[go: up one dir, main page]

KR102154683B1 - 글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102154683B1
KR102154683B1 KR1020190142363A KR20190142363A KR102154683B1 KR 102154683 B1 KR102154683 B1 KR 102154683B1 KR 1020190142363 A KR1020190142363 A KR 1020190142363A KR 20190142363 A KR20190142363 A KR 20190142363A KR 102154683 B1 KR102154683 B1 KR 102154683B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
misc
feature
bzdu
aptamer
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020190142363A
Other languages
English (en)
Inventor
이조운이
김윤동
이다솜
이정균
이대견
임소령
Original Assignee
주식회사 압타머사이언스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 압타머사이언스 filed Critical 주식회사 압타머사이언스
Priority to KR1020190142363A priority Critical patent/KR102154683B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102154683B1 publication Critical patent/KR102154683B1/ko
Priority to EP20885612.0A priority patent/EP4054643A4/en
Priority to CN202080088771.4A priority patent/CN114845736B/zh
Priority to PCT/KR2020/015536 priority patent/WO2021091319A1/en
Priority to US17/774,601 priority patent/US20230127087A1/en
Priority to JP2022526479A priority patent/JP7561845B2/ja
Priority to JP2024010095A priority patent/JP2024054164A/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/282—Platinum compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/332—Abasic residue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4722—Proteoglycans, e.g. aggreccan
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)

Abstract

본 발명은 글리피칸-3(Glypican-3, GPC3) 특이적 변형 압타머 및 이를 이용한 간암의 예방 또는 치료에 관한 것으로, 본 발명의 글리피칸-3 특이적 변형 압타머는 글리피칸-3에 특이적으로 결합하여 간암세포 내에 세포 내재화되며, 압타머에 결합되어있는 항암제를 통해 항암 활성을 나타내므로, 정상 간세포에는 영향 없이 GPC3가 발현된 간암세포에만 선택적 항암효과를 가진다.

Description

글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도{Glypican-3 specific modified aptamer and uses thereof}
본 발명은 글리피칸-3(Glypican-3, GPC3) 특이적 변형 압타머 및 이를 이용한 간암의 예방 또는 치료에 관한 것이다.
간암은 간에서 일차적으로 발생한 원발성의 악성 종양을 통칭한다. 그 중 간세포에서 기원한 '간세포성암'의 비율이 약 77%, 담도암이 16%, 그 외의 암종은 드물어, 간암은 대부분 간세포성암(Hepatocellular carcinoma, HCC)으로 볼 수 있다. 간세포성암의 주요 원인은 만성B형간염, 만성C형간염, 간경변증, 알코올 간질환 등이다.
간암은 대부분 수술이나 조직검사 없이 치료하기 때문에 조직 샘플을 얻기가 쉽지 않고, 만성간염이나 간경변 동반 등 고려해야 할 임상 데이터가 다른 암종에 비해 많아 임상 연구가 쉽지 않기 때문에, 간암에 대한 연구는 다른 암종에 비해 상대적으로 부족했다.
또한, 간암은 동반질환인 만성 간염과 간경변증을 동반하고 조기에 주위 혈관을 침범하여 급격하게 진행되는 종양의 생물학적 특성으로 치료 난이도가 매우 높다.
간세포성암의 치료는 간절제 혹은 간이식 수술, 국소치료, 경동맥화학색전술 및 기타 경동맥 치료, 방사선 치료, 전신치료 등이 시행된다. 전신치료는 림프절, 폐 등의 간 외 전이가 있어 국소치료가 불가능한 환자를 대상으로 하며, 복합항암요법이 주로 사용됐다. 그러나 화학요법의 객관적 반응률은 10% 미만이라고 알려졌고, 생존기간을 연장시킨다는 증거는 없었다.
이후 간세포성암이 고도의 혈관성 종양이라는 점이 밝혀지면서 넥사바(성분명 소라페닙), 렌비마(성분명 렌바티닙)와 같이 VEGFR(혈관내피세포증식인자수용체)를 주요 타겟으로 하는 표적치료제가 개발됐다. 이는 진행·전이성 간암에서의 치료대안이 됐다.
그러나, 초기에는 증상이 거의 없어 대부분 암이 진행되어 증상이 나타난 후 치료가 시작되는 간암의 특성상, 간암 후기(Late-stage HCC)에서 효과적인 치료 방법이 필요한 실정이며, 아울러 기존 치료제에 대한 보조 또는 새로운 기전에 대한 치료 방법이 요구된다.
한편, 글리피칸-3(Glypican-3, GPC3)은 세포 분열과 성장을 조절하는 GPI(glycosyl-phosphatidylinositol)-고정 HSPG(heparan sulfate proteoglycan)으로, 글리피칸 패밀리에 속한다. GPC3은 N-말단 서브유닛 및 C-말단 서브유닛으로 구성되고, Wnt 신호 경로, IGF, FGF 매개 및 TGF-β2 신호전달에 관여하는 것으로 알려져 있다. GPC3은 HCC 특이적 마커로 이를 표적으로 하는 항암제가 다수 연구되고 있다.
현재 다수의 제약회사들에서 GPC3에 대한 단클론항체(mAb), ADS(antibody drug conjugates) 및 CAR-T cell(chimeric antigen receptor T-cell) 등이 개발 중이며, 현재 전임상 또는 임상 단계에 있다. 그러나, 현재까지 GPC3를 이용한 효과적인 HCC 표적 항암제는 개발되지 않고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 새로운 간암 치료제를 개발하기 위해 다방면으로 노력한 결과, 목적하는 간암 세포에 특이적으로 약물을 전달하여 항암효과를 나타내는 간암 치료제를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
J Korean Med Assoc 2013 November; 56(11): 1001-1011
본 발명의 하나의 목적은 글리피칸-3(Glypican-3, GPC3)에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머 및 상기 핵산 압타머와 결합한 항암제를 포함하는, 변형 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 변형 압타머를 유효성분으로 포함하는, 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 핵산 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 핵산 압타머를 유효성분으로 포함하는, 글리피칸-3 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 간암의 진단 또는 예후에 필요한 정도를 제공하기 위하여, 검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 글리피칸-3의 함량을 검출하는 단계; 상기 함량 검출결과를 대조군 시료의 글리피칸-3의 함량 검출결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 유래 시료의 함량 수준에 변화가 있는 경우, 상기 대상체를 간암의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 글리피칸-3을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 글리피칸-3 검출용 조성물을 포함하는, 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 글리피칸-3(Glypican-3, GPC3)에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머 및 상기 핵산 압타머와 결합한 항암제를 포함하는, 변형 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "글리피칸-3"은 세포 분열과 성장을 조절하는 GPI(glycosyl-phosphatidylinositol)-고정 HSPG(heparan sulfate proteoglycan)으로, N-말단 서브유닛 및 C-말단 서브유닛으로 구성되고, Wnt 신호 경로, IGF, FGF 매개 및 TGF-β2 신호전달에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서, 용어 "압타머", 또는 "핵산 압타머"는 "Chemical Antibody"로서 특정 화합물부터 단백질까지 다양한 종류의 표적 리간드에 높은 특이도와 친화도로 결합할 수 있는 특성을 가지는 짧은 길이(20~80개 염기)의 단일 가닥 핵산 분자를 의미한다. 압타머는 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 통해 생체 외(In Vitro)에서 제조할 수 있다. 상기 "압타머", 또는 "핵산 압타머"는 혼용되어 사용될 수 있다.
삭제
압타머는 표적 단백질에 대해 나노몰(nM) 내지 펨토몰(fM)수준의 높은 결합력과 선택성을 지니고 있다는 점에서 항체와 유사한 특성을 가지는 올리고 핵산 분자로 여겨진다. 한편, 항체와 비교할 때 압타머는 다음과 같은 여러 가지 장점을 가지고 있다: (1) 화학적 합성이 용이하며 또한 비교적 작고 단순한 분자이므로 여러 가지 필요한 변형이 쉽게 가능하고, (2) SELEX 과정을 통해 선택성과 친화도를 극대화할 수 있으며, (3) 화학적 합성으로 만들어지므로 순도가 높고, (4) 기기 분석을 통해 만들어진 물질을 동정할 수 있으며, (5) 동물에 주입하여 항체를 생성하기 어려운 독소 등에 대한 압타머의 개발이 가능하며, (6) 열에 안정하여 실온에서 장기간 보존도 가능하고, (7) 생체 내 면역반응(Immunogenicity)을 거의 일으키지 않고, (8) 일단 특정 물질에 특이적으로 결합하는 압타머를 분리해내면 자동화된 올리고머 합성 방법으로 낮은 비용과 일관성으로 재생산이 가능하여 경제적이다.
압타머 선별 과정에는 일반적으로 1014 내지 1015개 정도의 서로 다른 서열, 즉 다양성을 가지는 라이브러리로부터 단일 가닥 핵산 풀(pool)을 확보하는 과정이 필요하다. 이를 위한 방법으로 여러 가지 방법이 이용되고 있으나 일반적으로 비대칭 PCR을 사용하여 한쪽 가닥만을 증폭시키는 방법, 이중 가닥 핵산의 한 가닥 끝 부분에 비오틴(biotin)을 붙인 후 스트렙타비딘(streptavidin)으로 감싼 비드(bead)를 이용하여 한 가닥만을 선택적으로 분리하는 방법이 가장 많이 이용되고 있다.
이후, 확보한 라이브러리를 표적 분자에 결합시켜 결합력이 높은 압타머를 골라내는 선택 과정을 진행한다. 표적 분자가 단백질인 경우에는 보통 단백질에 표지된 비오틴을 스트렙타비딘 비드를 이용해 풀 다운(Pull down)한다. 표적 단백질과 변형 핵산 라이브러리의 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내어 표적 단백질에 결합하지 않은 변형 핵산 라이브러리들을 제거한다.
플레이트(Plate)의 경우에도 마찬가지로 핵산 라이브러리와 표적 단백질의 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내어 표적 단백질에 결합하지 않는 핵산들을 제거한다. 이러한 방법들을 사용하여 리간드에 대해 친화도를 가지는 압타머들을 얻을 수 있다. 보통 5-15 회의 선별-증폭 과정을 반복하면 높은 친화도를 가지는 압타머를 얻을 수 있다. 선별 과정이 종료되면 증폭한 핵산을 클로닝한 후 개개의 클론으로부터 서열 분석을 통해 그 서열을 확인하고, 압타머를 합성하여 표적 분자와의 친화도 및 결합력을 측정한다.
본 발명에서, 용어 "표적 분자"는 본 발명의 압타머로 검출할 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 상기 표적 분자는 분리된 시료 내에 존재하는 것으로 포획 압타머가 결합할 수 있는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 보조인자(cofactor), 약물, 염료, 성장인자 및 규제물질(controlled substance)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 표적 분자는 글리피칸-3, 이의 리간드 또는 이의 수용체일 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 글리피칸-3에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머는 서열번호 1의 변이체, 즉, 서열번호 1로 이루어지는 염기서열의 변이체로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1은 서열번호 1의 염기서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 발명의 서열번호 1에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들면, 본 발명의 서열번호 1은 상기 서열번호 1의 염기서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 압타머에 상응하는 효능을 나타내는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드도 본 출원의 서열번호 1의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들면, '서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드’는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드'에 속할 수 있음은 자명하다.
상기 서열번호 1의 변이체는, 상기 서열번호 1을 이루는 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 화학적 또는 물리적으로 변형(modification)된 형태를 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 변이체는 서열번호 1의 염기서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 절단; 서열번호 1의 염기서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드 내 염기 구조의 피리미딘 기의 5번 탄소 위치에서 나프틸기로의 치환; 하나 이상의 뉴클레오티드가 당과 염기를 가지지 않는 링커로의 치환; 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2번 탄소 위치에서 -OH 기가 -Methoxy(메톡시), -F(fluorine, 불소) 또는 Methoxyethyl(메톡시에틸) 중 어느 하나 이상으로의 치환; 하나 이상의 뉴클레오티드 내 염기 구조의 피리미딘 기의 5번 탄소 위치에서 벤질기로의 치환;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치환으로 인한 변형을 포함하는 것일 수 있다.
상기 나프틸기는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112019114716756-pat00001
상기 링커는 하기 화학식 2로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112019114716756-pat00002
상기 벤질기는 하기 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 3]
Figure 112019114716756-pat00003
구체적으로, 상기 하나 이상의 뉴클레오티드 내 염기 구조의 피리미딘 기의 5번 탄소 위치에서 나프틸기로의 치환은, 상기 피리미딘 기의 5번 탄소 위치에서 5-(N-나프틸메틸카르복시아미드)-2'-디옥시우리딘(5-(N-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)로의 치환인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 글리피칸-3 특이적 압타머는 혈청 내 안정성 증진을 위하여, 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두가 변형되어 혈청 내 안정성이 증진된 것일 수 있다. 상기 변형은 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 압타머의 3' 말단에 idT를 결합시킨 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 상기 글리피칸-3 특이적 압타머는 글리피칸-3에 특이적으로 결합하여 세포 내재화를 유도할 수 있다.
본 발명에서, 용어, "변형 압타머"는 전술한 핵산 압타머 및 항암제를 포함하는 압타머를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "항암제"는 폐암(예, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종), 중피종, 췌장암(예, 췌관암, 췌장 내분비 종양), 인두암, 후두암, 식도암, 위암(예, 유두 선암, 점액성 선암, 선편평상피암종), 십이지장암, 소장암, 대장암(예, 결장암, 직장암, 항문암, 가족성 대장암, 유전성 비용종증 대장암, 소화관 간질 종양), 유방암(예, 침윤성 유관암, 비침윤성 유관암, 염증성 유방암), 난소암(예, 상피성 난소암종, 고환외 배세포 종양, 난소성 배세포 종양, 난소 저악성도 종양), 고환 종양, 전립선암(예, 호르몬-의존성 전립선암, 호르몬-비의존성 전립선암), 간암(예, 간세포암, 원발성간암, 간외 담관암), 갑상선암(예, 갑상선 수질암종), 신장암(예, 신세포암종, 신우와 요관의 이행 상피암종), 자궁암(예, 자궁경부암, 자궁체암, 자궁 육종), 뇌종양(예, 수모세포종, 신경교종, 송과체 성세포종양, 모양세포성 성세포종, 미만성 성세포종, 퇴형성성 성세포종, 뇌하수체 선종), 망막모세포종, 피부암(예, 기저세포암, 악성 흑색종), 육종(예, 횡문근육종, 평활근육종, 연조직 육종), 악성 골종양, 방광암, 혈액암(예, 다발성 골수종, 백혈병, 악성 림프종, 호지킨병, 만성 골수 증식 질환), 원발 미상 암 등, 말초 신경 장애를 부작용으로서 야기하는 암의 예방제 및 치료제를 포함한다. 상기 항암제의 예로는 젬시타빈(Gemcitabine)(젬시타빈주), 사이타라빈(Cytarabine), 카르보플라틴(Carboplatin)(파라플라틴), 시스플라틴(Cisplatin)(플라티놀, 플라티놀-AQ), 크리조티닙(Crizotinib)(잘코리), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)(시톡산, 네오사르), 도세탁셀(Docetaxel)(탁소티어), 독소루비신(Doxorubicin)(아드리아마이신), 엘로티닙(Erlotinib)(타르세바), 에토포사이드(Etoposide)(베페시드), 플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 이마티닙 메실레이트(Imatinib mesylate)(글리벡), 이리노테칸(irinotecan)(캄토사르), 리포좀-캡슐화된 독소루비신(독실), 메토트렉세이트(Methotrexate)(폴렉스, 멕세이트, 아메토프테린), 파클리탁셀(Paclitaxel)(탁솔, 아브락산), 소라피닙(Sorafenib)(넥사바), 수니티닙(Sunitinib)(수텐트), 토포테칸(Topotecan)(하이캄틴), 트라벡티딘(Trabectedin)(욘델리스), 빈크리스틴(Vincristine)(온코빈, 빈카사르 PFS), 및 빈블라스틴(Vinbrastine)(벨반) 등이 있으나, 이에 제한되지 않고 공지되어 있는 항암제라면 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 항암제는 젬시타빈, 사이타라빈, 카르보플라틴, 시스플라틴, 크리조티닙, 시클로포스파미드, 도세탁셀, 독소루비신, 엘로티닙, 에토포사이드, 플루오로우라실, 이마티닙 메실레이트, 이리노테칸, 리포좀-캡슐화된 독소루비신, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 소라피닙, 수니티닙, 토포테칸, 트라벡티딘, 빈크리스틴, 및 빈블라스틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있고, 보다 구체적으로 젬시타빈일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항암제는 상기 변형 압타머에 1개 이상 결합되는 것일 수 있으며, 구체적으로는 2개 이상 결합되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 3개 이상 결합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항암제는 상기 압타머의 5' 말단, 3' 말단 또는 양 말단 중 어느 하나 이상의 말단에 공유결합, 이온결합, 금속결합, 반데르발스 결합 및 수소결합 중 어느 하나 이상의 화학결합을 통해 결합되거나, 상기 압타머의 염기서열 내 하나 이상의 염기가 치환되어 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 상기 변형 압타머는 압타머의 염기서열 내 하나 이상의 염기가 항암제로 치환되어 결합된 것일 수 있으며, 예를 들면, 변형 압타머의 염기서열 내 하나 이상의 시토신 또는 구아닌이 항암제로 치환되어 결합된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 항암제는 전술한 상기 압타머의 말단 또는 압타머 내 치환되는 염기 하나의 위치에 2개 이상이 연속하여 결합된 것일 수 있으며, 2개 이상 연속하여 결합 시, 항암제 간은 공유결합, 이온결합, 금속결합, 반데르발스 결합 및 수소결합 중 어느 하나 이상의 화학결합을 통해 결합될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 항암제는 상기 압타머의 염기서열 내 독립적으로 존재하는 1개 이상의 염기가 치환되어 결합된 것일 수 있고, 2개 이상의 염기가 치환되어 결합된 것일 수도 있다.
상기 독립적으로 존재하는 2개 이상의 염기가 치환된 경우에는 항암제가 연속 또는 불연속하여 치환될 수 있고, 항암제가 불연속하여 치환된 경우에는 상기 항암제 간의 화학결합은 이루어지지 않을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 바와 같이 압타머의 염기서열 내 하나 이상의 염기가 항암제로 치환된 변형 압타머는, 압타머의 말단에 항암제가 결합된 변형 압타머에 비해 생체내에서 항암제가 안정하게 존재하고, 글리피칸-3을 발현하는 간암세포에 내재화 후 압타머가 분해되어 항암제가 방출됨에 따라 암세포 특이적 항암효능을 나타내게 되므로 항암제의 무작위적인 세포사멸 및 이로 인한 부작용을 방지하고, 암세포 선택적인 세포사멸이 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 글리피칸-3 특이적 압타머는 서열번호 2 내지 서열번호 25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 변형 압타머의 제조방법을 제공하는 것이다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 변형 압타머는 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면, 일반적인 올리고뉴클레오티드 합성 방법, 핵산 압타머와 항암제를 반응시키는 방법 등으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 올리고뉴클레오티드 합성 방법은, 구체적으로, 핵산 압타머 합성 시 항암제를 염기 대신 첨가하여 압타머 서열 내 항암제를 포함하는 변형 압타머를 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 핵산 압타머와 항암제를 반응시키는 방법은, 구체적으로, 글리피칸-3에 특이적으로 결합하는 압타머 염기서열을 가지는 핵산 압타머를 준비하는 압타머 준비 단계; 및 상기 핵산 압타머와 항암제를 반응시켜 변형 압타머를 형성하는 변형 압타머 형성 단계를 포함하여 이루어지는 것일 수 있으며, 상기 변형 압타머 형성 단계는, 예를 들면, 핵산 압타머에 아세토니트릴(acetonitrile)에서 용해시킨 항암제와 활성제(activator)를 첨가하여 수 분 동안 반응시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 변형 압타머를 유효성분으로 포함하는, 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 약학 조성물은 간암의 "예방"(prevention) 및/또는 "치료"(treatment)의 용도를 갖는다. 예방적 용도에 있어, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명에 기술된 질환, 장애, 또는 상태를 가지고 있거나 발병 위험이 있는 것으로 의심되는 개체에 투여된다. 즉, 간암의 발병 위험이 있는 개체에게 투여될 수 있다. 치료적 용도에 있어, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명에 기술된 장애를 이미 앓고 있는 환자와 같은 개체에 본 발명에 기술된 질병, 장애, 또는 상태의 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기 위해 충분한 양으로 투여된다. 이러한 사용에 효과적인 양은 질환, 장애 또는 상태의 심각도 및 경과, 이전의 치료, 개체의 건강 상태와 약물에 대한 반응성, 및 의사 또는 수의사의 판단에 따라 달려있을 것이다.
본 발명의 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 간암의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용 가능하다. 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물이 간암이 발병하여 진행하였거나 발병할 수 있는 가능성이 높은 개체에게 투여되어, 간암의 발생을 막거나 발생의 정도를 완화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에서 유효성분인 글리피칸-3 특이적 변형 압타머는 약학 조성물 내에 100 nM 내지 500 nM의 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위보다 낮은 농도에서는 간암세포에 대한 글리피칸-3 선택적 항암효과가 나타나기에 충분하지 않을 수 있으며, 상기 농도 범위보다 높은 농도에서는 표피암세포에 대해 세포독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 글리피칸-3 특이적 압타머를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 간암 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "개체"는 간암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 제외한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물을 간암의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 간암의 의심 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 상기 약학적으로 유효한 양은 전술한 바와 같다.
본 발명의 약학 조성물은 간암을 예방 또는 치료 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 2 내지 서열번호 25 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는, 글리피칸-3에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머를 제공하는 것이다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 핵산 압타머를 유효성분으로 포함하는, 글리피칸-3 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 글리피칸-3 검출용 조성물은 전술한 핵산 압타머 외에도 핵산 압타머의 안정적인 보관 및 보존을 위한 당업계에 공지된 담체 및/또는 보존제, 안정제 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 핵산 압타머에는 검출가능한 표지가 부착될 수 있다. 압타머에 검출가능한 표지를 부착시킴으로 인하여, 표적 분자와 압타머의 결합 여부 및 결합 정도를 손쉽게 관찰 및 측정하는 것이 가능하다. 상기 검출가능한 표지는 당업계에 알려진 검출 방법에 의하여 검출될 수 있는 모이어티일 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다. 상기 검출가능한 표지는 예를 들면, 발색효소 (퍼옥시다제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타제 (alkalinephosphatase) 등), 형광물질 (FITC, RITC, 로다민 (rhodamine), 텍사스레드 (Texas Red), 플로레신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 퀀텀닷 (quantum dots)), 크로모포어 (chromophore), 시아닌 (Cyanine) 및 방사성 동위원소 (124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 구체적으로 상기 압타머의 5' 말단에 Cy5을 결합시킨 것일 수 있다.
상기 검출용 조성물은 기관, 조직, 세포를 비롯하여, 표적 분자, 표적 분자를 포함하는 표적 물질을 검출할 수 있고, 구체적으로 암세포 또는 종양과 연관되어 발현되는 표적 물질을 검출할 수 있으며, 보다 구체적으로 간암과 연관되어 발현되는 글리피칸-3를 포함하는 표적 물질을 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
즉, 상기 검출용 조성물은 글리피칸-3 이미징용인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 검출용 조성물은 세포 내 형광을 측정하여 세포를 검출할 수 있고, 이 때 상기 세포는 글리피칸-3를 발현하는 세포일 수 있으며, 보다 구체적으로 글리피칸-3를 발현하는 암세포일 수 있다. 상기 암세포는, 예를 들어, 간암 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
즉, 상기 검출용 조성물은 글리피칸-3를 이미징하여 간암을 진단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 간암의 진단 또는 예후에 필요한 정도를 제공하기 위하여, 검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 글리피칸-3의 함량을 검출하는 단계; 상기 함량 검출결과를 대조군 시료의 글리피칸-3의 함량 검출결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 유래 시료의 함량 수준에 변화가 있는 경우, 상기 대상체를 간암의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 글리피칸-3을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 시료는 개체에서 분리된 세포, 혈액, 체액 또는 조직을 포함하는 것일 수 있으며, 글리피칸-3를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 글리피칸-3 검출에 필요한 정보를 제공하는 방법은 본 발명의 압타머를 포함하는 검출용 조성물을 시료와 접촉시켜, 상기 압타머 및 시료 내 글리피칸-3의 복합체 형성을 확인함으로써, 글리피칸-3를 검출하고 글리피칸-3 검출에 필요한 정보를 제공하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 압타머 및 글리피칸-3의 복합체 형성은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법 (fluorometric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 흡광법(absorbance measurement), 분광법 (spectrometric method), 라만분광법(Raman spectroscopic method), 표면플라즈몬공명법 (surface plasmon resonance method), 간섭계법 (interferometric method), 육안측정법(visual assessment), 섬광계수법(scintillation counting method), 또는 효소면역측정법(Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay)에 의해 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태는 글리피칸-3 검출용 조성물을 포함하는, 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 글리피칸-3 특이적 변형 압타머는 글리피칸-3에 특이적으로 결합하여 간암세포 내에 세포 내재화되며, 압타머에 결합되어있는 항암제를 통해 항암 활성을 나타내므로, 정상 간세포에는 영향 없이 GPC3가 발현된 간암세포에만 선택적 항암효과를 가진다.
도 1은 GPC3 특이적 압타머 라이브러리의 단백질 결합 친화력을 나타낸 도이다. NT#는 뉴클레오티드 수(길이)를 의미한다. 농도별 단백질에서 가장 낮은 농도 2개는 제외하였다.
도 2는 GPC3 특이적 압타머 라이브러리 중 2428-12-10(40mer) 및 이의 서열을 일부 절단한 12-12(35mer)의 단백질 결합 친화력을 나타낸 도이다.
도 3은 젬시타빈이 결합된 12-10 변형 압타머의 모식도이다. 2차원 예측 프로그램상 화학적 치환여부는 표기되지 않아 일반 염기로 표시되었다.
도 4는 젬시타빈이 결합된 12-10 변형 압타머의 단백질 결합 친화력을 나타낸 도이다.
도 5는 젬시타빈이 결합된 12-10 변형 압타머의 항암효능을 나타낸 도이다.
도 6은 GPC3 특이적 압타머 라이브러리 중 2428-12-10(12-10)를 다양한 길이로 절단하여 제작한 압타머 라이브러리에 대한 세포 결합을 나타낸 도이다.
도 7은 GPC3 특이적 압타머 라이브러리 중 2428-12-10(12-10)를 다양한 길이로 절단하여 제작한 압타머 라이브러리에 대한 세포 내재화를 나타낸 도이다.
도 8은 젬시타빈이 결합된 12-12 변형 압타머의 모식도이다. 2차원 예측 프로그램상 화학적 치환여부는 표기되지 않아 일반 염기로 표시되었다.
도 9는 젬시타빈이 결합된 12-12 변형 압타머에 대한 세포 결합을 나타낸 도이다. 12-12는 12-12 압타머, SC는 스크램블된 12-12 압타머이다.
도 10은 젬시타빈 3개가 결합된 변형 압타머(12-12 G(3))에 대한 세포 내재화를 나타낸 도이다. 12-12는 12-12 압타머, SC는 스크램블된 12-12 압타머이다.
도 11은 젬시타빈 3개가 결합된 변형 압타머(12-12 G(3))에 대한 시간에 따른 세포 내재화를 나타낸 도이다. 12-12는 12-12 압타머, SC는 스크램블된 12-12 압타머이다.
도 12는 젬시타빈 3개가 결합된 변형 압타머(12-12 G(3))의 농도별(10 nM~1 uM) 따른 항암효능을 나타낸 도이다. 12-12는 12-12 압타머, Gemcitabine은 젬시타빈 단독이다.
도 13은 젬시타빈 3개가 결합된 변형 압타머(12-12 G(3))의 농도별(31.75 nM~2 uM) 따른 항암효능을 나타낸 도이다. 12-12는 12-12 압타머, Gemcitabine은 젬시타빈 단독이다.
도 14는 압타머 서열 내 염기의 치환 위치 및 대상(Nap-dU, C3 링커, 2-F, 2-O-Me)에 따른 단백질 결합 친화력 및 세포 결합을 나타낸 도이다.
도 15는 단백질 결합 친화력 및 세포 결합을 고려하여 화학적으로 최적화된 압타머 후보를 선별한 도이다.
도 16은 화학 최적화된 압타머 라이브러리의 세포 결합을 나타낸 도이다.
도 17은 화학 최적화된 압타머 라이브러리(Combi 6~10)의 세포 내재화를 나타낸 도이다.
도 18은 젬시타빈이 결합된 화학 최적화된 압타머 라이브러리에 대한 단백질 결합 친화력을 나타낸 도이다.
도 19는 젬시타빈이 결합된 화학 최적화된 압타머 라이브러리에 대한 세포 결합을 나타낸 도이다.
도 20은 화학 최적화된 압타머 라이브러리(combi 1~3)에 대한 세포 내재화를 나타낸 도이다. Control은 무처리, 1212는 12-12 압타머, SC는 스크램블된 12-12 압타머이다.
도 21은 젬시타빈이 3개 또는 5개 결합된 화학 최적화된 압타머 라이브러리(combi 4)에 대한 세포 내재화를 나타낸 도이다. Control은 무처리, 1212는 12-12 압타머, SC는 스크램블된 12-12 압타머이다.
도 22는 젬시타빈이 3개 또는 5개 결합된 화학 최적화된 압타머 라이브러리(combi 5)에 대한 세포 내재화를 나타낸 도이다. Control은 무처리, 1212는 12-12 압타머, SC는 스크램블된 12-12 압타머이다.
도 23은 젬시타빈이 3개 또는 5개 결합된 화학 최적화된 압타머 라이브러리(combi 4~5)에 대한 항암효능을 나타낸 도이다.
도 24는 젬시타빈이 3개 결합된 화학 최적화된 압타머(Combi 11 G(3))에 대한 항암효능을 나타낸 도이다.
도 25는 젬시타빈이 3개 또는 5개 결합된 화학 최적화된 압타머 라이브러리(combi 4~5)의 Hep3B에 대한 세포주기를 분석한 도이다.
도 26은 젬시타빈이 3개 또는 5개 결합된 화학 최적화된 압타머 라이브러리(combi 4~5)의 HepG2에 대한 세포주기를 분석한 도이다.
도 27은 젬시타빈이 3개 또는 5개 결합된 화학 최적화된 압타머 라이브러리(combi 4~5)의 A431에 대한 세포주기를 분석한 도이다.
도 28은 화학 최적화된 압타머 라이브러리(12-12, combi 5 G(3))에 대한 마우스 혈청 안정성을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1. GPC3 특이적 압타머 선별
1-1. 단백질 결합 친화력(binding affinity) 분석
GPC3에 특이적일 것으로 예상되는 압타머 라이브러리 7개[2428-12-09, 2428-12-10, 2428-12-11, 2424-30-01, 2424-30-05, 2424-30-06, 2424-30-07, 모두 40 mer] 중에서 GPC3에 가장 특이적으로 결합하는 압타머를 선별하기 위해 RI(Registered Importer) 표지를 통한 단백질 결합 어세이(binding assay)를 수행하였다. 구체적으로, 각 후보 압타머 서열의 올리고뉴클레오티드 3' 부분에 RI 표지 및 비표지된 올리고뉴클레오티드 부분을 제거하기 위해, 플레이트에 α-32P 0.25 ul, 말단데옥시뉴클레오티딜전이효소(DNA nucleotidylexotransferase 또는 terminal transferase) 0.25 ul, 10X NEB 완충액 1 ul(New England Biolabs, USA), CoCl2 1ul, 주형(압타머 서열) 7.5 ul (총 10 ul)을 넣고 호일(Foil)로 플레이트를 밀봉한 후 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다(효소 인큐베이션). 다시 70 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션한 후(효소 인큐베이션), 인큐베이션한 각 시료를 30 ul의 증류수로 희석하였다. 마이크로스핀(Microspin) G-50 컬럼의 아래 부분을 제거하고 튜브(tube)를 씌웠다. 800 rcf로 1 분 동안 회전시킨 후, 튜브를 제거하였다. 레진(resin)에 시료를 넣고 상온에서 800 rcf로 2 분간 회전시켰다.
RI 표지 및 비표지된 올리고뉴클레오티드 부분이 제거된 압타머를 100 ul의 1X SB18T0,05로 20,000 cpm까지 희석하였다. 95 ℃에서 5 분 동안, 이어서 37 ℃에서 15 분 동안 압타머를 가열 및 냉각시켰다. 단백질(GPC3) 100 nM을 4.64 배로 순차 희석(serial dilution)하여 총 8 포인트로 각 웰에 30 ul씩 첨가하였다. 가열 및 냉각이 끝난 압타머에 200 ul의 1X SB18T0.05를 첨가한 후 이를 각 웰에 30 ul씩 넣어 총 60 ul가 되도록 하였다. 압타머 2 ul을 대조군(input control)으로 나일론 필터에 떨어뜨렸다. 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 동안 1X SB18T0.05 30 ul를 필터 플레이트에 미리 넣었다. 인큐베이션 후 조백스(Zorbax) 레진을 5.5 ul 넣고, 1400 rpm에서 1 분 동안 반응시켰다. 조백스-단백질-압타머(Zorbax-protein-aptamer)를 필터 플레이트에 넣고 흡입(suction) 후 1X SB18T0.05 200 ul로 세척하였다. 나일론 필터를 노출시키고, 필터 플레이트를 인광체이미지기(phosphorimager)에서 17 시간 동안 밤새 스크리닝하였다. 스크린을 분석하고, 각 단백질 농도에 따른 결합 정도를 도출하였다(percentage bound 값).
그 결과, 도 1과 같이 단백질 농도가 높을수록 많은 압타머가 결합한 것으로 나타났으며, 후보 중 2428-12-10가 최대 결합 능력(maximum binding capacity, Bmax) 0.79, 해리 상수(dissociation constant, Kd) 1.50으로 가장 우수한 결합력을 나타내었다.
가장 우수한 결합력을 나타낸 2428-12-10(이하, 12-10으로 명명, 40 mer, 서열번호 1) 압타머 및 이의 서열을 일부 절단한 12-12(35mer) 압타머에 대한 결합 친화력을 상기의 방법으로 확인하였다. 구체적으로, GPC3에 시아닌5(Cy5) NHS 에스테르(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)를 결합시켜 GPC3-Cy5를 제조하였다. Cy5 합성은 일반적인 올리고뉴클레오티드 합성과 동일한 방법으로 합성하였다. 합성된 최종 분말에 최소량의 물(약 50㎕)을 첨가하여 재현탁하고, 이후 GPC3-Cy5 100 nM을 4.64 단계로 순차 희석하고 각 단백질 농도에 따른 결합 정도를 도출하였다.
그 결과, 도 2와 같이 단백질 농도가 높을수록 많은 압타머가 결합한 것으로 나타났으며, 12-10와 12-12의 Kd값이 유사하게 나타난 것을 확인하였다.
1-2. GPC3 특이적 압타머 및 변형 압타머의 단백질 결합 친화력 분석
12-10(40 mer) 압타머에 항암제가 결합된 변형 압타머를 제조하였다. 변형 압타머는 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 이용하여 제조하였으며, 올리고뉴클레오티드 합성 시 압타머 서열 내 염기 2개가 항암제[젬시타빈, gemcitabine(2',2'-difluoro 2'deoxycytidine)]로 치환되도록 하여 변형 압타머를 형성시켰다. 이때, 젬시타빈이 치환되는 위치는 젬시타빈이 치환되어도 압타머의 구조형성에 영향이 없을 자리를 예측하여 염기서열 C 또는 G 중에서 선정 후, 3'-말단, 루프(Loop), 5'-말단(end) 또는 염기쌍(Pair) 부분에 젬시타빈이 2개씩 각각 치환되어 결합된 12-10 G(2) 압타머(서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5)(도 3)를 제조하였다(도 3). 상기 압타머 서열은 하기 표 1과 같았다.
서열번호 명칭 서열
1 12-10 GGGAAGnGAAnGCGnnGAAnnAnGnCCCnnCAGnCAnCAC
2 12-10 G(2)3’ GGGAAGnGAAnGCGnnGAAnnAnGnCCCnnCAGnCAnCASSA
3 12-10 G(2)L GGGAAGnGAAnGCGnnGAAnnAnGnSSCnnCAGnCAnCAC
4 12-10 G(2)5’ SSGAAGnGAAnGCGnnGAAnnAnGnCCCnnCAGnCAnCAC
5 12-10 G(2)P GGGAAGnGAAnGCGnnGAAnnAnGnCCCnnCAGnSAnSAC
상기 서열에서 n으로 표시되는 염기는 디옥시우리딘의 피리미딘 기의 5번 탄소 위치에 벤질기가 도입된 염기(BzdU)로서, 상기 화학식 3으로 표시된다. S로 표시되는 염기는 젬시타빈이 치환된 염기이다.
이후, 제조된 12-10 G(2) 변형 압타머(서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5) 및 대조군으로 12-10에 대하여 실시예 1-1의 방법에 따라 단백질 결합 친화력을 분석하였다.
그 결과, 도 4와 같이 젬시타빈의 위치에 따라 결합 친화력이 달라지는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과에 따라 염기쌍 부분과 5' 말단은 젬시타빈으로 치환될 경우 단백질과의 결합력에 영향을 주는 위치임을 확인하였다.
1-3. GPC3 특이적 압타머 및 변형 압타머의 항암효능 분석
12-10 G(2) 변형 압타머 100 μM(서열번호 2, 서열번호 3) 및 대조군으로 무처리군(12-10), 젬시타빈 개수를 맞추기 위해 2배 농도인 200 nM의 젬시타빈을 단독 처리한 젬시타빈 처리군이 간세포에 선택적 항암효능을 나타내는지 확인하기 위해, 세포독성을 분석하였다. 구체적으로, Huh-7 세포(ATCC, Rockville, MD, USA)를 96 웰 플레이트에 1x104/ml로 시딩하고, 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA)와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 포함된 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA)배지를 사용하여 5% CO2, 37 ℃ 조건 하에 배양하였다. 다음날 압타머 스톡(100 μM)을 5X SB18 완충액과 혼합하여 80 μM로 제조한 후 95 ℃에서 5 분 가열하고 상온에서 15 분 이상 냉각하였다. 배양한 세포에서 배지를 제거하고 무혈청 배지 100 μl를 첨가한 후 37 ℃에서 1 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 무혈청 배지를 제거한 후 1X PBS 100 μl로 세척하였다. KRPH 완충액 100 μl을 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 압타머를 원하는 농도의 2배가 되도록 KRPH 완충액으로 희석한 후 1X가 되도록 96 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃에서 4 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 압타머 처리 후 KRPH 완충액을 제거하고 후 배양배지 100 μl를 넣고 37 ℃에서 3일 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 6일 후 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 키트 용액 10 μl씩을 각 웰에 넣어준 후 37 ℃에서 3 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 마이크로플레이트리더기로 450 nM에서 세포 사멸 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 5와 같이 3' 말단과 루프 부분에 결합된 복합체의 세포사멸효능은 거의 유사하게 나타났으며, 젬시타빈에 의한 항암효능이 잘 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 길이 최적화된 GPC3 특이적 압타머 선별
2-1. 세포 결합(cell binding) 분석
12-10 압타머 및 12-10 압타머를 다양한 길이로 절단하여 제작한 압타머 라이브러리 5개[12-10(40 mer), 12-12(35 mer), 12-11(29 mer), 12-13(24 mer), 12-14(23 mer), 12-15(18 mer)]에 대하여 세포 결합력을 분석하였다. 각 압타머 서열들은 실시예 1-1의 방법에 따라 5' 말단에 Cy5를 표지하였다. 100 mm2 배양접시에 Huh-7 세포(ATCC, Rockville, MD, USA) 2x106/ml를 시딩하고, 10% FBS(Gibco, Grand Island, NY, USA)와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 포함된 DMEM 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 5% CO2, 37 ℃ 조건 하에 배양하였다. 압타머 스톡 5 μM과 5X SB18 완충액을 혼합하여 압타머 4 μM을 만든 후 95 ℃에서 5 분간 가열하고 상온에서 15 분 이상 냉각하였다. 압타머 4 μM을 KRPH 완충액(HEPES 20 mM, KH2PO₄ 5 mM, MgSO₄ 1 mM, CaCl₂ 1 mM, NaCl 136 mM, KCl 4.7 mM, pH 7.4)에서 25 nM로 희석하였다. 배양한 세포의 배양액을 제거하고 PBS(Phosphate-buffered saline) 4 ml을 넣고 세척 후 PBS 4ml을 제거하였다. 다시 차가운 PBS 또는 따뜻한 PBS 4ml을 넣고 스크래퍼(scraper)로 세포를 긁어서 각각 튜브에 모아준 후 피펫팅(pipetting)하였다. 시료 수만큼 FACs(Fluorescence-activated cell sorting) 튜브에 나눠서 첨가한 후 4 ℃에서 2000 rpm, 4 분동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 KRPH 완충액 15 ml에 25 nM 압타머 및 대조군(31-08(40 mer) 압타머)을 각각 500 ul씩 넣고 피펫팅하였다. 호일로 튜브 바깥쪽을 감싸 빛을 차단한 후 4 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 4 ℃에서 2000 rpm, 4 분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 차가운 1x PBS 2 ml을 넣고 세척하고 4 ℃에서 2000 rpm, 4 분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하는 과정을 3회 반복하였다. 3회째 상층액 제거 후, 1 ~ 2 ml FACs 완충액(1% BSA, 1X PBS)에 넣고 FACs 튜브에 옮겨 얼음 위에 두었다. 650-670 nm에서 Cy5를 측정하였다.
그 결과, 도 6과 같이 12-12(35 mer)의 세포 결합력이 가장 우수한 것을 확인하였다.
2-2. 세포 내재화(internalization) 분석
12-10 압타머를 다양한 길이로 절단하여 제작한 압타머 5개[12-12(35 mer), 12-11(29 mer), 12-13(24 mer), 12-14(23 mer) 및 12-15(18 mer)]에 대하여 세포 내재화를 분석하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트를 준비하고 동그란 커버 글래스(cover glass)를 6 웰 플레이트 안에 두었다. 실시예 1-3의 방법에 따라 Huh-7 세포를 6 웰 플레이트에 배양하였다. 압타머 스톡 5 μM과 5X SB18 완충액을 혼합하여 압타머 4 μM을 만든 후 95 ℃에서 5 분간 가열하고 상온에서 15 분 이상 냉각하였다. 다음날 배양한 세포에서 배지를 제거한 후 무혈청 배지를 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 무혈청 배지를 제거하고 1X PBS 2 ml을 넣고 세척하였다. KRPH 완충액을 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 4 μM 압타머를 25 nM가 되도록 희석한 후, 37 ℃에서 1시간 또는 4시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 1X PBS 2 ml로 3회 반복 세척하였다. 세척은 교반기(shaker)에서 빛을 차단한 상태로 상온에서 10 분 동안 수행하였다. 이후, 4 ℃에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 처리하여 고정하였다. 1X PBS 2 ml을 이용하여 3회 반복 세척하였다. 투과화(Permeabilization) 용액(0.2% Triton X-100 in 1X PBS)을 넣고 상온에서 15 분 동안 인큐베이션한 후, 1X PBS 2 ml로 3회 반복 세척하였다. 블로킹(Blocking) 용액(3% BSA, 1X PBS)을 넣고 37 ℃에서 20 분 동안 5% CO2 조건에서 인큐베이션하였다. 1X PBS 2 ml로 1회 세척하였다. 150 nM 리소트래커(Lysotracker)를 포함하는 블로킹(Blocking) 용액을 처리한 후 37 ℃에서 1시간 동안 5% CO2 조건에서 인큐베이션하였다. 1X PBS 2 ml로 3회 반복 세척하고, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색하였다. 커버 글래스를 조심스럽게 떼서 매니큐어 처리하였다.
그 결과, 도 7과 같이 12-12(35 mer)의 세포 내재화가 가장 우수한 것을 확인하였다.
2-3. GPC3 특이적 압타머 및 변형 압타머의 세포 결합 및 세포 내재화 분석
GPC3에 대한 결합 친화력, 세포 결합 및 세포 내재화가 우수한 것으로 확인된 12-12(35 mer) 압타머에 실시예 1-2의 방법에 따라 항암제를 결합시켜, 젬시타빈이 3, 5, 7개씩 각각 치환되어 결합된 12-12 G(3), 12-12 G(5), 12-12 G(7) 압타머(서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9)를 제조하였다(도 8). 각 라이브러리의 3' 말단에는 idT가 부착되어 합성되었다.
이후, 12-12 G(3), 12-12 G(5), 12-12 G(7) 압타머 및 대조군으로 무처리군(3' 말단에 idT가 부착된 12-12, 서열번호 6), 12-12-Cy5, 스크램블된 12-12(Scrambled 35 mer)에 대하여 실시예 2-1의 방법에 따라 세포 결합을 분석하였다. 상기 압타머 서열은 하기 표 2와 같았다.
서열번호 명칭 서열 3'
6 12-12 GnGAAnGCGnnGAAnnAnGnCCCnnCAGnCAnCAC idT
7 12-12 G(3) GnGAAnGCGnnGAAnnAnGnSSSnnCAGnCAnCAC idT
8 12-12 G(5) GnGAAnGSGnnGAAnnAnGnSSSnnCAGnCAnCAS idT
9 12-12 G(7) GnGAAnGSSnnGAAnnAnSnSSSnnCAGnCAnCAS idT
상기 서열에서 n으로 표시되는 염기는 디옥시우리딘의 피리미딘 기의 5번 탄소 위치에 벤질기가 도입된 염기(BzdU)로서, 상기 화학식 3으로 표시된다. S로 표시되는 염기는 젬시타빈이 치환된 염기이다.
그 결과, 도 9와 같이 젬시타빈 3개가 결합된 변형 압타머가 가장 우수한 세포 결합을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 젬시타빈 3개가 결합된 변형 압타머 12-12 G(3) 및 대조군으로 12-12 압타머, 스크램블된 12-12(SC)에 대하여 실시예 2-2의 방법에 따라 세포 내재화를 분석하였다.
그 결과, 도 10과 같이 젬시타빈 3개가 결합된 변형 압타머 12-12 G(3)의 세포 내재화가 우수한 것을 확인하였으며, 도 11과 같이 내재화 시작 후 1, 2, 4 시간 뒤 확인한 결과에서도 젬시타빈 3개가 결합된 변형 압타머 12-12 G(3)의 세포 내재화가 우수한 것을 확인하였다.
본 실시예의 결과에서 젬시타빈의 개수가 증가할수록 세포 결합력이 낮아지는 것을 확인하였다.
2-4. GPC3 특이적 압타머 및 변형 압타머의 항암효능 분석
단백질 결합 친화력, 세포 결합 및 세포 내재화가 우수한 것으로 확인된 변형 압타머 12-12 G(3) 및 대조군으로 무처리군, 12-12 단독, 젬시타빈 단독이 간암세포 및 표피암세포에 대해 GPC3 선택적 항암효능을 나타내는지 확인하기 위해, 세포독성을 분석하였다. 구체적으로, HepG2, Hep3B 및 A431 세포(ATCC, Rockville, MD, USA)를 96 웰 플레이트에 1x104/ml로 시딩하고, 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA)와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 포함된 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA)배지를 사용하여 5% CO2, 37 ℃ 조건 하에 배양하였다. 다음날 압타머 스톡(100 μM)을 5X SB18 완충액과 혼합하여 80 μM로 제조한 후 95 ℃에서 5 분 가열하고 상온에서 15 분 이상 냉각하였다. 배양한 세포에서 배지를 제거하고 무혈청 배지 100 μl를 첨가한 후 37 ℃에서 1 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 무혈청 배지를 제거한 후 1X PBS 100 μl로 세척하였다. KRPH 완충액 100 μl을 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 압타머를 원하는 농도의 2배가 되도록 KRPH 완충액으로 희석한 후 1X가 되도록 96 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃에서 4 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 압타머 처리 후 KRPH 완충액을 제거하고 후 배양배지 100 μl를 넣고 37 ℃에서 6일 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 6일 후 CCK-8 키트 용액 10 μl씩을 각 웰에 넣어준 후 37 ℃에서 3 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 마이크로플레이트리더기로 450 nM에서 세포 사멸 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 12와 같이 10 nM 내지 1 uM 농도의 젬시타빈 3개가 결합된 변형 압타머 12-12 G(3)는 10 nM 내지 1 uM 농도의 12-12 또는 30 nM 내지 3uM 농도의 젬시타빈에 비해 HepG2 세포사멸 효과가 우수하였으며, 표피암세포인 A431에 대해서는 세포사멸을 나타내지 않았다.
또한, 도 13과 같이 31.75 nM 내지 2 uM 농도의 젬시타빈 3개가 결합된 변형 압타머 12-12 G(3)는 동일한 농도의 12-12 또는 젬시타빈에 비해 HepG2 세포사멸 효과가 우수하였으며, 표피암세포인 A431에 대해서는 세포사멸을 나타내지 않았다.
실시예 3. 화학 최적화된 GPC3 특이적 압타머 선별
3-1. 염기가 치환된 압타머 라이브러리 제작
GPC3에 대한 결합 친화력, 세포 결합 및 세포 내재화가 우수한 것으로 확인된 12-12(35 mer) 압타머를 화학적으로 최적화하기 위해, 압타머 서열 내에 치환을 도입하였다. 구체적으로, 압타머 서열 내에 Nap-dU를 도입한 라이브러리 12개, C3 링커를 도입한 라이브러리 11개, 2-F를 서열 중 염기 G에만 도입한 라이브러리 7개, 2-F를 서열 중 염기 C에만 도입한 라이브러리 7개, 2-F를 서열 중 염기 A에만 도입한 라이브러리 8개, 2-O-Me을 서열 중 염기 G에만 도입한 라이브러리 7개, 2-O-Me을 서열 중 염기 C에만 도입한 라이브러리 7개, 2-O-Me을 서열 중 염기 A에만 도입한 라이브러리 8개를 제작하였다. 각 라이브러리의 5' 말단에는 Cy5, 3' 말단에는 idT가 부착되어 합성되었다.
3-2. 염기가 치환된 압타머 라이브러리에 대한 단백질 결합 친화력 분석
실시예 3-1의 압타머 라이브러리의 단백질 결합 친화력을 분석하기 위해 Nap-dU, 2-F, 2-O-Me를 도입한 라이브러리에 대해 qPCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction) 결합 어세이, C3 링커를 도입한 라이브러리에 대해 MST(Microscale Thermophoresis) 어세이를 수행하였다. 구체적으로, qPCR을 이용한 단백질 결합 어세이는 qPCR 마스터 믹스[최종 농도 기준: 1X KOD 완충액, 0.2 mM dNTP, 0.2 uM 5', 3' 프라이머, 5 mM MgCl2, 1X SYBR 그린, 0,025U/ul KOD 폴리머라아제, D.W.(KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix, Sigma, Madrid, Spain)]를 이용하여 수행하였다. 압타머(20 nM) 5 ul와 1X SB18T0.05 95 ul를 혼합하여 농도가 10 fmole(1010 카피)인 압타머를 준비하고, 95 ℃에서 5 분, 70 ℃에서 5 분, 48 ℃에서 5 분, 이후 37 ℃에서 방치하여 가열 및 냉각하였다. GPC3 100 nM을 4.64 배 순차희석한 총 8 포인트를 각 웰에 30 ul씩 첨가하였다. 가열 및 냉각된 압타머에 1X SB18T0.05 200 ul을 첨가한 후 이를 각 웰에 30 ul씩 넣어, 웰당 함유된 GPC3 및 압타머가 총 60 ul이 되도록 하였다. 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하여 GPC3 및 압타머 간 결합이 일어나도록 반응시켰다. 인큐베이션 후 10 mg/ml의 TALON 비드(bead)(Clontech)를 5.5 ul씩 각 웰에 넣고, 1400 rpm에서 5 분간 반응시켰다. 필터 플레이트에 반응시킨 TALON 비드-GPC3-압타머 혼합물을 넣고 흡입시켰다. 이후, 1X SB18T0.05 200 ul로 세척 후 SB18T0.05 완충액을 제거하였다. 필터 플레이트에 남은 완충액을 제거하기 위해 필터 플레이트 아래에 딥 웰 플레이트(deep well plate)를 끼운 후, 1000 rpm에서 1 분 동안 원심분리하였다. 새로운 딥 웰 플레이트에 8mM HCl 20 ul을 첨가하고 원심분리했던 필터 플레이트를 끼웠다. 필터 플레이트에 20 mM NaCl 80 ul을 첨가한 후 1000 rpm에서 5 분 동안 반응시키고, 이후 1000 rpm에서 2 분 동안 원심분리하여 압타머를 용리(elution)시켰다. 용리된 압타머를 1010 카피가 되도록 농도를 맞춘 후 1010 카피부터 108 카피까지 10배씩 3.2 mM NaCl을 이용하여 희석시키고 각 농도의 압타머(1010 카피, 109 카피, 108 카피)를 qPCR 플레이트의 웰의 두번째 줄에 각각 10 ul 첨가하였다. 각 단백질과 결합시키지 않은 순수 압타머(standard) 1010 카피, 109 카피, 108 카피를 qPCR 플레이트의 웰의 첫번째 줄에 각각 10 ul 첨가하였다. 이후, qPCR 혼합물을 모든 웰에 10 ul씩 첨가하여, 웰 내 총 부피가 20 ul가 되도록 한 후 qPCR을 수행하였다. qPCR 조건은 96 ℃에서 45 초, 55 ℃에서 10 초, 70 ℃에서 1 시간 동안 1회, 이후 96 ℃에서 15 초, 70 ℃에서 1 분 동안 40 회 반복하였다. 이후, 실시예 1-1의 방법에 따라 Bmax 및 Kd 값을 산출하였다.
MST를 수행하기 위해, 5 uM 압타머 24 ul과 5X SB18 완충액 6 ul을 혼합하여 4 uM 압타머 30 ul을 제조한 후, 95 ℃에서 5 분 동안, 이후 상온에서 10 분 동안 가열 및 냉각하였다. 압타머의 5' 말단에 Cy5를 표지하고, 1X SB18T0.05 완충액을 이용하여 표지된 압타머를 4 nM, GPC3를 200 nM 농도로 각각 희석하였다. 200 nM GPC3 10 ul을 새 PCR 튜브에 20 ul씩 배분하고 1X SB18T0.05 완충액을 이용하여 1/2 순차희석하였다. 희석된 GPC3에 4 nM 압타머를 10 ul씩 첨가하여, 총 20 ul이 되도록 하였다. 20 ul의 GPC3-압타머 혼합물을 MST 모세관(capillary)에 투여하고 모세관 스캔(Start capillary scan)을 이용하여 적정한 형광값을 결정한 후, MST를 측정하고 Kd 및 Kd 컨피던스(confidence) 값을 도출하였다.
그 결과, 도 14와 같이, 12-12(35 mer) 압타머 라이브러리의 단백질 결합 친화력이 확인되었다.
3-3. 화학 최적화된 압타머 라이브러리 선별
실시예 3-2의 결과와 실시예 3-1의 압타머 라이브러리에 대해 실시예 2-1의 방법에 따라 HepG2 세포 결합을 분석한 결과를 종합하고, 단백질 결합 친화력 및 세포 결합을 고려하여 압타머 서열 내 염기의 치환 위치 및 대상(Nap-dU, C3 링커, 2-F, 2-O-Me)을 도출하고, 우수한 단백질 결합 친화력 및 세포 결합을 나타낼 수 있을 것으로 예상되는 압타머 라이브러리 10개(combi 1~10, 서열번호 10~19)를 선별하였다(도 15).
선별된 압타머 중 combi 1~5에 대하여 실시예 2-1의 방법에 따라 세포 결합 분석 및 실시예 2-2의 방법에 따라 세포 내재화 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 16과 같이 HepG2에서 combi 5의 세포 결합이 12-12와 가장 유사한 것을 확인하였으며, 도 17a와 같이 Hep3B 세포에서 combi 5의 세포 내재화가 가장 많이 이루어진 것을 확인하였다. combi 4에서도 우수한 세포 내재화가 확인되었다. 또한, 도 17b와 같이 Combi 6~10번에서 세포내재화를 확인하였다. 또한 Combi 6~10번에서 GPC3가 많이 발현된 간암 특이적 세포(HepG2, Hep3B)의 선택적인 세포 내재화가 일어나는 것을 확인하였으며, GPC3의 발현이 낮은 A431세포에는 세포 내재화가 나타나지 않았다. 그 중 Combi 8과 Combi 9에서 세포 내재화가 가장 많이 일어난 것을 확인하였다.
실시예 4. 화학 최적화된 GPC3 특이적 변형 압타머 선별
4-1. 단백질 결합 친화력, 세포 결합, 세포 내재화 및 항암효능 분석
우수한 단백질 결합 친화력 및 세포 내재화가 확인된 압타머 라이브러리 combi 4, 5 및 8에 실시예 1-2의 방법에 따라 항암제를 결합시켜 변형 압타머를 제조하였다. 구체적으로, combi 4, 5 및 8에 젬시타빈을 3 또는 5개 결합시켜 변형 압타머를 제조하였다. 또한, 압타머 서열 내 염기의 일부가 메톡시에틸(Methoxyethyl, MOE)로 치환된 압타머 라이브러리(서열번호 20)에 젬시타빈을 3개 결합시켜 변형 압타머를 제조하였다. 상기 압타머 서열은 하기 표 3과 같았다.
서열번호 명칭 서열 3'
10 Combi 1 GnGAFAFnGCGnnGFAFAnnAnGnCFCFCFnnCAGnCAnCAC idT
11 Combi 2 GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAFnnAFnGYCFCFCFnnCAGMenCAnCMeAMeCF idT
12 Combi 3 GnGAFAFnGCGnnGFAFAMennAMenWnCFCFCFnnCAGFnCAnCAC idT
13 Combi 4 GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAFnnAFnGYCFCFCFnnCAGMenCAnCFAMeCF idT
14 Combi 5 GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAMennAMenWYCFCFCFnnCAGMenCAnCFAMeCF idT
15 Combi 6 GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAMennAMenGYCFCFCFnnCAGMenCAnCFAMeCF idT
16 Combi 7 GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAMennAMenGnCFCFCFnnCAGMenCAnCFAMeCF idT
17 Combi 8 GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAMennAMenWnCFCFCFnnCAGMenCAnCFAMeCF idT
18 Combi 9 GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAnnAnGnCFCFCFnnCAGMenCAnCFAMeCF idT
19 Combi 10 GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAFnnAFnGnCFCFCFnnCAGMenCAnCFAMeCF idT
20 Combi 11 G(3) GmoenGmoeAFAFnGCGnnGFAFAmoennAmoenWYSSSnnCAGmoenCAnCFAmoeCF idT
21 Combi 4 G(3) GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAFnnAFnGYSSSnnCAGMenCAnCFAMeCF idT
22 Combi 5 G(3) GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAMennAMenWYSSSnnCAGMenCAnCFAMeCF idT
23 Combi 8 G(3) GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAMennAMenWnSSSnnCAGMenCAnCFAMeCF idT
24 Combi 4 G(5) GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAFnnAFnGYSSSnnCAGMenCAnSAMeS idT
25 Combi 5 G(5) GMenGMeAFAFnGCGnnGFAFAMennAMenWYSSSnnCAGMenCAnSAMeS idT
상기 서열에서 Me로 표시된 염기는 2번 탄소 위치에 -Me(메톡시)기가 도입된 염기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA)이다. F로 표시된 염기는 2번 탄소 위치에 -F(불소)기가 도입된 염기(2-F, 2-Fluorine-DNA)이다. moe로 표시되는 염기는 2번 탄소 위치에 -moe(메톡시에틸)기가 도입된 염기(2-moe, 2-Methoxyethyl-DNA)이다. Y로 표시된 염기는 피리미딘 기의 5번 탄소 위치에 5-(N-나프틸메틸카르복시아미드)-2'-디옥시우리딘(5-(N-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)가 도입된 염기(Nap-dU)로서, 상기 화학식 1로 표시된다. W로 표시되는 염기는 3번 탄소 위치에 링커(C3 linker)가 도입된 염기(C3 linker-DNA)로서, 상기 화학식 2로 표시된다. n으로 표시되는 염기는 디옥시우리딘의 피리미딘 기의 5번 탄소 위치에 벤질기가 도입된 염기(BzdU)로서, 상기 화학식 3으로 표시된다. S로 표시되는 염기는 젬시타빈이 치환된 염기이다.
제조된 변형 압타머에 대하여 실시예 3-2의 방법에 따라 MST을 이용한 단백질 결합 분석, 실시예 2-1의 방법에 따라 세포 결합 분석 및 실시예 2-2의 방법에 따라 HepG2, A431에서 세포 내재화 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 18과 같이 combi 4 및 5에 젬시타빈을 3개 결합시켰을 경우 Kd는 12-12 압타머와 유사한 수준이었으나, 젬시타빈을 5개 결합시켰을 경우에는 결합력이 낮은 것으로 나타났다.
또한, 도 19와 같이 combi 4 및 5에 젬시타빈을 3개 결합시켰을 경우가(Combi 4 Gem(3), Combi 5 Gem(3)) 5개 결합시켰을 경우(Combi 4 Gem(5), Combi_5 Gem(5))보다 세포 결합력이 우수하였으며, combi 4와 combi 5간의 세포 결합력을 비교해보면, 젬시타빈이 결합되지 않았을 때의 세포 결합력과 마찬가지로, combi 5에서 세포 결합력이 우수하였다. 도 20 내지 도 22에서도 젬시타빈을 3개 결합시킨 combi 4 및 5(Combi_4 Gemcitabine(3), Combi_5 Gemcitabine(3))에서 우수한 세포 내재화가 확인되었다.
젬시타빈을 3 또는 5개 결합시킨 combi 4 및 5, 젬시타빈이 3개 결합된 combi 11이 간암세포 및 표피암세포에 대해 GPC3 선택적 세포사멸효능을 나타내는지 확인하기 위해, 실시예 1-3의 방법에 따라 세포사멸효능을 분석하였다.
그 결과, 도 23과 같이 젬시타빈을 3 또는 5개 결합시킨 combi 4 및 5(Combi 4_G(3), Combi 5_G(3), Combi 4_G(5), Combi 5_G(5))는 표피암세포인 A431에 대해서는 500 nM 농도까지 세포사멸효과를 나타내지 않았으나, GPC3가 발현된 간암세포에 대해서는 100 nM 농도에서부터 세포사멸을 나타내었다. 압타머에 결합된 젬시타빈의 개수가 늘어날수록 세포사멸효과도 강해지는 것을 확인하였다.
또한, 도 24와 같이 젬시타빈이 3개 결합된 combi 11은 간암세포에 대해 200 nM 농도에서부터 세포사멸을 나타내는 것을 확인하였다.
4-2. 세포주기 분석
젬시타빈을 3 또는 5개 결합시킨 combi 4 및 5가 간암세포의 세포주기에 미치는 영향을 확인하기 위해 세포주기를 분석하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트에 Hep3B, HepG2, A431 세포 1x106/well을 시딩하고, 10% FBS와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2, 37 ℃ 조건 하에 배양하였다. 다음날, 변형 압타머 스톡 100 μM과 5X SB18 완충액을 혼합하여 압타머 80 μM을 만든 후 95 ℃에서 5 분간 가열하고 상온에서 15 분 이상 냉각하였다. 배양한 세포의 배양액을 제거하고 무혈청 배지로 교체한 후 37 ℃에서 1 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 무혈청 배지를 제거하고 1X PBS 2 ml을 넣고 세척 후 KRPH 완충액 2 ml을 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. 압타머를 넣은 후 다시 37 ℃에서 4 시간 동안 5% CO2 조건에서 배양하였다. KRPH 완충액을 제거하고 1X PBS 2 ml을 넣고 세척하고 PBS를 제거하였다. 다시 1X PBS 2 ml을 넣고 스크래퍼로 세포를 긁어서 FACs 튜브에 모은 후 4 ℃에서 2000 rpm, 4 분동안 원심분리하였다. 1/500로 희석한 RNAase A와 PBS에서 50 μg/ml로 희석한 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide)을 FACs 튜브에 500 ul 첨가하고 피펫팅하였다. 빛을 차단한 조건에서 상온에 30 분 동안 인큐베이션 한 후 세포주기를 측정하였다.
그 결과, 도 25 내지 27과 같이 젬시타빈을 3 또는 5개 결합시킨 combi 4 및 5(Combi 4_G(3), Combi 5_G(3), Combi 4_G(5), Combi 5_G(5))는 간암세포에 대해서는 세포주기 진행을 G1/S 단계에서 억제하였으나, 표피암세포에 대해서는 세포주기 억제를 나타내지 않았다. 이를 통해 젬시타빈의 개수 증가에 따른 세포주기 억제 효과의 증가를 확인하였으며, GPC3가 발현되지 않은 다른 암세포에서는 비교군인 젬시타빈 단독처리와 비교하였을 때 세포주기억제 효과를 나타내지 않은 것으로 보아 GPC3가 발현된 세포에 대한 선택성이 나타나는 것을 확인하였다.
4-3. 혈청 안정성 분석
12-12, combi 5 압타머 및 젬시타빈을 3 또는 5개 결합시킨 combi 4, 5 변형 압타머가 인간 혈청 내에서 안정한지 확인하기 위해 혈청 안정성을 분석하였다. 구체적으로, 100 % 인간 혈청에 10 uM의 변형 압타머 10 ul을 넣고 37 ℃에서 0, 1, 3, 6, 12, 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 10 uM 대조군 압타머 5 ul를 넣고, 증류수로 250 ul가 되도록 부피를 맞췄다. 페놀:클로로폼:이소아밀알코올 (25:24:1)을 같은 부피로 250 ul 첨가하고 교반하였다. 각 시료를 16000 x g로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮기고 완전히 건조시켰다. 5x 샘플 완충액과 증류수로 희석 후 95 ℃에서 5 분간 끓인 뒤 식혔다. 요소 PAGE(Polyacrylamide gel Electrophoresis)로 220 V에서 25 분간 샘플 분리 후, SYBR 골드에 염색하여 Gel Doc™ EZ 시스템으로 확인하였다.
그 결과, 도 28과 같이 인간 혈청에서 12-12 압타머는 6시간 동안의 반감기를 유지하였으나 화학적 최적화된 Combi 5 G(3)의 경우 반감기가 약 64시간으로 안정성이 증가한 것을 확인하였다. 이는 최적화 전 12-12 보다 약 10배 이상 개선된 결과를 보였다.
본 실시예들의 결과에서 GPC3 유무에 따른 선택적인 항암효과와 젬시타빈의 개수 의존적인 세포사멸 효과를 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Aptamer Sciences Inc. <120> Glypican-3 specific modified aptamer and uses thereof <130> KPA190881-KR <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-10 <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> n is BzdU. <400> 1 gggaagngaa ngcgnngaan nangncccnn cagncancac 40 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-10 G(2)3' <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (41) <223> S is Gemcitabine. <400> 2 gggaagngaa ngcgnngaan nangncccnn cagncancas sa 42 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-10 G(2)L <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> S is Gemcitabine. <400> 3 gggaagngaa ngcgnngaan nangnsscnn cagncancac 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-10 G(2)5' <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> S is Gemcitabine. <400> 4 ssgaagngaa ngcgnngaan nangncccnn cagncancac 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-10 G(2)P <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> S is Gemcitabine. <400> 5 gggaagngaa ngcgnngaan nangncccnn cagnsansac 40 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-12 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <400> 6 gngaangcgn ngaannangn cccnncagnc ancac 35 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-12 G(3) <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> S is Gemcitabine. <400> 7 gngaangcgn ngaannangn sssnncagnc ancac 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-12 G(5) <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> S is Gemcitabine. <400> 8 gngaangsgn ngaannangn sssnncagnc ancas 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-12 G(7) <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> S is Gemcitabine. <400> 9 gngaangssn ngaannansn sssnncagnc ancas 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 1 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <400> 10 gngaangcgn ngaannangn cccnncagnc ancac 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 2 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> Y is Nap-dU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 11 gngaangcgn ngaannangy cccnncagnc ancac 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 3 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> W is C3 linker-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <400> 12 gngaangcgn ngaannanwn cccnncagnc ancac 35 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 4 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> Y is Nap-dU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 13 gngaangcgn ngaannangy cccnncagnc ancac 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 5 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> W is C3 linker-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> Y is Nap-dU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 14 gngaangcgn ngaannanwy cccnncagnc ancac 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 6 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> Y is Nap-dU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 15 gngaangcgn ngaannangy cccnncagnc ancac 35 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 7 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 16 gngaangcgn ngaannangn cccnncagnc ancac 35 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 8 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> W is C3 linker-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 17 gngaangcgn ngaannanwn cccnncagnc ancac 35 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 9 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <400> 18 gngaangcgn ngaannangn cccnncagnc ancac 35 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 10 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 19 gngaangcgn ngaannangn cccnncagnc ancac 35 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 11 G(3) <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-Methoxyethyl-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-Methoxyethyl-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-Methoxyethyl-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-Methoxyethyl-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> W is C3 linker-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> Y is Nap-dU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-Methoxyethyl-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-Methoxyethyl-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 20 gngaangcgn ngaannanwy sssnncagnc ancac 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 4 G(3) <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> Y is Nap-dU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 21 gngaangcgn ngaannangy sssnncagnc ancac 35 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 5 G(3) <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> W is C3 linker-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> Y is Nap-dU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 22 gngaangcgn ngaannanwy sssnncagnc ancac 35 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 8 G(3) <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> W is C3 linker-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> C is 2-Fluorine-DNA. <400> 23 gngaangcgn ngaannanwn sssnncagnc ancac 35 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 4 G(5) <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> Y is Nap-dU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <400> 24 gngaangcgn ngaannangy sssnncagnc ansas 35 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combi 5 G(5) <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A is 2-Fluorine-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> W is C3 linker-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> Y is Nap-dU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> G is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is BzdU. <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> S is Gemcitabine. <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> A is 2-O-Methoxy-DNA. <220> <221> misc_feature <222> (35) <223> S is Gemcitabine. <400> 25 gngaangcgn ngaannanwy sssnncagnc ansas 35

Claims (15)

  1. 글리피칸-3(Glypican-3, GPC3)에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머 및 항암제를 포함하는, 변형 압타머로서,
    상기 핵산 압타머는 서열번호 6의 염기서열 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머이며,
    상기 변이체는 서열번호 6의 염기서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드 내 염기 구조의 피리미딘 기의 5번 탄소 위치에서 나프틸기로의 치환; 하나 이상의 뉴클레오티드가 당과 염기를 가지지 않는 링커로의 치환; 하나 이상의 뉴클레오티드 내 염기 구조의 2번 탄소 위치에서 -OH 기가 -Methoxy(메톡시), -F(불소) 또는 Methoxyethyl(메톡시에틸) 중 어느 하나 이상으로의 치환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것이고,
    상기 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine) 또는 사이타라빈(cytarabine)인 것인, 변형 압타머.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 압타머는 서열번호 6 내지 서열번호 25로 이루어지는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것인, 변형 압타머.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 상기 핵산 압타머에 1개 이상 결합되는 것인, 변형 압타머.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항암제는 상기 핵산 압타머의 염기서열 내 어느 하나 이상의 염기가 치환되어 결합된 것인, 변형 압타머.
  7. 제6항에 있어서, 상기 염기는 시토신 또는 구아닌인 것인, 변형 압타머.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 젬시타빈인 것인, 변형 압타머.
  10. 제1항, 제4항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항의 변형 압타머를 유효성분으로 포함하는, 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 서열번호 6 내지 서열번호 25로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는, 글리피칸-3에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머.
  12. 서열번호 6으로 이루어진 염기서열의 변이체를 포함하는, 글리피칸-3에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머로서,
    상기 변이체는 서열번호 6의 염기서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드 내 염기 구조의 피리미딘 기의 5번 탄소 위치에서 나프틸기로의 치환; 하나 이상의 뉴클레오티드가 당과 염기를 가지지 않는 링커로의 치환; 하나 이상의 뉴클레오티드 내 염기 구조의 2번 탄소 위치에서 -OH 기가 -Methoxy(메톡시), -F(불소) 또는 Methoxyethyl(메톡시에틸) 중 어느 하나 이상으로의 치환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것인, 핵산 압타머.
  13. 제11항 또는 제12항의 핵산 압타머를 유효성분으로 포함하는, 글리피칸-3 검출용 조성물.
  14. 간암의 진단 또는 예후에 필요한 정도를 제공하기 위하여,
    제13항의 검출용 조성물을 이용하여 검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 글리피칸-3의 함량을 검출하는 단계;
    상기 함량 검출결과를 대조군 시료의 글리피칸-3의 함량 검출결과와 비교하는 단계; 및
    상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 유래 시료의 함량 수준에 변화가 있는 경우, 상기 대상체를 간암의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는,
    글리피칸-3을 검출하는 방법.
  15. 제13항의 검출용 조성물을 포함하는, 간암 진단용 키트.
KR1020190142363A 2019-11-08 2019-11-08 글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도 Active KR102154683B1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190142363A KR102154683B1 (ko) 2019-11-08 2019-11-08 글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도
EP20885612.0A EP4054643A4 (en) 2019-11-08 2020-11-06 MODIFIED APTAMER SPECIFIC FOR GLYPICAN-3 AND ITS USE
CN202080088771.4A CN114845736B (zh) 2019-11-08 2020-11-06 磷脂酰肌醇聚糖-3特异性修饰的适体及其用途
PCT/KR2020/015536 WO2021091319A1 (en) 2019-11-08 2020-11-06 Glypican-3-specific modified aptamer and use thereof
US17/774,601 US20230127087A1 (en) 2019-11-08 2020-11-06 Glypican-3-specific modified aptamer and use thereof
JP2022526479A JP7561845B2 (ja) 2019-11-08 2020-11-06 グリピカン－３特異的変形アプタマー及びその用途
JP2024010095A JP2024054164A (ja) 2019-11-08 2024-01-26 グリピカン－３特異的変形アプタマー及びその用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190142363A KR102154683B1 (ko) 2019-11-08 2019-11-08 글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102154683B1 true KR102154683B1 (ko) 2020-09-11

Family

ID=72472504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190142363A Active KR102154683B1 (ko) 2019-11-08 2019-11-08 글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230127087A1 (ko)
EP (1) EP4054643A4 (ko)
JP (2) JP7561845B2 (ko)
KR (1) KR102154683B1 (ko)
CN (1) CN114845736B (ko)
WO (1) WO2021091319A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021091319A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 Aptamer Sciences Inc. Glypican-3-specific modified aptamer and use thereof
WO2025023650A1 (ko) * 2023-07-21 2025-01-30 한국생명공학연구원 신규한 항-gpc3 키메릭 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역세포

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480639B (zh) * 2021-12-24 2022-09-30 中国医学科学院北京协和医院 新靶点用于诊断和治疗垂体腺瘤

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170104398A (ko) * 2016-03-07 2017-09-15 포항공과대학교 산학협력단 Glypican-3에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도
KR20180013082A (ko) * 2016-07-28 2018-02-07 고려대학교 산학협력단 암세포 화학요법을 위한 agtr1 압타머-항암약물 복합체

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002330482A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-29 Perseus Proteomics Inc. Method of diagnosing cancer by detecting gpc3
US7691586B2 (en) * 2004-04-28 2010-04-06 Perseus Proteomics Inc. Method for predicting and judging the recurrence of liver cancer after treating liver cancer
CL2009000647A1 (es) * 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
TWI532842B (zh) 2009-06-11 2016-05-11 力博美科股份有限公司 針對凝乳酶之適體及其用途
TWI693073B (zh) * 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
JP6636436B2 (ja) * 2014-02-05 2020-01-29 ディーキン・ユニバーシティー アプタマー構築体
US9976146B2 (en) * 2014-05-30 2018-05-22 Academia Sinica Aptamer targeting MAGE-A3 peptide and uses thereof
ES2809125T3 (es) * 2015-09-23 2021-03-03 Bristol Myers Squibb Co Moléculas de armazón a base de fibronectina de unión a glipicano-3
US11845938B2 (en) * 2016-03-31 2023-12-19 City Of Hope Aptamer compositions and the use thereof
CN106636108A (zh) * 2017-01-25 2017-05-10 复旦大学附属中山医院 一种特异性结合gpc3的核酸适配体及其应用
KR102154683B1 (ko) * 2019-11-08 2020-09-11 주식회사 압타머사이언스 글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170104398A (ko) * 2016-03-07 2017-09-15 포항공과대학교 산학협력단 Glypican-3에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도
KR20180013082A (ko) * 2016-07-28 2018-02-07 고려대학교 산학협력단 암세포 화학요법을 위한 agtr1 압타머-항암약물 복합체

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Korean Med Assoc 2013 November; 56(11): 1001-1011

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021091319A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 Aptamer Sciences Inc. Glypican-3-specific modified aptamer and use thereof
CN114845736A (zh) * 2019-11-08 2022-08-02 适本科学株式会社 磷脂酰肌醇聚糖-3特异性修饰的适体及其用途
CN114845736B (zh) * 2019-11-08 2024-10-11 适本科学株式会社 磷脂酰肌醇聚糖-3特异性修饰的适体及其用途
WO2025023650A1 (ko) * 2023-07-21 2025-01-30 한국생명공학연구원 신규한 항-gpc3 키메릭 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역세포

Also Published As

Publication number Publication date
JP7561845B2 (ja) 2024-10-04
US20230127087A1 (en) 2023-04-27
JP2023500946A (ja) 2023-01-11
EP4054643A1 (en) 2022-09-14
JP2024054164A (ja) 2024-04-16
EP4054643A4 (en) 2023-12-13
WO2021091319A1 (en) 2021-05-14
CN114845736B (zh) 2024-10-11
CN114845736A (zh) 2022-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6636436B2 (ja) アプタマー構築体
KR102154683B1 (ko) 글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도
KR101189790B1 (ko) 췌장암 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도
EP2868747B1 (en) Aptamer for periostin and anti-cancer composition including same
Ahmadyousefi et al. Nucleic acid aptamers in diagnosis of colorectal cancer
JP2022061987A (ja) 癌細胞に結合するｄｎａアプタマー
CN109337909A (zh) 一种检测肝癌耐药细胞株的核酸适体及其应用
JP6313478B2 (ja) Ｍａｇｅ−ａ３ペプチド標的アプタマー及びその使用
CN107604064B (zh) Ccl20在肿瘤化疗疗效评估和肿瘤治疗中的应用
Li et al. Selection of trophoblast cell surface antigen 2-targeted aptamer for the development of cytotoxic aptamer-drug conjugate
KR20230136399A (ko) EGFRvIII 특이적 압타머 및 이의 용도
US9233121B2 (en) Compositions and methods for the treatment of cancer
KR20240173344A (ko) 락토바실러스 살리바리우스 또는 박테로이데스 플레비우스를 포함하는 면역항암제 치료 반응성 및 예후 예측용 바이오마커 및 이를 이용한 면역항암제 치료 반응성 및 예후 예측 방법
KR101552014B1 (ko) 폐암 진단을 위한 nir의 신규한 용도
Liu et al. Development and characterization of a chimeric siRNA-aptamer with inhibitory activity in HER2/3+ cells
KR20130111779A (ko) Ａｌｐｐｌ２ 단백질을 이용한 췌장암 진단 방법
CN104001174A (zh) Ssx2ip在预防和治疗肿瘤转移中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20191108

PA0201 Request for examination
PA0302 Request for accelerated examination

Patent event date: 20200413

Patent event code: PA03022R01D

Comment text: Request for Accelerated Examination

Patent event date: 20191108

Patent event code: PA03021R01I

Comment text: Patent Application

PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20200511

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20200826

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20200904

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20200907

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230831

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20240904

Start annual number: 5

End annual number: 5