CN106164293B - 适配子构建体 - Google Patents

Abstract

本公开涉及适配子及其用途，尤其涉及特异性结合CD133并在癌症的诊断和/或治疗中特别有用的适配子。

Description

适配子构建体

相关申请和通过引用并入

本文所引用或参考的所有文件，连同本文或通过引用并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的指导、说明、产品说明书和产品手册，均通过引用整体并入本文中。

本申请要求2014年2月5日提交的AU 2014900347标题为“适配子构建体”的优先权。

技术领域

本公开涉及适配子及其用途，尤其涉及能特异性结合CD133并且在癌症的诊断和/或治疗中特别有用的适配子。

背景技术

CD133，也称为Prominin-1，是高度糖基化的五次跨膜(pentaspan)膜糖蛋白，其与质膜中的胆固醇结合。尽管已知该蛋白能够确定大量的细胞群体，包括成体干细胞和祖细胞，并且在多种发育的上皮细胞和分化细胞中表达，但其具体功能仍有待阐述。然而，其与Notch-信号通路有关联，该通路对二元细胞命运、肠上皮细胞的分化和淋巴组织生成至关重要(Ulasov等人.2011.Mol Med 17:103-12)。由于认为该分子是许多癌症中的癌症干细胞(CSC)的标记物，近年对其表现出了更多的兴趣。确实，越来越多的证据表明CD133在许多癌症中的CSC上表达，并且在免疫缺陷小鼠中，相对于阴性对照物，CD133+细胞存在增加的肿瘤发生可能性(Dittfeld等人.2009.Radiother Oncol 92:353-61)。

近年，免疫疗法对癌症治疗具有很大的影响。然而，抗体，甚至是人源化抗体的使用，可引起可能致命的不良副作用(Hansel等人.2010.Nat Rev Drug Discov 9:325-38)。这引起了对“更大和更好的”选择的探索。已进行了数次使用核酸作为治疗剂的尝试，但这些尝试取得了令人失望的结果，这尤其是因为这些核酸不能进入细胞(Shigdar等人.2011.Br J Haematol 155:3-13)。

化学抗体，称为适配子，在过去20年中被越来越多地用于临床应用。确实，一种适配子哌加他尼(pegaptanib)(抗VEGF适配子)已得到FDA批准，并且几种其它的适配子在进行临床试验。将适配子用于治疗的兴趣增加是由于几个原因，包括如下事实：它们没有表现出免疫原性、由于是化学合成的而产生的批次间差异很小，以及相比常规抗体更为稳定。由于其尺寸较小，它们还显示优良的肿瘤穿透。然而，它们最重要的特征是能够将这些适配子附着至纳米粒子、药物、成像剂或其它核酸治疗剂，而无功能丧失(Meng等人.2012.PLoSOne 7:e33434)。该功能化引起新的和更多的靶向治疗，其相比当前的治疗方式具有更少的副作用(Meng等人.2012同上)。当相比主要为被动过程的常规治疗时，靶向递送系统要有效得多。适配子要想成为有效的药物递送剂，该适配子必须能结合其细胞表面上的靶标，并在短时间内被内化。因此，本领域需要具有改进的结合特性和肿瘤穿透的适配子。

发明内容

最近已了解到癌症干细胞是引起赘生组织形成和生长的原因，并且其天然耐受化学治疗，这解释了为何传统化疗起初能够缩小肿瘤但不能完全根除肿瘤，导致最后的复发。根据癌症干细胞假说，CD133阳性细胞(CD133⁺)决定长期的肿瘤生长，并因此被怀疑能影响临床结果。最近发现CD133阳性细胞的比例以及它们的成簇的拓扑组织均为不良的无进展生存和总体生存的重要预后因素，而与肿瘤阶段、切除程度或患者年龄无关。

当前用于靶向CD133阳性癌症干细胞的技术利用常规的基于抗体的系统，但由于可用的抗CD133抗体的尺寸以及它们相对不能穿透组织而缺少灵敏性。

因此，针对CD133+细胞的适配子的产生将有利于根除癌症。本发明人制备了CD133特异性的适配子，其能被快速内化并显示优良的肿瘤穿透，从而解决了这一问题。尤其是本公开的适配子是特别有效的治疗诊断剂。

本公开提供了一种特异性结合CD133的适配子。在一个实例中，所述适配子是寡核苷酸。在一个实例中，所述寡核苷酸可以是RNA、DNA或杂交RNA/DNA适配子，和/或可以包含除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的核苷酸。

本公开还提供了一种适配子，其包含序列5’–X-ACGUAUACUAU-Y-3’(SEQ ID NO:1)，其中X和Y的序列是互补的，从而能够碱基配对，并且其中X和Y单独地包含一段CG配对的核苷酸，所述CG配对的核苷酸足以允许至少一种半簇附着至其上。

根据本公开的适配子，X和Y可以单独地包含至少4个CG配对的核苷酸(4个CG对)。在另一个实例中，X和Y可以单独地包含至少5个CG配对的核苷酸、或者至少6个CG配对的核苷酸、或者至少7个CG配对的核苷酸、或者至少8个CG配对的核苷酸、或者至少9个CG配对的核苷酸、或者至少10个CG配对的核苷酸、或者至少11个CG配对的核苷酸、或者至少12个CG配对的核苷酸、或者至少13个CG配对的核苷酸、或者至少14个CG配对的核苷酸、或者至少15个CG配对的核苷酸。

在另一个实例中，所述适配子可包含4至15个CG配对的核苷酸(4至15个CG对)。在另一个实例中，所述适配子可包含2至12个CG配对的核苷酸。在另一个实例中，所述适配子可以包含2至10个配对的核苷酸、2至8个配对的核苷酸、或2至6个配对的核苷酸。

本领域技术人员应理解CG配对的核苷酸构成适配子的茎区。

在一个实例中，所述适配子显示对CD133约24nM或更低的平衡解离常数(K_D)。在另一个实例中，所述适配子显示对CD133约24nM的解离常数(K_D)。在另一个实例中，所述适配子对CD133显示24nM的解离常数(K_D)。在另一个实例中，所述解离常数通过测量适配子与表达在HT29细胞上的CD133的结合来确定。

在一个实例中，所述适配子是杂交RNA/DNA适配子。在另一个实例中，所述适配子是分离的适配子。在另一个实例中，所述适配子是根据本领域已知的方法(例如SELEX)合成的。

在一个实例中，根据本公开的适配子特异性地结合CD133。在另一个实例中，根据本公开的适配子选择性地结合CD133。

在一个实例中，所述适配子包含序列5’–CGCGCGCCGCACGUAUACUAUGCGGCGCGCG-3′(SEQ ID NO:2)。在一个实例中，所述适配子包含根据SEQ ID NO:2所示的序列，其中所述序列包含10个GC配对的核苷酸，所述核苷酸是DNA。在另一个实例中，所述适配子包含RNA序列5′-ACGUAUACUAU-3’(SEQ ID NO：3)。在另一个实例中，所述适配子包含根据SEQ ID NO:2所示的序列，其含有根据SEQ ID NO:3所示的序列，其中SEQ ID NO:3是RNA，剩余的序列是DNA。在一个实例中，预测的适配子二维结构的茎区在图1中显示。

在一个实例中，适配子基本上由根据SEQ ID NO:2所示的序列组成。可选地，所述适配子可以由根据SEQ ID NO:2所示的序列组成。根据本公开的或根据SEQID NO:2所示的适配子包括额外的序列。根据本公开的适配子可以包含与SEQ IDNO:2具有至少95％同一性的序列，或者至少90％同一性、至少92％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性、至少75％同一性、或至少70％同一性的序列。

在一个实例中，通过插入(intercalation)进行半簇的附着。在另一个实例中，通过缀合进行附着。在另一个实例中，通过静电结合进行附着。在另一个实例中，通过接头(linker)进行附着。

根据本公开的半簇可以是DNA染色剂或用于化疗治疗的分子，或者是能够进行两种功能的分子。能够插入至根据本公开的适配子的合适的分子的实例可以选自：阿霉素(doxorubicin)、亚德里亚霉素(adriamycine)、黄连素、原黄素(provflavine)、米托蒽醌、柔毛霉素、沙利度胺、更生霉素、达诺霉素、放线菌素D、9-氨基吖啶、氨柔比星、安吖啶、蒽环霉素(anthramycine)、小檗因、博来霉素、elliplicine、表柔比星、伊达比星、methpyrillo、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、米托蒽醌、吡柔比星、匹克生琼(pixantrone)、普卡霉素、普罗黄素(proflavine)、灵菌红素、沙利度胺、voreloxin、戊柔比星、佐柔比星、扑尔敏、prodisiosin、methapyrillino、丝裂霉素、偏端霉素、dantinomycin、偏端霉素、卡波铂、顺铂和其它铂衍生物、Hoechst 33258、berenil、DAPI、或致癌剂(包括黄曲霉素B1的exo 8,9环氧化物、吖啶比如普罗黄素或奎纳克林或溴化乙锭)。其它GC插入剂是本发明所属领域技术人员熟知的，并且意图被纳入本公开的范围。在优选的实例中，所述分子是阿霉素(DOX)。

X和Y的序列能够形成碱基配对，因此提供了适配子的茎区。不希望受到理论的束缚，优选地，半簇能够通过插入碱基配对的X和Y的DNA序列中的CpG位点之间而附着至本公开的适配子。对于DOX，每CpG位点平均有约2.5个DOX分子，或者换言之，约2.5个DOX分子能够插入根据SEQ ID NO:2所示的序列。

所述适配子的总长度可以是19至101个核苷酸、21至85个核苷酸、25至75个核苷酸、31至65个核苷酸、41至55个核苷酸、或者31至41个核苷酸。本领域技术人员应理解，虽然本公开描述了包含至少15个CG配对的核苷酸的适配子，剩余的茎序列除了交替的CG配对的核苷酸以外，可以包含RNA或DNA序列。

本公开的适配子在序列中可以进一步包含一个或多个核苷酸取代，保持适配子的结合环。在一个实例中，在本文公开的适配子、或者根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的适配子序列的茎区中，序列包含至少1个、2个、3个、4个、5个或6个取代。应理解取代的数量取决于适配子的长度，并且将耐受至适配子仍能够允许分子比如阿霉素进行附着的程度。

在一个实例中，所述适配子进一步包含一种或多种改进适配子(在体外和/或在体内)稳定性的修饰。在一个实例中，在环区的嘧啶核苷酸碱基(C和/或U)是经2’-氟代(2’-F)修饰的。为避免疑义，环区是序列5’-ACGUAUACUAU-3’(SEQ ID NO:3)。在另一个实例中，在适配子茎区的C碱基(脱氧胞苷，dC)被修饰为5-甲基脱氧胞苷(5-甲基dC)。当dC被取代为5-甲基dC时，适配子的Tm可以提高多达0.5℃每插入。不希望受到理论的束缚，在CpG基序中存在的5-甲基dC能够阻止或限制无端的(unwarranted)免疫反应，否则在体内施用寡核苷酸时发生无端的免疫反应，这对于体内诊断和治疗尤其重要。在另一个实例中，适配子的3’端可以被修饰以保护其免受核酸酶消化。在另一个实例中，使用磷酸基团、磷酸酯或者反向的dT(invdT-3’)修饰3’端来修饰适配子。在另一个实例中，5’端可以偶联染料，比如生物素、异硫氰酸荧光素(FITC)、青蓝(Cy3或Cy5)。本领域技术人员熟知额外的修饰，并且认为是包括在本公开之内的。

在一个实例中，本公开提供了杂交RNA/DNA适配子，其包含序列5’-X-A(2’fC)G(2’-fU)A(2’fU)A(2’fC)(2’fU)A(2’fU)-Y-(inv dT)-3’(SEQ ID NO:4)，其中，X和Y是互补的，从而能够碱基配对，并且其中X和Y单独包含一段CG配对的核苷酸，f＝2’-氟代，以及invdT＝反向的dT(反向连接)，并且其中X和Y的长度足以允许至少一种半簇附着至其上。在一个具体的实例中，X和Y是DNA。

在一个实例中，本公开提供了一种杂交RNA/DNA适配子，其包含序列5’–mCGmCGmCGmCmCGmCA(2’fC)G(2’-fU)A(2’fU)A(2’fC)(2’fU)A(2’fU)GmCGGmCGmCGmCG-(invdT)-3’(SEQ ID NO:5)，其中，C＝5-甲基dC，f＝2’-氟代，以及inv dT＝反转dT(反向连接)。根据这个实例，所述适配子包含反向的3’端G。

在另一个实例中，所述杂交RNA/DNA适配子基本上由根据SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5所示的序列组成。在另一个实例中，杂交RNA/DNA适配子由根据SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5所示的序列组成。

根据本公开的适配子可以包含与SEQ ID NO:4或5具有至少95％同一性的序列，或者与SEQ ID NO:4或5所示的序列具有至少90％同一性、至少92％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性、至少75％同一性、或至少70％同一性的序列。

所述适配子可以进一步包含3’或5’染料，比如Cy3或Cy5。

本领域已知制备2’-氟代修饰的RNA碱基的方法。在一个实例中，在合成RNA转录本期间直接并入2’-氟代修饰的碱基。

本公开还提供了一种适配子，其实质上具有与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示序列的适配子相同的结合CD133的能力。

在一个实例中，根据本公开的适配子特异性地结合CD133⁺细胞。在另一个实例中，根据本公开的适配子选择性地结合CD133⁺细胞。CD133⁺细胞可以是干细胞。所述干细胞可以是经纯化的或分离的干细胞，在一个实例中可以是癌症干细胞。在一个实例中，癌症干细胞的特征是(i)表达CD133、(ii)致瘤、(iii)能够自我更新、(iv)能够分化以及(v)通过常规治疗抵抗凋亡。

可选地，癌症干细胞可以描述为从来源比如生物样品分离的、富集的或纯化的。在另一个实例中，癌症干细胞代表基于CD133⁺表达富集的细胞群。在另一个实例中，细胞群包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的癌症干细胞。

在一个实例中，表达CD133的细胞和/或癌症干细胞在体内。在另一个实例中，表达CD133的细胞和/或癌症干细胞在体外。在另一个实例中，表达C133的细胞和/或癌症干细胞存在于从受试者获得的生物样品中。可以以任何常规方式检测适配子的结合，例如，通过检测与适配子连接的标记、通过适配子成像、或通过确定结合适配子的量。合适的方法例如在WO 2004/081574中描述。

在另一个实例中，本公开的表达CD133的细胞和/或癌症干细胞单独地或共同地表达一种或多种标记物，所述标记物选自CD44、ABCG2、β-连环蛋白、CD117、ALDH、VLA-2、CD166、CD201、IGFR、EpCAM和EGF1R。

“单独地”意思是本公开分别包括所述的标记物或标记物组，尽管在本文没有分别列举单独的标记物或标记物组，所附权利要求可以分别地彼此区分地限定这种标记物或标记物组。

“共同地”意思是本公开包括任何数量或组合的所述的标记物或肽的组，尽管本文没有被具体列举这种数量或组合的标记物或标记物组，所附权利要求可以分别限定这种组合或子组合，并区别于任何其它标记物的组合或标记物组。

在另一个实例中，根据本公开的肿瘤干细胞是脑癌干细胞、转移性脑癌细胞、乳癌干细胞、前列腺癌干细胞、胰腺癌干细胞、结肠癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞、卵巢癌干细胞、皮肤癌干细胞或黑色素瘤干细胞。

本公开的适配子可以用于治疗或诊断。此外因为DOX是天然荧光的，其同时能够被用于治疗和诊断(即治疗诊断)。

本公开还提供了一种包含根据本公开的适配子的诊断剂或治疗诊断剂。在一个实例中，所述适配子是根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的适配子。在另一个实例中，所述诊断剂包含偶联可检测的标记的本公开的适配子。在一个实例中，所述诊断剂用于在体内或在体外检测表达CD133的癌症干细胞。在一个实例中，所述治疗诊断剂是适配子-Dox缀合物。

本公开还提供了一种用于在受试者中、或在从受试者获得的生物样品中鉴定或检测表达CD133的细胞和/或癌症干细胞，所述受试者患有、或疑似患有癌症，所述方法包括使细胞和本文所描述的诊断剂或治疗诊断剂接触。

在一个实例中，本公开的诊断剂或治疗诊断剂能够用于在受试者中、或者在从受试者获得的生物样品中检测表达CD133的细胞和/或癌症干细胞的存在，所述受试者患有肿瘤或疑似患有肿瘤。如果需要，检测可以通过将适配子与可检测的标记相偶联而促进。可检测的标记的实例包括多种酶、辅基(prosthetic group)、荧光物质、发光物质、生物发光物质、电子致密标记、MRI标记和放射性物质。

本公开还提供了一种如本文中描述的适配子或者如本文中描述的诊断剂用于生物样品的组织学检查。本领域技术人员熟知制备组织学样品的方法。

本公开的适配子可以进一步偶联至半簇，所述半簇是活性半簇。所述半簇可以是配体，比如另外的适配子或可选的配体。所述半簇可以是免疫球蛋白、或免疫球蛋白的片段或部分、治疗剂、另一种药物或生物活性剂、毒素、或放射性核素。可选地，所述半簇可以包括siRNA、DNA酶或核酶。前述半簇的任何组合也包括在本公开中。

本公开还提供了一种编码如本文所描述的适配子的表达载体。还提供了与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:5中任一项互补的核苷酸序列，尤其与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5中任一项互补。

本公开还提供了一种用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者提供本文所描述的适配子或治疗诊断剂。被治疗的受试者通常是受益于使用本公开的适配子或治疗诊断剂的治疗的受试者。在一个实例中，所述受试者被诊断为患有癌症。可选地，所述受试者是疑似患有癌症的受试者，在该情况中适合向受试者施用治疗诊断剂。如本文所描述的偶联至半簇的本公开的适配子、或者本文所描述的治疗诊断剂可以被施用于受试者持续数周、数月或数年时间，以监测和/或治疗受试者。

根据本公开的受试者可以是患有或疑似患有癌症的受试者，所述癌症选自脑癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤或存在CD133+细胞的任何其它癌症。在一个实例中，所述癌症是任何存在或疑似存在表达CD133的细胞和/或癌症干细胞的癌症。

本公开还提供了本文所描述的适配子在制备用于检测或诊断癌症的诊断剂中的用途。

本公开还提供了根据本公开的适配子或根据本公开的治疗诊断剂在制备用于在受试者中治疗癌症的药物的用途。

本公开还提供了根据本公开的适配子或根据本公开的治疗诊断剂在医学中的用途。

本公开还提供了根据本公开的适配子或根据本公开的治疗诊断剂用于在受试者中治疗癌症的用途。

本公开还提供一种组合物，其包含治疗有效量的根据本公开的适配子或治疗诊断剂，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一个实例中，所述组合物是药物组合物。

本文所描述适配子、治疗诊断剂或组合物可以被单独使用，或与其它治疗方式组合使用。例如，所述适配子或药物组合物可以与放射治疗或其它化疗剂组合使用。不希望受到理论的束缚，假定放射治疗和/或化疗剂主要通过靶向快速分裂的细胞而被用于减小肿瘤，所述快速分裂的细胞通常是癌症干细胞的子代细胞。本文所描述的所述适配子、治疗诊断剂或组合物可以被施用至肿瘤的位点，以特异性去除癌症干细胞。因此，本文所描述的适配子、治疗诊断剂或组合物可以与放射治疗或化疗一起使用，或者化疗或放射治疗的治疗之后使用。此外，如本文所描述的适配子、治疗诊断剂或组合物可以在肿瘤的手术切除后使用，以消除任何手术后保留的剩余癌症细胞。

在另一个实例中，所述适配子在脂质体的表面被提供。所述脂质体可以含有药物。合适的药物的实例包括化疗剂、免疫检查点抑制剂(例如PD-1)、抗生素、免疫球蛋白或抗体、类固醇、或者止痛药。

适配子或包含适配子的组合物可以通过本领域已知的方法向受试者施用。在一个实例中，所述适配子或组合物是肠胃外施用的，例如通过静脉内、肌肉内、皮下或局部注射。

还预期本文所描述的所述适配子、治疗诊断剂或组合物可以与一种或多种靶向存在于癌症干细胞的抗原的额外适配子联合。

应理解，本公开的每个实例加上必要的变更适用于治疗、预防或改善受试者中的癌症的方法。

附图说明

图1：预测DOX插入修饰的CD133适配子的示意图。(A)通过VIENNA软件确定的适配子的二级结构(左侧)，以及阿霉素的分子结构(右侧)。(B)代表由于药物对双链G-C配对的高亲和性，适配子和DOX间可能的插入。

图2：预测的DOX插入至CD133RNA-DNA杂交适配子的示意图。(A)通过VIENNA软件确定的适配子的二级结构(左侧)，以及阿霉素的分子结构(右侧)。(B)代表由于药物对双链G-C配对的高亲和性，适配子和DOX间可能的插入。

图3：确定荧光强度和DOX浓度之间的关系。使用多种浓度的DOX以测量荧光强度。数据显示平均值±SE，n＝3。

图4：在将DOX插入CD133适配子之后的荧光淬灭曲线。在缀合之后，纯化适配子-Dox缀合物。通过在495nm波长处UV的吸收，确定DOX的荧光。数据显示平均值±SE，n＝3。

图5：在PBS中DOX从缀合物释放持续3天。在透析盒中，吸光度(Y轴)与DOX荧光强度相关。强度越高，越多DOX从缀合物释放。数据显示平均值±SE，n＝3。

图6：在CD133阴性HEK2932和CD133阳性的HT29细胞中确定CD133适配子-Dox缀合物的解离常数。使用浓度范围0-200nM的荧光标记的CD133适配子和CD133适配子-Dox缀合物研究结合。(A)使用阳性CD133适配子-Dox缀合物处理的HEK293T细胞系，(B)使用阴性对照适配子-Dox缀合物处理的HEK2932，(C)使用阳性CD133适配子(未缀合)处理的HT29，以及(D)使用阳性CD133适配子-Dox缀合物处理的HT29细胞。数据显示平均值±SE，n＝3。

图7：使用CD133适配子确定CD133适配子-Dox缀合物的解离常数。(A)阳性CD133适配子-Dox缀合物，(B)阴性对照CD133适配子-Dox缀合物具有与阳性适配子相同的核酸序列，除了2’-O-甲基修饰替换了2’-氟代化学修饰，导致3-D结构的改变，破坏了对CD133的结合，以及(C)未缀合的阳性的CD133适配子。

图8：内化的DOX和适配子的共聚焦显微术。(A-C)阳性CD133HT29细胞系。(A)CD133适配子。(B)CD133适配子-Dox缀合物。(C)阴性对照适配子-Dox缀合物。(D)阴性对照细胞系HEK293T与CD133适配子-Dox缀合物孵育。(E)HT29细胞系与游离的DOX孵育。标尺＝20μm。

图9：共聚焦显微术评估DOX和适配子的内化的处理：(a)CD133适配子，(b)CD133适配子-Dox缀合物，以及(c)使用游离的DOX孵育的阴性对照。

图10：肿瘤球尺寸。对来自96孔板中的500个细胞的球进行测量。细胞在球对照介质、游离的DOX和适配体-Dox缀合物的条件下。可见相比对照，缀合物在全部三个浓度中降低球尺寸(P<0.0)，数据显示平均值±SE，n＝3。

图11：通过在不同的条件下，以不同的细胞浓度形成的球的数量测量球的形成。50个细胞1μM显示无变化，但是10个细胞的对照和缀合物的形成差异明显(P<0.01)。增加常规和新的药物的浓度，导致相比对照，缀合物更高的球形成的抑制(P<0.001)。当浓度增加至2μM时，该作用可以在50个细胞观察到(P<0.001)。在所有这些CD133适配子-Dox缀合物中，与游离的DOX相比，肿瘤球抑制具有显著差异(P<0.01)。

图12：使用6孔超低附着(ultralow attachment)板进行肿瘤球的可视化。

序列表要点

SEQ ID NO:1：是CD133适配子环区的核心核苷酸序列，其5’和3’端侧翼是一段交替的CG配对的核苷酸。

SEQ ID NO:2：是能够缀合DOX的CD133适配子的序列。

SEQ ID NO:3：是CD133适配子的环区核心核苷酸序列。

SEQ ID NO:4：是杂交RNA/DNA CD133适配子的序列，其5’和3’端侧翼是一段交替的CG核苷酸，并含有3’反向的dT。

SEQ ID NO:5：是杂交RNA/DNA CD133适配子的序列。

具体实施方式

通用技术和所选定义

术语“和/或”，例如“X和/或Y”，应理解为是指“X和Y”或者“X或Y”，并且应当理解为提供了对两种含义或其中的一种含义的明确支持。

本说明书中包括的任何文献、行为、材料、装置、物品等的论述不应理解为承认这些事物中的任一种或所有这些事物形成了现有技术基础的一部分，或者由于其出现于本申请的每项权利要求的优先权日期之前而成为本公开相关的领域中的公共常识。

在整个本说明书中，除非明确地另有所述，或者上下文另有要求，提及单个步骤、物质组合物、步骤组合或者物质组合物的组合应当理解为包括这些步骤、物质组合物、步骤组合或者物质组合物的组合中的一项和多项(即，一项或更多项)。

除非明确另有所述，本文中描述的每个实例加以必要的修改适用于本公开中的各个和每个其它实例。

本领域技术人员理解本公开易于进行除明确描述的那些以外的改变和修改。应理解，本公开包括所有这样的改变和修改。本公开还包括本说明书中单独或共同提及或指出的步骤、特征、组合物和化合物的全部，以及所述步骤或特征的任何和全部组合或者任何两项或更多项。

本公开并不限于本文中描述的具体实例的范围，这些具体实例仅旨在示例的目的。功能等同的产品、组合物和方法显然位于本公开的范围中。

不需要过多的实验，除非另有所示，使用分子生物学、重组DNA技术、细胞生物学和免疫学的常规技术即可实施本公开。此类方案描述于，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,纽约,第二版(1989),第I、II和III卷全卷；DNA Cloning:A Practical Approach,第I和II卷(D.N.Glover,ed.,1985),IRL Press,牛津,整篇文档；Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach(M.J.Gait,ed,1984)IRL Press,Oxford,整篇文档,且尤其是其中的Gait的文章,ppl-22；Atkinson等人,pp35-81；Sproat等人,pp 83-115；以及Wu等人,pp135-151；4.Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.,1985)IRL Press,牛津,整篇文档；Immobilized Cells and Enzymes:APractical Approach(1986)IRL Press,牛津,整篇文档；Perbal,B.,A Practical Guideto Molecular Cloning(1984)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan,eds.,Academic Press,Inc.),整系列,Sakakibara,D.,Teichman,J.,Lien,E.Land Fenichel,R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73 336-342；Merrifield,R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154；Barany,G.和Merrifield,R.B.(1979)in The Peptides(Gross,E.和Meienhofer,J.eds.),vol.2,pp.1-284,Academic Press,纽约.12.Wünsch,E.,ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der OrganischenChemie(Müler,E.,ed.),vol.15,第4版，第1和2部分,Thieme,Stuttgart；Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,海德尔堡；Bodanszky,M.&Bodanszky,A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,海德尔堡；Bodanszky,M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25,449-474；Handbook ofExperimental Immunology,I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.,1986,BlackwellScientific Publications)；以及Animal Cell Culture:Practical Approach,第三版(John R.W.Masters,ed.,2000),ISBN 0199637970,整篇文档。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含”或者变型如“包括”或“含有”应理解为意指包括所述的步骤或元件或整数，或者步骤或元件或整数的组，但不排除任何其它的步骤或元件或整数，或者元件或整数的组。

术语“由…组成”应理解为意指方法、过程或物质的组合物(例如适配子序列)具有所述的步骤和/或组分，并且没有其它的步骤或组分。

在本文中用于核酸序列的情况中，术语“基本上由…组成”是非穷尽地解释，并且理解为意指核苷酸序列中存在额外的核苷酸碱基，其中所述额外的碱基构成不超过总核苷酸序列的约10％。

如本文所用，术语“约”在涉及可测量的值如重量、时间、剂量等的量时，是指包括与指定量的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，并且甚至更优选±0.1％的差异。

如本文所用的术语“适配子”或“寡核苷酸适配子”一般是指单个定义的序列的寡核苷酸，或者所述寡核苷酸的混合物，其中所述混合物保留了对CD133的特异性结合。如本文所用，“适配子”是指单链核酸。在结构上，本公开的适配子为特异性结合性寡核苷酸。适配子可包含RNA、DNA或RNA和DNA二者。适配子可以是使用领域公知的方法合成生产的。可选地，适配子可以是重组生产的。

如本文所用的术语“寡核苷酸”通用于多脱氧核糖核苷酸(含有2’-脱氧-D-核糖或其经修饰的形式)，即DNA；多核糖核苷酸(含有D核糖或其经修饰的形式)，即RNA；以及任何其它类型的多核苷酸，其为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷，或者经修饰的嘌呤或嘧啶碱基或无碱基核苷酸。根据本公开的内容，术语“寡核苷酸”不仅包括具有常规碱基、糖残基和核苷酸间连接的那些，还包括包含这3种半簇中任何一种或所有的修饰的那些。

如本文所用的术语“CG配对的核苷酸”理解为指当存在于双链结构时，互补的C和G核苷酸碱基配对。例如，单个CG配对的核苷酸对应于在一条链上的C与互补链上的G碱基配对。4个CG配对的核苷酸指这样一种结构，其中在一条链的线性序列中存在CGCG或GCGC，并且与互补链上的互补序列GCGC或CGCG碱基配对。

如本文所用的“术语CpG位点”理解为指在碱基线性序列中，沿其长度胞嘧啶核苷酸出现在鸟嘌呤核苷酸旁边的DNA区。术语CpG是C-磷酸-G的简称，即，胞嘧啶和鸟嘌呤仅被一个磷酸分开。符号CpG用于区分线性序列与CG碱基配对的胞嘧啶和鸟嘌呤。

如本文所用的术语“RNA-DNA杂交适配子”是一种包含核糖核苷单元和脱氧核糖核苷单元或碱基的适配子。

如本文所用的术语“嘧啶”指胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基。胸腺嘧啶(T)通常在DNA中发现，但不出现在RNA中。胞嘧啶在RNA和DNA中发现，并且尿嘧啶通常在RNA中发现，但不出现在DNA中。

如本文所用，术语“结合亲和性”意指适配子结合或不结合靶标的倾向，并且描述了适配子结合靶标的结合强度或亲和性的测量。所述相互作用的能量学在“结合亲和性”上是有意义的，因为其确定了相互作用伴侣的必要浓度、这些伴侣能够结合的速率，以及溶液中结合和游离分子的相对浓度。所述能量学在本文中尤其是通过确定解离常数K_d来表征的。如本领域所已知的，低的解离常数指示分子彼此间的较强的结合和亲和性。

如本文中所用，术语“生物样品”是指来自受试者的细胞或细胞群或一定量的组织或流体。最经常情况下，所述样品已被从受试者移除，但术语“生物样品”也可指体内分析的细胞或组织，即未从受试者移除的细胞或组织。通常，“生物样品”包含来自受试者的细胞。在本公开中“生物样品”将包括表达CD133的细胞。生物样品包括但不限于组织活检、穿刺活检、刮擦物(例如，口腔刮擦物)、全血、血浆、血清、淋巴、骨髓、尿液、唾液、痰、细胞培养物、胸膜液、心包液、腹水或脑脊液。生物样品还包括组织活检和细胞培养物。生物样品或组织样品可指分离自个体的组织或流体样品，包括但不限于，例如，血液、血浆、血清、肿瘤活检、尿液、粪便、痰、脊髓液、胸膜液、乳头吸液、淋巴液、皮肤的外部部分、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、奶、细胞(包括但不限于血细胞)、肿瘤、器官，以及体外细胞培养物组分样品。在一些实施方案中，样品来自原发性或转移性肿瘤的切除术、支气管镜活检或芯针活检，或者来自胸膜液的单元块(cellblock)。另外，可使用细针吸入样品。样品可为石蜡包埋的或冷冻的组织。可通过从受试者去除细胞样品获得样品。

给予术语“足以允许将至少一种半簇附着至其上”广义的解释。该术语包括直接的附着或连接、或者非直接的附着或连接(例如共价键或静电相互作用)、或者可逆的内含或嵌入(insertion)(比如插入)。在另一个实例中，所述附着是通过缀合或通过使用接头进行的。

如本文所用的术语“偶联至”旨在包括适配子借以与本文所描述的3’或5’端试剂(例如invdT)或与本文所描述的半簇连接、附着或结合的任何结构。

术语“具有实质上相同能力”理解为指适配子能够竞争性地抑制本公开的适配子与CD133上表位的结合。用于确定是否适配子能够竞争性地抑制本公开的适配子与CD133的结合的方法可包括本领域已知的竞争性结合测定。

如本文所用的术语“分离的”意指可从其它组分或化学品纯化的适配子，所述组分或化学品可以存在于产生和纯化适配子的过程中(例如使用SELEX方法)。在细胞的情况中，该术语还指从细胞可能天然存在的环境中的其它组分中可分离的或纯化细胞。分离的细胞可被纯化至相对于其可天然获取的状态的任何程度。

术语“免疫球蛋白片段”可以与“抗原结合片段”交换使用，并且理解为指完整抗体的一种或多种可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用，术语“治疗有效量”应理解为指足够量的用于减少表达CD133的癌症干细胞的数目和/或癌症的一种或多种症状的根据本公开的适配子或药物组合物。技术人员理解这样的量将根据例如具体受试者和/或疾病的类型或严重性或水平而改变。该术语不应理解为将本公开限定于特定量的适配子。

如本文所用，术语“治疗”应理解为指施用治疗有效量的如本文所公开的适配子或药物组合物，并减轻与癌症相关的或由癌症引起的临床病况的至少一种症状。

如本文所用，术语“特异性结合”应理解为指，相较于适配子与替代细胞或物质的反应或结合，适配子与特定细胞或物质反应或结合得更为频繁、更为快速、持续时间更长和/或亲和性更大。例如，相比适配子结合不相关的蛋白和/或表位或其免疫原性片段，特异性结合靶标蛋白的适配子以更大的亲和性、亲合力(avidity)、更快速地和/或以更长的持续时间结合该蛋白或表位或其免疫原性片段。通过阅读本定义，还应理解，例如，特异性结合第一靶标的适配子可以或可以不特异性结合第二靶标。由此，“特异性结合”未必需要排斥结合或不可检测地结合另一靶标，这包括在术语“选择性结合”中。通常，但非必然地，提及结合时，是指特异性结合。根据相比适配子和环境中的其它物质或总体上的非相关分子的解离常数，适配子对靶标的比较解离常数(Kd)来定义结合的特异性。通常适配子对于靶标的Kd比靶标和不相关物质或环境中的伴随物质的Kd小2倍、5倍或10倍。甚至更优选地，Kd为小50倍、100倍或200倍。

术语“选择性结合”应理解为指适配子与标记物或在细胞上表达的抗原排斥结合或不可检测地结合，其中所述标记物或抗原不是CD133。

如本文所用的术语“CD133⁺”或“表达CD133的细胞”可互换使用。该术语包括可通过任何合适的方式检测的细胞表面表达的CD133抗原。在一个实例中，提及细胞对于给定标记物为阳性是指其可为该标记物的低(lo或暗)或高(亮，bri)表达者，这取决于该标记物在细胞表面上存在的程度，其中所述术语涉及荧光强度。

如本文所使用的，术语“治疗诊断”或“治疗诊断剂”理解为指并有诊断和治疗功能的适配子。这种实体可以同时用于靶向药物递送和释放以及诊断，所述诊断包括监测疾病进程和对治疗的反应。更具体地，根据本公开的治疗诊断剂是一种化疗分子，例如阿霉素被缀合至适配子从而形成的适配子-Dox缀合物。术语“适配子-Dox缀合物”理解为指如图1中所示的一个或多个阿霉素分子被插入在适配子茎序列的本公开的CD133适配子。

如本文所用，术语“受试者”应理解为指任何受试者，包括人或非人受试者。非人受试者可包括非人的灵长、有蹄(牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和美洲野牛)、犬、猫科动物、兔(家兔、野兔和鼠兔)、啮齿(小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠)、鸟和鱼。在一个实例中，受试者为人。

适配子

适配子的几种独特的特性使得它们成为用于大量的分子生物学应用和用作潜在的药剂的有吸引力的工具。首先，大多数适配子以高亲和性结合靶标，显示皮摩尔至纳摩尔范围内的典型的解离常数。适配子的结合位点包括靶标分子的裂缝和凹槽，引起与许多当前可用的药剂非常类似的拮抗活性。第二，适配子的结构在广泛的温度和储存条件范围内是稳定的，保持了形成其独特的三级结构的能力。第三，适配子可被化学合成，这与制备单克隆抗体所需的昂贵的和劳动密集的生物系统形成对比。

不希望受到理论的束缚，由于RNA适配子对其靶标蛋白的理论上较高的亲和性以及修饰的RNA比未修饰的RNA更大的血浆稳定性，RNA适配子通常是许多研究小组优选的。

本文公开了能特异性结合CD133抗原的适配子分子，其可用于在细胞内有效递送试剂，比如治疗癌症的化疗分子。本公开的这种适配子分子特别用作治疗剂、诊断剂和治疗诊断剂。

适配子为单链的寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其结合特定的靶标分子如蛋白或小分子。因此，适配子是抗体的寡核苷酸类似物。通常，适配子包含约15至约100个核苷酸，优选约15至约40个核苷酸，并且更优选约20至约40个核苷酸，其中长度落入这些范围中的寡核苷酸可通过常规技术进行制备。

适配子结合高度依赖于适配子寡核苷酸形成的二级结构。RNA和单链DNA(或类似物)适配子是已知的。参见，例如Burke等人(1996).J.Mol.Biol.264:650-666；Ellington和Szostak(1990).Nature 346:818-22；Hirao等人(1998).Mol Divers.4:75-89；Jaeger等人(1998).EMBO Journal 17:4535；Kensch等人(2000).J.Biol.Chem 275:18271-8；Schneider等人(1995).Biochemistry 34:9599-9610；以及US 5773598、US6028186、US6110900、US6127119和US 6171795。

本公开的适配子包括杂交RNA/DNA适配子，其中适配子的结合(即，环)区是RNA，茎区是DNA。不希望受到理论的束缚，认为DNA茎区提供了分子比如阿霉素插入的位点，因为分子对双链DNA CG配对的高亲和性。

适配子的产生

本领域技术人员熟知用于制备根据本公开的适配子的多种方法。指数富集的配基系统进化“SELEX^TM”是一种用于针对任何期望的靶标制备核酸配体的方法，如，例如在U.S.5,475,096和5,270,163、以及PCT/US91/04078中描述的，其每一个通过参考特别并入本文。

SELEX^TM技术基于这样的事实，即核酸具有足够的形成多种二维和三维结构的能力，以及在其单体中适用的充当几乎任何化合物(不管是大还是小尺寸)的配体(即，形成特异性结合对)的足够的化学多样性。

该方法包括使用相同的通用选择方案，从候选物的混合物选择，并逐步迭代结构改进，以达到几乎任何所期望的结合亲和性和选择性的标准。从核酸的混合物开始，优选包含随机化序列片段，SELEX^TM方法包括在有利于结合的条件下将混合物与靶标接触、将未结合的核酸与那些结合靶标分子的核酸分离、使核酸-靶标对解离、扩增从核酸-靶标对解离的核酸以获得配体富集的核酸混合物的步骤，然后通过所需的多个循环中重复结合、分离、解离和扩增的步骤。

在含有大量的可能的序列和结构的核酸混合物中，存在对于给定的靶标的大范围的结合亲和性。例如，核酸混合物包含20个核苷酸的随机化片段，其具有4²⁰个候选的可能性。对靶标具有更高的亲和性常数的那些最有可能结合到靶标。在分离、解离和扩增之后，产生第二核酸混合物，对更高结合亲和性候选物富集。额外轮的偏向最佳配体的渐进选择，直至得到的核酸混合物主要由仅一个或一些序列组成。然后将这些进行克隆、测序并单独测试对纯配体的结合亲和性。

重复选择和扩增的循环，直至获得期望的目标。在最通常的情况中，持续选择/扩增直至在重复循环中不再获得结合强度的显著提高。该方法可以被用于多达约10¹⁸种不同的核酸种类的样品。测试混合物的核酸优选包括随机化序列部分以及用于有效扩增必要的保守序列。核酸序列变体可以以多种方式生产，包括随机化核酸序列的合成，以及从随机化裂解的细胞核酸中进行尺寸选择。可变序列部分完全含有或部分含有随机序列；它还可以含有与随机化序列合并的保守序列的子部分。在选择/扩增迭代之前或期间，通过突变可以引入或增加在测试核酸中的序列变异性。

如在Shigdar S等人(2013)Cancer Letters 330:84-95中描述的，在选择期间适配子候选物的富集可以使用限制性片段长度多态性(RFLP)和流式细胞术监测。

适配子的结合亲和性

结合亲和性描述了分子彼此的结合强度或亲和性的测量。本文中的适配子对于靶标和其它分子的结合亲和性根据Kd进行定义。可通过本领域已知的方法确定解离常数，并且甚至对于复杂的混合物，可通过诸如Caceci,M.,等人,Byte(1984)9:340-362中描述的那些方法计算解离常数。测量解离常数的实例描述于例如US7602495，其描述了表面等离子体共振分析，以及在US 6562627和US 2012/00445849中。在另一个实例中，使用诸如Wong和Lohman,(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5428-5432公开的双过滤硝酸纤维素过滤器结合测定确认Kd。确定适配子的结合亲和性的方法还在例如Stoltenburg R等人(2005)Anal Bioanal Chem 383:83-91、Tran DT等人(2010)Molecules 15,1127-1140和Cho M等人(2013)PNAS 110(46):18460-18465中描述。

然而，观察到对于一些小寡核苷酸，难以直接确定Kd，并且可能造成高的误导性结果。在这些情况下，用已知能结合靶标或候选物的物质进行针对靶标分子或其它候选物质的竞争性结合测定。在理想情况下，发生50％抑制时的浓度值(Ki)等于Kd。然而，在任何情况Ki都不会小于Kd。因此，替代性地，Ki的测定为Kd的值设定了最大值。在技术困难阻碍Kd的精确测量的那些情况下，可方便地替换Ki测量来提供Kd的上限。Ki值也可用于确认本公开的适配子结合CD133。

改进适配子稳定性

在使用核酸作为治疗剂中遇到的一个潜在的问题在于，在显示期望的效果前，寡核苷酸以其磷酸二酯形式在体液中可被诸如内切酶和外切酶的细胞内酶和细胞外酶快速降解。本公开还包括如本文所述的类似物和/或经设计用于改进适配子的一种或多种特性比如保护免被核酶消化的额外修饰。

本公开中预期的寡核苷酸适配子修饰包括但不限于，提供了其它化学基团的那些，所述其它化学基团向核酸配体碱基或核酸配体整体并入额外的电荷、极性、疏水性、氢键、静电相互作用和流变性。

用于产生耐受核酶的寡核苷酸适配子的修饰还可包括一种或多种取代的核苷酸间连接、改变的糖、改变的碱基或其组合。此类修饰包括2’-位置的糖修饰、5-位置的嘧啶修饰、8-位置的嘌呤修饰、环外胺的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修饰、甲基化和不常见的碱基配对组合如异碱基异胞苷和异鸟苷；3’和5’修饰如加帽；缀合至高分子量、非免疫原性化合物；缀合至亲脂性化合物；以及磷酸酯骨架修饰。

在一个实例中，与本公开的适配子缀合的非免疫原性的高分子量化合物为聚烷二醇，优选聚乙二醇。在一个实例中，骨架修饰包括并入一个或多个硫代磷酸酯至磷酸骨架中。在另一个实例中，本公开的适配子包含并入少于10个、少于6个或少于3个硫代磷酸酯至磷酸骨架中。

在适当情况下，额外的修饰可以包括以下的至少一种：2’-脱氧、2’-卤代(包括2’-氟代)、2’-氨基(优选非取代的或单取代或二取代)、2’-单-、二-或三-卤代甲基、2’-O-烷基、2’-O-卤代-取代烷基、2’-烷基、叠氮基、硫代磷酸酯、硫氢基、甲基膦酸酯、荧光素、罗丹明、芘、生物素、黄嘌呤、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-羟基-6-巯嘌呤、以及在6-位置硫取代的嘧啶碱基、或在5位置卤代或C15烷基基团取代的嘧啶碱基、非碱基接头、3’-脱氧腺苷以及其它可用的“链终止子”或“不可延伸”类似物(在RNA的3’端)、或者比如32P、33P等标记。前述的所有可以使用本文公开的标准合成技术并入到适配子。

适配子的利用

本公开的适配子分子可用作分离和纯化靶标分子(例如，携带CD133的癌症干细胞)的亲和配体；追踪、监测、检测和定量靶标分子(例如，携带CD133的癌症干细胞)的探针，或者封闭、允许、激活或催化在生理上与实现治疗效果有关的反应的探针。它们可用作药剂，结合特定靶标以及将特定分子导向期望位点。

本公开的适配子分子可用于体外过程，例如用于纯化靶标分子(例如，携带CD133的癌症干细胞)的亲和纯化混合物。适配子对于从污染物中色谱分离靶标分子(例如，携带CD133的癌症干细胞)和从细胞培养物或细胞提取物中纯化靶标分子是理想的。

在一个实例中，本公开的适配子分子可用作将靶标(例如，携带CD133的癌症干细胞)结合或固定至固相支持物的捕获试剂。固相支持物可由具有通常与过滤器、晶圆、晶圆芯片、膜和薄膜有关的结构和组合物的基底组成。然而，预期固相支持物可由这样的基底组成，其包括但不限于树脂、亲和树脂、磁珠或聚合物珠子或用于捕获或固定用于诊断、检测或定量研究的试剂的任何诊断性检测剂。

固相支持物可基于期望的用途包含任何材料，包括但不限于：玻璃、金属表面，以及诸如钢材、陶瓷材料或聚合物材料如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺和聚偏二氟乙烯等的材料，或以上的组合。

CD133抗原

CD133最初称为AC133，是一种糖蛋白(也称为Prominin 1)。其为特异性定位至细胞突起的5次跨膜的跨膜糖蛋白的一个成员。CD133表达于造血干细胞、内皮祖细胞、恶性胶质瘤、神经元和神经胶质干细胞、龋源性儿科脑瘤，以及成人肾脏、乳腺、气管、唾液腺、胎盘、消化道、睾丸和其它细胞类型中。

结合表达CD133的癌症干细胞

通过干细胞分化更新成体细胞的最熟知的实例是造血系统。发育上未成熟的前体细胞如造血干细胞和祖细胞响应分子信号，以逐渐形成不同的血液和淋巴细胞类型。干细胞也存在于其它组织中，包括上皮组织和间质组织。癌症干细胞可起源于这些细胞类型中的任何一种，例如，由于正常干细胞中的遗传损伤或通过干细胞和/或分化细胞的异常调节的增殖而产生。

癌症干细胞可来源于包含致瘤干细胞的任何癌症，所述致瘤干细胞即具有广泛或无限增殖能力的细胞，并且产生了大多数的癌细胞。在确立的肿瘤中，大多数细胞已丢失了广泛增殖和形成新的肿瘤的能力，并且小部分的癌症干细胞增殖从而再生癌症干细胞，以及产生缺少致瘤潜力的肿瘤细胞。癌症干细胞可不对称地和对称地分裂，并且可显示变化的增殖速率。癌症干细胞可包括已重新获得了干细胞性能的瞬时性扩增的细胞或祖细胞。

可从中分离干细胞的代表性癌症包括特征为实体瘤的癌症，包括例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm’s tumor)、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

可根据本公开从中分离或富集干细胞的额外的代表性癌症包括造血性恶性肿瘤，如B细胞淋巴瘤和白血病，包括低级/滤泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡NHL、中级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级小非切割的细胞NHL、巨大肿块性疾病(bulky disease)NHL和华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia)、慢性白细胞性白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、成淋巴细胞性白血病(lymphoblastic leukemia)、淋巴细胞性白血病、单核细胞性白血病、髓系白血病和前髓系白血病。

可使用本文所述的适配子分子选择携带CD133的癌症干细胞。例如，与荧光染料偶联的适配子可用于主动选择癌症干细胞。还已知CD133在一些正常细胞中表达。然而，认为在癌症干细胞中，CD133表达上调。癌症干细胞标记物通常以这样的水平表达，即比相同来源的分化细胞或非致瘤细胞高至少约5倍，例如，高至少约10倍，或高至少约15倍，或高至少约20倍，或高至少约50倍，或高至少约100倍。选择过程还可包括阴性选择标记物，用于排除非癌症干细胞群中的那些癌细胞。

应理解在实施本公开时，可通过多种不同的方法分离携带CD133的细胞。例如，可将本公开的适配子附着于固相支持物以允许粗分离。可根据分离效率、相关的细胞毒性、实施的容易程度和速率以及所需的高级设备和/或专业技能，采用具有不同效率的不同技术。用于分离或纯化的方法可包括但不限于，使用包被适配子的磁珠的磁力分离、亲和色谱和用附着至固体基质的适配子进行的“淘选(panning)”。提供精确分离或纯化的技术包括但不限于FACS。准备FACS的方法对技术人员是显而易见的。

表达CD133的癌症干细胞的富集

本公开的适配子可用于从获自受试者的生物样品富集癌症干细胞。通常，所述受试者为患有肿瘤或疑似患有肿瘤的受试者，所述肿瘤含有癌症干细胞。本文中所用的术语“富集的”或“富集”或其变型描述这样的细胞群，即其中当相比未处理的细胞群(例如，样品中的细胞)时，一种特定细胞类型(即，癌症干细胞)的比例增加。

在一个实例中，针对癌症干细胞富集的群包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％、80％、或85％、或90％、或95％的携带CD133(阳性)的癌症干细胞。就此而言，术语“包含癌症干细胞的富集的细胞群”应理解为给术语“包含X％的癌症干细胞的细胞群”提供了明确的支持，其中X％为本文所述的百分比。

在一个实例中，从可选择形式的包含CD133+细胞的细胞制剂中富集细胞群。就此而言，术语“可选择形式”应理解为是指细胞表达允许选择携带CD133的细胞的标记物(例如，细胞表面标记物)。

使用适配子分子对癌症的诊断/检测

本公开的适配子可用于体外诊断和/或检测目的，以确定恶性组织中的癌症干细胞的存在。所述方法包括检测生物样品中CD133+癌症干细胞的存在。例如，可将生物样品与本公开的标记的适配子或本公开的适配子-Dox接触，并测定适配子特异性结合样品中的细胞的能力。结合指示携带CD133的癌症干细胞的存在。本公开的适配子也可用于通过向受试者施用本公开的适配子(其标记有能产生可检测信号的报告基团)来体内定位肿瘤。可选地，或额外地，由于阿霉素具有固有的荧光活性(尤其在远红外波长)，该特征可被开发用于诊断。然后，可使用流式细胞术、显微术、外部闪烁扫描术、发射断层扫描、光学成像或放射核扫描(radionuclear scanning)检测结合的适配子。所述方法可用于在受试者中根据疾病的程度给癌症分级和监测对治疗响应的变化。

可通过将适配子与可检测标记偶联来促进癌症干细胞的检测。可检测标记的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、电子致密标记、MRI标记和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。合适的荧光物质的实例包括伞形酮(umbellifone)、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯代三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光物质的实例包括鲁米诺。生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素和水母素，并且合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S、18F、64Cu、94mTc、124I、11C、13N、15O、68Ga、86Y、82Rb或3H。

可通过例如使用Klenow聚合酶的模板延伸，通过T4连接酶介导的连接和末端脱氧核苷酰转移酶来实现适配子的3’端标记。可通过以过量的GTP-β-S补充体外转录混合物来实现5’端标记，然后可将其硫醇用于附着生物素。另外，将合适的基团直接化学缀合至5’端或3’端可用于标记适配子。

适配子在癌症治疗和治疗诊断中的用途

可将本公开的适配子偶联至半簇，并用于将所述半簇导向CD133+细胞，优选癌症干细胞。半簇的实例包括可用于杀死癌症干细胞的毒素、放射性核素或化疗剂。

可通过化学合成的半簇和适配子、或通过缀合方式例如用于连接分别制备的适配子和所述半簇的非肽共价键(例如非酰胺键)，将适配子融合至半簇，例如毒素。可选地，可通过合适的接头肽连接所述适配子和半簇。

可用的毒素分子包括肽毒素，当存在于细胞中时具有显著的细胞毒性。毒素的实例包括细胞毒素、破坏酶活性并从而杀死癌症干细胞的代谢干扰物(抑制剂和活化剂)，以及能杀死具有确定半径的效应子部分的所有细胞的放射性分子。代谢干扰物是能改变细胞代谢而使得正常功能被改变的分子，例如，酶或细胞因子。在广义上，术语毒素包括任何造成肿瘤细胞死亡的效应子。

许多肽毒素具有广泛性的真核受体结合结构域；在这些情况下，必须对毒素进行修饰以防止杀死不携带CD133的细胞(例如，防止杀死不携带CD133但具有未修饰的毒素的受体的细胞)。必须以保存所述分子的细胞毒性功能的方式进行这样的修饰。可能有用的毒素包括但不限于：白喉毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素、0-志贺样毒素(SLT-I、SLT-II、SLT-IIV)、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、假单胞菌外毒素、alorin、皂素、莫迪素(modeccin)和白树毒素(gelanin)。其它毒素包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和淋巴毒素(LT)。具有抗肿瘤活性的另一种毒素为卡里奇霉素γ1，其为包含具有针对肿瘤的相当大的效力的抗肿瘤抗生素的二炔-烯(Zein N等人(1988).Science 240:1198-201)。

例如，可将白喉毒素(其序列是已知的)缀合至本公开的适配子。由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diptheriae)分泌的天然的白喉毒素分子由几个功能域组成，以分子的氨基末端起始，所述功能域可表征为具有酶促活性的片段A(AA 1-193)和片段B(AA 194-535)，所述片段B包括异位结构域和广义的细胞结合域(AA 475-535)。

可以本领域技术人员已知的几种方式中的任一种连接适配子和毒素半簇。例如，将适配子缀合至毒素(白树毒素)的方法描述于Chu TC等人.(2006)Cancer Res 6(12)5989-5992中。

所述半簇也可以是在局部水平激活或抑制身体的免疫系统的免疫系统调节物。例如，递送至肿瘤的细胞因子，例如淋巴因子如IL-2，可引起细胞毒性T-淋巴细胞或自然杀伤细胞在肿瘤附近增殖。

半簇或报告基团也可为放射性分子，例如，放射性核素或所谓的敏化剂，例如，在特定条件下变得具有放射性的前体分子，例如，在所谓的“硼中子俘获治疗”(BNCT)中，暴露于低能中子束的硼，所述治疗在Barth等人(1990).Scientific American Oct 1990:100-107中有描述。可使用具有此类放射性效应子部分的化合物来抑制肿瘤中的癌症干细胞增殖和标记癌症干细胞用于成像目的。

放射性核素为可发射α、β或γ粒子的单原子放射性分子。α粒子发射体优于β或γ粒子发射体，因为它们在较短的距离释放高得多的能量辐射，并因此是有效的，而不会显著地穿透和损伤正常组织。发射放射性核素的合适的α粒子包括211At、212Pb和212Bi。

放射性分子可以直接或通过双官能螯合剂与适配子紧密连接。该螯合剂不允许洗脱，并因此过早在体内释放放射性分子。Waldmann,Science,252:1657-62(1991)。例如，为了使BNCT适用于本发明，可将硼的稳定同位素，例如硼10，选为化合物的抗肿瘤半簇或效应子部分。通过适配子与癌症干细胞的特异性结合，硼将会被递送和浓缩至肿瘤细胞中或肿瘤细胞上。在允许积累足够量的硼的时间后，可以具有约0.025eV的能量的低能中子束对肿瘤进行成像和辐照。虽然该中子辐照自身对肿瘤周围的健康组织或肿瘤自身造成很少的损伤，硼10(例如，在肿瘤细胞的表面上)会捕获中子，从而形成不稳定同位素硼11。硼11立即裂变产生锂7核子和高能α粒子，约279万Ev。这些重粒子是高度致命的，但在很小范围内形成辐射，因为粒子具有仅约一个细胞直径(10微米)的光程长。

可以附着至本公开的适配子的合适的化疗剂可以选自：阿霉素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔毛霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1去氢睾酮(1de-hydrotestosterone)、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素、抗代谢物(比如氨甲叶酸、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉宾、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine)、羟基脲、门冬酰胺酶、吉西他滨、克拉屈滨)、烷化剂(比如氮芥、嗥替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、达卡巴嗪(DTIC)、甲基苄肼、丝裂霉素C、顺铂和其它铂衍生物，比如卡波铂)、抗生素(比如更生霉素(以前的放线菌素)、博来霉素、柔毛霉素(以前的道诺霉素)、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、氨茴霉素(AMC))。

可选地，所述半簇是能够插入适配子茎区序列的化疗分子或其它分子。例如，所述化疗分子是阿霉素，该分子能够插入适配子茎的DNA中的CpG位点。化疗剂比如阿霉素是固有荧光的，这使得使用多种成像技术便于探查和可视化它们的位置。治疗和成像能力相结合于DOX分子中，这使得它适合用作治疗诊断剂。因此，本公开的适配子可以用作治疗诊断剂，以递送阿霉素至癌症干细胞。为了增加水性溶解度，在阿霉素中的糖的氨基基团可以通过形成DOX氢氯化物而质子化。

能够插入至本公开的适配子的半簇包括：阿霉素、亚德里亚霉素、黄连素、原黄素、米托蒽醌、柔毛霉素、沙利度胺、更生霉素、达诺霉素、放线菌素D、9-氨基吖啶、氨柔比星、安吖啶、蒽环霉素、小檗因、博来霉素、elliplicine、表柔比星、伊达比星、methpyrillo、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、米托蒽醌、吡柔比星、匹克生琼、普卡霉素、普罗黄素、灵菌红素、沙利度胺、voreloxin、戊柔比星、佐柔比星、扑尔敏、prodisiosin、methapyrillino、丝裂霉素、偏端霉素、dantinomycin、偏端霉素、卡波铂、顺铂和其它铂衍生物、Hoechst 33258、berenil、DAPI、或致癌剂(包括黄曲霉素B1的exo 8,9环氧化物、吖啶比如普罗黄素或奎纳克林或溴化乙锭)。其它GC插入剂是本发明所属领域技术人员熟知的，并且被纳入本公开的范围。

本公开的适配子也可用于将siRNA、核酶或DNA酶递送至细胞中。

合适的siRNA、核酶或治疗剂的实例取决于环境。适合根据本公开使用的siRNA或核酶的实例包括靶向ATP结合盒式膜转运蛋白、多能性基因(Bmi-1、Notch 1、Sox 2、Oct-4、Nanog、β-连环蛋白、Smo、巣蛋白、ABCG2、Wnt2和SCF等)、GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)和生存素的那些。

例如，这已在现有技术中使用抗PSMA适配子进行了证明。基于对PSMA通过网格蛋白有被小窝内化至核内体的了解，假定抗PSMA适配子将运载所附着的siRNA至表达PSMA的细胞，并且与PSMA蛋白结合的适配子-siRNA将通过内化进入细胞。接着，siRNA部分将接受Dicer复合物的处理，并送入至RNA诱导沉默复合物(RISC)介导的基因沉默通路。3个研究小组已使用不同的策略来完成这一过程。Chu等人(2006)Nucleic Acids Res 34,e73描述了用于组装抗PSMA适配子和siRNA的生物素-链霉亲和素桥联介导的缀合方法。McNamara等人.(2006)Nat Biotechnol 24,1005-1015使用“仅RNA”的适配子-siRNA嵌合方法来连接适配子和siRNA。在随后的Wullner等人(2008).Curr.Cancer Drug Targets 8:554-565的研究中，作者使用抗PSMA适配子来递送真核延长因子2(EEF2)siRNA至PSMA阳性的前列腺癌细胞，二价的PSMA适配子被用于该目的。作者证明，相比单价的抗PSMA-siRNA嵌合体，二价适配子构建物的基因敲低效力较优。

本公开的适配子也可用于递送货运物至多种实体瘤中的CD133⁺癌症干细胞。白树毒素是能抑制蛋白合成过程并且具有细胞毒性的核糖体毒素。然而，其不能透膜，并且需要引导物用于其进入细胞。因此，可使用本公开的适配子来递送不能透膜的毒素荷载至癌症干细胞。在另一个实施方案中，本发明的适配子能够用于递送阿霉素(DOX)，所述阿霉素是一种DNA插入化疗剂，其本身不能靶向癌症干细胞、靶向CD133⁺癌症干细胞。

耐细胞毒性化疗剂的肿瘤，部分是由于至癌细胞的递送不足和癌细胞摄取不足，并且更重要的是癌细胞的流出。来源于聚(D,L-乳酸-乙醇酸共聚物)PLGA的可生物降解的纳米粒子(NP)被用于解决这一问题，如Dhar等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:17356-17361中所述。简而言之，通过引入两个烷基链将顺铂转化为其前药Pt(IV)化合物。这增加了化合物的疏水性，且简化了将其包装在NP的疏水核中的过程。聚乙二醇(PEG)被用作合成PLGA-PEG纳米粒子的纳米沉淀步骤中的共聚物。以PSMA(前列腺特异性膜抗原)适配子修饰PLGA-PEG-NP表面。当以LNCaP细胞孵育时，NP经历内吞作用，且烷基化的前药通过细胞质还原过程被转化为顺铂。

本公开还延伸至使用适配子分子同时作为药物递送剂和成像剂(治疗诊断)。这可通过将适配子缀合至荧光量子点(QD)的表面来实现。接着，用Dox孵育QD-适配子缀合物以形成QD-适配子-Dox纳米粒子。Dox和QD均为荧光分子。然而，由于它们在QD-适配子-Dox纳米粒子中相互靠近，它们通过双荧光共振能量转移(FRET)机制淬灭彼此的荧光。因此，QD-适配子-Dox纳米粒子是非荧光的。然而，通过前列腺癌细胞中PSMA介导的内吞作用而进行的QD-适配子-Dox纳米粒子的内化造成Dox从QD-适配子-Dox纳米粒子释放，其引起Dox和QD的荧光的恢复。

药物组合物

在本公开还提供了一种药物组合物，其包含本文所描述的适配子、诊断剂或治疗诊断剂。本公开的药物组合物包括制备用于存储或施用的组合物，包括在药学上可接受的载体和/或赋形剂中的药学上有效量的适配子。根据用于施用的途径和装置进行组合物的赋形剂或其它成分的选择。

术语“载体”和“赋形剂”是指本领域中常规使用的用于促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质组合物(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,16版.,Mac Publishing Company(1980)。载体也可降低活性化合物的任何不需要的副作用。合适的载体为，例如稳定的，例如，不能与载体中的其它成分反应。在一个实例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下不在受体中产生显著的局部或系统不利影响。

用于本公开的合适载体包括常规使用的那些，例如，水、盐水、水性葡萄糖、乳糖、林格氏溶液(Ringer's solution)(一种缓冲溶液)、透明质酸和乙二醇，其为示例性的液体载体，特别是(在等渗时)用于溶液。合适的药物载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

可添加其它的一般添加剂如抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等。为了制备可注射的溶液、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，可额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂。

如本领域通常已知的，本公开的适配子和其制剂可以直接地或局部地(例如局部给药)施用给患者或靶标组织或器官。例如，组合物可以包含递送载体，包括脂质体，用于向受试者施用。通过本领域技术人员已知的多种方法可以将核酸分子施用至细胞，包括但不限于封装在脂质体中通过离子导入(iontophoresis)，或者通过其它载体并入，比如可生物降解聚合物、水凝胶、环糊精、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和PLCA微球、可生物降解纳米胶囊、和生物黏附微球、或通过蛋白质载体。

可用于本公开的适配子的递送系统包括，例如水性或非水性凝胶、霜、多重乳剂、微乳剂、脂质体、膏剂、水性或非水性溶剂、洗剂、喷雾剂、碳氢化合物基质和粉剂，并且含有赋形剂，比如增溶剂、渗透促进剂(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，以及亲水性聚合物(例如聚卡波非和聚乙烯基吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是脂质体或透皮促进剂。

本公开的药物组合物是以适于施用例如系统性或局部施用至细胞或受试者(包括例如人)的形式。合适的形式部分取决于用途或进入途径，例如口服、透皮或通过注射。本领域已知其它因素，以及包括注意事项比如毒性和阻碍组合物发挥其作用的形式。

可经肠胃外(例如，静脉内、皮下、局部或腹膜注射)施用包含本公开的适配子的适配子或组合物。可根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用频率、施用方法、排泄物和疾病的严重性来确定有效剂量的适配子。在一个实例中，如本文所描述的适配子或治疗诊断剂含重量有10-95％的适配子。在另一个实例中，适配子或治疗诊断剂含有重量25-75％的适配子。

通常，施用0.1mg/kg至100mg/kg体重/天的活性成分的量。

用于口服使用的制剂也可以作为硬明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或者作为软明胶胶囊存在，其中活性成分与水或油介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。

水性悬浮液含有与适于制备水性悬浮液的赋形剂相混合的适配子。这种赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、氢丙基-甲基纤维素(hydropropyl-methylcellulose)、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散或润湿剂可以是天然产生的磷脂，例如卵磷脂，或者烯化氧与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸，或者环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物比如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯(polyoxyethylene sorbitol monooleate)，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物例如聚乙烯脱水山梨醇单油酸酯(polyethylene sorbitan monooleate)。水性悬浮液还含有一种或多种防腐剂例如乙烷基或正丙基对羟基苯甲酸、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂、和一种或多种甜味剂比如蔗糖或糖精。

油性悬浮液可以通过将适配子悬浮在植物油中而制剂，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或者在矿物油中制剂，比如液体石蜡。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂比如抗坏血酸而保存。

分散性粉剂和颗粒剂适于通过添加水制备水性悬浮液，以提供和分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的适配子。合适的分散剂或润湿剂或悬浮剂通过以上提及的那些所示例。也存在额外的赋形剂，例如甜味、调味和着色剂。

本发明的药物组合物还可是水包油的乳剂形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然产生的胶例如阿拉伯树胶或黄蓍胶，天然产生的磷脂例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯例如脱水山梨醇单油酸酯，以及所述偏酯和环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。所述乳剂还含有甜味和调味剂。

无菌注射制剂还可以是在非毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受载体和溶剂中可以被利用的是水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液以及含有氯化钠和氯化钾的等渗盐溶液。此外，无菌的不挥发性油常规用作溶剂或悬浮介质。为此，可以利用任何温和的不挥发性油，包括合成的单或二甘油酯。此外，脂肪酸比如油酸应用于注射剂的制备。

应理解，对于任何具体的受试者的具体剂量水平取决于多个因素，包括利用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、施用途径、以及排泄率、药物组合和接受治疗的具体疾病的严重性。施用频率可以是每天、每周或每月一至数次。

适配子的组合

可根据本文公开的任何方法，单独或结合一种或多种额外的适配子来使用本公开的适配子分子。在一个实例中，可将本公开的适配子分子与可促进癌症干细胞的检测、纯化或富集的适配子组合。在一个实例中，所述额外的适配子包含Shigdar S等人(2011).Cancer Sci 102(5):991-998中描述的序列EpDT3 5′-GCGACUGGUUACCCGGUCG-3′。在另一个实例中，所述额外的适配子结合不同的靶标，例如EpCAM。

本公开还包括在5’和/或3’端通过接头连接有另一个适配子的适配子。本领域已知合适的接头，并可以包括聚合物比如PEG。

试剂盒

本公开还提供了用于实施本文公开的方法的诊断试剂盒。在一个实例中，所述诊断试剂盒包含用于检测表达CD133的细胞(例如，癌症干细胞)的如本文所述的适配子或诊断剂。

所述试剂盒还可包含助剂如缓冲剂和稳定剂。所述诊断试剂盒还可包含用于降低背景干扰的试剂、对照试剂和用于进行测试的装置。通常还包含关于如何使用所述诊断试剂盒的指导。

本领域技术人员应理解可对上述实施方案进行多种变型和/或修改，而不脱离本公开的广义总体范围。因此，本实施方案在所有方面应理解为示例性和非限制性的。

实施例

方法

细胞系和细胞培养

购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，马纳萨斯，VA，美国)的HT-29(人结肠直肠癌细胞)和HEK293T(人胚胎肾细胞)维持在杜氏改良的伊戈尔介质(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM，Invitrogen，维多利亚，澳大利亚)中，其添加了10％胎牛血清(FCS，Hyclone，美国)。将细胞于37℃下孵育在5％CO 2水饱和的气氛中。

CD133适配子的产生

如在Shigdar S等人(2013)Cancer Letters 330:84-95中描述的产生起始CD133适配子。如图1中所示，将适配子的茎区序列替换为DNA茎。

开发适配子-Dox缀合物

使用VIENNA软件(http://rna.tbi.univie.ac.at/)预测CD133-适配子的2D结构。该结构指导更准确和更有效的制备适配子-药物缀合物的特性。设计用于与化疗剂阿霉素(DOX)(SIGMA-ALDRICH)缀合的CD133-适配子由IBA(德国)合成，并储存在-80℃。缀合之前，通过在85℃加热5分钟折叠(folded)适配子，在超过10分钟缓慢地冷却至室温，接着在37℃孵育15分钟。然后在含有50mM NaCl和2.5mM MgCl2的缀合缓冲液中将DOX与适配子充分混合，并且在37℃，在Orbital混合器/孵育器(RATEK)中以75r.p.m孵育2小时。然后将缀合物经过

G-50柱(SIGMA-ALDRICH)以将适配子-Dox缀合物与游离的DOX分离。因此适配子-DOX缀合物含有一个或多个DOX分子，所述DOX分子被插入适配子茎区的DNA序列。

确定DOX和适配子的摩尔比

通过紫外光谱(UV-Spec)，DOX的天然荧光和其插入CD133适配子之后淬灭可以被用于测量DOX缀合的程度以及稳定性。使用不同的适配子-Dox摩尔比(0、0.01、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6)研究缀合过程，并基于游离的DOX的标准曲线使用UV-Spec或荧光读板机(fluorescence plate reader)分析。

通过HPLC评价DOX负载效率

通过使用乙腈提取缀合物中的DOX，接着使用HPLC定量DOX，确定在不同的适配子/DOX摩尔比时DOX负载效率。简要地，使用90μl的乙腈稀释从SephadexG-50柱洗脱的30微升的适配子-Dox缀合物，并旋涡1分钟。然后将该溶液在21000×g离心5分钟，将50μl的上清液稀释于150μL的PBS，充分混合后在21000×g进行另一次离心5分钟。取100微升的上清液，使用HPLC通过C-18柱经反相色谱确定DOX浓度。在HPLC中使用即时UV检测器定量DOX。在相同的条件下，使用标准的DOX溶液制备校准标准曲线。药物负载效率(DLE)通过以下公式计算：

分析适配子药物释放

使用透析方法，采用Slide-A-Lyzer透析盒(截断分子量3.5kDa，ThermoSCIENTIFIC，Cat No:66333)确定在体外从适配子-DOX缀合物释放的DOX。将适配子-Dox缀合物(400μL，1μg/ml DOX)添加至盒中。在黑暗中轻微搅动，在37℃针对PBS和具有10％FCS的PBS在pH 8、7.4或5.0透析所述透析盒。在不同的时间点(10分钟、0.5小时、1小时、4小时、8小时、24小时和48小时)，从外部缓冲液中取一份30微升的介质用于释放动力学分析，并替换为30μL新鲜的介质。使用荧光读板机(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)，根据DOX浓度对比其荧光强度的标准曲线，将荧光强度转换为DOX的质量，来确定DOX的浓度。适配子-Dox的DOX累计释放以释放的DOX百分比表示，以时间函数制图。

确定适配子-Dox缀合物和其靶标细胞的平衡解离

为最小化非特异性结合，首先将1×105HT29或HEK293T细胞与封闭缓冲液(含10％FCS、1％BSA和1％tRNA的PBS)孵育20分钟。然后使用洗涤缓冲液(含有5％FBS和2.5mMMgCl2)洗涤细胞两次，与CD133适配子、阴性对照适配子、CD133适配子-Dox缀合物或阴性对照适配子-Dox缀合物在冰上孵育1小时，全部使用Cy5在缀合缓冲液中标记(50mM NaCl和2.5mM MgCl2)。

在流式细胞术分析之前，使用洗涤缓冲液再洗涤细胞两次，然后悬浮于150μl洗涤缓冲液。然后使用流式细胞仪(FACS CANTOII,Becton Dickerson)收集数据，以测量适配子的荧光强度，以阴性对照适配子的荧光背景归一化荧光强度来确定结合亲和性，然后使用Graph Pad Prism软件导出。

适配子-DOX缀合物的内化

在8室玻片(8-chamber slide)中，以8×10⁵个细胞每孔接种HT29和HEK293T持续24小时，为共聚焦显微术准备。使用封闭缓冲液(含10％FCS、1mg/mL BSA、0.1mg/mL tRNA的PBS)孵育细胞20分钟，接着使用洗涤缓冲液(含有5％FBS、2.5mM MgCl2和5mM NaCl的PBS)洗涤两次，之后与200nM适配子、阴性对照适配子、适配子-Dox缀合物或阴性对照适配子-Dox缀合物，在缀合缓冲液中在37℃孵育30分钟。在孵育的最后15分钟期间，向细胞添加Bisbenzimide Hoechst 33342(3mg/ml)(Sigma)。移除适配子溶液，在PBS中洗涤细胞3次，每次5分钟，之后使用FluoView FV10i激光扫描共焦显微镜(Olympus)进行可视化。

在体外CSC频率分析

在80％汇合时，使用胰蛋白酶消化收集细胞，在DMEM/F12无血清介质中以单细胞重悬，接着离心(1000×g 5分钟)。以每孔5、10、50、100、500和1000个细胞的密度，将细胞接种到96孔超低附着板中，或者在6孔超低附着板中4000个细胞/孔，用于肿瘤球形成。使用三个实验组：肿瘤球介质对照、游离DOX处理(1、1.5和2μM)以及适配子-Dox处理(1、1.5和2μM，相当于相同浓度的游离DOX)。在37℃孵育24小时之后，移除上清液，替换为等体积的新鲜的CSC介质。肿瘤球定义为具有超过50μm的直径、边界轮廓分明的细胞团块。在接种后3天记录肿瘤球形成频率和尺寸。使用ELDA网站(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html)计算CSC的频率。根据公式F＝形成的肿瘤球的数量/接种的单个细胞的数量(F是肿瘤球形成频率)计算在6-孔孵育的肿瘤球形成频率。

数据分析

除非另有说明，数据和结果以平均值和标准差(平均值±S.D.)报告。不同组间平均值的差异使用SPSS 13.0程序的单因素方差分析(ANOVA)进行分析。P值小于0.05被认为是统计上显著的。

实施例1：DOX与CD133适配子的缀合

目前癌症治疗的主要问题是不能靶向癌症干细胞(CSC)。为开发新的靶向CSC的试剂，将本身不能靶向CSC的常用的化疗药物DOX缀合至针对细胞表面标记物CD133的适配子。通过评估适配子结合亲和性和特异性以及药物的细胞毒性来测试缀合的适配子维持功能的能力。

使用VIENNA软件(http://rna.tbi.univie.ac.at/)预测CD133适配子的二级结构(图1)。本发明人以前确认了CD133和适配子之间的相互作用通过适配子的环发生(ShigdarS等人(2013)Cancer Letters 330:84-95)。此外，已知阿霉素(DOX)插入DNA中配对的G-C碱基(图1B)。因此，在CD133适配子中的RNA茎被替换为10-bp DNA茎以提供DOX负载的平台。为增加适配子靶标结合部分和DOX-DNA缀合物的稳定性，在DNA茎中使用5’甲基-dC，相比天然的对应物提供了更强的碱基配对。

通过连续增加的适配子比DOX摩尔比的缀合测定，确定在适配子中DOX负载的最佳摩尔比。为进行该半定量分析，使用UV-Spec和HPLC首先确定在不同浓度的DOX荧光定量评估(图2)。这提供了测量的荧光强度和游离的DOX的真实浓度之间的关联。通过UV-Spec和高效液相色谱(HPLC)监测DOX插入至CD133适配子。图3显示DOX的天然荧光，以及之后以CD133适配子比DOX摩尔比0.4:1插入的最大淬灭。适配子负载的DOX随使用的适配子的浓度增加而增加，且在0.4时达到平台。该数据连同在标准曲线中游离的DOX的基线，允许以淬灭的百分比监测DOX与适配子的缀合(图3)。

实施例2：DOX-适配子缀合物的体外稳定性

药物的控制和持续释放对于药物递送系统是重要的。本发明人以前显示适配子通过内吞作用而被内化，可能进入核内体和溶酶体隔室(compartments)，其具有6.0至5.0的pH，9Shigdar S等人(2011)Cancer science 102:991-998。因此，在PBS和含有胎牛血清(FCS)的PBS中研究在pH范围中来自适配子-DOX缀合物的DOX体外释放谱。如在图4和5中所显示，在体外DOX从适配子-Dox释放是依赖pH的，并显示出少许初始突释的稳定持续释放模式。在pH7.4(循环系统中发现的生理pH)，在PBS中48小时后检测到适配子上插入的DOX的最小释放。相似地，在pH 8.0，从适配子-Dox释放的DOX更低。然而在pH 5.0，在PBS中DOX的释放急剧增加。为模拟在循环中的条件，在添加有FCS的PBS中测量DOX释放(图5)，关于随着不同的pH DOX的释放，发现与图4相一致。这种依赖pH的释放行为是令人满意的，因为在体内系统循环的中性环境中DOX应保持与适配子的缀合，并且在内化至肿瘤细胞之后在晚期核内体/溶酶体的酸性环境中被释放。

实施例3：确定适配子缀合物的平衡解离常数

为确定DOX的缀合是否阻碍结合亲和性和适配子对CD133的特异性，将荧光标记的Cy5适配子-Dox缀合物与HT29结肠直肠癌细胞孵育，通过流式细胞术分析确定平衡解离常数(K_D)(图6)。在本研究使用的CD133适配子的解离常数在图7中显示。

选择两种细胞系HT29和HEK293T用于研究。HT29表达高水平的CD133，然而HEK293细胞系不表达CD133，用作CD133结合特异性的阴性对照。如在图6A中所显示的，适配子-Dox缀合物对阴性对照细胞(HEK293T)具有微不足道的亲和性，因为其显示大于1000nM的K_D。为确定CD133适配子通过特异性分子相互作用结合CD133，而不是核酸与CD133间非特异性结合，使用阴性对照适配子-Dox缀合物重复实验(图6B)。该阴性对照适配子具有如阳性适配子相同的核酸序列，除了2’-O-甲基修饰替换了2’-氟代化学修饰。

因此，其具有改变的3-D结构，破坏了其对CD133的结合。阴性对照适配子-Dox还显示对HT29细胞系不结合，平衡解离K_D>1000nM。相反，CD133适配子和(图6C)和CD133适配子-Dox缀合物(图6D)以高亲和性结合HT29细胞，分别为84.81nM和23.89nM，表明保留亲和性，并且使用DOX插入茎提高了亲和性。

实施例4：适配子-Dox缀合物的细胞内化

质膜上存在ABC转运蛋白的提高的表达，将被动扩散到细胞的游离的药物外排，这是CSC化学抗性的关键机制之一。一种克服这种防御的方式是通过内吞作用递送细胞毒性药物，因此绕过基于质膜的药物外排泵。为评估CD133适配子-Dox缀合物有效细胞内递送药物的能力，通过共聚焦显微术定性分析缀合物的内化(图8)。使用适配子和DOX处理用于评估内化在图9中显示。

DOX的激发和发射波长分别是480和580nm，同时使用Cy5标记适配子，Cy5具有645/664nm的发射和激发波长。即，通过共聚焦流式细胞术分析的不同的荧光通道，能够明确鉴定在缀合物中的DOX和适配子。HT29细胞首先与标记有Cy5的CD133适配子孵育，在孵育1小时之后显示被成功的内化(图8A)。接着，为确定DOX的插入是否能够影响内化，使用适配子-Dox缀合物重复实验(图8B)。如在图8A和B所显示，缀合物显示与其仅有CD133适配子的对应物相似的内化水平。阴性对照适配子和细胞系(293T)也确认了与亲和性结果相似的缀合物的特异性(图8C-D)。此外，在图8E中显示，使用TRITC通道测量DOX细胞内荧光的水平相比游离的DOX更高。

实施例5：适配子-Dox缀合物在体外清除自我更新细胞的能力的确立

功能能力是分析CSC的关键，而非表型表达。这是因为，虽然CSC的特性可以依赖癌症类型、肿瘤生长的阶段和在群中的异质性而变化，但保留了自我更新和产生完整子代细胞的能力(Kreso A和O’Brien CA in Current Protocols in Stem Cell Biology(JohnWiley和Sons,Inc.,2007)。通过在促进自我更新的条件下的调节细胞(CSC的关键性质)，并且消除终末分化细胞，在体外形成的肿瘤球是自我更新潜能的良好指标(Kreso等人，上文)。以前的研究确认了DOX对杀死CSC是无效的(Zeppernick F等人(2008)Clin CancerRes 14:123-129，Zhuang X等人(2012)BMC Cancer 12:1-16)。为评价CD133适配子缀合物是否能够提高DOX针对CSC的细胞毒性能力，进行了上述的肿瘤球形成测定。为分析常规药物DOX和新开发的适配子-Dox缀合物间的CSC靶向差异，使用基于公开的IC50值的DOX的浓度(Poljakova J等人(2008)Interdisciplinary toxicology 1:186-189；Shen F等人(2008)The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 324:95-102；Oudard S等人(1991)Cancer chemotherapy and pharmacology 28:259-265)。为了这个目的，在超低附着板中接种不同浓度的HT29细胞。对于96孔超低附着板，以500/孔、200/孔、100/孔、50/孔、10/孔和5/孔的一系列稀释密度接种细胞。对于6孔超低附着板，以2000/孔或4000/孔的密度接种细胞。细胞与1、1.5、或2μM的游离的DOX或者相同浓度的适配子-DOX孵育。三天以后，评估肿瘤球的尺寸(图10)以及形成肿瘤球的孔的数量(图11)。尽管在更高细胞接种剂量时没有明显的球形成抑制(图11)，但使用适配子-DOX处理的细胞与对照以及游离的DOX相比，肿瘤球尺寸显著下降(图10)。

为了在体外获得适配子-Dox缀合物的真实作用，使用更低接种剂量的细胞(10或5个细胞/孔)(图11)。使用游离的DOX处理细胞显示肿瘤球形成的频率无显著降低，除了使用5个细胞/孔或更低细胞接种剂量的那些。相反，使用适配子-Dox缀合物处理的细胞，相比PBS对照和游离的DOX显示肿瘤球形成频率的显著降低。为进一步确认使用96孔超低附着板获得的结果，使用第二(6孔)版本的肿瘤球测定，以确定获得的结果是可重复的(图12)。在96孔和6孔测定实验之间的差异是相比在96孔中的单肿瘤球，6孔允许很多肿瘤球的形成。与96孔板情况相似，在6孔板中相比使用游离的DOX或对照处理，使用适配子-Dox处理肿瘤球的形成急剧降低。

Claims (24)

1.一种适配子，其由序列5’-X-ACGUAUACUAU-Y-3’(SEQ ID NO：1)组成，其中X和Y的序列是互补的，从而能够碱基配对，其中X和Y单独地由一段4至15个交替的CG核苷酸组成，所述4至15个交替的CG核苷酸足以允许至少一种半簇插入至其上，其中配对时所述交替的CG核苷酸构成适配子的茎区并且其中所述半簇是DNA染色剂或在化疗治疗中使用的分子。

2.根据权利要求1所述的适配子，其显示对CD133约24nM或更低的解离常数(KD)。

3.根据权利要求1所述的适配子，其特异性结合CD133。

4.根据权利要求1所述的适配子，其由根据SEQ ID NO:2所示的序列组成。

5.根据权利要求1所述的适配子，其中在化疗治疗中使用的分子选自阿霉素、亚德里亚霉素、黄连素、原黄素、米托蒽醌、柔毛霉素、沙利度胺、更生霉素、达诺霉素、放线菌素D、9-氨基吖啶、氨柔比星、安吖啶、蒽环霉素、小檗因、博来霉素、elliplicine、表柔比星、伊达比星、methpyrillo、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、米托蒽醌、吡柔比星、匹克生琼、普卡霉素、普罗黄素、灵菌红素、沙利度胺、voreloxin、戊柔比星、佐柔比星、扑尔敏、prodisiosin、methapyrillino、丝裂霉素、偏端霉素、dantinomycin、偏端霉素、卡波铂、顺铂和其它铂衍生物、Hoechst 33258、berenil、DAPI、或溴化乙锭。

6.根据权利要求5所述的适配子，其中所述半簇是阿霉素。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的适配子，其包含一种或多种增加适配子稳定性的修饰。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的适配子，其中在环区的嘧啶核苷酸碱基(C和/或U)是经2’-氟代(2’-F)修饰的，其中环区序列是5’ACGUAUACUAU 3’。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的适配子，其中3’端偶联磷酸基团、磷酸酯、或反向的dT(invdT-3’)。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的适配子，其中5’端偶联染料。

11.根据权利要求1-6中任一项所述的适配子，其包含序列5’–X-A(2’fC)G(2’-fU)A(2’fU)A(2’fC)(2’fU)A(2’fU)-Y-(inv dT)-3’(SEQ ID NO：4)，其中f是2-氟代，以及inv dT是反向的dT。

12.根据权利要求1-6中任一项所述的适配子，其包含序列5’-mCGmCGmCGmCmCGmCA(2′fC)G(2’-fU)A(2’fU)A(2’fC)(2’fU)A(2’fU)GmCGGmCGmCGmCG-(inv dT)-3’(SEQ ID NO:5)，其中mC是5-甲基dC，f是2-氟代，以及inv dT是反向的dT。

13.根据权利要求1-6中任一项所述的适配子，其特异性结合CD133⁺细胞。

14.根据权利要求13所述的适配子，其中CD133⁺细胞是癌症干细胞。

15.根据权利要求13所述的适配子，其中所述细胞在体外。

16.根据权利要求13所述的适配子，其中所述细胞存在于从受试者获得的生物样品中。

17.一种诊断或治疗诊断剂，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的适配子。

18.根据权利要求17所述的治疗诊断剂，其是适配子-Dox缀合物，其中所述Dox被插入在适配子。

19.根据权利要求17或18所述的诊断剂或治疗诊断剂分别在制备用于鉴定在从受试者获得的生物样品中的表达CD133的细胞和/或癌症干细胞的试剂盒中的用途，所述受试者患有或疑似患有癌症。

20.根据权利要求1-6中任一项所述的适配子，其还偶联活性半簇。

21.根据权利要求20所述的适配子，其中所述活性半簇选自适配子、免疫球蛋白或其片段、治疗剂、药物、生物活性剂、毒素、放射性核素、siRNA、DNA酶、核酶、或其组合。

22.如权利要求1至12中任一项所述的适配子或如权利要求17或18所述的治疗诊断剂在制备用于治疗受试者中癌症的药物中的用途。

23.一种组合物，其包含如权利要求1至12任一项所述的适配子或如权利要求17或18所述的治疗诊断剂，用于治疗有需要的受试者中的癌症。

24.一种组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1至12任一项所述的适配子、或如权利要求17或18所述的治疗诊断剂，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

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