CN106061995A - Uspa2蛋白质构建体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含粘膜炎莫拉菌(M.catarrhalis)泛表面蛋白A2(UspA2)的组合物。更具体地，本申请涉及UspA2蛋白质构建体和包含该构建体的免疫原性组合物、包含该免疫原性组合物的疫苗和它们的治疗用途。本发明还涉及包含与源自流感嗜血菌的至少一种抗原组合的UspA2的组合物、包含该抗原的免疫原性组合物、包含该免疫原性组合物的疫苗和它们的治疗用途。
Description
技术领域
本发明涉及包含粘膜炎莫拉菌(M.catarrhalis，M.cat.)泛表面蛋白A2(UspA2)的组合物。更具体地，本申请涉及UspA2蛋白质构建体和包含该构建体的免疫原性组合物、包含这种免疫原性组合物的疫苗以及它们的治疗用途。
背景技术
泛表面蛋白A2(UspA2)是三聚体自主转运蛋白，其在电子显微照片中显示为棒棒糖共享(lollipop-shared)的结构(Hoiczyk等人EMBO J。19：5989-5999(2000))。它由一个N末端的头、接着一个以两亲性螺旋为结尾的茎和一个C末端膜区域组成(Hoiczyk等人EMBOJ.19：5989-5999(2000))。UspA2包含一个极高度保守的结构域(Aebi等人，Infection&Immunity 65(11)4367-4377(1997))，其是公认的单克隆抗体，该单克隆抗体一旦被动转移至小鼠粘膜炎莫拉菌激发模型中便显示出保护性(Helminnen等人J Infect Dis.170(4)：867-72(1994))。
UspA2已显示出与宿主结构和细胞外基质蛋白，例如纤连蛋白(Tan等人，J InfectDis。192(6)：1029-38(2005))和层粘连蛋白(Tan等人，J Infect Dis.194(4)：493-7(2006))的相互作用，这意味着，UspA2在粘膜炎莫拉菌感染的早期阶段发挥作用。
UspA2也与粘膜炎莫拉菌抵抗正常人血清杀菌活性的能力有关(Attia AS等人Infect Immun 73(4)：2400-2410(2005))。它(i)结合补体抑制因子C4bp，使得粘膜炎莫拉菌抑制典型的补体系统，(ii)通过从血清中吸收C3防止替代的补体途径的活化和(iii)通过结合补体调节蛋白玻连蛋白，干扰所述补体系统的最终阶段(膜攻击复合物(MembraneAttack Complex，MAC))(de Vries等人，Microbiol Mol Biol Rev.73(3)：389-406(2009))。
粘膜炎莫拉菌是已与成人慢性阻塞性肺疾病(COPD)中增加的恶化风险有关的重要且常见的呼吸性病原体(Sateesh等人，Journal of Chronic Obstructive PulmonaryDisease 3：109-115(2006))。
存在针对粘膜炎莫拉菌的疫苗的需求。
发明内容
在第一个方面，本发明提供了式(I)的蛋白质。
A–(R1)m–(B)n(式I)
其中：
A是来自粘膜炎莫拉菌的UspA2或其免疫原性片段；
R1是氨基酸；
m是0、1或2；
B是组氨酸；和
n是0、1、2、3、4、5或6。
在第二方面，本发明提供了包含式(I)蛋白质和本发明蛋白质的免疫原性组合物。所述组合物还可包含药学上可接受的佐剂。该组合物可包含赋形剂。
在第三方面，本发明提供了用于治疗或预防完全或部分由粘膜炎莫拉菌造成的病症或疾病的方法。该方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的式(I)蛋白质或本发明蛋白质。
在第四方面，本发明提供了用于治疗或预防中耳炎的方法。该方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的式(I)蛋白质或本发明蛋白质。
在第五方面，本发明提供了用于治疗或预防慢性阻塞性肺疾病恶化的方法。该方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的式(I)蛋白质或本发明蛋白质。
在第六方面，本发明提供了用于治疗或预防肺炎的方法。该方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的式(I)蛋白质或本发明蛋白质。
在第七方面，本发明提供了包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的药物组合物，其用于治疗或预防完全或部分由粘膜炎莫拉菌造成的病症或疾病。药物组合物还可包含药学上可接受的佐剂。
在第八方面，本发明提供了编码本发明蛋白质的核酸。
在第九方面，本发明提供了生产本发明核酸的方法。
在第十方面，本发明提供了包含至少一种来自粘膜炎莫拉菌的抗原和至少一种来自流感嗜血菌的抗原的组合物。所述组合物还可包含药学上可接受的佐剂。该组合物可包含赋形剂。
在其它方面，本发明提供了用于治疗或预防完全或部分由粘膜炎莫拉菌和/或流感嗜血菌造成的病症或疾病的方法。该方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的式(I)蛋白质或本发明蛋白质。
在其他方面，本发明提供了用于治疗或预防慢性阻塞性肺疾病的恶化的方法。该方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的式(I)蛋白质或本发明蛋白质和治疗有效量的至少一种来自流感嗜血菌的抗原。
本发明还提供了包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的药物组合物，其用于治疗或预防完全或部分由粘膜炎莫拉菌以及来自流感嗜血菌的至少一种抗原所造成的病症或疾病。药物组合物还可包含药学上可接受的佐剂。
本发明的其他方面在下文的具体实施方案、实施例和权利要求的详尽描述中进行说明。
附图说明
图1：用高细胞密度诱导(HCDI)方法的标准发酵图和在20L规模的分批补料发酵过程中监测到的参数。
图2：用低细胞密度诱导(LCDI)方法的标准发酵图和在20L规模的分批补料发酵过程中监测到的参数。
图3：由蛋白质构建体MC-001、MC-002、MC-004、MC-005、MC-006、MC-007、MC-008和MC-010得到的UspA2在发酵罐中进行评估；数据来自表4。
图4：由沉降速度分析型超速离心确定的纯化的MC-005的分子量分布。大多数蛋白质被发现为三聚体，伴有一小部分的较高分子量的低聚物，其可对应的是三聚体的二聚体。MW＝分子量。kDa＝千道尔顿。
图5：由沉降速度分析型超速离心确定的纯化的MC-001的分子量分布。大多数蛋白质被发现为三聚体。
图6：由沉降速度分析型超速离心确定的纯化的MC-001的分子量分布。该样品呈现多个种类且是高度多分散的。所检测的主要种类的沉降系数无法对应于在其他批次中正常检测的三聚体中的任一个。
图7：由沉降速度分析型超速离心确定的纯化的MC-001的分子量分布。大多数蛋白质被发现为三聚体。
图8：由沉降速度分析型超速离心确定的纯化的MC-007的分子量分布。大多数蛋白质被发现为三聚体。
图9：UspA2构建体的远UV圆二色谱(CD)给出了蛋白质二级结构的指示。
图10：在MC-005的热解折叠过程中通过圆二色谱(CD)检测的二级结构(UspA2Δhelix+6His)。该光谱的视觉分析清楚地显示蛋白质在33℃丧失了其大部分的二级结构。
图11：在MC-007(UspA2全螺旋+6His)的热解折叠过程中通过圆二色谱(CD)检测的二级结构。该光谱的视觉分析显示其二级结构的丧失比没有螺旋的构建体慢。加热至33℃后便检测到结构变化，但是完全的解折叠应发生在35℃至37℃。
图12：MC-001批次opt-01的MALDI光谱。在57427Da观察到的质量可能与去甲硫氨酰化蛋白有关，而在57620Da的峰可对应完整蛋白质。
图13：MC-011批次BMP37的MALDI光谱。所观察到的质量可与去甲硫氨酰化蛋白有关。在+186Da和+366Da的两个另外的峰未确定。
图14：MC-001和MC-007在小鼠肺定植模型中的保护性效力。
图15：在小鼠肌内给药后诱导的针对UspA2的抗体响应，其中PII和PIII分别表示在第28天(柱II)和第42天(柱III)收集的血清中的抗-IgG水平。
图16：由针对同株的UspA2所诱导的杀菌滴定度，所述同株由不同的佐剂(AS01E、AS04C和AlPO4)配制。
图17：在小鼠肌内给药后诱导的针对UspA2的抗体响应，其使用抗原和佐剂的不同制剂。
图18：由针对同株的UspA2所诱导的杀菌滴定度，其使用抗原和佐剂的不同制剂。
图19：用PD-PEPilA-UspA2疫苗(三价NTHi-M.cat.疫苗)诱导针对小鼠PD的IgG响应，所述疫苗用不同的佐剂配制。
图20：用PD-PEPilA-UspA2疫苗(三价NTHi-M.cat.疫苗)诱导针对小鼠PE的IgG响应，所述疫苗用不同的佐剂配制。
图21：用PD-PEPilA-UspA2疫苗(三价NTHi-M.cat.疫苗)诱导针对小鼠PilA的IgG响应，所述疫苗用不同的佐剂配制。
图22：PE在配有AS01E的二价PD-PEPilA和三价PD-PEPilA-UspA2制剂中的免疫原性。
图23：PilA在配有AS01E的二价PD-PEPilA和三价PE-PilA-UspA2制剂中的免疫原性。
图24：PD在配有AS01E的二价PD-PEPilA和三价PE-PilA-UspA2制剂中的免疫原性。
图25：四价PD/PEPilA/UspA2/AS01E疫苗制剂对小鼠肺的影响，所述小鼠肺用热灭活M.cat.进行预先致敏–在PBS免疫的小鼠中有血管周围炎和细支气管周围炎。
图26：四价PD/PEPilA/UspA2/AS01E疫苗制剂对小鼠肺的影响，所述小鼠肺用热灭活M.cat.进行预先致敏–在免疫后的第2天。
图27：四价PD/PEPilA/UspA2/AS01E疫苗制剂对小鼠肺的影响，所述小鼠肺用热灭活M.cat.进行预先致敏–在免疫后的第7天。
图28：四价PD/PEPilA/UspA2/AS01E疫苗制剂对小鼠肺的影响，所述小鼠肺用热灭活M.cat.进行预先致敏–在免疫后的第14天。
图29：四价PD/PEPilA/UspA2/AS01E疫苗制剂对小鼠肺的影响，所述小鼠肺用热灭活M.cat.进行预先致敏–详细的结果
图30：接种疫苗后，肺CD4T细胞对M.cat.WC再刺激的响应。肺CD4细胞表达IL17。用热灭活的M.cat.全细胞(WC)或介质再刺激。
图31：接种疫苗后，肺CD4T细胞对M.cat.WC再刺激的响应。肺CD4细胞表达TNFα。用热灭活的M.cat.全细胞(WC)或介质再刺激。
图32：接种疫苗后，肺CD4T细胞对M.cat.WC再刺激的响应。肺CD4细胞表达IFNγ。用热灭活的M.cat.全细胞(WC)或介质再刺激。
图33：接种疫苗后，肺CD4T细胞对M.cat.WC再刺激的响应。肺CD4细胞表达IL13。用热灭活的M.cat.全细胞(WC)或介质再刺激。
图34：激发后，肺CD4T细胞对M.cat.WC再刺激的响应。肺CD4细胞表达IL17。用热灭活的M.cat.全细胞(WC)或介质再刺激。
图35：激发后，肺CD4T细胞对M.cat.WC再刺激的响应。肺CD4细胞表达TNFα。用热灭活的M.cat.全细胞(WC)或介质再刺激。
图36：激发后，肺CD4T细胞对M.cat.WC再刺激的响应。肺CD4细胞表达IFNγ。用热灭活的M.cat.全细胞(WC)或介质再刺激。
图37：激发后，肺CD4T细胞对M.cat.WC再刺激的响应。肺CD4细胞表达IL13。用热灭活的M.cat.全细胞(WC)或介质再刺激。
发明详述
除非在本文中另外说明或定义，本文所用的所有技术和科学术语与本文所属领域技术的一般技术人员通常所理解的具有相同的含义。例如，在分子生物学中常用的术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes V，由牛津大学出版社出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由BlackwellScience Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编辑)，MolecularBiology和Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
除非上下文中另外明确指出，否则单数术语“一”、“该”和“所述”包括复数指示物。同样地，除非上下文中另外明确指出，否则词语“或”旨在包括“和”。还应理解，针对核酸或多肽所给出的所有碱基大小或氨基酸大小，和所有的分子量或分子质量值均为近似值，且提供以用于描述。此外，对于物质(例如，抗原)的浓度和水平所给出的数值限制可为近似值。因此，当浓度指定为(例如)大约200pg，其意指该浓度包括稍高于或稍低于(“大约”或“～”)200pg的值。
虽然与本文所述的那些类似或相同的方法和材料可用于实施或检测本发明，但合适的方法和材料如下所述。
术语“包括”是指“涵盖”。因此，除非上下文另有要求，术语“包括”及其变体例如“包含”和“含有”将理解为暗示了包括所述化合物或组合物(例如，核酸、多肽、抗原)或步骤，或化合物或步骤的集合，但是不排除任何其他化合物、组合物、步骤或其集合。缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁文exempli gratia，且在本文中用以表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”同义。
为了便于回顾本发明的各种实施方案，提供以下术语的解释。在本公开的上下文中提供了额外的术语和解释。
本文所用“受试者”是哺乳动物，包括人、非人灵长类和非灵长类哺乳动物，例如啮齿动物属的成员(包括但不限于小鼠和大鼠)和兔形目(包括但不限于家兔)。
如本文所用“UspA2”是指粘膜炎莫拉菌的泛表面蛋白A2。UspA2可由ATCC 25238的氨基酸序列SEQ ID NO：1组成或可包含ATCC 25238的氨基酸序列SEQ ID NO：1。
以及在整个长度上，与SEQ ID NO：1具有至少或刚好63％、66％、70％、72％、74％、75％、77％、80％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。比较粘膜炎莫拉菌的UspA2的38个序列(表1，SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38)证明了如SEQ IDNO.1所述的UspA2的大约63％至大约100％的同一性。
如SEQ ID NO：1中所述的UspA2含有信号肽(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸1-29)、层粘连蛋白连接结构域(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸30-177)、纤连蛋白连接结构域(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸165-318)(Tan等人JID 192：1029-38(2005))、C3连接结构域(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸30-539(WO2007/018463)，或SEQ ID NO：1的氨基酸30-539的片段，例如，SEQ ID NO：1的氨基酸165-318(T等人J.Immunol.186：3120-3129(2011))、两亲性螺旋(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸519-564或SEQ ID NO：1的氨基酸520-559，其使用不同的预测方法鉴定)和C末端锚定结构域(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸576-630(Brooks等人，Infection&Immunity，76(11)，5330-5340(2008))。
UspA2氨基酸的差别已经被用来描述各种粘膜炎莫拉菌种类。参见例如，JBacteriology 181(13)：4026-34(1999)，Infection and Immunity 76(11)：5330-40(2008)和PLoS One 7(9)：e45452(2012)。
UspA2可由一种氨基酸序列组成或包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO.1在选自以下的任意一个或多个氨基酸上不同：AA(氨基酸)30-298、AA 299-302、AA303-333、AA 334-339、AA 349、AA 352-354、AA 368-403、AA 441、AA 451-471、AA 472、AA474-483、AA 487、AA 490、AA 493、AA 529、AA 532或AA 543。UspA2可由一种氨基酸序列组成或包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1的不同在于相比于SEQ IDNO.1其含有至少一种氨基酸插入。UspA2可由一种氨基酸序列组成或包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO.1在SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：38中的任意一个氨基酸差异上有所不同。例如，SEQ ID NO.1在氨基酸70上可含有K而不是Q，在氨基酸135上含有Q而不是G和/或在氨基酸216上含有D而不是N。
表1：粘膜炎莫拉菌的38株菌株的UspA2氨基酸序列(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：38)。
UspA2可为来自粘膜炎莫拉菌菌株ATCC(美国注册商标)25238TM、美国2933、美国2912、美国2908、芬兰307、芬兰353、芬兰358、芬兰216、荷兰H2、荷兰F10、挪威1、挪威13、挪威20、挪威25、挪威27、挪威36、BC5SV、挪威14、挪威3、芬兰414、日本Z7476、比利时Z7530、德国Z8063、美国O12E、希腊MC317、美国V1122、美国P44、美国V1171、美国TTA24、美国O35E、美国SP12-6、美国SP12-5、瑞典BC5、美国7169、芬兰FIN2344、美国V1118、美国V1145或美国V1156的UspA2。UspA2可为在SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38中任一个所示的UspA2。UspA2可为来自另一来源的UspA2，所述另一来源对应的是在SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38中任一个的UspA2的序列。相应的UspA2序列可由本领域技术人员使用各种算法确定。例如，Gap程序或Needle程序可用于确定对应于SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38中任一个的的UspA2序列。
UspA2可为在整个长度上与SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38中任一个有至少95％同一性的序列。
UspA2的免疫原性片段包括以下的免疫原性片段：SEQ ID NO：1的至少450个连续氨基酸、SEQ ID NO：1的490个连续氨基酸(例如，MC-004或MC-005的UspA2片段)、SEQ IDNO：1的511个连续氨基酸(例如，构建体MC-001、MC-002、MC-003或MC-004的UspA2片段)、SEQID NO：1的534个连续氨基酸(例如，MC-009或MC-011的UspA2片段)或SEQ ID NO：1的535个连续氨基酸(例如，MC-007、MC-008或MC-010的UspA2片段)。所述免疫原性片段可诱发可结合SEQ ID NO：1的抗体。
UspA2的免疫原性片段可包括SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38中任一个的至少450、490、511、534或535个连续氨基酸的免疫原性片段。UspA2的免疫原性片段可包括来自SEQID NO：2–SEQ ID NO：38中任一个的UspA2的免疫原性片段，其对应的是在UspA2构建体MC-001、MC-002、MC-003、MC-004、MC-005、MC-006、MC-007、MC-008、MC-009、MC-010或MC-011的任一个中的SEQ ID NO：1的UspA2片段。所述免疫原性片段可诱发抗体，所述抗体可结合衍生出该片段的全长序列。
多肽对之间的比对可通过各种程序计算。例如，可使用来自EMBOSS程序包的Needle程序(免费软件；EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(2000).Trends in Genetics16(6)：276—277)和来自GCG(美国注册商标)程序包的Gap程序(Accelrys Inc.)。
所述Gap和Needle程序是描述于：Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中的Needleman-Wunsch算法的工具。这些程序经常使用常见的BLOSUM62打分矩阵(scoring matrix)(Steven Henikoft和Jorja G.Henikoft(1992)，“Amino acid substitution matrices from protein blocks”)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(Biochemistry)：10915-10919)，其缺口罚分和缺口延伸罚分分别是8和2。有时也使用PAM250打分矩阵(Dayhoft等人,(1978)，“A model ofevolutionary changes in proteins”，“Atlas of Protein Sequence and structure”5(3)M.O.Dayhoft(编辑),345-352,National Biomedical Research Foundation,Washington)。
打分矩阵是通过编号倾向于突变成另一个，或倾向于保守的各氨基酸进行描述的。这些数通常可由在详确配对或多重比对，或甚至是多种比对的片段中观察到的突变统计计算的。通常，在这些表中，如果高的正数与一对相同的氨基酸有关，这表明该残基具有低的突变倾向。相反地，与一对不同的氨基酸相关的高正数表明在这二者之间高的突变倾向，且这称为“保守取代”。
着眼于配对比对，可观察到在这两个序列之间的对准的相同残基(“同一性”)。同一性的百分比可通过将以下乘以100计算：(1)相同的数目与比对的长度(例如，在Needle程序中的输出)之间的商数，或(2)相同的数目和最长序列长度之间的商数，或(3)相同的数目和最短序列长度之间的商数，或(4)相同的数目和比对残基的数目(例如，在Gap程序中的输出)之间的商数。
表8的同一性百分比已根据上段的定义(3)进行计算，其使用Gap软件计算的成对比对。
如本文所用“佐剂”是指一种化合物或物质，当将其与疫苗、免疫治疗剂或含有其他抗原-或免疫原的组合物组合给药至受试者时，增加或提高所述受试者对所给药的抗原或免疫原的免疫响应(相比于不存在佐剂将获得的免疫响应)。这与在癌症治疗上下文中由National Cancer Institute of the United States Institutes of Health所定义的作为主要治疗之后提供的额外治疗以降低癌症复发风险的“佐剂疗法”是有区别的。
本发明还提供了包含保守氨基酸取代的式(I)蛋白质。例如，式(I)蛋白质可含有粘膜炎莫拉菌的UspA2的任意氨基酸的保守取代，如本文所述的任意序列(例如，SEQ IDNO.1–SEQ ID NO.38中所示的任意UspA2序列)。
本文所用“信号肽”是指存在于前体蛋白上(通常在N末端)的短的(少于60个氨基酸，例如，3-60个氨基酸)多肽，且其通常不存在于成熟的蛋白质。所述信号肽(sp)通常富含疏水性氨基酸。所述信号肽指导所翻译的蛋白的跨膜运输和/或分泌。信号肽也可也可称为靶向信号、转运肽、定位信号或信号序列。例如，所述信号序列可为共翻译或翻译后的信号肽。
异源性信号肽可在蛋白质运输或分泌过程中或之后通过信号肽肽酶从蛋白质构建体上裂解。例如，所述信号肽肽酶是信号肽肽酶I。“异源性”信号肽是与其在自然界中存在的蛋白质无关的一种物质。
本文所用“治疗”是指预防受试者中病症或疾病的症状的发生、预防受试者中病症或疾病的症状的复发、延迟受试者中病症或疾病的症状的复发、降低受试者中病症或疾病的症状的严重性或频率、减缓或消除受试者中病症的进展以及部分或完全消除受试者中病症或疾病的症状。
如本文所用“任选地”是指随后描述的事件可能发生或可能不发生，且包括发生和不发生的时间。
中耳炎是80％不到3岁的儿童中的主要患病原因(Expert Rev.Vaccines 5：517-534(2006))。超过90％的儿童在7岁前发展成中耳炎(Current Opinion inInvestigational Drugs 4：953-958(2003))。在2000年，美国有1600万人次因中耳炎就医并派发了大约1300万抗细菌处方(Pediatrics 113：1451-1465(2004))。在欧洲国家，所报告的急性中耳炎发病率为每个儿童每年0.125-1.24次(Expert Review of Vaccines 8：1479-1500(2009))。中耳炎是一个高花费的感染且是儿童接受抗生素最常见的原因(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。细菌导致大约70％的急性中耳炎病例，主要病原体为肺炎链球菌、不可分型的流感嗜血菌(NTHi)和粘膜炎莫拉菌(Expert Review of Vaccines 5：517-534(2006))。一部分儿童出现复发或慢性中耳炎且这些耳炎容易使儿童患有延长的中耳积液，其与听力丧失有关且延迟表达和语言的发展(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。最近的抗生素压力和用结合肺炎球菌的疫苗的接种已经导致出现β-内酰胺酶-其生成了流感嗜血菌和粘膜炎莫拉菌，其在北美是导致急性中耳炎的最主要的生物体，然后是肺炎链球菌(Pediatr Clin NAm 60(2013)391-407)。
由于中耳炎是一种多因素疾病，使用疫苗策略预防中耳炎的可行性受到了质疑(Current Infectious Disease Reports 11：177-182(2009))。
栗鼠模型是中耳炎及其预防的稳健且有效的动物模型(Expert Review ofVaccines 8：1063-1082(2009))。尽管该栗鼠模型可模拟人类感染的自然过程，但是其他人认为该栗鼠模型的结果可能在不同实验室中有所不同(Current Opinion inInvestigational Drugs 4：953-958(2003))。
各种其他的啮齿类动物也已用于诱导中耳炎且总结于Vaccine 26:1501-1524(2008)中。鼠类动物模型经常在中耳炎研究中进行研究。
杀菌抗体的存在涉及预防由不可分型的流感嗜血菌导致的中耳炎(CurrentOpinion in Infectious Disease 16：129-134(2003))。但是，免疫应答不必是有效对抗NTHi的杀菌性的。仅与NTHi表面粘附素反应的抗体在栗鼠中可减少或消除中耳炎(CurrentOpinion in Investigational Drugs 4：953-958(2003))。
慢性阻塞性肺疾病是肺部的慢性炎性疾病且是世界范围内发病和死亡的主要原因。在2005年，美国大约有二十分之一的死亡是由于COPD作为背后的原因(Drugs和Aging26：985-999(2009))。据预测，到2020年，COPD将上升至伤残调整寿命年(慢性无效疾病)的第五大原因、以及称为死亡的第三重要的原因(Lancet 349：1498-1504(1997))。
COPD过程的特征在于进行性恶化的气流限制和肺功能的下降。COPD可伴随频繁且复发的急性恶化(AE)，这涉及庞大的医疗开支和高发病率(Proceedings of the AmericanThoracic Society 4：554–564(2007))。一项研究表明，COPD症状的急性恶化有大约50％是由不可分型的流感嗜血菌、粘膜炎莫拉菌、肺炎链球菌和铜绿假单胞菌导致的(Drugs andAging 26：985-999(2009))。在20-30％的COPD恶化中发现流感嗜血菌(H.influenzae)；在10-15％的COPD恶化中发现肺炎链球菌；和在10-15％的COPD恶化中发现粘膜炎莫拉菌(NewEngland Journal of Medicine 359：2355-2365(2008))。已经显示，在香港、韩国和菲律宾，流感嗜血菌、肺炎链球菌和粘膜炎莫拉菌是支气管炎急性恶化的主要病原体，而在亚洲的其他国家/地区，包括印度尼西亚、泰国、马来西亚和台湾，克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌构成大比重的病原体(Respirology,(2011)16，532-539；doi：10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x)。在孟加拉国，20％患有COPD的患者显示出对假单胞菌、克雷伯菌、肺炎链球菌和流感嗜血菌为阳性的痰培养物，而65％患有AECOPD(急性COPD恶化)的患者显示出对假单胞菌、克雷伯菌、不动杆菌、肠杆菌、粘膜炎莫拉菌及其组合为阳性的培养物(Mymensingh Medical Journal 19：576-585(2010))。但是，已经提出，两种最重要的预防COPD恶化的措施是主动免疫接种和药物疗法的慢性维持(Proceedings of theAmerican Thoracic Society 4：554–564(2007))。
社区获得性肺炎(CAP)已被描述为传染病致死的首要原因并排在美国总死亡原因的第六位。粘膜炎莫拉菌在北美是与CAP相关的一种病原体(Clin Chest Med 26(2005)37-55)且在日本为与中到重度社区获得性肺炎相关的一种病原体(J InfectChemother.2014Nov 20.pii：S1341-321X(14)00396-1.doi：10.1016/j.jiac.2014.11.006.[Epub ahead of print])。
需要有效的针对粘膜炎莫拉菌的疫苗。
本发明涉及式(I)蛋白质
A–(R1)m–(B)n(式I)
其中：
A为来自粘膜炎莫拉菌的UspA2或其免疫原性片段；
R1为氨基酸；
m为0或2；
B为组氨酸；和
n为0、1、2、3、4、5或6。
在一个具体实施方案中，R1和m按如下进行限定，其中(R1)m是AS(丙氨酸丝氨酸)。在另一实施方案中，R1是非天然氨基酸。
在一个实施方案中，式(I)的蛋白质和本发明蛋白质按如下进行限定，其中m为0。在一个实施方案中，当m为0时，n为2。在本发明的另一实施方案中，当m为0时，n不为0。
在一个实施方案中，m为2。
在一个具体实施方案中，n选自1、2和6。在另一实施方案中，n选自2和6。在一个具体实施方案中，n为2。在另一实施方案中，n为6。
在一个实施方案中，n选自0、1、2和6，或其任意子集。
在一个实施方案中n为0。在另一实施方案中，当n为0时，m为2。
在一个实施方案中，n为1。在一个实施方案中，n为3。在一个实施方案中，n为4。在一个实施方案中，n为5。
在一个实施方案中，式(I)的蛋白质在氨基末端还含有甲硫氨酸(M)；具有下式的蛋白质：甲硫氨酸-A–(R1)m–(B)n。这些包含在本发明蛋白质中。在一个具体实施方案中，当m为0且n为0时，式(I)的蛋白质和本发明蛋白质是非天然蛋白质。
在一个实施方案中，式(I)的蛋白质和本发明蛋白质是非天然蛋白质。
在一个实施方案中，式(I)的蛋白质按如下进行限定，其中A为来自粘膜炎莫拉菌的UspA2。在另一实施方案中，式(I)的蛋白质按如下进行限定，其中A为如在氨基酸序列中所示的UspA2，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：1到SEQID NO：38的任意子集。在另一实施方案中，式(I)的蛋白质按如下进行限定，其中A为UspA2，其中UspA2在整个长度上，与SEQ ID NO：1具有至少63％、66％、70％、72％、74％、75％、77％、80％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在另一实施方案中，式(I)的蛋白质按如下进行限定，其中A为UspA2，其中UspA2与在SEQ ID NO：1中所示的UspA2氨基酸序列具有大约75％-100％的同一性。在另一实施方案中，A为UspA2，其中UspA2与在SEQ ID NO：1中所示的UspA2氨基酸序列具有大约90％-100％的同一性。在另一实施方案中，A为UspA2，其中UspA2与在SEQ ID NO：1中所示的UspA2氨基酸序列具有至少95％的同一性。在另一实施方案中，式(I)的蛋白质按如下进行限定，其中A为UspA2，其中UspA2与在SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38的任一个中所示的UspA2氨基酸序列具有大约75％-100％的同一性。在另一实施方案中，A为UspA2，其中UspA2与在SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38的任一个中所示的UspA2氨基酸序列具有大约90％-100％的同一性。在其他实施方案中，A为UspA2，其中UspA2与在SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38的任一个中所示的UspA2具有至少95％的同一性。在具体实施方案中，A为UspA2，其具有SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列。
在另一实施方案中，式(I)的蛋白质按如下进行限定，其中A为来自粘膜炎莫拉菌的UspA2的免疫原性片段。在另一实施方案中，A为UspA2的免疫原性片段，其中UspA2具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：38的任意子集。在另一实施方案中，A为UspA2的免疫原性片段，其中UspA2与在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列具有大约75％-100％的同一性。在另一实施方案中，A为UspA2的免疫原性片段，其中UspA2与SEQ ID NO.1具有大约90％-100％的同一性。在另一实施方案中，A是UspA2的免疫原性片段，其中UspA2与SEQ ID NO.1具有至少95％的同一性。在另一实施方案中，A为UspA2的免疫原性片段，其中UspA2与在SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38的任一个中所示的氨基酸序列有大约75％-100％的同一性。在另一实施方案中，A为UspA2的免疫原性片段，其中UspA2与SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38的任一个有大约90％-100％的同一性。在另一实施方案中，A为UspA2的免疫原性片段，其中UspA2与SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：38的任一个有至少95％的同一性。在具体实施方案中，A为UspA2的免疫原性片段，其中UspA2具有如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。
在另一实施方案中，A为粘膜炎莫拉菌的UspA2的免疫原性片段，其选自SEQ IDNO.1的氨基酸30-540(SEQ ID NO：39)、SEQ ID NO：1的氨基酸31-540(SEQ ID NO：40)、SEQID NO：1的氨基酸30-519(SEQ ID NO：41)、SEQ ID NO：1的氨基酸30-564(SEQ ID NO：42)和SEQ ID NO：1的氨基酸31-564(SEQ ID NO：43)。更具体地，在一个实施方案中，A为SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：1的氨基酸31-564。在另一实施方案中，A为SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：1的氨基酸30-564。在另一实施方案中，A为粘膜炎莫拉菌的UspA2的免疫原性片段，其选自SEQ ID NO.1的氨基酸30-540(SEQ ID NO：39)、SEQ ID NO.1的氨基酸31-540(SEQ ID NO：40)和SEQ ID NO.1的氨基酸30-519(SEQ ID NO：41)。在另一实施方案中，A为UspA2的免疫原性片段，其与SEQ ID NO.39具有至少52％(美国2908)、55％(挪威25)、57％(日本Z7476)、62％(芬兰FIN2344)、64％(美国2912)、69％(美国P44)、73％(美国7169)、76％(挪威27)、81％(美国V1145)、88％(德国Z8063)或100％(瑞典BC5)的同一性。在另一实施方案中，A为UspA2的免疫原性片段，其与SEQ ID NO.43具有至少52％(美国2908)、57％(荷兰F10)、62％(美国2933)、65％(希腊MC317)、67％(美国V1122)、70％(美国P44)、73％(美国7169)、76％(挪威3)、81％(德国Z8063)、100％(瑞典BC5)的同一性。
在另一实施方案中，A是粘膜炎莫拉菌的UspA2的免疫原性片段，其选自SEQ IDNO：2到SEQ ID NO：38，其中该片段包含如下氨基酸，其与SEQ ID NO.1的氨基酸30-540(SEQID NO：39)、SEQ ID NO：1的氨基酸31-540(SEQ ID NO：40)、SEQ ID NO：1的氨基酸30-519(SEQ ID NO：41)、SEQ ID NO：1的氨基酸30-564(SEQ ID NO：42)或SEQ ID NO：1的氨基酸31-564(SEQ ID NO：43)比对。在一个实施方案中，实施Needleman-Wunsch算法的Gap程序(来自GCG程序包)或Needle程序(来自EMBOSS程序包)可用于比对该序列。
UspA2-SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：1的UspA2的氨基酸30-540，SEQ ID NO：39
SEQ ID NO：1的UspA2的氨基酸31-540，SEQ ID NO：40
SEQ ID NO：1的UspA2的氨基酸30-519，SEQ ID NO：41
SEQ ID NO：1的UspA2的氨基酸30-564，SEQ ID NO：42
SEQ ID NO：1的UspA2的氨基酸31-564，SEQ ID NO：43
在另一实施方案中，A为粘膜炎莫拉菌的UspA2的免疫原性片段，其在以下一个或多个氨基酸与SEQ ID NO：1不同：AA(氨基酸)30-298、AA 299-302、AA 303-333、AA 334-339、AA 349、AA 352-354、AA 368-403、AA 441、AA 451-471、AA 472、AA 474-483、AA 487、AA 490、AA 493、AA 529、AA 532或AA 543。在另一实施方案中，A是粘膜炎莫拉菌的UspA2的免疫原性片段，其与SEQ ID NO：1的不同在于其相比于SEQ ID NO.1含有至少一个氨基酸插入。
在另一实施方案中，A是UspA2的免疫原性片段，其含有层粘连蛋白连接结构域和纤连蛋白连接结构域。
在另一实施方案中，A是UspA2的免疫原性片段，其含有层粘连蛋白连接结构域、纤连蛋白连接结构域和C3连接结构域。
在其他实施方案中，A是UspA2的免疫原性片段，其含有层粘连蛋白连接结构域、纤连蛋白连接结构域、C3连接结构域和两亲性螺旋。
所述层粘连蛋白连接结构域、纤连蛋白连接结构域、C3连接结构域或两亲性螺旋可以按SEQ ID NO：1定义或可为SEQ ID NO：2到SEQ ID NO：38的任一个中的相应的序列。
式(I)蛋白质和本发明蛋白质在受试者，例如哺乳动物，尤其是人中用作免疫原。具体地，式(I)的蛋白质和本发明蛋白质在受试者，尤其是人中用于诱导针对粘膜炎莫拉菌的免疫应答。式(I)的蛋白质和本发明蛋白质用于治疗或预防粘膜炎莫拉菌感染或疾病。更具体地，式(I)的蛋白质和本发明蛋白质用于治疗或预防中耳炎和/或COPD和/或AECOPD和/或肺炎。
本发明涉及包含粘膜炎莫拉菌的UspA2或其免疫原性片段的免疫原性组合物。本发明还涉及包含这种免疫原性组合物的疫苗及它们的治疗用途。本发明的免疫原性组合物和疫苗用于治疗或预防粘膜炎莫拉菌感染或疾病。更具体地，本文所述的免疫原性组合物和疫苗用于治疗或预防中耳炎和/或COPD和/或AECOPD和/或肺炎。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含粘膜炎莫拉菌的UspA2。UspA2可为SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：38的任一个或与SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：38的任一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的UspA2序列。UspA2也可为与SEQ ID NO：1具有至少63％(美国2908)、66％(日本Z7476)、70％(荷兰F10)、72％(芬兰358)、74％(美国P44)、77％(芬兰307)、80％(挪威3)、84％(美国V1145)、90％(德国Z8063)或100％(瑞典BC5)同一性的UspA2序列。
在另一实施方案中，所述免疫原性组合物包含UspA2的免疫原性片段。所述UspA2的免疫原性片段可为SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或SEQ IDNO.43，或与序列SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或SEQ IDNO.43任一个具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。所述UspA2的免疫原性片段可为与SEQ ID NO.39具有至少52％(美国2908)、55％(挪威25)、57％(日本Z7476)、62％(芬兰FIN2344)、64％(美国2912)、69％(美国P44)、73％(美国7169)、76％(挪威27)、81％(美国V1145)、88％(德国Z8063)或100％(瑞典BC5)同一性的UspA2序列。所述UspA2的免疫原性片段也可为与SEQ ID NO.43具有至少52％(美国2908)、57％(荷兰F10)、62％(美国2933)、65％(希腊MC317)、67％(美国V1122)、70％(美国P44)、73％(美国7169)、76％(挪威3)、81％(德国Z8063)、100％(瑞典BC5)同一性的UspA2序列。氨基酸差异已经描述于不同的粘膜炎莫拉菌种的UspA2中。
UspA2含有层粘连蛋白连接结构域(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸30-177，SEQ IDNO：44)。在一个实施方案中，UspA2的片段包含SEQ ID NO：1的层粘连蛋白结合区。在另一实施方案中，UspA2的片段包含SEQ ID NO：2–SEQ ID NO：38的任一个的层粘连蛋白结合区。
SEQ ID NO：1的氨基酸30-177，SEQ ID NO：44：
UspA2含有纤连蛋白连接结构域(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸165-318，SEQ IDNO：45)。在一个实施方案中，UspA2的片段包含SEQ ID NO：1的纤连蛋白结合区。在另一实施方案中，UspA2的片段包含SEQ ID NO：2–SEQ ID NO：38的任一个的纤连蛋白结合区。所述SEQ ID NO：45的纤连蛋白连接结构域还具有C3结合性质。
SEQ ID NO：1的氨基酸165-318，SEQ ID NO：45：
UspA2含有补体构件3(C3)连接结构域(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸30-539，SEQID NO：46，或SEQ ID NO：1的氨基酸165-318，SEQ ID NO：45)。在一个实施方案中，UspA2的片段包含SEQ ID NO：1的C3结合区。在另一实施方案中，UspA2的片段包含SEQ ID NO：2–SEQID NO：38的任一个的C3连接结构域。
SEQ ID NO：1的氨基酸30-539，SEQ ID NO：46：
UspA2含有两亲性螺旋(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸519-564或SEQ ID NO：1的氨基酸520-559)。在一个实施方案中，UspA2的片段包含SEQ ID NO：1的氨基酸519-564。在另一实施方案中，所述UspA2的片段包含SEQ ID NO：1的氨基酸520-559。在另一实施方案中，所述UspA2的片段包含SEQ ID NO：2–SEQ ID NO：38的任一个的两亲性螺旋。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含式(I)蛋白质，其中A为UspA2的免疫原性片段，其包含层粘连蛋白连接结构域和纤连蛋白连接结构域。
在另一实施方案中，所述免疫原性组合物包含式(I)蛋白质，其中A为UspA2的免疫原性片段，其包含层粘连蛋白连接结构域、纤连蛋白连接结构域和C3连接结构域。
在其他实施方案中，所述免疫原性组合物包含式(I)蛋白质，其中A为UspA2的免疫原性片段，其包含层粘连蛋白连接结构域、纤连蛋白连接结构域、C3连接结构域和两亲性螺旋。
在另一实施方案中，所述免疫原性组合物包含如式(I)所定义的蛋白质。所述免疫原性组合物可含有，例如，在氨基末端具有额外的甲硫氨酸的式(I)蛋白质。
在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物可与其他抗原一起施用。例如，本发明的免疫原性组合物可与来自流感嗜血菌的抗原一起施用。例如，式(I)的蛋白质可与流感嗜血菌的蛋白质D(PD)一起施用。蛋白质D可如在WO91/18926中所述。本发明的免疫原性组合物可与来自流感嗜血菌的蛋白质E(PE)和Pilin A(PilA)一起施用。蛋白质E和Pilin A可如在WO2012/139225中所述；将其内容引入本文作为参考。蛋白质E和Pilin A可作为融合蛋白提供。
在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物可与其他细菌种类的额外抗原一起施用，所述其它细菌种类也已知导致中耳炎、COPD、AECOPD或肺炎。
实现所需治疗或生物效果的免疫原性组合物所需的量将取决于许多因素，例如预期的用途、给药方式、接受者和所治疗病症的类型和严重性，并将最终由主治医生或兽医决定。通常，用于治疗在人中完全或部分由粘膜炎莫拉菌导致的病症的典型剂量，例如，可预期处于约0.001mg-0.120mg的范围。更具体地，用于治疗在人中完全或部分由粘膜炎莫拉菌导致的病症的典型剂量可位于约0.003mg至约0.03mg的蛋白质的范围。本发明提供了包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的免疫原性组合物，其用于治疗或预防完全或部分由粘膜炎莫拉菌导致的病症或疾病。所述免疫原性组合物可含有额外的抗原；对于各额外的抗原，用于治疗在人中完全或部分由流感嗜血菌导致的病症的典型剂量可位于约0.005mg至约0.05mg的范围。这个剂量可以单一单位剂量进行给药。也可给药多个单独的单位剂量。例如，单独的单位剂量可在生命的第一年内作为单独的初次剂量进行给药或作为给定的单独的加强剂量以有规律的周期(例如，每1、5或10年)进行给药。本发明还提供了一种免疫原性组合物，其包含用于治疗或预防完全或部分由粘膜炎莫拉菌造成的病症或疾病的式(I)蛋白质或本发明蛋白质以及来自流感嗜血菌的至少一种抗原。
包含本发明的免疫原性组合物的制剂可适用于通过合适的途径进行给药，例如，通过肌内、舌下、经皮、真皮内或鼻内途径。这种制剂可通过本领域已知的任意方法进行制备。
本发明的免疫原性组合物还可包含佐剂。当在本说明书中使用术语“佐剂”时，它是指与所述免疫原性组合物联合给药以提高患者对所述组合物的免疫原性组分的免疫应答的物质。
合适的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾，但也可以是钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或可为酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生糖、或聚磷腈的不溶性悬浮液。在一个实施方案中，所述蛋白质可吸附到磷酸铝上。在另一实施方案中，所述蛋白质可吸附于氢氧化铝上。在第三个实施方案中，明矾可用作佐剂。
促进主要Th1应答的合适佐剂系统包括：脂质A的无毒衍生物、单磷酰脂质A(MPL)或其衍生物，尤其是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)(其制备参见GB 2220211A)；和单磷酰脂质A(优选3-脱-O-酰化单磷酰脂质A)与铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳液的组合。在这种组合中，抗原和3D-MPL均包含在相同的微粒结构中，使得更有效地递送抗原和免疫刺激信号。研究显示，3D-MPL能够进一步提高明矾吸附的抗原的免疫原性(Thoelen等人Vaccine(1998)16：708-14；EP 689454-B1)。
AS01是佐剂系统，其含有MPL(3-O-去酰基化-4’-单磷酰脂质A)、QS21((皂皮树，级分21)Antigenics，New York，NY，USA)和脂质体。AS01B是佐剂系统，其含有MPL、QS21和脂质体(50μg MPL和50μg QS21)。AS01E是佐剂系统，其含有MPL、QS21和脂质体(25μg MPL和25μgQS21)。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗包含AS01。在另一实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗包含AS01B或AS01E。在具体实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗包含AS01E。
AS02是佐剂系统，其在油/水乳液中含有MPL和QS21。AS02V是佐剂系统，其在油/水乳液中含有MPL和QS21(50μg MPL和50μg QS21)。
AS03是佐剂系统，其在油/水(o/w)乳液中含有α-生育酚和角鲨烯。AS03A是佐剂系统，其在o/w乳液中含有α-生育酚和角鲨烯(11.86mg生育酚)。AS03B是佐剂系统，其在o/w乳液中含有α-生育酚和角鲨烯(5.93mg生育酚)。AS03C是佐剂系统，其在o/w乳液中含有α-生育酚和角鲨烯(2.97mg生育酚)。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗包含AS03。
AS04是佐剂系统，其含有吸附在铝盐(500μg Al3+)上的MPL(50μg MPL)。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗包含AS04。
涉及使用QS21和3D-MPL的系统公开在WO 94/00153中。其中所述QS21被胆固醇淬灭的组合物公开在WO 96/33739中。涉及在水包油乳液中的QS21、3D-MPL和生育酚的额外的佐剂制剂公开在WO 95/17210中。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物还包含皂苷，其可为QS21。该制剂还可包含水包油乳液和生育酚(WO 95/17210)。含有寡核苷酸(WO 96/02555)和其他免疫调节寡核苷酸(WO 0226757和WO 03507822)的未甲基化的CpG也优选为TH1应答的诱导物且适用于本发明。
额外的佐剂是选自金属盐、水包油乳液、Toll样受体激动剂(具体地为Toll样受体2激动剂、Toll样受体3激动剂、Toll样受体4激动剂、Toll样受体7激动剂、Toll样受体8激动剂和Toll样受体9激动剂)、皂苷或其组合的那些。
本发明提供了制备免疫原性组合物的方法，其包括将式(I)蛋白质或本发明蛋白质与佐剂组合。
本发明还提供了包含本发明免疫原性组合物和药学上可接受的佐剂的疫苗。
可能的赋形剂包括精氨酸、普流尼克酸(pluronic acid)和/或聚山梨酯。在优选的实施方案中，使用聚山梨酯80(例如，TWEEN(美国注册商标)80)。在其他实施方案中，使用约0.03％至约0.06％的最终浓度。具体地，可使用约0.03％、0.04％、0.05％或0.06％聚山梨酯80(w/v)的最终浓度。
本发明提供了制备免疫原性组合物或疫苗的方法，其包括将式(I)蛋白质或本发明蛋白质与药学上可接受的赋形剂组合。
本发明还提供了编码本发明蛋白质的核酸。术语“核酸”是指核苷酸的聚合形式。核苷酸可为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。所述核酸优选基本上不含其他核酸。
本发明提供了产生本发明核酸的方法。本发明核酸可通过本领域技术人员已知的方法制备。例如，本发明核酸可部分或整体进行合成。所述核酸可通过消化较长氨基酸或接合较短氨基酸进行制备。
本发明提供了治疗或预防中耳炎的方法。所述方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的式(I)蛋白质或本发明蛋白质。
本发明提供了用于治疗或预防慢性阻塞性肺疾病的恶化的方法。所述COPD的恶化可为急性恶化。该方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的式(I)蛋白质或本发明蛋白质。
本发明提供了用于治疗或预防肺炎的方法。所述方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的式(I)蛋白质或本发明蛋白质。
本发明提供了包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的药物组合物，其用于治疗或预防完全或部分由粘膜炎莫拉菌造成的病症或疾病。药物组合物可还包含药学上可接受的佐剂。
本发明提供了以下在制备用于治疗或预防粘膜炎莫拉菌感染或疾病的药物中的用途：(a)式(I)蛋白质和本发明蛋白质；(b)包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的免疫原性组合物；或(c)疫苗，其包含(c1)式(I)蛋白质或本发明蛋白质或(c2)包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的免疫原性组合物。
本发明提供了以下在制备用于治疗或预防中耳炎的药物中的用途：(a)式(I)蛋白质和本发明蛋白质；(b)包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的免疫原性组合物；或(c)疫苗，其包含(c1)式(I)蛋白质或本发明蛋白质或(c2)包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的免疫原性组合物。
本发明提供了以下在制备用于治疗或预防慢性阻塞性肺疾病的急性恶化(AECOPD)的药物中的用途：(a)式(I)蛋白质和本发明蛋白质；(b)包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的免疫原性组合物；或(c)疫苗，其包含(c1)式(I)蛋白质或本发明蛋白质或(c2)包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的免疫原性组合物。
本发明提供了以下在制备用于治疗或预防肺炎的药物中的用途：(a)式(I)蛋白质和本发明蛋白质；(b)包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的免疫原性组合物；或(c)疫苗，其包含(c1)式(I)蛋白质或本发明蛋白质或(c2)包含式(I)蛋白质或本发明蛋白质的免疫原性组合物。
以下实施例仅旨在用于说明而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
在所述实施例中，以下术语具有指定的含义：
6xhis＝6个组氨酸；
xg＝离心力(重力数)
AS＝丙氨酸丝氨酸
BSA＝牛血清白蛋白；
℃＝摄氏度；
CaCl2＝氯化钙；
CD＝圆二色谱；
CHCl3＝氯仿；
CH3CN＝乙腈；
CO2＝二氧化碳；
Da＝道尔顿；
DNA＝脱氧核糖核酸；
DO＝溶解氧；
DSC＝差示扫描量热法；
EDTA＝乙二胺四乙酸；
h＝小时；
H2O＝水；
H2O2＝过氧化氢；
HCDI＝高细胞密度诱导；
HCl＝氯化氢；
His＝his＝组氨酸；
IMAC＝固定化金属亲和层析；
IPTG＝异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷；
kVolts＝千伏
L＝升；
LB＝Luria-Bertani；
LCDI＝低细胞密度诱导；
MeOH＝甲醇；
ml＝毫升；
NaCl＝氯化钠；
RPM＝rpm＝每分钟转数；
min＝分钟；
mM＝毫摩尔；
μg＝微克；
μL＝微升；
MW＝分子量；
m/z＝质荷比；
NaCl＝氯化钠；
NaPO4＝磷酸钠；
ng＝纳克；
NH4OH＝氢氧化铵；
nm＝纳米；
O.D.＝光密度；
PBS＝磷酸盐缓冲盐水；
PCR＝聚合酶链反应；
psi＝磅/平方英寸；
PVDF＝聚偏氟乙烯；
SDS-PAGE＝十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；
TFA＝三氟乙酸
Tm＝熔点；
Tm1＝第一熔点；
Tm2＝第二熔点；
w/v＝重量/体积比。
实施例
实施例1：蛋白质构建体
蛋白质构建体是由含有和不含有额外氨基酸的不同的UspA2片段产生的。下表描述了所制备的蛋白质构建体。
表2：含有UspA2蛋白质的蛋白质构建体。
A.A.＝氨基酸
在表2中所列的各蛋白质构建体的DNA和氨基酸序列如下文所示。
蛋白质构建体序列：
MC-001(DNA)-SEQ ID NO：52
MC-001(蛋白质)–(M)(UspA2氨基酸30-540)(ASHHHHHH)SEQ ID NO：53
MC-002(DNA)-SEQ ID NO：54
MC-002(蛋白质)–(M)(UspA2氨基酸30-540)SEQ ID NO：55
SEQ ID NO：56
SEQ ID NO：57
MC-003(DNA)–SEQ ID NO：87
MC-003(蛋白质)–(M)(UspA2氨基酸30-540)(H)–SEQ ID NO：88
MC-004(DNA)-SEQ ID NO：58
MC-004(蛋白质)–(M)(UspA2氨基酸30-540)(HH)SEQ ID NO：59
MC-005(DNA)-SEQ ID NO：60
MC-005(蛋白质)–(M)(UspA2氨基酸30-519)(ASHHHHHH)SEQ ID NO：61
MC-006(DNA)-SEQ ID NO：62
MC-006(蛋白质)–(M)(UspA2氨基酸30-519)SEQ ID NO：63
MC-007(DNA)-SEQ ID NO：64
MC-007(蛋白质)–(M)(UspA2氨基酸30-564)(ASHHHHHH)SEQ ID NO：65
MC-008(DNA)-SEQ ID NO：66
MC-008(蛋白质)–(M)(UspA2 30-564)(HH)SEQ ID NO：67
MC-009(DNA)-SEQ ID NO：68
MC-009(蛋白质)–(M)(UspA2 31-564)(HH)SEQ ID NO：69
MC-010(DNA)-SEQ ID NO：70
MC-010(蛋白质)–(M)(UspA2氨基酸30-564)SEQ ID NO：71
MC-011(DNA)-SEQ ID NO：72
MC-011(蛋白质)–(M)(UspA2氨基酸31-540)(ASHHHHHH)SEQ ID NO：73
载体构建和转化
菌株ATCC 25238的UspA2的DNA序列–SEQ ID NO：74。
菌株ATCC 25238的UspA2的蛋白质序列-SEQ ID NO.1如上文所述。
载体构建
为了产生构建体MC-001，将编码UspA2基因片段(菌株ATCC 25238的氨基酸30-540)的DNA片段进行密码子优化(非天然)并经GENEART(美国注册商标)进行合成，所述UspA2基因片段包括用于促进克隆的NdeI/XhoI限制位点(起始甲硫氨酸由NdeI位点编码)和对应于AS(丙氨酸丝氨酸)氨基酸连接基和6xhis氨基酸的DNA序列。密码子优化是指所述核苷酸序列从其天然序列改变而不改变氨基酸序列，以更好地与大肠杆菌中所用的密码子匹配以进行最佳表达。根据标准方法，使用NdeI/XhoI限制位点将所述UspA2片段克隆至pET-26b表达载体中。
为了产生MC-002、MC-003和MC-004构建体，使用MC-001构建体作为模板、引物UspA2Nde opt(其含有甲硫氨酸起始密码子)和各自的引物UspA2opt delta His、A2opt1His delta AS和A2opt 2His delta AS进行聚合酶链反应以扩增所述UspA2基因片段(菌株ATCC 25238的氨基酸30-540)。根据标准方法，使用NdeI/XhoI限制位点将所述UspA2片段克隆至pET-26b表达载体中。
为了产生构建体MC-005，使用MC-001载体作为模板以及引物UspA2Nde opt(其含有甲硫氨酸起始密码子)和R delta hairpin A2opt His进行聚合酶链反应以扩增该UspA2基因片段(菌株ATCC 25238的氨基酸30-519)。将对应于NdeI限制位点的DNA序列并入5’引物中并将XhoI限制位点并入3’引物中。此外，将对应于AS氨基酸连接基和6xhis氨基酸的DNA序列并入3’引物中。然后将产生的PCR产物插入到pET-26b(+)克隆载体(NOVAGEN(美国注册商标))中。
为了产生构建体MC-006，使用MC-005构建体作为模板以及引物UspA2Nde opt(其含有甲硫氨酸起始密码子)和delta His delta hélice进行聚合酶链反应以扩增所述UspA2基因片段(菌株ATCC 25238的氨基酸30-519)。将对应于NdeI限制位点的DNA序列并入5’引物中并将XhoI限制位点并入3’引物中。然后将所产生的PCR产物插入到pET-26b(+)克隆载体(NOVAGEN(美国注册商标))中。
为了产生构建体MC-007，将编码UspA2基因片段(菌株ATCC 25238的氨基酸30-564)的DNA片段进行密码子优化并经GENEART(美国注册商标)进行合成(质粒：1026399)，所述UspA2基因片段包括用于促进克隆的NdeI/XhoI限制位点(起始甲硫氨酸由NdeI位点编码)和对应于AS(丙氨酸丝氨酸)氨基酸连接基和6xhis氨基酸的DNA序列。根据标准方法，使用NdeI/XhoI限制位点将所述UspA2片段克隆至pET-26b表达载体中。
为了产生构建体MC-008，使用MC-007构建体作为模板以及引物UspA2Nde opt(其含有甲硫氨酸起始密码子)和2His hélice deltaAS进行聚合酶链反应以扩增该UspA2基因片段(菌株ATCC 25238的氨基酸30-564)。将对应于NdeI限制位点的DNA序列并入5’引物并将XhoI限制位点并入3’引物。然后将所产生的PCR产物插入该pET-26b(+)克隆载体(NOVAGEN(美国注册商标))中。
为了产生构建体MC-009，使用1026399质粒作为模板和引物N-term cyto Abis(其含有甲硫氨酸起始密码子)和2His hélice deltaAS进行聚合酶链反应以扩增该UspA2基因片段(菌株ATCC 25238的氨基酸31-564)。将对应于NdeI限制位点的DNA序列并入5’引物，其包含谷氨酰胺缺失；并将XhoI限制位点并入3’引物，其包含两个组氨酸残基。然后将所产生的PCR产物插入pET-26b(+)克隆载体(NOVAGEN(美国注册商标))中。进行最终构建体的DNA测序以确认正确的序列。
为了产生构建体MC-010，使用MC-007构建体作为模板以及引物UspA2Nde opt(其含有甲硫氨酸起始密码子)和cyto hélice dHis dAS进行聚合酶链反应以扩增所述UspA2基因片段(菌株ATCC 25238的氨基酸30-564)。将对应于NdeI限制位点的DNA序列并入5’引物并将XhoI限制位点并入3’引物。然后将所产生的PCR产物插入所述pET-26b(+)克隆载体(NOVAGEN(美国注册商标))中。
为了产生构建体MC-011，使用MC-001构建体作为模板以及引物N-term cyto Abis(其含有甲硫氨酸起始密码子)和N-末端反向引物(N-term reverse)进行聚合酶链反应以扩增所述UspA2基因片段(菌株ATCC 25238的氨基酸31-540)。将对应于NdeI限制位点的DNA序列并入5’引物并将XhoI限制位点并入3’引物。然后将所产生的PCR产物插入到所述pET-26b(+)克隆载体(NOVAGEN(美国注册商标))中。
用于扩增的PCR引物序列的详细列表描述于表3。根据制造商的建议，使用ExpandHigh Fidelity PCR系统试剂盒(Roche)进行聚合酶链反应。根据制造商的建议，使用RapidDNA Ligation试剂盒(Roche)进行连接。
表3：用于UspA2扩增的PCR引物序列
转化
根据使用CaCl2-处理的细胞的标准方法，将大肠杆菌(E.coli)BLR(DE3)、修饰的BLR(DE3)或B834(DE3)细胞用质粒DNA进行转化(Hanahan D.《Plasmid transformation bySimanis.》In Glover,D.M.(Ed),DNA cloning.IRL Press London.(1985):p.109-135.)。简而言之，将BLR(DE3)感受态细胞在冰上慢慢解冻。使用50-100μl感受态细胞混合大约4μl的质粒(10-100ng)。此后，将该制剂在冰上培养5分钟。为了进行转化反应，将该制剂在42℃热脉冲30秒，然后在冰上培养2分钟。将大约0.5ml的SOC培养基(具有分解代谢产物阻遏的超优化肉汤)加至所转化的细胞中并将该细胞培养物在37℃培养1小时，然后置于含50μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂中。将大约150μl的转化细胞培养物放置并在37℃培养过夜。
BLR(DE3)：BLR是BL21(F–ompT hsdSB(rB–mB–)gal dcm(DE3)的recA–衍生物。用于表达重组蛋白质的该E.coli菌株提高质粒单体的产量并可帮助稳定靶标质粒，所述靶标质粒含有重复序列或其产品可引起DE3原噬菌体的丧失(Studier，F.W.(1991)J.Mol.Biol.219：37–44)。E.coli BLR的详细的基因型(DE3)已经由NOVAGEN(美国注册商标)公布(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcmΔ(srl-recA)306：：Tn10(TetR)(DE3)。
B834(DE3)为BL21的亲本菌株。这些宿主是甲硫氨酸营养缺陷型并使用35S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸将靶蛋白进行高度特异性的活性标记以用于结晶。E.coli B834的详细的基因型(DE3)已经由NOVAGEN(美国注册商标)公布：F–ompT hsdSB(rB–mB–)gal dcm met(DE3)。
修饰的BLR(DE3)：为了预防(磷)糖基化，将Pgl基因插入到位于BLR(DE3)基因组的生物素基因座中。此外，为了预防Ile-Val取代，将在苏氨酸脱氨酶基因中的C219Y突变进行修正。
基因型：(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcmΔ(srl-recA)306：：Tn10(TetR)；Δ(bioA-bioD)：：Pgl；TD+(C219Y)(DE3)。
实施例2：使用摇瓶的蛋白质表达
用重组质粒转化的大肠杆菌菌株用于接种100ml的LB肉汤(Becton，Dickinson和Company)±1％(重量/体积比，w/v)葡萄糖(Laboratoire MAT，目录号：GR-0101)和50μg/ml卡那霉素(Sigma)。该预培养物通常在37℃生长过夜。使用12ml的预培养物来接种500ml LB肉汤+50μg/ml卡那霉素。将培养物在37℃培养并以150RPM搅拌以达到约0.6的O.D.600nm。
在约0.6的O.D.600nm时，通过加入1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG；EMDChemicals Inc.，目录号：5815)诱导该BLR(DE3)培养物表达所述重组蛋白质并在23℃培养过夜同时以150RPM搅拌。诱导期后，将培养物以6370g离心20分钟并将350ml培养物中的沉淀物在-20℃进行单独冷冻。
实施例3：使用磷酸盐缓冲液的蛋白质纯化(MC-001构建体和MC-011构建体)
将在摇瓶中诱导后所得到的各细菌沉淀物重新混悬于30ml 20mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)，其含有10mM NaCl和Roche COMPLETE(美国注册商标)蛋白酶抑制剂混合物(1片/50ml缓冲液)。将细胞裂解液用弗氏细胞压碎器进行3次萃取(20000psi)并通过以23700g离心30分钟进行澄清。收集上清液并在0.22μm进行过滤。
将6xHis标记的-蛋白质在固定化金属亲和层析(IMAC)上进行纯化，其使用XK16柱和20ml NiNTA树脂(Qiagen)，所述树脂预先用20mM含有10mM NaCl的磷酸钾缓冲液(pH8.0)或含有500mM精氨酸的PBS缓冲液pH 8.0进行平衡。将可溶性组分以至多4ml/min的速率进行负载(产生“流过级分”)。装载到柱上后，将该柱用含有10mM NaCl的60ml的20mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)以4ml/min的速率进行洗涤，得到“洗涤级分#1”。进行第二次洗涤，其使用相同缓冲液+10mM咪唑，得到“洗涤级分#2”。使用含有200mM或/和500mM咪唑的相同缓冲液进行洗脱。
通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析洗脱级分中的样品。用含有10mM NaCl的5升20mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)对含有所述蛋白质的样品进行透析。蛋白质浓度使用Lowry方法进行测定。
实施例4：使用含有精氨酸的缓冲液的蛋白质纯化(MC-001、MC-005和MC-007)
将在摇瓶(实施例3)或发酵罐(实施例5)中诱导后所得的各细菌沉淀物重新混悬于30ml PBS缓冲液+500mM精氨酸pH8.0和Roche COMPLETE(美国注册商标)蛋白酶抑制剂混合物(1片/50ml缓冲液)中。或者，将发酵细胞糊(≈7g)重新混悬于含500mM精氨酸的90mlPBS缓冲液pH8.0和Roche COMPLETE(美国注册商标)蛋白酶抑制剂混合物(1片/50ml缓冲液)中。
将细胞裂解液用弗氏细胞压碎器进行2或3次萃取(20000psi)并通过以23700g在4℃离心30分钟进行澄清。收集上清液并以0.22μm进行过滤。将6xHis标记的-蛋白质在固定化金属亲和层析(IMAC)上进行纯化，其使用XK16柱和80ml NiNTA树脂(Qiagen)，所述树脂预先用PBS缓冲液+500mM精氨酸pH 8.0进行平衡。将可溶性组分以至多4ml/min的速率进行负载(产生“流过级分”)。装载到柱上后，将该柱用相同缓冲液进行洗涤，然后用含有10mMNaCl的20mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)以4-6ml/min的速率进行洗涤，得到“洗涤级分#1”。使用相同缓冲液+10mM咪唑进行第二洗涤，得到“洗涤级分#2”。使用相同缓冲液+200mM咪唑或500mM咪唑进行洗脱。在其他洗脱小瓶中，加入5mM最终浓度的EDTA。
将从洗脱级分中得到的样品用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。将含有蛋白质的样品用含有10mM NaCl和5mM EDTA的5升20mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)进行透析。使用Lowry方法确定蛋白质浓度。
此方案可用于其他的6xHis标记的-蛋白质。
实施例5：发酵
可使用以下发酵过程：
工作种子是烧瓶生长的大肠杆菌BLR(DE3)或BLR(DE3)-衍生的菌株的冷冻等分，所述菌株被含有编码特异性抗原候选重组蛋白质构建体的序列的pET26b衍生物所转化。
将工作种子(WS)从冷冻库取出、解冻并用于接种含预培养物介质的Erlenmeyer烧瓶。种子和烧瓶培养物的操作在层流(LAF)罩或生物学安全工作橱(BSC)下无菌完成。该预培养烧瓶通常在30℃-37℃，以200RPM的搅拌速度培养，其时间为达到在650nm处的光密度(OD650nm)是1.0至3.0所需的时间，通常为4–6小时。
20L发酵罐是通过就地清洗(Clean-In-Place)制备的，接着进行自动蒸汽灭菌。将起始培养基在无菌条件下转移到该发酵罐中。将充满25％NH4OH的瓶与该发酵罐无菌连接用于自动pH控制。通过加入NH4OH溶液将起始培养基的初始pH调节至目标pH。使用注射器通过在顶板中的隔膜加入辐照止泡剂。将填充有原料介质的小瓶无菌连接至该发酵罐。进样是通过pO2-级联(控制溶解氧)或预编程的进样曲线控制的。搅拌是通过pO2-级联或预编程的搅拌曲线控制的。
初始发酵罐参数通常如下所示：
·温度：28℃-32℃
·压力：0.5barg(7psi)
·空气流速：2VVM(每分钟容器体积)
·pH：通过加入25％NH4OH调节至6.8。
该预培养物的等分部分(通常为5ml–50ml)用于利用注射器通过在该发酵罐顶板的隔膜进行添加以接种该起始发酵罐介质。发酵培养的阶段是：
·批量阶段：使用碳源将生物质蓄积在起始培养基中。
·补料分批阶段：根据pO2-级联控制或预编程的进样曲线引入进样培养基。通过进样培养基中的碳源继续蓄积生物物质。
·诱导阶段：所述重组蛋白质抗原的表达通过将IPTG溶液加至发酵罐中的培养物中进行诱导。
收集时，通常将培养物在1L的离心瓶中进行收集并离心以从液体上清液级分中分离固体沉淀物(细胞糊)级分。将该上清液丢弃，并记录细胞湿重(固体沉淀物)并将该细胞糊袋在-20℃储存。
也可使用以下操作：
大肠杆菌标准预培养物
各标准预培养物是使用大肠杆菌菌株的冷冻种子培养物制备的。这些菌株是BLR(DE3)菌株，所述菌株被含有编码待评估的具体构建体的序列的pET26b衍生物所转化。
将该种子培养物解冻到室温并使用400μl以接种含有400ml的预培养物培养基的2L Erlenmeyer烧瓶(改编自Zabriskie等人(J.Ind.Microbiol.2：87-95(1987))。
然后将所接种的烧瓶在37℃(±1℃)和200rpm进行培养。培养6h后停止该预培养。在这一步中，在650nm处的光密度(OD650nm)约为2。一旦该培养结束，便使用预培养物以接种发酵罐中的培养基。
20L规格的分批补料发酵
方法
使用20L的发酵罐(Biolafitte)。将9L的批量阶段培养基无菌转移至该发酵罐中。将该培养基的pH通过加入碱来再次调节至6.8。再将1ml的未稀释的辐照止泡剂(SAG 471)加至该发酵罐中。然后在接种前设置温度(28℃)、排出压力(head pressure)(0.5bar)、通气速率(每分钟20L鼓泡空气)和起始搅拌速度(300rpm)。在这些条件下的溶解氧水平为100％。在发酵过程中，将所述排出压力和通气速率维持在恒定的水平。
根据下式，通过加入1当量的10ml OD650nm＝2的预培养物来完成接种(如上述在实施例2中制备)：
在批量阶段(0-15h)，所述温度维持在28℃。将溶解氧的水平设置在20％。当溶解氧(DO)下降到低于20％时，通过增加搅拌来调节所述DO水平。葡萄糖耗尽导致DO增加并伴有搅拌下降。
当葡萄糖耗尽时，所述进料速率是基于上升至超过7.0的pH信号起始的。从该点开始，该进料速率受控于需氧量，当溶解氧趋于降低至低于20％设置点时，提高流速。在这一步骤中，所述搅拌速率维持在900rpm。
在分批补料阶段(诱导前)，通过加入碱来维持所述pH在6.8，将该温度调节在30℃。
应用两个策略以产生所述蛋白质：
当用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在80±5的光密度诱导培养物时，通常在培养40h后，施用所述“高细胞密度诱导”(HCDI)。将该温度维持在28℃且进样速率仍由需氧量控制恒定搅拌速率为900rpm。
所述“低细胞密度诱导”(LCDI)过程是指该诱导，通常在24h的培养之后达到40±5的光密度。该温度降至30℃，然后施加0.5ml/min的恒定进样速率。然后将1mM IPTG加至该培养物中。在这一步中，通过控制搅拌速率将所述DO水平维持在20％。
在诱导期结束时(72h)，通过离心收集细胞糊(6,500xg，4℃持续1h)，并在-20℃储存。
图1和2描述了用HCDI和LCDI方法的标准发酵图以及在20L规格的分批补料发酵过程中所监测的参数。
表4显示了在发酵罐中所评估的构建体以及各自所得到的UspA2产量。
表4
His＝组氨酸
图3描述的是表4中的UspA2产量与所述在发酵罐中所评估的构建体的图形式。
在该图中，UspA2产量受到构建体中所存在的组氨酸残基的影响(p<0.05，单因素，三级，II型ANOVA)。观察到组氨酸残基数与UspA2发酵产量之间的正相关，在分批补料发酵中0与6个残基之间产量的增幅超过400％。
还观察到，添加到半螺旋结构(MC-003构建体)的一个组氨酸残基产生大约1g/l蛋白质的UspA2产量。
实施例6：蛋白质表征
分析型超速离心
分析型超速离心被用于通过测量分子响应于离心力的移动速率来确定在蛋白质样品中的不同物质在溶液中的均匀性和尺寸分布。这是基于由沉降速度试验得到的不同物种的沉降系数计算的，其取决于它们的分子形状和质量。
在AN-60Ti转子被平衡至15℃后，将以下蛋白质样品在Beckman-CoulterProteomeLab XL-1分析型超速离心机上以28 000RPM进行旋转。
a.MC-005lot BMP53，675μg/ml在20mM NaPO4、10mM NaCl中，pH8.0
b.MC-001lot BMP13，545μg/ml在20mM NaPO4、10mM NaCl中，pH8.0
c.MC-001lot BMP14，545μg/ml在20mM NaPO4、10mM NaCl中，pH8.0
d.MC-001lot BMP54，445μg/ml在20mM NaPO4、10mM NaCl中，pH8.0
e.MC-007lot BMP70，510μg/ml在20mM NaPO4、10mM NaCl中，pH8.0
为了数据收集，在280nm处每5分钟记录一次，共记录133到325次扫描结果。
使用用于确定C(S)分布的程序SEDFIT(通过National Institutes for Health获得)进行数据分析。所述C(S)分布代表的是在由于它们沉降系数而分离的大分子混合物中不同组分的相对强度，其为分子大小和构象的函数。在15℃对所述蛋白质的微分比容的确定是依据它们的氨基酸序列用SEDNTERP软件完成的。SEDNTERP(SEDNTERP通过新罕布什尔大学的Biomolecular Interaction Technologies Center发布并支持)也用于确定所述缓冲液在15℃的粘度和密度。
通过将样品整体分布曲线下的总面积视为100％并计算每个种类的贡献所代表的这个总面积的百分比来完成对所有种类的相对丰度的确定。C(S)分布图(浓度vs沉降系数)已用于该计算，认为其相比于C(M)分布(浓度vs分子量)能更好地代表原始数据。
不同纯化的构建体的分析型超速离心能够观察到，当在纯化前的细胞裂解过程中加入500mM L-精氨酸时，具有C末端his标记的UspA2 Δhelix、UspA2 1/2 helix和UspA2全螺旋在溶液中主要以三聚体存在(图4、5、7和8)。
当在细胞裂解过程中没有加入L-精氨酸时，观察到大小不均匀分布的UspA2 1/2helix。观察到两种主要的群体。用该蛋白质制剂无法确定通过AUC(分析型超速离心)检测的种类的分子量，因为对分子量评估而言必不可少的摩阻比需要从均匀的样品进行计算。但是，基于沉降系数，所观察的种类应该并没有对应于在其他样品中所观察到的三聚体。
图4描述的是通过沉降速度分析型超速离心确定的纯化的MC-005的分子量分布。大多数蛋白质被发现为三聚体，含一小部分的高分子量低聚物，其对应的是三聚体的二聚物。
图5描述的是由沉降速度分析型超速离心确定的纯化的MC-001的分子量分布。大多数蛋白质被发现为三聚体。
图6描述的是由沉降速度分析型超速离心确定的纯化的MC-001的分子量分布。该样品呈现多个种类且是高度多分散的。所检测的主要种类的沉降系数不对应于在其他组中正常检测出的三聚体中的一种。
图7描述的是由沉降速度分析型超速离心确定的纯化的MC-001的分子量分布。大多数蛋白质被发现为三聚体。
图8描述的是由沉降速度分析型超速离心确定的纯化的MC-007的分子量分布。大多数蛋白质被发现为三聚体。
圆二色谱/二级结构
圆二色谱(CD)是通过测量左侧偏振光与右侧偏振光的吸收差异来确定蛋白质组合物的二级结构组成的，所述差异是由于结构不对称。在远紫外区(190-250nm)CD光谱的形状和强度是不同的，无论蛋白质呈现β折叠、α-螺旋或无规卷曲结构。在给定蛋白质样品中的各二级结构类型的相对丰度可通过与参考光谱比较进行计算。
远UV光谱是使用178到250nm处的0.01cm光程，以及1nm分辨率和带宽在Jasco J-720分光偏振计上测量的。该细胞的温度通过Peltier恒温RTE-111单元块维持在不同温度。测量过程中维持10L/min的氮气流。
将以下蛋白质构建体的浓度调节至在20mM NaPO4、10mM NaCl，pH8.0的缓冲液中400μg/ml。
a.MC-005lot BMP53，在20mM NaPO4、10mM NaCl中，pH8.0
b.MC-001lot BMP13，在20mM NaPO4、10mM NaCl中，pH8.0
c.MC-001lot BMP14，在20mM NaPO4、10mM NaCl中，pH8.0
d.MC-001lot BMP54，在20mM NaPO4、10mM NaCl中，pH8.0
e.MC-007lot BMP70，在20mM NaPO4、10mM NaCl中，pH8.0
二级结构的计算结果已通过使用以下算法完成：
Selcon 3(Sreerama和Woody，Anal.Biochem.(1993)，209，32；Sreerama和Woody，Biochemistry，33，10022-25(1994)；Sreerama等人Protein Science,8,370-380(1999)；Johnson W.C.Jr.,Proteins:Str.Func.Genet.35,307-312(1999))
CDSSTR(Johnson W.C.Proteins:Struc.Func.Genet.35,307-312(1999)由Sreerama.N.修改(Anal.Biochem.,287,252(2000))。
所显示的结果是用这两种算法计算的百分比平均值且处于5％的误差范围内。
发酵罐中表达的蛋白质的二级结构计算结果显示于表5，考虑到了5％的误差范围。
表5：在22℃的二级结构计算值
| 蛋白质 | 螺旋 | β | 无规 |
| MC-005BMP53 | 40.8 | 26.4 | 34.1 |
| MC-007BMP70 | 58.2 | 18.2 | 24.7 |
| MC-001BMP54 | 53.7 | 14.2 | 34.4 |
计算结果与该光谱的形状和视觉分析一致，其中螺旋含量在208和220nm处随最小强度升高。蛋白质由高比例的螺旋结构组成，伴有β结构的存在。
在图9中光谱的重叠显示在构建体形状上没有显著的差异。MC-005螺旋的光谱显示较低的强度，其可以是由于较少的α结构，这与不存在C末端螺旋相一致。
图9显示出UspA2构建体MC-001、MC-005和MC007的远UV圆二色谱光谱，给出了蛋白质二级结构的指示。光谱的重叠清楚地显示含有半C末端螺旋和全C末端螺旋的构建体在它们的二级结构中没有可检测到的差异，而不具有螺旋的构建体产生的光谱在强度上有差异，其可以是由于不同的二级结构含量。
热解折叠
在热解折叠过程中，在不同温度测量的远-UV CD光谱显示MC-005不如MC-007热稳定。MC-005在33℃所观察到的光谱类似于解折叠蛋白质的典型光谱。对于MC-007构建体，即使在33℃观察到二级结构的部分丧失，但是完全的解折叠发生在35℃至37℃。这可指示含有全螺旋构建体MC-007具有更高热稳定性。
图10显示了在MC-005(UspA2Δhelix+6His)的热解折叠过程中通过圆二色谱监测的二级结构。该光谱的视觉分析清楚地显示了该蛋白质在33℃丧失了其大部分二级结构。
图11显示了在MC-007(UspA2+螺旋+6His)的热解折叠过程中通过圆二色谱监测的二级结构。该光谱的视觉分析显示相比于无螺旋的构建体其二级结构的丧失较慢。一旦加热至33℃，结构变化为可测的，但是完全解折叠发生在35℃至37℃。
差示扫描量热法(DSC)热解折叠
比较不同的UspA2构建体的热转化以评估C-末端螺旋修饰对蛋白质的热稳定性的影响。
在MicroCal(GE Healthcare的一部分)的VP-DSC上进行分析。缓冲液20mM NaPO4，10mM NaCl，5mM EDTA，pH8用作参照并从扫描中减去。在温度梯度之前将蛋白质在起始温度平衡15分钟，然后以90℃/小时的加热速率从10℃到60℃进行DSC扫描。
在MC-001和MC-007构建体中检测到两个转化而在MC-005中仅检测到1个。不同构建体的转化值(或Tm)可见于表6。
虽然全部这三种蛋白质的较低Tm大约为32℃，但是主要区别是第二Tm的值。相比于半螺旋(MC-001)的34.5℃，含有全螺旋的构建体(MC-007)具有较高的Tm(37.5℃)。
已经证实，对于MC-001和MC-007，在32℃附近的第一Tm是可逆的，而较高的Tm是不可逆的。对于MC-005，可检测的唯一的Tm是不可逆的。
表明含全螺旋的构建体MC-007的热稳定性更高。
表6：通过DSC测定的UspA2构建体的熔点
| 构建体 | [mg/mL] | Tm1(℃) | Tm2(℃) |
| MC-005lotBMP53 | 0.400 | 31.74 | ----- |
| MC-001lotBMP54 | 0.400 | 32.02 | 34.51 |
| MC-007lotBMP70 | 0.400 | 32.19 | 37.50 |
质谱法
UspA2蛋白质样品是由蛋白质沉淀，通过CHCl3/MeOH/H2O系统制备的。将蛋白质沉淀物在微量离心管底部进行离心，然后在氮气下慢慢干燥。然后将所干燥的沉淀物溶于2μl的纯净的甲酸中，然后用3μl超纯水和5μl芥子酸稀释。用作MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析仪)分析的基质的芥子酸在补充有0.1％的最终浓度的TFA的50％CH3CN/50％H2O中进行制备。
将1μl的所述样品+基质的混合物点在Bruker 384标准不锈钢MALDI靶上并使其干燥以在室温和大气压下结晶(干滴法)。
UspA2质谱分析在Bruker Ultraflex 2MALDI-TOF质谱仪(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)上以正电离和线性模型进行。将在芥子酸基质中共结晶的蛋白质样品用smartbeam激光照射。完整的UspA2蛋白质的质量测量是在10.000-100.000Da的质量范围内用25千伏的加速电压进行的。激光衰减被微调以尽可能获得最佳的蛋白质信号并避免任何断裂以及背景过度电离现象。该质谱仪的校准是在用同源矩阵的闭合外部方法并使用市售Bruker蛋白质校准混合物2，通过在以下校准器上的准确测量完成的：在m/z 22307Da，蛋白质A的[M+2H]2+(在离子化过程中向该蛋白质中加上两个H+离子后，通过MS检测器测得的质量)种类、在m/z 23982Da的胰蛋白酶原的[M+H]+种类、在m/z 44613Da，蛋白质A的[M+H]+种类和在m/z 66431Da的牛白蛋白[M+H]+种类。各个所呈现的光谱是由500个单独的照射的总和得到的。
分析以下样品：
在N-末端有MQAK氨基酸的MC-001构建体(SEQ ID NO：85)在摇瓶lot opt-01中产生，在N-末端有MAK氨基酸的MC-011构建体在摇瓶lot BMP37中产生。
在表7和图12中，在N-末端有MQAK氨基酸的MC-001蛋白质(SEQ ID NO：85)中，该末端已显示出被至少部分去甲硫氨酰化，如相比于预期质量57565Da，所测分子质量为所示出的57427Da。另一个57620Da的峰可代表完全未去甲硫氨酰化的蛋白质、N-乙酰化蛋白质或另一修饰的蛋白质群。
图12描述了MC-001lot opt-01的MALDI谱。在57427Da观察到的质量可与去甲硫氨酰化蛋白质相关，而在57620Da的峰可对应于该完整蛋白质。
如表7和图13所示，在N末端有MAK氨基酸的MC-011蛋白质在MALDI-MS提供主要群体，其可对应的是去甲硫氨酰化蛋白质，相比于基于完整氨基酸序列所预期的57437Da的质量而言具有57265Da的质量。由于在+186Da和+366Da的两个另外的峰与任何预期的翻译后修饰均不接近，因此它们无法通过这个实验鉴定。
表7：通过MALDI-MS测量的两个UspA2构建体的分子质量。这两个构建体的主要测量质量均比从氨基酸序列预期的要低。用这两个构建体得到的主要群体的质量可与去甲硫氨酰化蛋白质相关。
通过埃德曼降解进行N末端测序
为了评估N-末端区域的最优化(与N-末端甲硫氨酸相邻的氨基酸序列的最优化)是否导致所述蛋白质的去甲硫氨酰化，已经对在N-末端携带MAK氨基酸的MC-011构建体进行N-末端测序。
将该蛋白质通过SDS PAGE在Invitrogen的Novex 4％-20％聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，然后转移至Problot PVDF(聚偏氟乙烯)(Bio-Rad)膜上。将该膜用氨基黑染色。然后将感兴趣的条带剪切并根据制造商的方案使用Applied Biosystems Procise序列分析系统进行分析。进行12个循环的埃德曼降解。
所得N-末端氨基酸序列是AKNDITLEDLP(SEQ ID NO：86)，其对应于起始于最初甲硫氨酸之后第二位氨基酸的蛋白质的N末端。这表明所述成熟的蛋白质大体上被去甲硫氨酰化。
实施例7：UspA2构建体MC-001：杀菌活性
杀菌试验
将粘膜炎莫拉菌在37℃+5％CO2的培养皿中培养过夜。将细菌转移到12ml的0.1％HBSS-BSA(含牛血清白蛋白的Hank缓冲盐溶液)缓冲液以得到0.650的OD620。将血清样品在56℃加热45min以灭活内源性补体。将一系列两倍稀释在SBA缓冲液(0.1％HBSS–BSA)中的血清加至96-孔圆底微量滴定板(25μl/孔)中。然后，将50μl的SBA缓冲液加至各孔中。然后将25μl的410^4cfu/ml的粘膜炎莫拉菌菌株加至含有血清的孔中并在室温培养15min。最后加入在0.1％HBSS-BSA中稀释8倍的25μl刚解冻的幼兔补体以达到125μl的最终体积。通过轨道振荡(210rpm)，将板在37℃培养1h。该反应通过将微孔板铺在冰上至少5分钟来停止。
均质化后，将不同稀释度的混悬液(细菌、血清、补体和缓冲液的混合物，体积125μl，如上段所讨论)加到巧克力琼脂板上并在37℃、5％CO2下培养24小时并对粘膜炎莫拉菌菌落进行计数。
不含血清样品的8个孔用作细菌对照以确定每孔的粘膜炎莫拉菌菌落数。确定对照孔的CFU(菌落形成单位)的平均值并用于计算各血清样品的杀灭活性。杀菌滴度表示为诱导50％杀菌的血清稀释度的倒数。
在小鼠、豚鼠和兔子中针对MC-001产生的抗-UspA2抗血清在上文所述的针对20种不同的粘膜炎莫拉菌菌株的杀菌试验中进行测定，所述菌株是从不同国家(美国、芬兰、荷兰、挪威、瑞典)的不同组织(血液、痰、鼻、中耳液)中分离的。
如下所示，抗-UspA2抗体能够诱导粘膜炎莫拉菌的交叉杀菌(cross-bactericidal killing)，无论所测菌株所表达的UspA2的同源百分比是多少。此外也显示了针对菌株的杀菌活性，所述菌株仅表达UspA1或嵌合蛋白UspA2H。正如预期的那样，没有检测到或仅检测到弱的针对UspA1和UspA2双敲除突变体的杀菌抗体滴度。
表8：在小鼠，豚鼠和兔子中产生的抗-UspA2MC-001抗体的交叉杀菌活性。1+2KO是UspA1&UspA2双敲除。1KO的仅UspA1敲除。MEF(AOM)＝中耳液(急性中耳炎)。在所分离的来源一栏中的“/”＝不清楚所分离的来源。
**使用软件GapL/ClustaIX对比所述ATCC25238 UspA2片段AA30-540所确定的。
表9：在表8的粘膜炎莫拉菌菌株中的UspA表达。
实施例8：在肺定植的小鼠模型中的保护(MC-001)
将5周龄雌性Balb/c小鼠(n＝8/5组)通过肌内途径在第0、14和28天用含有10μg的调配在AS02V中的UspA2构建体MC-001的50μl疫苗进行免疫。小鼠在第42天用5.105CFU的不同粘膜炎莫拉菌菌株进行鼻内激发。对激发后0、3和6小时收集的肺中的细菌进行计数。组间差异使用Dunnet检验进行分析。
如表10中所归纳的，UspA2构建体MC-001诱导针对同源性和异源性菌株(包括表达UspA1但不表达UspA2的菌株43617和表达嵌合蛋白UspA2H的BBH18菌株(其由UspA1的N-末端序列和UspA2的C-末端序列构成))的显著保护。
表10：UspA2MC-001构建体的保护效力
*使用GapL/ClustalX软件对比ATCC25238 UspA2片段AA 30-540所确定的。
粗体p值是显著的(p<0.05)
实施例9：UspA2构建体MC-007：抗体杀菌活性
杀菌试验
将粘膜炎莫拉菌25238在37℃+5％CO2的培养皿中培养过夜。将细菌转移到12ml0.1％HBSS-BSA缓冲液中以得到0.650的OD620。将血清样品在56℃加热45min以灭活内源性补体。将一系列两倍稀释在SBA缓冲液(0.1％HBSS–BSA)中的血清加至96-孔圆底微量滴定板(25μl/孔)中。然后，将50μl的SBA缓冲液加至各孔。然后将25μl的410^4cfu/ml的粘膜炎莫拉菌25238菌株加至含有血清的孔中并在室温培养15min。最后加入在0.1％HBSS-BSA中稀释8倍的25μl刚解冻的幼兔补体以达到125μl的最终体积。通过轨道振荡(210rpm)，将板在37℃培养1h。该反应通过将微孔板铺在冰上至少5分钟来停止。均质化后，将不同稀释度的混悬液加到巧克力琼脂板上并在37℃、5％CO2培养24小时并对莫拉菌菌落进行计数。不含血清样品的8个孔用作细菌对照以确定每孔的粘膜炎莫拉菌菌落数。确定对照孔的CFU的平均值并用于计算各血清样品的杀灭活性。杀菌滴度表示为诱导50％杀菌的血清稀释度的倒数。
在小鼠中用UspA2构建体MC-001或MC-007产生的抗-UspA2抗血清在使用针对25238粘膜炎莫拉菌同源性菌株的上述方案的杀菌试验中进行测定。
如表11所示，所述MC-007UspA2构建体诱导高杀菌响应，类似于MC-001所诱导的那样。
表11：抗-UspA2MC-001和MC-007抗体的杀菌活性。正常小鼠血清＝仅接种AS02V而不接种UspA2的小鼠的血清。
实施例10：UspA2构建体MC-007：在肺激发模型中的保护效力
在肺定植小鼠模型中的保护
将5周龄雌性Balb/c小鼠(每组8只小鼠，每个时间点最多5组)通过肌内途径在第0、14和28天用含有10μg调配在AS02V中的UspA2构建体MC-001或调配在AS02V中的MC-007的50μl疫苗进行免疫。小鼠在第42天用5.105CFU的粘膜炎莫拉菌菌株ATCC(美国注册商标)25238TM进行鼻内激发。将小鼠用10μg粘膜炎莫拉菌菌株ATCC(美国注册商标)25238TM的灭活全细胞(作为阳性对照)(在图14中M.cat.WC 25238)或仅用AS02V(作为阴性对照)进行免疫。对激发后0、3和6小时收集的肺中的细菌进行计数。组间差异使用Dunnet检验进行分析。
如图14所示，这两种UspA2构建体类似地抵抗ATCC(美国注册商标)菌株25238TM。
实施例11：UspA2 MC-009蛋白制剂在小鼠中的免疫原性
将25只雌性Balb/c小鼠的组通过肌内(IM)途径在第0、14和28天用50μl的以下制剂进行免疫：
-MC-009(1μg)AlPO4(1000μg/ml)
-MC-009(1μg)AS04C(AlPO4/MPL 100/100每ml)
-MC-009(1μg)AS01E(QS21/MPL 50/50每ml)
使用以下方案，在第28天(PII)和第42天(PIII)测定在所收集的各血清中的抗-IgG水平：
ELISA检测抗-UspA2抗体。
将板在4℃用100μl每孔的4μg/ml UspA2构建体MC-009的碳酸盐缓冲液pH 9.6涂布过夜。将该板用0.09％NaCl 0.05％TWEEN(美国注册商标)20(聚山梨酯20)洗涤三次。洗涤后，将一系列两倍稀释的血清加至在PBS 0.05％TWEEN(美国注册商标)20中的微孔中。将该板在室温放置30分钟同时振荡。洗涤后，加入与过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson 115-035-003)(100μl每孔)，并将该板在室温放置30分钟同时振荡。将该板按上述进行洗涤并将暴露溶液(4mg的OPDA Sigma P8787和5μl的H2O2在10ml柠檬酸盐0.1M PH(pH)4.5)加至各孔(100μl/孔)，持续15min，避光。将该反应通过加入50μl HCl 1N停止并在490nm读取吸光度(620nm为参考滤光片)。
该滴度使用SOFTMAX(美国注册商标)Pro软件，用4-参数方法进行计算。
如图15所示，UspA2用各佐剂制剂诱导高抗体水平。
杀菌试验
所述杀菌试验是使用以下方案，针对表达同源性全长UspA2的粘膜炎莫拉菌菌株(ATCC(美国注册商标)25238TM)进行的：将粘膜炎莫拉菌菌株ATCC(美国注册商标)25238TM在37℃+5％CO2的培养皿中培养过夜。将细菌转移到10ml BHi(心脏浸出液肉汤)中以得到0.650的OD620。将血清样品在56℃加热45min以灭活内源性补体。将一系列两倍稀释在SBA缓冲液(0.1％HBSS–BSA)中的血清加至96-孔圆底微量滴定板(25μl/孔)中。然后，将50μl的SBA缓冲液加至各孔。然后将25μl的410^3cfu/ml的粘膜炎莫拉菌菌株25238TM加至含有血清的孔中并在室温培养15min。最后加入在0.1％HBSS-BSA中稀释8倍的25μl刚解冻的幼兔补体达到125μl的最终体积。通过轨道振荡(210rpm)，将板在37℃培养1h。该反应通过将微孔板铺在冰上至少5分钟来停止。然后将该板各孔的20μl等分转移至96孔平底微板的相应的孔中并将50μl Mueller Hinton肉汤–0.9％琼脂加至各孔中。加入50μl的PBS0.9％琼脂作为第二层。在37℃，5％CO23小时后，将该板在25℃培养过夜，使用自动化图像分析系统(KS400，Zeiss，Oberkochen，Germany)对莫拉菌菌落进行计数。不含血清样品的8个孔用作细菌对照以确定每孔的莫拉菌数。确定对照孔的CFU的平均值并用于计算各血清样品的杀灭活性。杀菌滴度表示为诱导50％杀菌的血清稀释度的倒数。
图16描述由抗同源性菌株UspA2诱导的杀菌滴度。在这个实验中，对于各佐剂制剂，UspA2都诱导高水平杀菌抗体。在PIII检测血清；检测5个血清样品的五个集合。
实施例12：与PD和PE-PilA NTHi抗原结合的UspA2的免疫原性。
免疫方案
将25只雌性Balb/c小鼠的组通过肌内(IM)途径在第0、14和28天用50μl以下制剂进行免疫：
-UspA2构建体MC-009(1μg)AlPO4
-UspA2构建体MC-009(1μg)AS04C
-UspA2构建体MC-009(1μg)AS01E
-UspA2-PD-PEPilA(UspA2构建体MC-009，PEPilA构建体LVL-735)AlPO4(1ug的各UspA2、PD和PEPilA；1000mg/ml的AlPO4)
-UspA2-PD-PEPilA(UspA2构建体MC-009，PEPilA构建体LVL-735)AS04C AlPO4(1ug的各UspA2、PD和PEPilA；100/100每ml的AlPO4/MPL)
-UspA2-PD-PEPilA(UspA2构建体MC-009，PEPilA构建体LVL-735)AS01E(1ug的各UspA2、PD和PEPilA；50/50每ml的QS21/MPL)
ELISA检测抗-UspA2抗体
使用以下方案，在第28天和第42天测定在所收集的各血清中的抗-UspA2IgG水平。
将板在4℃用100μl每孔的4μg/ml UspA2构建体MC-009的碳酸盐缓冲液pH 9.6涂布过夜。将该板用0.09％NaCl 0.05％TWEEN(美国注册商标)20(聚山梨酯20)洗涤三次。洗涤后，将一系列两倍稀释的血清加至在PBS 0.05％TWEEN(美国注册商标)20中的微孔中。将该板在室温放置30分钟同时振荡。洗涤后，加入与过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson 115-035-003)(100μl每孔)，并将该板在室温放置30分钟同时振荡。将该板按上述进行洗涤并将暴露溶液(4mg的OPDA Sigma P8787和5μl的H2O2在10ml柠檬酸盐0.1M PH(pH)4.5中)加至各孔(100μl/孔)，持续15min，避光。将该反应通过加入50μl HCl 1N停止并在490nm读取该吸光度(620nm为参考滤光片)。该滴度使用SOFTMAX(美国注册商标)Pro软件，用4-参数方法进行计算。
ELISA检测抗-PE抗体
将板在4℃用100μl每孔的2μg/ml的UspA2碳酸盐缓冲液pH 9.6涂布过夜。将该板用0.09％NaCl 0.05％TWEEN(美国注册商标)洗涤三次。洗涤后，将一系列两倍稀释的血清加至在PBS 0.05％TWEEN(美国注册商标)20中的微孔中。将该板在室温放置30分钟同时振荡。洗涤后，加入与过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson 115-035-003)(100μl每孔)，并将该板在室温放置30分钟同时振荡。将该板按上述进行洗涤并将暴露溶液(4mgOPDA和5μl的H2O2在10ml柠檬酸盐0.1M PH 4.5中)加至各孔(100μl/孔)，持续15min，避光。将该反应通过加入50μl HCl 1N停止并在490nm读取该吸光度(620nm为参考滤光片)。
该滴度使用SOFTMAX(美国注册商标)Pro软件，用4-参数方法进行计算。
ELISA检测抗-PilA抗体
将板在4℃用100μl每孔的4μg/ml PilA的碳酸盐缓冲液pH 9.6涂布过夜。将该板用0.09％NaCl 0.05％TWEEN(美国注册商标)洗涤三次。洗涤后，将一系列两倍稀释的血清加至在PBS 0.05％TWEEN(美国注册商标)20中的微孔中。将该板在室温放置30分钟同时振荡。洗涤后，加入与过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson 115-035-003)(100μl每孔)，并将该板在室温放置30分钟同时振荡。将该板按上述进行洗涤并将暴露溶液(4mgOPDA和5μl的H2O2在10ml柠檬酸盐0.1M PH 4.5中)加至各孔(100μl/孔)，持续15min，避光。将该反应通过加入50μl HCl 1N停止并在490nm读取该吸光度(620nm为参考滤光片)。
该滴度使用SOFTMAX(美国注册商标)Pro软件，用4-参数方法进行计算。
ELISA检测抗-PD抗体
将板在4℃用100μl每孔的8μg/ml PD的碳酸盐缓冲液pH 9.6涂布过夜。将该板用0.09％NaCl 0.05％TWEEN(美国注册商标)洗涤三次。洗涤后，将一系列两倍稀释的血清加至在PBS 0.05％TWEEN(美国注册商标)20中的微孔中。将该板在室温放置30分钟同时振荡。洗涤后，加入与过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson 115-035-003)(100μl每孔)，并将该板在室温放置30分钟同时振荡。将该板按上述进行洗涤并将暴露溶液(4mg OPDA和5μl的H2O2在10ml柠檬酸盐0.1M PH 4.5中)加至各孔(100μl/孔)，持续15min，避光。将该反应通过加入50μl HCl 1N停止并在490nm读取该吸光度(620nm为参考滤光片)。
该滴度使用SOFTMAX(美国注册商标)Pro软件，用4-参数方法进行计算。
杀菌试验
使用以下方案，在第42天测量在所收集的混合血清(5个集合/组)中的杀菌滴度：
将粘膜炎莫拉菌在37℃+5％CO2的培养皿中培养过夜。将细菌转移到10ml BHi(心脏浸出液肉汤)培养基中以得到0.650的OD620。将血清样品在56℃加热45min以灭活该内源性补体。将一系列两倍稀释在SBA缓冲液(0.1％HBSS–BSA)中的血清加至96-孔圆底微量滴定板(25μl/孔)中。然后，将50μl的SBA缓冲液加至各孔。然后将25μl的4 10^3cfu/ml的粘膜炎莫拉菌菌株25238加至含有血清的孔中并在室温培养15min。最后加入在0.1％HBSS-BSA中稀释8倍的25μl刚解冻的幼兔补体以达到125μl的最终体积。通过轨道振荡(210rpm)，将板在37℃培养1h。该反应通过将微孔板铺在冰上至少5分钟来停止。然后将该板各孔的20μl等分转移至96孔平底微板的相应的孔中并将50μl Mueller Hinton肉汤–0.9％琼脂加至各孔中。加入50μl的PBS 0.9％琼脂作为第二层。在37℃，5％CO2 3小时后，将该板在25℃培养过夜。使用自动化图像分析系统(KS 400，Zeiss，Oberkochen，Germany)对莫拉菌菌落进行计数。不含血清样品的8个孔用作细菌对照以确定每孔的莫拉菌数。确定对照孔的CFU的平均值并用于计算各血清样品的杀灭活性。杀菌滴度表示为诱导50％杀菌的血清稀释度的倒数。
该杀菌试验是针对表达同源UspA2的粘膜炎莫拉菌菌株25238TM进行的。
在AS04C(post III)和AS01E(post II)制剂中观察到PD和PE-PilA抗原的存在对UspA2IgG水平的负面影响(图17)。但是该影响是有限的(≤2倍的抗体减少)且并未在杀菌试验中被证实(图18)。由PE-PEPilA-UspA2疫苗诱导的针对小鼠PD、PE和PilA的IgG响应分别如图19、图20和图21所示。
因此，当UspA2与PD和PE-PilA组合时是免疫原性的。
实施例13：UspA2构建体MC-009：在小鼠中结合UspA2的PD和PE-PilA
NTHi抗原的
免疫原性
免疫方案
将25只雌性Balb/c小鼠的组通过肌内(IM)途径在第0、14和28天用50μl的以下制剂进行免疫：
-PD-PEPilA(1μg的PD和1ug的PEPilA构建体LVL-735)AS01E
-UspA2-PD-PEPilA(1μg的UspA2构建体MC-009、PD和PEPilA构建体LVL-735)AS01E
在第28天(PII)和第42天(PIII)测定在所收集的单独的血清中针对PD、PE和PilA的ELISA IgG水平。
ELISA检测抗-PE抗体
将板在4℃用100μl每孔的2μg/ml UspA2的碳酸盐缓冲液pH 9.6涂布过夜。将该板用0.09％NaCl 0.05％TWEEN(美国注册商标)洗涤三次。洗涤后，将一系列两倍稀释的血清加至在PBS 0.05％TWEEN(美国注册商标)20中的微孔中。将该板在室温放置30分钟同时振荡。洗涤后，加入与过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson 115-035-003)(100μl每孔)，并将该板在室温放置30分钟同时振荡。将该板按上述进行洗涤并将暴露溶液(4mgOPDA和5μl的H2O2在10ml柠檬酸盐0.1M PH 4.5中)加至各孔(100μl/孔)，持续15min，避光。将该反应通过加入50μl HCl 1N停止并在490nm读取该吸光度(620nm为参考滤光片)。
该滴度使用SOFTMAX(美国注册商标)Pro软件，用4-参数方法进行计算。
ELISA检测抗-PilA抗体
将板在4℃用100μl每孔的4μg/ml PilA的碳酸盐缓冲液pH 9.6涂布过夜。将该板用0.09％NaCl 0.05％TWEEN(美国注册商标)洗涤三次。洗涤后，将一系列两倍稀释的血清加至在PBS 0.05％TWEEN(美国注册商标)20中的微孔中。将该板在室温放置30分钟同时振荡。洗涤后，加入与过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson 115-035-003)(100μl每孔)，并将该板在室温放置30分钟同时振荡。将该板按上述进行洗涤并将暴露溶液(4mgOPDA和5μl的H2O2在10ml柠檬酸盐0.1M PH 4.5中)加至各孔(100μl/孔)，持续15min，避光。将该反应通过加入50μl HCl 1N停止并在490nm读取该吸光度(620nm为参考滤光片)。
该滴度使用SOFTMAX(美国注册商标)Pro软件，用4-参数方法进行计算。
ELISA检测抗-PD抗体
将板在4℃用100μl每孔的8μg/ml PD的碳酸盐缓冲液pH 9.6涂布过夜。将该板用0.09％NaCl 0.05％TWEEN(美国注册商标)洗涤三次。洗涤后，将一系列两倍稀释的血清加至在PBS 0.05％TWEEN(美国注册商标)20中的微孔中。将该板在室温放置30分钟同时振荡。洗涤后，加入与过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG抗体(Jackson 115-035-003)(100μl每孔)，并将该板在室温放置30分钟同时振荡。将该板按上述进行洗涤并将暴露溶液(4mg OPDA和5μl的H2O2在10ml柠檬酸盐0.1M PH 4.5中)加至各孔(100μl/孔)，持续15min，避光。将该反应通过加入50μl HCl 1N停止并在490nm读取该吸光度(620nm为参考滤光片)。
该滴度使用SOFTMAX(美国注册商标)Pro软件，用4-参数方法进行计算。
观察到，加入UspA2对AS01E中PD和PEPilA的免疫原性没有大的影响，如图22、23和24所示。
实施例14：在小鼠粘膜炎莫拉菌肺炎模型中，含有UspA2的四价疫苗制剂的安全性。
为了降低在用候选疫苗免疫的COPD患者肺中产生不良炎症反应的风险(所述疫苗旨在预防由不可分型的流感嗜血菌(NTHi)和粘膜炎莫拉菌(M.cat.)造成的恶化)，开发和使用各种动物模型以评估该疫苗的安全性。所测制剂含有三种NTHi抗原(PD、PE和PilA，后两者结合成为PEPilA融合蛋白)、一种M.cat.抗原(UspA2)和佐剂系统01E(AS01E)。
两种模型专门用于评估该疫苗的UspA2组分的安全性。
模型1：
·目的
这个模型旨在评估接种后在发炎的肺中可能诱导的不良免疫应答。
·研究设计
通过在第0、7和14天三次鼻内给药25μg热灭活的M.cat.菌株ATCC(美国注册商标)25238TM全细胞(表达UspA2，其与所述疫苗UspA2是100％同源的的)将C57Bl/6小鼠致敏。这种处理诱导在肺中的血管周围和细支气管周炎症(伴有集合淋巴结的形成)、肺泡炎、肺炎、纤维变性和强M.cat.全细胞特异性IL-17+CD4+T细胞响应，其结合模仿了在COPD患者肺中观察到的炎性过程(除了肺气肿)。
然后将小鼠通过肌内途径在第42天用以下制剂的人剂量的1/10进行接种：
-PD 10μg/PEPilA(LVL735构建体，描述于WO2012/139225)10μg/UspA2(MC009构建体)10μg/AS01E
-PD 10μg/PEPilA(LVL735构建体)10μg/UspA2(MC009构建体)3.3μg/AS01E
-AS01E(阴性对照)
-PBS(阴性对照)
为了评估这些制剂对致敏诱导的肺炎的影响：
-从第43天到第49天每天监测小鼠以观察死亡率和指示产生不良事件的任何临床迹象(虚脱、竖毛、弓背姿势)。
-在接种后第2、7和14天进行肺的组织学分析(每组和每个时间点5只小鼠)以观察可能的炎症恶化。
-在接种后第7天和第14天所收集到的肺集合上评估是否诱导了潜在的不希望的T细胞应答(4个集合/组/时间点且每个集合为3只小鼠的肺)。将肺的T细胞用UspA2肽、热灭活的M.cat.全细胞(WC)或培养基(作为阴性对照)进行再刺激过夜，然后用流动细胞计数分析CD5、CD4、CD8、IL-17、IL-13、TNFα和IFNγ的表达。
·结果
-未报道死亡和不良事件。
-肺组织学(图25-29)：
ο在肺中观察到的变化在所有组中的严重程度方面是类似的且特征在于轻度到中度的血管周/支气管的单核细胞浸润。
ο没有观察到与免疫有关的肺泡炎和/或肺炎。
-T细胞响应：
ο一旦用WC再刺激，在肺中检测到强的CD4+T细胞响应(主要是产生IL-17和TNFα的细胞)(图30-33)，但这与所施用的制剂(仅用疫苗或佐剂或使用PBS)无关。观察到低的或没有肺CD8+T细胞响应(数据未显示)。
ο无论哪组都没有可检测的T细胞响应被UspA2肽再刺激，这表明UspA2-特异性响应在免疫后没有被引发或提高(数据未显示)。
模型2：
·目的
这个模型旨在评估免疫和M.cat.激发后在发炎的肺中可能诱导的不良免疫应答。
·研究设计
将C57Bl/6小鼠依次：
-在第0、7和14天通过三次鼻内给药25μg的热灭活M.cat.菌株25238WC(表达UspA2，其与所述疫苗UspA2是100％同源的)进行致敏(如模型1)。
-在第42天，通过肌内途径用以下制剂的人剂量的1/10进行接种(如模型1)：
·PD(10μg/PEPilA(LVL735构建体)10μg/UspA2(MC009构建体)10μg/AS01E
·PD 10μg/PEPilA(LVL735构建体)10μg/UspA2(MC009构建体)3.3μg/AS01E
·AS01E(阴性对照)
·PBS(阴性对照)
-通过在第56天，一次鼻内给药25μg热灭活M.cat.菌株F10WC(表达UspA2，其与所述疫苗UspA2共享53％的同源性)或通过一次鼻内给药PBS作为对照进行激发。该激发菌株不同于致敏菌株，其用于模仿在由于新获得的M.cat.菌株而经历新的恶化的COPD患者中观察到的情况。
为了评估免疫和激发对致敏诱导的肺炎的影响：
-从第43天到第63天每天监测小鼠以观察死亡率和指示产生不良事件的任何临床迹象(虚脱、竖毛、弓背姿势)。
-在激发后第7天和第14天所收集到的肺集合上评估是否诱导了潜在的不希望的T细胞应答(4个集合/组/时间点和每个集合为3只小鼠的肺)。将所述肺的T细胞用UspA2肽、热灭活的M.cat.全细胞(WC)或培养基(作为阴性对照)进行再刺激过夜，然后用流动细胞计数分析CD5、CD4、CD8、IL-17、IL-13、TNFα和IFNγ的表达。
·结果
-未报道死亡和不良事件。
-T细胞响应：
ο一旦用F10WC再刺激，在所述肺中检测到强的激发后CD4+T细胞响应(主要是产生IL-17和TNFα的细胞)，但这与所施用的制剂(仅用疫苗或佐剂或使用PBS)无关(图34-37)。意料之中地，在用灭活细菌激发的小鼠中的这些响应高于用PBS激发的小鼠的这些响应。无论是何种激发，观察到低或无肺CD8+T细胞响应(数据未显示)。
ο没有可检测的T细胞响应被UspA2肽再刺激，无论是何种基团，这表明UspA2-特异性响应在激发后没有被引发或提高(数据未显示)。
总结
所测的PD/PEPilA/UspA2/AS01E制剂以及更具体地是这些疫苗的UspA2组分在小鼠M.cat.肺炎模型中显示是安全的。
Claims (40)
1.式I的蛋白质：
A–(R1)m–(B)n (式I)
其中：
A为来自粘膜炎莫拉菌的UspA2或其免疫原性片段；
R1是氨基酸；
m为0或2；
B是组氨酸；和
n是0、1、2、3、4、5或6。
2.根据权利要求1的蛋白质，其中A是UspA2的免疫原性片段。
3.根据权利要求1-2中任一项的蛋白质，其中A是源自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：38中任一个的UspA2。
4.根据权利要求1-3中任一项的蛋白质，其中m为2。
5.根据权利要求1-4中任一项的蛋白质，其中m为0。
6.根据权利要求1-5中任一项的蛋白质，其中(R1)m为AS(丙氨酸丝氨酸)。
7.根据权利要求1-6中任一项的蛋白质，其中n选自1、2和6。
8.根据权利要求1-7中任一项的蛋白质，其中n为2。
9.根据权利要求1-8中任一项的蛋白质，其还包含在氨基末端的甲硫氨酸。
10.根据权利要求1-9中任一项的蛋白质，其中n为0。
11.根据权利要求1-10中任一项的蛋白质，其中A为UspA2，其中UspA2在整个长度上，与SEQ ID NO：1具有至少63％、66％、70％、72％、74％、75％、77％、80％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
12.根据权利要求1-10中任一项的蛋白质，其中A是UspA2的免疫原性片段，其选自SEQID NO.1的氨基酸30-540(SEQ ID NO：39)、SEQ ID NO：1的氨基酸31-540(SEQ ID NO：40)、SEQ ID NO：1的氨基酸30-519(SEQ ID NO：41)、SEQ ID NO：1的氨基酸30-564(SEQ ID NO：42)和SEQ ID NO：1的氨基酸31-564(SEQ ID NO：43)。
13.根据权利要求1-11中任一项的蛋白质，其中A是UspA2的免疫原性片段，其与SEQ IDNO.39具有至少52％、55％、57％、62％、64％、69％、73％、76％、81％、88％或100％的同一性。
14.根据权利要求1-11中任一项的蛋白质，其中A是UspA2的免疫原性片段，其与SEQ IDNO.43具有至少52％、57％、62％、65％、67％、70％、73％、76％、81％、100％的同一性。
15.根据权利要求1-14中任一项的蛋白质，其中所述蛋白质选自SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：88。
16.根据权利要求1-14中任一项的蛋白质，其中A是UspA2的免疫原性片段，其包含层粘连蛋白连接结构域和纤连蛋白连接结构域。
17.根据权利要求1-14中任一项的蛋白质，其中A是UspA2的免疫原性片段，其包含层粘连蛋白连接结构域、纤连蛋白连接结构域和C3连接结构域。
18.免疫原性组合物，其包含如权利要求1-17中任一项所定义的式(I)蛋白质。
19.权利要求18的免疫原性组合物，其包含UspA2的免疫原性片段，其选自SEQ ID NO.1的氨基酸30-540(SEQ ID NO：39)、SEQ ID NO：1的氨基酸31-540(SEQ ID NO：40)、SEQ IDNO：1的氨基酸30-519(SEQ ID NO：41)、SEQ ID NO：1的氨基酸30-564(SEQ ID NO：42)和SEQID NO：1氨基酸31-564(SEQ ID NO：43)。
20.权利要求18的免疫原性组合物，其包含与SEQ ID NO.39具有至少52％、55％、57％、62％、64％、69％、73％、76％、81％、88％或100％同一性的UspA2的免疫原性片段。
21.权利要求18的免疫原性组合物，其包含与SEQ ID NO.43具有至少52％、57％、62％、65％、67％、70％、73％、76％、81％、100％同一性的UspA2的免疫原性片段。
22.权利要求18的免疫原性组合物，其包含选自SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：88的蛋白质。
23.权利要求18-22中任一项的免疫原性组合物，其还包含源自流感嗜血菌的至少一种抗原。
24.权利要求23的免疫原性组合物，其中所述至少一种抗原是蛋白质D。
25.权利要求18-24的免疫原性组合物，其还包含蛋白质E。
26.权利要求18-25中任一项的免疫原性组合物，其还包含PilA。
27.权利要求26的免疫原性组合物，其中PE和PilA作为融合蛋白存在。
28.疫苗，其包含权利要求1-17中任一项的蛋白质或权利要求18-27中任一项的免疫原性组合物。
29.权利要求28的疫苗，其还包含佐剂。
30.权利要求29的疫苗，其中所述佐剂是AS01E。
31.权利要求28-30中任一项的疫苗，其中所述免疫原性组合物包含SEQID NO：69的蛋白质、蛋白质D和PE-PilA融合蛋白。
32.权利要求28-31中任一项的疫苗，其中所述PE-PilA融合蛋白是LVL-735。
33.在有此需要的受试者中治疗或预防中耳炎的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求18-27中任一项的免疫原性组合物或权利要求28-32中任一项的疫苗。
34.在有此需要的受试者中治疗或预防慢性阻塞性肺疾病的急性恶化(AECOPD)的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求18-27中任一项的免疫原性组合物或权利要求28-32中任一项的疫苗。
35.在有此需要的受试者中治疗或预防肺炎的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求18-27中任一项的免疫原性组合物或权利要求28-32中任一项的疫苗。
36.在有此需要的受试者中治疗或预防粘膜炎莫拉菌感染或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求18-27中任一项的免疫原性组合物或权利要求28-32中任一项的疫苗。
37.权利要求1-17的蛋白质，或权利要求18-27的免疫原性组合物，或权利要求28-32的疫苗，其用于治疗或预防中耳炎。
38.权利要求1-17的蛋白质，或权利要求18-27的免疫原性组合物，或权利要求28-32的疫苗，其用于治疗或预防慢性阻塞性肺疾病的急性恶化(AECOPD)。
39.权利要求1-17的蛋白质，或权利要求18-27的免疫原性组合物，或权利要求28-32的疫苗，其用于治疗或预防肺炎。
40.权利要求1-17的蛋白质，或权利要求18-27的免疫原性组合物，或权利要求28-32的疫苗，其用于治疗或预防粘膜炎莫拉菌感染或疾病。
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