF培养得到的DC与该疫苗进行温育。次日，将细胞放置在新鲜的培养基中，并加入相同供体的纯CD4+T细胞。几天之后，加入PSA肽，并且在4小时之后测定在培养物上清液中分泌的γ-IFN水平。
图23显示了多种PSA肽引发强烈的γ-IFN生成反应，这表明抗-CD4012E12和类似的抗-CD40剂可以有效地将抗原递送至DC，导致针对该抗原的多个表位的免疫应答的敏化。
图24显示了抗-CD40-PSA靶向的DC诱导PSA-特异性的CD8+T细胞应答。使用1ugmAb融合蛋白将IFNDC与PSA进行靶向。将经纯化的自体CD8+T细胞共培养10天。使用抗-CD8和PSA(KLQCVDLHV)-四聚体对细胞进行染色。细胞来自HLA-A*0201阳性的健康供体。该结果证实了抗-CD40将PSA有效地递送到DC，而DC反过来引发PSA特异性的CD8+T细胞的扩增。
图25示意图(左)和由肽池的T细胞产生的IFNγ，以及对照表示供体2。将负载2μg/ml的抗-CD40-细胞周期蛋白D1的5x10e3IFNDC与经纯化的自体CD4+T细胞(2x10e5)共培养8天。随后用5μM得自细胞周期蛋白D1的单个肽在布雷菲德菌素甲A(Brefeldin A)的存在下再刺激细胞5小时。对细胞进行染色，从而测定细胞内的IFNγ表达。
图26显示了肽扫描，和在图25所示的由得自肽池的T细胞产生的IFNγ，并且对照表示供体2。将负载2μg/ml的抗-CD40-细胞周期蛋白D1的5x10e3IFNDC与经纯化的自体CD4+T细胞(2x10e5)共培养8天。随后用5μM的得自细胞周期蛋白D1的单个肽在布雷菲德菌素甲的存在下再刺激细胞5小时。对细胞进行染色，从而测定细胞内的IFNγ表达。
图27显示了抗-CD40-MART-1肽抗体的表达和构建体设计。
图28是MART-1的CD4+和CD8+免疫显性表位的总结。
图29显示了抗-CD40-gp100肽抗体的表达和构建体设计。
图30显示了附加的抗-CD40-gp100肽抗体的设计。
图31显示了附加的抗-CD40-gp100肽抗体的表达和构建体设计。
图32是gp100中对CD4+和CD8+免疫显性表位的总结。
图33显示了附加的抗-CD40-gp100肽抗体的表达和构建体设计。
图34显示了使用检测通过CD40连接的测定，利用各种抗体得到的结果-作为细胞死亡读数。
图35显示了当采用doc并随后进行捕获使抗体制备为融合蛋白时的各种构建体的结合。
图36和37比较了在不添加GM-CSF和IFNa(图36A-D)，和单独使用可溶性抗体(图37A-D)与DC温育24小时产生的细胞因子。
图38A-B证实了本发明的不同浓度的抗-CD40抗体对B细胞增殖的效应。
发明描述
尽管在下文中详细讨论了本发明的不同实施方案的制备和使用，应该认识到，本发明提供了多种可实施的发明构思，所述发明构思能在多种特定的环境下实施。在此讨论的特定实施方案仅仅是用于制备及使用本发明的具体方式的说明，而不限制本发明的范围。
为了便于理解本发明，在下文定义了多个术语。在此定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员一般所理解的含义。术语如“一个(a)”，“一个(an)”及“该(the)”不是仅指单个的实体，而是包括其具体实例可以用于说明的大类。本文的术语用于描述本发明的具体实施方式，然而其使用不限制本发明，除非在权利要求中指出。
本发明还包括抗体(或者“Ab”)或其片段的变体和其他改变，例如抗-CD40融合蛋白(抗体与术语“免疫球蛋白”可交换地使用)。如本文中所使用的，术语“抗体或其片段”包括完整的抗体或者抗体的片段，例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、及单链的Fv片段(ScFv)或者任意生物上有效的能特异性地结合于例如CD40的免疫球蛋白片段。与非人类的抗体相比，来自人类或者是人源化抗体在人类中具有降低的免疫原性或者没有免疫原性，并且具有更低数量的免疫原性表位或者没有免疫原性表位。一般地选择在人类中具有降低水平的免疫原性，或者没有免疫原性的抗体及其片段。
如本文中所使用的，术语“Ag”或者“抗原”指能够结合于免疫球蛋白分子的抗原结合区域，或者能够引发免疫应答的物质，所述的免疫应答如通过将抗原呈递到主要组织相容性抗原(MHC)细胞蛋白的T细胞介导的免疫应答。如本文中所使用的，“抗原”包括但不限于抗原决定簇、半抗原及免疫原，所述的免疫原可以是肽、小分子、碳水化合物、脂类、核酸或其组合。熟练的免疫学家能够认识到，当讨论处理从而呈递到T细胞上的抗原时，术语“抗原”是指由MHC呈递到T细胞受体上的T细胞表位的抗原的那些部分(例 如肽的片段)。在B细胞介导的免疫应答的环境下，以对“抗原”特异性的抗体的形式使用时，结合到抗体(轻链和重链)的互补决定区的抗原的部分，该结合部分可以是线性的或者三维的表位。在本发明的环境下，术语抗原在两个环境下使用，即，抗体对于蛋白质抗原(CD40)是特异性的，但还携带一个或多个用于由MHC呈递到T细胞上的肽表位。在特定的情况下，将本发明的疫苗或者融合蛋白所递送的抗原内在化，并在呈递之前通过抗原呈递细胞进行加工，例如通过切割所述抗体或者融合蛋白的一个或多个部分。
如本文中所使用的，术语“抗原肽(antigenic peptide)”指特异性地由B-细胞或者T-细胞识别的多肽抗原的那部分。B细胞通过抗体的产生对外来的抗原决定簇作出应答，而T-淋巴细胞是介导细胞免疫。因此，抗原肽是抗原被抗体所识别的那些部分，或者在MHC的环境下，是抗原被T-细胞受体所识别的那些部分。
如本文中所使用的，术语“表位”指能特异性地结合到免疫球蛋白，或者由主要组织相容性抗原(MHC)蛋白(如I类的或者II类的)呈递到T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇一般地是5-30个氨基酸长的短肽，其适合MHC分子的沟槽，所述的MHC分子向T细胞受体呈现特定的氨基酸侧链，并在沟槽中具有特定的其他残基，例如由于沟槽、肽的侧链和T细胞受体的特定的电荷特征。一般来说，当解离常数是1mM、100nM或者甚至10nM时，抗体特异性地结合于抗原。
如本文所使用的，术语“载体(vector)”在两个不同的环境下使用。当使用术语“载体”指疫苗时，载体用于描述用于指导或者递送疫苗的抗原部分的非抗原部分。例如，可以将抗体或者其片段连接到引发免疫应答的抗原上，或者与该抗原形成融合蛋白。对于细胞疫苗来说，递送和/或呈递抗原的载体是抗原呈递细胞，其由加载了抗原的细胞进行递送。在特定的情况下，细胞载体自身也可以加工抗原(或多种抗原)，并将其呈递到T细胞，并且激发抗原特异性的免疫应答。当在核酸的环境下使用时，“载体”指构建体，所述的构建体能够在宿主细胞中递送，并且优选地能够表达一个或多个感兴趣的基因或者多核苷酸序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸露的DNA或者RNA表达载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或者RNA表达载体、包裹在脂质体和特定的真核细胞如生产细胞(producer cell)中的DNA或者RNA表达载体。
如本文中所使用的，术语“稳定的”和“不稳定的”当其指蛋白时，用于描 述保持其三维结构和/或活性(稳定的)，或立刻或随时间失去其三维结构和/或活性(不稳定的)的肽或蛋白质。如本文中所使用的，术语“不溶的”指在细胞中产生时(例如在真核或者原核细胞中，或者在体外表达的重组蛋白)，在不使用变性条件或者变性剂(例如分别地热或者化学变性剂)的情况下在溶液中不可溶。发现在本文中教导的抗体或其片段及接头将具有所述的肽的抗体融合蛋白从不可溶和/或不稳定转化成稳定和/或可溶的蛋白。另一个稳定性与不稳定性的实例是，在同样的溶液中测量时，蛋白的功能域具有稳定的构型时，其具有比蛋白的不稳定功能域更高的熔化温度(Tm)。当在同样的溶液中测量时，如果Tm的差为至少约2℃，一个功能域与另一个功能域相比是稳定的，所述的差更优选地为约4℃，再更优选地为约7℃，又更优选地为约10℃，还更优选地为约15℃，再更优选地为约20℃，还再优选地为约25℃，以及最优选地为约30℃。
如本文中所使用的，“多核苷酸”或者“核酸”指单链或者双链形式的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的链(包括天然核苷酸的已知类似物)。双链的核酸序列包括互补的序列。所述的多核苷酸可以编码免疫球蛋白的可变区和/或恒定区，所述的免疫球蛋白的可变区和/或恒定区与一个或多个接头形成融合蛋白。在本发明的应用中，可以经加工使多克隆位点(MCS)进入抗体的重链和/或轻链的羧基末端的位置，从而使得能在接头之间框内插入所表达的肽。如本文中所使用的，术语“经分离的多核苷酸”指来自基因组、cDNA、或者来自合成的多核苷酸或其一些组合。由于其来源，所述的“经分离的多核苷酸”(1)其从本质上与发现该“经分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或者部分不相关；(2)其可操作地连接到在自然条件下不与之连接的多核苷酸；或者(3)在自然条件下不以更大的序列的部分出现。本领域技术人员能够意识到，可以使用本领域中已知的技术在核酸的层面上进行操作，从而设计和完成载体，所述的现有技术中已知的技术如John Wiley and Sons出版的CurrentProtocols in Molecular Biology,2007中教导的，其相关的部分在此引入作为参考。总地来说，可以使用聚合酶链式反应、寡核苷酸或者聚合酶链式反应片段的酶促插入(enzymatic insertion)将编码核酸序列插入载体，所述的载体可以是表达载体。为了便于在抗体的轻链、重链或者轻链和重链两者的羧基末端进行插入，可以在抗体序列的序列中改造出多克隆位点(MCS)。
如本文中所使用的，术语“多肽”指氨基酸的聚合物，而不指特定长度的 产物；因此，肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义之内。此术语不表示或者排除所述多肽的表达后修饰，所述表达后修饰例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。定义中所包括的例如，含有氨基酸的一个或多个类似物的多肽(包括，例如非天然氨基酸等等)，具有取代连接键以及具有其他现有技术中已知的修饰的多肽，所述的修饰可以是天然产生的和非天然产生的。术语“功能域”或者“多肽功能域”指在天然构型下，折叠成单个球形功能域的多肽序列，其可以显示出分离的(discrete)结合或者功能性能。
“得自”指明的核酸序列的多肽或者氨基酸序列，指具有与该序列中编码的多肽或其部分相同的氨基酸序列的多肽，其中所述的部分由至少3-5个氨基酸构成，优选地由4-7个氨基酸构成，更优选地由至少8-10个氨基酸构成，以及还更优选地由11-15个氨基酸构成；或者所述的多肽与该序列中编码的多肽在免疫上是可识别的。该术语还包括从所指明的核酸序列表达的多肽。
如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”指任意的材料，所述的材料当与本发明的免疫球蛋白(Ig)融合蛋白结合时，使得所述的Ig能保持生物活性，并且所述的材料一般地与受试者的免疫系统不反应。实例包括，但不限于标准的药物载体如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液，及不同类型的润湿剂。可以在本发明中使用特定的稀释剂，例如，对于气雾剂或者肠道外给药，所述的稀释剂可以是磷酸盐缓冲盐水，或者生理(0.85％)盐水。
伴随本发明使用的抗体至少包含抗-CD40_12E12.3F3(ATCC登记号PTA-9854)、抗-CD40_12B4.2C10(保藏编号HS446,ATCC登记号____)和抗-CD4011B6.1C3(保藏编号HS440,ATCC登记号____)的可变区。
本发明提供了CD40结合分子，所述的结合分子包括至少一个免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包括按顺序的超可变区CDR1L、CDR2L和CDR3L，所述的CDR1L具有氨基酸序列SASQGISNYLN(SEQ ID NO.:41)，所述的CDR2L具有氨基酸序列YTSILHS(SEQ ID NO.:42)，以及所述的CDR3L具有氨基酸序列QQFNKLPPT(SEQ ID NO.:43)，并且所述的结合分子的氨基酸序列显示于SEQ ID NO.37中；及其直接的等价物，抗-CD40_11B6.1C3或抗-CD40＿12B4.2C10抗体。
因此，本发明提供了CD40结合分子，所述的结合分子包含含有至少一个免疫球蛋白重链可变区(VH)的抗原结合位点，所述免疫球蛋白重链可变区包括按顺序的超可变区CDR1H、CDR2H和CDR3H，所述的CDR1H具有氨基酸序列GFTFSDYYMY(SEQ ID NO.:44)，所述的CDR2H具有氨基 酸序列YINSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO.:45)，以及所述的CDR3H具有氨基酸序列RGLPFHAMDY(SEQ ID NO.:46)，并且所述的结合分子的氨基酸序列显示于SEQ IDNO.38中；及其直接的等价物，抗-CD40_11B6.1C3或抗-CD40_12B4.2C10抗体。
在一个方面，本发明提供了单区CD40结合分子，所述的分子包含经分离的免疫球蛋白轻链，所述的免疫球蛋白轻链包含前文所定义的重链可变区(VL)。在另一个方面，本发明提供了单区CD40结合分子，所述的分子包含经分离的免疫球蛋白重链，所述的重链包含前文所定义的重链可变区(VH)。
在另一个方面，本发明还提供了包括重链(VH)和轻链(VL)可变区两者的CD40结合分子，其中所述的CD40结合分子包含至少一个抗原结合位点，所述的CD40结合分子包含：a)免疫球蛋白的重链可变区(VL)，其包含按顺序的超可变区CDR1L、CDR2L和CDR3L，所述的CDR1L具有氨基酸序列SASQGISNYLN(SEQ ID NO.:41)，所述的CDR2L具有氨基酸序列YTSILHS(SEQ ID NO.:42)，以及所述的CDR3L具有氨基酸序列QQFNKLPPT(SEQ ID NO.:43)，并且所述的结合分子的氨基酸序列显示于SEQ ID NO.1中；以及b)免疫球蛋白轻链可变区(VH)，其包含按顺序的超可变区CDR1H、CDR2H和CDR3H，所述的CDR1H具有氨基酸序列GFTFSDYYMY(SEQ ID NO.:44)，所述的CDR2H具有氨基酸序列YINSGGGSTYYPDTVKG(SEQ IDNO.:45)，以及所述的CDR3H具有氨基酸序列RGLPFHAMDY(SEQ ID NO.:46)，并且所述的结合分子的氨基酸序列显示于SEQ ID NO.38中；及其直接的等价物，抗-CD40＿11B6.1C3或抗-CD40＿12B4.2C10抗体。
除非另外地指明，任意的多肽链在本文中都描述为具有从N-末端开始，并在C-末端结束的氨基酸序列。如果抗原结合位点包括VH和VL区两者，其可以位于同一多肽分子上，或者优选地，各个区可以位于不同的链上，其中VH区为免疫球蛋白的重链或其片段的部分，以及VL为免疫球蛋白的轻链或其片段的部分。
如本文中所使用的，术语“CD40结合分子”指单独地或者与其他的分子相关联时能结合于CD40抗原的任意分子，其具有本文教导的VL和VH CDR的一种或多种，在一些情况下具有2、3、4、5或者全部的6个CDR。结合反应可以通过标准方法(定性测定)显示，所述的方法例如通过阻碍其他分 子与CD40的结合进行测定的生物测定，或者任意种类的结合或活性测定(例如免疫应答的激发、减少或者调节)，上述的测定以阴性对照测试作为参考，在该阴性对照测试中，使用具有不相关的特异性但是属于同一同种型(isotype)的抗体，例如抗-CD25或者抗-CD 80抗体。
本发明还可以制成单链的抗体，所述的单链抗体中，抗体的重链和轻链可变区由肽接头共价地连接，所述的肽接头通常地包含10到30个氨基酸，优选地15-25个氨基酸。因此，该结构不包括重链和轻链的恒定部分，并且认为小肽间隔区比整个的恒定部分具有较少的免疫原性。
如在本文中所使用的，术语“嵌合抗体”指重链或者轻链或者重链和轻链两者的恒定区为人类来源，而重链和轻链两者的可变区为非人(如小鼠、仓鼠或者大鼠)的来源，或者是人类来源但是来自不同的人类抗体的抗体。
如本文中所使用的，术语“CDR-移植抗体”指高度可变的互补决定区(complementarity determining regions)(CDR)得自供体的抗体，如非人类(例如小鼠)的抗体或者不同的人类抗体，而免疫球蛋白的其他部分的全部或者基本上全部(例如可变区的恒定区域，也即构架区)得自受体抗体(人化抗体的情形下—人类来源的抗体)。CDR-移植抗体可以在构架区，例如在接近高度可变区的构架区域的部分包括供体序列的若干氨基酸。
如本文中所使用的，术语“人类抗体”指重链和轻链两者的恒定区和可变区均为人类来源，或者大体上与人类来源的序列相同，而不一定来自同一个抗体的抗体，其包括由小鼠产生的抗体，其中小鼠、仓鼠或者大鼠的免疫球蛋白的可变和恒定部分基因已经由其人类等价物替代，例如，其一般描述于EP 0546073 B1、第5545806号美国专利、第5569825号美国专利、第5625126号美国专利、第5633425号美国专利、第5661016号美国专利、第5770429号美国专利、EP 0 438474 B1和EP 0 463151 B1中，相关的部分在此结合作为参考。
本发明的CD40结合分子可以是人源化抗体，该抗体包含得自抗-CD40 12E12.3F3、抗-CD40 11B6.1C3或者抗-CD40_12B4.2C10抗体的CDR。嵌合抗体的一个实例包括重链和轻链两者的可变区具有人类来源的可变区，所述的可变区例如作为SEQ ID NO.:1和SEQ IDNO.:2的部分的抗CD40_12E12.3F3抗体；SEQ ID NO.:3或者SEQ ID NO.:4或者SEQ ID NO.:5中的抗-CD40_12B4.2C10和/或抗-CD40_11B6.1C3，SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7的那些可变区，或其组合。所述的恒定区功能域优选地还包括适用 的人类恒定区功能域，例如描述于"Sequences of Proteins of Immunological Interest",Kabat E.A.等人,USDepartment of Health and Human Services,Public Health Service,NationalInstitute of Health中。其核酸序列可见于例如SEQ ID NO.:8和9中。
超可变区可以与任意类型的构架区关联，所述的构架区例如为人类来源的。适用的构架区由Kabat E.A.描述。一种重链构架是SEQ ID NO.:1的部分的抗-CD40_12E12.3F3抗体，抗-CD40-12B42C10-SEQ ID NO.:4或者SEQ ID NO.:5和/或抗-CD40-11B6.1C3-SEQID NO.:7的重链构架或其组合，例如FR1L、FR2L、FR3L和FR4L区。以类似的方式，SEQ ID NO.1显示了抗-CD40_12E12.3F3(或者分别为抗-CD40_12B4.2C10和抗-CD40_11B6.1C3，SEQ IDNO.:3和6的等价物)重链构架，所述的构架包含FR1H、FR2H、FR3H和FR4H区的序列。所述的CDR可以加到人类抗体构架上，例如在授予Rybak等人的7456260中所描述的，其教导了新的人类可变链构架区及包含该构架区，相关的部分和构架序列的人源化抗体在此引入作为参考。为了完成遗传学水平上的植入，本发明还包括VL和VH区的基本核酸序列，以及完整的抗体和其人源化类型，本发明的核酸序列包括SEQ ID NO.:8和9，其分别地为抗-CD40抗体的轻链和重链，以及包括核酸序列，所述的核酸序列包含用于同样的氨基酸序列及其保守的变体的可变密码子，所述的保守的变体在核酸或者氨基酸水平上具有85％、90％、95％或者100％的序列同源性。类似地，CDR分别地，成组地或者2、3、4或者5个或者全部一起可以在核酸或者氨基酸水平上具有85％、90％、95％或者100％的序列同源性。
通常在非人的系统中，例如在小鼠中开发抗在所有人类中天然地发现的蛋白质的单克隆抗体，因此其一般地为非人类的蛋白质。这一点的直接后果是，由杂交瘤产生的异基因抗体当给药到人类时，引起不想要的，主要由所述的异基因免疫球蛋白的恒定区所介导的免疫应答。异基因抗体容易引起宿主免疫应答，从而限制了该抗体的用途，由于其不能在长时间内给药。因此，使用单链的、单功能域的、嵌合的、CDR-移植的或者尤其地人类的抗体是特别有用的，该抗体在给药到人类时，不太可能引起显著的异基因响应。本发明包括在氨基酸序列上有小的改变的抗体，所述的改变如一个、几个或者甚至数个氨基酸的缺失、增加或者取代，所述的有小的改变的抗体仅仅是原蛋白的等位形式，其具有基本上相同的性质。
可以在不同的检测中方便地测试针对CD40与其受体的结合的抑制，所 述的检测包括描述于下文的那些检测。术语“到同样的程度”意味着在前文中所指的检测之一中，在统计学的意义上，对照和等价的分子显示出本质上相同的CD40结合抑制曲线。例如所使用的检测可以是本发明的结合分子对CD40的结合的竞争性抑制检测。
一般地说，人类的抗-CD40抗体至少包含：(a)一个轻链，其包含可变区和人类轻链的恒定部分，所述的可变区具有与SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，所述的SEQ ID NO.1从第1位的氨基酸开始，到第107位的氨基酸结束；以及(b)一个重链，其包含可变区和人类重链的恒定部分，所述的可变区具有与SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。所述的人类重链的恒定部分可以是γ1、γ2、γ3、γ4、β2或者δ或者ε类型，优选地为γ类型，然而所述的人类轻链的恒定部分可以为κ或者λ类型(其包括了λ1、λ2和λ3亚型)但是优选为κ类型。可变区和恒定区的一般位置上的氨基酸序列在本领域中是已知的，并一般地符合Kabat命名法。
本发明的CD40结合分子可以通过重组DNA技术生产。因此，必须构建编码该结合分子的一个或多个DNA分子，使其和合适的控制序列在一起，并将其转移到适合的宿主有机体中进行表达。
以非常一般的方式相应地提供了：(i)编码本发明的CD40结合分子的单个功能域的DNA分子，本发明的单链CD40结合分子，本发明的CD40结合分子的重链或者轻链或其片段；以及(ii)本发明的DNA分子通过重组方法在生产本发明的CD40结合分子中的用途。
现有技术的当前状态是，本领域技术人员可以根据本文中所提供的信息合成本发明的DNA分子，即，超可变区的氨基酸序列和编码其的DNA序列。构建可变区基因的方法例如描述于EPA 239400中，其相关的部分在此结合作为参考。总地来说，克隆了编码MAb的可变区的基因。确定了编码构架和超可变区的DNA片段，并且除去了编码所述的超可变区的DNA片段，从而使编码所述的构架区的DNA片段在连接处与适合的限制性位点融合。所述的限制性位点可以按照标准步骤，通过DNA分子的诱变在合适的位置产生。根据SEQ ID NO.1和3或者2和4(分别为氨基酸和核酸序列)中给出的序列，通过DNA合成制备了双链的合成CDR盒。这些盒通常以具有粘性末端的形式提供，从而使其可以连接到构架的结合处(junction)。
为了得到编码本发明的所述的CD40结合分子的DNA构建体，没有必 要从生产的杂肿瘤细胞系中得到mRNA。例如，第WO 90/07861号PCT申请中在仅给出了关于基因的核苷酸序列的书面信息的情况下，就通过重组DNA技术生成抗体给出了完整的指示，其相关的部分在此结合作为参考。总地来说，该方法包括多种寡核苷酸的合成，其通过PCR方法的扩增，以及其剪切从而得到所想要的DNA序列。
包括适合的启动子的表达载体或者编码重链和轻链的恒定部分的基因可以公开获得。因此，一旦制备了本发明的DNA分子，其可以方便地转移到合适的表达载体中。也可以通过标准的方法，例如WO 88/1649中所描述的方法制备编码单链抗体的DNA分子。在前文的基础上，说明书的充分公开不必进行杂交瘤或者细胞系的保藏。
例如，制备了特异性地结合到CD40上的第一和第二DNA构建体。总地来说，第一DNA构建体编码轻链或其片段，并且包含a)第一部分，该部分编码可变区，所述的可变区包含构架和超可变区的二者之一，所述的超可变区位于序列CDR1L、CDR2L和CDR3L中，其氨基酸序列显示于SEQ ID NO.1中；该第一部分从编码所述的可变区的第一个氨基酸的密码子开始，并且在编码所述可变区的最后一个氨基酸的密码子结束，以及b)第二部分，该第二部分编码轻链恒定部分或其片段，其从编码重链的恒定部分的第一个氨基酸的密码子开始，并且在编码恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子处结束，随后为终止密码子。
所述的第一部分编码可变区，该可变区具有与SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6或者7中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。第二部分编码人类的重链的恒定部分，更优选地人类的γ1链的恒定部分。该第二部分可以是基因组来源的DNA片段(包含内含子)或者cDNA片段(没有内含子)。
第二DNA构建体编码重链或其片段，并包含a)第一部分，该第一部分编码包含构架和超可变区二者之一的可变区；所述的超可变区为CDR1H以及可选地为CDR2H和CDR3H，其氨基酸序列显示于SEQ ID NO.2中；该第一部分从编码所述的可变区的第一个氨基酸的密码子开始，并且在编码所述可变区的最后一个氨基酸的密码子结束，以及b)第二部分，该第二部分编码重链恒定部分或其片段，其从编码轻链的恒定部分的第一个氨基酸的密码子开始，并且在编码恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子结束，随后为终止密码子。
所述的第一部分编码可变区，该可变区具有与SEQ ID NO.2中所示的氨 基酸序列基本上相同的氨基酸序列。所述的第一部分具有如SEQ ID NO.2中所示的核酸序列，从第1位的核苷酸开始并且在第321位的核苷酸结束。同时优选地，该第二部分编码人类轻链的恒定部分，更优选地编码人类的κ链的恒定部分。
本发明还包括CD40结合分子，其中CDR1L、CDR2L、CDR3L、CDR1H、CDR2H或者CDR3H或者构架中的一个或多个残基，一般地仅数个(如FR1-4L或者H)通过例如对应的DNA序列的定点突变，从显示于SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38的残基变化。本发明包括编码该改变的CD40结合分子的DNA序列。尤其地，本发明包括CD40结合分子，其中CDR1L、CDR2L和/或CDR3L的一个或多个残基从SEQ ID NO.37所示的残基变化，以及CDR1H、CDR2H和/或CDR3H的一个或多个残基从SEQ ID NO.38所示的残基变化，或来自SEQ ID NO.1、3和6的等价物。
各个DNA构建体置于适合的控制序列的控制下，尤其地，在适合的启动子的控制下。任意类型的启动子都可以使用，只要其适合所述的在其中DNA构建体转移用于表达的宿主有机体即可。然而，如果表达在哺乳动物细胞中进行，可以在B细胞中使用免疫球蛋白基因启动子。所述的第一和第二部分可以由内含子隔开，并且，可以将增强子合适地放置于第一部分和第二部分之间的内含子中。该转录而不翻译的增强子的存在可以帮助进行充分的转录。在特定的实施方案中，第一和第二DNA构建体包含增强子，所述的增强子为例如重链人类基因的增强子。
想要的抗体可以在细胞培养物中，或者在转基因动物中产生。适用的转基因动物可以根据标准方法得到，所述的标准方法包括将位于适合的控制序列下的所述的第一和第二DNA构建体微注射到卵子中，将如此制备的卵子转移到合适的假妊娠雌性中，并选择表达想要的抗体的后代。
本发明还提供了能够在原核或者真核细胞系中复制的表达载体，所述的表达载体包含前文描述的DNA构建体的至少之一。随后将含有DNA构建体的各个表达载体转移到适合的宿主有机体中。当DNA构建体分别插入到两个表达载体中时，可以将其分别地进行转移，即每个细胞中一种类型的载体，或者可以将其共转移，后者可能是优选的。适用的宿主有机体可以是细菌、酵母或者哺乳动物细胞系，后者是优选的。更优选地，所述的哺乳动物细胞系来自淋巴，如骨髓瘤、杂交瘤或者正常的永生B细胞，其合适地不表达任何的内源抗体重链或者轻链。
当在细胞培养物中产生所述的抗体链时，必须首先将DNA构建体插入到单个的表达载体中，或者插入到两个分开的但是相容的表达载体中，后者可能是优选的。为了在哺乳动物中进行表达，优选地将CD40结合分子的编码序列整合到宿主细胞DNA的基因座内中，所述的基因座允许或者帮助该CD40结合分子的高水平表达。
在本发明的再一个方面，提供了产生CD40结合分子的产物的方法，该方法包括：(i)将使用以上定义的表达载体转化的有机体进行培养；并且(ii)从培养物中回收CD40结合分子。
依照本发明，发现了抗-CD40_12E12.3F3、抗CD40_12B4.2C10和/或抗-CD40_11B6.1C3抗体显示出对人类CD40的抗原表位具有结合特异性。因此，最出人意料的是此表位的抗体，例如抗-CD40_12E12.3F3、抗CD40_12B4.2C10和/或抗-CD40_11B6.1C3抗体能将抗原高效地呈递到树突细胞(DC)中。抗体，尤其是嵌合抗体和CDR-移植抗体，以及尤其地人类抗体，所述抗体对成熟的人类CD40的抗原表位具有结合特异性；以及该抗体在加载DC抗原中的用途是新颖的，并包括在本发明的范围内。
为了使用本发明的抗-CD40抗体来治疗适应症，适当的剂量理所应当地根据例如将要使用的在本文中公开的抗体、宿主、给药方式和所治疗的疾病的性质和严重程度而变化。然而，在预防性的用途中，在从约0.05mg到约10mg每千克体重的剂量下，更通常地在约0.1mg到约5mg每千克体重的剂量下，得到令人满意的结果。在预防用途中给药的频率通常地在约一周一次到约每三个月一次的范围内，更通常地在约每两周一次到约每十周一次的范围内，例如每4到8周一次。本发明的抗-CD40抗体可以经肠道外、经静脉内给药，例如给药到肘前静脉或者其他外周静脉、经肌肉内给药或者皮下给药。
本发明的药物组合物可以按照传统的方式进行制造，例如为冻干的形式。在即用给药时，将其溶解在合适的含水载体中，例如注射用无菌水，或者无菌缓冲生理盐水。如果期待制备更大体积的溶液用于输注给药而不是弹丸注射(bolus injection)给药，在配制时将人类血清白蛋白或者患者自身的肝素化血液掺入到盐水中是有利的。过量的该生理惰性的蛋白的存在阻止抗体被吸收到输注溶液所使用的容器和管的壁上而损失。如果使用了白蛋白，适合的浓度是按重量计盐水溶液的0.5％到4.5％。
本发明的一个实施方案提供了免疫缀合物(immunoconjugate)，所述的 免疫缀合物包含本发明的人源化抗体，例如人源化抗-CD40抗体，其连接到一个或多个效应分子(effector molecule)、抗原(或多个抗原)和/或可检测的标记(或多个标记)上。优选地，所述的效应分子是治疗性的分子，例如含有一个或多个T细胞表位的一个或者多个肽、毒素、小分子、细胞因子或者趋化因子、酶或者放射性标记。
典型的毒素包括但不限于假单胞菌外毒素或者白喉毒素。小分子的实例包括但不限于化疗化合物，如紫杉醇(taxol)、阿霉素(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleiomycin)。典型的细胞因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-12、IL-17和IL-25。典型的酶包括但不限于RNA酶、DNA酶、蛋白酶、激酶和半胱天冬酶。典型的放射性同位素包括但不限于32P和125I。
如本文中所使用的，术语“表位”指能够激发免疫应答的分子或者物质。在一个实例中，表位包括但不限于多肽和编码多肽的核酸，其中当该核酸所表达的多肽经过加工并且在主要组织相容性复合体(MHC)分子上呈递时，该核酸到多肽的表达能够激发免疫应答。一般地说，表位包括呈递到细胞表面上的肽，所述的肽非共价地结合于I类或者II类MHC的结合沟，从而其可以与T细胞受体及各自的T细胞辅助分子相互作用。
抗原的蛋白水解加工。由MHC呈现到抗原呈递细胞上的表位是更大的肽或者蛋白质抗原前体的切割肽或者产物。对于MHC I表位来说，蛋白质抗原通常由细胞中固有的蛋白酶体消化。细胞内的蛋白酶体消化产生约3到23个氨基酸长度的肽片段，随后该肽片段加载到MHC蛋白上。细胞内或者在细胞外的环境中的其他蛋白水解作用可以进一步地剪切(trim)并加工这些片段。MHC II类表位的加工通常通过来自溶酶体/内涵体的隔室(compartment)中的细胞内蛋白酶进行。在一个实施方案中，本发明包括，连接到抗-CD40抗体(或其片段)的预加工的肽，所述的抗-CD40抗体(或其片段)控制所述的肽，针对该肽在抗原呈递细胞中发生增强的免疫应答。
为了识别潜在有效的作为免疫原性化合物的表位，单独进行MHC结合预测是有用的，但通常是不充分的。本发明包括特异性地鉴定抗原内表位的方法，所述的表位是最可能在探寻特定来源的抗原呈递细胞及应答子T细胞(responder T cell)中引起免疫应答的表位。
本发明使得能够为那些表位的鉴定进行快速和简易的检测，所述的表位是最可能在使用患者自身的抗原呈递细胞和T细胞系统时产生想要的免疫 应答的表位。本发明的组合物和方法适用于任意的蛋白质序列，使得使用者鉴定能够结合到MHC并且合适地呈递到对该抗原应答的T细胞的表位。相应地，本发明不限于任意特定的靶或者医疗条件，相反涵盖来自任意有用的来源的MHC表位(或多个表位)。
如本文中所适用的，术语“镶饰的(veneered)”指人源化抗体构架，在该抗体构架上，将抗原结合位点或者得自非人抗体的CDR(例如小鼠、大鼠或者仓鼠)置于人类的重链和轻链保守结构构架区中(FR)，例如在轻链或者重链多核苷酸中，从而将非人抗体的特异性“移植”到人类的构架中。表达所述的镶饰的抗体的多核苷酸表达载体或者多种载体可以转染哺乳动物的细胞，从而表达重组的人类抗体，该重组的人类抗体显示非人抗体的抗原特异性，并且经历会增强其表达、稳定性、溶解性或其组合的翻译后修饰。抗原。
用于本发明的病毒性抗原实例包括但不限于，例如HIV、HCV、CMV、腺病毒、反转录病毒、小核糖核酸病毒等等。反转录病毒抗原的非限制性实例如来自人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原的反转录病毒抗原，如来自gag、pol和env基因的基因产物、Nef蛋白、反转录酶和其他的HIV组分；肝炎病毒抗原如乙型肝炎病毒的S、M和L蛋白，乙型肝炎病毒的前-S抗原，和其他肝炎如甲、乙和丙型肝炎病毒组分，例如丙型肝炎病毒RNA；流感病毒抗原如血凝素和神经氨酸苷酶及其他的流感病毒组分；麻疹病毒抗原如麻疹病毒融合蛋白及其他的麻疹病毒组分；风疹病毒抗原如蛋白质E1和E2及其他的风疹病毒组分；轮状病毒抗原如VP7sc和其他的轮状病毒组分；巨细胞病毒抗原如包膜糖蛋白B及其他的巨细胞病毒抗原组分；呼吸道合胞体病毒抗原如RSV融合蛋白、M2蛋白和其他的呼吸道合胞体病毒组分；单纯疱疹病毒抗原如极早期蛋白、糖蛋白D及其它的单纯疱疹病毒抗原组分；水痘带状疱疹病毒抗原如gpI、gpII和其他的水痘带状疱疹病毒抗原组分；日本脑炎病毒抗原如蛋白质E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A、80％E及其它的日本脑炎病毒抗原组分；狂犬病病毒抗原如狂犬病糖蛋白、狂犬病核蛋白及其它的狂犬病病毒抗原组分。其他的病毒性抗原的实例参见Fundamental Virology,Second Edition,eds.Fields,B.N.and Knipe,D.M.(RavenPress,New York,1991)。所述的至少一个的病毒抗原可以是肽，所述的肽来自腺病毒、反转录病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、轮状病毒、汉坦病毒、冠状病毒、披膜病毒、黄病毒(flavirvirus)、弹状病毒、副粘病毒、 正粘病毒、本扬病毒、砂粒病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海绵状病毒。在某些具体的非限制性实例中，所述的至少一种病毒抗原是肽，所述的肽得自HIV、CMV、甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、流感、麻疹、骨髓灰质炎、天花、风疹；呼吸道合胞病毒、单纯疱疹、水痘带状疱疹、爱泼斯坦-巴尔、日本脑炎、狂犬病、流感和/或感冒病毒的至少一种。
在一个方面，所述的一种或多种抗原肽选自Nef(66-97):VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO.:148)、Nef(116-145):HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL(SEQ ID NO.:149)、Gag p17(17-35):EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO.:150)、Gag p17-p24(253-284):NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO.:151)、或者Pol 325-355(RT 158-188)为:
AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO.:152)的至少一种。在一个方面，所述的融合蛋白肽由一个或者多个接头隔开，所述的接头选自：SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO.:11)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ IDNO.:12)、TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.:13)；或者TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.:14)。
可以使用本发明的抗-CD40抗原疫苗进行递送的抗原靶包括编码抗原的基因，所述的抗原如病毒性抗原、细菌性抗原、真菌性抗原或者寄生虫抗原。病原体包括锥虫，绦虫，蛔虫，蠕虫，疟疾。肿瘤标记物例如胎儿抗原或者前列腺特异性的抗原可以按此方式进行靶向。其他的实例包括：HIV env蛋白和乙型肝炎表面抗原。为了接种的目的给予根据本发明的载体要求该载体相关的抗原是充分地无免疫原性的，从而使得该转基因的长期表达成为可能，而该转基因的强免疫应答是想要的。在一些情况下，对个体的接种的需要可以只是偶发的，例如每年一次或者两年一次，并且该接种提供针对感染剂的长期免疫保护。本发明中用于载体以及最终用作抗原的有机体、过敏原和核酸和氨基酸序列可以在第6541011号美国专利中找到，其相关的部分在此结合作为参考，尤其地，将有机体和特定的序列匹配的表格可以用于本发明。
与在本文中公开的抗-CD40抗原疫苗一起使用的细菌性抗原包括，但不限于例如细菌抗原，如百日咳毒素、纤维状血凝素、百日咳杆菌粘附素、FIM2、 FIM3、腺苷酸环化酶和其他的百日咳细菌抗原组分；白喉细菌抗原如白喉毒素或者白喉类毒素，及其它的白喉细菌抗原组分；破伤风细菌抗原如破伤风毒素或者破伤风类毒素，及其它的破伤风细菌抗原组分；链球菌细菌抗原如M蛋白和其他的链球菌细菌性抗原组分；革兰氏阴性杆菌细菌抗原如脂多糖和其他的革兰氏阴性细菌抗原组分；结核分枝杆菌细菌性抗原如分枝菌酸、热激蛋白65(HSP65)、30kDa的主分泌蛋白、抗原85A及其他的分枝杆菌抗原组分；幽门螺旋杆菌细菌性抗原组分；肺炎球菌细菌性抗原如肺炎球菌溶血素、肺炎荚膜多糖和其他的肺炎球菌细菌性抗原组分；流感嗜血杆菌细菌抗原如荚膜多糖和其他的流感嗜血杆菌细菌抗原组分；炭疽细菌性抗原如炭疽保护性抗原和其他的炭疽细菌性抗原组分；立克次体细菌性抗原如rompA和其他立克次体细菌性抗原组分。本文中所描述的细菌性抗原还包括任意其他的细菌、分枝杆菌、支原体、立克次氏体或者衣原体的抗原。病原体的部分或者全部也可以是流感嗜血杆菌、恶性疟原虫、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、淋球菌、沙门氏菌、血清型伤寒杆菌、志贺菌、霍乱弧菌、登革热、脑炎、日本脑炎、莱姆病、鼠疫菌、西尼罗河病毒、黄热病、野兔热、肝炎(病毒性、细菌性)，RSV(呼吸道合胞病毒)、HPIV 1和HPIV 3、腺病毒、天花、过敏和癌症。
用于本发明的组合物和方法的真菌性抗原包括，但不限于例如假丝酵母真菌性抗原组分、组织胞浆菌真菌性抗原如热激蛋白60(HSP60)及其它组织胞浆菌真菌性抗原组分；隐球菌真菌性抗原如荚膜多糖和其他的隐球菌真菌性抗原组分；球孢子菌真菌性抗原如小球抗原和其他的球孢子菌真菌性抗原组分；和癣真菌性抗原例如毛癣菌素和其他的球孢子菌真菌性抗原组分。
原生动物和其他的寄生虫抗原的实例包括，但不限于例如恶性疟原虫抗原如裂殖子表面抗原，子孢子表面抗原，环子孢子(circumsporozoite)抗原，配子体/配子表面抗原，红内期抗原pf 155/RESA和其他的疟原虫抗原组分；弓形虫抗原如SAG-I、p30和其他的弓形虫抗原组分；血吸虫抗原如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白和其他的血吸虫抗原组分；硕大利什曼原虫抗原和其他利什曼原虫抗原如gp63，脂磷聚糖和其相关的蛋白，和其他的利什曼原虫抗原组分；以及克氏锥虫抗原如75-77kDa抗原，56kDa抗原和其他的锥虫抗原组分。
可以使用本发明的抗-CD40抗原疫苗进行靶向的抗原一般地按照多种因素进行选择，所述的因素包括：内在化的可能性、免疫细胞特异性的水平、 所靶向的免疫细胞的类型，免疫细胞成熟和/或激活程度等等。在这个实施方案中，抗体可以是单特异性或者双特异性的抗体，后者包括一个抗-CD40的结合功能域，和一个抗第二种抗原的结合功能域，所述的第二种抗原例如树突细胞的细胞表面标记物，如I类MHC、II类MHC、B7-2、CD 18、CD29、CD31、CD43、CD44、CD45、CD54、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR和/或Dectin-1等等；而在一些情况下，也缺少CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD 19、CD20、CD56、和/或CD57。抗原呈递细胞的细胞表面标记物的实例包括但不限于I类MHC、II类MHC、CD45、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1和/或Fcγ受体。T细胞的细胞表面标记物的实例包括，但不限于CD3、CD4、CD8、CD14、CD20、CD11b、CD16、CD45和HLA-DR。
位于细胞表面用于递送的靶抗原包括特征为肿瘤抗原的那些，其一般地得自肿瘤组织的细胞的细胞表面、细胞质、核、细胞器等。本发明的抗体部分的肿瘤目标的实例包括但不限于血液癌症如白血病和淋巴瘤，神经肿瘤如星形细胞瘤或恶性胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、胃肠肿瘤如胃癌和结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系统肿瘤如子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或阴茎癌、骨肿瘤、血管瘤、或唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆道系统癌、喉癌、肺和支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑癌和神经系统的其他部分癌症、甲状腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
可以利用本发明，单独或者结合递送到免疫细胞，进行抗原呈递的抗原的实例包括肿瘤蛋白如突变的致癌基因；与肿瘤关联的病毒蛋白；以及肿瘤粘液素和糖脂。所述的抗原可以是与肿瘤关联的病毒性蛋白，可能是前文记载的各类病毒。特定的抗原可以是肿瘤的特征(通常不由肿瘤前体细胞表达的蛋白的一个子集)或者可以是通常能够地在肿瘤前体细胞中表达但是具有肿瘤的突变特征的蛋白质。其他的抗原包括正常蛋白的突变变体(或多种突变体)，其具有改变的活性或者亚细胞的分布，例如产生肿瘤抗原的基因的突变。
用于抗-CD40融合蛋白疫苗的肿瘤抗原的具体的非限制性实例包括，例如CEA、前列腺特异性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4，6和12、MUC(黏液素)(如MUC-1,MUC-2等等)、GM2和GD2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART(黑色素瘤抗原)、Pmel 17(gp100)、GnT-V 内含子V序列(N-乙酰基葡萄糖胺转移酶V内含子V序列),前列腺Ca psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、MUM-1-B(黑色素瘤中普遍存在的突变基因产物)、GAGE(黑色素瘤抗原)1、MAGE、BAGE(黑色素瘤抗原)2-10、C-ERB2(Her2/neu)、DAGE、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、gp75、人类乳头瘤病毒(HPV)E6和E7、p53、肺抗性蛋白(lungresistance protein)(LRP)、Bcl-2、Ki-67、细胞周期蛋白B1、gp100、存活素和NYESO-1。
除此之外，免疫原性的分子可以是涉及自身免疫疾病的开始和/或传播的自身抗原，其病理学在很大程度上是由于对相应的靶器官、组织或者细胞如SLE或者MG表达的分子有特异性的抗体的活性。在该疾病中，可能希望将持续进行中的抗体介导的(即Th2-类型的)对相关的自身抗原的免疫应答朝细胞(即Th1类型的)免疫应答的方向控制。或者可以期待通过预防性地诱导针对合适的自身抗原的Th1应答，使针对受试者的自身抗原的Th2应答不发生或者其水平降低，所述的受试者不具有，但是怀疑易患相关的免疫疾病。感兴趣的自身抗原包括但不限于：(a)关于SLE、Smith蛋白、RNP核糖核蛋白及SS-A和SS-B蛋白；以及(b)关于MG、乙酰胆碱受体。其他包含在一种或多种类型的自身免疫应答的多种抗原的实例包括例如内源激素如黄体生成素(luteinizing hormone)、促卵泡素(follicularstimulating hormone)、睾酮(testosterone)、生长激素、催乳素(prolactin)和其他的激素。
在自身免疫疾病、过敏症和移植排斥中涉及的抗原可以用于本发明的组合物和方法。例如，下列自身免疫疾病或障碍中涉及的任意一种或多者中的抗原可以用于本发明：糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetes mellitus)，关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎)、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括异位性皮炎和湿疹样皮炎)、牛皮癣、干燥综合征，包括继发干燥综合征的干燥性角结膜炎、斑秃、由于节肢动物叮咬反应引发的过敏反应、克罗恩病、阿弗他溃疡、虹膜炎、结膜炎、角结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风病逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双边进展性感觉神经性听力损失、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少症、多软骨炎、韦格纳肉芽肿病、慢性活动性肝炎、史蒂文斯-约翰逊综合征、特发性口炎性腹泻、扁平苔藓、克罗恩病、Graves眼病、结节病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎和肺间 质纤维化。自身免疫疾病中涉及的抗原的实例包括谷氨酸脱羧酶65(GAD65)、天然的DNA、髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein)、髓鞘蛋白脂质蛋白(myelin proteolipid protein)、乙酰胆碱受体组分、甲状腺球蛋白(thyroglobulin)和促甲状腺激素(TSH)受体。
过敏症中涉及的抗原的实例包括花粉抗原，如日本柳杉花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麦草花粉抗原、动物源性抗原如尘螨抗原和猫科动物抗原、组织相容性抗原(histocompatiblity antigen)和青霉素及其他治疗药物。移植排斥中涉及的抗原的实例包括移植到移植接收者中的移植物的抗原组分，所述的移植物如心脏、肺、肝、胰腺、肾和神经移植部分。所述的抗原可以是在治疗自身免疫疾病中有用的改造的肽配体(alteredpeptide ligand)。
本领域技术人员应该认识到，任意的蛋白质效应分子的序列都可以进行这样的改造，该改造不从本质上影响所述效应子蛋白质的功能上的优点。例如，甘氨酸和丙氨酸一般被认为是可交换的，天冬氨酸和谷氨酸以及天冬酰胺和谷氨酰胺也是如此。本领域的技术人员应认识到效应子序列的许多不同变体能编码活性大体上与天然的效应子相同的效应子。所述的效应子分子和抗体可以通过前文所述的化学方式或者重组方式进行缀合。化学修饰包括，例如为了将所述的效应子分子和抗体彼此连接的目的而进行衍生，所述的衍生是直接的或者通过连接的化合物，其通过蛋白质化学的领域中公知的方法进行。对于本发明的人源化抗体，共价的和非共价的连接方式均可以使用。
将效应子分子连接到抗体的步骤依所连接到抗体的部分的化学结构而不同。多肽一般地含有多个官能团；例如羧酸(COOH)、游离的氨基(-NH2)或者巯基(-SH)基团，其可以与抗体上的适合官能团反应，导致其与效应子分子的结合。可选地，可以将所述的抗体进行衍生化，从而使其暴露或者连接额外的反应性官能团，例如与可得自Pierce ChemicalCompany,Rockford Ill的多种接头分子之中任意的接头分子进行连接。
所述的接头能够与所述的抗体和所述的效应子分子形成共价键。对于本领域的技术人员来说，适合的接头是公知的，其包括但不限于直链的或者支链的碳接头、杂环的碳接头或者肽接头。当抗体和效应子分子是多肽时，可以通过其侧基将所述的接头连接到其组成部分的氨基酸上(例如通过半胱氨酸的二硫键连接)。然而，在优选的实施方案中，所述的接头连接到末端的氨基酸的α碳的氨基上和羧基上。
在一些情况下，在免疫缀合物达到其靶向位点时，希望将效应子分子从 抗体上释放。因此，在这些情况下，免疫缀合物包含在靶向位点的附近可切割的连接。为了从抗体释放效应子分子，该接头的切割可以通过酶活性或者该免疫缀合物处于易受影响的环境引起，所述的环境为在靶向的细胞内部，或者在靶向的位点的附近。当所述的靶向位点是肿瘤时，可以使用在肿瘤位点处存在的环境下(例如当暴露于肿瘤相关的酶或者酸性的pH)可切割的接头。
本发明的效应子分子和抗体的典型化学修饰还包括使用聚乙二醇(PEG)进行衍生化，从而延长在循环系统中的滞留时间并降低免疫原性，所述的衍生化根据公知的方法进行(参见例如Lisi等人,Applied Biochem.4:19(1982)；Beauchamp等人,AnalBiochem.131:25(1982)；以及Goodson等人,Bio/Technology 8:343(1990))。
本发明预期了用于主动免疫和被动免疫的实施方案中的疫苗。建议适于用作疫苗的免疫原性组合物可以最容易地按照本文中所公开的方式，直接从肽进行制备，所述的肽能激发免疫原性的T细胞。将最终的接种材料进行粗略的透析，从而除去不想要的分子量小的分子，和/或冻干，从而更方便地配制到想要的载体中。在本发明特定的实施方案中，本发明的组合物和方法用于生产细胞疫苗，例如该抗体的递送抗原的抗-CD40结合部分用于指导所述的抗原(或多种抗原)到达抗原呈递细胞，所述的抗原呈递细胞随后将所述的抗原“加载”到MHC蛋白上用于呈递。因此所述的细胞疫苗是使用本发明的组合物加载从而产生加载了抗原的抗原呈递细胞的抗原呈递细胞。
当所述的疫苗是抗-CD40结合蛋白自身的时候，例如是完整的抗体或其片段时，则这些“活性组分”可以使用现有技术中已知的方法制成疫苗，所述的现有技术如第4608251、4601903、4599231、4599230和4578770号美国专利，其相关的部分在此结合作为参考。一般地来说，该疫苗制备成可注射的，例如制备成液态的溶液或者悬浮液，或者适于在注射前再悬浮于液体中的固体形式。该制备物也可以是乳化的。活性的免疫原性组分通常与药学上可接受的并且与所述的活性成分相容的赋形剂混合。适合的赋形剂为如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等或者其组合。除此之外，所述的疫苗也可以按照需要地含有少量的辅料，如润湿剂或者乳化剂，pH缓冲剂，或者提高所述疫苗的效果的佐剂。
将疫苗以与其剂型制剂相容的方式给予，并且其量是治疗上有效的和产生免疫性的。所给予的量取决于所治疗的受试者，包括，例如个体的免疫系 统产生免疫应答的能力。所需给予的细胞和活性组分的精确量取决于从业医师的判断。然而，对于细胞疫苗来说，适用的剂量范围为数千个细胞(到数百万个细胞)的数量级。对于标准的表位或者表位递送疫苗来说，则该疫苗可以是每次接种数百微克的活性组分。对于初次给予和加强注射而言，适用的治疗方案也是可以变化的，但是定式为进行初次给予，接着是进行随后的接种(subsequent inoculation)或者其他的给予。
本申请的方式可以在大范围内变化，然而，本文中的特定实施方案最可能是经静脉内递送，或者直接地递送到肿瘤或者感染的位点。无论如何，任意给予疫苗的传统方法都是可行的。疫苗的剂量取决于给药的途径，以及会随着宿主的大小发生变化。
在许多情况下，希望将多次给予该疫苗，例如每周或者每隔一周进行四次到六次接种。正常的接种治疗方案通常以两周到十二周的间隔，或者三周到六周的间隔进行。为了将免疫应答维持在保护性的水平上，或者针对疾病缓解或者重新感染的可能性，可以希望采取1-5年间隔，通常地3年间隔的定期加强。免疫疗程之后可以进行检测，所述的检测如测量T细胞活化、细胞因子分泌或者甚至是抗体的产生，该检测最经常地在体外完成。这些免疫应答检测是公知的，并且可见于大量的专利中，并是如本文所教导的。
本发明的疫苗可以以一个或者多个“单位剂量”提供，这取决于使用的是核酸载体、最终的经纯化的蛋白质还是最终的疫苗形式。单位剂量定义为含有预先确定的量的治疗组合物，所述的治疗组合物按计算产生预期的，与其给予相关联的想要的应答，所述的给予也即通过合适的途径和治疗方案。所给予的量，其具体的途径和制剂是临床领域的技术人员的技能范围之内的。也可以对所治疗的受试者进行评估，具体地，评估该受试者的免疫系统的状态，和所期待的保护的状态。单位剂量不需要以单次的注射进行给予，而是可以在一段时间内进行连续的输注。本发明的单位剂量可以方便地用DNA/kg(或者蛋白质/Kg)体重来表示，范围在约0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.5、1、10、50、100、1000或者更多的mg/DNA/kg或者蛋白质/Kg体重进行给予。
类似地，所递送的抗-CD40抗原疫苗可以为约0.2到约8.0mg/kg体重。因此，在特定的实施方案中，可以将0.4mg、0.5mg、0.8mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、5.5mg、6.0mg、6.5mg、7.0mg和7.5mg的该疫苗递送到个体的体内。给予的疫苗的剂量在很大的程度上 取决于所治疗的受试者的体重和身体状态，以及给药途径和治疗的频率。包括预先连接到脂质体或者病毒递送载体的裸露的多核苷酸的药物组合物可以按照从1μg到1mg的多核苷酸对1μg到100mg蛋白质的范围的量进行给予。因此，具体的组合物可以包括独立地与1μg、5μg、10μg、20μg、3.0μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、100μg、150μg、200μg、250μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1mg、1.5mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或者100mg的载体相对应的1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、100μg、150μg、200μg、250μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或者1000μg的多核苷酸或者蛋白质。
本发明的抗体任选地可以共价或者非共价地连接到可检测的标记上。适合于该用途的可检测标记包括任意的可以由光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或者化学方法检测的组合物。在本发明中有用的标记包括磁性珠(例如DYNABEADS)，荧光染料(如异硫氰酸荧光素、德州红、罗丹明、绿色荧光蛋白等等)，放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或者32P)，酶(例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶及其它在ELISA中常用的酶)，以及比色标记如胶体金，或者有色玻璃或者塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等等)的珠。
检测该标记的方法对于本领域技术人员而言是公知的。因此，例如放射性标记可以使用感光胶片或者闪烁计数器进行检测，荧光标记物可以使用光电探测器检测发射的光进行检测。酶标记一般通过向该酶提供底物，并检测由酶对底物的活性所产生的反应产物进行检测，以及比色的标记通过简单地观看有色的标记进行检测。
本发明的抗体和/或免疫缀合物的组合物尤其地对于肠胃外给药是有用的，所述肠胃外给药如经静脉给药或者给药到体腔中。用于给药的组合物一般地包含溶于药学上可接受的载体的所述抗体和/或免疫缀合物溶液，所述的载体优选地为含水载体。多种含水载体都可以使用，例如缓冲的盐水等等。这些溶液是无菌的，并且一般地不含有不想要的物质。这些组合物可以通过传统的、公知的灭菌技术进行灭菌。为了满足合适的生理条件的要求，该组合物可以含有药学上可接受的辅料，如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂等等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。在这些制剂中，融合蛋白的浓度可以在很大范围内变化并主要基于流体的体积、粘度、体重 等等，以及针对所选择的具体给药方式以及患者的需求进行选择。
因此，本发明的用于经静脉给予的一般的药物免疫缀合物的组合物为约0.1到10mg每例患者每天。可以使用每例患者每天0.1到高达约100mg的剂量。用于制备可给药的组合物的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或者显而易见的，并描述于出版物如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE,19th ED.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1995)中。
本发明的组合物可以为了治疗性的治疗给药。在治疗应用中，组合物以足以治愈或者至少部分地缓解疾病及其并发症的量给药到患病的患者。将对于完成此目的而言充足的量定义为“治疗上有效的剂量”。对于此应用有效的量取决于疾病的严重程度和患者健康的大致状态。该化合物的有效量是在由医师或者其他有资格的观测者的记载中，提供症状(或多种症状)主观上的缓解，或者提供客观上可确认的改善的量。
组合物的一次或多次给药的实施取决于患者所需要，及其耐受的剂量和频率。无论如何，该组合物都应该提供足量的本发明的蛋白质，从而有效地治疗患者。优选地，该剂量给药一次，但是可以周期地施用，直到达到治疗效果或者直到副作用使得疗法中止。一般来说，所述的剂量足以治疗或者缓解疾病的症状或者体征，而不产生不想要的对患者的毒性。
本发明的免疫缀合物组合物的控释的肠胃外制剂可以制成植入物、油性注射剂或者颗粒系统。蛋白质递送系统的广泛概述，参见Banga,A.J.,THERAPEUTIC PEPTIDES ANDPROTEINS:FORMULATION,PROCESSING,AND DELIVERY SYSTEMS,Technomic PublishingCompany,Inc.,Lancaster,Pa.,(1995)，其在此结合作为参考。颗粒系统包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊含有作为中间芯的治疗蛋白。在微球中，治疗剂分布在该颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球和微胶囊一般地分别称作纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管具有约5μm的直径，从而只有纳米颗粒是经静脉给药的。微颗粒一般地直径在100μm左右，并经皮下或者经肌肉内给药。
可以将聚合物用于本发明的免疫缀合物组合物的离子控释。本领域已知有多种可降解的和不可降解的聚合物基质可以用于控释药物递送(Langer,R.,AccountsChem.Res.26:537-542(1993))。例如，嵌段共聚物，帕洛沙姆在低温下以黏的却流动性的的液体存在，但是在体温下形成半固体的凝胶，已经将羟基磷灰石用作蛋白质控释的微载体，和/或脂质体可以用作控释以及 脂类包裹的药物的药物靶向。已知此外有多种用于将治疗性的蛋白质进行受控的递送的系统。参见例如第5055303、5188837、4235871、4501728、4837028、4957735和5019369、5055303、5514670、5413797、5268164、5004697、4902505、5506206、5271961、5254342和5534496号美国专利，其各个的相关部分在此结合作为参考。
在本发明的抗体的多种不同用途中，包括由特定的人类细胞引起的各种疾病症状。例如，人源化形式的小鼠抗-CD40_12E12.3F3(ATCC登记号PTA-9854)，抗-CD40_12B4.2C10(保藏编号HS446，ATCC登记号___)和抗-CD40 11B6.1C3(保藏编号HS440，ATCC登记号___)，在本文中公开的抗体，这些抗体的一个应用是表达CD40的细胞的治疗、接触、成像、活化或失活。
在另一个实施方案中，本发明提供了递送抗原的试剂盒，所述抗原如CD40或者其免疫反应性的片段，其为缀合的或者为与一个或多个T细胞或者B细胞表位的融合蛋白的形式。如本文中所使用的，“生物样品”是生物组织或者流体的样品，其含有抗原。该样品包括但不限于来自活组织检查的组织、血液和血细胞(如白细胞)。优选地，所述的细胞是淋巴细胞，如树突细胞。生物样品还包括组织的片段，如出于组织学的目的取得的冷冻的片段。生物样品一般地得自多细胞的真核生物，优选地得自哺乳动物如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或者兔，以及更优选地得自灵长类动物，例如猕猴、黑猩猩或者人类。最优选地，该样品来自人类。本发明的抗体也可以在体内使用，例如作为用于体内成像的诊断性工具。
试剂盒一般地包括编码本发明的抗体(或其片段)的核酸序列，所述的抗体在羧基末端具有一个或多个构架部分或者多克隆位点，在该处可以插入一个或多个抗原的编码序列。在一些实施方案中，所述的抗体是人源化抗-CD40Fv片段，如scFv或者dsFv片段。除此之外，该试剂盒一般地包括说明材料，该说明材料公开本发明的抗体的使用方法(例如针对在使用树突细胞进行免疫之前将其加载到树突细胞中，所述的树突细胞可以是自身的树突细胞)。所述的试剂盒还可以包括附加的部分，从而便于将其用于设计试剂盒的具体应用。因此，例如该试剂盒可以额外地包括检测标记的方法(例如用于酶标记的酶底物，用于检测荧光珠的滤器设备，如羊抗小鼠HPP的合适的二级标记等等)。该试剂盒可以额外地包括缓冲液和其他成熟地用于具体方法的操作的试剂。该试剂盒和合适的容纳物对于本领域技术人员而言是 已知的。
在本发明的另一系列用途中，可以将由本发明的抗体所靶向的抗体于将靶向的细胞从培养物中的细胞群中清除。例如，如果选择特定群体的T细胞，可以使用本发明的抗体来富集具有进行的免疫应答的相反效果的T细胞群体。因此，例如可以通过向患者提供加载了抗原的树突细胞，从具有癌症的患者中培养的细胞中清除癌细胞，所述的抗原加载使用了本发明的抗体作为触发针对该癌症、病毒或者其他病原体的抗原的靶向部分。类似地，所述的抗体可以用于增加调节T细胞的群体，或者将其免疫应答朝着接近或者远离细胞毒性的T细胞应答方向发展或者甚至驱使B细胞应答。
抗-CD40_12E12.3F3
抗-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C-下划线区显示了重链V区氨基酸序列：
MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGST YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPPEPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS(SEQ ID NO.：1)
抗-CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C-下划线区显示了轻链V区氨基酸序列：
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSG VPSRFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC-(SEQ ID NO.：2)
抗-CD40_12B4.2C10
抗-CD40_12B4.2C10重链：
MEWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVLHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYPAYSGYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQKGEFV(SEQ ID No.：3)
抗-CD40_12B4.2C10轻链：
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCHHGNTLPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID No.：4)
抗-CD40_12B4.2C10轻链-可选的克隆(17K6)
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYRYQQKPGSSPKPWIYGTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID No.：5)
抗-CD40_11B6.1C3
抗-CD40_11B6.1C3重链：
MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDKASLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCAREDYVYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQKGEFV(SEQ ID No.：6)
抗-CD40_11B6.1C3轻链：
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFALKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID No.：7)
[抗-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C]-下划线区显示了重链V区序列：
AACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGG GGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACA TGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTAT TATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCG GCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTC AAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGCAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGC (SEQ ID NO.：8)
[抗-CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C]-下划线区显示了轻链V区序列：
ATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGAC TACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGTGCAAGTCAGGGCATTAGCAATTATT TAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAATTTTACACTCAGGAGTC CCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACCATCGGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGC CACTTACTATTGTCAGCAGTTTAATAAGCTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO.：9)
抗-CD40_12B4.2C10_H-V-hIgG4H-C重链
GAATGGAGTTGGATATTTCTCTTTCTTCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATGTTTTGCACTGGGTGAAACAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGGGCTATCCGGCCTACTCTGGGTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGC(SEQ ID NO.：10)
抗-CD40_12B4.2C10_K-V-hIgGK-C(变体1)轻链
GATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGGGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACAGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCACCCAAACCCTGGATTTATGGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAATATCATAGTTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO.：11)
抗-CD40_12B4.2C10_K-V-hIgGK-C(变体2)轻链
ATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCATCATGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO.：12)
抗-CD40_11B6.1C3_H-V-hIgG4H-C重链
GGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTACATGCACTGGGTGAAGCAAAGCCATGTAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTTACAATGGTGCTACTAGCTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCAGCTTGACTGTAGATAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGACTACGTCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGC(SEQ ID NO.：14)
抗-CD40_11B6.1C3_K-V-hIgGK-C轻链
AAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCGCACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO：15)
实施例1：抗-CD40-HIV肽疫苗
从大量的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位中选取五个19到32个氨基 酸长的序列，所述的表位是在不同的I类MHC分子的环境下，在HIV-1Nef、Gag和Env蛋白中识别出来的。已经报道了在小鼠中、在灵长类中以及在人类中可以使用脂肽疫苗有效地诱导CTL应答。将所述的五个HIV肽随后在C末端位置使用(Palm)-NH2基团进行修饰，并且所述的五个HIV肽序列已经在科技文献中[例如Characterization of a multi-lipopeptides mixture usedas an HIV-1 vaccine candidate(1999)Klinguer等人,Vaccine,Volume 18,259-267]，以及在专利申请中[Cytotoxic T lymphocyte-inducing lipopeptides and use asvaccines.Gras-Masse H.等人,专利号为EP0491628(1992-06-24)；US 5871746(1999-02-16)]有充分描述。
非常想要的HIV疫苗由与上述HIV肽融合的重组的抗-树突细胞受体抗体构成。本发明包括有效地产生蛋白和HIV疫苗的组合物和方法。
以下显示的序列是五个选择的HIV肽的氨基酸序列并且在每个HIV蛋白质内的氨基酸位置在括号中。
Nef(66-97)是:VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO.:16)
Nef(116-145)是:HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL(SEQ ID NO.:17)
Gag p17(17-35)是:EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO.:18)
Gag p17-p24(253-284)是:NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO.:19)
Pol 325-355(RT 158-188)是:AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO.:20)
本发明包括组装编码HIV肽和柔性接头序列的构建体的组合物和方法。重链表达载体通常具有Nhe I位点[g|ctagc]，该位点附加到重链的C末端残基密码子上的，或者[对于flex-vl载体]附加到flex-vl序列的C末端密码子的。柔性接头序列或者HIV肽序列在N-末端柔性接头或者HIV肽密码子之前具有Spe I位点[a|ctagt]，附加到C-末端柔性接头或者HIV肽密码子的Nhe I位点，随后为TGA终止密码子，接着是Eco RI位点，然后是Not I位点。将该柔性接头或者HIV肽Spe I-Not I片段插入到使用Nhe I–Not I消化制备的重链载体中。Nhe I和Spe I是相容的位点，但是当连接时，[g|ctagt]不再是Nhe I或者Spe I位点。因此可以将额外的Spe I-Not I柔性接头或者HIV肽片段插入到新的Nhe I-Not I的间隔中，所述的新的Nhe I-Not I的 间隔位于最初的柔性接头或者HIV肽的远端。以这种方式，可以将HIV肽链和/或柔性接头编码区附加到表达载体重链的编码区。
图1显示了与不同的HIV肽融合的蛋白质A亲和性重组抗体(第1至5泳道)，所述的重组抗体由经转染的293F细胞分泌，经还原性SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析。图2显示了与不同的HIV肽融合的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第1和第2泳道)，所述的重组抗体由经转染的293F细胞分泌，随后通过还原性SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析。图3显示了与不同的HIV肽链融合的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第1到第5泳道)，所述的抗体从转染的293F细胞中分泌，并经还原性SDS.PAGE和考马斯亮蓝染色分析。图4显示了与不同的HIV肽链融合的蛋白质A亲和纯化的重组抗体(第1到第6泳道)，所述的抗体从转染的293F细胞中分泌，然后经还原性SDS.PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
实施例2.HIV肽疫苗——体外抗原靶向生物学
在体外对HIV患者进行抗-CD40.LIPO5HIV肽疫苗测试。为了研究αCD40.LIPO5HIV肽融合重组抗体(αCD40.LIPO5rAb)介导抗原呈递的能力，将融合的rAb加入到来自感染了HIV的个体的血细胞中，并测量来自外周血液单核细胞(PBMC)的细胞因子产生。
图5描述了在体外使用的方案，该方案用于检测αCD40.LIPO5HIV肽融合重组抗体(αCD40.LIPO5rAb)在PBMC培养物的环境下，引发抗原特异性T细胞增殖的效力。总地来说，将来自HIV患者的单采(apheresis)的PBMC(2x106细胞/ml)与一定剂量范围的αCD40.LIPO5HIV肽疫苗进行温育。在第2天，在培养物中加入100U/ml IL-2并且随后每两天使用100U/ml IL-2更换培养基。在第10天时，使用单个的长肽将扩增的细胞激发48小时，所述的长肽对应于αCD40.LIPO5 HIV肽融合rAb中掺入的5个HIV肽序列。随后，收集培养物上清，并使用多珠检测(multiplex beads assay)(Luminex)评估细胞因子的产生(所述产生通过对肽序列具有T细胞受体[TCR]特异性的T细胞进行)。如果产生依赖于抗-CD40.LIPO5HIV肽疫苗的存在，在此检测中测得的抗原特异性的细胞因子产量反映了在培养物中通过抗原呈递细胞[APC]的疫苗摄取，以及肽的加工[蛋白酶降解]和呈递到MHC上。具有TCR的T细胞识别抗原-MHC复合物，所述的TCR仅识别特定的HIV抗原-MHC复合物。在HIV患者中，该细胞可能 是在患者中作为对HIV感染的应答而扩增的记忆T细胞。
APC可以呈递来自疫苗中所有5个HIV肽区中的表位。图5中的方案用于检测作为对抗-CD40.LIPO5肽疫苗的应答，HIV特异性的T细胞在体外的扩增。在图6中显示了来自7个个体中的结果，并且该结果表明，αCD40.LIPO5 HIV肽融合rAb在所研究的全部患者中引发HIV肽特异性的IFNγ应答。因此，所述的α-CD40.LIPO5 HIV肽融合rAb使DC能将疫苗中5个肽中的至少1个或者2个不同的肽交叉呈递到各个个体的T细胞。然而，这一组激发了IFNγ产生的HIV肽对于各个患者而言是不同的——很可能反映了对HIV特异性的记忆T细胞的不同池。
图6A-C显示了在来自HIV患者的PBMC中，HIV肽特异性的IFNγ的产生，所述的PBMC与不同浓度的抗CD40.LIPO5肽链疫苗进行温育。C是对照组，其未接受疫苗，并且限定了培养物对各个肽的基线反应。
图7是αCD40.LIPO5肽疫苗针对来自8例HIV患者的5个肽区的应答的总结。该数据基于肽特异性的IFNγ产生。图7显示了在8例HIV患者中观察到的抗原特异性的应答。该数据证实了该疫苗的所有HIV肽区具有被加工并呈递到T细胞的能力——假定这一可能的情况，仅当合适的TCR-耐受细胞存在时，才能观察到对这些肽的应答。因此，各个患者有该细胞的特征谱。
αCD40.LIPO5肽抗体可以引起能分泌广谱的细胞因子的抗原特异性T细胞的增殖。
图8A-B显示了αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗引起HIV肽特异性的T细胞的扩增，所述的T细胞能够分泌多种细胞因子——在疫苗中想要的特征。在图8A-B中，αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗引发gag253、nef66、nef116和pol325肽特异性的应答，其特征在于多种细胞因子的产生。这是患者A5。
抗-CD40.LIPO5 HIV肽体外接种DC。
图9显示了检测αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗指导抗原特异性T细胞扩增的能力的方案，所述的抗原特异性T细胞是由DC靶向摄取，并将肽表位呈递到其表面的MHC复合物上产生的。简单地说，HIV患者的单核细胞通过与IFNα和GM-CSF培养2天，分化成DC。随后加入不同剂量的αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗或者5种肽的混合物并持续18小时。第3天，在共培养物中加入自体T细胞(比例为1：20)。在第5天，在培养物中加入100U/ml IL-2，并且随后每2天使用100U/ml IL-2更换培养基。在第 10天，使用单个的长肽将扩增的细胞再激发48小时，所述的长肽对应于在αCD40.LIPO5 HIV肽融合rAb中掺入的5个HIV肽序列。随后，收集培养物上清，并使用Luminex评估细胞因子的产生。
图10A-B显示了对HIV肽应答的细胞因子分泌，所述的HIV肽来自使用不同剂量的αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗处理的DC-T细胞共培养物。这是患者A10。显示于图10A-B中的患者A10中的结果证实了抗原特异性T细胞的扩增对应于在gag17、gag253和pol325 HIV肽区中的表位。在多数的情况下，αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗和非-LIPO5疫苗[5种非脂质化的HIV肽的混合物，其具有对应于αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗的序列的序列]的应答之间有一致性。因此，在这里αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗在体外的环境下发挥良好的作用，其中经培养的DC有效地加工HIV抗原并将其呈递到T细胞。这例证了αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗用于体外接种的用途，由此“经接种疫苗的DC”经冷藏用于未来再次注射到同一例患者中。
αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗——柔性接头区可能的免疫效果。使HIV肽序列散布于αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗自身中的柔性接头序列其自身可能含有T细胞表位。图11A-B显示了患者A4未表现出具有显著的记忆T细胞池，所述的记忆T细胞对与αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗内的5个接头序列具有特异性。在图11A-B中，来自使用αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗处理的患者A4的PBMC引发抗原特异性T细胞的扩增，所述的T细胞对gag253区有特异性，而对柔性接头序列没有特异性。使用了在图9中描述的方案，其中柔性接头长肽依次对应于加粗区，HIV肽为粗斜体，其示于下文的序列中。
αCD40.LIPO5HIV肽疫苗重链序列以加粗显示柔性接头区，以下划线显示连接序列，以及HIV肽区以粗斜体显示。
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQ AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS.(SEQ ID NO.：21).
在图12A中，来自使用αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗处理的患者A3的PBMC引发抗原特异性T细胞的扩增，所述的T细胞对gag253、nef66和nefl16区有特异性，而对柔性接头序列没有特异性。使用了在图1中描述的方案，其中柔性接头长肽在序列上对应于图8中所示的加粗区。
图12B-1和B-2显示了与30nM的三种不同的HIV5肽DC靶向疫苗温育HIV患者A17PBMC引起的HIV抗原特异性T细胞应答。将细胞与IL-2培养10天，并随后使用单个的长肽进行刺激，所述的单个的长肽对应于DC靶向疫苗中所包括的5个HIV肽序列。1小时后，加入布雷菲德菌素A(brefeldin A)，并继续温育另外5小时，然后染色进行FACS分析。FACS图显示了对CD3＋T细胞的IFNg和CD8染色。圆圈标明了不与疫苗培养的PBMC的细胞相比，IFNg＋细胞发生显著的疫苗引发的扩增。CD8-细胞是CD4＋T细胞。数据显示抗-CD40.HIV5pep疫苗引发nef66(N66)-特异性的CD8＋T细胞的强烈扩增，这一点在其他DC靶向载体中未见到。
这些是基于LIPO5 HIV肽链的数据。例如所述的抗-CD40重链是抗-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gagl7-f1-gag253-f2-nefl16-f3-nef66-f4-pol158]，其序列为：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAASAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS(SEQ ID NO.：22).
图12C-1和C-2是与图12B中所显示的研究类似的研究，除了PBMC是来自不同的HIV患者(A2)外。该数据显示了由抗-CD40.HIV5pep，而非其他的DC靶向疫苗，或者由肽自身的混合物引发的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞应答。
图12D显示了基于对15例不同的HIV肽应答[取自3例患者的5个肽区]的分析，在引发广谱的HIV肽特异性的CD8+和CD4+T应答方面，抗-CD40.HIV5pep疫苗明显优于抗-DCIR.HIV5pep、抗-LOX-1.HIV5pep和非-LIPO5的混合物。
柔性接头序列的免疫原性对αCD40.LIPO5HIV肽疫苗的设计有很大关系。前文中所示的有限的数据集，测试对柔性接头序列内的表位有特异性的T细胞的记忆(recall)表明抗这些序列的人类全部抗体(human repertoire)是可变的。同时，这些序列从头引发反应的能力未经测试。可以使用本发明测试在猴子中对αCD40.LIPO5HIV肽疫苗的应答。如果有必要的话，在这些区中特定的较不想要的表位可以通过预测性的计算方式和肽激发扫描确定，并随后通过引入破坏TCR相互作用的突变变化将其消除。
人源化抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区和轻链可变区的构架区来自供体人类的抗体，并且其中所述的轻链互补决定区与具有氨基酸序列SASQGISNYLN(SEQ ID NO.：41)的CDR1L、具有氨基酸序列YTSILHS(SEQ ID NO.：23)的CDR2L、具有氨基酸序列QQFNKLPPT(SEQ ID NO.：23)的CDR3L相比具有至少80％、90％、95％或者更高的同源性；并且其中所述的重链互补决定区与CDR1H、 CDR2H和CDR3H相比包含至少80％、90％、95％或者更高的同源性，所述的CDRlH具有氨基酸序列GFTFSDYYMY(SEQ ID NO.:24)，所述的CDR2H具有氨基酸序列YINSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO.:25)，以及所述的CDR3H具有氨基酸序列RGLPFHAMDY(SEQ ID NO.:26)。例如，所述的人化抗体可以包含与SEQ ID NO.:2、4、5或者7的构架相比具有至少95％的同源性的VL构架，且包含与SEQ ID NO.:1、3或者6的构架相比具有至少95％的同源性的VH构架。在另一个方面，所述的供体CDR序列来自抗-CD4012E12.3F3、抗-CD40_12B4.2C10、抗-CD40_11B6.1C3或其重链或轻链的组合，并且进一步地，其中该抗体或其片段特异性地结合于CD40。
实施例3.前列腺特异性抗原(PSA)，细胞周期蛋白D1，MART-1，流感病毒核蛋白 (NP)和流感病毒血凝素的HA1亚基(H1N1,PR8)和肽筛选。
抗-CD40mAb的内在化。将1x106IL-4DC在冰中与3mg/ml的人类γ球蛋白在PBS中温育1小时，所述的PBS含有3％BSA，从而阻止非特异性的结合。将细胞在冰上与Alexa 568标记的抗-CD40mAb震荡30分钟(都在非特异性的封闭液中且最终浓度是20ng/ml)。随后洗涤细胞，并使表面结合的抗体在37℃下内在化不同的次数，持续0到90分钟。在内在化之后，将细胞使用冰冷的PBS洗涤两次，所述的PBS含有1％的BSA和0.05％的叠氮化钠(PBA)，并且在冰冷的1％无甲醇的甲醛(MFF)的PBS溶液中4℃下固定过夜。将细胞在PBS 3％BSA中4℃下渗析20分钟，所述的PBS 3％BSA含有0.5％的皂角苷(PBAS)，并且转移到96孔的圆底聚丙烯微滴定板中。使用冰冷的PBAS洗涤两次之后，将细胞在冰上与3mg/ml人类γ球蛋白在PBAS中温育1小时。BODIPY-鬼笔环肽在PBAS中稀释，并与细胞在冰中温育1小时。将细胞进一步地用核复染剂TOPRO-II染色。在Leica SP1共聚焦显微镜上对载玻片进行成像。
细胞。用于细胞表面染色的单克隆抗体购自BD Biosciences(CA)。将来自健康供体的单核细胞(1×106/ml)在含有GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(50ng/ml)或者GM-CSF(100ng/ml)和IFNα(500单位/ml)(R&D,CA)的Cellgenics培养基(法国)中培养。对于IFNDC而言，在第1天，供给细胞IFNα和GM-CSF。对于IL-4DC而言，在第1天和第3天，在培养基中 补充同样量的细胞因子。使用PercollTM gradients(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)通过密度梯度离心从血沉棕黄层中分离PBMC。使用StemCell kits(CA)纯化全部的CD4+和CD8+T细胞。
肽。合成了前列腺特异性抗原(PSA)、细胞周期蛋白D1、MART-I、流感病毒核蛋白(NP)和流感病毒血凝素的HA1亚基(H1N1PR8)的15聚体(有11个氨基酸重叠)(Mimotopes)。
DC和T细胞的共培养和细胞因子的表达。将加载了重组融合蛋白(抗-CD40-HA1、对照Ig-HA1、抗-CD40-PSA、抗-CD40-细胞周期蛋白D1、抗-CD40-MART-1、抗-MARCO-MART-1和对照Ig-MART-1)的5x103DC与2x105CFSE-标记的CD4+T细胞共培养8天。在使用APC标记的抗-CD4抗体对细胞染色后，通过测量CFSE的稀释度测试其增殖。
为了测量细胞内的IFNγ的表达，将CD4+T细胞使用1-5μM所标明的肽在布雷菲德菌素甲A的存在下再激活5小时。在独立的实验中，将CD4+T细胞与所标明的肽再激活36小时，并且随后通过Luminex测量由CD4+T细胞所分泌的细胞因子。
将CD8+T细胞与DC在20单位/ml IL-2和20单位/ml IL-7的存在下共培养10天。在培养的第10天，使用所标明的抗-CD8和四聚体对CD8+T细胞进行染色。
CTL检测。在培养的第10天，进行5-h的51Cr释放检测。首先将T2细胞与51Cr进行同位素脉冲标记，并随后使用MART-1的10μM HLA-A2表位或者流感病毒M1的1nM表位进行标记。使用无肽的T2细胞作为对照。计算三份样品的平均值，并且使用下式确定特异性裂解的百分比：特异性裂解的百分比＝100x(实验中51Cr的释放-对照51Cr的释放)/(51Cr释放的最大值-对照51Cr的释放)。最大的释放指来自2.5％Triton X-100的靶标中的读数。
对人的CD40特异性的mAb的制备。为了对鼠进行免疫及筛选mAb，分别地制备了受体外功能域hlgG(人类的IgG1Fc)和AP(人类胎盘碱性磷酸酶)的融合蛋白。按照[J.Immunol.163:1973-1983(1999)]所描述对人类IgFc融合蛋白的哺乳动物载体进行了改造。所述的用于受体胞外功能域、AP蛋白的哺乳动物表达载体采用PCR扩增AP的133-1581残基(gb|BC009647|)的cDNA生成，同时加入了框内附近的Xho I位点和远端的6个C-末端的His残基及随后的TGA终止密码子和Not I位点。该Xho I-Not I片段在上述的受体胞外功能域IgG载体中替代了人类的IgG Fc编码序列。使用FreeStyleTM 293 Expression System(Invitrogen,CA)按照生产商的指南制备融合蛋白(1mg总质粒DNA加1.3ml 293Fectin试剂/L的转染物)。使用1ml HiTrap蛋白质A亲和层析(GE Healthcare,CA)，以0.1M甘氨酸，pH2.7下洗脱，对受体胞外功能域hIgG进行纯化。使用2M Tris中和馏分，并随后对PBS进行透析。
通过传统的技术产生鼠mAb。总地来说，对六周龄的BALB/c小鼠皮下注射(i.p.)20μg受体胞外功能域.hlgGFc融合蛋白及Ribi佐剂进行接种，随后在10天及15天之后使用20μg的抗原进行加强。三个月后，在取得脾脏之前三天对所述的小鼠再一次进行加强。在最终的加强之后三到四天，收获小鼠的引流淋巴结(draining lymph nodes)(LN)。将来自脾脏的B细胞或者LN细胞与SP2/O-Ag 14细胞(ATCC)进行融合。筛查杂交瘤的上清，从而分析与单独的融合组分相比，或者与融合到碱性磷酸酶的受体胞外功能域相比，对受体胞外功能域融合蛋白有特异性的mAb[J.Immunol.163:1973-1983(1999)]。随后使用短暂感染了编码全长受体cDNA的表达质粒的293F细胞在FACS中筛查阳性细胞。所选择的杂交瘤是单个细胞克隆的，并在CELLine烧瓶(Integra,CA)中扩增。将杂交瘤上清与等体积的1.5M甘氨酸、3MNaCl、1x PBS、pH 7.8(结合缓冲液)混合，并与MabSelect树脂(GE Healthcare,CA)(800ml/5ml上清一起震荡。将该树脂使用结合缓冲液进行洗涤，并使用pH 2.7的0.1M甘氨酸进行洗脱。随后使用2M Tris进行中和，将mAb对PBS进行透析。
重组mAb的表达和纯化。使用RNeasy试剂盒(Qiagen,CA)从杂交瘤细胞中制备总RNA，并将其用于cDNA的合成和PCR(SMART RACE试剂盒，BD Biosciences)，所述的PCR使用提供的5’引物和基因特异性的3’引物(mIgGκ,5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3'(SEQ ID NO.:48)；mIgG2a,5'ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3')(SEQ ID NO.:49)。随后将PCR产物进行克隆(pCR2.1TA试剂盒,Invitrogen)并通过DNA测序(MC Lab,CA)进行表征。将所得到的序列用作小鼠的重链(H)和轻链(L)可变(V)区的cDNA，使用特定的引物将信号肽和V区PCR扩增，同时为了向编码下游的人类IgGκ或者IgG4H区的表达载体中进行克隆，加入侧翼的限制性位点。通过扩增侧翼为Xho I和Not I位点的残基401-731(gi|63101937|)，并将其插入到pIRES2-DsRed2(BD Biosciences)的Xho I- Not I的间隔区中，构建了用于表达嵌合的mVκ-hIgκ的载体。使用PCR从起始密码子扩增mAb VK区，将Nhe I或者Spe I以及随后CACC附加到编码(例如gi|76779294|的残基126)的区域及附加了远端Xho I位点。该PCR片段随后克隆到前述的载体的Nhe I-Not I间隔区。对照人类IgGκ序列对应于gi|49257887|残基26-85和gi|21669402|残基67-709。对照的人类IgG4H载体对应于具有S229P和L236E取代的gi|19684072|的残基12-1473，所述的取代使得二硫键稳定化，并且防止剩余的FcR相互作用[J.Immunol.164:1925-1933(2000)]，其插入在pIRES2-DsRed2的Bgl II和Not I位点之间，与此同时加入序列5'gctagctgattaattaa 3'而不是中止密码子。使用PCR从起始密码子开始扩增mAb VH区，在编码gi|19684072|的残基473的区中附加CACC随后BgI II位点。随后将该PCR片段克隆到上述载体的Bgl II-Apa I间隔中。
Flu HA1融合蛋白的表达和纯化。所述的Flu HA1抗原的编码序列是CipA蛋白质[热纤梭菌(Clostridium thermocellum)]gi|479126|的残基147-160，随后为具有P321L的取代的血凝素[甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34(H1N1))]gi|126599271|残基18-331，并且具有6个C-端组氨酸残基，该编码序列插入到重链载体的Nhe I和Not I位点之间，从而编码重组抗体-HA1融合蛋白(rAb.HAl)。类似地，重组抗体-PSA融合蛋白(rAb.PSA)通过将gi|34784812|前列腺特异性抗原残基101-832,近端序列GCTAGCGATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACACTTCTAGCGC(SEQ IDNO.:27)(Nhe I位点和CipA间隔区)和远端Not I位点插入到同一个重链载体中进行编码。按照上文对hFc融合蛋白的描述，表达并纯化重组抗体蛋白。在一些情况下rAb的抗原编码区和相对应的L链编码区转移到分别的cetHS-puro UCOE载体(Millipore,CA)中。UCOE载体与预适应性的无血清的悬浮细胞系联合使用使得能够快速地生产大量的蛋白[Cytotechnology 38,43-46(2002)]。将生长在具有GlutaMAX和HT的培养基补充物(Invitrogen)的CD-CHO中的CHO-S细胞以5x105ml进行接种，24小时后，转染到500ml的Corning Ehrlenmyer烧瓶中，并在125rpm下，在8％CO2中进行温育。在转染的当天，将存活率至少为95％的1.2x107细胞加入到125ml的烧瓶中，最终体积为30ml的具有GlutaMAX的CD-CHO中。将具有48ml的FreeStyle Max试剂(Invitrogen)的0.6ml OptiPRO SFM(Invitrogen)在温和混合下加入 到0.6ml的OptiPRO SFM中混合并经无菌过滤到24μg SeeI线性化的轻链载体和24μg的Sce I-线性化的重链载体中。在20分钟之后，将DNA-脂类复合物在涡旋震荡下缓慢加入到125ml CHO-S培养烧瓶中。将细胞温育24小时，随后加入30ml的CD-CHO与CHO-M5合并的培养基溶液(Sigma，CHO Kit 1的C0363 component部件)，所述的培养基溶液含有5mg/ml嘌呤霉素(A.G.Scientific，CA)，2xGlutaMAX和0.25xPen/Strep(Invitrogen)。在第2天，将另外的5mg/ml嘌呤霉素直接加到培养物中并在转染后第六天开始，在细胞存活之后，使选择进行～10-14天。存活的细胞的计数下降，并且存活密度是～2-3x106/ml时，将该细胞以1E6/ml转移到的新鲜的选择培养基中(具有2X GlutaMAX，0.25xPen/Strep，10mg/ml嘌呤霉素的CD CHO-S+CHO M5)。当存活率达到＞90％时，制备冷冻细胞原种。当在500ml的烧瓶中细胞密度超过2x106/ml时，将细胞分到选择培养基中，直到放大到在500ml的烧瓶中有4×250ml时。当细胞存活率下降到80％以下并且最大的最终细胞密度～7x106/ml时，收集上清。内毒素水平低于0.2单位/ml。
重组的Flu M1和MART-1蛋白的表达和纯化。在将Nhe位点I掺入到起始密码子的远端及将Not I掺入到终止密码子的远端的同时，使用PCR来扩增流感A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)M1基因的ORF。将经切割的片段克隆到pET-28b(+)(Novagen)中，将所述的M1ORF与His6的标签置于框内，从而编码His.Flu M1蛋白。编码来自热纤梭菌(C.thermocellum)(未公开)的N-末端169个残基的黏连蛋白功能域的pET28b(+)衍生物表达Coh.His，所述的N-末端169个残基的黏连蛋白功能域插入在Nco I和Nhe I位点之间。为了表达Cohesin-Flex-hMART-1-PeptideA-His，将序列GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCG(SEQ ID NO.：28)(编码
DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAE ILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP(SEQ IDNO.：29)-斜体的残基是免疫显性的HLA-A2-限制性肽，并且围绕该肽的下划线的残基来自MART-1)插入到上述载体的Nhe I和Xho I位点之间。该蛋白质在大肠杆菌株BL21(DE3)(Novagen)或者T7 Express(NEB)中进 行表达，所述的菌株在LB中在37℃下生长，同时进行卡那霉素抗性选择(40μg/ml)，并且当加入120mg/L的IPTG时，以200转/分震荡直到对数生长中期。三小时之后，通过离心收获该细胞，并于-80℃下储藏。将得自各个1L的发酵物中的大肠杆菌细胞重新悬浮在含有0.1ml蛋白酶抑制剂Cocktail II(Calbiochem,CA)的30ml冰冷的50mM的Tris，1mM EDTA pH 8.0中(缓冲液B)。将细胞在冰上于设定18(Fisher SonicDismembrator 60)下超声降解2×5分钟，在该设定下有5分钟的停止期，并随后于4℃下17000r.p.m(Sorvall SA-600)转20分钟。为了纯化His.Flu M1，将50ml细胞裂解液上清部分通过5ml Q琼脂糖珠，并在琼脂糖的流出液中加入pH 7.9的6.25ml 160mM Tris，40mM咪唑和4M NaCl。该流出液以4ml/min加载到充有Ni++的5ml HiTrap螯合的HP柱上。将柱结合的蛋白使用20mM NaPO3,300mM NaCl pH 7.6(缓冲液D)清洗，随后使用100mM H3COONa pH4.0进行再次清洗。结合的蛋白使用pH 4.0的100mMH3COONa进行洗脱。收集峰组分，并以4ml/min将其加载到5ml HiTrap S柱上，所述的柱子使用100mM H3COONa pH 5.5进行平衡，并使用平衡缓冲液进行清洗，随后使用具有0-1M NaCl的梯度的，pH 5.5的50mMNaPO4进行洗脱。收集位于约500mM NaCl的峰组分。为了进行Coh.Flu M1.His的纯化，按照上文将来自2L培养物的细胞进行裂解。在离心之后，在上清中加入2.5ml的Triton X 114并在冰上温育5分钟。进一步地在25℃下温育5分钟之后，将上清从Triton X 114中分离，随后在25℃下进行离心。重复此提取，并将上清通过5ml Q琼脂糖珠，并且在Q琼脂糖的流出液中加入pH 7.9的6.25ml 160mM Tris,40mM咪唑,4M NaCl。随后通过Ni++螯合色谱将蛋白质按照上文所述地进行纯化，并且使用具有0-500mM咪唑的缓冲液D进行洗脱。
图13显示了抗-CD40mAb:IL-4DC的内在化。使用500ng/ml的抗-CD40-Alexa 568处理IL-4DC。图14显示了由抗-CD40HA1靶向的DC增殖的CD4和CD8 T细胞。将负载2μg/m1的抗-CD40-HA或者对照Ig-HA1的5x10e3 IFNDC与CFSE标记的自体CD4+或CD8+T细胞(2×10e5)共培养7天。随后使用抗-CD4或者抗-CD8抗体对细胞进行染色。通过测定CFSE的稀释度来检测细胞增殖。图15显示了HA1融合蛋白对CD4+T增殖的滴定。将负载了融合蛋白的IFNDC(5K)与CFSE标记的CD4+T细胞(200K)共培养7天。图16显示了由抗-CD40-HA1靶向的IFNDC激活HA1-特异性 的CD4+T细胞。使用负载5μM的标记肽的DC再刺激CD4+T细胞，并且随后将细胞外IFNγ染色。图17显示了由抗-CD40-HA1靶向的IFNDC激活HA1-特异性的CD4+T细胞。使用负载5μM的标记肽的DC再活化CD4+T细胞36小时，并且随后分析培养物上清液以测定IFNγ。图18显示了靶向CD40导致了MART-1特异性的CD8+T细胞的交叉敏化(cross priming)增强。将负载融合蛋白的IFNDC(5K/池)与经纯化的CD8+T细胞共培养10天。使用抗-CD8和四聚体对细胞进行染色。细胞来自健康的供体(HLA-A*0201+)。图19显示了靶向CD40导致MART-1特异性的CD8+T细胞的交叉敏化增强(使用来自不同的健康供体的细胞进行8次重复实验的汇总)。图20显示了使用抗-CD40-MART-1靶向的IFNDC诱导的CD8+CTL是有功能的。将使用融合蛋白靶向的IFNDC共培养的CD8+T细胞与负载了10μM肽表位的T2细胞混合。图21显示了使用IFNDC诱导的CD8+CTL是有功能的，所述的IFNDC使用抗-CD40-Flu M1进行靶向。将与融合蛋白靶向的IFNDC共培养的CD8+T细胞与负载了1.0nM肽表位的T2细胞混合。图22显示了测试由连接到PSA(前列腺特异性抗原)的抗-CD4012E12组成的疫苗引发原态T细胞群体扩增的能力的方案的概括。PSA特异性CD4+T细胞对应于宽范围的PSA表位。总地来说，将健康供体的单核细胞与IFNα和GM-CSF培养得到的DC与该疫苗进行温育。次日，将细胞放置在新鲜的培养基中，并加入相同供体的纯CD4+T细胞。几天之后，加入PSA肽，并且在4小时之后测定在培养物上清液中分泌的γ-IFN水平。
图23显示了多种PSA肽引发强烈的γ-IFN产生反应，这表明抗-CD4012E12和类似的抗-CD40剂能有效地将抗原递送到DC，导致引发针对该抗原的多个表位的免疫应答的敏化。PSA抗原的肽定位。将加载了2μg/ml的抗-CD40-PSA的5x10e3 IFNDC与经纯化的自体CD4+T cells(2x10e5)共培养8天。随后将细胞与5μM的得自PSA的单个肽一起重新激活36小时。通过Luminex测量IFNγ的量。细胞来自健康的供体。
图24显示了抗-CD40-PSA靶向的DC诱导PSA-特异性的CD8+T细胞应答。使用1μgmAb融合蛋白将IFNDC与PSA进行靶向。将经纯化的自体CD8+T细胞共培养10天。将细胞使用抗-CD8和PSA(KLQCVDLHV)-四聚体进行染色。细胞来自HLA-A*0201阳性的健康供体。该结果证实了抗-CD40将PSA有效地递送到DC，其则引发PSA特异性的CD8+T细胞的扩增。总地来说，将加载了2μg/ml的抗-CD40-PSA 与经纯化的自体CD8+T细胞(2x10e5)共培养10天。随后使用四聚体将细胞染色。细胞来自HLA-0*201阳性的健康供体。
图25示意图(左侧)和肽池的T细胞的IFNγ产生，以及对照为供体2。将加载了2μg/ml抗-CD40-细胞周期蛋白Dl的5x10e3IFNDC与经纯化的自体CD4+T细胞(2x10e5)共培养8天。随后将细胞由得自细胞周期蛋白D1的5μM的单个的肽在布雷菲德菌素甲A的存在下，进行重新刺激5小时。将细胞进行染色，从而测量细胞内的IFNγ表达。
图26显示了肽扫描和T细胞的IFNγ产生，所述的T细胞得自图25中所示的肽池，以及对照为供体2。将加载了2μg/ml抗-CD40-细胞周期蛋白D1的5x10e3 IFNDC与经纯化的自体CD4+T细胞(2x10e5)共培养8天。随后将细胞由得自细胞周期蛋白D1的5μM的单个的肽在布雷菲德菌素甲A的存在下，进行重新刺激5小时。将细胞进行染色，从而测量细胞内的IFNγ表达。
总之，通过CD40将抗原递送到最为有效的抗原呈递细胞DC是有效地诱导和激活抗原特异性的CD4+和CD8+T细胞介导的免疫的方式。因此，由抗-CD40mAb制备的疫苗能诱导针对癌症和感染的有效免疫。
肽信息：
HAl序列：
MKANLLVLLCALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCR(SEQ IDNO.：30)
LKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELRE(SEQ IDNO.：31)
QLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNS(SEQ IDNO.：32)
YVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQA(SEQ IDNO.：33)
GRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLG(SEQ IDNO.：34)
AINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSI(SEQ ID NO.：35)
图17中的肽序列
肽22：SSFERFEIFPKESSWPN(SEQ ID NO.：36)
肽45：GNLIAPWYAFALSRGFG(SEQ ID NO.：37)
肽46：WYAFALSRGFGSGIITS(SEQ ID NO.：38)
NP序列：
MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNS(SEQ IDNO.：39)
LTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIW(SEQ IDNO.：30)
RQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAG(SEQ IDNO.：41)
AAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMD(SEQ IDNO.：42)
QVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVG(SEQ IDNO.：43)
IDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLST(SEQ IDNO.：44)
RGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPF(SEQ IDNO.：45)
DRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFD(SEQ IDNO.：46)
MSNEGSYFFGDNAEEYDN(SEQ ID NO.：48)
图23中肽的序列
肽22：GKWVRELVLYDKEEIRR(SEQ ID NO.：49)
肽33：RTGMDPRMCSLMQGSTL(SEQ ID NO.：50)
肽46：MCNILKGKFQTAAQKAM(SEQ ID NO.：51)
前列腺特异性抗原(PSA序列)
MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV(SEQ IDNO.：52)
LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD(SEQ IDNO.：53)
LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS(SEQ IDNO.：54)
NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP(SEQ IDNO.：55)
SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO.：56)
图23中肽的序列
肽1：APLILSRIVGGWECE(SEQ ID NO.：57)
肽4：ECEKHSQPWQVLVAS(SEQ ID NO.：58)
肽25：GDDSSHDLMLLRLSE(SEQ ID NO.：59)
肽26：SHDLMLLRLSEPAEL(SEQ ID NO.：60)
肽49：SGDSGGPLVCNGVLQ(SEQ ID NO.：61)
肽54：GSEPCALPERPSLYT(SEQ ID NO.：62)
肽56：ERPSLYTKVVHYRKW(SEQ ID NO.：63)
肽58：VVHYRKWIKDTIVAN(SEQ ID NO.：64)
细胞周期蛋白D1的序列
MRSYRFSDYLHMSVSFSNDMDLFCGEDSGVFSGESTVDFSSSEVDSWPGDSIACFIEDER(SEQ IDNO.：65)
HFVPGHDYLSRFQTRSLDASAREDSVAWILKVQAYYNFQPLTAYLAVNYMDRFLYARRLP(SEQ IDNO.：66)
ETSGWPMQLLAVACLSLAAKMEEILVPSLFDFQVAGVKYLFEAKTIKRMELLVLSVLDWR(SEQ IDNO.：67)
LRSVTPFDFISFFAYKIDPSGTFLGFFISHATEIILSNIKEASFLEYWPSSIAAAAILCV(SEQ IDNO.：68)ANELPSLSSVVNPHESPETWCDGLSKEKIVRCYRLMKAMAIENNRLNTPKVIAKLRVSVR(SEQ IDNO.：69)
ASSTLTRPSDESSFSSSSPCKRRKLSGYSWVGDETSTSN(SEQ ID NO.：70)
图26中肽的序列。
肽7：DRVLRAMLKAEETCA(SEQ ID NO.：71)
肽8：RAMLKAEETCAPSVS(SEQ ID NO.：72)
肽10：TCAPSVSYFKCVQKE(SEQ ID NO.：73)
MART-1抗原。MART-1是与肿瘤关联的黑色素细胞分化抗原。使用MART-1抗原进行接种可以刺激宿主的细胞毒性T-细胞应答，导致肿瘤细胞的裂解，该应答是针对表达黑色素细胞分化抗原的肿瘤细胞的。
图27显示了抗-CD40-MART-1肽抗体的表达和构建体设计。图28是MART-1的对CD4+和CD8+免疫显性的表位的总结。图27和28显示了柔性接头技术的应用，该技术使得能够成功地表达与人类MART-1的大部分(～2/3)融合的重组抗-DC受体靶向抗体。融合到整个MART-1的编码区域的重链的C末端的重组抗体完全不从哺乳动物生产细胞中分泌[未显示]。Flex-vl-hMART-l-Pep-3-f4-Pep-l加合物的表达尤其好，并且是MART-1靶向的疫苗的一个优选实施方案，具有MART-1表位的最大负载的Flex-vl-hMART-l-Pep-3-f4-Pep-l-f3-Pep-2也是如此。MART-1的幻灯片演示的第2页显示这些加合物可以成功地附加到多种抗-DC受体载体上。
下面的序列是pep3-pepl-pep2融合蛋白的重链-hMART-1肽链，其中 各个hMARTl肽序列[加粗-斜体]由肽链内的间隔子f[以加粗显示]隔开。在这种情况下，将得自纤维素酶体锚定支架蛋白B前体[溶纤维素拟杆菌-在gag-nef疫苗的发明内容中描述]的27个氨基酸长的接头flex-vl(vl)[斜体]插入到重链的C端和hMARTl肽-柔性间隔子链之间。下划线的AS残基为连接序列。
[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hMART-l-Pep-3-f4-Pep-1]C981是：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS AS AS (SEQ ID NO.：74)
[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-l-f3-Pep-2]C978是：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTLSKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS AS AS AS AS AS(SEQ ID NO.：75)
[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hMART-l-Pep-3-f4-Pep-l]C1012是：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKFYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS AS AS AS(SEQ ID NO.：76)
mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hMART-l-Pep-3-f4-Pep-l-f3-Pep-2]C1013是：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS AS AS AS AS AS(SEQ ID NO.：77)
MART-1 DNA序列：
具有3个肽的MART-1构建体，起始/终止位点加下划线，肽1为加粗，肽2为粗斜体并且肽3为加粗下划线：
AACACCGACTAACAACAGATGATCTGGATGCAGCTAGT GCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGT GCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGT tgaGCGGCCGCATCGAAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC(SEQ IDNO.：78)
MART1-肽3，斜体的部分是CD4+免疫显性的表位。
GFDHRDSKVSLQEQSPPPYSP(SEQ ID NO.：79)
Flex-4
ASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAAS(SEQ ID NO.：80)
MART1-肽1，斜体部分是CD4+免疫显性表位，并且下划线-斜体部分是CD8+免疫显性表位。
YTT(SEQ IDNO.：81)
Flex-3：ASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPAS(SEQ ID NO.：82)
MART1-肽2，斜体的部分是CD4+免疫显性的表位。
VLLLIGCWYCRRCPQEG(SEQ ID NO.：83)
具有两个肽的MART1构建体：
肽3是加粗-斜体-下划线的，flex-4是加粗的并且肽1是加粗-斜体-下划线的：
AS(SEQ ID NO.：84)
蛋白质序列：C978。rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hMART-l-Pep-3(加粗-斜体-下划线)-f4(加粗)-Pep-l(加粗-斜体)-f3(斜体)-Pep-2(加粗-下划线)]
MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVYDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAS (SEQ ID NO.：85)
蛋白序列：C981。rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hMART-l-Pep-3(加粗-斜体-下划线)-f4-(加粗)-Pep-l](加粗-下划线)
MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAS (SEQ ID NO.：86)
GP100抗原。GP100抗原是黑色素瘤关联的抗原。当其在疫苗制剂中给药时，gp100可以激发针对表达该抗原的肿瘤的免疫应答，该免疫应答可以导致肿瘤大小的减少，所述的免疫应答是细胞毒性的T细胞HLA-A2.1限制的免疫应答。
与重组的抗体H链编码区融合的GP100胞外功能域编码区域在哺乳动物生产细胞中完全不分泌[未显示]。全部的序列如下显示-斜体的残基是前导序列和跨膜区，肽为加粗-斜体，并且跨膜区是斜体-下划线的。
TKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSRSYVPLAHSSSAFTSVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRALVVTHTQVVLQAAIPLTSCGSSPVPGTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIMPGQEAGLGQ YRRRLMKODFSVPQLPHSSSHWLRLPRIFCSCPIGENSPLLSGQQV(SEQ IDNO.：87)
已知的HLA-A0201限制性的肽序列为：GP100 M：209-217(2M)：IMDQVPFSV(SEQ IDNO.：88)；209-217 WT：ITDQVPFSV(SEQ ID NO.：89)GP100M：280-288(9V)：YLEPGPVTV(SEQID NO.：90)280-288 WT：YLEPGPVTA(SEQ ID NO.：91)GP100 WT：154-162：KTWGQYWQV(SEQID NO.：92)。
图29-33显示了gp100加合物，其成功地作为分泌的抗-DC受体靶向疫苗进行表达。其采取了柔性接头序列、gp100胞外功能域编码区的断裂和改组的应用。描述了gp100疫苗加合物的优选的实施方案。
图29显示了抗-CD40-gp100肽抗体的表达和构建体设计。图30显示了附加的抗-CD40-gp100肽抗体的设计。图31显示了附加的抗-CD40-gp100肽抗体的表达和构建体设计。图32是gp100中对CD4+和CD8+免疫显性表位的总结。图33显示了附加的抗-CD40-gp100肽抗体的表达和构建体设计。
rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-hgp100-Pep-1-f4-Pep-3-f3-Pep-4-f4-Pep-5-f3-Pep-2]C1285，肽是加粗-斜体，柔性接头是加粗，并且下划线的AS序列是连接序列：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWYAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDYSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS AS AS PAS AS AS AS AS AS(SEQ ID NO.：93)
rAB-cetHS-puro[hIgG4H-C-Flex-hgp100-Pep-1-f4-Pep-3-f3-Pep-4-f4-Pep-5-f3-Pep-2]C1286：
RLQLQESGPGLLKPSVTLSLTCTVSGDSVASSSYYWGWVRQPPGKGLEWIGTINFSGNMYYSPSLRSRVTMSADMSENSFYLKLDSVTAADTAVYYCAAGHLVMGFGAHWGQGKLVSVSPASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPFVQFNWYVDGVFVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEFMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS AS AS AS AS AS AS AS AS (SEQ ID NO.：94)
gp100：-核酸序列。肽1-下划线，肽2-斜体，肽3-加粗，肽4-加粗-下划线，肽5加粗-斜体。
GATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAAAAGTACCCAGAAAC CAGGACTGGCTTGGTGTCTCAAGGCAACTCAGAACCAAAGCCTGGAACAGGCAGCTGTATCCAGAGTGGACAGAAGC CCAGAGACTTGACTGCTGGAGAGGTGGTCAAGTGTCCCTCAAGGTCAGTAATGATGGGCCTACACTGATTGGTGCAA ATGCCTCCTTCTCTATTGCCTTGAACTTCCCTGGAAGCCAAAAGGTATTGCCAGATGGGCAGGTTATCTGGGTCAAC AATACCATCATCAATGGGAGCCAGGTGTGGGGAGGACAGCCAGTGTATCCCCAGGAAACTGACGATGCCTGCATCTT CCCTGATGGTGGACCTTGCCCATCTGGCTCTTGGTCTCAGAAGAGAAGCTTTGTTTATGTCTGGAAGACCTGGGGCC AATACTGGCAAGTTCTAGGGGGCCCAGTGTCTGGGCTGAGCATTGGGACAGGCAGGGCAATGCTGGGCACACACACC ATGGAAGTGACTGTCTACCATCGCCGGGGATCCCAGAGCTATGTGCCTCTTGCTCATTCCAGCTCAGCCTTCACCAT TACTGACCAGGTGCCTTTCTCCGTGAGCGTGTCCCAGTTGCGGGCCTTGGATGGAGGGAACAAGCACTTCCTGAGAA ATCAGGCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGT GCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGT GCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGT GCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGT GCTAGC TGA(SEQ ID NO.：95)
GP100-肽1-核酸序列。
GATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAAAAGTACCCAGAAACCAGGACTGGCTTGGTGTCTCAAGGCAACTCAGAACCAAAGCCTGGAACAGGCAGCTGTATCCAGAGTGGACAGAAGCCCAGAGACTTGACTGCTGGAGAGGTGGTCAAGTGTCCCTCAAGGTCAGTAATGATGGGCCTACACTGATTGGTGCAAATGCGTCCTTCTCTATTGCCTTGAACTTCCCTGGAAGCCAAAAGGTATTGCCAGATGGGCAGGTTATCTGGGTCAACAATACCATCATCAATGGGAGCCAGGTGTGGGGAGGACAGCCAGTGTATCCCCAGGAAACTGACGATGCCTGCATCTTCCCTGATGGTGGACCTTGCCCATCTGGCTCTTGGTCTCAGAAGAGAAGCTTTGTTTATGTCTGGAAGACCTGGGGCCAATACTGGCAAGTTCTAGGGGGCCCAGTGTCTGGGCTGAGCATTGGGACAGGCAGGGCAATGCTGGGCACACACACCATGGAAGTGACTGTCTACCATCGCCGGGGATCCCAGAGCTATGTGCCTCTTGCTCATTCCAGCTCAGCCTTCACCATTACTGACCAGGTGCCTTTCTCCGTGAGCGTGTCCCAGTTGCGGGCCTTGGATGGAGGGAACAAGCACTTCCTGAGAAATCAG(SEQ ID NO.：96)
蛋白质序列：
DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ(SEQ ID NO.：97)
GP100-肽3
GGCACCACAGATGGGCACAGGCCAACTGCAGAGGCCCCTAACACCACAGCTGGCCAAGTGCCTACTACAGAAGTTGTGGGTACTACACCTGGTCAGGCGCCAACTGCAGAGCCCTCTGGAACCACATCTGTGCAGGTGCCAACCACTGAAGTCATAAGCACTGCACCTGTGCAGATGCCAACTGCAGAGAGCACAGGTATGACACCTGAGAAGGTGCCAGTTTCAGAGGTCATGGGTACCACACTGGCAGAGATGTCAACTCCAGAGGCTACAGGTATGACACCTGCAGAGGTATCAATTGTGGTGCTTTCTGGAACCACAGCTGCA(SEQ ID NO.：98)
蛋白质序列：
GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA(SEQ ID NO.：99)
GP100-肽4：
CAGGTAACAACTACAGAGTGGGTGGAGACCACAGCTAGAGAGCTACCTATCCCTGAGCCTGAAGGTCCAGATGCCAGCTCAATCATGTCTACGGAAAGTATTACAGGTTCCCTGGGCCCCCTGCTGGATGGTACAGCCACCTTAAGGCTGGTGAAGAGACAAGTCCCCCTGGATTGTGTTCTGTATCGATATGGTTCCTTTTCCGTCACCCTGGACATFGTCCAG(SEQID NO.：100)
蛋白质序列：
QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQ(SEQ ID NO.：101)
GP100-肽5
GGTATTGAAAGTGCCGAGATCCTGCAGGCTGTGCCGTCCGGTGAGGGGGATGCATTTGAGCTGACTGTGTCCTGCCAAGGCGGGCTGCCCAAGGAAGCCTGCATGGAGATCTCATCGCCAGGGTGCCAGCCCCCTGCCCAGCGGCTGTGCCAGCCTGTGCTACCCAGCCCAGCCTGCCAGCTGGTTCTGCACCAGATACTGAAGGGTGGCTCGGGGACATACTGCCTCAATGTGTCTCTGGCTGATACCAACAGCCTGGCAGTGGTCAGCACCCAGCTTATCGTGCCTGGGATTCTTCTCACAGGTCAAGAAGCAGGCCTTGGGCAG(SEQ ID NO.：102)
蛋白质序列：
GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ(SEQ ID NO.：103)
GP100-肽2
CCTCTGACCTTTGCCCTCCAGCTCCATGACCCTAGTGGCTATCTGGCTGAAGCTGACCTCTCCTACACCTGGGACTTTGGAGACAGTAGTGGAACCCTGATCTCTCGGGCACYTGTGGTCACTCATACTTACCTGGAGCCTGGCCCAGTCACTGCCCAGGTGGTCCTGCAGGCTGCCATTCCTCTCACCTCCTGTGGCTCCTCCCCAGTTCCAGCTAGC(SEQ ID NO.：104)
蛋白质序列：
PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPAA(SEQID NO.：105)
细胞周期蛋白B1抗原。细胞周期蛋白B1，也称作CCNB1，是编码涉及有丝分裂的调节蛋白的人类基因。细胞周期蛋白B1与p34(cdc2)复合，形成促成熟因子(MPF)。已知有两个可选的转录物，其是可选转录起始位点的结果。第一种转录产物编码组成性表达的转录产物。第二种转录产物是主要在G2/M期表达的受细胞周期调控的转录产物。
随后的氨基酸序列是人类细胞周期蛋白B1。已知含有T细胞表位的两个肽区是以加粗-下划线和斜体-下划线突出显示。
MALRVTRNSKINAENKAKINMAGAKRVPTAPAATSKPGLRPRTALGDIGNKVSEQLQAKMPMKKEAKPSATGKVIDKKLPKPLEKVPMLVPVPVSEPVPEPEPEPEPEPVKEEKLSPEPILVDTASPSPMETSGCAPAEEDLCQAFSDVILAVNDVDAEDGADPNLCSEYVKDIYAYLRQLEEEQAVRPKYLLGREVTGNMRAILIMLQLVGVTAMFIASKYEEMYPPEIGDFAFVTDNTYTKHWIRQ DMVHFPPSQIAAGAFCLALKILDNGEWTPTLQHYLSYTEESLLPVMQHLAKNVVMVNQGLTKHMTVKNKYATSKHAKISTLPQLNSALVQDLAKAVAKVHHHHHH(SEQ ID NO.：106)
肽-1 MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY(SEQ ID NO.：107)
肽-2
DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK(SEQ ID NO.：108)
图35显示了从转染的哺乳动物293F细胞中分泌的原型细胞周期蛋白B1的相对表达水平的总结。柔性接头序列有利于分泌。
C1189 rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl(加粗)-hCyclinBl-肽-2(斜体)-肽-1(加粗-斜体)-f4(加粗)][AS接头-下划线]
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPFPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS AS AS AS AS(SEQ ID NO.：109）
上文是抗-CD4012E12-周期蛋白B1疫苗的一种形式的成熟分泌的H链序列。AS残基来自连接限制性位点。DNA编码序列示于下文，并且其包括信号肽：
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAA(GTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGACTGGCTAGTACAGGTTCAAATGAAATTCAGGTTGTTGCAGGAGACCATGTACATGACTGTCTCCATTATTGATCGGTTCATGCAGAATAATTGTGTGCCCAAGAAGGCTAGTATGGAAATGAAGATTCTAAGAGCTTTAAACTTTGGTCTGGGTCGGCCTCTACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGGAGAGGTTGATGTCGAGCAACATACTTTGGCCAAATACCTGATGGAACTAACTATGTTGGACTATGCTAGTACCAACGACAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGC(SEQ ID NO.：110)
C1143 rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl(加粗)-hCyclinBl-肽-2(斜体)-f3(加粗)][AS接头-下划线的]。
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS AS AS(SEQ ID NO.：111)
上文是抗-CD4012E12-周期蛋白Bl疫苗的一种形式的成熟分泌的H链序列。AS来自连接限制性位点。DNA编码序列示于下文，并且其包括信号肽。
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGACTGGCTAGTACAGGTTCAAATGAAATTCAGGTTGTTGCAGGAGACCATGTACATGACTGTCTCCATTATTGATCGGTTCATGCAGAATAATTGTGTGCCCAAGAAGGCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGC(SEQ ID NO.：112)
C911 rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl(加粗-hCyclinBl-肽-1(斜体)-f4(加粗)]
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDLAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS ASAS AS(SEQ ID NO.：114)
C911 rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl(加粗)-hCyclinBl-肽-1(斜体)-f4(加粗)]的核酸序列
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGCCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTCGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTATGGAAATGAAGATTCTAAGAGCTTTAAACTTTGGTCTGGGTCGGCCTCTACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGGAGAGGTTGATGTCGAGCAACATACTTTGGCCAAATACCTGATGGAACTAACTATGTTGGACTATGCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGC(SEQ ID NO.：115)
D型细胞周期蛋白抗原。D型细胞周期蛋白主要地在细胞周期的G1期表达。在特定的癌症类型中，包括淋巴瘤和非小细胞肺癌中已经广泛地研究了细胞周期蛋白D1的表达模式。约30％的乳腺癌是细胞周期蛋白D1阳性的。细胞周期蛋白的过表达现在是套细胞淋巴瘤(Mantle Cell Lymphoma)的诊断中成熟建立的标准，所述的套细胞淋巴瘤是恶性的，非-Hodgkin′s淋巴瘤，其特征在于独特的染色体转座t(11；14)。
细胞周期蛋白D1-肽1-加粗，肽2-加粗-下划线，肽-3斜体，肽4-下划线。
AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEE VDLACTPTDVRDVDI(SEQ ID NO.：116)
Pep-1
MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV(SEQ ID NO.：117)
Pep-2
QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEELCIYTDNSIRPEELLQMELL(SEQ ID NO.：118)
Pep-3
LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV(SEQ IDNO.：119)
Pep-4
AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI(SEQ ID NO.：120)
表1.克隆-抗体相关性
图34显示使用各种抗体得到的结果，其使用了通过CD40连接检测信号转导的试验，读数为细胞死亡。CD40自身可以发送此种信号，但是当在CHO细胞中表达时将FAS的细胞内功能域用于比较(Fas CHO与CHO进 行比较)。简单地说，CHS-S细胞使用与FAS细胞内功能域或hCD40融合的hCD40胞外域TM的表达载体转染。这些细胞正常增殖，但通过CD40连接的信号转导活化细胞凋亡信号。在48小时后，将MTT加入培养物中并测定染色的减少，其与活性线粒体(即活的细胞)的含量成正比。
ELISA。在平板上涂CD40ecto(人或NHP coh)然后是mAb.抗-mIgGHRP或CBD doc/然后是CD40ecto(coh＝凝集蛋白，NHP＝非人灵长类，HRP＝辣根过氧化物酶)然后是mAb并且随后抗-mIgG HRP或捕获物是抗-mIgG，然后是Mabs，然后是生物素化的CD40ecto(人类或NHP coh)。如在以上实例中描述的，测定细胞因子的产生。
图35显示了当使用doc使抗体制备为融合蛋白并随后使用捕获物时各种构建体的结合。图36和37比较了在不添加GM-CSF和IFNa(图36A-D)，和单独使用可溶性抗体(图37A-D)的条件下与DC温育24小时的细胞因子的产生。图38A-B证实了本发明的不同浓度的抗-CD40抗体对B细胞增殖的效应。
B细胞增殖。通过B细胞富集试剂盒(B cell enrichment kit)(得自BD)使来自健康供体的PBMC的B细胞富集。在含有10％FCS的RPMI培养基中，在50单位/ml的IL-2的存在下培养CFSE标记的5x10e4B细胞6天。使用流式细胞仪通过测定CFSE稀释度来检测B细胞增殖。出人意料地发现，在各种稀释度下，抗体能够引起B细胞增殖，而免疫球蛋白和抗-CD40抗体(数据未显示)则不能。
本文显示的各种构建体证实了当：(1)将抗体重新改装为重组小鼠v区人IgG4C区嵌合体，并且(2)在(1)的情况下添加H-链-C-末端抗原可以保持活性时，CD40抗体(例如12E12)作为可变区能够强烈地活化。这些可变区-肽融合蛋白和/或复合物极大地增强了疫苗的效力。
预期的是，本说明书中所讨论的任何实施方案可以通过关于本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。
要理解的是，本文所述的具体实施方案是通过举例的方式说明来显示而不是为了限制本发明。本发明的主要特征可以在不脱离本发明范围的情况下用于各种实施方案中。本领域技术人员将认识到，或者能够仅仅利用常规的实验确定本文所述具体步骤的许多等同物。这样的等同物被认为是在本发明的范围内，且被权利要求所涵盖。
本说明书中提到的所有出版物和专利申请表明了本发明所涉及领域的技术人员的水平。所有的出版物和专利申请均引入本文作为参考，其引入的程度如同各个独立的出版物或专利申请具体并独立地被指明引入作为参考。
词语“一个(a)”或“一种(an)”当与权利要求和/或说明书中的术语“包含(comprising)”结合使用时，可以指“一种”，但其也与“一种或多种”、“至少一种”和“一种或多于一种”的意思相一致。在权利要求中所使用的术语“或者”是指“和/或”，除非明确指明仅仅是指替代物，或替代物为相互排斥的，尽管公开内容支持仅仅指替代物及“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“大约”用来说明这样的值，其包括用来测定所述值的装置和方法的误差的固有变化，或者研究受试者之间存在的变化。
如在本说明书和权利要求(或多个权利要求)中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及任何形式的“包含”，如“包含(comprise)和包含(comprises)”)，“具有(having)”(以及任何形式的“具有”，如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(以及任何形式的“包括”，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及任何形式的“含有”，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括的或开放式的，且不排除额外的，未述及的元素或方法步骤。
本文所使用的术语“或它们的组合”是指在该术语之前所列举项目的全部排列和组合。例如，“A、B、C或它们的组合”意在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一种，并且如果在特定的上下文中顺序是重要的，那么还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个例子，明显包括的是包含一种或多种项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员将理解的是，通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制，除非从上下文中另外是明显的。
根据本发明的公开内容，在不过度的实验下可以制备和实施本文所公开和要求保护的全部组合物和/或方法。尽管以经以优选的实施方案的形式描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以改变本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或方法的步骤的顺序。对本领域技术人员而言明显的所有这样相似的取代和修饰被认为是在所附的权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思内。

Claims (56)

1.一种与CD40结合的重组抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含：与SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区具有90％的序列同源性的至少一个可变区；以及与SEQ IDNO:1、3或7的一个抗体重链可变区具有90％的序列同源性的至少一个可变区。
2.权利要求1所述的抗体，所述抗体还包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含γ-1、γ-2、γ-3或γ-4人重链恒定区或所述人重链恒定区的变体。
3.权利要求1所述的抗体，所述抗体还包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含λ或κ人轻链恒定区。
4.权利要求1所述的抗体，其中所述结合片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2和双链抗体。
5.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:1、3或6的多肽序列。
6.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽序列。
7.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区具有95％、99％或100％的序列同源性的至少一个可变区；以及与SEQ ID NO:1、3或7的一个抗体重链可变区具有95％、99％或100％的序列同源性的至少一个可变区。
8.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤选自抗-CD40_12E12.3F3(ATCC登记号PTA-9854)、抗-CD40_12B4.2C10(ATCC提交号HS446)和抗-CD40_11B6.1C3(ATCC提交号HS440)。
9.权利要求1所述的抗体，其中在不预先活化树突细胞的前提下，所述抗体单独地能够引起树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IL-12p40或TNFα中的至少一种。
10.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体能够引起使用GM-CSF和干扰素α活化的树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IP-10、IL-10或IL-12p40中的至少一种。
11.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人源化的。
12.一种包含与药学上可接受的载体或稀释剂组合的抗体或其抗原结合片段的组合物，其中所述抗体是权利要求1所述的抗体。
13.权利要求12所述的组合物，其中抗体是人源化的。
14.一种人源化重组抗体或其抗原结合片段，所述人源化重组抗体或其抗原结合片段两者均与CD40结合，所述人源化重组抗体或其抗原结合片段包含：a)SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区；和b)SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区。
15.权利要求14所述的抗体，所述抗体还包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含γ-1、γ-2、γ-3或γ-4人重链恒定区或该人重链恒定区的变体。
16.权利要求14所述的抗体，其中所述人源化抗体包含互补决定区，所述互补决定区为人类抗体构架上的：a)SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区；和b)SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区。
17.权利要求14所述的抗体，所述抗体还包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含λ或κ人轻链恒定区。
18.权利要求14所述的抗体，其中所述结合片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2和双链抗体。
19.权利要求14所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个多肽序列和SEQ ID NO:1、3或7的至少一个多肽序列。
20.权利要求14所述的抗体，其中在不预先活化树突细胞的前提下，所述抗体单独地能够引起树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IL-12p40或TNFα中的至少一种。
21.权利要求14所述的抗体，其中所述抗体能够引起使用GM-CSF和干扰素α活化的树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IP-10、IL-10或IL-12p40中的至少一种。
22.一种包含与药学上可接受的载体或稀释剂组合的抗体或其抗原结合片段的组合物，其中所述抗体是权利要求14所述的抗体。
23.一种编码权利要求1所述的多肽的分离的核酸。
24.一种编码权利要求14所述的多肽的分离的核酸。
25.一种包含权利要求23所述的核酸序列的表达载体，所述核酸序列与控制序列可操作地连接，所述控制序列由使用该载体转染的宿主细胞识别。
26.一种包含权利要求25所述的载体的宿主细胞。
27.一种生产多肽的方法，所述方法包括：在表达核酸序列的条件下，培养权利要求26所述的宿主细胞，从而生产多肽；和从宿主细胞中回收多肽。
28.一种包含权利要求24所述的核酸序列的表达载体，所述核酸序列与控制序列可操作地连接，所述控制序列由使用该载体转染的宿主细胞识别。
29.一种包含权利要求28所述的载体的宿主细胞。
30.一种生产多肽的方法，所述方法包括：在表达核酸序列的条件下，培养权利要求29所述的宿主细胞，从而生产多肽；和从宿主细胞中回收多肽。
31.一种编码对CD40特异性的抗体的分离的核酸序列，所述抗体包含具有SEQ ID NO:9、11、12、14的核酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:8、10或13的核酸序列的重链。
32.权利要求31所述的核酸，其中所述结合片段是选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2和双链抗体的抗体片段。
33.一种用于鉴定人源化抗体的受体种系序列的方法，所述方法包括步骤：
a)鉴定具有需要的生物活性的非人类抗体，所述抗体选自SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区；以及SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区；
b)确定非人类抗体VH和VL区的氨基酸序列；和
c)将非人类抗体序列与一组人类种系序列进行比较，其中所述比较包括以下子步骤：
1)指出非人类VH和VL区序列的序列残基数；
2)标出序列中的CDR和FR区；
3)在非人类和人类种系序列相同的每个残基位置指定预定的数值分数；和
4)将所有的残基分数加和从而得到对于各个人类种系序列的总分数；以及
d)将具有最高总残基分数的人类种系序列鉴定为受体种系序列。
34.权利要求33所述的方法，其中所述非人类抗体对CD40具有特异性。
35.一种由权利要求33所述的方法产生的抗体。
36.一种制备抗体的方法，所述方法包括：
在宿主细胞中表达重组抗体或其抗原结合片段，所述重组抗体或其抗原结合片段二者均与CD40结合，所述重组抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区；和SEQ ID NO:1、3或7的至少一个抗体重链可变区。
37.权利要求36所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌、真菌、昆虫或哺乳动物的细胞。
38.权利要求36所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
39.权利要求36所述的方法，其中在不预先活化树突细胞的前提下，所述抗体单独地能够引起树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IL-12p40或TNFα中的至少一种。
40.权利要求36所述的方法，其中所述抗体能够引起使用GM-CSF和干扰素α活化的树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IP-10、IL-10或IL-12p40中的至少一种。
41.权利要求36所述的方法，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区具有95％、99％或100％的序列同源性的至少一个可变区；以及与SEQ ID NO:1、3或7的一个抗体重链可变区具有95％、99％或100％的序列同源性的至少一个可变区。
42.一种与CD40结合的重组抗体或其抗原结合片段，其中在不预先活化树突细胞的前提下，所述抗体单独地能够引起树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IL-12p40或TNFα中的至少一种。
43.权利要求42所述的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区具有90％的序列同源性的至少一个可变区；以及与SEQ ID NO:1、3或7的一个抗体重链可变区具有90％的序列同源性的至少一个可变区。
44.权利要求42所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:1、3或6的多肽序列。
45.权利要求42所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽序列。
46.权利要求42所述的抗体，其中所述抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤选自抗-CD40_12E12.3F3(ATCC登记号PTA-9854)、抗-CD40_12B4.2C10(ATCC提交号HS446)和抗-CD40_11B6.1C3(ATCC提交号HS440)。
47.权利要求42所述的抗体，其中所述抗体是人源化的。
48.一种与CD40结合的重组抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体单独地能够引起B细胞增殖至少10％的B细胞。
49.权利要求48所述的抗体，其中增殖的B细胞的百分比是至少15％、20％、25％、28％、30％或35％。
50.权利要求48所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:1、3或6的多肽序列。
51.权利要求48所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:2、4、5或7的多肽序列。
52.权利要求48所述的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2、4、5或7的至少一个抗体轻链可变区具有95％、99％或100％的序列同源性的至少一个可变区；以及与SEQ ID NO:1、3或7的一个抗体重链可变区具有95％、99％或100％的序列同源性的至少一个可变区。
53.权利要求48所述的抗体，其中所述抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤选自抗-CD40_12E12.3F3(ATCC登记号PTA-9854)、抗-CD40_12B4.2C10(ATCC提交号HS446)和抗-CD4011B6.1C3(ATCC提交号HS440)。
54.权利要求48所述的抗体，其中在不预先活化树突细胞的前提下，所述抗体单独地能够引起树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IL-12p40或TNFα中的至少一种。
55.权利要求48所述的抗体，其中所述抗体能够引起使用GM-CSF和干扰素α活化的树突细胞分泌IL-6、MIP-1a、IP-10、IL-10或IL-12p40中的至少一种。
56.权利要求48所述的抗体，其中所述抗体是人源化的。
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