CN100381463C

CN100381463C - 用于生产治疗用乙型肝炎疫苗或药物的免疫原及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN100381463C
Application number: CNB021307385A
Authority: CN
Inventors: 吴玉章; 边疆; 周伟; 贾正才; 石统东; 邹丽云
Original assignee: Institute of Immunology PLA; Chongqing Jiachen Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Inst Of Immunology Pla; Jiangsu Mendelgene Technology Co ltd
Priority date: 2002-09-18
Filing date: 2002-09-18
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2022-09-18
Also published as: US8591908B2; AU2003271021A1; AU2003271021A8; US20060246089A1; WO2004026899A9; CN1483736A; WO2004026899A1

Abstract

本发明涉及一种免疫原，其特征在于该免疫原含有一个多肽序列，该多肽序列含有氨基酸序列1、氨基酸序列2和氨基酸序列3，其中氨基酸序列1、氨基酸序列2与氨基酸序列3之间分别由若干个氨基酸残基组成的连接肽段共价连接；所述氨基酸序列1是Th细胞表位序列；所述氨基酸序列2是乙型肝炎病毒来源的CTL表位序列；所述氨基酸序列3是乙型肝炎病毒来源的B细胞表位序列。本发明还涉及该免疫原的制备方法及其作为制备治疗用乙型肝炎疫苗或药物的用途。

Description

用于生产治疗用乙型肝炎疫苗或药物的免疫原及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及乙型肝炎治疗用免疫原及其制备方法和应用，以及含有该免疫原的乙型肝炎疫苗或药物及其生产方法和应用。

背景技术

乙型病毒性肝炎是一种全球性疾病。据WHO报告：全球乙型肝炎病毒感染者约占人群的30％，约18亿；慢性感染者约0.35亿。后者表现为持续性病毒血症，其病毒水平是爱滋病毒(HIV)和丙肝病毒(HCV)的100-1000倍以上。在全球范围内，中国属高流行区，乙型肝炎病毒携带者约占人口的10％(1.2亿)、慢性肝炎患者约0.3亿。乙型病毒性肝炎多为围产期传播、青春期发病、青壮年恶化。因此，其危害的人群多为青壮年。大部分病人感染后通过自然病程痊愈，而部分病人则迁延不愈并发展为肝硬化、肝癌。据估计全球每年至少有50万慢性感染患者死于肝硬化和肝癌。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是已知仅次于烟草的人类致癌原。

目前，控制乙型肝炎流行的主要手段是由WHO推行的全球免疫接种计划。但是由于：(1)该计划采用的预防性疫苗，对已感染者无效；(2)在未感染的新生儿人群，有5-15□不应答；(3)接种普及率仍不高，具1999年的统计，全球高发区新生儿的接种率只有62□。因此，在今后一个相当长的时期内，乙型肝炎仍将是危害人类健康的重要问题之一。

HBV核心抗原(HBcAg)在肝癌及其癌旁组织中的阳性率分别为62.5％和29.2％。目前已证实：(1)HBV作为一种嗜肝病毒，并不能直接引起肝细胞损伤，其感染的病理和临床后果取决于免疫机制。(2)作为细胞内感染，慢性持续性感染状态主要与机体细胞免疫应答太弱有关。其中，HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反应决定了HBV感染的最终结果。感染HBV后CTL活性高者体内病毒被清除而痊愈；CTL活性低或测不到的感染者则发展为慢性持续感染状态，并进一步发展为肝硬化或/和肝癌。因此，克服HBV持续感染患者的免疫耐受状态，在体启动HBV特异性CTL反应，可治疗HBV慢性感染持续状态及防止其相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病。

美国Scripps研究所的F V Chisari在自己研究的基础上分别申请了4项美国专利(专利号US6235288，US5932224，US5840303US，US5788969)。这些专利的主要内容均是关于在HBV抗原上所确定的CTL表位，这些表位分别来源于核心抗原、表面抗原、多聚酶和X抗原。这些部位或结构，是HBV所诱导的CTL所识别的部位。中国江西南昌医学院申请了一种含Pre-S2和HBsAg的质粒DNA疫苗，以激发细胞免疫和体液免疫反应，用于乙型肝炎的预防和治疗。

当前，对HBV慢性持续感染状态(包括病毒携带者、慢性迁延性肝炎和慢性活动性肝炎)尚无特效治疗手段。干扰素(IFN-α/β，IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF-α)被证明能下调感染细胞HBV的复制和基因表达，它对复制中的DNA中间体和转录模板等具有敏感性，但并不能清除病毒。拉米呋定(3TC)是第一个用于临床的核苷类抗病毒复制药物，能减低病毒血症达2倍log。但却很难清除病毒，因为e抗原阳性携带者的血清中病毒滴度达10⁸以上。实际上，临床研究也未发现HBsAg转阴的经治病人。因此，急需发展有效治疗HBV慢性持续感染状态的手段。

本发明的概述

本发明的第一个目的在于提供一种能诱导HBV特异性CTL的免疫原，以及含有该免疫原的治疗用乙型肝炎疫苗；

本发明本发明的第二个目的在于提供了所述免疫原的制备方法和所述治疗用乙型肝炎疫苗的制备方法；

本发明第三个目的在于提供了所述免疫原用于制备治疗用乙型肝炎疫苗或药物的用途；

本发明另一目的是提供了所述免疫原用于制备治疗HBV慢性感染持续状态及其相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或药物的应用。

本发明的详细描述

本发明提供了以下几方面的内容：

一种免疫原，其特征在于该免疫原含有一个多肽序列，该多肽序列含有氨基酸序列1、氨基酸序列2和氨基酸序列3，其中氨基酸序列1、氨基酸序列2与氨基酸序列3之间分别由若干个氨基酸残基组成的连接肽段共价连接，所述氨基酸序列1是Th细胞表位序列，所述氨基酸序列2是乙型肝炎病毒来源的CTL表位序列，所述氨基酸序列3是乙型肝炎病毒来源的B细胞表位序列。

上述氨基酸序列1是破伤风类毒素来源的Th细胞表位上的第830-843氨基酸序列或其变异序列、通用Th细胞表位PADRE；所述氨基酸序列2是：HBV核心抗原上第18-27氨基酸序列或其变异序列、141-151氨基酸序列或其变异序列、117-125氨基酸序列或其变异序列、88-94氨基酸序列或其变异序列、88-96氨基酸序列或其变异序列，HBV表面抗原上第183-191氨基酸序列或其变异序列、201-210氨基酸序列或其变异序列、204-212氨基酸序列或其变异序列、370-379氨基酸序列或其变异序列、251-259氨基酸序列或其变异序列、260-269氨基酸序列或其变异序列、335-343氨基酸序列或其变异序列、338-347氨基酸序列或其变异序列、348-357氨基酸序列或其变异序列、378-387氨基酸序列或其变异序列；Pre S1抗原上第10-17氨基酸序列或其变异序列，Pre S2抗原上第109-123氨基酸序列或其变异序列、抗原上第152-161氨基酸序列或其变异序列；HBx抗原上第92-100氨基酸序列或其变异序列、99-108氨基酸序列或其变异序列、115-123氨基酸序列或其变异序列、133-141氨基酸序列或其变异序列；Pol抗原上第61-69氨基酸序列或其变异序列、455-463氨基酸序列或其变异序列、575-583氨基酸序列或其变异序列、773-782氨基酸序列或其变异序列、803-811氨基酸序列或其变异序列、756-764氨基酸序列或其变异序列、816-824氨基酸序列或其变异序列、655-663氨基酸序列或其变异序列、551-559氨基酸序列或其变异序列、772-780氨基酸序列或其变异序列、502-510氨基酸序列或其变异序列、538-546氨基酸序列或其变异序列、642-650氨基酸序列或其变异序列、646-654氨基酸序列或其变异序列；所述氨基酸序列3是HBV Pre-S2来源的B细胞表位上的第14-24氨基酸序列或其变异序列、HBS抗原上a决定簇。

上述氨基酸序列1是QYIKANSKFIGITE或其变异序列、PADRE或其变异序列；所述氨基酸序列2是：PLGFFPDH或其变异序列、MQWNSTALHQALQDP或其变异序列、SILSKTGDPV或其变异序列、VLQAGFFLL或其变异序列、FLLTRILTI或其变异序列、FLGGTPVCL或其变异序列、LLCLIFLLV或其变异序列、LLDYQGMLPV或其变异序列、WLSLLVPFV或其变异序列、GLSPTVWLSV或其变异序列、KVLHKRTLGL或其变异序列、VLHKRTLGL或其变异序列、GLSAMSTTDL或其变异序列、CLFKDWEEL或其变异序列、VLGGCRHKLV或其变异序列、FLPSDFFPSV或其变异序列、STLPETTVVRR或其变异序列、EYLVSFGVW或其变异序列、GLYSSTVPV或其变异序列、GLSRYVARL或其变异序列、FLLSLGIHL或其变异序列、ILRGTSFVYV或其变异序列、SLYADSPSV或其变异序列、KYTSFPWLL或其变异序列、SLYADSPSV或其变异序列、ALMPLYACI或其变异序列、YMDDVVLGA或其变异序列、WILRGTSFV或其变异序列、KLHLYSHPI或其变异序列、FTQAGYPAL或其变异序列、SLNFLGGTTV或其变异序列、LLDYQGMLPV或其变异序列、LLVPFVQWFV或其变异序列、GLSPTVWLSV或其变异序列、LLPIFFCLWV或其变异序列、YVNTNMG或其变异序列，YVNTNMGLK或其变异序列、SILSKTGDPV或其变异序列、GLSPTVWLSV或其变异序列，SIVSPFIPLL或其变异序列；所述氨基酸序列3是DPRVRGLYFPA或其变异序列、CTKPTDGNCT或其变异序列。

上述免疫原，其特征在于所述连接肽段是由三至七个氨基酸残基组成。

上述免疫原，其特征在于所述连接肽段是AAA、SSS或GGG。

上述的免疫原，其特征在于氨基酸序列1、氨基酸序列2与氨基酸序列3之间的连接次序是：氨基酸序列1-氨基酸序列2-氨基酸序列3，氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列2，氨基酸序列2-氨基酸序列1-氨基酸序列3，氨基酸序列2-氨基酸序列3-氨基酸序列1，氨基酸序列3-氨基酸序列1-氨基酸序列2，或着氨基酸序列3-氨基酸序列2-氨基酸序列1。

上述免疫原，其特征在于所述免疫原还含有若干个修饰基团，该修饰基团是烷基羰基、链烯基羰基。

上述免疫原，其特征在于所述免疫原含有两个修饰基团。

上述免疫原，其特征在于所述免疫原含有一个修饰基团。

上述免疫原，其特征在于所述烷基羰基选自由CH₃(CH₂)₁₀CO-，CH₃(CH₂)₁₂CO-，CH₃(CH₂)₁₄CO-和CH₃(CH₂)₁₆CO-组成的一组烷基羰基中的一个至五个；所述链烯基羰基选自由CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₇CO-，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇CO-和CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇CO-组成的一组链烯基羰基中的一个至五个。

上述免疫原，其特征在于所述修饰基团与所述多肽序列的任意一个氨基酸残基共价连接。

上述免疫原，其特征在于所述修饰基团与所述多肽序列的N末端α氨基、C末端α羧基或氨基酸残基的任何一个侧链基团共价连接。

上述免疫原，其特征在于所述修饰基团与所述多肽序列的N末端α氨基之间通过连接肽段KSS连接，其中，所述多肽序列的N末端α氨基与连接肽段KSS的C末端通过肽键连接，所述修饰基团与连接肽段KSS的ε氨基共价连接。

上述免疫原，其特征在于所述修饰基团与所述侧链基团上的氨基、羧基或羟基等基团共价连接。

上述免疫原，其特征在于所述修饰基团与N末端赖氨酸的ε氨基共价连接。

上述免疫原，其特征在于所述连接肽段KSS的α氨基上还共价连接一个所述的修饰基团。

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₀CO KSSPADREGGGSLNFLGGTTVSSSDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAALLCLIFLLVGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAALLDYQGMLPVGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)-CO，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇CO₇-KSSQYIKANSKFIGITEGGG

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇COFLPSDFFPSVAAADPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇COKSSPADREGGGWLSLLVPFVSSSDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA

上述的免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSPADREGGGLLVPFVQWFVSSSDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSPADREAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAALLPIFFCLWVGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₆COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₆COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEGGGFLPSDFFPSVSSSDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGLK GGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAA PLGFFPDHGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAMQWNSTALHQALQDPGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSPDAREAAASILSKTGDPVGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAAVLQAGFFLLGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADRESSSFLLTRILTIGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAAFLGGTPVCLGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAASIVSPFIPLLGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAASTLPETTVVRRGGGDPRVRGLYFPA

上述免疫原，其特征在于一级结构是：

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGCTKPTDGNCT

一种设计、筛选和合成上述的免疫原的方法，包括基于表位的疫苗设计(EBVD)，分子模拟、分子设计、筛选体系和多肽固相合成，其中多肽固相合成中树脂与每种氨基酸或棕榈酸投料的摩尔比为1∶2-1∶8，精氨酸、天酰胺以及棕榈酸组分的连接采用双偶联，反应温度为20-40℃。

上述投料的摩尔比为1∶4，上述反应温度为30℃。

一种制备上述免疫原的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)多肽固相合成所述免疫原-树脂，所述免疫原-树脂表示与树脂结合的免疫原；(2)对免疫原-树脂进行裂解，得到裂解液；(3)将步骤(2)的裂解液采用体积排阻层析进行初步分离纯化；(4)通过反相层析纯化得到免疫原。

如上述的方法，其特征在于所述步骤(2)选用TFA裂解液；裂解条件是免疫原-树脂的浓度：小于100mg/ml，反应温度：15-50℃，反应时间：0.5-3小时。

如上述的方法，其特征在于所述TFA裂解液为：0.75g苯酚、0.25ml乙二硫醇、0.5ml苯甲硫醚、0.5ml去离子水、10.0ml TFA；所述裂解条件是免疫原-树脂的浓度：40.00mg/ml，反应温度：25℃，反应时间：1.5小时。

如上述的方法，其特征在于所述步骤(3)中的体积排阻层析采用的柱填料为Sephadex LH20，流动相为二甲基亚砜。

如上述的方法，其特征在于所述步骤(4)中的反相层析采用的柱填料为POROS 50 R1、POROS 50 R2、SOURCE 30 RPC或Dleta Pak C₁₈。

如上述的方法，其特征在于所述步骤(4)中的反相层析采用梯度洗脱，流动相采用乙腈/TFA、乙腈/HCl、乙醇/TFA、乙醇/HCl或乙醇/磷酸的水溶液。

如上述的方法，其特征在于所述反相层析纯化的柱温是20-60℃。

如上述的方法，其特征在于所述反相层析纯化的柱温是28-40℃。

如上述的方法，其特征在于所述反相层析纯化的柱温是32-36℃。

如上述的方法，其特征在于所述反相层析纯化的柱温是34℃。

上述的免疫原在制备治疗HBV慢性感染持续状态及其相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或药物的用途。

一种如上述的用途，其特征在于所述HBV慢性感染持续状态为慢性乙型肝炎或乙型肝炎病毒携带者。

一种治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗含有上述的免疫原。

一种治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗含有上述的免疫原以及药学上可接受的辅料、佐剂和/或载体。

如上述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗是药学上可接受的任意一种剂型。

如上述治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗的制剂是注射剂、透皮剂、口服剂、吸入剂或栓剂。

如上述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗的剂型为乙醇溶液剂型、混悬液剂型、液体脂质体剂型或冻干脂质体剂型。

如上述治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述液体脂质体剂型或冻干脂质体剂型含有磷脂。

如上述治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述液体脂质体剂型或冻干脂质体剂型还含有胆固醇。

如上述治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述液体脂质体剂型或冻干脂质体剂型还含有维生素E。

如上述治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述液体脂质体剂型或冻干脂质体剂型还含有棕榈酸。

如上述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗中的免疫原、磷脂、胆固醇、维生素E和棕榈酸的摩尔比为0.1-0.5∶40-80∶0-40∶0～10∶0-10。

如上述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗中的免疫原、磷脂、胆固醇、维生素E和棕榈酸的摩尔比为0.2-0.4∶60∶20∶6∶6。

如上述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗中的免疫原、磷脂、胆固醇、维生素E和棕榈酸的摩尔比为0.3-0.36∶60∶20∶6∶6。

如上述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述磷脂为大豆磷脂或卵磷脂。

一种制备上述的治疗用乙型肝炎疫苗的方法，其特征在于所述方法包括采用二次乳化法制备脂质体。

如上述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述冻干脂质体剂型还含有人白蛋白、甘露醇和磷酸盐。如上所述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述冻干脂质体剂型含上述述免疫原、磷脂、胆固醇、棕榈酸、维生素E、甘露醇、人血白蛋白、KH₂P04、Na₂HP04，其摩尔比为0.01-0.1∶5-15∶1-7∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶70-150∶0.1-0.3∶1-10∶1-10。

本发明的目的也在于提供一种设计、筛选、制备本发明的如上所述免疫原或疫苗的方法。

本发明首次建立了基于表位的疫苗设计技术路线(英文译名为：EPITOPE-BASED VACCINE DESIGN，EBVD)。采用EBVD，以乙型肝炎抗原表位图谱为基础，按照不同类型表位、不同抗原来源表位、不同的连接顺序、不同的化学修饰基团等，采用EBVD方案进行设计、筛选。首次确定了具有前述骨架结构的免疫原。该种分子一方面能刺激人外周血淋巴细胞产生增殖反应、Th1极化反应、HBV特异性CTL反应、抑制HBV的复制；比采用单表位多肽提高200倍以上效率。另一方面，在HBV转基因小鼠体内有效激发Th1极化反应、HBV特异性CTL反应、抑制HBV的复制。实验结果表明上述免疫原可开发成为一种新型乙型肝炎及其继发性肝硬化、肝癌的治疗用疫苗或药物。

采用固相化学合成方法制备该种分子。确定了反应体系的最佳温度、投料比、肽树脂裂解方法和时间、纯化条件等因素。在本发明方法中，最佳反应温度30-40℃；采用HOBT/DCC偶联策略，α、β、γ、δ四各组分连续合成，R、N、α采用双偶联，原料和树脂的最佳摩尔投料比是4∶1，每个氨基酸或组分平均偶联效率达99.5％以上；肽树脂裂解采用三氟乙酸法，最佳裂解时间90分钟。

在本发明的方法中，纯化采用两步法：(1)采用体积排阻层析法初步纯化，二甲基亚砜(DMSO)为流动相，最佳柱温20-40℃。(2)采用反相层析法高度纯化。研究了其最佳上样条件、最佳层析填料、最佳柱温度等因素。在本发明中，最佳层析填料是POROS 50 R1，最佳柱温度22-34℃。

经乙醇溶液、脂质体混悬液体剂型、冻干剂型的比较，证明脂质体剂型在诱导Th1极化、诱导CTL活性方面优于乙醇溶液剂型、皮下注射疼痛感明显减轻。脂质体冻干剂型在稳定性方面明显优于脂质体混旋液剂型。

本发明采用L₉(3⁴)正交设计、筛选获得所述免疫原脂质体注射剂最佳处方。其中，含有上述免疫原、大豆磷脂、棕榈酸、维生素E和/或胆固醇。

进一步比较了各种不同条件下，对脂质体形成、包封率、粒度分布等影响。确定了脂质体的制备条件和工艺流程。

脂质体制备工艺流程图见附图7。

附图7是脂质体制备条件和工艺流程图。

本发明的第三个目的是提供将本发明的这些免疫原制成治疗HBV慢性感染持续状态及其相关的继发性肝硬化、肝癌的疫苗或药物的应用。

上述免疫原及其剂型，使用任何一种公知的免疫方式，例如：皮下注射、皮内注射、腹腔注射、静脉注射等进行免疫。免疫剂量可以是0.01nmol至20nmol。可以不使用另外的佐剂。用于免疫小鼠或HLA转基因小鼠可刺激淋巴细胞活化和增殖、Th1极化和CTL应答；用于免疫HBV转基因小鼠可以剂量依赖性方式激淋巴细胞活化和增殖、Th1极化和CTL应答，并抑制HBV复制、血中HBV DNA拷贝数下降、HBsAg、HBeAg滴度下降或消失。该效应为单独使用单表位多肽或多表位多肽所不能达到。在体外刺激人外周血单个核细胞可以剂量依赖性方式激淋巴细胞活化和增殖、Th1极化和CTL应答，后者可杀伤HepG2.2.1.5细胞、E6细胞，抑制HBV复制、HBV DNA拷贝数下降、HBsAg、HBeAg滴度下降或消失。该效应比单独使用单表位多肽高200倍以上。

附图简要说明

图1是基于表位的疫苗设计(英文译名为：EPITOPE-BASED VACCINEDESIGN，EBVD)示意图。首先选择靶抗原，通过高分辨率的免疫识别研究获得表位图谱。基于表位图谱，采用分子设计、分子模拟技术设计免疫原。通过化学或基因合成得到该分子，进行功能筛选和毒理、药代初步评价，通过构效关系分析，对分子进行改造、优化，而后合成、评价，进入下一循环。通过200个循环左右，可获得先导结构。附图2是诱导淋巴细胞增殖效应图，其中取HLA-A²⁺健康人新鲜外周血，Ficoll-Hypaque法分离外周血单个核淋巴细胞，用RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)于96孔细胞培养板内(10⁶细胞/孔)体外培养。设受试药物组为

(CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA)、Pre-S2对照组、空白对照组，分别加IL-2(5IU)和受试药物，继续培养6天，再用相同剂量的IL-2和受试药物再次刺激48小时，并加³H-TdR(1μCi/ml)，继续培养18h后收集细胞，测γ-记数值。结果表明受试药物可显著诱导淋巴细胞的增殖反应。最低有效剂量为0.1ng，在0.1-10ng剂量范围内呈剂量依赖性反应。

附图3是诱导Th1极化的效应图，其中取HLA-A²⁺健康人新鲜外周血，Ficoll-Hypaque法分离外周血单个核淋巴细胞，用RPMI1640培养基(含10％胎牛血清、100U/ml青链霉素)分组培养(10⁶/孔，24孔细胞培养板)，分别加IL-2(30IU)和受试药物(不同剂量CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇COKSSPADREGGGWLSLLVPFVSSSDPRVRGLYFPA)，继续培养6天，再用相同剂量的IL-2和受试药物每周刺激1次，共3次，末次刺激24小时后，取培养上清，用ELISA方法检测其中的IL-4和IFN-γ分泌情况。结果表明：受试药物可诱导IFN-γ分泌，剂量-效应显著；而诱导IL-4分泌的效应不明显。提示受试药物诱导Th1型T细胞极化的功能较强，而诱导Th2型T细胞极化的功能较弱。

附图4是诱导细胞毒效应图，其中取HLA-A2⁺健康人新鲜外周血，Ficoll-Hypaque法分离外周血单个核淋巴细胞，用RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)分组培养(10⁶/孔，24孔细胞培养板)，分别加IL-2(30IU)和受试药物(10ngCO，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇CO₇KSSQYIKANSKFIGITEGGGDPRVRGLYFPA)，继续培养6天，再用相同剂量的IL-2和受试药物每周刺激1次，共3次，末次刺激3天后，获得抗原特异性效应CTL细胞。采用标准⁵¹Cr释放试验检测比较细胞毒活性。靶细胞分别为：2215(HBV感染的人肝细胞癌细胞系，可模拟HBV感染肝细胞的功能)、E6(人HLA-A*0201转染P815细胞，CTL表位肽抗原预孵)、T2(HLA-A2⁺人T、B淋巴细胞瘤细胞系，CTL表位肽抗原预孵)；效靶细胞比例分别为(E/T)：12.5、25、50、100。结果表明受试药物可诱导人PBMC产生CTL效应，特异性溶破靶细胞(A)。上述HLA-A2⁺人PBMC末次刺激24小时后，用ELISPOT方法检测比较受试药物诱导IFN-γ分泌型CTL细胞在外周血淋巴细胞中的增殖效应。结果表明受试药物可诱导人PBMC中IFN-γ分泌细胞的增殖，并有显著的剂量-效应关系(B、C)。

附图5是抗病毒效应图，其中取HLA-A2⁺HBV携带者、急性肝炎患者、慢性肝炎患者新鲜外周血单个核淋巴细胞，做病毒抑制实验，取上清，测定HBV-DNA拷贝数(A)、HBeAg、HBsAg分泌量(B、C)。结果表明随着共培养时间的增长，HBV-DNA、HBsAg、HBeAg的表达/复制被抑制，有明显的剂量-效应关系。表明受试药物(CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGCTKPTDGNCT)诱导HLA-A2⁺人PBMC活化有显著的剂量-效应关系。

附图6是剂量-效应关系图：

HBV-DNA转基因小鼠(ayw型HBV全基因(1.3Kb)转染昆明种小鼠)为模型。将动物随机分组，每组5只，于双侧胁下和后足掌皮下注射，按10、100、1000U/鼠的3个剂量给药，每周加强免疫一次，共3次。设IFN-α2b(15000U/鼠)为阳性对照药、设生理盐水为阴性对照药。给药结束后30天，取小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞，用试品10ng/ml体外刺激3天，取上清，用ELISA法检测培养上清中IFN-γ、IL-4等细胞因子的分泌情况，分析受试药物(CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAASIVSPFIPLLGGGDPRVRGLYFPA)体内诱导T细胞Th1/Th2型极化的功能。结果可检测到较强的IFN-γ分泌；IL-4的检测未见明显的剂量-效应关系(A、B、C)。上述上清液，用ELI-SPOT法检测IFN-γ分泌细胞在外周血淋巴细胞中的表达频率。结果表明，在结束免疫后第30天，随着原免疫剂量的升高，外周血淋巴细胞中IFN-γ分泌细胞的表达频率升高，其中100、1000U/鼠的免疫剂量，体内诱导外周血淋巴细胞中IFN-γ分泌细胞的表达频率升高明显，最高可检测到3660IFN-γ分泌细胞/10⁶PBMC。IFN-α2b给药组最高可检测到1250IFN-γ分泌细胞/10⁶PBMC(D)。于三次免疫结束后的第10、20、30天，取血分离血清，分别用ELISA法、定量PCR法检测血清中HBsAg、HBV-DNA的含量。结果表明该品可以剂量依赖性的方式导致表面抗原分泌(C)水平、HBV-DNA复制(F)水平的明显下降。

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明实施例的制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1.采用EBVD对三表位治疗用(合成肽)乙型肝炎疫苗表位数目及其排列组合的设计和筛选

以乙型肝炎抗原表位图谱为基础，按照不同类型表位、不同抗原来源表位、不同的连接顺序、不同的化学修饰基团等，采用EBVD方案进行设计、筛选表位组分的来源范围包括：HBV之s抗原、e抗原、c抗原来源的优势B细胞表位、T辅助细胞(Th)表位、细胞毒性T细胞(CTL)表位、其它抗原来源的通用Th细胞表位、表位修饰基团。在表位修饰基团中考虑了有文献证明可促进免疫活性的单链脂肪酸和本发明人证明的糖类基团。采用了线形单表位修饰类、单表位分枝类(2、4、8分枝)、CTL表位-Th细胞表位嵌合体类、CTL表位-Th细胞表位嵌合体修饰类、B细胞表位-CTL表位-Th细胞表位嵌合体类、B细胞表位-CTL表位-Th细胞表位嵌合体修饰类等6类。表位间的联结顺序采用已证明对抗原性(免疫原性)无影响的-A-A-A-或-G-G-G-。由此获得200余种结构。在O2工作站采用分子模拟方法(InsightII软件)比较所设计抗原多肽的结构与天然抗原的相似形、与MHC结合的位阻情况等，并对抗原多肽进行免疫原性、理化、生化特性分析，进行排序。

采用化学合成法合成所设计的免疫原。首先合成计算机排序和理论上可能性最大的结构，而后进入体外功能筛选。体外功能筛选包括：对人外周血单个核细胞诱导Th1极化、诱导HBV特异性CTL、多肽抗原特异性CTL对HepG2.2.1.5细胞HBsAg、HBeAg的抑制作用等。根据体外功能实验，对所设计的结构进行优化、改进、合成，进入下一轮实验。对体外实验所筛选到的结构，进入体内实验筛选，包括：在Balb/C小鼠诱导Th1极化、在HBV转基因小鼠抑制病毒复制、小鼠急性毒性实验等。经过大量初步筛选和比较分析发现：有3个表位是较好的候选组分。进一步的筛选表明：3表位的多肽抗原较单表位或双表位多肽抗原为优，而与四个以上表位的效果无明显差别(见表3)；三表位分子中表位间不同的排列组合以εPA44的组合效果最好(见表4)；经体内实验和体外实验证明：化学修饰中以棕榈酸共价修饰的效果较好；经单克隆抗体和肽探针技术检测证明：联结顺序的选择保证了表位在免疫原中的表位成分的免疫特异性未发生改变。筛选结果见表1和表2。

*所列表位数目为由三类表位组成的免疫原(含不同的排列方式)。其中，C：CTL表位；B：B细胞表位；T：Th细胞表位。数字表示该表位的个数。表内所示为体外实验筛选结果。

表1 治疗用(合成肽)乙型肝炎疫苗表位数目的筛选*

表2 三表位分子中不同排列组合的筛选*

*排列方式指从N-末端向C-末端的表位排布。其中，C：CTL表位；B：B细胞表位；T：Th细胞表位。表内所示为体外实验筛选结果

实施例2.CH₃(CH₂)₁₀CO KSSPADREGGGSLNFLGGTTVSSSDPRVRGLYFPA的固相化学合成

采用Fmoc固相化学合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽链。在Applied Biosystems 431A多肽合成仪上进行。Fmoc氨基酸为原料，上样量1mM，侧链保护为：Ser(tBu)，Thr(tBu)，Tyr(tBu)、His(Trt)、Gln(Trt)、ASP(OtBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)。选用HMP-树脂为固相载体，上样量0.25mM，原料/树脂比4∶1。偶联到树脂上的氨基酸(多肽羧基端第一个氨基酸)采用对称酸酐活化法活化，其余氨基酸和棕榈酸的活化采用HOBt/DCC活化法。其中，天冬酰胺、精氨酸和棕榈酸采用双偶联，棕榈酸偶联后无脱Fmoc保护基团步骤。

切割与脱保护：用TFA、EDT、苯甲硫醚、结晶苯酚和超纯水按一定比例混合液将肽从树脂上、侧保护性基团从氨基酸上切下，乙醚沉淀、旋转转蒸发得粗肽产物，经HPLC鉴定，此粗肽产物纯度稳定在80％左右。

实施例3.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAALLCLIFLLVGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

切割与脱保护：用TFA、EDT、苯甲硫醚、结晶苯酚和超纯水按一定比例混合液将肽从树脂上、侧保护性基团从氨基酸上切下，乙醚沉淀、旋转转蒸发得粗肽产物，经HPLC鉴定，此粗肽产物纯度稳定在85％左右。

实施例4.CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAALLDYQGMLPVGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例5.CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)-CO，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇CO₇KSSQYIKANSKFIGITEGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

采用Fmoc固相化学合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽链。在Applied Biosystems 431A多肽合成仪上进行。Fmoc氨基酸为原料，上样量1mM，侧链保护为：Ser(tBu)，Thr(tBu)，Tyr(tBu)、His(Trt)、Gln(Trt)、ASP(OtBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)。选用HMP-树脂为固相载体，上样量0.25mM，原料/树脂比4∶1。偶联到树脂上的氨基酸(多肽羧基端第一个氨基酸)采用对称酸酐活化法活化，其余氨基酸和棕榈酸的活化采用HOBt/DCC活化法。其中，采用双偶联，脂肪酸偶联后无脱Fmoc保护基团步骤。

实施例6.

CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇COFLPSDFFPSVAAADPRVRGLYFPA的固相化学合成

采用Fmoc固相化学合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽链。在Applied Biosystems 431A多肽合成仪上进行。Fmoc氨基酸为原料，上样量1mM，侧链保护为同实施例3。选用HMP-树脂为固相载体，上样量0.25mM，原料/树脂比4∶1。偶联到树脂上的氨基酸(多肽羧基端第一个氨基酸)采用对称酸酐活化法活化，其余氨基酸和棕榈酸的活化采用HOBt/DCC活化法。其中，采用双偶联，脂肪酸偶联后无脱Fmoc保护基团步骤。

实施例7.CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇COKSSPADREGGGWLSLLVPFVSSSDPRVRGLYFPARGLYFPA的固相化学合成

实施例8.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例9.CH₃(CH₂)₁₄COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例10.CH₃(CH₂)₁₄COKSSPADREGGGLLVPFVQWFVSSSDPRVRGLYFPA的固相化学合成

切割与脱保护：用TFA、EDT、苯甲硫醚、结晶苯酚和超纯水按一定比例混合液将肽从树脂上、侧保护性基团从氨基酸上切下，乙醚沉淀、旋转转蒸发得粗肽产物，经HPLC鉴定，此粗肽产物纯度稳定在75％左右。

实施例11.CH₃(CH₂)₁₄COKSSPADREAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

切割与脱保护：用TFA、EDT、苯甲硫醚、结晶苯酚和超纯水按一定比例混合液将肽从树脂上、侧保护性基团从氨基酸上切下，乙醚沉淀、旋转转蒸发得粗肽产物，经HPLC鉴定，此粗肽产物纯度稳定在78％左右。

实施例12.CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAALLPIFFCLWVGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例13.CH₃(CH₂)₁₆COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

切割与脱保护：用TFA、EDT、苯甲硫醚、结晶苯酚和超纯水按一定比例混合液将肽从树脂上、侧保护性基团从氨基酸上切下，乙醚沉淀、旋转转蒸发得粗肽产物，经HPLC鉴定，此粗肽产物纯度稳定在83％左右。

实施例14.

CH₃(CH₂)₁₆COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例15.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEGGGFLPSDFFPSVSSSDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例16.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGLKGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

切割与脱保护：用TFA、EDT、苯甲硫醚、结晶苯酚和超纯水按一定比例混合液将肽从树脂上、侧保护性基团从氨基酸上切下，乙醚沉淀、旋转转蒸发得粗肽产物，经HPLC鉴定，此粗肽产物纯度稳定在81％左右。

实施例17.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAPLGFFPDHGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例18.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSYIKANSKFIGITEAAA MQWNSTALHQALQDP GGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

切割与脱保护：用TFA、EDT、苯甲硫醚、结晶苯酚和超纯水按一定比例混合液将肽从树脂上、侧保护性基团从氨基酸上切下，乙醚沉淀、旋转转蒸发得粗肽产物，经HPLC鉴定，此粗肽产物纯度稳定在86％左右。

实施例19.CH₃(CH₂)₁₄COKSSPDAREAAASILSKTGDPVGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例20.CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAAVLQAGFFLLGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例21.CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADRESSSFLLTRILTIGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例22.CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAAFLGGTPVCLGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

切割与脱保护：用TFA、EDT、苯甲硫醚、结晶苯酚和超纯水按一定比例混合液将肽从树脂上、侧保护性基团从氨基酸上切下，乙醚沉淀、旋转转蒸发得粗肽产物，经HPLC鉴定，此粗肽产物纯度稳定在74％左右。

实施例23.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

实施例24.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAASIVSPFIPLLGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

切割与脱保护：用TFA、EDT、苯甲硫醚、结晶苯酚和超纯水按一定比例混合液将肽从树脂上、侧保护性基团从氨基酸上切下，乙醚沉淀、旋转转蒸发得粗肽产物，经HPLC鉴定，此粗肽产物纯度稳定在79％左右。

实施例25.CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAASTLPETTVVRRGGGDPRVRGLYFPA的固相化学合成

切割与脱保护：用TFA、EDT、苯甲硫醚、结晶苯酚和超纯水按一定比例混合液将肽从树脂上、侧保护性基团从氨基酸上切下，乙醚沉淀、旋转转蒸发得粗肽产物，经HPLC鉴定，此粗肽产物纯度稳定在82％左右。

实施例26.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGCTKPTDGNCT的固相化学合成

实施例27.

CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGCTKPTDGNCT肽树脂的裂解

选用TFA裂解液(0.75g苯酚、0.25ml乙二硫醇、0.5ml苯甲硫醚、0.5ml去离子水、10.0ml TFA)，可最大限度地抑制副反应的发生。首先，比较εP A 44肽树脂裂解反应浓度，对其裂解液分离纯化的影响。反应条件，裂解液体积：1.5ml；反应温度：25℃；反应时间：2.0小时。反应结束后滤除树脂，收集的滤液在20℃水浴下，缓慢加入1.0ml二甲基亚砜(DMSO)并及时摇动散热。采用体积排阻层析(SEC)，加上述样品2.0ml进行εP A 44的分离纯化。层析条件，层析系统：P-6000泵及AKTAexplorer 100；层析柱：直径10mm，柱长250mm，填料Sephadex LH20；流动相：DMSO；流速：0.4ml/min。收集εP A 44组分并进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析，测定纯度和含量并计算“肽/肽树脂(□)”。

表3 肽树脂裂解反应浓度对其裂解液分离纯化的影响

^※注：以“肽/肽树脂(％)”间接反映出“收率”的变化。

表3的结果显示，当εP A 44肽树脂浓度过高(53.33mg/ml)时，裂解液加入DMSO可产生沉淀，分离的εP A 44占肽树脂26.03□，收率较低；当εP A 44肽树脂浓度为40mg/ml时，裂解液加入DMSO不产生沉淀，分离的εP A 44占肽树脂29.80□，收率较高。因此，将εP A 44肽树脂裂解反应浓度确定为40mg/ml。

采用上述方法及确定的εP A 44肽树脂裂解反应浓度下，进一步观察裂解反应时间对肽树脂裂解液分离纯化的影响。

表4 裂解反应时间对肽树脂裂解液分离纯化的影响

^※注：以“肽/肽树脂(％)”间接反映出“收率”的变化。

由表4可以看出，将裂解反应时间控制在1～2小时，肽树脂裂解液经SEC分离后，收集的εP A 44纯度和收率均较高。因此将裂解反应时间确定为1.5小时。

实施例28.CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAASTLPETTVVRRGGGDPRVRGLYFPA肽树脂裂解液的初步纯化

在DMSO中εP A 44溶解性好且稳定，而在其它溶液中溶解度及稳定性均不够理想，详见表5。因此选用DMSO作为SEC的流动相。

表5 在不同溶液体系中的溶解度和稳定性

^※注：室温下放置1个月，经RP-HPLC分析εP A 44纯度和含量无变化。

在上述确定的裂解反应条件下进行批量制备。采用SEC加样55.0ml，进行εP A 44肽树脂裂解液的初步纯化。层析条件，层析系统：P-6000泵及AKTAexplorer 100；层析柱：直径25mm，柱长850mm，填料Sephadex LH20；流动相：DMSO；流速：2.0ml/min。收集εP A44组分并进行RP-HPLC分析，测定纯度和含量并计算“肽/肽树脂(□)”。

表6 肽树脂裂解液的初步纯化效果及重复性观察

^※注：以“肽/肽树脂(％)”间接反映出“收率”的变化。

结果见表6及层析图谱。采用DMSO作为流动相以及上述SEC对树脂裂解液进行初步纯化，收集的εP A 44，纯度为53.10±2.59□，占肽树脂的46.93±0.54□。得到了较好的初步纯化效果及重复性。

实施列29.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA精制方法

采用层析技术作为εP A 44的精制方法。比较凝胶过滤、离子交换层析和反相层析对εP A 44的纯化效果，收集εP A 44洗脱峰峰尖并进行RP-HPLC分析纯度。

凝胶过滤层析不能达到精制的要求；离子交换层析未见到明显的洗脱峰，非特异性吸附严重，不宜采用；而反相层析尽管成本较高，却能够满足精制的要求。

表7 不同层析方法纯化的纯度比较

实施例30.反相层析填料的筛选

采用不同的反相层析填料装柱，分别对

CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAAFLGGTPVCLGGGDPRVRGLYFPA进行精制，收集洗脱峰峰尖并进行RP-HPLC分析纯度。

表8 不同反相层析填料固定相的纯化比较

结果见表8。选择疏水性较弱的反相层析填料POROS 50 R1作为固定相，收集的洗脱峰峰尖纯度较高。表明采用反相层析对疏水性较强的本品进行纯化时，不宜选用疏水性较强的反相层析填料(Dleta PakC18、SOURCE 30 RPC和POROS 50 R2)作为固定相。

实施例31.离子对试剂对

CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADRESSSFLLTRILTIGGGDPRVRGLYFPA反相层析的影响

采用层析柱SR 10/450 POROS 50 R1进行反相层析，比较了采用不同的流动相进行纯化对纯度的影响。层析条件，层析系统：AKTAexplorer 100；样品及加样量：2.0ml；层析柱：直径10mm，柱长450mm，填料POROS 50 R1；柱温：25℃；流动相(A、B)：详见表6-07；梯度：0～100□B，10 CV(柱体积)；流速：4.0ml/min。收集εP A44洗脱峰峰尖并进行RP-HPLC分析纯度。

表9 离子对试剂对反相层析中纯度的影响

由表9可以看出，以乙醇溶液作为流动相，当不加入任何离子对试剂时，未见明显的本品洗脱峰；当加入离子对试剂时，可以使本品被完全洗脱下来。其中，加入酸(HCl)比碱(NaOH)更有利于ε本品纯化。

实施例32.反相层析柱温的确定

选用磷酸代替盐酸作为离子对试剂(可避免将来对大规模不锈钢层析制备系统的腐蚀作用)，并采用层析柱SR 10/200 POROS 50 R1，进一步观察柱温对CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAAVLQAGFFLLGGGDPRVRGLYFPA在反相层析中纯度和收率的影响。层析条件，层析系统：AKTAexplorer100；样品及加样量：εP A 44(10.34mg/ml)，0.5ml；层析柱：直径10mm，柱长200mm，填料POROS 50 R1；柱温：详见表6-08；流动相A：30□乙醇-10mmol/L磷酸，流动相B：90□乙醇-10mmol/L磷酸；梯度：0～50□B，5CV、50～100□B，0.5CV、100～100□B，0.5CV；流速：4.0ml/min。收集洗脱峰并进行RP-HPLC分析，测定纯度和含量并计算收率。

表10 柱温对反相层析中纯度和收率的影响

表10中的结果显示，当柱温为22℃时，由于样品中的本品溶解于DMSO，此温度下样品溶液的粘度较大，不利于本品的扩散以及同固定相的结合，使其大部分随溶剂峰穿过柱子，造成了纯化后的本品收率降低；当柱温升高到28～40℃时，收率较室温(22℃)有显著的提高。其中，确定的优化后反相层析柱温为32～36℃。

实施例33.CH₃(CH₂)₁₄COKSSPDAREAAASILSKTGDPVGGGDPRVRGLYFPA反相层析加样量及载量的确定

由于本品溶解在DMSO中，加样量和样品中本品浓度，都可能成为影响层析过程的重要参数。因此进一步观察了加样量及载量，对本品在反相层析中纯度和收率的影响。层析条件，层析系统：AKTAexplorer100；样品及加样量：本品(10.34mg/ml)，见表6-09；层析柱：直径10mm，柱长450mm，填料POROS 50 R1；柱温：34℃；流动相A：30□乙醇-10mmol/L磷酸，流动相B：90□乙醇-10mmol/L磷酸；梯度：0～50□B，5CV、50～100□B，0.5CV、100～100□B，0.5CV；流速：4.0ml/min。收集本品洗脱峰并进行RP-HPLC分析，测定纯度和含量并计算收率。

表11 样品量对本品在反相层析中纯度和收率的影响

由表11看出，当加样量低于0.75ml时，纯化后本品纯度达到99□以上，收率接近70□；当加样量为1.00ml时，收率降低且纯度仅为97.88□，达不到精制的要求。因此，通常加样量和载量控制在柱体积的2□和0.2mg/ml左右。

实施例34.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSYIKANSKFIGITEAAAMQWNSTALHQALQDPGGGDPRVRGLYFPA原液的批量精制效果及重复性观察

采用层析柱AP 550/275 POROS 50 R1进行批量制备。肽树脂经过裂解和初步纯化后，收集的εP A 44样品分成7次进行高度纯化，进一步观察了εP A 44原液的批量精制效果及重复性。层析条件，层析系统：AKTAexplorer100；样品：详见表6-10，加样量：11.0ml；层析柱：直径50mm，柱长275mm，填料POROS 50 R1；柱温：34℃；流动相A：30□乙醇-10mmol/L磷酸，流动相B：90□乙醇-10mmol/L磷酸；梯度：0～50□B，5CV、50～100□B，0.5CV、100～100□B，0.5CV；流速：100.0ml/min。将收集的εP A 44洗脱峰合并液混匀后，取样经检定合格即为原液，存放于-20℃备用。并且根据检定结果计算出本品的产量、收率和比活性。

结果见表12。经过反相层析高度纯化批量精制的原液，本品的产量为694.88±12.71mg，纯度为98.66±0.14□，收率为86.89±0.43□，比活性为11689.76±1503.57U/mg。达到了较好的精制效果及重复性。

表12.本品原液的批量精制效果及重复性观察

实施例35.

冻干CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAA PLGFFPDH GGGDPRVRGLYFPA脂质体注射剂工艺流程：

见附图8的实施例35的脂质体注射剂工艺流程图

实施例38.冻干

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAA YVNTNMGLK GGGDPRVRGLYFPA脂质体注射剂制备工艺

工艺过程中通入无菌高纯氮气，以防磷脂氧化并促使乙醚挥发。采用超滤方法反复对脂质体混悬液进行浓缩和透析，最终的体积浓缩倍数和透析倍数分别达到8倍和200倍以上，以除去液体中残留的有机溶剂。工艺过程中各物料及其体积变化详见表16-1。

表13 工艺过程中的物料名称及其体积比

实施例39 一种乙型肝炎治疗用疫苗处方

选用最常用的大豆磷脂和胆固醇构成磷脂双分子层膜。其中，前者是主要的类脂质成分，后者兼有稳定磷脂双分子层膜的作用。另外添加少量棕榈酸和维生素E，前者能够增加负电荷数量，增强脂质体对CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA(pI8.1)的结合能力；后者是为了防止磷脂氧化分解。甘露醇和人血白蛋白可作为冻干脂质体的保护剂和赋形剂。磷酸缓冲液(pH 6.5)可减缓大豆磷脂的水解，并调节渗透压至等渗。

实施例40.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEGGGFLPSDFFPSVSSSDPRVRGLYFPA治疗性疫苗制剂类脂质成分及脂质体形成条件的确定

采用二次乳化法制备脂质体，将类脂质成分溶解于乙醚溶液中，再与本品浓缩液混合，形成乳化液(W/O)，注入磷酸缓冲液(PB)或水中，同时控制温度和搅拌，二次形成乳化液(W/O/W)，随着乙醚的挥发逐步形成脂质体。通过超滤装置浓缩和透析(透析倍数须达到200倍以上)以及10μm微孔滤膜过滤，以除去液体中可能游离的和可能发生聚集沉淀的本品。取样进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析，测定包封量并与投药量比较计算脂质体包封率。试验设计采用L₉(3⁴)正交表。

表14 乙醚溶液成分及脂质体形成条件对其包封率的影响

注：1～9编号乙醚溶液中均含6mmol/L维生素E。

表14中结果表明，影响的主要因素依次为D、C、A和B，因素与水平的最佳组合为A II B III C I D I。

实施例41.免疫原浓度对脂质体包封率的影响

在上述正交试验确定的配方和条件基础上，比较了免疫原溶液的浓度对脂质体包封率的影响。

结果见表，当免疫原浓度在1.0～2.0mg/ml之间时，脂质体包封率均在90％以上(P＞0.05)；当浓度增加至2.5mg/ml时，包封率降至80％以下(P＜0.001)。因此在制备脂质体时，将免疫原原液超滤浓缩至1.5～2.0mg/ml。

表15 不同浓度εP A 44溶液对脂质体包封率的影响

实施例41.

CH₃(CH₂)₁₆COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA一种冻干εP A 44脂质体注射剂处方的确定

在表16中，编号1～11配方均含5％甘露醇/10mmol/L磷酸缓冲液(KH₂PO₄/Na₂HPO₄为60/40)。

表16脂质体浓缩液和赋形剂及其浓度对冻干的影响

^※注：浓缩后的脂质体浓缩液体积等于乳化液(W/O)体积(参见表16-1)。

当脂质体浓缩液加量为半成品分装液的25～50％(V/V)时，选择加入1％人血白蛋白为赋形剂能得到很好的冻干效果。因此，当浓缩后的脂质体浓缩液体积等于乳化液(W/O)体积时，将脂质体浓缩液体积确定为分装液体积的37.5％(V/V)，即脂质体浓缩液加量的平均水平。此时，分装液中各辅料浓度应符合表16-4的要求，分装量为1ml且符合冻干脂质体注射剂处方的要求。实际操作时，经常由于脂质体浓缩液体积大于乳化液(W/O)体积，可能使分装液体积增大，需按以下公式计算实际分装量，即：

给药时均加入1ml注射用水悬浮。

实施例42.冻干

CH₃(CH₂)₁₆COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGGGGDPRVRGLYFPA注射剂的批量制备结果及重复性观察

在上述试验确定的工艺条件下，经本品原液的超滤浓缩及脂质体的制备，加入辅料液分装、冻干和辐射灭菌，进行本品冻干注射剂成品的批量制备。

表17 本品冻干注射剂的批量制备结果及重复性观察

^※注：D50、D90和D99分别指10□、50□和90□的粒子其粒径均小于该值。

表17的结果显示，批量制备的本品脂质体包封率为89.76±1.26□；本品注射剂成品中，脂质体的D50、D90和D99分别为0.29±0.04、0.80±0.12和2.83±0.82，εP A 44含量为303.11±7.47μg/瓶，比活性为13627.46±648.95U/mg。达到了较好的重复性。

实施例43.CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAA LLPIFFCLWVGGGDPRVRGLYFPA的淋巴细胞转化实验：

2-3月龄Balb/c小鼠，雌雄均可。分0.001nmol，0.01nmol，0.1nmol、0.5nmol、1nmol、10nmol、20nmol、40nmol共8个剂量组，双侧后足掌免疫εP A 30，每周一次，共3次。脱颈处死小鼠，无菌条件下取双侧月国窝淋巴结，用3H-TdR掺入法检测，结果证明0.01nmol起效，在0.01nmol至20nmol的剂量范围内呈剂量依赖性反应。

实施例44.CH₃(CH₂)₁₄COKSSPADREAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA中和性抗体检测及特异性鉴定：

2-3月龄Balb/c小鼠，雌雄均可。分0.001nmol，0.01nmol，0.1nmol、0.5nmol、1nmol、10nmol、20nmol、40nmol共8个剂量组，双侧后足掌免疫εP A 44，每周一次，共3次。免疫结束后3周，取眼球放血，收集血清，用双抗体夹心法检测抗体。采用国际上全部的10株单抗，通过抗体竞争抑制实验检测其特异性。证明0.01nmol可诱发抗体产生，在0.01nmol至20nmol的剂量范围内呈剂量依赖性反应。此抗体为HBV中和性抗体。

实施例45.CH₃(CH₂)₁₄COKSSPADREGGGLLVPFVQWFVSSSDPRVRGLYFPA诱导Th1极化检测

2-3月龄Balb/c小鼠，雌雄均可。0.001nmol，0.01nmol，0.1nmol、0.5nmol、1nmol、10nmol、20nmol、40nmol共8个剂量组，双侧后足掌免疫εP A 44，每周一次，共3次。免疫结束后3周，取眼球放血，收集血清。采用ELISA法检测Th1/Th2细胞因子。结果证明本品0.01nmol剂量可在体诱导IFN-γ、IL-2为优势的细胞因子产生，且在0.01nmol--10nmol剂量范围内呈剂量依赖性反应。

实施例46.ELISPOT法检测

CH₃(CH₂)₁₄COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA诱导的细胞毒活性

2-3月龄Balb/c小鼠，雌雄均可。分0.001nmol，0.01nmol，0.1nmol、0.5nmol、1nmol、10nmol、20nmol、40nmol共8个剂量组，双侧后足掌免疫本品，每周一次，共3次。分别在免疫后第6、12、18、24天，自小鼠眼眶后无菌采取抗凝血，Ficoll-Hypaque法分离PBMC，用RPMI1640培养基(含10％小牛血清、100μ/ml青链霉素)体外培养(10⁶/ml，96孔细胞培养板)一天，待其恢复原生长状态后，用作待测细胞。ELISPOT 96孔细胞培养板用IFN-γ包被抗体预包被过夜，每孔设3个复孔，用含5％小牛血清的RPMI1640室温封闭1小时，空干后，加入待测细胞(5×10⁴细胞/100ul/孔，含RPMI1640培养基、10％小牛血清、100μ/ml青链霉素、1ug/ml肽)，其中以melan A27-35肽免疫的小鼠PBMC为阴性对照，培养15小时后，洗涤6次，空干板，加生物素标记的检测抗体，于37℃温育1小时，再次洗涤，空干后，加底物显色，计数斑点数目。结果表明最低有效剂量为0.01nmol，在0.01nmol--20nmol剂量范围内呈剂量依赖性反应。

实施例47.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA诱导健康人外周血单个核细胞(PBMC)增殖实验

无菌取正常人的抗凝外周血，常规Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC，用RPMI1640培养基(含10％小牛血清、100u/ml青链霉素、L-谷氨酰胺)，在24孔细胞培养板中体外培养，细胞浓度为10⁶/ml。设空白对照组、试验组、Pre-S(2)对照组，分别加IL-2(30IU/ml)和受试药物(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)，继续培养6天后，再用相同剂量的IL-2和受试药物同剂量下再次刺激1次，并加3H-TdR(1uCi/ml)，继续培养18h后收集细胞，液闪检测。结果表明：在0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml剂量范围内，本品以剂量依赖方式刺人PBMC增殖。

实施例48.

CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇COKSSPADREGGGWLSLLVPFVSSSDPRVRGLYFPA诱导健康人外周血单个核细胞(PBMC)Th1/Th2极化分析

无菌取正常人的抗凝外周血，常规Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC，用RPMI1640培养基(含10％小牛血清、100u/ml青链霉素、L-谷氨酰胺)，在24孔细胞培养板中体外培养，细胞浓度为10⁶/ml。设正常对照组、含受试药物组，分别加IL-2(30IU/ml)和受试药物(0.1μg/ml、1μg/ml)，培养6天后，再用相同剂量受试药物再次刺激1次，3天后，离心取上清，用Endogen试剂盒检测Th1/Th2极化。结果表明，Pre-S(2)可诱导较强的Th2型的T细胞转化，但基本不能诱导T淋巴细胞向Th1型转化；受试药物能够诱导T淋巴细胞向Th1、Th2型转化，尤以Th1型转化明显。

实施例49.

CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇COFLPSDFFPSVAAADPRVRGLYFPA诱导HBV特异性效应CTL的诱导及细胞毒活性检测

人PBMC用RPMI1640培养基(含10％小牛血清、100μ/ml青链霉素)分组培养(10⁶/ml，24孔细胞培养板)一天，待其恢复原生长状态后，分别加IL-2(30IU/ml)和受试药物(0.1μg/ml、1μg/ml)，继续培养6天后，再用相同剂量的IL-2和受试药物每周刺激1次，共3次，末次刺激3天后，获得抗原特异性效应CTL细胞。采用标准⁵¹Cr释放试验检测比较细胞毒活性。靶细胞(肽预包被的T2细胞和HepG2.2.1.5细胞)培养至状态良好，用前10小时在培养液中加入受试药物10μg/ml，继续培养。10⁶靶细胞置于1ml RPMI 1640培养基(含20％小牛血清)中，加100μCi ⁵¹Cr(NEN)，于37℃水浴中标记2小时。标记后的靶细胞用无菌PBS缓冲液离心洗涤3次(500rpm/5min)，然后以10⁴靶细胞/50ul/孔的数量铺于96孔V-型底细胞培养板中，每孔做3个复孔。按效靶比(E/T)12.5、25、50、100：1分别加入效应细胞，轻轻振荡混匀，500rpm离心3-5分钟，然后置于37℃，5％CO₂培养箱中共培养4小时。取上清检测γ计数值。最大释放值为10⁴靶细胞置于1mol/L盐酸中培养所得上清的γ计数值，最小释放值为10⁴靶细胞置于含20％小牛血清的RPMI1640培养基中4小时所得上清的γ计数值。其中，最小释放值应低于最大释放值的30％。⁵¹Cr释放百分数计算公式为：[(样本cpm-最小释放cpm)/(最大释放cpm-最小释放cpm)]×100％。

⁵¹Cr释放试验结果表明：人PBMC体外培养、经累次刺激诱导产生并扩大抗原特异性效应CTL细胞的数量，并做对HepG2.2.15细胞、肽抗原预包被的T2细胞和E6细胞的细胞毒杀伤试验，结果受试药物诱导的T淋巴细胞均能够特异性杀伤肽预包被的T2细胞、E细胞和HepG2.2.15，靶细胞特异性溶破率可达62.8％.

实施例50.CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)-CO，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇CO₇KSSQYIKANSKFIGITEGGGDPRVRGLY之ELISPOT法检测细胞毒活性

人PBMC，经首次刺激6天后，作为待测细胞。ELISPOT 96孔细胞培养板用IFN-γ包被抗体预包被过夜，每孔设3个复孔，用含5％小牛血清的RPMI1640室温封闭1小时，空干后，加入待测细胞(5×10⁴细胞/100ul/孔，含RPMI1640培养基、10％小牛血清、100μ/ml青链霉素、1ug/ml肽)，其中以未刺激的正常PBMC为阴性对照，培养15小时后，洗涤6次，空干板，加生物素标记的检测抗体，于37℃温育1小时，再次洗涤，空干后，加底物显色。在倒置显微镜下观察、计数斑点数目。结果证明：本品在0.01nmol--20nmol剂量范围内以剂量依赖性方式诱导细胞毒反应。

实施例51.CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAALLDYQGMLPVGGGDPRVRGLYFPA诱导的HBV抗原抑制试验：

24孔细胞培养板，HepG2.2.1.5细胞单层培养，加入无毒浓度以下2倍稀释的7个浓度药物激活的PBMC，按效靶比10∶1，同时设正常对照和药物对照。培养第3、5、7、10、14天，取上清，测定HBsAg、HBeAg。结果表明：本品在0.01nmol--20nmol剂量范围内以剂量依赖性方式抑制HBsAg、HBeAg的浓度。

实施例52.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAALLCLIFLLVGGGDPRVRGLYFPA诱导急性乙型肝炎病人PBMC之淋巴细胞增殖实验

无菌取急性肝炎恢复期病人和的抗凝外周血，常规Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC，用RPMI1640培养基(含10％小牛血清、100u/ml青链霉素、L-谷氨酰胺)，在24孔细胞培养板中体外培养，细胞浓度为10⁶/ml。设空白对照组、试验组、Pre-S(2)对照组，分别加IL-2(30IU/ml)和受试药物(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)，继续培养6天后，再用相同剂量的IL-2和受试药物同剂量下再次刺激1次，并加3H-TdR(1uCi/ml)，继续培养18h后收集细胞，液闪检测。结果表明：在0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml剂量范围内，本品以剂量依赖方式刺急性肝炎恢复期病人PBMC增殖。

实施例53.CH₃(CH₂)₁₀CO KSSPADREGGGSLNFLGGTTVSSSDPRVRGLYFPA诱导的肝炎病人PBMC之淋巴细胞极化分析

设急慢性肝炎空白对照组、急肝含受试药物组、慢肝受试药物组，用Endogen试剂盒或EELISPOT法检测Th1/Th2极化情况。结果：ELISA法检测病人PBMC的培养上清中IL-4、IL-10、IFN-γ等细胞因子浓度及变化情况，结果表明，Pre-S2可诱导较强的Th2型的T细胞转化，但基本不能诱导T淋巴细胞向Th1型转化；受试药物能够诱导T淋巴细胞向Th1、Th2型转化，以Th1型转化最为明显。

实施例54.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA诱导肝炎病人PBMC之淋巴细胞的HBV特异性效应CTL的产生及细胞毒活性检测

设急慢性肝炎空白对照组、急肝受试药物组、慢肝受试药物组，病人PBMC体外培养、经累次刺激诱导产生并扩大抗原特异性效应CTL细胞的数量，并做对肽预包被的T2、E6细胞和HepG2.2.15细胞的细胞毒杀伤试验，结果受试药物诱导的T淋巴细胞均能够特异性杀伤上述三种靶细胞系，对急肝恢复期病人PBMC而言，靶细胞特异性溶破率可达68.6％.而慢性肝炎病人PBMC，靶细胞特异性溶破率略低，可达42.6％.

实施例55.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA诱导乙型肝炎病人ELISPOT法检测细胞毒活性：

人PBMC，经首次刺激6天后，作为待测细胞。ELISPOT 96孔细胞培养板用IFN-γ包被抗体预包被过夜，每孔设3个复孔，用含5％小牛血清的RPMI1640室温封闭1小时，空干后，加入待测细胞(5×10⁴细胞/100ul/孔，含RPMI1640培养基、10％小牛血清、100μ/ml青链霉素、1ug/ml肽)，其中以未刺激的正常PBMC为阴性对照，培养15小时后，洗涤6次，空干板，加生物素标记的检测抗体，于37℃温育1小时，再次洗涤，空于后，加底物显色。在倒置显微镜下观察、计数斑点数目。结果证明：ε-PA30在0.01nmol--20nmol剂量范围内以剂量依赖性方式诱导细胞毒反应。

实施例56.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA在HBV转基因小鼠诱导Th1极化

采用HBV-DNA转基因小鼠(ayw型HBV全基因(1.3Kb)转染昆明种小鼠)。将动物随机分组，每组10只，于双侧胁下和后脚掌皮下注射，按10、100、1000U/鼠的3个剂量给药，每周加强免疫一次，共3次。设IFN-α2b(15000U/鼠)为阳性对照药、设生理盐水为阴性对照药。给药前、最后一次给药结束后10、20、30天。给药结束后30天，取小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞，用试品10ng/ml体外刺激3天，取上清，用ELISA法检测培养上清中TNF-α、IFN-γ、IL-4等细胞因子的分泌情况，分析受试药物体内诱导T细胞Th1/Th2型极化的功能。结果可检测到较强的IFN-γ分泌；IL-4的检测未见明显的剂量-效应关系。

实施例57.

CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA在HBV转基因小鼠诱导CTL活性

采用HBV-DNA转基因小鼠(ayw型HBV全基因(1.3Kb)转染昆明种小鼠)。将动物随机分组，每组15只，于双侧胁下和后脚掌皮下注射，按10、100、1000U/鼠的3个剂量给药，每周加强免疫一次，共3次。设IFN-α2b(15000U/鼠)为阳性对照药、设生理盐水为阴性对照药。给药前、最后一次给药结束后10、20、30天。给药结束后30天，取小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞，用试品10ng/ml体外刺激3天，用ELI-SPOT法检测IFN-γ分泌细胞在外周血淋巴细胞中的表达频率。结果表明，在结束免疫后第30天，随着原免疫剂量的升高，外周血淋巴细胞中IFN-γ分泌细胞的表达频率升高，其中100、1000U/鼠的免疫剂量，体内诱导外周血淋巴细胞中IFN-γ分泌细胞的表达频率升高明显，最高可检测到3660±IFN-γ分泌细胞/10⁶PBMC。

实施例58.

CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA在HBV转基因小鼠抑制病毒表面抗原(HBsAg)

采用HBV-DNA转基因小鼠(ayw型HBV全基因(1.3Kb)转染昆明种小鼠)。将动物随机分组，每组15只，于双侧胁下和后脚掌皮下注射，按10、100、1000U/鼠的3个剂量给药，每周加强免疫一次，共3次。设IFN-α2b(15000U/鼠)为阳性对照药、设生理盐水为阴性对照药。给药前、最后一次给药结束后10、20、30天。于三次免疫结束后的第10、20、30天，取血，分离血清，分别用ELISA法血清中HBsAg。结果表明血清HBsAg明显降低，且呈剂量依赖性和时间依赖性。

实施例59.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA在HBV转基因小鼠抑制病毒复制

采用HBV-DNA转基因小鼠(ayw型HBV全基因(1.3Kb)转染昆明种小鼠)。将动物随机分组，每组15只，于双侧胁下和后脚掌皮下注射，按10、100、1000U/鼠的3个剂量给药，每周加强免疫一次，共3次。设IFN-α2b(15000U/鼠)为阳性对照药、设生理盐水为阴性对照药。给药前、最后一次给药结束后10、20、30天。于三次免疫结束后的第10、20、30天，取血，分离血清，分别用定量PCR法检测血清中HBV DNA拷贝数。结果表明血清HBV DNA拷贝数明显降低，且呈剂量依赖性和时间依赖性。

实施例60.

CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的等电点测定

采用载体两性电解质PH梯度等电聚胶。预处理：8N尿素和2％TritonX-114，同时在聚丙烯酰胺凝胶中也要加入相应浓度的尿素和0.5％的TritonX-114。染色采用常规的考马斯亮兰染色。结果表明：本品等电点为pH7.2。

实施例61.

CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的紫外光谱测定

采用紫外分光光度计，对乙型肝炎治疗性多肽ε-PA44半成品进行紫外光谱扫描，并确定最大紫外吸收值对应的波长。将送检样品稀释至仪器的测定范围内，取样进行紫外光谱扫描，扫描波长为：190nm-500nm；空白对照为：50％乙醇。结果表明：其紫外光谱最大特征吸收峰在

实施例62.

CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的肽图测定

称重1mg胰蛋白酶于1.5ml离心管，并溶于0.1M NaHCO₃中，终浓度为1mg/ml，即为胰蛋白酶储液。加10μl胰蛋白酶液于εPA44样品管。盖紧离心管，反应混合物于37℃孵育2小时。在消化反应正在进行的同时，置剩余的胰蛋白酶储液于冰上。2小时后补加10μl胰蛋白酶于消化混合物。盖紧离心管，再继续在37℃下孵育4.5小时。反应结束时加10μl TFA终止反应。直接取样20μl进行RP-HPLC分析[HP1100高效液相色谱仪；色谱柱：Waters Symmetry C₁₈分析柱(粒度5μm，孔径100_柱直径3.9mm柱长150mm)]。

结果获得其特征性肽图。

实施例63.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA纯度分析(一)

采用有效的分子量线性范围为1000----80000的高效凝胶分析柱对分子量约为4947.37道尔顿的εPA44纯度进行分析，以214nm紫外波长检测肽键的吸收，根据面积归一化法积分计算本品主峰的百分纯度。仪器与色谱条件：Waters Delta 600高效液相色谱仪；WatersMillennium³²色谱软件；Waters Uitrahydrogel 250高分辨凝胶分析柱(粒度6μm，孔径250_，柱直径7.8mm柱长300mm)；CH₃CN(乙腈，HPLC级，浙江临海)；TFA(三氟乙酸，HPLC级，美国Sigma公司)。流动相选用40％CH₃CN 0.1％TFA；浓缩后的半成品取样2ul上样；流速：0.5ml/min；紫外检测波长：214nm。结果表明：该品纯度在99.8％。

实施例64.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA纯度分析(二)

采用梯度反相高压液相色谱的方法分离本品，以214nm紫外波长检测肽键的吸收，根据面积归一化法积分计算主峰εPA44的百分纯度。仪器与色谱条件：HP 1100高效液相色谱仪；色谱注：Waters Symmetry C₁₈分析柱(粒度5μm，孔径100_柱直径3.9mm柱长150mm)及保护柱(粒度5μm，孔径100_柱直径3.9mm柱长20mm)；CH₃CN(乙腈，HPLC级，浙江临海)；TFA(三氟乙酸，HPLC级，美国Sigma公司)。流动相A相为100％H₂O-0.1％TFA；B相为100％CH₃CN-0.1％TFA；线性梯度：10％B～70％B 30min；流速：1ml/min；紫外检测波长：214nm。结果表明：本品纯度为：99.9％。

实施例65.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA含量测定

采用外标法和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析技术，测定组分收集液、半成品、浓缩液及其脂质体浓缩液等样品中本品的含量。

将送检样品稀释至本品标准曲线的定量范围内，取样进行RP-HPLC分析，根据建立的定量标准曲线线性回归方程：Y(峰面积)＝12.362X(浓度)+80.702和样品的稀释倍数，计算送检样品的本品含量。

仪器与色谱条件：HP 1100高效液相色谱仪；色谱注：WatersSymmetry C₁₈分析柱(粒度5μm，孔径100_，柱直径3.9mm，柱长150mm)及保护柱(粒度5μm，孔径100_，柱直径3.9mm，柱长20mm)；柱温：25℃；CH₃CN(乙腈，HPLC级，浙江临海)；TFA(三氟乙酸，HPLC级，美国Sigma公司)。流动相A：100％H2O-0.1％TFA；流动相B：100％CH₃CN-0.1％TFA；线性梯度：30％～60％B 15min；流速：1ml/min；紫外检测波长：214nm。结果表明：本品含量4.5mg/ml。

实施例66.

CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA分子量测定

运用电喷雾质谱(ESI-MS)软电离使多肽及蛋白质分子带多个电荷，形成不同质量电荷比，从而根据相邻两个峰的质荷比联立方程(n＝m₁-H/m₂-m₁)得到的所带电荷数来达到准确测定εPA44分子量的目的。仪器与质谱条件：PE ABI 2000质谱仪；PE SCIEX Analyst 1.0b3质谱分析软件；扫描Q1正离子，GAS1：20 GAS2：0 CUR：20 TEM：50℃ CAD：0 IS：5500 NC：2 DP：30 FP：350 EP：-10 DF：0 CEM：1800。检测结果：4929.12u，与理论分子量相符。

实施例67.

CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA脂质体的粒径分布测定

采用激光粒度分析仪(Laser Particle Sizer“Analysette 22”；德国FRITSCH)、用微量池(德国FRITSCH)检测εP A 44脂质体的粒径分布。检测范围：0.1μm-100.25μm，分辨率：62道(9mm/38mm)。将冻干εP A 44脂质体成品随机抽样，用水溶解、稀释、混允后检测。结果表明：本品D50为0.25μm，D90为0.72μm，跨距小于3。

实施例68.

CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA半成品的效价/比活性测定

将送检的原液半成品，稀释至本品效价测定的范围内，进行酶联板的包被、封闭、酶标抗体的结合及显色。在酶标仪450nm下检测吸光值(A450nm)，并与本品参考品比较，测定萃取样品中εP A 44的效价，计算出本品半成品的比活性。

将本品参考品用50％乙醇稀释10倍，再进行倍比稀释；分别吸取100μl稀释液加入96孔酶标板，均重复3孔，置4℃冰箱包被20-24小时。εP A 44原液按照参考品的操作进行稀释和包被。阴性对照孔：加入50％乙醇100μl。包被结束后，每孔加1％小牛血清200μl，放置4℃冰箱封闭2小时。将酶联板空干，每孔加入酶标抗体80μl，置于37℃孵育40分钟；将酶联板用洗液清洗4次，空干后每孔加入底物液A、B各50μl，置37℃避光显色15分钟；每孔加终止液50μl。在550型酶标检测仪上测定A_450nm。，根据εP A 44参考品的半效值(半数最大吸光值)，采用程序或直线回归方法处理，分别计算参考品和样品的半效稀释倍数；将其代入以下面公式，计算出待检样品效价和本品成品比活性。

检测结果表明：本品比活性为13985.31U/mg；每瓶效价为4085.53U。

实施例69.

CH₃(CH₂)-₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA脂质体效价/比活性测定

经洗涤、离心、萃取和干燥处理，再溶解并取样进行RP-HPLC分析测定εP A 44的含量。依据测定的含量将样品稀释至效价测定的范围内，进行酶联板的包被、封闭、酶标抗体的结合及显色。在酶标仪450nm下检测吸光值(A450nm)，并与本品参考品比较，测定萃取样品中本品的效价，计算出本品成品的比活性。将参考品用50□乙醇稀释10倍，再进行倍比稀释；分别吸取100μl稀释液加入96孔酶标板，均重复3孔，置4℃冰箱包被20-24小时。本品成品经上述预处理样品，按照本品参考品的操作进行稀释和包被。阴性对照孔：加入50□乙醇100μl。包被结束，每孔加1□小牛血清200μl，放置4℃冰箱封闭2小时。将酶联板空干，每孔加入酶标抗体80μl，置于37℃孵育40分钟；将酶联板用洗液清洗4次，空干后每孔加底物液A、B各50μl，置37℃显色15分钟；每孔加终止液50μl。在550型酶联仪上测定A_450nm。根据εP A 44参考品的半效值(半数最大吸光值)，采用程序或直线回归方法处理，分别计算本品参考品和样品的半效稀释倍数；将其代入以下面公式，计算出待检样品效价和本品成品比活性。

检测结果表明：本品比活性为14173.51U/mg；每瓶效价为4177.78U。

Claims

1.一种免疫原，其特征在于该免疫原是一个由氨基酸序列1、氨基酸序列2和氨基酸序列3组成的多肽序列，氨基酸序列1、氨基酸序列2与氨基酸序列3之间分别由3-7个氨基酸残基组成的连接肽段共价连接；其中所述氨基酸序列1是QYIKANSKFIGITE或PADRE；所述氨基酸序列2是：PLGFFPDH、MQWNSTALHQALQDP、SILSKTGDPV、VLQAGFFLL、FLLTRILTI、FLGGTPVCL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、WLSLLVPFV、GLSPTVWLSV、KVLHKRTLGL、VLHKRTLGL、GLSAMSTTDL、CLFKDWEEL、VLGGCRHKLV、FLPSDFFPSV、STLPETTVVRR、EYLVSFGVW、GLYSSTVPV、GLSRYVARL、FLLSLGIHL、ILRGTSFVYV、SLYADSPSV、KYTSFPWLL、SLYADSPSV、ALMPLYACI、YMDDVVLGA、WILRGTSFV、KLHLYSHPI、FTQAGYPAL、SLNFLGGTTV、LLDYQGMLPV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSV、LLPIFFCLWV、YVNTNMG、YVNTNMGLK、SILSKTGDPV、GLSPTVWLSV或SIVSPFIPLL；所述氨基酸序列3是DPRVRGLYFPA或CTKPTDGNCT，并且有一个修饰基团与所述多肽序列的N末端α氨基之间通过连接肽段KSS连接，其中，所述多肽序列的N末端α氨基与连接肽段KSS的C末端通过肽键连接，所述修饰基团与连接肽段KSS的ε氨基共价连接，所述修饰基团选自CH₃(CH₂)₁₀CO-，CH₃(CH₂)₁₂CO-，CH₃(CH₂)₁₄CO-，CH₃(CH₂)₁₆CO-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₇CO-，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇CO- 和CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇CO-。

2.权利要求1所述的免疫原，其特征在于所述连接肽段是AAA、SSS或GGG。

3.如权利要求1或2所述的免疫原，其特征在于氨基酸序列1、氨基酸序列2与氨基酸序列3之间的连接次序是：氨基酸序列1-氨基酸序列2-氨基酸序列3，氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列2，氨基酸序列2-氨基酸序列1-氨基酸序列3，氨基酸序列2-氨基酸序列3-氨基酸序列1，氨基酸序列3-氨基酸序列1-氨基酸序列2，或者氨基酸序列3-氨基酸序列2-氨基酸序列1。

4.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₀COKSSPADREGGGSLNFLGGTTVSSSDPRVRGL YFPA。

5.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAALLCLIFLLVGG GDPRVRGLYFPA。

6.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAALLDYQGMLPVGGGDPR VRGLYFPA。

7.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)-CO，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇CO₇KSSQYIKANSKFIGITEGGGDPRVRGLYFPA。

8.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇COFLPSDFF PSVAAADPRVRGLYFPA。

9.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)CH＝CH(CH₂)₇COKSSPADREGGGWLSLLVPFVSSSDPRVRGLYFPA。

10.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSV GGGDPRVRGLYFPA。

11.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH_3-(CH₂)₁₄COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVR GLYFPA。

12.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH_3-(CH₂)₁₄COKSSPADREGGGLLVPFVQWFVSSSDPRVR GLYFPA。

13.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH_3-(CH₂)₁₄COKSSPADREAAAGLSPTVWLSVGGGDPR VRGLYFPA。

14.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH_3-(CH₂)₁₆COKSSPADREAAALLPIFFCLWVGGGDPRV RGLYFPA。

15.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₆COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGGG GDPRVRGLYFPA。

16.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH_3-(CH₂)₁₆COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSV GGGDPRVRGLYFPA。

17.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEGGGFLPSDFFPSVS SSDPRVRGLYFPA。

18.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH_3-(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGLKG GGDPRVRGLYFPA。

19.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAPLGFFPDHG GGDPRVRGLYFPA。

20.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₄COKSSYIKANSKFIGITEAAAMQWNSTALHQA LQDPGGGDPRVRGLYFPA。

21.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₄COKSSPDAREAAASILSKTGDPVGGGDPRVR GLYFPA。

22.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAAVLQAGFFLLGGGDPRVRG LYFPA。

23.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADRESSSFLLTRILTIGGGDPRVRGLY FPA。

24.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAAFLGGTPVCLGGGDPRVR GLYFPA。

25.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAGLSPTVWLSV GGGDPRVRGLYFPA。

26.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAASIVSPFIPLLG GGDPRVRGLYFPA。

27.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₆COKSSPADREAAASTLPETTVVRRGGGDPRVR GLYFPA。

28.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于一级结构是CH₃(CH₂)₁₄COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVG GGCTKPTDGNCT。

29.一种设计、筛选和合成权利要求1至28中任一项所述的免疫原的方法，包括基于表位的疫苗设计，分子模拟、分子设计、筛选体系和多肽固相合成，其中多肽固相合成中树脂与每种氨基酸或棕榈酸投料的摩尔比为1∶2-1∶8，精氨酸、天冬酰胺以及棕榈酸组分的连接采用双偶联，反应温度为20-40℃。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述投料的摩尔比为1∶4，所述反应温度为30℃。

31.一种制备权利要求1至28中任一项所述免疫原的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)多肽固相合成所述免疫原-树脂，所述免疫原-树脂表示与树脂结合的免疫原；(2)对免疫原-树脂进行裂解，得到裂解液；(3)将步骤(2)的裂解液采用体积排阻层析进行初步分离纯化；(4)通过反相层析纯化得到免疫原。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于所述步骤(2)选用TFA裂解液；裂解条件是免疫原-树脂的浓度：小于100mg/ml，反应温度：15-50℃，反应时间：0.5-3小时。

33.如权利要求31或32所述的方法，其特征在于所述TFA裂解液为：0.75g苯酚、0.25ml乙二硫醇、0.5ml苯甲硫醚、0.5ml去离子水和10.0ml TFA；所述裂解条件是免疫原-树脂的浓度：40.00mg/ml，反应温度：25℃，反应时间：1.5小时。

34.如权利要求31所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中的体积排阻层析采用的柱填料为Sephadex LH20，流动相为二甲基亚砜。

35.如权利要求31所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中的反相层析采用的柱填料为POROS 50 R1、POROS 50 R2、SOURCE 30 RPC或DletaPak C18。

36.如权利要求31或35所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中的反相层析采用梯度洗脱，流动相采用乙腈/TFA、乙腈/HCl、乙醇/TFA、乙醇/HCl或乙醇/磷酸的水溶液。

37.如权利要求31或34或35中任一项所述的方法，其特征在于所述反相层析纯化的柱温是20-60℃。

38.如权利要求37所述的方法，其特征在于所述反相层析纯化的柱温是28-40℃。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于所述反相层析纯化的柱温是32-36℃。

40.如权利要求39所述的方法，其特征在于所述反相层析纯化的柱温是34℃。

41.权利要求1至28中任一项所述的免疫原在制备治疗HBV慢性感染持续状态及其相关的继发性肝硬化、肝癌的疫苗或药物的用途。

42.一种如权利要求41所述的用途，其特征在于所述HBV慢性感染持续状态为慢性乙型肝炎或乙型肝炎病毒携带者。

43.一种治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗含有权利要求1至28中任一项所述的免疫原。

44.如权利要求43所述治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗的制剂是注射剂、透皮剂、口服剂、吸入剂或栓剂。

45.如权利要求43所述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗的剂型为液体剂型、混悬液剂型、液体脂质体剂型或冻干脂质体剂型。

46.如权利要求45所述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于液体剂型为乙醇溶液剂型。

47.如权利要求45所述治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述液体脂质体剂型或冻干脂质体剂型含有磷脂。

48.如权利要求47所述治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述液体脂质体剂型或冻干脂质体剂型还含有胆固醇。

49.如权利要求47所述治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述液体脂质体剂型或冻干脂质体剂型还含有维生素E。

50.如权利要求47所述治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述液体脂质体剂型或冻干脂质体剂型还含有棕榈酸。

51.如权利要求45所述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗以摩尔比0.1-0.5∶40-80∶0-40∶0-10∶0-10的比例含有免疫原、磷脂、胆固醇、维生素E和棕榈酸。

52.如权利要求51所述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗中的免疫原、磷脂、胆固醇、维生素E和棕榈酸的摩尔比为0.2-0.4∶60∶20∶6∶6。

53.如权利要求52所述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于该疫苗中的免疫原、磷脂、胆固醇、维生素E和棕榈酸的摩尔比为0.3-0.36∶60∶20∶6∶6。

54.如权利要求47所述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述磷脂为大豆磷脂或卵磷脂。

55.如权利要求45所述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述冻干脂质体剂型还含有人白蛋白、甘露醇和磷酸盐。

56.如权利要求45所述的治疗用乙型肝炎疫苗，其特征在于所述冻干脂质体剂型含权利要求1至28任意一项所述免疫原、磷脂、胆固醇、棕榈酸、维生素E、甘露醇、人血白蛋白、KH₂PO₄和Na₂HPO₄，其摩尔比为0.01-0.1∶5-15∶1-7∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶70-150∶0.1-0.3∶1-10∶1-10。

57.一种制备权利要求45或47所述的治疗用乙型肝炎疫苗的方法，其特征在于所述方法包括采用二次乳化法制备脂质体。