CN105925687A - 一种用于儿科的肺吸虫病诊断的试剂盒及其诊断方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于儿科的肺吸虫病诊断的试剂盒，所述试剂盒包含的适配子能够高效的特异性的结合ESP。该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以ESP为靶目标，从随机文库中筛选出了能与ESP特异性结合的RNA适配子。通过适配子特异性的结合ESP，从而定量测定血液中的肺吸虫病，从而能够快速高效的初步筛选肺吸虫病。该试剂盒制备简单，成本低廉，适宜于大面积的推广使用，具有极高的社会价值。

Description

一种用于儿科的肺吸虫病诊断的试剂盒及其诊断方法

技术领域

本发明涉及医学检测领域，特别涉及一种用于儿科的肺吸虫病诊断用的试剂盒。

背景技术

儿童由于体内免疫能力较低，经常罹患各种疾病，特别是寄生虫类的疾病。肺吸虫病(Paragonimiasis)是一种常见和重要的人兽共患寄生虫病，主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲，尤以亚洲地区多见，在我国流行于22个省、市、自治区，估计每年感染者约200万之多，严重危害人类健康，尤其是青少年、儿童的健康。肺吸虫病主要是肺吸虫虫体(幼虫或成虫)在人体组织与器官内移行、寄居造成的机械性损伤，及其代谢物等引起的免疫病理反应。

小儿肺吸虫病临床表现：依肺吸虫寄生的部位而分为以下几型。1.肺型起病大多缓慢，全身症状有发热、乏力、消瘦、盗汗等。同时咳嗽、胸闷、胸痛、咯铁锈色痰或痰带血丝。有时可伴有胸腔积液。2.脑型多见于儿童。表现为头痛、呕吐、意识障碍、癫发作和瘫痪等。因病变在脑中主要损害的部位而分为癫型、脑瘤型、脑膜炎型、脑血栓型和癔病型。脑脊液常有异常改变。3.腹型主要为腹痛、腹壁紧张、局部有压痛。如虫囊侵及肠壁时可有腹泻及粘液脓血便。4.皮下结节大小不等(约0.5～4cm直径大小)，位于深部皮下，以腹壁皮肤多见，能向各处迁移游走。

在我国，致病虫种主要为卫氏肺吸虫和斯氏肺吸虫或斯氏狸殖吸虫，其成虫寄生于人、犬、果子狸等肉食动物的肌肉和器官如肝、肺中；尤其斯氏肺吸虫作为仅在我国流行的一种吸虫，其在人体内不能发育成熟，而以幼虫在人体内移行、窜扰，常常引起游走性皮下包块或结节，脑占位性病变和内脏损伤等肺外型寄生虫表现，造成多器官、组织的损害。肺吸虫病根据肺吸虫寄生部位不同，出现复杂的病理变化和多种多样的临床表现，临床症状不典型，易与其他疾病混淆，误诊率极高。对于感染早期、低度感染及肺外型肺吸虫病患者，以发现虫卵或虫体的病原学检测方法往往难以获得检测结果。

半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease)是多种寄生虫分泌、排泄的一种蛋白水解酶，也是免疫优势抗原，并具有明显的种、属特异性。发明人研究发现，斯氏狸殖吸虫的半胱氨酸蛋白酶对宿主具有免疫原性和反应性，能诱导免疫反应，可作为肺吸虫病的免疫诊断抗原；因该蛋白酶的免疫组化反应呈现虫体的肠道、排泄囊内，其编码基因杂交定位在成虫的肠壁、体壁，故将该蛋白酶又称为肺吸虫排泄分泌蛋白(Excretory-secretory protein,ESP)。已有研究证实，通过检测ESP蛋白的存在与否，即可检验肺吸虫病的存在。

目前，用于肺吸虫病的免疫学检测方法种类较多，包括抗体检测方法如皮内试验(IT)、补体结合试验(CFT)、间接血凝试验(IHA)、对照免疫电泳试验(CIEP)、免疫荧光试验(IFAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等；以及抗原检测方法如多克隆或单克隆抗体ELISA法等。抗体检测方法敏感性高，但因治愈后抗体在体内仍可维持较长时间，致使疗效考核效果不理想，尤其在疫区反复感染人群中无法区别是现行感染还是既往感染；抗体检测中使用的抗原，如虫体抗原、排泄分泌抗原等，均为粗抗原，易出现同源吸虫间交叉反应，并严重依赖于虫体来源的成分；各实验室的检测抗原不一致，导致无法对检测结果进行比较等问题。此外，循环抗原(CAg)检测，即对虫体的代谢产物及腺体分泌液、子宫液、脱落的虫体皮层表膜等抗原性物质的检测，方法特异性高，能反映感染虫荷；因CAg出现较抗体产生为早，有早期检测价值；而且经有效治疗使虫体死亡后抗原消失快，可用于确诊和(或)疗效考核，但其不足之处在于敏感性较低，并受多种因素干扰。这一现状严重影响了临床上肺吸虫感染的早检测、早预防、早治疗，限制了人肺吸虫感染的流行病学调查研究。

虽然可以采用抗体通过酶联免疫反应来定量分析ESP的含量，但是该方法对抗体的要求比较高，并且检测成本也比较高，因此，对于贫穷落后地区，并不适宜大面积推广。

SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的核酸分子被洗去，而与革G物质有强亲和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex技术，筛选特定的结合ESP的适配体，进而将适配体制备成为特异性检测ESP的试剂盒，准确、快速、简便地进行肺吸虫病的诊断与鉴别诊断、以及疗效考核具有重要意义及广阔的应用前景。

发明内容

本发明的技术方案通过以下步骤实现：

本发明的目的是提供一种ESP的核酸适配体序列。

本发明中，所述的ESP的核酸适配体(序列1-16)能够特异结合ESP。

本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性结合ESP的试剂盒。

从体外合成的随机寡聚DNA文库，(5′-AACATGAGCAACATTAGCCA----N36----GGACAGTGAACGAAGTACCT-3′)，其中N36为36个随机寡核苷酸；从中筛选出与ESP特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物P1：AACATGAGCAACATTAGCCA；引物P2：AGGTACTTCGTTCACTGTCC，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。

本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以ESP为正筛靶标，筛选与ESP特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合ESP的序列，本发明中命名为适配体ESP ap-1～16。序列如下：

ESP ap-1:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUUAAUACAAAUCUCUAAAUAGAACCACCCCAACUUUGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-2:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAUAUACCUUACCCUAUCCAAGACAAUCUAUCUCCCAGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-3:

AACAUGAGCAACAUUAGCCACUAUACUUAAUUUCACAACAGAAUCUAACCUCCUAAGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-4:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAAUUACCCCCUCUUCAGAACACAAUCUAUAAAAUCAGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-5:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUCUUUAUUUAUUCAUCCGCUCUUACUCCAAUCACUAGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-6:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAACAAUACCUCCCAUCCCGUCUCCUUUCUACAUCCCGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-7:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAUAUCCAUCCUACCCAUCCCGCUUUACUACUCUCUCGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-8:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUUUAUUUCUUCUCACAAUUCAGCAACUAACUCCACAGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-9:

AACAUGAGCAACAUUAGCCACACCACAUAAAAUCUAUUCAAGAAUUAAUACUUUCAGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-10:

AACAUGAGCAACAUUAGCCACUCUUCUUCAACUCAAUAUCGUUCCCUUAACUUAUCGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-11:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUCUAUCUACCAAUCUUACGAUUCAAUCCCUAUACAUGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-12:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUUAUCAUCUUACAUUCGCCCCUCAAUUCCCUAACAAGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-13:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAACUCCUUUUCCUUCUGUCACACCACUUCACAUAUAGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-14:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAAUUCUUACACAUCUCGCCUACUUCCUAUUACUUUUGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-15:

AACAUGAGCAACAUUAGCCACCAUUUUAUAACCAAAUCAUCUACUCGUUCUCUCCAGGACAGUGAACGAAGUACCU

ESP ap-16:

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUCCAUUCUAUAAUUAACCGCCACUAAUUCCUCAUCCGGACAGUGAACGAAGUACCU

以上述核酸适配子筛选文库为基础，可对文库两端的固定序列的个别核苷酸进行替换、颠倒、移位，或对其长度进行小幅延长或缩短，或对文库中间的随机序列进行延长或缩短，或对扩增文库的引物作相应的简单改造，然后制备简单改造后的文库和引物进行核酸适配子的筛选、PCR扩增和分析与应用。

以上述核酸适配子筛选文库为基础，可随机改变文库中间的随机序列区的核苷酸组成，通过计算机软件模拟寡核苷酸序列的二级结构或三级结构，设计出核酸适配子或改造从本文库筛选出的核酸适配子。

可利用上述任何一个原始或简单改造后的文库进行核酸适配子的筛选、分析、改造和应用。

本发明的有益效果：本发明设计出了一个性能优秀的随机单链寡核苷酸文库。文库具有接近长度下限的短固定序列和较长的随机序列，充分保证了文库中单链寡核苷酸的多样性。文库固定序列(引物序列)的独特设计能使用高退火温度进行PCR扩增，既能有效获得目的产物，又能有效抑制非特异性产物。本文库及引物应用于ESP的核酸适配子筛选获得成功，所述的适配子可以用于制备检测试剂盒，从而用于儿童的肺吸虫病的检测。

具体实施方式

实施例1肺吸虫病ESP蛋白的获得

按照CN 101319224B中权利要求1公开的制备肺吸虫排泄分泌蛋白的方法，制备得到肺吸虫排泄分泌蛋白，蛋白浓度为100mg/mL，置4℃保存。

实施例2适配子的获得

从体外合成的随机寡聚DNA文库，5′-AACATGAGCAACATTAGCCA----N36----GGACAGTGAACGAAGTACCT-3′。

所用引物:

F：5，-AACATGAGCAACATTAGCCA-3

R：5，-GGACAGTGAACGAAGTACCT-3

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。80μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与20ug ESP蛋白37℃孵育40min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.7mol/L醋酸铵，l.6mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行14轮。将最后一轮筛选得到的适配子上测序仪测序。测定得到序列如SEQ IDNO：1-16所示。

实施例3特异性高亲和力的ESP结合适配子的获得

将RNA适配子分别取1.5μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化1h，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(1-200nM)的ESP蛋白37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与SIgA蛋白的解离常数。结果如下：

名称	解离常数Kd(nM)
		ESP ap-1	6.5
ESP ap-2	7.6
		ESP ap-3	6.7
ESP ap-4	6.5
		ESP ap-5	5.9
ESP ap-6	5.8
		ESP ap-7	7.7
ESP ap-8	8.0
		ESP ap-9	8.6
ESP ap-10	8.8
		ESP ap-11	9.0
ESP ap-12	8.3
		ESP ap-13	7.6
ESP ap-14	7.6
		ESP ap-15	6.9
ESP ap-16	6.4
		PBS空白对照	无结合能力

从以上结果可以看出，本发明的16个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中也没有所述结合特性的适配子能够结合ESP蛋白。

实施例4降解活性分析

分别采用华支睾吸虫、猪囊尾蚴、裂头蚴、人血白蛋白、IgA、血红蛋白与16条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些寄生虫或者蛋白相结合，而只与ESP蛋白结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.4ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置四周。通过RT-PCR检测，发现四周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例5临床试验分析

将16个适配子分别用于检测同样的儿童血液的临床样本，其中从感染有华支睾吸虫、斯氏狸殖吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的人上收集10ml血液各10组，加入常规的细胞裂解液裂解细胞，而后裂解液被分装为15μl每小瓶并冷藏直至使用。以没有感染寄生虫疾病的儿童10组作为阴性对照。

将50组血清加入到无菌离心管中，加入PBS溶液震荡溶解。分别将偶联有磁珠的16组适配子0.1μg与50组的细胞裂解液溶液15μl混合孵育20分钟，而后磁分离，即可获得相应的分离的ESP蛋白，通过检测发现，在10例斯氏狸殖吸虫感染组中，16组适配子均检测到高浓度的ESP蛋白，平均检测浓度为40.5mg/L，并且分布均匀，而在感染有华支睾吸虫、猪囊尾蚴和裂头蚴的组以及健康组中均没有检测到与适配子结合的ESP蛋白，由此可见，可以采用本发明的16种适配子可以快速的实现斯氏狸殖吸虫感染100％的初步筛选的检测效果。具有极高的准确性和特异性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉陈博

〈120〉一种用于儿科的肺吸虫病诊断的试剂盒及其诊断方法

〈210〉1

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-1

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUUAAUACAAAUCUCUAAAUAGAACCACCCCAACUUUGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉2

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-2

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAUAUACCUUACCCUAUCCAAGACAAUCUAUCUCCCAGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉3

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-3

AACAUGAGCAACAUUAGCCACUAUACUUAAUUUCACAACAGAAUCUAACCUCCUAAGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉4

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-4

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAAUUACCCCCUCUUCAGAACACAAUCUAUAAAAUCAGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉5

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-5

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUCUUUAUUUAUUCAUCCGCUCUUACUCCAAUCACUAGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉6

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-6

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAACAAUACCUCCCAUCCCGUCUCCUUUCUACAUCCCGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉7

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-7

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAUAUCCAUCCUACCCAUCCCGCUUUACUACUCUCUCGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉8

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-8

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUUUAUUUCUUCUCACAAUUCAGCAACUAACUCCACAGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉9

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-9

AACAUGAGCAACAUUAGCCACACCACAUAAAAUCUAUUCAAGAAUUAAUACUUUCAGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉10

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-10

AACAUGAGCAACAUUAGCCACUCUUCUUCAACUCAAUAUCGUUCCCUUAACUUAUCGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉11

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-11

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUCUAUCUACCAAUCUUACGAUUCAAUCCCUAUACAUGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉12

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-12

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUUAUCAUCUUACAUUCGCCCCUCAAUUCCCUAACAAGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉13

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-13

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAACUCCUUUUCCUUCUGUCACACCACUUCACAUAUAGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉14

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-14

AACAUGAGCAACAUUAGCCAAAUUCUUACACAUCUCGCCUACUUCCUAUUACUUUUGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉15

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-15

AACAUGAGCAACAUUAGCCACCAUUUUAUAACCAAAUCAUCUACUCGUUCUCUCCAGGACAGUGAACGAAGUACCU

〈210〉16

〈211〉76

〈212〉RNA

〈213〉人工序列

〈400〉ESP ap-16

AACAUGAGCAACAUUAGCCAUCCAUUCUAUAAUUAACCGCCACUAAUUCCUCAUCCGGACAGUGAACGAAGUACCU

Claims (5)

1.一种用于特异性诊断肺吸虫病的试剂盒，其含有核酸适体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述适体为SEQ ID No.1-16任一条序列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。

3.权利要求2中所示的适体在检测ESP蛋白的应用。

4.权利要求2中所示的适体用于制备检测肺吸虫病的试剂盒中的应用。

5.一种诊断肺吸虫病的方法，其特征在于：使用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。