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CN105980402B - 带标签的嵌合效应分子及其受体 - Google Patents

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CN105980402B
CN105980402B CN201480075007.8A CN201480075007A CN105980402B CN 105980402 B CN105980402 B CN 105980402B CN 201480075007 A CN201480075007 A CN 201480075007A CN 105980402 B CN105980402 B CN 105980402B
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gly
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ser
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刘凌峰
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Fred Hutchinson Cancer Center
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Abstract

本公开涉及用于遗传上工程改造宿主细胞的带标签的嵌合效应分子及其受体分子，其中可以使用所述标签来将重组宿主细胞鉴别、分离、分选、诱导以增殖、跟踪或排除。示例的受体分子是具有包含靶标结合结构域、铰链区和标签盒的胞外结构域、作为跨膜结构域的疏水部分以及具有效应结构域的胞内部分的嵌合抗原受体(CAR)。示例的靶标是CD19，示例的标签是Step‑标签。被重组修饰以用于表达此种分子的T细胞可以用于过继免疫治疗。

Description

带标签的嵌合效应分子及其受体
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年12月20日提交的美国临时申请号61/919,201在35 U.S.C.§119(e)下的权益，所述申请通过引用整体并入本文。
政府利益的声明
本发明在国立卫生研究院授予的授权/合同号CA136551下在政府支持下做出。政府具有本发明的某些权利。
关于序列表的声明
与本申请有关的序列表以文本形式提供以替代纸件副本，且特此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是360056_426WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件是32.3KB，于2014年12月22日创建，且通过EFS-Web电子呈交。
背景
技术领域
本公开涉及含有标签盒(tag cassette)的融合蛋白，且更具体地，涉及带标签的嵌合效应分子(Key-ChEM)和带标签的嵌合抗原受体分子(T-ChARM)以及生产这样的融合蛋白的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞可以被鉴别、分离、分选、诱导以增殖、跟踪、消除和/或用作治疗剂(例如，在过继免疫治疗中)。
相关领域的描述
当在肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体中发现肿瘤反应性T细胞时，开始开发基于T细胞的免疫疗法(Clark等人,Cancer Res.29:705,1969)。一个策略(被称作过继性T细胞转移)包括针对肿瘤反应性预先选择的肿瘤浸润性淋巴细胞的分离、在IL-2存在下由抗-CD3和抗-CD28抗体诱导的肿瘤反应性T细胞的克隆扩大和最后将扩大的细胞群体灌输回荷瘤患者(与化学疗法和IL-2的重复施用一起)(Dudley等人,Science 298:850,2002)。这种形式的使用肿瘤浸润性淋巴细胞的过继性T细胞疗法在技术上是麻烦的，并仅在小部分具有黑素瘤的患者中导致完全减轻，且在其它癌症中是很少有效的(Besser等人,Clin.CancerRes.16:2646,2010)。
肿瘤反应性T细胞克隆的分离导致另一种免疫治疗方案的开发，即对特定抗原特异性的重组T细胞受体(TCR)的产生，所述抗原使用载体递送系统引入T细胞中以赋予对肿瘤细胞上表达的MHC分子呈递的肿瘤相关肽的特异性。一个类似的方案引入合成的受体，其被称作嵌合抗原受体(CAR)，其含有与一个或多个细胞内组分连接的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域例如在抗肿瘤疗法的背景下可以结合至肿瘤特异性的或有关的抗原，所述细胞内组分包含效应结构域，如TCR和/或共刺激性信号转导结构域。不同于TIL，TCR或CART细胞免疫疗法的基本操作是用编码肿瘤靶向部分的转基因遗传修饰人T细胞、离体扩增重组T细胞和将扩增的重组T细胞输回患者中。在使用CAR T细胞的过继性治疗的情况下，合成的CAR结构的组成、以及遗传工程改造的T细胞的质量和纯度将决定对体内肿瘤的治疗效果。但是，在扩增和选择重组细胞群体、以及确保所述细胞在体内是足够有效的和特异性的以避免严重自身免疫副作用方面存在挑战。
目前，在免疫疗法领域中仍然需要用于鉴别、有效地分离/分选、选择性地扩增、在体内跟踪和控制或消除工程改造的细胞如经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)的组合物和方法。
概述
在某些方面，本公开涉及一种单链融合蛋白，其包含通过疏水部分连接的细胞外组分和细胞内组分，其中所述细胞外组分包含特异性地结合靶标的结合结构域、标签盒和包含铰链的连接区域，且其中所述细胞内组分包含效应结构域。
在某些方面，本公开涉及一种嵌合抗原受体分子，其包含具有一个或多个细胞外标签盒的融合蛋白，所述细胞外标签盒(a)位于细胞外结合结构域的氨基端处，(b)嵌入在细胞外结合结构域内，或(c)布置在细胞外结合结构域和包含效应结构域的细胞内组分之间且连接二者。
在其它方面，本公开涉及一种单链融合蛋白，其包含疏水部分，所述疏水部分布置在细胞外组分和细胞内组分之间且连接二者，其中所述细胞外组分包含标签盒和包含铰链的连接区域，且其中所述细胞内组分包含效应结构域。
在其它方面，本公开涉及一种用于活化细胞如T细胞(例如，非天然T细胞)的方法，所述方法包括使细胞与对标签盒特异性的结合结构域接触，其中所述细胞包含编码根据本公开的融合蛋白的核酸分子，且所述对标签盒特异性的结合结构域附于固体表面。
在其它方面，本公开涉及一种用于促进细胞增殖如T细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞(例如，非天然T细胞)与对标签盒特异性的结合结构域和生长因子细胞因子接触达足以允许细胞生长的时间，其中所述细胞包含编码根据本公开的融合蛋白的核酸分子，且所述对标签盒特异性的结合结构域附于固体表面。
在某些其它方面，本公开涉及一种用于鉴别细胞如T细胞的方法，所述方法包括：使包含细胞如T细胞(例如，非天然T细胞)的样品与对标签盒特异性的结合结构域接触，其中所述细胞包含编码根据本公开的融合蛋白的核酸分子，且所述对标签盒特异性的结合结构域包含可检测的部分；以及检测表达融合蛋白的细胞在样品中的存在。
在某些其它方面，本公开涉及一种用于分选T细胞的方法，所述方法包括：使包含非天然T细胞的样品与对标签盒特异性的结合结构域接触，其中所述非天然T细胞包含编码根据本公开的融合蛋白的核酸分子，且所述对标签盒特异性的结合结构域包含可检测的部分；以及自样品中不表达融合蛋白的其它细胞分选所述表达融合蛋白的非天然T细胞。
在某些方面，本公开涉及一种用于富集或分离T细胞的方法，所述方法包括：使包含非天然T细胞的样品与对标签盒特异性的结合结构域接触，其中所述非天然T细胞包含编码根据本公开的融合蛋白的核酸分子，且所述对标签盒特异性的结合结构域包含可检测的部分；以及自样品中不表达融合蛋白的其它细胞富集或分离出表达融合蛋白的非天然T细胞。
在其它方面，本公开涉及一种用于除去某些T细胞的方法，所述方法包括使非天然T细胞与对标签盒特异性的结合结构域接触，其中所述非天然T细胞包含编码根据本公开的融合蛋白的核酸分子，且其中所述对标签盒特异性的结合结构域的结合导致表达融合蛋白的T细胞的细胞死亡。
参考下述详细描述和附带的附图，会明白本发明的这些和其它方面。本文中公开的所有参考文献特此通过引用整体并入，如同每篇单独地并入。
附图简述
图1A-1H显示了不同单链嵌合效应分子的图示，所述单链嵌合效应分子含有一个或多个亲和标签盒(A-D，在本文中被称作Key-ChEM)，且任选地含有一个或多个特异性的结合结构域(E-G，在本文中被称作T-ChARM)。所述单链ChEM和ChARM含有细胞内结构域。所述标签盒可以是任何类型的亲和标签，如Strep
Figure BDA0001070643250000041
II(SEQ ID NO.:1)、Myc标签(SEQ IDNO.:7)、V5标签(SEQ ID NO.:8)、
Figure BDA0001070643250000042
标签(SEQ ID NO.:3)、His标签或其它肽或分子，其被非内源性的关联结合配偶体(例如，受体、蛋白、抗体)识别。如显示的，Key-ChEM可以含有(A,B)一个标签盒、(C)两个标签盒(Key-ChEM2)、(D)三个标签盒(Key-ChEM3)或更多。另外，所述嵌合分子可以具有多个效应结构域(例如，A和C-G的分子具有两个效应结构域，而在B中显示的分子具有三个效应结构域)，且所述标签盒可以放在Key-ChEM或T-ChARM分子的不同区域中。在这些具体实施例中，T-ChARM具有位于特异性结合结构域和效应结构域之间(E)、在特异性结合结构域的远端部(例如，氨基端)处(F)、整合在特异性结合结构域内(G)(例如，位于scFv的VH和VL链之间的柔性接头内)的一个标签盒，并且具有两个不同的标签——一个在所述结合结构域的C-端，且一个在所述结合结构域的N-端(H)。所述T-ChARM也可以具有两个、三个或更多个标签盒，如关于Key-ChEM所显示的。如在这些图示中显而易见的，可以将标签盒通过接头模块(例如，柔性(GlyxSer)n接头模块)连接至另一个Key-ChEM或T-ChARM组分或另一个标签。可以使接头长度更长或更短以实现特异性结合结构域与靶配体或抗原的最佳相互作用，和实现表达ChEM或T-ChARM的细胞与靶细胞之间的最佳相互作用。
图2A-2D显示了表达不同种类的抗-CD19T-ChARM和常规抗-C19CAR(缺乏标签盒而具有短的、中等的和长的间隔结构域)的人效应T细胞针对被转染成表达CD19或ROR1(对照)的K562白血病细胞、CD19+/ROR1+Raji淋巴瘤细胞和EBV转化的B细胞(其表达膜结合的抗-CD3mAb单链抗体(OKT3scFv)以活化所有效应T细胞)的细胞裂解活性。
图3A-3F显示了将表达不同抗-CD19T-ChARM(A-C)和常规抗-C19CAR(D-F)的T细胞与表达CD19(A和D)或ROR1(阴性对照；B和E)的K562细胞一起以及与PMA/离子霉素(ionomycin)(阳性对照；C和F)一起共培养后24小时得到的上清液的多路(multiplex)细胞因子测定
Figure BDA0001070643250000051
的结果。
图4A和4B显示了将表达不同抗-CD19T-ChARM(A)和CD19CAR(B)的T细胞与CD19+Raji细胞一起共培养后24小时得到的上清液的多路细胞因子测定
Figure BDA0001070643250000052
的结果。
图5显示了T细胞增殖测定的结果，其中羧基荧光素染料稀释指示，表达T-ChARM(含有一个、两个或三个标签盒)或常规CAR(CD19(长))的抗-CD19CD8+T细胞响应于表达CD19的肿瘤细胞(蓝)而扩增，而在表达ROR1的肿瘤细胞(红)存在下不扩增。
图6A-6E表明，表达T-ChARM(含有一个、两个或三个标签盒)或常规CAR(含有短或中等连接区域)的抗-CD19人T细胞可以根除NSG小鼠中建立的Raji肿瘤。在这些实验中，将Raji细胞转染成表达荧火虫萤光素酶基因，并通过给小鼠注射萤光素和生物发光成像来测量肿瘤生长。
图7表明，表达抗-CD19CAR和T-ChARM的人T细胞在过继转移进接种了Raji淋巴瘤的NSG小鼠中后可以在血液中持续。通过用对人CD8和CD45细胞表面分子特异性的单克隆抗体染色来区分人T细胞。
图8A-8D表明，使用标签特异性的结合剂，可以通过流式细胞计量术鉴别表达T-ChARM的T细胞。在该实施例中，将纯化的T-ChARM T细胞通过表达标志物tEGFR进行检测(A)，通过抗-strep标签II(STII)进行检测(B)，或用StrepTactin APC进行检测(C,D)。
图9表明，用与荧光染料连接的标签特异性的结合剂，可以从低纯度(在实施例中15％)至高纯度(在实施例中99％)通过流式细胞计量术分选表达T-ChARM的T细胞。在实施例中，所述标签是StrepTag II，且所述标签特异性的结合剂是与荧光染料连接的抗STIImAb。
图10显示了通过使用不同大小的
Figure BDA0001070643250000061
小珠直接富集表达T-ChARM的T细胞(含有三个Strep-标签标签盒)。左侧的图显示了富集的级分的染色，且右侧的图显示了流出物(未富集的级分)。
图11显示了表达T-ChARM(含有一个、两个或三个标签盒)或常规抗-CD19CAR的T细胞(CD19长)的光学显微照片，所述T细胞已经与小珠一起共培养，所述小珠被连接至针对标签序列的结合配体
Figure BDA0001070643250000062
所述显微照片表现出T-ChARM T细胞的选择性簇集和增殖。
图12显示了表达T-ChARM的T细胞(含有一个、两个或三个标签盒)在与
Figure BDA0001070643250000063
微米珠(microbead)一起培养10天中的生长曲线。
图13A和13B显示了在单独的或与抗-CD28mAb组合的Streptactin微米珠、纳米珠(nanobead)或抗-StrepTag II mAb结合标签盒以后，通过CD25和CD69的增量调节确定的表达T-ChARM的T细胞的活化。显示了(A)24小时和(B)48小时的刺激后的数据。
图14A和14B显示了表达T-ChARM的T细胞的选择性扩增。与抗-Strep标签/抗-CD28-MB一起培养9天的未分选的T-ChARM1/4-1BB和T-ChARM1/CD28转导的T细胞(CD8+和CD4+)。如下评估T-ChARM细胞的百分比：(A)在培养之前和之后，对T细胞上的Strep标签表达进行流式检测。用单独的抗-CD3/抗-CD28-MB处理过的培养物细胞用作对照。(B)CD19+永生化的B细胞系(TM-LCL)扩增后FACS分选的EGFR+抗-CD19ChARM T细胞。分别用抗-EGFR(上行)和抗-Strep标签II(下行)抗体染色。
图15显示了用不同量的
Figure BDA0001070643250000064
小珠刺激后7天通过Ki-67蛋白水平测量的表达抗-CD19T-ChARM的T细胞(含有一个、两个或三个标签盒)的增殖。在底图中，显示了利用CD19+EBV-LCL(TM-LCL)通过T-ChARM的抗-CD19结合组分的刺激后表达T-ChARM的T细胞中的Ki-67的表达。
图16显示了在不同种类的Streptactin、抗-Streptag II或抗CD3/抗-CD28缀合的小珠上培养的表达T-ChARM的T细胞的生长曲线。
图17A和17B显示了表达抗-CD19T-ChARM的T细胞在Strep-Tactin小珠上的选择性扩增(A)。随后通过利用CD19+LCL的通过抗-CD19嵌合受体的刺激，可以扩增表达抗-CD19T-ChARM的T细胞(B)。
图18A-18D表明，在不进行利用抗-CD3/抗-CD28小珠的预先活化的情况下，在有IL-7和IL-15存在下培养后，可以用两类T-ChARM(4-1BB/CD3ζ(A和B)或CD28/CD3ζ(C和D)的效应结构域)转导T细胞。可以通过将抗-Strep标签II小珠加入培养物将表达转导的T-ChARM的T细胞选择性地扩增和富集(B和D)(甚至在没有抗-CD3/抗-CD28小珠刺激的情况下)，但是当没有将抗-Strep标签II小珠加入到培养物中时不会扩增(A和C)。
图19A-19D表明，在用CD19阳性的肿瘤细胞(A.K562/CD19；B-Raji)(作为表达抗-CD19CAR(短)(CD19-S)的对照T细胞)再刺激后，通过用
Figure BDA0001070643250000071
微米珠刺激而扩增的抗-CD19T-ChARM1T细胞保持相当的或优越的生产细胞因子(GM-CSF、干扰素-γ、IL-2和TNF-α)的能力。K562细胞(C)和PMA-离子霉素(D)分别充当阴性对照和阳性对照。
图20表明，可以诱导表达T-ChARM的T细胞以形成簇，并用单独的抗-Strep标签小珠或用含有抗-Strep标签和抗-CD27抗体或者含有抗-Strep标签和抗-CD28抗体的小珠扩增。
图21显示了CD19+永生化的B细胞系(TM-LCL)扩增后FACS分选的EGFR+抗-CD19ChARM T细胞的流式细胞计量术分析(MFI)。分别用抗-EGFR(上行)和抗-Streptag II(下行)抗体染色。
图22显示了用于检查多种抗-CD19ChARM转导的T细胞(效应物)对用CD19(K562/CD19)或ROR1(K562/ROR1)转导的K562细胞或CD19+Raji肿瘤细胞(靶标)的细胞裂解效应的铬释放测定结果。E/T＝效应物/靶标比。
图23A和23B显示了表达(A)抗-CD19短、T-ChARM1、T-ChARM2、T-ChARM3(具有CD28/CD3ζ效应结构域)和(B)具有抗-ROR1R12短和T-ChARM1(具有41BB/CD3ζ效应结构域)的T细胞的细胞裂解活性。测试细胞的针对用CD19(K562/CD19)或ROR1(K562/ROR1)转导的K562细胞或CD19+Raji肿瘤细胞(靶标)的细胞裂解活性。E/T＝效应物/靶标比。
图24显示了多种抗-CD19T-ChARM转导的T细胞(效应物)针对用CD19(K562/CD19)或ROR1(K562/ROR1)转导的K562细胞或CD19+Raji肿瘤细胞(靶标)的IL2/IFN-γ生产。
图25A-25C显示了24h后ChARM转导的T细胞与CD19+Raji细胞(1:4比率)的一式三份共培养上清液的luminex多路细胞因子分析。数据来源于使用来自不同供体的T细胞的三个独立实验，并所有数据表达为平均值±SD。进行Student氏t检验。*P<0.01。(A)表达具有长(CH3-CH2-铰链)、中(CH3-铰链)和短(仅铰链)间隔区的抗-CD19CAR的CD8+T细胞的细胞因子生产的对比。将来自3个独立实验的多路细胞因子数据标准化(细胞因子释放CD19-CAR'长/41BB'＝1)；(B)相比于具有4-1BB/CD3ζ效应结构域的抗-CD19CAR-短，表达抗-CD19T-ChARM1(1ST)、T-ChARM2(2ST)、T-ChARM3(3ST)(具有4-1BB/CD3ζ效应结构域)的CD8+T细胞的细胞因子生产的对比。将得自3个独立实验的多路细胞因子数据标准化(细胞因子释放CD19-CAR-短:Hi/4-1BB＝1)；和(C)相比于具有CD28/CD3ζ效应结构域的抗-CD19CAR-短，表达抗-CD19T-ChARM1(1ST)、T-ChARM2(2ST)、T-ChARM3(3ST)(具有CD28/CD3ζ效应结构域)的CD8+T细胞的细胞因子生产的对比。将得自3个独立实验的多路细胞因子数据标准化(细胞因子释放CD19-CAR-短:Hi/CD28＝1)。
图26显示了在没有添加外源细胞因子的情况下用CD19+Raji肿瘤细胞(实心灰色)或仅培养基(灰色线)刺激后5天用于测量表达抗-CD19 4-1BB或CD28ChARM的T细胞的增殖的CFSE染料稀释。
图27A-27D显示了FACS分选的EGFR+抗-CD19ChARM(A)CD8+T细胞(CD19-Hi/4-1BB、ST-CD19/4-1BB、CD19(VH-ST-VL)/4-1BB；CD19-1ST/4-1BB、CD19-2ST/4-1BB、CD19-3ST/4-1BB CAR)；(B)CD4+T细胞(CD19-Hi/4-1BB、ST-CD19/4-1BB、CD19(VH-ST-VL)/4-1BB；CD19-1ST/4-1BB、CD19-2ST/4-1BB、CD19-3ST/4-1BB CAR)；(C)抗-CD19ChARM CD8+T细胞(CD19-Hi/CD28、CD19-1ST/CD28、CD19-2ST/CD28、CD19-3ST/CD28CAR)；和(D)抗-ROR1R12ChARM T细胞(R12-Hi/4-1BB、R12-1ST/4-1BB)，将其在与IL2一起的培养中用StrepTactin包被的微米珠(StrepTactin-MB)、抗-Streptag标签抗体或抗-Strep标签/抗-CD28抗体包被的微米珠(αStrep标签-MB和αStrep标签/CD28-MB)刺激。刺激48小时后，将细胞收获，并通过流式细胞计量术评估T细胞活化标志物CD25。未处理的细胞(培养基)用作对照。
图28显示了在有IL2存在下用StrepTactin-MB、αStrep标签-MB和αStrep标签/CD28-MB刺激的FACS分选的EGFR+抗-CD19 4-1BB ChARM T细胞(CD8+)的代表性显微图像。未处理的细胞(培养基)用作对照。刺激48h以后拍摄显微图像。
图29A和29B显示了ChARM T细胞的生长曲线。在有IL2存在下在含有StrepTactin-MB、αStrep标签-MB和αStrep标签/CD28-MB的CTL培养基中培养FACS分选的EGFR+抗-CD19ChARM(A)CD8+和(B)CD4+T细胞。
图30A-30F显示了用抗-CD19-1ST/4-1BB或CD19-1ST/CD28CAR转导的抗-CD3/抗-CD28微米珠刺激的CD8+T细胞；EGFR染色和分选以后，将纯的CAR T细胞用TM-LCL或αStrep标签-MB或αStrep标签/CD28-MB扩增8天。在扩增之前(αCD3/CD28-MB)或之后(TM-LCL或αStrep标签-MB或αStrep标签/CD28-MB)进行体外功能性试验以评价CAR T细胞功能。(A)进行铬释放测定以检查ChARM T细胞对靶细胞(K562/CD19)或对照细胞(K562/ROR1)的细胞裂解效应。E/T：效应物/靶标比；(B)通过ELISA测量细胞因子生产以评价24小时后从5×104抗-CD19ChARM T细胞与靶细胞(K562/CD19)或对照细胞(K562/ROR1)的共培养物得到的上清液中的IFN-γ和IL2。PMA/离子霉素刺激的T细胞用作阳性对照。(n＝3；*P<0.05)；(C)在没有添加外源细胞因子的情况下，用靶细胞(K562/CD19)(实心灰色)或对照细胞(K562/ROR1)(灰色线)刺激后5天ChARM T细胞的CFSE增殖测定。对于分析，将一式三份孔合并，并分析活的(PI-)、EGFR-阳性的CART细胞的增殖；(D)在扩增之前(αCD3/CD28-MB)或之后(TM-LCL或αStrep标签-MB或αStrep标签/CD28-MB)，在ChARM T细胞上的CD45RO、CD62L、CD28和CD27表达的流式检测；(E)在第1天通过尾静脉注射给小鼠组群接种Raji-ffluc，然后在肿瘤植入后7天施用在CD19+B LCL或αStrep标签/CD28-MB上扩增的5x106CD8+ChARM T细胞(CD19-Hi/4-1BB和CD19-1ST/4-1BB)。在注射萤光素底物以后，通过系列生物发光成像评价肿瘤进展和分布；和(F)在过继转移到NSG/Raji小鼠中后，抗-CD19ChARM T细胞的持续。在T细胞输注后的不同时间点，用不同ChARM转导的T细胞治疗的小鼠组群的外周血(眼出血)中的ChARM T细胞的流式细胞计数分析。使用CD8+tEGFR+和ChARM+T细胞的频率作为活的周围血细胞的百分比。
图31显示了在没有添加外源细胞因子的情况下用CD19(K562/CD19)、ROR1(K562/ROR1)、单独培养基或CD19+Raji肿瘤细胞刺激5天以后，用于测量利用4-1BB T细胞的抗-CD19CAR-短、T-ChARM1、T-ChARM3和Myc-ChARM的增殖的CFSE染料稀释。
图32显示了铬释放测定，其为了检查利用4-1BB T细胞的抗-CD19CAR-短、T-ChARM1、T-ChARM3和Myc-ChARM对靶细胞(K562/CD19)或对照细胞(K562/ROR1)的细胞裂解效应而进行。E/T:效应物/靶标比
详细描述
本公开提供了组合物和方法，其用于产生多种包含一个或多个亲和标签盒的融合蛋白，所述融合蛋白是嵌合效应分子(ChEM)，所述嵌合效应分子象“钥匙”一样起作用以接近和操作(即，开启或关闭或调节)多种生物途径中的任一种。这些嵌合效应分子在本文中被称作Key-ChEM。编码这样的融合蛋白的核酸分子可以用于产生经修饰的宿主细胞，其中特异性细胞应答(如增殖或杀死)被引起、控制或两者。例如，可以从受试者得到某些类型的先祖细胞，将其修饰成表达包含标签盒的融合蛋白，将其诱导以增殖，然后为了特定治疗效果(例如，重构受试者虚弱的免疫系统)将其输入回所述受试者。备选地，这样的含有标签的融合蛋白可以进一步具有对特定靶标(例如，肿瘤抗原)特异性的结合结构域。在这样的实施例中，这些融合蛋白是带标签的嵌合抗原受体分子(T-ChARM)，其可以引入特定细胞中并然后用于鉴别、分选、活化或扩增所述经修饰的细胞。在某些实施方案中，将这样的带标签的嵌合分子转导进细胞如免疫细胞(例如，T细胞)中并表达。
在某些方面，本公开还提供了用于选择性地活化、促进增殖、鉴别、分选、富集、分离、跟踪或消灭包含编码具有一个或多个标签盒的融合蛋白(Key-ChEM或T-ChARM)的核酸分子的细胞(例如，T细胞)的方法。另外，本公开提供了Key-ChEM或T-ChARM，以及用于将本公开的Key-ChEM或T-ChARM用于不同治疗应用的细胞、组合物和方法，所述应用包括治疗受试者的疾病(例如，癌症、传染性疾病、炎性疾病、免疫疾病、老化相关性疾病)。
在更详细地阐述本公开之前，可能有助于其理解的是，提供要在本文中使用的某些术语的定义。贯穿本公开阐述了另外的定义。
除非另外指出，在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括在列举的范围内的任意整数的值，且当适当时，包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。并且，除非另外指出，在本文中关于任何物理特征(如聚合物亚基、大小或厚度)列举的任何数字范围应当理解为包括在列举的范围内的任意整数。除非另外指出，本文中使用的术语“约”是指指出的范围、值或结构的±20％。应当理解，本文中使用的术语“一个”和“一种”表示列举的组分中的“一个/种或多个/种”。备选方案(例如，“或”)的应用应当被理解为是指备选方案中的一个、两者或它们的任意组合。本文中使用的术语“包括”、“具有”和“包含”同义地使用，所述术语及其变体意图解释为非限制性的。
另外，应当理解，本申请公开了从本文描述的结构和取代基的不同组合衍生出的各种化合物或化合物的集合，达到与如同单独地阐述每种化合物或化合物的集合相同的程度。因而，特定结构或特定取代基的选择是在本公开的范围内。
术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制至指定的材料或步骤，或限制至不会实质上影响要求保护的发明的基本特征的那些材料或步骤。例如，在以下情况下，蛋白结构域、区域、模块或盒(例如，结合结构域、铰链区、接头模块、标签盒)或蛋白质(其可能具有一个或多个结构域、区域、模块或盒)“基本上由特定氨基酸序列组成”：结构域、区域、模块、盒或蛋白质的氨基酸序列包括延伸、缺失、突变或它们的组合(例如，在氨基端或羧基端处或在结构域之间的氨基酸)，其联合地构成结构域、区域、模块、盒或蛋白质的长度的至多20％(例如，至多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)且不会实质上影响结构域、区域、模块、盒或蛋白质的活性(例如，结合蛋白或标签盒的靶标结合亲和力)(即，不会使活性降低超过50％，如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)。
本文中使用的“结合结构域”(也被称作“结合区域”或“结合部分”)表示这样的分子，如肽、寡肽、多肽或蛋白质，其具有与靶分子(例如，CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、PD-L1、PD-L2、PSMA)特异性地和非共价地缔合、联合或结合的能力。结合结构域包括生物分子或其它目标靶标的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组地生产的结合配偶体。在某些实施方案中，结合结构域是抗原结合结构域，如抗体或T细胞受体(TCR)或其功能结合结构域或抗原结合片段。示例性的结合结构域包括单链抗体可变区(例如，结构域抗体，sFv，scFv，Fab)、受体胞外结构域(例如，TNF-α)、配体(例如，细胞因子、趋化因子)、T细胞受体(TCR)如单链TCR(scTCR)的抗原结合区域或针对结合生物分子的特异性能力而选择的合成多肽。
本文中使用的“特异性地结合”表示结合结构域或其融合蛋白以等于或大于105 M-1的亲和力或Ka(即，以1/M为单位的特定结合相互作用的平衡结合常数)与靶分子结合或联合，同时不会显著地结合或联合样品中的任意其它分子或组分。结合结构域(或其融合蛋白)可以分类为“高亲和力”结合结构域(或其融合蛋白)或“低亲和力”结合结构域(或其融合蛋白)。“高亲和力”结合结构域表示具有至少107 M-1、至少108 M-1、至少109 M-1、至少1010M-1、至少1011 M-1、至少1012 M-1或至少1013 M-1的Ka的那些结合结构域。“低亲和力”结合结构域表示具有高达107 M-1、高达106 M-1、高达105 M-1的Ka的那些结合结构域。备选地，可以将亲和力定义为以M为单位的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)(例如，10-5 M至10-13M)。在某些实施方案中，结合结构域可以具有“增强的亲和力”，其表示与野生型(或母体)结合结构域相比对靶抗原具有更强结合的选定的或经工程改造的结合结构域。例如，增强的亲和力可以是由于比野生型结合结构域更高的对靶抗原的Ka(平衡结合常数)，或由于比野生型结合结构域更小的对靶抗原的Kd(解离常数)，或由于比野生型结合结构域更小的对靶抗原的解离速率(Koff)。已知多种用于鉴别本公开的特异性地结合特定靶标的结合结构域以及确定结合结构域或融合蛋白亲和力的测定，如蛋白质印迹、ELISA和
Figure BDA0001070643250000131
分析(也参见，例如，Scatchard等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949；和美国专利号5,283,173、5,468,614或等同文献)。
本文中使用的“异源的”或“非内源性的”或“外源的”表示对于宿主细胞或受试者而言非天然的任何基因、蛋白、化合物、分子或活性，或者是对于宿主或宿主细胞而言天然的、但是已经被改变或突变使得结构、活性或二者在天然分子和突变分子之间不同的任何基因、蛋白、化合物、分子或活性。在某些实施方案中，异源的、非内源性的或外源的分子(例如，受体、配体)可以对于宿主细胞或受试者而言不是内源性的，但是编码这样的分子的核酸可能已经通过接合、转化、转染、电穿孔等添加给宿主细胞，其中所述添加的核酸分子可以整合进宿主细胞基因组中或可以作为染色体外遗传物质(例如，作为质粒或其它自主复制的载体)存在。术语“同源的”或“同系物”表示从在宿主细胞、物种或菌株中发现的或从其衍生出的分子或活性。例如，异源或外源分子或编码所述分子的基因可以分别与天然宿主或宿主细胞分子或编码所述分子的基因同源，但是可能具有改变的结构、序列、表达水平或它们的组合。非内源性分子可以来自相同物种、不同物种或它们的组合。
本文中使用的术语“内源性的”或“天然的”表示在宿主或宿主细胞中通常存在的基因、蛋白、化合物、分子或活性。
本文中使用的“标签盒”表示固定于、融合至目标蛋白或者是目标蛋白的部分的独特肽序列，异源或非内源性关联结合分子(例如，受体、配体、抗体或其它结合配偶体)能够与其特异性地结合，其中所述结合性质可以用于检测、鉴别、分离或纯化、跟踪、富集或靶向带标签的蛋白或表达带标签的蛋白的细胞，特别是当带标签的蛋白是蛋白或其它材料的异质群体的部分时，或当表达带标签的蛋白的细胞是细胞的异质群体(例如，生物样品如外周血)的部分时。在某些实施方案中，可以使表达带标签的蛋白的细胞与异源或非内源性关联结合分子接触，并诱导生物应答，如促进细胞活化、细胞增殖或细胞死亡。在提供的融合蛋白中，标签盒被关联结合分子特异性地结合的能力不同于或附加于结合结构域特异性地结合靶分子的能力。所述标签盒通常不是抗原结合分子，例如，不是抗体或TCR或其抗原结合部分。
本文中使用的“铰链区”或“铰链”表示(a)免疫球蛋白铰链序列(由例如上部和核心区域制成)或其功能片段或变体，(b)II型C-凝集素结构域间(茎)区域或其功能片段或变体，或(c)分化簇(CD)分子茎区域或其功能变体。本文中使用的“野生型免疫球蛋白铰链区”表示在抗体重链中发现的天然存在的上部和中部铰链氨基酸序列，其插入在CH1和CH2结构域之间并将其相连(对于IgG、IgA和IgD)或插入在CH1和CH3结构域之间并将其相连(对于IgE和IgM)。在某些实施方案中，铰链区是人的，且在特定实施方案中，包含人IgG铰链区。
本文中使用的“连接区域”表示融合蛋白中的一个或多个蛋白、多肽、寡肽、肽、结构域、区域、模块、盒、基序或它们的任意组合，其连接两个或更多个蛋白、多肽、寡肽、肽、结构域、区域、模块、盒、基序或它们的任意组合。例如，连接区域可以提供间隔区功能以促进两个单链融合蛋白的相互作用，或一个或多个结合结构域的定位，使得得到的多肽结构保持对靶分子的特异性结合亲和力或保持信号转导活性(例如，效应结构域活性)或二者。在某些实施方案中，连接区域可以包含“接头模块”，其为具有约2至约500个氨基酸的氨基酸序列，其可以为由接头连接的两个区域、结构域、基序、盒或模块之间的构象运动提供柔性和空间。示例性的接头模块包括具有1至约10个GlyxSery重复的那些，其中x和y独立地是0-10的整数，前提条件是，x和y不都是0(例如，(Gly4Ser)2(SEQ ID NO:67)、(Gly3Ser)2(SEQID NO:68)、Gly2Ser或它们的组合，如(Gly3Ser)2Gly2Ser)(SEQ ID NO:69)。在某些其它实施方案中，连接区域可以具有包含一个或多个免疫球蛋白重链恒定区如单独的CH3或CH2CH3的接头模块。在其它实施方案中，连接区域可以包含铰链区或标签盒。每个这样的连接组分不是相互排斥的。例如，连接区域可以包含一个铰链和一个或多个接头模块，或连接区域可以包含一个铰链、一个或多个接头模块和一个或多个标签盒。示例性的连接区域的长度可以变化，例如，约5至约500个氨基酸，或约10至约350个氨基酸，或约15至约100个氨基酸，或约20至约75个氨基酸，或约25至约35个氨基酸。
本文中使用的“疏水部分”是指在细胞膜中具有热力学上稳定的三维结构且通常在约15个氨基酸至约30个氨基酸的长度范围内的任何氨基酸序列。疏水结构域的结构可以包含α螺旋、β筒、β折叠、β螺旋或它们的任意组合。
本文中使用的“效应结构域”是融合蛋白或受体的细胞内部分，其在接收适当信号时可以在细胞中直接地或间接地促进生物学或生理学应答。在某些实施方案中，效应结构域是当结合时接收信号的蛋白或蛋白复合物的部分，或它直接结合靶分子，所述靶分子触发来自效应结构域的信号。当它含有一个或多个信号转导结构域或基序如基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)时，效应结构域可以直接促进细胞应答。在其它实施方案中，效应结构域通过结合一种或多种直接促进细胞应答的其它蛋白而间接地促进细胞应答。
“可变区接头”具体地表示5至约35个氨基酸的序列，其将重链免疫球蛋白可变区连接至轻链免疫球蛋白可变区，或连接T细胞受体Vα/β和Cα/β链(例如，Vα-Cα,Vβ-Cβ,Vα-Vβ)或将每个Vα-Cα、Vβ-Cβ、Vα-Vβ对连接至铰链或疏水结构域，这会提供对于两个亚结合结构域的相互作用而言足够的间隔功能和柔性，使得得到的单链多肽保留与抗体或T细胞受体相同的对靶分子的特异性结合亲和力。在某些实施方案中，可变区接头包含约10至约30个氨基酸或约15至约25个氨基酸。在特定实施方案中，可变区接头肽包含1-10个GlyxSery重复，其中x和y独立地是0-10的整数，前提条件是，x和y不都是0(例如，Gly4Ser(SEQ ID NO:10)、Gly3Ser(SEQ ID NO:71)、Gly2Ser或(Gly3Ser)n(Gly4Ser)1(SEQ ID NO:72)、(Gly3Ser)n(Gly2Ser)n、(SEQ ID NO:73)(Gly3Ser)n(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:72)或(Gly4Ser)n(SEQ IDNO:10)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数)，且其中连接的可变区形成功能性免疫球蛋白样结合结构域(例如，scFv、scTCR)。示例性的可变区接头包括在SEQ IDNOS.:44、65-69和71-73中描述的那些氨基酸序列和(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:10)，其中n是3，如在具有SEQID NO.:57所示的氨基酸序列的T-ChARM中所发现的。
“连接氨基酸(junction amino acid)”或“连接氨基酸残基”表示在多肽的两个邻近基序、区域或结构域之间(如在结合结构域和邻近接头区域之间，或在疏水结构域和邻近效应结构域之间，或在连接两个基序、区域或结构域的接头区域的一端或两端，例如，在接头和邻近结合结构域之间和/或在接头和邻近铰链之间)的一个或多个(例如，约2-20个)氨基酸残基。连接氨基酸可以源自融合蛋白的构建体设计(例如，在编码融合蛋白的核酸分子的构建过程中由限制性酶位点的应用而产生的氨基酸残基)。例如，在由SEQ ID NO.:58所示的核酸序列编码的T-ChARM中，单个连接氨基酸天冬酰胺由存在于编码分泌信号序列的核酸序列(SEQ ID NO.:63)和编码标签盒的序列(SEQ ID NO.:38)之间的AAT密码子编码。类似地，天冬酰胺(N)连接氨基酸存在于在具有SEQ ID NO.:54所示的氨基酸序列的T-ChARM中发现的柔性接头氨基酸序列GGSGSG(SEQ ID NO.:65)和氨基酸标签序列WSHPQFEK(SEQ ID NO.:1)之间。
抗体技术领域的技术人员理解的术语各自给出了在本领域中获得的含义，除非在本文中明确地不同地定义。术语“抗体”表示包含通过二硫键互联的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的完整抗体，以及具有或保留结合靶分子的能力的完整抗体的抗原结合部分。单克隆抗体或其抗原结合部分可以是非人的、嵌合的、人源化的或人的，优选人源化的或人的。免疫球蛋白结构和功能综述在，例如，Harlow等人,编.,Antibodies:A LaboratoryManual,第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,1988)。
例如，术语“VL”和“VH”表示分别来自抗体轻链和重链的可变结合区域。所述可变结合区域由被称作“互补性决定区”(CDR)和“框架区”(FR)的不连续的、明确限定的亚区域构成。术语“CL”表示“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”，即，来自抗体轻链的恒定区。术语“CH”表示“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”，其可以根据抗体同种型进一步分成CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)或CH1、CH2、CH3和CH4结构域(IgE、IgM)。“Fab”(抗原结合片段)是抗体结合抗原的部分，且包括可变区和通过链间二硫键连接至轻链的重链的CH1。
本文中使用的“Fc区部分”表示来自抗体的Fc片段(“可结晶片段”区或Fc区)的重链恒定区区段，其可以包括一个或多个恒定结构域，如CH2、CH3、CH4或它们的任意组合。在某些实施方案中，Fc区部分包括IgG、IgA或IgD抗体的CH2和CH3结构域或它们的任意组合，或IgM或IgE抗体的CH3和CH4结构域和它们的任意组合。在其它实施方案中，CH2CH3或CH3CH4结构具有来自相同抗体同种型的亚区域结构域，且是人的，如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM(例如，来自人IgG1的CH2CH3)。作为背景，Fc区负责免疫球蛋白的效应子功能，如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、CDC(补体依赖性的细胞毒性)和补体结合，结合Fc受体(例如，CD16、CD32、FcRn)，相对于缺少Fc区的多肽的更大的体内半衰期，蛋白A结合，且可能甚至是胎盘转移(参见Capon等人,Nature 337:525,1989)。在某些实施方案中，在本公开的融合蛋白中发现的Fc区部分能够介导这些效应子功能中的一种或多种，或通过例如本领域已知的一种或多种突变而缺少这些活性中的一种或多种或全部。
另外，抗体具有典型地位于Fab和Fc区之间的铰链序列(但是铰链的下段可以包括Fc区的氨基端部分)。作为背景，免疫球蛋白铰链充当柔性间隔区以允许Fab部分在空间上自由移动。不同于恒定区，铰链具有结构多样性，在免疫球蛋白种类之间和甚至亚类之间序列和长度有所不同。例如，人IgG1铰链区是自由柔性的，其允许Fab片段围绕对称轴旋转和以在两个重链间二硫键中的第一个为中心的球体内移动。通过对比，人IgG2铰链是相对短的，且含有被四个重链间二硫键稳定化的刚性聚脯氨酸双螺旋，其限制柔性。人IgG3铰链与其它亚类的差别在于它的独特的伸长的铰链区(是IgG1铰链的长度的约4倍)，其含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，从而形成不可弯曲的聚脯氨酸双螺旋，并提供更大的柔性，因为Fab片段相对远离Fc片段。人IgG4铰链比IgG1更短，但是具有与IgG2相同的长度，且它的柔性介于IgG1和IgG2之间。
“T细胞受体”(TCR)表示在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现的分子，其与CD3联合地通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。在大多数T细胞中TCR具有高度可变的α和β链(也分别被称作TCRα和TCRβ)的二硫键连接的异源二聚体。在T细胞的小子集中，TCR由可变γ和δ链(也分别被称作TCRγ和TCRδ)的异源二聚体构成。TCR的每个链是免疫球蛋白超家族的一个成员，且具有一个N-端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、一个跨膜区域和一个在C-端的短的胞质尾(参见Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current BiologyPublications,第4:33页,1997)。在本公开中使用的TCR可以来自多个动物物种，包括人、小鼠、大鼠、猫、狗、山羊、马或其它哺乳动物。TCR可以是细胞结合的(即，具有跨膜区域或结构域)或呈可溶形式。
“主要组织相容性复合物分子”(MHC分子)表示向细胞表面递送肽抗原的糖蛋白。MHC I类分子是跨膜的α链(具有三个α结构域)和非共价地结合的β2微球蛋白组成的异源二聚体。MHC II类分子由两个跨膜糖蛋白α和β组成，它们二者皆跨膜。每个链具有两个结构域。MHC I类分子将起源于胞质溶胶中的肽递送至细胞表面，在此处肽:MHC复合物被CD8+T细胞识别。MHC II类分子将起源于囊泡系统中的肽递送至细胞表面，在此处它们被CD4+T细胞识别。MHC分子可以来自多种动物物种，包括人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
“载体”是一种核酸分子，其能够运输另一种核酸。载体可以是，例如，质粒、粘粒、病毒或噬菌体。“表达载体”是当存在于适当环境中时能够指导由所述载体携带的一种或多种基因编码的蛋白表达的载体。
“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒。“γ逆转录病毒”表示逆转录病毒科的一个属。示例性的γ逆转录病毒包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮组织增殖病病毒。
“慢病毒”表示能够感染分裂的和非分裂的细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个例子包括HIV(人免疫缺陷病毒：包括HIV 1型和HIV 2型)；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
“造血先祖细胞”是从造血干细胞或胎儿组织衍生出的细胞，其能够进一步分化成成熟细胞类型(例如，T细胞谱系的细胞)。在某些实施方案中，CD24lo Lin-CD117+造血先祖细胞是有用的。如本文中定义的，造血先祖细胞可以包括胚胎干细胞，其能够进一步分化成T细胞谱系的细胞。造血先祖细胞可以来自多个动物物种，包括人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。“胸腺细胞先祖细胞”或“胸腺细胞”是存在于胸腺中的造血先祖细胞。
“造血干细胞”表示未分化的造血细胞，其能够在体内自我更新，在体外基本上无限地扩增，且能够分化成其它细胞类型，包括T细胞谱系的细胞。造血干细胞可以分离自，例如，但不限于，胎儿肝、骨髓、脐带血。
“胚胎干细胞”或“ES细胞”或“ESC”表示未分化的胚胎干细胞，其具有整合进发育中的胚胎的种系中并变成其组成部分的能力。胚胎干细胞能够分化成造血先祖细胞和任何组织或器官。适合用在本文中的胚胎干细胞包括来自以下的细胞：J1ES细胞系、129J ES细胞系、鼠干细胞系D3(美国典型培养物保藏中心)、来源于129/Sv小鼠的R1或E14K细胞系、来源于Balb/c和C57Bl/6小鼠的细胞系和人胚胎干细胞(例如来自WiCell ResearchInstitute,WI；或ES cell International,Melbourne,澳大利亚)。
“T细胞谱系的细胞”表示表现出T细胞或其前体或先祖的至少一种表型特征的细胞，所述表型特征将所述细胞与其它淋巴细胞和红细胞或骨髓谱系的细胞区分开。这样的表型特征可以包括T细胞特有的一种或多种蛋白(例如，CD3+、CD4+、CD8+)的表达，或T细胞特有的生理学特征、形态学特征、功能特征或免疫学特征。例如，T细胞谱系的细胞可以是归类于T细胞谱系的先祖细胞或前体细胞；CD25+未成熟的和失活的T细胞；已经经历CD4或CD8谱系定型的细胞；CD4+CD8+双阳性的胸腺细胞先祖细胞；单阳性的CD4+或CD8+；TCRαβ或TCRγδ；或成熟的和功能性的或活化的T细胞。
“核酸分子”或多核苷酸可以呈RNA或DNA的形式，其包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。核酸分子可以是双链的或单链的，且如果是单链的，可以是编码链或非编码链(反义链)。编码分子可以具有与本领域已知的编码序列相同的编码序列，或可以具有不同的编码序列，其作为遗传密码的冗余或简并性的结果或通过剪接可以编码相同的多肽。
“治疗”或“处理”或“改善”表示受试者(例如，人或非人哺乳动物，如灵长类动物、马、狗、小鼠、大鼠)的疾病、病症或病症的医学管理。一般而言，以足以引起治疗或预防益处的量施用适当的剂量或治疗方案，其包含表达本公开的Key-ChEM或T-ChARM的宿主细胞和任选的佐剂。治疗或预防/防止益处包括改善的临床结果；与疾病有关的征状的缓解或减轻；减少的征状发生；改善的生活质量；更长的无疾病状态；疾病的范围的减小，疾病状态的稳定化；疾病进展的延迟；减轻；存活；延长的存活；或它们的任意组合。
本公开的融合蛋白或表达本公开的融合蛋白(例如，Key-ChEM、T-ChARM)的细胞的“治疗有效量”或“有效量”表示足以以统计上显著的方式导致正在治疗的疾病的一种或多种征状的改善的化合物或细胞的量。当提及单独施用的单一活性成分或表达单一活性成分的细胞时，治疗有效剂量表示该成分或表达该单独成分的细胞的效果。当提及组合时，治疗有效剂量表示导致治疗效果的活性成分的组合量或组合的辅助性活性成分与表达活性成分的细胞，无论是连续地还是同时地施用。另一种组合可以是表达超过一种活性成分(如两种不同的T-ChARM、T-ChARM和TCR、T-ChARM和CAR、或它们的组合)的细胞。
贯穿本公开提供了另外的定义。
Key-ChEM和T-ChARM
在某些方面，本公开提供了一种被称作Key-ChEM的单链融合蛋白，其包含通过疏水部分连接的细胞外组分和细胞内组分，其中所述细胞外组分包含标签盒和包含铰链的连接区域，且其中所述细胞内组分包含效应结构域。在某些实施方案中，连接区域还包含一个接头模块或一个或多个位于连接区域内的标签盒。在某些其它实施方案中，一个或多个标签盒通过接头模块连接至连接区域。
在其它Key-ChEM实施方案中，所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：标签盒、包含铰链的连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分(参见，例如，图1A和1B)。在其它Key-ChEM实施方案中，所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：第一连接区域、标签盒、包含铰链的第二连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分。在其它Key-ChEM实施方案中，所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：第一标签盒、第一连接区域、第二标签盒、包含铰链的第二连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分(参见，例如，图1C)。在其它Key-ChEM实施方案中，所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：第一标签盒、第一连接区域、第二标签盒、第二连接区域、第三标签盒、包含铰链的第三连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分(参见，例如，图1D)。
在某些其它Key-ChEM实施方案中，所述融合蛋白还包含非共价地结合的结合结构域，如与标签盒结合的结合结构域(即，多链T-ChARM)。在其它Key-ChEM实施方案中，所述非共价地结合的结合结构域是双特异性的，其中第一结合端是对标签盒特异性的，且第二结合端是对不同于标签盒的靶标特异性的，或者所述第一和第二结合端都是对标签盒特异性的。在其它Key-ChEM实施方案中，所述非共价地结合的结合结构域是多特异性的，其中第一端结合标签盒，且第二端是对不同于标签盒的一种或多种靶标特异性的。在这样的实施方案中，Key-ChEM包含多聚体蛋白。在某些实施方案中，这样的包含一个或多个非共价地结合的结合结构域的Key-ChEM包含杂多聚体。
在其它方面，本公开提供了一种被称作T-ChARM的单链融合蛋白，其包含通过疏水部分连接的细胞外组分和细胞内组分，其中所述细胞外组分包含特异性地结合靶标的结合结构域、标签盒和包含铰链的连接区域，且其中所述细胞内组分包含效应结构域。在某些实施方案中，T-ChARM结合结构域是scFv、scTCR、受体胞外结构域或配体。
在其它T-ChARM实施方案中，所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：细胞外结合结构域、标签盒、包含铰链的连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分(参见，例如，图1E)。在其它T-ChARM实施方案中，所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：细胞外结合结构域、第一连接区域、标签盒、包含铰链的第二连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分。在其它T-ChARM实施方案中，所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：细胞外结合结构域、第一标签盒、第一连接区域、第二标签盒、包含铰链的第二连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分。在其它T-ChARM实施方案中，所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：细胞外结合结构域、第一标签盒、第一连接区域、第二标签盒、第二连接区域、第三标签盒、包含铰链的第三连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分。
在某些其它T-ChARM实施方案中，所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：标签盒、细胞外结合结构域、包含铰链的连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分(参见，例如，图1F)。在其它T-ChARM实施方案中，所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：细胞外scFv或scTCR结合结构域、包含铰链的连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分，所述细胞外scFv或scTCR结合结构域包含可变区接头，所述可变区接头含有标签盒，所述标签盒被设置在可变区之间(例如，在可变区接头的N端处或附近，在可变区接头的C端处或附近，或靠近可变区接头的中央嵌入)。嵌入可变区接头中的一个示例性标签盒包含GGSGSG(X)nWSHPQFEKGSGSG(SEQ ID NO.:45)，其中X是任选的，可以是任意氨基酸，且n是0、1、2、3、4或5。在SEQ ID NO.:54中，存在这样的具有嵌入标签的可变区接头，其中n是1且X是天冬酰胺(N)。
Key-ChEM或T-ChARM可以是细胞结合的(例如，在细胞表面上表达)或呈可溶形式。在某些实施方案中，编码Key-ChEM或T-ChARM融合蛋白的核酸分子可以经过密码子优化以增强或最大化在某些类型的细胞如T细胞中的表达(Scholten等人,Clin.Immunol.119:135,2006)。
在其它实施方案中，Key-ChEM或T-ChARM还可以包含细胞毒性的组分(例如，化疗药物如抗有丝分裂剂(例如，长春地辛)、抗叶酸剂、烷化剂(例如，替莫唑胺)、细菌毒素、蓖麻毒素、抗病毒剂、放射性同位素、放射性金属)，其可用于特异性地杀死或抑制癌细胞、感染的细胞或其它患病的细胞。在其它实施方案中，Key-ChEM或T-ChARM还可以包含可检测的组分(例如，生物素、荧光部分、放射性核素)，其可用于跟踪或成像癌细胞、感染的细胞或其它组织(例如，在自身免疫攻击下的组织)。在其它实施方案中，Key-ChEM或T-ChARM还可以包含功能性组分(例如，免疫刺激部分、细胞因子、免疫调节剂、免疫球蛋白蛋白等)。
在本文中进一步详细描述了本公开的融合蛋白的组成部分。
标签盒
在根据本公开的单链融合蛋白(例如，Key-ChEM或T-ChARM)中所含的标签盒将是可以以高亲和力或亲合力特异性地结合关联受体或结合配偶体(例如，抗体)的细胞外组分，其中所述关联受体或结合配偶体对于表达Key-ChEM或T-ChARM的宿主或细胞而言是异源的或非内源性的。在单链融合蛋白结构内，标签盒可以位于(a)连接区域的氨基端的紧邻处，(b)插入在接头模块之间并连接接头模块，(c)结合结构域的羧基端的紧邻处，(d)插入在结合结构域(例如，scFv)与效应结构域之间并连接二者，(e)插入在结合结构域的亚基之间并将其连接，或(f)在本公开的单链融合蛋白的氨基端处。在某些实施方案中，一个或多个连接氨基酸可以被设置在标签盒与疏水部分之间并连接二者，或设置在标签盒与连接区域之间并连接二者，或设置在标签盒与接头模块之间并连接二者，或设置在标签盒与结合结构域之间并连接二者。
示例性的标签盒包括Strep标签(其是指原始的
Figure BDA0001070643250000231
标签、
Figure BDA0001070643250000232
标签II或其任意变体；参见，例如，美国专利号7,981,632，所述Strep标签通过引用并入本文),His标签,Flag标签(SEQ ID NO.:3),Xpress标签(SEQ ID NO.:4),Avi标签(SEQ ID NO.:5),钙调蛋白标签(SEQ ID NO.:19),聚谷氨酸标签,HA标签(SEQ ID NO.:6),Myc标签(SEQ ID NO.:7),Nus标签,S标签,SBP标签,Softag1(SEQ ID NO.:9),Softag 3(SEQ ID NO.:32),V5标签(SEQ ID NO.:8),CREB-结合蛋白(CBP),谷胱甘肽S-转移酶(GST),麦芽糖结合蛋白(MBP),绿色荧光蛋白(GFP),硫氧还蛋白标签,或它们的任意组合。在某些实施方案中，标签盒是具有Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:1)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO.:2)的氨基酸序列的Strep标签。在其它实施方案中，标签盒可以是遗传工程改造的亲和位点，如最小螯合位点(例如，HGGHHG,SEQ ID NO.:33)
标签盒可以以多个拷贝存在于本公开的融合蛋白中。例如，本公开的融合蛋白可以具有1、2、3、4或5个标签盒(例如，Strep标签)。在某些实施方案中，Key-ChEM或T-ChARM的连接区域包括一个标签盒、两个标签盒、三个标签盒、四个标签盒或五个标签盒。所述多个标签盒中的每一个可以是相同的或不同的。示例性实施方案包括具有Strep标签和Strep标签盒、或His标签和Strep标签盒、或HA标签和Strep标签盒、或Myc标签和Strep标签盒的Key-ChEM或T-ChARM。备选地，Key-ChEM或T-ChARM将具有相同类型或相同氨基酸序列的多个标签盒，如2、3、4或5个Strep标签盒(例如，Strep标签II)。
例如，Key-ChEM或T-ChARM可以具有至少两个不同的标签盒。在某些实施方案中，第一标签盒可以提供刺激信号，且不同的第二标签盒可能用于与检测试剂结合或与抗体-毒素缀合物或与抗体-成像剂缀合物结合。在其它实施方案中，所述两个或更多个第一标签盒可以位于Key-ChEM或T-ChARM的不同区域中。在某些实施方案中，第一标签盒位于连接区域中，且第二标签盒位于Key-ChEM或T-ChARM的氨基端或羧基端或二者处(参见，例如，图1H)。
在某些实施方案中，标签盒包含约5至约500个氨基酸、或约6至约100个氨基酸、或约7至约50个氨基酸、或约8至约20个氨基酸。在某些实施方案中，标签盒具有7-10个氨基酸。优选地，标签盒是非免疫原性的或最小免疫原性的。基本上，标签盒可以充当手柄或信标以允许鉴别、富集、分离、活化、跟踪或消除表达Key-ChEM或T-ChARM的细胞或者促进其增殖。
在某些实施方案中，标签盒位于本公开的融合蛋白的连接区域内。例如，连接区域还可以包含与标签盒邻近的接头模块，其中所述接头模块与标签盒一起具有以下氨基酸序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:20)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:21)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:22)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:23)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:24)或Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:25)。
包含如本文中所述的一个或多个标签盒的单链融合蛋白将能够与关联结合配偶体结合，其中所述关联结合配偶体对于表达如本文中所述的包含标签盒的融合蛋白的宿主或细胞而言是异源的。在某些实施方案中，存在于本公开的单链Key-ChEM或T-ChARM中的标签盒是Strep标签，其具有链霉抗生物素、streptactin或二者作为关联结合配偶体，或者被对Strep标签特异性的抗体识别。在某些实施方案中，所述关联结合配偶体(例如，受体、蛋白、抗体)可以是可溶的，是基质组合物的部分，或缀合至固体表面(例如，平板、小珠)。示例性的固体表面包括小珠和颗粒(例如，微米小珠和颗粒和纳米小珠和颗粒)，如磁性小珠和颗粒。
在单链T-ChARM融合蛋白实施方案中，蛋白复合物可以形成在融合蛋白和关联标签盒结合配偶体之间，这是标签盒和结合配偶体之间的结合的结果。在某些实施方案中，T-ChARM包含scFv或scTCR结合结构域，其中标签盒位于可变区接头内(在结合结构域亚基之间)。在其它实施方案中，T-ChARM具有位于结合结构域的氨基端处的标签盒。在这样的蛋白复合物或融合蛋白结构中，T-ChARM结合结构域将保持它的靶标特异性或它的特异性靶标结合亲和力。
连接区域和铰链
在根据本公开的单链融合蛋白中包含铰链的连接区域可以位于(a)疏水部分的氨基端紧邻处，(b)插入在标签盒(例如，Strep标签)和效应结构域之间并连接二者，(c)结合结构域的羧基端紧邻处，或(d)插入在接头模块和效应结构域之间并连接二者。如本文中所述的包含具有铰链的连接区域的单链融合蛋白将能够与另一种单链融合蛋白结合以形成二聚体(例如，同源二聚体或异源二聚体)，其中Key-ChEM或T-ChARM二聚体将含有一个或多个能够结合关联结合配偶体的标签盒，且T-ChARM二聚体将进一步包含保持其靶标特异性或其特异性靶标结合亲和力的结合结构域。
连接区域可以仅由铰链组成、仅由接头模块组成、由铰链和接头模块组成或由铰链、一个或多个接头模块和一个或多个标签盒组成。在某些实施方案中，接头模块包括形成柔性结构的约2至约20个氨基酸。示例性的接头模块包括免疫球蛋白CH2CH3、免疫球蛋白CH3、或一个或多个GlyxSery，其中x和y独立地是0-10的整数，前提条件是，x和y不都是0(例如，(Gly4Ser)2(SEQ ID NO:67)、(Gly3Ser)2(SEQ ID NO:68)、Gly2Ser或它们的组合如(Gly3Ser)2Gly2Ser)(SEQ ID NO:69)。在其它实施方案中，连接区域包含标签盒。例如，连接区域含有一至五个标签盒，其中每个标签盒连接至一个或两个包含(GlyxSery)n的接头模块，其中n是1-10的整数，且x和y独立地是0-10的整数，前提条件是，x和y不都是0。示例性的接头模块具有Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO.:10)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ IDNO.:11)、(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO.:12)的氨基酸序列，其可以以任意组合存在于连接区域内。
在某些实施方案中，存在于本公开的单链Key-ChEM或T-ChARM中的铰链可以是免疫球蛋白铰链区，如野生型免疫球蛋白铰链区或其改变的免疫球蛋白铰链区。在某些实施方案中，铰链是野生型人免疫球蛋白铰链区。在某些其它实施方案中，一个或多个氨基酸残基可以添加在野生型免疫球蛋白铰链区的氨基端或羧基端处作为融合蛋白构建体设计的部分。例如，1、2或3个另外的连接氨基酸残基可以存在于铰链氨基端或羧基端处，或铰链可以含有末端或内部缺失且已经加回1、2或3个另外的连接氨基酸残基。
在某些实施方案中，铰链是改变的免疫球蛋白铰链，其中在野生型免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基被一个或多个其它氨基酸残基置换。示例性的改变的免疫球蛋白铰链包括免疫球蛋白人IgG1、IgG2或IgG4铰链区，其中在野生型人IgG1、IgG2或IgG4铰链中发现的1、2或3个半胱氨酸残基被1、2或3个不同的氨基酸残基(例如，丝氨酸或丙氨酸)置换。在某些实施方案中，铰链多肽包含或是与野生型免疫球蛋白铰链区(如野生型人IgG1铰链、野生型人IgG2铰链或野生型人IgG4铰链)具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列。
在其它实施方案中，存在于本公开的单链Key-ChEM或T-ChARM中的铰链可以是并非基于或源自免疫球蛋白铰链的铰链(即，不是野生型免疫球蛋白铰链或改变的免疫球蛋白铰链)。这样的铰链的例子包括II型C-凝集素或CD分子的茎区域的约5至约150个氨基酸的肽，包括约8至约25个氨基酸的肽、或约7至约18个氨基酸的肽、或其变体。
II型C-凝集素或CD分子的“茎区域”表示II型C-凝集素或CD分子的位于C-型凝集素样结构域(CTLD；例如，类似于天然杀伤细胞受体的CTLD)和疏水部分(跨膜结构域)之间的细胞外结构域的部分。例如，人CD94(GenBank登记号AAC50291.1)的细胞外结构域对应于氨基酸残基34-179，但是CTLD对应于氨基酸残基61-176，所以人CD94分子的茎区域包含氨基酸残基34-60，其位于疏水部分(跨膜结构域)和CTLD之间(参见Boyington等人,Immunity10:75,1999；关于其它茎区域的描述，也参见Beavil等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 89:753,1992；和Figdor等人,Nat.Rev.Immunol.2:77,2002)。这些II型C-凝集素或CD分子也可以具有在茎区域和跨膜区域或CTLD之间的连接氨基酸。在另一个实施例中，233个氨基酸的人NKG2A蛋白(GenBank登记号P26715.1)具有范围为氨基酸71-93的疏水部分(跨膜结构域)和范围为氨基酸94-233的细胞外结构域。CTLD包含氨基酸119-231，且茎区域包含氨基酸99-116，其可以侧接另外的连接氨基酸。其它II型C-凝集素或CD分子、以及它们的细胞外配体结合结构域、茎区域和CTLD是本领域已知的(参见，例如，GenBank登记号NP_001993.2；AAH07037.1；NP_001773.1；AAL65234.1；CAA04925.1；分别关于人CD23、CD69、CD72、NKG2A和NKG2D的序列及其描述)。
II型C-凝集素或CD分子的茎区域铰链或其片段的“衍生物”包括约8至约150个氨基酸序列，其中野生型II型C-凝集素或CD分子的茎区域的1、2或3个氨基酸具有缺失、插入、置换或它们的任意组合。例如，衍生物可以包含一个或多个氨基酸置换和/或氨基酸缺失。在某些实施方案中，与野生型茎区域序列(如来源于NKG2A、NKG2D、CD23、CD64、CD72或CD94的约8至约20个氨基酸的那些)相比，茎区域的衍生物对蛋白水解性裂解具有更高抗性。
在某些实施方案中，茎区域铰链可以包含约7至约18个氨基酸且可以形成α-螺旋卷曲螺旋(coiled coil)结构。在某些实施方案中，茎区域铰链含有0、1、2、3或4个半胱氨酸。示例性的茎区域铰链包括茎区域的片段，如包含来自CD69、CD72、CD94、NKG2A和NKG2D的茎区域的约10至约150个氨基酸的那些部分。
可以用在本公开的单链Key-ChEM或T-ChARM中的替代铰链来自连接免疫球蛋白V样或免疫球蛋白C样结构域的细胞表面受体部分(结构域间区域)。还预期在Ig V样结构域之间的区域(在细胞表面受体含有多个串联的Ig V样结构域的情况下)和在Ig C样结构域之间的区域(在细胞表面受体含有多个串联的Ig C样区域的情况下)作为可用在本公开的单链Key-ChEM或T-ChARM中的铰链。在某些实施方案中，由细胞表面受体结构域间区域组成的铰链序列还可以含有天然存在的或添加的基序，如IgG核心铰链序列，以提供一个或多个二硫键从而稳定Key-ChEM或T-ChARM二聚体形成。铰链的例子包括在CD2、CD4、CD22、CD33、CD48、CD58、CD66、CD80、CD86、CD150、CD166或CD244的Ig V样和Ig C样区域之间的结构域间区域。
在某些实施方案中，铰链序列具有约5至约150个氨基酸、约5至约10个氨基酸、约10至约20个氨基酸、约20至约30个氨基酸、约30至约40个氨基酸、约40至约50个氨基酸、约50至约60个氨基酸、约5至约60个氨基酸、约5至约40个氨基酸，例如，约8至约20个氨基酸或约10至约15个氨基酸。所述铰链可以是基本上柔性的，但是也可以提供更刚性的特征或可以主要含有α-螺旋结构而具有最小β折叠结构。
在某些实施方案中，铰链序列在血浆和血清中是稳定的，且耐受蛋白水解性裂解。例如，在IgG1上铰链区中的第一个赖氨酸可以被突变或删除以使蛋白水解性裂解最小化，且铰链可以包括连接氨基酸。在某些实施方案中，铰链序列可以含有天然存在的或添加的基序，如免疫球蛋白铰链核心结构CPPCP(SEQ ID NO.:26)，其赋予形成一个二硫键或多个二硫键以稳定二聚体形成的能力。
疏水部分
在本公开的单链融合蛋白(例如，Key-ChEM或T-ChARM)中所含的疏水部分将允许本公开的融合蛋白与细胞膜结合，使得融合蛋白的一部分将位于细胞外(例如，标签盒、连接结构域、结合结构域)且一部分将位于细胞内(例如，效应结构域)。疏水部分通常被设置在细胞膜磷脂双层内。在某些实施方案中，一个或多个连接氨基酸可以被设置在疏水部分与效应结构域之间并连接二者，或设置在疏水部分与连接区域之间并连接二者，或设置在疏水部分与标签盒之间并连接二者。
在某些实施方案中，疏水结构域是跨膜结构域，如来源于整合膜蛋白(例如，受体、分化簇(CD)分子、酶、转运蛋白、细胞粘附分子等)的跨膜结构域。在特定实施方案中，疏水部分是来自CD4、CD8、CD27或CD28的跨膜结构域。在某些实施方案中，跨膜结构域是具有在SEQ ID NO.:16中所示的氨基酸的CD28跨膜结构域。
效应结构域
在本公开的单链融合蛋白(例如，Key-ChEM或T-ChARM)中所含的效应结构域将是细胞内组分，且能够将功能信号传递给细胞。在某些实施方案中，单链Key-ChEM或T-ChARM将分别与第二单链Key-ChEM或T-ChARM二聚化，其中所述二聚化允许包含效应结构域的细胞内组分紧邻并在暴露于适当信号时促进信号转导。除了形成这样的二聚体蛋白复合物以外，效应结构域还可以与其它信号转导因子(如共刺激因子)结合，以形成产生细胞内信号的多蛋白复合物。在某些实施方案中，效应结构域通过与一种或多种直接促进细胞应答的其它蛋白结合而间接地促进细胞应答。效应结构域可以包括一个、两个、三个或更多个受体信号转导结构域、共刺激结构域或它们的组合。包含来自多种信号转导分子(例如，信号转导受体)中的任一种的效应结构域、共刺激结构域或二者的任何细胞内组分可以用在本公开的融合蛋白中。
在本公开的融合蛋白中有用的效应结构域可以来自以下各项的蛋白：Wnt信号转导途径(例如，LRP、Ryk、ROR2)、NOTCH信号转导途径(例如，NOTCH1、NTOCH2、NOTCH3、NOTCH4)、Hedgehog信号转导途径(例如，PTCH、SMO)、受体酪氨酸激酶(RTK)(例如，表皮生长因子(EGF)受体家族、成纤维细胞生长因子(FGF)受体家族、肝细胞生长因子(HGF)受体家族、胰岛素受体(IR)家族、血小板来源的生长因子(PDGF)受体家族、血管内皮生长因子(VEGF)受体家族、原肌球蛋白受体激酶(Trk)受体家族、ephrin(Eph)受体家族、AXL受体家族、白细胞酪氨酸激酶(LTK)受体家族、具有免疫球蛋白样和EGF样结构域1的酪氨酸激酶(TIE)受体家族、受体酪氨酸激酶样孤儿(ROR)受体家族、discoidin结构域(DDR)受体家族、在转染过程中重新布置的(RET)受体家族、酪氨酸-蛋白激酶样(PTK7)受体家族、与受体酪氨酸激酶(RYK)受体家族有关的、肌肉特异性激酶(MuSK)受体家族)；G-蛋白偶联受体、GPCR(Frizzled,Smoothened)；丝氨酸/苏氨酸激酶受体(BMPR、TGFR)；或细胞因子受体(IL1R、IL2R、IL7R、IL15R)。
在某些实施方案中，效应结构域包含淋巴细胞受体信号转导结构域或包含具有一个或多个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的氨基酸序列。在其它实施方案中，效应结构域包含与细胞质信号转导蛋白结合的细胞质部分，其中所述细胞质信号转导蛋白是淋巴细胞受体或其信号转导结构域、包含多个ITAM的蛋白、共刺激因子或它们的任意组合。
示例性的效应结构域包括来自4-1BB(例如，SEQ ID NO.:17)、CD3ε、CD3δ、CD3ζ(例如，SEQ ID NO.:18)、CD27、CD28(例如，SEQ ID NO.:35)、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NOTCH1、Wnt、NKG2D、OX40、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或它们的任意组合的那些。
在特定实施方案中，本公开的Key-ChEM或T-ChARM的效应结构域是CD3ζ和CD28，是CD3ζ和4-1BB，或是CD3ζ、CD28和4-1BB。
结合结构域
如本文中描述的，本公开的T-ChARM单链融合蛋白包含特异性地结合靶标的结合结构域。结合结构域对靶标的结合可以阻断靶标(例如，受体或配体)和另一种分子之间的相互作用，并例如干扰、减少或消除靶标的某些功能(例如，信号转导)，或结合靶标可以诱导某些生物途径或鉴别靶标用于消除。
结合结构域可以是特异性地结合目标靶标的任何肽。结合结构域的来源包括来自多个物种的抗体可变区(其可以呈抗体、sFv、scFv、Fab、基于scFv的grababody或可溶性VH结构域或结构域抗体的形式)，所述物种包括人、啮齿动物、禽或羊。结合结构域的另外来源包括来自其它物种的抗体的可变区，所述物种如骆驼科(camelid)(来自骆驼、单峰骆驼或羊驼；Ghahroudi等人,FEBS Lett.414:521,1997；Vincke等人,J.Biol.Chem.284:3273,2009；Hamers-Casterman等人,Nature 363:446,1993和Nguyen等人,J.Mol.Biol.275:413,1998),铰口鲨(nurse shark)(Roux等人,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)95:11804,1998),科氏兔银鲛(spotted ratfish)(Nguyen等人,Immunogen.54:39,2002)或七鳃鳗(lamprey)(Herrin等人,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)105:2040,2008和Alder等人.Nat.Immunol.9:319,2008)。这些抗体可以仅使用重链可变区形成抗原结合区域，即，这些功能性抗体是仅重链的同源二聚体(被称作“重链抗体”)(Jespers等人,Nat.Biotechnol.22:1161,2004；Cortez-Retamozo等人,Cancer Res.64:2853,2004；Baral等人,Nature Med.12:580,2006；和Barthelemy等人,J.Biol.Chem.283:3639,2008)。
本公开的结合结构域的替代来源包括编码随机肽文库的序列或编码替代非抗体支架的环区域中的经工程改造的氨基酸多样性的序列，如scTCR(参见，例如，Lake等人,Int.Immunol.11:745,1999；Maynard等人,J.Immunol.Methods 306:51,2005；美国专利号8,361,794),纤维蛋白原结构域(参见，例如，Weisel等人,Science 230:1388,1985),Kunitz结构域(参见，例如，美国专利号6,423,498),设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)(Binz等人,J.Mol.Biol.332:489,2003和Binz等人,Nat.Biotechnol.22:575,2004),纤连蛋白结合结构域(adnectin或monobody)(Richards等人,J.Mol.Biol.326:1475,2003；Parker等人,Protein Eng.Des.Selec.18:435,2005和Hackel等人(2008)J.Mol.Biol.381:1238-1252),半胱氨酸结微型蛋白(Vita等人(1995)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)92:6404-6408；Martin等人(2002)Nat.Biotechnol.21:71,2002和Huang等人(2005)Structure 13:755,2005),三十四肽重复结构域(Main等人,Structure 11:497,2003和Cortajarena等人,ACS Chem.Biol.3:161,2008),富亮氨酸重复结构域(Stumpp等人,J.Mol.Biol.332:471,2003),脂质运载蛋白结构域(参见，例如，WO 2006/095164,Beste等人,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)96:1898,1999和
Figure BDA0001070643250000311
等人,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)106:8198,2009),V-样结构域(参见，例如，美国专利申请公开号2007/0065431),C-型凝集素结构域(Zelensky和Gready,FEBS J.272:6179,2005；Beavil等人,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)89:753,1992和Sato等人,Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)100:7779,2003),mAb2或FcabTM(参见，例如，PCT专利申请公开号WO 2007/098934；WO 2006/072620),armadillo重复蛋白(参见，例如，Madhurantakam等人,Protein Sci.21:1015,2012；PCT专利申请公开号WO2009/040338),affilin(Ebersbach等人,J.Mol.Biol.372:172,2007),affibody,avimer,knottin,fynomer,atrimer,细胞毒性T淋巴细胞相关的蛋白-4(Weidle等人,CancerGen.Proteo.10:155,2013)等(Nord等人,Protein Eng.8:601,1995；Nord等人,Nat.Biotechnol.15:772,1997；Nord等人,Euro.J.Biochem.268:4269,2001；Binz等人,Nat.Biotechnol.23:1257,2005；Boersma和Plückthun,Curr.Opin.Biotechnol.22:849,2011)。
本公开的结合结构域可以如本文中所述制备或通过本领域已知的多种方法来制备(参见，例如，美国专利号6,291,161和6,291,158)。例如，通过针对特异性地结合目标靶标的Fab片段筛选Fab噬菌体文库，可以鉴别本公开的结合结构域(参见Hoet等人,Nat.Biotechnol.23:344,2005)。另外，在方便的系统(例如，小鼠、HuMAb
Figure BDA0001070643250000321
TCmouseTM、
Figure BDA0001070643250000322
羊驼、鸡、大鼠、仓鼠、兔等)中使用目标靶标作为免疫原的传统杂交瘤开发策略可以用于开发本公开的结合结构域。
在某些实施方案中，结合结构域是包含对目标靶标特异性的VH和VL区的单链Fv片段(scFv)。在某些实施方案中，所述VH和VL域是人的。示例性的VH和VL区包括抗-CD19特异性单克隆抗体FMC63的区段(分别参见，例如，SEQ ID NO.:51和52)。
在某些实施方案中，结合结构域包含或是与轻链可变区(VL)(例如，来自FMC63,SEQ ID NO.:52；来自R12,SEQ ID NO.:56)的氨基酸序列或与重链可变区(VH)(例如，来自FMC63,SEQ ID NO.:51；来自R12,SEQ ID NO.:55)或二者具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列，其中每个CDR与特异性地结合目标靶标(例如，CD19、ROR1)的单克隆抗体或其片段或衍生物相比包含0个变化或至多1、2或3个变化。
在某些实施方案中，本公开的结合结构域VH区可以源自或基于已知单克隆抗体的VH，且与已知单克隆抗体的VH相比含有一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸置换(例如，保守的氨基酸置换或非保守的氨基酸置换)，或上面指出的变化的组合。插入、缺失或置换可以是在VH区域中的任何地方，包括在该区域的氨基端或羧基端或两端，前提条件是，每个CDR包含0个变化或至多1、2或3个变化，并且前提条件是，含有经修饰的VH区的结合结构域仍然可以以与野生型结合结构域类似的亲和力特异性地结合它的靶标。
在其它实施方案中，本公开的结合结构域中的VL区源自或基于已知单克隆抗体的VL，且与已知单克隆抗体的VL相比含有一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸置换(例如，保守的氨基酸置换)或上面指出的变化的组合。插入、缺失或置换可以是在VL区中的任何地方，包括在该区域的氨基端或羧基端或两端，前提条件是，每个CDR包含0个变化或至多1、2或3个变化，并且前提条件是，含有经修饰的VL区的结合结构域仍然可以以与野生型结合结构域类似的亲和力特异性地结合它的靶标。
VH和VL结构域可以以任一种取向(即，从氨基端至羧基端，VH-VL或VL-VH)布置，且可以通过能够提供间隔区功能的氨基酸序列(例如，具有约5至约35个氨基酸的长度)连接，使得两个亚结合结构域可以相互作用以形成功能性的结合结构域。在某些实施方案中，连接VH和VL结构域的可变区接头包括属于(GlynSer)家族的那些，如(Gly3Ser)n(Gly4Ser)1(SEQID NO:72)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:72)、(Gly3Ser)n(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:72)或(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:10)，其中n是1-5的整数。在某些实施方案中，所述接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO.:13)或Gly-Gly-Gly-Ser)4(SEQ ID NO.:14)。在某些实施方案中，这些基于(GlynSer)的接头用于连接结合结构域中的VH和VL结构域，且这些接头也可以用于将结合结构域连接至连接区域或连接至标签盒，或将标签盒连接至效应结构域。在某些其它实施方案中，标签盒是用于连接结合结构域的VH和VL结构域的基于(GlynSer)的接头的一部分或位于其内。在其它实施方案中，基于(GlynSer)的接头可以用于将一个或多个标签盒连接至T-ChARM结合结构域的N末端。
在某些实施方案中，结合结构域是包含Vα/β和Cα/β链(例如，Vα-Cα、Vβ-Cβ、Vα-Vβ)或包含对目标靶标(例如，肽-MHC复合物)特异性的Vα-Cα、Vβ-Cβ、Vα-Vβ对的单链T细胞受体(scTCR)。
在某些实施方案中，结合结构域包含或是与TCR Vα、Vβ、Cα或Cβ的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列，其中每个CDR与特异性地结合目标靶标的TCR或其片段或衍生物相比包含0个变化或至多1、2或3个变化。
在某些实施方案中，本公开的结合结构域Vα、Vβ、Cα或Cβ区域可以源自或基于已知TCR(例如，高亲和力TCR)的Vα、Vβ、Cα或Cβ，且与已知TCR的Vα、Vβ、Cα或Cβ相比含有一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸置换(例如，保守的氨基酸置换或非保守的氨基酸置换)或上面指出的变化的组合。插入、缺失或置换可以是在Vα、Vβ、Cα或Cβ区域中的任何地方，包括在这些区域的氨基端或羧基端或两端，前提条件是，每个CDR包含0个变化或至多1、2或3个变化，并且前提条件是，含有经修饰的Vα、Vβ、Cα或Cβ区域的结合结构域仍然可以以与野生型类似的亲和力特异性地结合它的靶标。
被本公开的T-ChARM单链融合蛋白所含的结合结构域特异性地结合的靶分子可以存在于目标细胞(“靶细胞”)上或与所述目标细胞结合。示例性的靶细胞包括癌细胞、与自身免疫疾病或病症有关或与炎性疾病或病症有关的细胞、和感染性生物体或细胞(例如，细菌、病毒、病毒感染的细胞)。也预见到感染性生物体(如哺乳动物寄生虫)的细胞作为靶细胞。
在某些实施方案中，本公开的T-ChARM单链融合蛋白的结合结构域识别选自肿瘤抗原、B细胞靶标、TNF受体超家族成员、Hedgehog家族成员、受体酪氨酸激酶、蛋白聚糖相关分子、TGF-β超家族成员、Wnt相关分子、T细胞靶标、树突细胞靶标、NK细胞靶标、单核细胞/巨噬细胞细胞靶标或血管生成靶标的靶标。在其它实施方案中，本公开的T-ChARM单链融合蛋白的结合结构域结合受体蛋白，如周围膜受体蛋白或跨膜受体蛋白。
在某些实施方案中，本公开的T-ChARM单链融合蛋白特异性地结合靶标，如CD3,CEACAM6,c-Met,EGFR,EGFRvIII,ErbB2,ErbB3,ErbB4,EphA2,IGF1R,GD2,O-乙酰基GD2,O-乙酰基GD3,GHRHR,GHR,FLT1,KDR,FLT4,CD44v6,CD151,CA125,CEA,CTLA-4,GITR,BTLA,TGFBR2,TGFBR1,IL6R,gp130,Lewis A,Lewis Y,TNFR1,TNFR2,PD1,PD-L1,PD-L2,HVEM,MAGE-A,间皮素,NY-ESO-1,PSMA,RANK,ROR1,TNFRSF4,CD40,CD137,TWEAK-R,HLA,与HLA结合的来源于肿瘤或病原体的肽(如来自hTERT、酪氨酸酶或WT-1),LTβR,LIFRβ,LRP5,MUC1,OSMRβ,TCRα,TCRβ,CD19,CD20,CD22,CD25,CD28,CD30,CD33,CD52,CD56,CD80,CD81,CD86,CD123,CD171,CD276,B7H4,TLR7,TLR9,PTCH1,PTCH1,Robo1,甲胎蛋白(AFP),Frizzled,OX40(也被称作CD134),或CD79b。在某些实施方案中，本公开的T-ChARM单链融合蛋白特异性地结合在被感染的细胞上表达的病原体特异性分子，如来自腺病毒、布尼亚病毒(bunyavirus)、疱疹病毒(herpesvirus)(例如，爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein BarrVirus)、巨细胞病毒(cytomegalocvirus))、乳多泡病毒(papovavirus)、乳头瘤病毒(papillomavirus)(例如，人乳头瘤病毒()，HPV)、副粘病毒(paramyxovirus)、小RNA病毒(picornavirus)、弹状病毒(rhabdovirus)(例如，狂犬病(Rabies))、正粘病毒(orthomyxovirus)(例如，流感)、痘病毒(poxvirus)(例如，牛痘(Vaccinia))、里奥病毒(reovirus)、逆转录病毒(retrovirus)、慢病毒(例如，人免疫缺陷病毒，HIV)、黄病毒(flavivirus)(例如，丙型肝炎病毒，HCV；乙型肝炎病毒，HBV)的分子。
宿主细胞和核酸
在某些方面，本公开提供了编码本文描述的Key-ChEM或T-ChARM中的任意一种或多种的核酸分子。这样的核酸分子可以被插入适当的载体(例如，病毒载体或非病毒质粒载体)中用于引入目标宿主细胞(例如，造血先祖细胞、T细胞)中。
本文中使用的术语“重组的”或“非天然的”表示包括至少一种遗传改变或已经通过引入外源核酸分子修饰过的生物体、微生物、细胞、核酸分子或载体，其中这样的改变或修饰是通过基因工程引入的。遗传改变包括例如修饰，所述修饰引入编码蛋白、融合蛋白或酶的可表达的核酸分子或细胞的遗传物质的其它核酸分子添加、缺失、置换或其它功能破坏。另外的修饰包括例如非编码调节区，其中所述修饰改变基因或操纵子的表达。在某些实施方案中，通过引入编码如本文中所述的Key-ChEM或T-ChARM的核酸，得自受试者的细胞如T细胞可以转化成非天然的或重组的细胞(例如，非天然的或重组的T细胞)，并且由此所述细胞表达细胞表面定位的Key-ChEM或T-ChARM。
编码核心病毒的载体在本文中被称作“病毒载体”。存在大量适合用于与本公开的组合物一起使用的可利用的病毒载体，包括被鉴别用于人基因治疗应用的那些(参见Pfeifer和Verma,Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177,2001)。合适的病毒载体包括基于RNA病毒的载体，如来源于逆转录病毒的载体，例如，来源于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)的载体，且包括更复杂的来源于逆转录病毒的载体，例如，来源于慢病毒的载体。来源于HIV-1的载体属于该类别。其它例子包括来源于HIV-2、FIV、马传染性贫血病毒、SIV和梅-维病毒(羊慢病毒)的慢病毒载体。使用逆转录病毒和慢病毒病毒载体和包装细胞用于用含有嵌合抗原受体转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法是本领域已知的，且之前已经描述于，例如，美国专利8,119,772；Walchli等人,PLoS One 6:327930,2011；Zhao等人,J.Immunol.174:4415,2005；Engels等人,Hum.Gene Ther.14:1155,2003；Frecha等人,Mol.Ther.18:1748,2010；Verhoeyen等人,Methods Mol.Biol.506:97,2009。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也是可商购的。
在某些实施方案中，使用病毒载体引入编码Key-ChEM的非内源性核酸序列或编码对靶标特异性的T-ChARM的非内源性核酸序列。病毒载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。病毒载体还可以包括编码转导标志物的核酸序列。用于病毒载体的转导标志物是本领域已知的，且包括选择标志物(其可以赋予抗药性)或可检测的标志物，如通过流式细胞计量术等方法可以检测的荧光标记或细胞表面蛋白。在特定实施方案中，病毒载体还包含用于转导的基因标志物，其包含绿色荧光蛋白、人CD2的细胞外结构域或截短的人EGFR(huEGFRt；参见Wang等人,Blood 118:1255,2011)。当病毒载体基因组包含多个要在宿主细胞中表达的核酸序列作为单独的转录物时，所述病毒载体也可以在所述两个(或更多个)转录物之间包含另外的序列从而允许双顺反子或多顺反子表达。在病毒载体中使用的这样的序列的例子包括内部核糖体进入位点(IRES)、弗林蛋白酶(furin)切割位点、病毒2A肽或它们的任意组合。
其它载体也可以用于多核苷酸递送，包括DNA病毒载体，包括，例如基于腺病毒的载体和基于腺相关病毒(AAV)的载体；来源于单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型HSV和减弱的HSV(Krisky等人,Gene Ther.5:1517,1998)。
最近为基因治疗用途开发的其它载体也可以与本公开的组合物和方法一起使用。这样的载体包括来源于杆状病毒和α-病毒的那些(Jolly,D J.1999.Emerging ViralVectors.第209-40页，见Friedmann T.编.The Development of Human Gene Therapy.NewYork:Cold Spring Harbor Lab)或质粒载体(如睡美人(sleeping beauty)或其它转座子载体)。在某些实施方案中，病毒或质粒载体还包含用于转导的基因标志物(例如绿色荧光蛋白,huEGFRt)。
在某些实施方案中，将造血先祖细胞或胚胎干细胞修饰成包含编码本公开的Key-ChEM或T-ChARM的非内源性核酸分子。造血先祖细胞可以包含胸腺细胞先祖细胞或诱导的多能干细胞，其可以来源于胎儿肝组织、骨髓、脐带血或外周血。造血先祖细胞可以来自人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。在特定实施方案中，使用CD24lo Lin-CD117+胸腺细胞先祖细胞。
在某些实施方案中，培养条件需要培养表达本公开的融合蛋白的造血先祖细胞足够的时间以诱导增殖或分化。通常将细胞保持培养约3天至约5天、或约4至约10天、或约5至约20天。应当理解，可以将细胞保持达到期望的结果(即，期望的细胞组成或增殖水平)所需的适当量的时间。例如，为了产生主要包含未成熟的和无活性的T细胞的细胞组成，可以将细胞保持培养约5至约20天。可以将细胞保持培养约20至约30天以产生主要包含成熟T细胞的细胞组成。还可以在不同时间点(如约几天至约25天)从培养物收集非粘附细胞。在某些实施方案中，将造血干细胞在间质细胞系上共培养(美国专利号7,575,925；Schmitt等人,Nat.Immunol.5:410,2004；Schmitt等人,Immunity 17:749,2002)。
可以向培养物加入一种或多种促进造血先祖细胞的定型(commitment)或分化的细胞因子。所述细胞因子可以是人的或非人的。可以使用的细胞因子的代表性例子包括FGF家族的所有成员，包括FGF-4和FGF-2；Flt-3-配体、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和IL-7。细胞因子可以与糖胺聚糖(如硫酸肝素)联合使用。
在某些实施方案中，能够在细胞表面上表达本公开的融合蛋白的细胞是T细胞，包括来源于人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物的原代细胞或细胞系。如果得自哺乳动物，则T细胞可以得自众多来源，包括血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或体液。可以富集或纯化T细胞。T细胞系是本领域众所周知的，其中的一些描述在Sandberg等人,Leukemia 21:230,2000中。在某些实施方案中，使用缺乏TCRα和β链的内源性表达的T细胞。这样的T细胞可以天然地缺乏TCRα和β链的内源性表达，或可以被修饰成阻断表达(例如，来自不表达TCRα和β链的转基因小鼠的T细胞，或被操作成抑制TCRα和β链的表达的细胞)或敲除TCRα链、TCRβ链或两个基因。在某些实施方案中，能够在细胞表面上表达本公开的融合蛋白的细胞不是T细胞或T细胞谱系的细胞，而是这样的细胞，即先祖细胞、干细胞或已经被修饰成表达细胞表面抗-CD3的细胞。
在某些实施方案中，被转染成表达本公开的Key-ChEM或T-ChARM的宿主T细胞是功能性的T细胞，如病毒特异性T细胞、肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞、原初T细胞、记忆干T细胞、中枢或效应记忆T细胞或CD4+CD25+调节T细胞。
可以向培养物中加入一种或多种促进表达本公开的Key-ChEM或T-ChARM的T细胞的增殖的生长因子细胞因子。所述细胞因子可以是人的或非人的。可以用于促进T细胞增殖的示例性生长因子细胞因子包括IL2、IL15等。
用途
可以用表达本公开中所述的Key-ChEM或T-ChARM的细胞治疗的疾病包括癌症、感染性疾病(病毒感染、细菌感染、原生动物感染)、免疫疾病(例如，自身免疫)或老化相关性疾病(例如，衰老)。过继性免疫和基因治疗对于多种类型的癌症(Morgan等人,Science314:126,2006；Schmitt等人,Hum.Gene Ther.20:1240,2009；June,J.Clin.Invest.117:1466,2007)和感染性疾病(Kitchen等人,PLoS One 4:38208,2009；Rossi等人,Nat.Biotechnol.25:1444,2007；Zhang等人,PLoS Pathog.6:e1001018,2010；Luo等人,J.Mol.Med.89:903,2011)而言是有前途的治疗。
多种癌症(包括实体瘤和白血病)适合于本文中公开的组合物和方法。可以治疗的示例性癌症类型包括乳腺、前列腺和结肠的腺癌；肺的支气管原癌的所有形式；髓样白血病；黑素瘤；肝细胞瘤；神经母细胞瘤；乳头瘤；apudoma；迷芽瘤；鳃原瘤；恶性类癌综合症；类癌心脏病；和癌(例如，Walker癌、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、Brown-Pearce癌、导管癌、艾利希氏(Ehrlich)瘤、Krebs 2癌、梅克尔细胞癌、粘液癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头状癌、硬癌、细支气管癌、支气管原癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)。可以治疗的另外的癌症类型包括组织细胞病症；恶性组织细胞增多症；白血病；霍奇金病；免疫增生性小癌；非霍奇金淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮组织增殖病；黑素瘤；软骨母细胞瘤；软骨瘤；软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间叶瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋养层肿瘤。此外，也预见到以下癌症类型适合于治疗：腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；圆柱瘤；囊腺癌；囊腺瘤；粒层细胞瘤；两性胚细胞瘤；肝细胞瘤；汗腺腺瘤；胰岛细胞瘤；莱迪希细胞瘤；乳头状瘤；塞尔托利细胞瘤；卵泡膜细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；成肌细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节瘤；神经胶质瘤；髓母细胞瘤；脑膜瘤；神经鞘瘤；神经母细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；副神经节瘤；非嗜铬副神经节瘤(paraganglioma nonchromaffin)。可以治疗的癌症的类型还包括血管角化瘤；血管淋巴样增生伴嗜酸细胞增多；致硬化的血管瘤；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊性肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；肿瘤；神经纤维瘤病；和宫颈发育不良。
适合于Key-ChEM或T-ChARM疗法的示例性过度增殖病症种类是B细胞癌，包括B细胞淋巴瘤(如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或中枢神经系统淋巴瘤的各种形式)、白血病(如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性髓性白血病的B细胞胚细胞转化)和骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)。另外的B细胞癌包括小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘带淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、粘膜层相关(MALT)淋巴组织的结节外边缘区B细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、不确定的恶性潜势的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病和移植后淋巴组织增生病症。
炎性疾病和自身免疫疾病包括关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、多软骨炎、银屑病关节炎、银屑病、皮炎、多肌炎/皮肌炎、包涵体肌炎、炎性肌炎、中毒性表皮坏死松解症、全身性硬皮病和硬化、肢端硬皮综合征、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肾小球肾炎、变应性病症、湿疹、哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺乏、系统性红斑狼疮(SLE)、亚急性皮肤红斑狼疮、盘状狼疮、狼疮脊髓炎、狼疮大脑炎、青少年型糖尿病、多发性硬化、变应性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、风湿热、西登哈姆舞蹈病、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫反应、结核病、结节病、肉芽肿病(包括韦格纳氏肉芽肿病和Churg-Strauss病)、粒细胞缺乏症、血管炎(包括超敏反应血管炎/脉管炎、ANCA和类风湿性血管炎)、再生病症性贫血、戴-布二氏贫血、免疫溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA))、恶性贫血、单纯性红细胞再生病症(PRCA)、因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞血细胞渗出的疾病、中枢神经系统(CNS)炎性病症、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基膜疾病、抗-磷脂抗体综合征、变应性神经炎、贝切特病、Castleman氏综合征、古德帕斯彻氏综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、Reynaud氏综合征、舍格伦综合征、斯-约二氏综合征、实体器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、大疱性类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多内分泌腺病、血清阴性的脊椎关节病、莱特尔氏病、僵人综合征、巨细胞动脉炎、免疫复合物肾炎、IgA肾病、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、亨诺-许兰氏紫癜、自身免疫性血小板减少症、睾丸和卵巢的自身免疫病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)、原发性甲状腺功能减退；自身免疫性内分泌疾病(包括自身免疫性甲状腺炎)、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退、阿狄森氏病、格雷夫斯氏病、自身免疫性多腺性综合征(或多腺性内分泌病综合征)、I型糖尿病(也被称作胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和席汉氏综合征)；自身免疫性肝炎、淋巴样间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)、非特异性间质性肺炎(NSIP)、Guillain-Barré综合征、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu氏)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、结节性多动脉炎(PAN)强直性脊柱炎、Berger氏病(IgA肾病)、快速进行性肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、乳糜泻(麸质肠病)、冷球蛋白血症、与肝炎有关的冷球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、冠状动脉疾病、家族性地中海热、显微镜下多血管炎、耳蜗前庭综合征、Whiskott-Aldrich综合征和闭塞性血栓性血管炎。
在特定实施方案中，用本文中公开的Key-ChEM或T-ChARM治疗受试者的方法包括急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和慢性髓细胞白血病。
感染性疾病包括与感染物有关的那些，且包括多种细菌(例如，致病性大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、铜绿假单孢菌(P.aeruginosa)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、肉毒梭菌(C.botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、幽门螺杆菌(H.pylori)、霍乱弧菌(V.cholerae)、李斯特氏菌属(Listeria spp.)、立克次氏体属(Rickettsia spp.)、衣原体属(Chlamydia spp.)等)、分枝杆菌和寄生虫(包括原生动物的任何已知的寄生成员)中的任一种。感染性病毒包括真核病毒，如腺病毒、布尼亚病毒、疱疹病毒、乳多泡病毒、乳头状瘤病毒(例如，HPV)、副粘病毒、小RNA病毒、弹状病毒(例如，狂犬病)、正粘病毒(例如，流感)、痘病毒(例如，牛痘)、里奥病毒、逆转录病毒、慢病毒(例如，HIV)、黄病毒(例如，HCV、HBV)等。在某些实施方案中，用本公开的Key-ChEM或T-ChARM治疗具有细胞溶质病原体的感染，所述病原体的抗原被MHC I类分子加工和展示。
可以将本公开的Key-ChEM或T-ChARM以与细胞结合的形式施用给受试者(例如，靶细胞群体(成熟的T细胞(例如，CD8+或CD4+T细胞)或T细胞谱系的其它细胞)的基因治疗)。在一个特定实施方案中，施用给受试者的表达Key-ChEM或T-ChARM的T细胞谱系的细胞是同系的、同种异体的或自体的细胞。在其它实施方案中，可以将Key-ChEM或T-ChARM以可溶形式施用给受试者。可溶性的TCR是本领域已知的(参见，例如，Molloy等人,Curr.Opin.Pharmacol.5:438,2005；美国专利号6,759,243)。
包括本公开的Key-ChEM或T-ChARM的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病或病症的方式(如由医学领域内的技术人员确定的)施用。所述组合物的适当剂量、合适持续时间和施用频率将取决于如以下的因素：患者的状况，疾病的大小、类型和严重程度，活性成分的特定形式，和施用方法。本公开提供了药物组合物，其包含表达如本文中公开的Key-ChEM或T-ChARM的细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。合适的赋形剂包括水、盐水、右旋糖、甘油等和它们的组合。
本公开的一个优点是，使用标签盒的关联结合配偶体可以消除施用给患者的表达Key-ChEM或T-ChARM的细胞。在某些实施方案中，本公开提供了通过使用对标签盒特异性的抗体、使用对标签盒特异性的关联结合配偶体或通过使用表达CAR且对标签盒具有特异性的第二T细胞来消除表达Key-ChEM或T-ChARM的T细胞的方法。在某些实施方案中，标签盒允许表达本公开的Key-ChEM或T-ChARM的T细胞的免疫消除。使用对标签盒特异性的消除试剂，可以完成对经工程改造的T细胞的消除。例如，如果使用Strep标签，那么可以使用各自与细胞毒性试剂(如毒素、放射性金属)融合或缀合的抗-Strep标签抗体、抗-Strep标签scFv或Streptactin，或者可以使用抗-Strep标签/抗-CD3双特异性的scFv或抗-Strep标签CAR T细胞。
在某些其它实施方案中，通过结合对标签盒具有特异性的抗体(例如，抗-标签抗体)，或通过特异性地结合标签盒的其它蛋白(例如，结合Strep标签的Streptactin)(其缀合至小珠、细胞培养板、琼脂糖或任意其它固体表面基质)，可以鉴别、分选、富集或分离表达本公开的Key-ChEM或T-ChARM的细胞。在某些实施方案中，通过使用亲和柱来分选、富集或分离这样的细胞。
在某些实施方案中，本公开提供了一种选择性地活化T细胞的方法，所述方法是通过使表达Key-ChEM或T-ChARM的非天然或重组T细胞与对标签盒特异性的且附于固体表面或作为生物相容性基质(例如，藻酸盐、基膜基质
Figure BDA0001070643250000431
生物聚合物)的部分的结合结构域接触。重组T细胞包含编码本公开的Key-ChEM或T-ChARM融合蛋白的外源核酸分子。例如，可以用小珠活化表达Key-ChEM或T-ChARM的T细胞，所述小珠用对标签盒特异性的关联结合配偶体(例如，抗体)包被或缀合。例如，如果标签盒是Strep标签，那么StrepTactin包被的小珠或抗-Strep标签抗体缀合的小珠可以用于诱导T细胞活化。在某些实施方案中，所述方法包括活化表达本公开的Key-ChEM或T-ChARM的离体重组T细胞，并任选地进一步表达嵌合抗原受体(CAR)。这样的活化的T细胞可用在本文描述的疾病治疗方法中。
在另一个方面，本公开提供了一种用于选择性地促进表达本公开的Key-ChEM或T-ChARM的重组T细胞的增殖的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使用标签结合配偶体(如抗体)选择性地离体增殖表达Key-ChEM或T-ChARM的T细胞。在其它实施方案中，所述方法包括用标签结合配偶体(如抗体)扩增功能性T细胞(例如，病毒特异性的，TAA(肿瘤相关抗原)特异性的CTL，或特定T细胞子集，如原初T细胞、记忆干T细胞、中枢或效应记忆T细胞、CD4+CD25+调节T细胞)，这可以任选地在有共刺激分子结合配偶体(如抗-CD27或抗CD28抗体)存在下进行。在某些实施方案中，抗-标签结合配偶体可以用于活化Key-ChEM(例如，Wnt或NOTCH Key-ChEM)转导的造血干细胞、胚胎干细胞或组织干细胞(例如，神经干细胞)以自我更新、扩增或分化成用于治疗用途的一种或多种期望表型。
在其它实施方案中，当表达本公开的Key-ChEM或T-ChARM时，Key-ChEM或T-ChARM允许选择性地促进体内T细胞增殖。在某些实施方案中，当与表达配体(例如，包括T细胞抑制细胞配体PD-L1、PD-L2)的细胞接触时，表达包含标签盒的CAR的T细胞允许CAR T细胞的体内扩增。这样的扩增的T细胞可用在本文描述的疾病治疗方法中。在某些实施方案中，在体内诱导表达本文中公开的Key-ChEM或T-ChARM的细胞的增殖或扩增，这可以用标签盒结合配偶体(如抗-标签抗体)和任选的共刺激分子结合配偶体(如抗-CD27或抗CD28抗体)诱导。
在某些其它实施方案中，在体内(如在肿瘤部位处)活化表达本文中公开的Key-ChEM或T-ChARM的细胞。例如，包含标签盒结合配偶体(如抗-标签抗体)和共刺激分子结合配偶体(如抗-CD27或抗CD28抗体)的组合物(例如，藻酸盐、基膜基质
Figure BDA0001070643250000441
生物聚合物或其它基质)或载体(例如，微米珠、纳米颗粒或其它固体表面)可以用于在肿瘤(例如，实体瘤)部位处局部地活化表达本文中公开的Key-ChEM或T-ChARM的T细胞。
在某些实施方案中，通过使用特异性地结合标签盒的抗体(例如，抗-标签抗体)，或通过特异性地结合标签盒序列的其它关联结合蛋白(例如，结合Strep标签的Streptactin)，可以在体内检测或跟踪表达Key-ChEM或T-ChARM的重组细胞，所述标签盒的结合配偶体缀合至荧光染料、放射性示踪剂、氧化铁纳米颗粒或本领域已知的用于通过X-射线、CT-扫描、MRI-扫描、PET-扫描、超声、流式细胞计量术、近红外成像系统或其它成像形式进行检测的其它成像剂(参见，例如，Yu等人,Theranostics 2:3,2012)。
在其它实施方案中，表达本公开的Key-ChEM或T-ChARM的细胞可以用在诊断方法或成像方法中，所述方法包括与本文中指出的适应症或病症关联使用的方法。
实施例
实施例1
KEY-嵌合效应分子(KEY-CHEM)和带标签的嵌合抗原受体分子(T-CHARM)及其衍生物
在图1中图示了含有一个或多个亲和标签盒的示例性嵌合融合蛋白。所述标签盒通常是小的(即，最小免疫原性的或非免疫原性的)，且不会与宿主或宿主细胞的任何内源性分子联合或结合。所述标签会特异性地结合异源关联受体(例如，配体、抗体或其它结合配偶体)，所述结合可以在这些嵌合效应分子(ChEM)的背景下用作“Key”以接近和操纵(即，开启或关闭或调节)多种细胞途径中的任一种(在本文中被称作Key-ChEM)。这些带标签的嵌合融合蛋白还可以包含对特定靶标(例如，肿瘤抗原)特异性的结合结构域。例如，带标签的嵌合融合蛋白包括嵌合抗原受体分子(在本文中被称作T-ChARM)。
编码Key-ChEM的示例性核酸分子(图1A)包含下述元件(5'至3')：Strep
Figure BDA0001070643250000451
II(SEQ ID NO.:38，其编码如在SEQ ID NO.:1中所示的肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)；连接部分，其包括接头模块(SEQ ID NO.:42，其编码如在SEQ ID NO.:11中所示的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2)和经修饰的IgG4铰链(SEQ ID NO.:27，其编码如在SEQ ID NO.:15中所示的肽Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro)；CD28跨膜结构域(SEQ ID NO.:27，其编码如在SEQ ID NO.:16中所示的肽)；和细胞内组分，其包含含有4-1BB部分(SEQ ID NO.:29，其编码如在SEQ ID NO.:17中所示的肽)和CD3ζ部分(SEQ IDNO.:30，其编码如在SEQ ID NO.:18中所示的肽；Kowolik等人,Cancer Res.66:10995,2006)的效应结构域。将该编码Key-ChEM(单个标签)的核酸分子克隆进epHIV7慢病毒载体中，如Yam等人(Mol.Ther.5:479,2002)和Wang等人(Blood 118:1255,2011)所述。
通过用EF-1启动子替代pHIV7的巨细胞病毒启动子(Wang等人,2011；Yam等人,2002)，从pHIV7载体衍生出epHIV7慢病毒载体。所述慢病毒载体也编码截短的人EGFR多肽(huEGFRt)，其不具有细胞外N-端配体结合结构域和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但是保持天然氨基酸序列、I型跨膜细胞表面定位和抗-EGFR单克隆抗体西妥昔单抗的构象上完整的结合表位(Wang等人,2011)。所述慢病毒载体协同表达被自我剪切的T2A序列隔开的Key-ChEM和huEGFRt(Szymczak等人,Nat.Biotechnol.22:589,2004)，其中通过与抗生物素免疫磁性微米珠结合地使用生物素化的西妥昔单抗，huEGFRt充当Key-ChEM阳性细胞的替代性选择表位。
编码T-ChARM的一种示例性核酸分子(图1E)包含下述元件：scFv，其含有CD19-特异性的FMC63单克隆抗体的VH和VL基因区段(SEQ ID NO.:36；Wang等人,2011)；Strep
Figure BDA0001070643250000452
II(SEQ ID NO.:38，其编码如在SEQ ID NO.:1中所示的肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)；连接部分，其包括接头模块(SEQ ID NO.:39、40或41，其编码如在SEQ IDNO.:11中所示的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2)和IgG4铰链(SEQ ID NO.:27)、CD28跨膜结构域(SEQ ID NO.:28)；和细胞内组分，其包含含有4-1BB部分(SEQ ID NO.:29)和CD3ζ部分(SEQ ID NO.:30)的效应结构域。包含两个标签的示例性T-ChARM(T-ChARM2)与单个标签T-ChARM(T-ChARM1)的差异在于包括在第一个和第二个Strep标签之间的第二接头模块(其编码如在SEQ ID NO.:12中所示的肽(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser)。包含三个标签的示例性T-ChARM(T-ChARM3)与双标签T-ChARM的差别在于包括在第二个和第三Strep标签之间的第三接头模块(其编码如在SEQ ID NO.:11中所示的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2)。在某些实施方案中，scFv包括ROR1-特异性的R12单克隆抗体的VH和VL区域(Yang等人,PLoS One6:e21018,2011)如在SEQ ID NO.:57中所示)和如在SEQ ID NO.:13中所示的可变结构域接头。另外，备选地用包含效应结构域的细胞内组分构建抗-CD19和抗-ROR1 T-ChARM，所述效应结构域包含CD28部分(SEQ ID NO.:35)替代4-1BB部分。
在某些实施方案中，本文描述的融合蛋白中的任一种从氨基端至羧基端包含：细胞外scFv或scTCR结合结构域，标签盒，包含IgG铰链的连接区域，跨膜结构域，和包含效应结构域的细胞内组分。在某些实施方案中，效应结构域包含4-1BB和CD3ζ、CD27和CD3ζ、CD28和CD3ζ、OX40和CD3ζ、CD28、4-1BB和CD3ζ、OX40、4-1BB和CD3ζ或CD28、OX40和CD3ζ的配对。如本文中定义的，这些分子中的任一种的效应结构域可以是整个细胞内部分，或可以仅包括选定的分子的效应部分。
编码具有N-端标签的T-ChARM(N1ChARM；图1F；SEQ ID NO.:58)的示例性核酸分子包含下述元件：分泌信号序列(SEQ ID NO.:63，其编码如SEQ ID NO.:47所示的肽MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP，其从成熟蛋白切割而来)，天冬酰胺连接氨基酸，Strep
Figure BDA0001070643250000461
II(SEQ ID NO.:38，其编码如SEQ ID NO.:1所示的肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)，接头模块(SEQ ID NO.:42，其编码如SEQ ID NO.:11所示的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2)，CD19-特异性的FMC63单克隆抗体的VH和VL基因区段的scFv(SEQ ID NO.:36；Wang等人,2011)，IgG4铰链(SEQ ID NO.:27)，CD28跨膜结构域(SEQ ID NO.:28)，和包含含有4-1BB部分(SEQ ID NO.:29)和CD3ζ部分(SEQ ID NO.:30)的效应结构域的细胞内组分。
编码具有嵌入可变区接头中的标签的T-ChARM(Ch1ARM；图1G；SEQ ID NO.:59)的示例性核酸分子包含下述元件：分泌信号序列(SEQ ID NO.:63，其编码如SEQ ID NO.:47所示的肽MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP，其从成熟蛋白切割而来)，CD19-特异性的FMC63单克隆抗体的VH基因区段(编码如SEQ ID NO.:51所示的氨基酸序列)，第一接头模块(编码如SEQ IDNO.:65所示的肽Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly)，天冬酰胺连接氨基酸，Strep
Figure BDA0001070643250000471
II(SEQID NO.:38，编码如SEQ ID NO.:1所示的肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)，第二接头模块(编码如SEQ ID NO.:66所示的肽Gly-Ser-Gly-Ser-Gly)，CD19-特异性的FMC63单克隆抗体的VL基因区段(编码如SEQ ID NO.:52所示的氨基酸序列)，IgG4铰链(SEQ ID NO.:27)，CD28跨膜结构域(SEQ ID NO.:28)，和包含含有4-1BB部分(SEQ ID NO.:29)和CD3ζ部分(SEQ ID NO.:30)的效应结构域的细胞内组分。
如Yam等人(Mol.Ther.5:479,2002)所述将编码这些示例性T-ChARM中的每一种(例如，带有单个、两个或三个标签的、带有N-端标签的、嵌入标签、指定的scFv)的核酸分子单独地克隆进epHIV7慢病毒载体中，并如在本文实施例中所述用于转导T细胞。在某些实施方案中，在克隆进epHIV7慢病毒载体中之前，将编码本公开的Key-ChARM的核酸分子密码子优化。在使用Calphos转染试剂(Clontech,Mountain View,CA)用慢病毒载体质粒和包装载体pCHGP-2、pCMV-Rev2和pCMV-G中的每一种共转染的293T细胞中生产编码T-ChARM的慢病毒上清液。转染后16小时改变培养基，并在24、48和72小时后收集慢病毒。
实施例2
重组T细胞的生产和T-CHARM的表达
使用CD8+/CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从正常供体的PBMC分离CD8+和CD4+，根据生产商的说明用抗-CD3/CD28小珠(Life技术)活化，并在活化后第3天通过以2,100rpm在32℃离心45min用补充了0.8μg/mL聚凝胺(Millipore,Bedford,MA)的慢病毒上清液(如在每个实施例中所指出的)(MOI＝3)转导。每48小时将T细胞在补充重组人(rh)IL-2至50U/mL的终浓度的RPMI、10％人血清、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素(CTL培养基)中扩增。扩增后，将各转导的T细胞系的等分试样用生物素缀合的抗-EGFR抗体和strepTavidin-PE(Miltenyi,Auburn,CA)染色。通过在FACS-Aria细胞分选仪(BectonDickinson)上分选，分离tEGFR+T细胞。然后将tEGFR+T细胞子集以1:7的T细胞:LCL比用辐照过的(8,000rad)CD19+B-LCL刺激，并在CTL培养基中扩增8天，每48小时添加50U/mL rhIL-2，或使用用于R12T-ChARM的快速扩增方案(Riddell和Greenberg,J.Immunol.Methods128:189,1990)。
将以下缀合抗体用于流式细胞计数表型确定和分析：CD4、CD8、CD25、CD137、CD45、膜联蛋白V、CD62L、CD27、CD28(BD Biosciences)、抗-Strep标签II抗体(Genscript)、EGFR抗体(ImClone Systems Incorporated,Branchburg,NJ)；strepTavidin-PE(BDBiosciences,San Jose,CA)。按照生产商的指导进行碘化丙啶(PI,BD Biosciences)染色用于活/死细胞区分。在FACS Canto II上进行流式分析，在FACS AriaII(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)上进行分选-纯化，并使用FlowJo软件(Treestar,Ashland,OR)分析数据。
为了检查T-ChARM的细胞表面表达，针对EGFRt表达来分选转导的T细胞，并通过利用荧光染料标记的抗-Strep标签mAb染色来进行评价。EGFR染色的平均荧光强度(MFI)在用T-ChARM和CD19-Short CAR中的每一种转导的T细胞上是类似的，这指示，将标签引入CAR中以产生ChARM不会干扰转基因表达(图21)。抗-Strep标签mAb特异性地染色用各种T-ChARM转导的T细胞，这与每种ChARM中标签序列的位置或数目无关。与T-ChARM1相比，用T-ChARM2和T-ChARM3转导的T细胞的抗-Strep标签染色的MFI更高，推测是由于在每种T-ChARM2和T-ChARM3上用于结合抗体-荧光染料缀合物的位点更多(图21)。
实施例3
表达T-CHARM的T细胞的细胞裂解活性
在铬释放测定中，将经工程改造成表达抗-CD19(scFv)T-ChARM1、T-ChARM2或T-ChARM3的CD8+大量T细胞的体外效应功能与经工程改造成表达含有不同长度的连接区域(分别是仅IgG4铰链(短)、IgG4CH3和铰链(中)和IgG4CH2CH3和铰链(长))的抗-CD19CAR的T细胞的效应功能进行比较。简而言之，将靶细胞用51Cr(PerkinElmer,Norwalk,CT)标记过夜，洗涤，并一式三份地以不同的效应物:靶标(E:T)比以1-2x103个细胞/孔与效应T细胞一起温育。温育4小时以后，收获上清液用于γ-计数，并使用标准公式计算特异性裂解。使用的靶细胞是Raji/ROR1(天然地CD19+，转导成表达无关抗原ROR1)和K562/CD19(转导成表达CD19)，将K562/ROR1(天然地CD19-，转导成表达无关抗原ROR1)用作阴性对照，并将LCL-OKT3细胞(转导成表达细胞表面抗-CD3)用作阳性对照。经工程改造成表达膜结合的抗-CD3scFv(LCL-OKT3)的成淋巴细胞样细胞系(LCL)细胞用作T细胞系的最大活化潜力的参比标准，因为这些表达OKT3的细胞通过结合CD3复合物而活化T细胞。
表达不同的抗-CD19T-ChARM和CAR构建体中的每一种的T细胞对于K562/ROR1细胞而言不是细胞毒性的(图2C)，但是在有表达抗-CD3的LCL/OKT3细胞存在下被活化而具有细胞裂解性(图2D)。此外，表达T-ChARM或CAR的T细胞赋予对CD19+细胞、Raji细胞(图2B)和K562/CD19(图2A)的特异性细胞裂解活性。当标签位于T-ChARM的氨基端处(N1ChARM)或嵌入scFv中(VH-标签-VL；Ch1ARM)时，得到类似的结果(参见图22)。另外，裂解的效率不受效应结构域(CD28替代4-1BB；参见图23A)、结合结构域(抗-ROR1替代抗-CD19；参见图23B)或使用的标签(图32显示了带Myc标签的ChARM的细胞裂解效应)影响。表达T-ChARM的细胞像含有短、中和长IgG4Fc间隔区的CAR一样有效地杀死肿瘤细胞。
实施例4
与K562细胞一起共培养的表达T-CHARM的T细胞的细胞因子释放
为了分析细胞因子分泌，将效应(E)细胞(表达抗-CD19T-ChARM和CAR的T细胞)和靶(T)细胞(K562/CD19和K562/ROR1，阴性对照)以4:1的E:T比一式三份地共培养，温育24小时，然后使用多路细胞因子免疫测定
Figure BDA0001070643250000501
测量上清液的GM-CSF、IFN-γ、IL-2和TNF-α水平。
结果(图3D)表明，与表达具有中等或长的连接区域的抗-CD19CAR的T细胞相比，表达具有短连接区域的抗-CD19CAR的细胞在接合靶细胞后产生更大量的细胞因子。用表达抗-CD19T-ChARM的细胞观察到类似的模式，其中(图3A)分别与具有两个标签和三个标签的T-ChARM2或T-ChARM3细胞相比，具有较短接头和单个标签的T-ChARM1细胞在接合靶细胞后产生更大量的细胞因子。对于抗-CD19T-ChARM和抗-CD19CAR细胞而言，产生的细胞因子的水平是类似的，尽管表达T-ChARM的细胞与表达CAR的细胞相比诱导显著更高水平的IFN-γ产生。图3B和3E表明，在不表达CD19的K562细胞中没有诱导细胞因子生产。图3C和3F显示来自用PMA/离子霉素刺激的阳性对照的结果。当检查N1ChARM和Ch1ARM构建体时，观察到类似的结果(参见图24)。另外，用抗-CD19ChARM转导的T细胞的细胞因子生产和增殖的分级与ChARM中使用的共刺激性结构域(4-1BB或CD28)无关(图25)。
实施例5
与RAJI B细胞淋巴瘤细胞一起共培养的表达T-CHARM分子的T细胞的细胞因子释放
将表达各种抗-CD19T-ChARM或CAR的T细胞与CD19+Raji细胞一起共培养24小时，并在多路细胞因子测定
Figure BDA0001070643250000502
中检查上清液。为了分析细胞因子分泌，将效应(E)细胞(表达抗-CD19T-ChARM和CAR的T细胞)和靶(T)细胞(Raji)以2:1的E:T比一式三份地共培养，温育24小时，然后使用多路细胞因子免疫测定
Figure BDA0001070643250000503
测量上清液的GM-CSF、IFN-γ、IL-2和TNF-α水平。
结果指示，与表达常规抗-CD19CAR中的任一种的T细胞(图4B)相比，表达具有一个、两个或三个标签盒的抗-CD19T-ChARM的T细胞当与Raji细胞一起共培养时能够生产高得多的水平的IFN-γ和GM-CSF(图4A)。
实施例6
表达T-CHARM分子的T细胞的增殖
为了分析细胞增殖，将表达抗-CD19T-ChARM或CAR的T细胞用0.2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE,Invitrogen)标记，所述羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯结合细胞内蛋白并使得细胞可通过流式细胞计量术在FITC通道中可见。标记以后，将细胞洗涤并在不含外源细胞因子的CTL培养基中以4:1的比率与刺激细胞(K562/CD19或K562/ROR1，阴性对照)一起一式三份地铺板。温育72小时以后，将细胞用PI标记以从分析中排除死细胞。通过流式细胞计量术分析样品，并通过CFSE稀释程度(即，染料稀释度是增殖的指示物，因为标记的强度随着每次细胞分裂而稀释一半)评估活的CD3+T细胞的细胞分裂。
对于分析，将一式三份的孔合并，并测量活的CD8+T细胞的增殖。最左列是细胞总数的正向散布图/侧向散布图，中间列是对CD8+T细胞进行门控的图，且最右列是显示CD8+T细胞子集中的CFSE稀释度的直方图(向左稀释度增加)。最右列中的红色峰指示无细胞分裂，且蓝色峰代表指示≥3、2或1次细胞分裂，且在每个直方图中的三个数字分别指示具有稀释的CFSE且经历超过3、2或1次细胞分裂的细胞的百分比。直方图表明，表达T-ChARM和CAR的T细胞在用K562/CD19细胞(蓝)共培养刺激后72小时期间剧烈地增殖，但是在阴性对照细胞K562/ROR1(红)的情况下却没有(图5)。与表达T-ChARM3或CAR(长)的T细胞相比，在表达T-ChARM1和T-ChARM2的T细胞中细胞分裂的平均数目更高。类似地，增殖水平独立于在ChARM中使用的共刺激性结构域(4-1BB或CD28)(图26)且独立于使用的标签(图31显示了当使用Myc标签时相等的增殖)。
实施例7
表达T-CHARM分子的T细胞的体内过继转移
6-8周龄雌性NOD.CB17-Prkdcscid/J(NOD/SCID)或NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠得自Jackson Laboratory或在内部繁育。经由尾静脉给小鼠静脉内(i.v.)注射0.5x106个用荧火虫萤光素酶(Raji-ffluc)转染的Raji淋巴瘤肿瘤细胞，并允许肿瘤植入发生6天。在第7天，小鼠接受5x106个用抗-CD19(scFv)T-ChARM1、T-ChARM2、T-ChARM3、CAR(短)、CAR(中)和CAR(长)人T细胞之一转导的T细胞的单次静脉内(i.v.)注射。为了验证肿瘤植入，在Raji-ffluc接种后第6天进行生物发光成像(图6A)。为了监测过继性T细胞疗法的抗肿瘤活性，在T细胞施用后第7天(图6B)、第11天(图6C)、第18天(图6D)和第26天(图6E)进行生物发光成像。
对于肿瘤细胞的生物发光成像，小鼠接受重悬于PBS中的萤光素底物(CaliperLife Sciences,Hopkinton,MA)的腹膜内(i.p.)注射(15μg/g体重)。将小鼠在诱导室中用异氟烷麻醉，并在注射萤光素后10、12和14分钟使用Xenogen IVIS In VivoImaging System(CaliperLife Sciences)以小像素合并(binning)模式以1秒至1分钟的采集时间成像以得到不饱和图像。使用LivingImageSoftware(CaliperLife Sciences)分析萤光素酶活性，并分析目标区域内的光子通量，所述目标区域包括各单个小鼠的整个身体。
生物发光图像表明，表达抗-CD19T-ChARM1、T-ChARM2或T-ChARM3的T细胞像表达抗-CD19CAR(短)或CAR(中等)的T细胞一样有效地根除肿瘤，而表达CAR(长)的T细胞对于该特定构建体和/或靶标而言不是非常有效的(图6)。
实施例8
表达T-CHARM分子的T细胞的体内持续性
用5x106个表达抗-CD19CAR/huEGFRt或T-ChARM/huEGFRt的人T细胞治疗带有Raji肿瘤的NSG小鼠组群，并在3周后使用抗-huEGFR、抗-人CD8和抗-人CD45单克隆抗体通过流式细胞计量术分析外周血(眼出血)。在图7中将CD8+huEGFRt+(Wang等人,2011)T细胞的频率显示为活的外周血细胞的百分比。可检测的huEGFRt的水平与表达T-ChARM的T细胞的水平相关。
尽管表达抗-CD19CAR(长)的T细胞在3周后不是一致地显著的，在过继转移和肿瘤根除后至少3周在NSG小鼠的外周血中可容易地检测到所有其它表达抗-CD19CAR和T-ChARM的T细胞。这些结果指示，表达抗-CD19CAR和T-ChARM的T细胞可以在体内坚持达延长的时间并介导抗肿瘤活性。
实施例9
表达T-CHARM分子的T细胞的鉴别
将表达抗-CD19T-ChARM/huEFRt的T细胞用EGFR Ab-生物素/StrepTavidin-PE、抗-Strep标签II-FITC、
Figure BDA0001070643250000531
-APC(别藻蓝蛋白)染色，然后通过流式细胞计量术分析。将抗-CD19CAR(短)转导的T细胞用作对照。所有转导的T-ChARM和抗-CD19CAR(短)T细胞被抗-EGFRmAb阳性染色，指示它们被转导和表达huEGFRT(图8A)。
结果表明，用将T-ChARM细胞中表达的标签序列染色的试剂，可以将T-ChARM2和T-ChARM3转导的T细胞容易地与非转导的细胞区分开(图8B,C)。T-ChARM1、T-ChARM2和T-ChARM3转导的T细胞被抗-Strep标签II-FITC抗体阳性染色，但是抗-CD19CAR(短)不会(图8B)。具有更多标签序列拷贝的那些具有增加的染色信号。T-ChARM细胞也被StreptactinAPC染色(图8C)，证实在Strep标签的情况下，超过一种染色试剂可以用于检测T细胞。
实施例10
分选表达T-CHARM分子的T细胞
将T-ChARM2转导的T细胞用抗-Strep标签-FITC标记的抗体染色，然后使用台式FACS细胞分选仪(BD FACSAria II细胞分选仪,BD Biosciences,San Jose,CA)分选。图9显示了在分选之前(顶行)和分选之后(底行)的细胞群体。最右侧的图(分选之后)表明，表达T-ChARM2的T细胞从15.8％的细胞群体富集至大于99％T-ChARM2T细胞的细胞群体。
实施例11
使用免疫磁性选择富集表达T-CHARM分子的T细胞
将细胞与Streptactin-微米珠或纳米珠(IBA,Goettingen,德国)一起温育，然后加载到磁性分离器中的MACS柱(Miltenyi Biotec)上。将柱用3ml MACS缓冲液洗涤3次。然后将柱从分离器取出，并通过将柱塞紧密地推入柱中来清洗具有附带的表达Strep标签的T细胞的
Figure BDA0001070643250000532
磁珠。将与对照T细胞混合的T-ChARM3转导的T细胞用以下类型的小珠之一标记：Strep-Tactin Microbeads 1#(通常用于蛋白纯化，约0.5-1.5μm的大小)；Strep-Tactin Microbeads 2#(通常与Fab
Figure BDA0001070643250000541
[带Strep标签的Fab片段]一起用于细胞分离，约0.5μm的大小)；Strep-Tactin Nanobeads 3#(通常与MHCI Streptamers[带Strep标签的MHCI单体]一起用于细胞分离，约100nm的大小)；加载到
Figure BDA0001070643250000542
柱(Miltenyi)上并插入磁性分离器中。将直接流出物和保持的级分单独地用抗-Strep标签-FITC标记的抗体染色并通过流式细胞计量术分析。
图10的第一行显示在应用于Strep-Tactin小珠柱之前的细胞群体，而图10的第二行、第三行和第四行分别显示了穿过小珠柱1#、2#和3#以后来自每个样品的细胞群体。第二行显示存在一些细胞损失，其可能是由于Strep-Tactin Microbeads 1#的大小不允许一些细胞穿过所述柱。总之，数据表明，试验的任何类型的Strep-Tactin小珠都可用于直接富集表达T-ChARM的T细胞。
实施例12
用标签结合试剂活化表达细胞表面T-CHARM的T细胞
T细胞活化和增殖需要通过T细胞抗原特异性的受体(TCR)与共刺激信号的接合介导的两种信号，最典型地是CD80和CD86结合CD28(Ledbetter等人,Blood 75:1531,1990)。因此，已经开发了抗-CD3/CD28mAb包被的微米珠以提供两种必要的信号，以及非特异性地活化和扩增用于临床应用的T细胞(Riddell和Greenberg,1990)。T细胞的抗CD3/CD28刺激也会促进利用编码CAR的逆转录病毒或慢病毒载体的转导，但是不会选择性地扩增转导的T细胞。
在不处理(阴性对照)或在以下处理之一的情况下将用抗-CD19T-ChARM3转导的T细胞在CTL培养基中培养48h：(a)
Figure BDA0001070643250000543
Microbeads 1#；(b)Strep-TactinMicrobeads 2#；(c)Strep-Tactin Nanobeads 3#；(d)与G蛋白小珠(约2μm的大小)缀合的抗-Strep标签抗体；(e)抗-Strep标签抗体/抗-CD28抗体双缀合的G蛋白小珠，或(f)与辐照过的TM-LCL细胞以及50U/ml IL2(阳性对照)共培养。为了确定细胞在培养24h和48h以后是否被活化，使用免疫荧光染色和流式细胞计量术检查细胞中CD25/CD69的存在。在通过T细胞表面受体或通过表达CD3ζ的CAR的信号转导的活化后，T细胞重新表达活化分子，包括CD69和CD 25。CD69是最早的细胞表面活化标志物之一，且可能涉及进行中的活化过程。当最初遇到抗原时，CD25合成(IL2受体α链)与IL2自身一起被T细胞活化诱导。
数据意外地表明，通过Strep-Tactin或抗-Strep标签抗体包被的小珠表达T-ChARM的T细胞的Strep标签结合显著活化这些T细胞，并且进一步表明，小珠大小也可能对T细胞活化水平具有影响(图13)。
在使用另外构建体的其它实验中，Strep-Tactin微米珠诱导表达ChARM2和ChARM3的CD8+(图27A)和CD4+(图27B)T细胞上的CD25增量调节，但是在表达缺少标签的ChARM1或CAR的T细胞上则不会，表明ChARM1结合Strep-Tactin微米珠的亲和力在基于ChARM的T细胞活化中是非最佳的。但是，抗-Strep标签抗体包被的微米珠(其对Strep标签的结合亲和力(KD＝～10nm)比Strep-Tactin(KD＝～1uM)高100倍)活化各种ChARM T细胞，不管ChARM中的标签的拷贝数或位置如何(图27A和B)。值得注意的是，Strep标签结合介导的活化可以存在于4-1BB和CD28ChARM T细胞(图27C)和非CD19靶向ChARM T细胞(图27D,ROR1靶向R12ChARM1)中。
实施例13
利用标签结合试剂的表达细胞表面T-CHARM的T细胞的增殖
将抗-CD19T-ChARM1、T-ChARM2、T-ChARM3和CAR(长)(阴性对照)转导的T细胞单独地在具有
Figure BDA0001070643250000551
微米珠和50U/ml IL2的CTL培养基中培养。第5天的显微成像揭示，表达T-ChARM2和T-ChARM3的T细胞令人惊讶地形成围绕小珠的大的簇集，从而指示Strep-Tactin小珠上的细胞增殖，这在表达抗-CD19CAR(长)的T细胞的情况下不明显(图11)。表达T-ChARM1的T细胞表现出更少的扩增的细胞簇，但是存在明显的细胞扩增，因为与阴性对照相比在平板上存在更多可见的细胞。在其它实验中，各种不同的表达ChARM的T细胞(包括N1ChARM和Ch1ARM)在用StrepTactin微米珠或抗-Strep标签抗体微米珠刺激后仅48小时内就出现增殖簇(图28)。常规的短的间隔区CAR T细胞(CD19-Hi)用作阴性对照。
确定在
Figure BDA0001070643250000561
微米珠上培养的表达T-ChARM的T细胞的生长曲线(参见图12和29)。在有50U/ml IL2和5ng/ml IL15存在下将共约1x106个抗-CD19T-ChARM1、T-ChARM2和T-ChARM3转导的T细胞单独地在含有Strep-Tactin微米珠、抗-Strep标签mAb或抗-Strep标签/抗-CD28mAb包被的微米珠的CTL培养基中铺板(图28)并培养10天。在第3、6和9天将每个孔的细胞数目计数。数据表明，当用Strep-Tactin小珠刺激时，T-ChARM3转导的T细胞在9天内具有最高生长速率。在Strep-Tactin小珠刺激的情况下，CD8+或CD4+抗-CD19ChARM-T细胞扩增了约20至约100倍，并在ChARM3T细胞中观察到最大扩增(图29A和B)。抗-Strep标签和抗-Strep标签/抗-CD28mAb包被的小珠在ChARM T细胞总数方面诱导了甚至更大的扩增(100-250倍)，且不同于StrepTactin小珠刺激，表达ChARM1的CD8+和CD4+T细胞与表达ChARM2或ChARM3的T细胞相比表现出更大扩增的趋势。表达CD28ChARM或抗-ROR1ChARM的T细胞也被用抗-Strep标签/抗-CD28小珠有效地扩增，从而证实了该方案用于扩增具有不同共刺激结构域的ChARM T细胞的适用性和对不同肿瘤靶标的特异性(数据未显示)。
在另一个生长曲线测定中，将共约5x105个抗-CD19T-ChARM3转导的T细胞在含有50U/ml IL2、下述小珠之一的CTL培养基中铺板：(a)Strep-Tactin Microbeads 1#，(b)Strep-Tactin Microbeads 2#，(c)Strep-Tactin Nanobeads 3#，(d)与G蛋白小珠缀合的抗-Strep标签抗体，(e)抗-Strep标签抗体/抗-CD28抗体双缀合的G蛋白小珠，或(f)抗-CD3/抗-CD28双抗体小珠(阳性对照)；并培养7天。在第3天、第5天和第7天计数每个孔的细胞数目。数据表明，抗-Strep标签抗体/抗-CD28抗体双缀合的G蛋白小珠到第5天促进最大的表达T-ChARM3的T细胞增殖，其显著优于抗-CD3/抗-CD28阳性对照(图16)。除了Strep-Tactin Microbeads 2#以外的Strep标签接合试剂促进表达T-ChARM的T细胞的增殖至与抗-CD3/抗-CD28阳性对照大约相同的水平。
为了进一步验证表达T-ChARM的T细胞的增殖，将Ki-67蛋白的水平作为增殖的替代量度来测量。Ki-67是与细胞增殖有关且细胞增殖可能需要的核蛋白。将用抗-CD19T-ChARM3转导的T细胞在CTL培养基中在存在下述处理之一的情况下培养5天：(a)
Figure BDA0001070643250000571
Microbeads 1#；(b)Strep-Tactin Microbeads 2#；(c)Strep-TactinNanobeads 3#；(d)与G蛋白小珠缀合的抗-Strep标签抗体；(e)抗-Strep标签抗体/抗-CD28抗体双缀合的G蛋白小珠，或(f)抗-CD3/抗-CD28双抗体小珠(阳性对照)。培养5天以后，将细胞固定，渗透化处理，用抗-Ki-67-FITC缀合的抗体染色，并通过流式细胞计量术分析。
这些数据表明，Strep-Tactin小珠或抗-Strep标签小珠可以促进选择性细胞增殖，并且通过Ki-67染色测量的增殖优于用抗-CD3/抗-CD28阳性对照观察到的增殖(图14)。
在用抗-CD19T-ChARM1、T-ChARM2或T-ChARM3转导的T细胞上进行Ki-67蛋白的另一水平，并在CTL培养基中在存在以下的情况下培养7天：(a)无处理；(b)
Figure BDA0001070643250000573
Microbeads 1#，剂量为15μg、50μg或150μg/1x106个细胞；或(c)与辐照过的TM-LCL细胞以及50U/ml IL2一起共培养(阳性对照)。培养7天以后，将细胞固定，渗透化处理，用抗-Ki-67-FITC缀合的抗体染色，并通过流式细胞计量术分析。这些结果也表明，Strep-Tactin小珠可以促进表达T-ChARM的T细胞中的增殖，无论使用的小珠的量如何，特别是对于T-ChARM2和T-ChARM3细胞(图15)。此外，每种表达T-ChARM的T细胞在有Strep-Tactin小珠存在下与TM-LCL阳性对照刺激一样好地或比其更好地扩增。
实施例14
表达T-CHARM分子的T细胞的选择性扩增
将共约5x105个人CD8+T细胞用抗-CD3/抗-CD28小珠刺激。在第2天，将处理过的细胞用含有编码抗-CD19T-ChARM1/huEGFRt的核酸分子的慢病毒转导。在第5天，除去抗-CD3/抗-CD28小珠。在此时，将处理过的细胞分成两组，一组没有任何进一步处理，另一组用
Figure BDA0001070643250000572
微米珠(约0.5μm至约1.5μm)处理。在第10天，将来自每组的细胞收获，用免疫荧光的抗-Strep标签抗体染色，并通过流式细胞计量术分析。生长曲线表明，在除去抗-CD3/抗-CD28小珠以后，Strep-Tactin微米珠的添加继续促进显著的T细胞增殖(图17A)。流式细胞计量术分析表明，增殖中的细胞实际上是表达T-ChARM的T细胞，因为与对照组(顶图)相比在Strep-Tactin微米珠处理过的组(底图)中存在显著更高百分比的表达T-ChARM的T细胞(如通过huEGFRt染色测量的)(图17B)。然后将来自每组的细胞使用huEGFRt标志物进一步分选，然后通过用CD19+TM-LCL刺激来扩增5.0x105个细胞。与对照组中的仅4.0x106个细胞相比，之前用StrepTactin微米珠处理过的细胞在7天中经历显著的且快速的增殖达到约8.0x107个细胞的水平。这证实，在通过T-ChARM的标签序列的Strep-Tactin微米珠刺激后，随后的通过T-ChARM的抗-CD19scFv组分的再刺激是非常有效的。
为了确定抗-CD3/抗-CD28小珠刺激到底是否是扩增表达T-ChARM的T细胞所需要的，我们检查了T细胞是否可以用单独的细胞因子刺激转导成表达T-ChARM，然后通过仅用抗-Strep标签小珠处理而选择性地扩增。将共约5x105个人CD8+T细胞与5ng/mL IL-7和10ng/mL IL-15一起培养24h，然后用相同滴度的编码两类抗-CD19T-ChARM3(41BB或CD28效应结构域)的病毒转导。将转导的细胞在第2天用与G蛋白小珠缀合的抗-Strep标签抗体处理，然后在第7天收获，用免疫荧光的抗-Strep标签II抗体染色，并通过流式细胞计量术分析。
数据表明，在不存在抗-CD3/抗-CD28小珠刺激的情况下，与G蛋白小珠缀合的抗-Strep标签抗体促进表达T-ChARM的T细胞的增殖至大于培养的细胞的60％(图18B和18D)。当转导的细胞没有暴露于抗-Strep标签抗体小珠时，则不到1％的转导的细胞增殖(图18A和18C)。
测试了在单独的抗-Strep标签或抗-Strep标签/抗-CD28mAb包被的微米珠上扩增后ChARM T细胞的功能性，以确保通过ChARM的刺激不会对体外或体内肿瘤识别具有有害作用。与设计中的共刺激性结构域无关，与扩增之前或抗原驱动的扩增(TM-LCL)之后的细胞相比，在抗-Strep标签微米珠上扩增的ChARM T细胞表现出有效的细胞裂解活性、有效地释放细胞因子、并在抗原刺激中保持广泛增殖能力(图30A-30C)。选择性扩增以后，ChARM T细胞具有高生存力(>90％)，大部分保持的共刺激受体(CD27/CD28)和中枢记忆T细胞标志物CD45RO和CD62L的表达(图30D)能够消除NSG小鼠中的Raji肿瘤(图30E)，且能够与通过CD19+B细胞刺激扩增的CAR T细胞一样好地持续(图30F)。
实施例15
标签结合试剂的接合对表达T-CHARM的T细胞的细胞因子释放的影响
将表达抗-CD19CAR(短)(通过TM-LCL刺激扩增)或T-ChARM1的T细胞(通过TM-LCL或StrepTactin微米珠刺激扩增)与Raji细胞(图19C)或表达CD19(图19A)或ROR1(阴性对照)(图19B)的K562细胞一起共培养24小时。PMA/离子霉素用作阳性对照(图19D)。将上清液收获，并使用多路细胞因子测定
Figure BDA0001070643250000591
分析。在Strep-Tactin微米珠上培养的表达抗-CD19T-ChARM1的T细胞的细胞因子释放水平高于(除了IFN-γ以外)关于用TM-LCL细胞刺激的表达T-ChARM1的T细胞所观察到的水平(图19A、C和D)。无论条件如何，K562/ROR1细胞共培养组(阴性对照)没有产生任何可检测的细胞因子(图19B)。令人感兴趣的是，与TM-LCL刺激的组相比，在Strep-Tactin小珠诱导的培养物中存在显著更高的IL2生产水平(超过10倍增加)。
实施例16
用与抗-CD27或抗-CD28抗体组合的抗-STREP标签抗体增强增殖
在第0天将经纯化的表达抗-CD19T-ChARM3的T细胞(5x105)放在CTL培养基+50U/mlIL2中，然后将2μg G蛋白磁珠(NEB)、抗-Strep标签II(0.5μg)/抗-CD27抗体(0.5μg)缀合的G蛋白小珠或抗-Strep标签II(0.5μg)/抗-CD28抗体(0.5μg)缀合的G蛋白小珠添加到细胞培养物。将仅培养基中的细胞用作阴性对照。在第5天，在显微镜下检查细胞。
图20表明，抗-Strep标签II抗体缀合的G蛋白小珠促进表达T-ChARM的T细胞的扩增，并且将抗-Strep标签II与抗-CD28或抗-CD27抗体组合会甚至更有效地促进表达T-ChARM的T细胞扩增。
可以组合上述不同实施方案以提供其它实施方案。在本说明书中提及的和/或在申请数据单中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开以它们的整体通过引用并入本文。如果必要的话，可以修改实施方案的方面以采用不同的专利、申请和公开的概念来提供其它实施方案。
考虑到上面的详细描述，可以对实施方案做出这些和其它变化。一般而言，在下述权利要求中，使用的术语不应当解释成将权利要求限制为在说明书和权利要求书中公开的特定实施方案，而是应当解释为包括所有可能的实施方案以及这样的权利要求所具有的等同方案的整个范围。因此，本公开没有限制权利要求。
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Figure IDA0001070643320000021
Figure IDA0001070643320000031
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Figure IDA0001070643320000281

Claims (163)

1.单链融合蛋白，其包含通过疏水部分连接的细胞外组分和细胞内组分，
其中所述细胞外组分包含(a)特异性地结合靶标的结合结构域，(b)多个标签盒，其中所述多个标签盒的每个标签盒包含Strep标签，其中所述Strep标签具有链霉抗生物素、streptactin或二者作为关联结合配偶体，和(c)包含铰链的连接区域，
其中所述多个标签盒位于所述结合结构域和所述铰链之间，且
其中所述细胞内组分包含效应结构域。
2.根据权利要求1所述的单链融合蛋白，其中所述结合结构域是scFv、scTCR、受体胞外结构域或配体。
3.根据权利要求1或2所述的单链融合蛋白，其中所述靶标包含CD3、CEACAM6、c-Met、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis A、Lewis Y、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、间皮素、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、HLA、与HLA结合的肿瘤或病原体相关的肽、与HLA结合的hTERT肽、与HLA结合的酪氨酸酶肽、与HLA结合的WT-1肽、LTβR、LIFRβ、LRP5、MUC1、OSMRβ、TCRα、TCRβ、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robo1、甲胎蛋白(AFP)、Frizzled、OX40或CD79b。
4.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述连接区域还包含接头模块。
5.根据权利要求4所述的单链融合蛋白，其中所述接头模块是(GlyxSery)n，其中n是1-10的整数，且x和y独立地是0-10的整数，前提条件是，x和y不都是0。
6.根据权利要求4所述的单链融合蛋白，其中所述接头模块是CH2CH3或CH3。
7.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中
所述多个标签盒包含二个至五个标签盒。
8.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述连接区域包含二个至五个标签盒。
9.根据权利要求7所述的单链融合蛋白，其中所述连接区域包含二个至五个标签盒，其中每个标签盒连接至一个或两个包含(GlyxSery)n的接头模块，其中n是1-10的整数，且x和y独立地是0-10的整数，前提条件是，x和y不都是0。
10.根据权利要求9所述的单链融合蛋白，其中所述接头模块具有Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO.:10)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:11)、(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO.:12)的氨基酸序列、或它们的任意组合。
11.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其还包含位于所述结合结构域中的一个或多个标签盒。
12.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其还包含位于所述结合结构域的氨基端的一个或多个标签盒。
13.根据权利要求11所述的单链融合蛋白，其中所述结合结构域是包含可变区接头的scFv或scTCR，其中所述可变区接头包含一个或多个标签盒。
14.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述单链融合蛋白还包含His标签、Flag标签、Xpress标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、X标签、SBP标签、Softag、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标签或它们的任意组合。
15.根据权利要求1-2任一项所述的单链融合蛋白，其中所述Strep标签具有氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:1)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO.:2)。
16.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述连接区域还包含与一个或多个标签盒邻近的接头模块，其中所述接头模块和邻近的标签盒共同地具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:20)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:21)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:22)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:23)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:24)或Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:25)的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述疏水部分是跨膜结构域。
18.根据权利要求17所述的单链融合蛋白，其中所述跨膜结构域是CD4、CD8、CD28或CD27跨膜结构域。
19.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述效应结构域或其效应部分是4-1BB(CD137)、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、OX40(CD134)、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或它们的任意组合。
20.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述效应结构域或其效应部分包含CD3ζ以及4-1BB(CD137)、CD27、CD28和OX40(CD134)中的一种或多种。
21.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：细胞外结合结构域、第一标签盒、第一连接区域、第二标签盒、包含铰链的第二连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分。
22.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：细胞外结合结构域、第一标签盒、第一连接区域、第二标签盒、第二连接区域、第三标签盒、包含铰链的第三连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分。
23.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：细胞外结合结构域、2-5个标签盒、包含铰链的连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分。
24.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：细胞外scFv或scTCR结合结构域、多个标签盒、包含IgG铰链的连接区域、跨膜结构域和包含效应结构域的细胞内组分，其中所述效应结构域包含4-1BB和CD3ζ、CD27和CD3ζ、CD28和CD3ζ、OX40和CD3ζ、CD28、4-1BB和CD3ζ、OX40、4-1BB和CD3ζ或CD28、OX40和CD3ζ。
25.根据权利要求1-2中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：包含受体胞外结构域的细胞外结合结构域、多个标签盒、包含铰链的连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分，其中所述效应结构域包含4-1BB、CD27、CD28或OX40。
26.嵌合抗原受体分子，其包含融合蛋白，所述融合蛋白具有一个或多个细胞外标签盒，所述细胞外标签盒设置在(a)特异性地结合抗原的细胞外结合结构域和(b)包含效应结构域的细胞内组分之间，并连接(a)特异性地结合抗原的细胞外结合结构域和(b)包含效应结构域的细胞内组分，
其中所述一个或多个标签盒包含2至5个标签盒，其中所述2至5个标签盒中的每一个均包含Strep标签，其中每个所述Strep标签具有链霉抗生物素、streptactin或二者作为关联结合配偶体。
27.根据权利要求26所述的嵌合抗原受体分子，其中所述嵌合抗原受体分子还包含一个或多个包含(GlyxSery)n的接头模块，其中n是1-10的整数，且x和y独立地是0-10的整数，前提条件是，x和y不都是0。
28.根据权利要求26所述的嵌合抗原受体分子，其中所述融合蛋白还包含设置在所述结合结构域和所述一个或多个标签盒之间的(GlyxSer)n接头模块，其中x是2-4的整数且n是1-3的整数。
29.根据权利要求26所述的嵌合抗原受体分子，其中所述融合蛋白还包含设置在所述一个或多个标签盒和所述包含效应结构域的细胞内组分之间的细胞外(GlyxSer)n接头模块，其中x是2-4的整数且n是1-3的整数。
30.根据权利要求26所述的嵌合抗原受体分子，其中所述融合蛋白还包含两个细胞外(GlyxSer)n接头模块，其中x是2-4的整数且n是1-3的整数，且其中第一接头模块是在所述一个或多个标签盒中的至少一个的氨基端，且第二接头模块是在所述一个或多个标签盒中的至少一个的羧基端。
31.根据权利要求26所述的嵌合抗原受体分子，其中所述一个或多个标签盒包括两个标签盒，且所述分子还包含两个细胞外(GlyxSer)n接头模块，其中x是2-4的整数且n是1-3的整数，且其中第一标签盒设置在所述结合结构域和第一接头模块之间，第二标签盒设置在第一和第二接头模块之间，且所述第二接头模块设置在第二标签盒和所述效应结构域之间。
32.根据权利要求31所述的嵌合抗原受体分子，其中所述融合蛋白还包含第三标签盒和第三细胞外(GlyxSer)n接头模块，其中所述第三标签盒设置在所述第二接头模块和所述第三接头模块之间，且所述第三接头模块设置在所述第三标签盒和所述效应结构域之间。
33.根据权利要求26-32中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述融合蛋白还包含细胞外铰链和细胞外CH2CH3接头模块，其中所述铰链邻近所述结合结构域，所述CH2CH3接头模块邻近所述包含效应结构域的细胞内组分，且所述一个或多个标签盒中的至少一个设置在所述铰链和所述CH2CH3接头模块之间。
34.根据权利要求26-32中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述融合蛋白还包含细胞外铰链和细胞外CH3接头模块，其中所述铰链邻近所述结合结构域，所述CH3接头模块邻近所述包含效应结构域的细胞内组分，且所述一个或多个标签盒中的至少一个和/或每一个设置在所述铰链和所述CH3接头模块之间。
35.根据权利要求26-32中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述融合蛋白包含至少一个选自下述的另外的标签盒：His标签、
Figure FDA0002810105710000051
标签、
Figure FDA0002810105710000052
标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、X标签、SBP标签、Softag、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标签或它们的任意组合。
36.根据权利要求26-32任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述Strep标签具有氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:1)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO.:2)。
37.根据权利要求26-32中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述结合结构域是scFv、scTCR、受体胞外结构域或配体。
38.根据权利要求26-32中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述抗原是或包含CD3、CEACAM6、c-Met、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis A、Lewis Y、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、间皮素、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、HLA、与HLA结合的肿瘤或病原体相关的肽、与HLA结合的hTERT肽、与HLA结合的酪氨酸酶肽、与HLA结合的WT-1肽、LTβR、LIFRβ、LRP5、MUC1、OSMRβ、TCRα、TCRβ、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robo1、甲胎蛋白(AFP)、Frizzled、OX40或CD79b。
39.根据权利要求26-32中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述效应结构域是4-1BB、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD27、CD28、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、NKG2D、OX40、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或它们的任意组合。
40.根据权利要求26-32中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述效应结构域包含CD3ζ以及4-1BB、CD27、CD28和OX40中的一种或多种。
41.根据权利要求26-32中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述效应结构域包含4-1BB和CD3ζ、CD27和CD3ζ、CD28和CD3ζ或CD28、4-1BB和CD3ζ。
42.根据权利要求26-32中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述结合结构域包含受体胞外结构域，且所述效应结构域包含4-1BB、CD27、CD28或OX40。
43.根据权利要求42所述的嵌合抗原受体分子，其中所述一个或多个标签盒位于所述受体胞外结构域的羧基端。
44.单链融合蛋白，其包含设置在细胞外组分和细胞内组分之间并连接细胞外组分和细胞内组分的疏水部分，其中所述细胞外组分包含多个标签盒和包含铰链的连接区域，其中所述多个标签盒位于铰链的氨基端，其中所述细胞内组分包含效应结构域，和其中所述多个标签盒的每一个包含Strep标签，其中所述Strep标签具有链霉抗生物素、streptactin或二者作为关联结合配偶体。
45.根据权利要求44所述的单链融合蛋白，其中所述连接区域还包含接头模块。
46.根据权利要求45所述的单链融合蛋白，其中所述接头模块是(GlyxSer)n，其中x是1-5的整数且n是1-10的整数。
47.根据权利要求45所述的单链融合蛋白，其中所述接头模块是CH2CH3或CH3。
48.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述多个标签盒的一个或多个在所述连接区域的氨基端。
49.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述多个标签盒包含二个至五个标签盒。
50.根据权利要求49所述的单链融合蛋白，其中所述多个标签盒的每个标签盒连接至一个或两个包含(GlyxSery)n的接头模块，其中n是1-10的整数，且x和y独立地是0-10的整数，前提条件是，x和y不都是0。
51.根据权利要求50所述的单链融合蛋白，其中所述接头模块具有Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO.:10)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:11)、(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO.:12)的氨基酸序列或它们的任意组合。
52.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述多个标签盒的一个或多个通过接头模块连接至所述连接区域。
53.根据权利要求52所述的单链融合蛋白，其中所述接头模块是或包含(GlyxSer)n，其中x是1-5的整数且n是1-10的整数。
54.根据权利要求52所述的单链融合蛋白，其中所述接头模块是或包含(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:11)。
55.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述细胞外组分还包含His标签、
Figure FDA0002810105710000081
标签、
Figure FDA0002810105710000082
标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、X标签、SBP标签、Softag、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标签或它们的任意组合。
56.根据权利要求44-47任一项所述的单链融合蛋白，其中所述Strep标签具有氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:1)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO.:2)。
57.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含与一个或多个标签盒邻近的接头模块，其中所述接头模块和邻近的标签盒具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:20)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:21)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:22)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:23)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:24)或Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:25)的氨基酸序列。
58.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述疏水部分是跨膜结构域。
59.根据权利要求58所述的单链融合蛋白，其中所述跨膜结构域是CD4、CD8、CD28或CD27跨膜结构域。
60.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述效应结构域是CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD27、CD28、CD79A、CD79B、CD134、CD137、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或它们的任意组合。
61.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述效应结构域包含CD3ζ以及4-1BB(CD137)、CD27、CD28和OX40(CD134)中的一种或多种。
62.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述效应结构域包含LRP、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2或Ryk。
63.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：第一标签盒、第一连接区域、第二标签盒、包含铰链的第二连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分。
64.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：第一标签盒、第一连接区域、第二标签盒、第二连接区域、第三标签盒、包含铰链的第三连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分。
65.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：2-5个标签盒、包含铰链的连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分。
66.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：多个标签盒、包含IgG铰链的连接区域、跨膜结构域和包含效应结构域的细胞内组分，所述效应结构域包含4-1BB和CD3ζ、CD27和CD3ζ、CD28和CD3ζ或CD28、4-1BB和CD3ζ。
67.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基端至羧基端包含：多个标签盒、包含铰链的连接区域、疏水部分和包含效应结构域的细胞内组分，所述效应结构域包含LRP、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2或Ryk。
68.根据权利要求44-47中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含非共价地结合的结合结构域。
69.根据权利要求68所述的单链融合蛋白，其中所述非共价地结合的结合结构域与所述多个标签盒的标签盒结合。
70.根据权利要求68所述的单链融合蛋白，其中所述非共价地结合的结合结构域是scFv、scTCR、受体胞外结构域或配体。
71.根据权利要求68中的任一项所述的单链融合蛋白，其中所述非共价地结合的结合结构域是双特异性的，其中第一结合端是对标签盒特异性的，且第二结合端是对不同于所述标签盒的靶标特异性的。
72.根据权利要求71所述的单链融合蛋白，其中所述非共价地结合的结合结构域是对CD3、CEACAM6、c-Met、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis A、Lewis Y、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、间皮素、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、HLA、与HLA结合的肿瘤或病原体相关的肽、与HLA结合的hTERT肽、与HLA结合的酪氨酸酶肽、与HLA结合的WT-1肽、LTβR、LIFRβ、LRP5、MUC1、OSMRβ、TCRα、TCRβ、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robo1、甲胎蛋白(AFP)、Frizzled、OX40或CD79b特异性的。
73.根据权利要求68所述的单链融合蛋白，其中所述结合结构域是双特异性的，其中第一和第二结合端是对所述标签盒特异性的。
74.根据权利要求68所述的单链融合蛋白，其中所述结合结构域是多特异性的，其中第一端结合所述标签盒，且第二端是对不同于所述标签盒的一种或多种靶标特异性的。
75.根据权利要求74所述的单链融合蛋白，其中至少一个结合结构域是对CD3、CEACAM6、c-Met、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis A、Lewis Y、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、间皮素、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、HLA、与HLA结合的肿瘤或病原体相关的肽、与HLA结合的hTERT肽、与HLA结合的酪氨酸酶肽、与HLA结合的WT-1肽、LTβR、LIFRβ、LRP5、MUC1、OSMRβ、TCRα、TCRβ、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robo1、甲胎蛋白(AFP)、Frizzled、OX40或CD79b特异性的。
76.根据权利要求68所述的单链融合蛋白，其中所述结合结构域是抗体。
77.根据权利要求68所述的单链融合蛋白，其中所述标签盒是具有氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:1)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO.:2)的Strep标签，且所述结合的结合结构域是生物素结合蛋白。
78.根据权利要求68所述的单链融合蛋白，其中所述结合结构域还包含细胞毒性试剂、放射性同位素试剂、放射性金属试剂或可检测的试剂。
79.根据权利要求1-2或44-47中的任一项所述的融合蛋白或根据权利要求26-32中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述融合蛋白或嵌合抗原受体分子还包含细胞毒性试剂、放射性同位素试剂、放射性金属试剂或可检测的试剂。
80.核酸分子，其编码根据权利要求1-25或44-77中的任一项所述的融合蛋白或根据权利要求26-43中的任一项所述的嵌合抗原受体分子。
81.载体，其包含根据权利要求80所述的核酸分子。
82.根据权利要求81所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
83.根据权利要求82所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。
84.宿主细胞，其包含编码根据权利要求1-25或44-77中的任一项所述的融合蛋白或根据权利要求26-43中的任一项所述的嵌合抗原受体分子的核酸分子。
85.根据权利要求84所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是T细胞。
86.用于活化细胞的体外方法，所述方法包括，使包含根据权利要求1-25或44-77中的任一项所述的融合蛋白或根据权利要求26-43中的任一项所述的嵌合抗原受体分子和/或根据权利要求80所述的核酸分子的细胞与对所述多个标签盒的标签盒特异性的结合结构域接触。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述对标签盒特异性的结合结构域附于固体表面和/或所述对标签盒特异性的结合结构域是关联受体、抗-标签抗体和/或抗-标签scFv。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中所述Strep标签具有氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:1)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ IDNO.:2)。
89.根据权利要求86-87中的一项所述的方法，其中所述对标签盒特异性的结合结构域是生物素结合蛋白或抗-Strep标签抗体。
90.根据权利要求86-87中的任一项所述的方法，其中所述结合结构域附于平面、琼脂糖、树脂、3D织物基质或小珠。
91.根据权利要求86-87中的任一项所述的方法，其中所述结合结构域附于微米珠或纳米珠。
92.根据权利要求86-87中的任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
93.根据权利要求86-87中的任一项所述的方法，其中所述细胞是人T细胞。
94.用于促进细胞增殖的体外方法，所述方法包括，使包含根据权利要求1-25或44-77中的任一项所述的融合蛋白或根据权利要求26-43中的任一项所述的嵌合抗原受体分子和/或根据权利要求80所述的核酸分子的非天然细胞与对所述多个标签盒的标签盒特异性的结合结构域和生长因子细胞因子接触达足以允许细胞生长的时间。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述对标签盒特异性的结合结构域附于固体表面和/或所述对标签盒特异性的结合结构域是关联受体、抗-标签抗体或抗-标签scFv。
96.根据权利要求94或95所述的方法，其中所述Strep标签具有氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:1)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ IDNO.:2)。
97.根据权利要求94-95中的一项所述的方法，其中所述对标签盒特异性的结合结构域是生物素结合蛋白或抗-Strep标签抗体。
98.根据权利要求94-95中的任一项所述的方法，其中所述结合结构域附于平面、琼脂糖、树脂、3D织物基质或小珠。
99.根据权利要求94-95中的任一项所述的方法，其中所述结合结构域附于微米珠或纳米珠。
100.根据权利要求94-95中的任一项所述的方法，其中所述生长因子细胞因子是IL2、IL15或二者。
101.根据权利要求94-95中的任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述细胞与抗-CD27结合结构域、抗-CD28结合结构域、抗-CD137结合结构域、抗-OX40结合结构域或其任意组合一起温育，其中所述结合结构域附于固体表面。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述抗-CD27、抗-CD28、抗-CD137结合结构域、抗-OX40结合结构域或它们的任意组合附于平面、琼脂糖、树脂、3D织物基质或小珠。
103.根据权利要求94-95中的任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
104.根据权利要求94-95中的任一项所述的方法，其中所述细胞是人T细胞。
105.根据权利要求103所述的方法，其中所述T细胞是功能性T细胞。
106.根据权利要求104所述的方法，其中所述T细胞是功能性T细胞。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述功能性T细胞是病毒特异性T细胞、肿瘤抗原特异性的细胞毒性T细胞、记忆干T细胞、中枢记忆T细胞或CD4+CD25+调节性T细胞。
108.根据权利要求106所述的方法，其中所述功能性T细胞是病毒特异性T细胞、肿瘤抗原特异性的细胞毒性T细胞、记忆干T细胞、中枢记忆T细胞或CD4+CD25+调节性T细胞。
109.根据权利要求94-95中的任一项所述的方法，其中当根据权利要求1-25或44-77中的任一项所述的融合蛋白的结合结构域或根据权利要求26-43中的任一项所述的嵌合抗原受体分子的结合结构域结合靶细胞配体时，在体内诱导所述增殖。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述靶细胞配体是T细胞抑制细胞配体。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述T细胞抑制细胞配体是PD-L1或PD-L2。
112.用于鉴别细胞的方法，所述方法包括：
使包含细胞的样品与对标签盒特异性的结合结构域接触，所述细胞包含根据权利要求1-25或44-77中的任一项所述的融合蛋白或根据权利要求26-43中的任一项所述的嵌合抗原受体分子和/或根据权利要求80所述的核酸分子，其中所述对所述多个标签盒的标签盒特异性的结合结构域包含可检测的部分；和
检测所述细胞在所述样品中的存在。
113.用于分选或选择细胞或细胞群体的方法，所述方法包括：
使包含T细胞的样品与对所述多个标签盒的标签盒特异性的结合结构域接触，所述T细胞包含根据权利要求1-25或44-77中的任一项所述的融合蛋白或根据权利要求26-43中的任一项所述的嵌合抗原受体分子和/或根据权利要求80所述的核酸分子，和
从其它细胞中选择或分选出被所述结合结构域特异性地结合的细胞，由此从其它细胞中选择或分选出所述细胞或细胞群体。
114.根据权利要求112或113所述的方法，其中所述结合结构域包含可检测的部分，所述部分是荧光标记。
115.根据权利要求112-113中的任一项所述的方法，其中所述结合结构域包含为APC或FITC的可检测的部分。
116.根据权利要求112-113中的任一项所述的方法，其中所述样品是血液。
117.根据权利要求112-113中的任一项所述的方法，其中使用流式细胞计量术检测或分选所述细胞。
118.根据权利要求112-113中的任一项所述的方法，其中所述细胞是非天然的细胞。
119.根据权利要求112所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
120.根据权利要求112-113中的任一项所述的方法，其中所述细胞是人T细胞。
121.用于富集或分离细胞或其群体的方法，所述方法包括，使包含细胞的样品与对所述多个标签盒的标签盒特异性的结合结构域接触，所述细胞包含根据权利要求80所述的核酸分子，根据权利要求1-25或44-77中的任一项所述的融合蛋白，和/或根据权利要求26-43中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，和自所述样品中不表达所述融合蛋白或受体的其它细胞富集或分离所述细胞。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述对标签盒特异性的结合结构域是关联受体、抗-标签抗体或抗-标签scFv。
123.根据权利要求121或122所述的方法，其中所述Strep标签具有氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:1)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO.:2)。
124.根据权利要求121-122中的任一项所述的方法，其中所述对标签盒特异性的结合结构域是生物素结合蛋白或抗-Strep标签抗体。
125.根据权利要求121-122中的任一项所述的方法，其中所述结合结构域附于平面、琼脂糖、树脂、3D织物基质或小珠。
126.根据权利要求121-122中的任一项所述的方法，其中所述结合结构域附于微米珠或纳米珠。
127.根据权利要求121-122中的任一项所述的方法，其中离体进行所述活化。
128.根据权利要求121-122中的任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：在富集或分离之前扩大根据权利要求102-121中的任一项所述的样品中的细胞群体。
129.根据权利要求121-122中的任一项所述的方法，其中所述细胞是非天然的细胞。
130.根据权利要求121-122中的任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
131.根据权利要求121-122中的任一项所述的方法，其中所述细胞是人T细胞。
132.根据权利要求121-122中的任一项所述的方法，其中通过磁性柱色谱法自所述样品的其它组分富集或分离所述细胞。
133.根据权利要求121-122中的任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：鉴别富集的或分离的细胞或细胞群体，其中所述鉴别步骤包括使所述细胞与对所述多个标签盒的标签盒特异性的且具有可检测的部分的结合结构域接触。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述可检测的部分是荧光标记。
135.根据权利要求133或134所述的方法，其中所述可检测的部分是APC、PE、Pacificblue、Alex fluor或FITC。
136.根据权利要求133-134中的任一项所述的方法，其中使用流式细胞计量术检测细胞或群体。
137.根据权利要求121中的任一项所述的方法，其中所述样品是血液或血液衍生的样品。
138.用于消灭细胞的体外方法，所述方法包括使细胞与对所述多个标签盒的标签盒特异性的结合结构域接触，所述细胞包含(a)根据权利要求80所述的核酸分子，(b)根据权利要求1-25或44-77中的任一项所述的融合蛋白，或(c)根据权利要求26-43中的任一项所述的嵌合抗原受体分子，其中所述对标签盒特异性的结合结构域的结合导致表达所述融合蛋白或嵌合抗原受体分子的细胞的细胞死亡。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述对标签盒特异性的结合结构域是关联受体、抗-标签抗体、抗-标签scFv或在其细胞表面上具有抗-标签结合结构域的细胞。
140.根据权利要求138或139所述的方法，其中所述Strep标签具有氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO.:1)或Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO.:2)。
141.根据权利要求138-139中的任一项所述的方法，其中所述对标签盒特异性的结合结构域是生物素结合蛋白、抗-Strep标签抗体或在其细胞表面上表达抗-Strep标签结合结构域的细胞。
142.根据权利要求138-139中的任一项所述的方法，其中所述对标签盒特异性的结合结构域是双特异性的结合结构域，其中第一结合结构域是对标签盒特异性的，且第二结合结构域是对CD3特异性的。
143.根据权利要求138-139中的任一项所述的方法，其中所述对标签盒特异性的结合结构域还包含细胞毒性试剂、放射性同位素试剂、放射性金属试剂或可检测的试剂。
144.用于产生期望的细胞群体的方法，所述方法包括，使包含非天然先祖细胞的样品与对标签盒特异性的结合结构域和生长因子接触达足以允许细胞生长和分化的时间，其中所述非天然先祖细胞包含编码根据权利要求44-77中的任一项的单链融合蛋白的核酸分子，且所述对多个标签盒的标签盒特异性的结合结构域附于固体表面。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述先祖细胞是干细胞。
146.根据权利要求144所述的方法，其中使用根据权利要求121-137中的任一项所述的方法进一步分离或富集所扩大的先祖细胞群体。
147.根据权利要求84或85所述的宿主细胞在制备用于治疗受试者中的疾病的药物中的用途。
148.根据权利要求147所述的用途，其中所述疾病是病毒性疾病、细菌性疾病、癌症、炎性疾病、免疫性疾病或老化相关性疾病。
149.根据权利要求147所述的用途，其中所述受试者是人。
150.根据权利要求147中的任一项所述的用途，其中所述宿主细胞是T细胞或自体T细胞。
151.根据权利要求150所述的用途，其中所述T细胞是调节性T细胞。
152.根据权利要求150所述的用途，其中所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
153.根据权利要求147中的任一项所述的用途，其中所述宿主细胞是干细胞。
154.根据权利要求84所述的宿主细胞在制备用于体内免疫细胞的局部活化的药物中的用途，所述宿主细胞与包含针对所述多个标签盒的标签盒的结合结构域和针对共刺激性分子的结合结构域的基质组合物组合，其中所述基质组合物中的结合结构域与所述宿主细胞的结合活化所述宿主细胞。
155.根据权利要求154所述的用途，其中所述基质组合物包含藻酸盐、基膜基质或生物聚合物。
156.根据权利要求154或155所述的用途，其中所述免疫细胞是T细胞。
157.根据权利要求84所述的宿主细胞在制备用于体内免疫细胞的局部活化的药物中的用途，所述宿主细胞与包含针对所述多个标签盒的标签盒的结合结构域和针对共刺激性分子的结合结构域的装置组合，其中所述基质组合物中的结合结构域与所述宿主细胞的结合活化所述宿主细胞。
158.根据权利要求157所述的用途，其中所述装置包含平面、琼脂糖小珠、树脂、3D织物基质或小珠。
159.根据权利要求157或158所述的用途，其中所述免疫细胞是T细胞。
160.根据权利要求84或85所述的细胞在制备用于跟踪细胞的方法中的试剂的用途，所述方法包括给受试者施用包含可检测的部分的结合分子，且所述结合分子特异性地结合所述融合蛋白或所述嵌合抗原受体分子内包含的所述多个标签盒的标签盒，和在所述受试者体内或在所述施用后得自所述受试者的样品中检测所述分子的存在，由此在所述受试者或其组织或流体中检测所述细胞。
161.根据权利要求160所述的用途，其中同时施用包含所述细胞的试剂和所述结合分子。
162.根据权利要求161所述的用途，其中所述结合分子和包含所述细胞的试剂作为复合物施用。
163.根据权利要求138-139任一项所述的用途，其中所述结合分子与磁性颗粒、超顺磁性氧化铁(SPIO)、氟脱氧葡萄糖(18F)、荧光化合物或它们的任意组合缀合。
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