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CN105916987A - 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法 - Google Patents

使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法 Download PDF

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CN105916987A
CN105916987A CN201480058177.5A CN201480058177A CN105916987A CN 105916987 A CN105916987 A CN 105916987A CN 201480058177 A CN201480058177 A CN 201480058177A CN 105916987 A CN105916987 A CN 105916987A
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cell
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H.高
Z.李
Z-B.刘
L.A.赖兹尼克
J.史
S.斯韦塔舍夫
J.K.杨
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Pioneer Hi Bred International Inc
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Application filed by Pioneer Hi Bred International Inc, EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical Pioneer Hi Bred International Inc
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Abstract

本发明提供了用于对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰的组合物和方法。所述方法和组合物采用向导RNA/Cas内切核酸酶系统来提供有效系统，用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点。本发明还提供了采用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的组合物和方法，用于对细胞或生物体的基因组中的核苷酸序列进行基因组修饰、用于编辑基因，和/或用于将目的多核苷酸插入到细胞或生物体的所述基因组中，或使目的多核苷酸从细胞或生物体的所述基因组缺失。一旦鉴定基因组靶位点，便可采用多种方法进一步修饰所述靶位点，使得所述靶位点包含多种目的多核苷酸。本发明还公开了育种方法和用于利用向导RNA和Cas内切核酸酶这两种成分来选择植物的方法。还提供了用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的组合物和方法。

Description

使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使 用方法
本申请要求2013年8月22日提交的美国临时申请61/868706、2013年9月25日提交的美国临时申请61/882532、2014年2月7日提交的美国临时申请61/937045、2014年3月14日提交的美国临时申请61/953090和2014年7月11日提交的美国临时申请62/023239的权益，所有申请据此全文以引用方式并入本文中。
技术领域
本公开涉及植物分子生物学领域，具体地讲，涉及用于改变植物细胞的基因组的方法。
以电子方式提交的序列表参考
通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该文件名称为“20140814_BB2284PCT_ST25_SequenceListing”，创建日期为2014年8月14日，文件大小为560千字节，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
背景技术
重组DNA技术已经使其能够将外来DNA序列插入到生物体的基因组中，因此改变生物体的表型。最常使用的植物转化方法是农杆菌(Agrobacterium)感染和粒子枪轰击(biolistic particle bombardment)，其中转基因以随机方式并以不可预测的拷贝数整合到植物基因组中。因此，已经对控制植物中的转基因整合作出了努力。
一种用于插入或者修饰DNA序列的方法涉及通过引入侧接有与基因组靶标同源的序列的转基因DNA序列来进行的同源DNA重组。美国专利5,527,695描述了用靶向真核生物DNA的预定序列的DNA序列转化真核生物细胞。具体地讲，讨论了使用位点特异性重组。转化的细胞通过使用选择性标记来鉴定，该选择性标记作为所引入的DNA序列的一部分而被包括。
已证实，在植物细胞中人工诱导的位点特异性基因组双链断裂通过使用两个不同的途径用外源供应的DNA进行同源重组而得到修复。(Puchta等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：5055-5060；2005年8月4日公布的美国专利申请公布2005/0172365A1；2006年12月14日公布的美国专利申请公布2006/0282914；2005年6月2日公布的WO 2005/028942)。
由于DNA区段(包括编码序列和非编码序列在内)的分离、克隆、转移和重组用限制性内切核酸酶进行最便利，许多研究集中在研究和设计内切核酸酶，诸如2004年8月12日公布的WO 2004/067736；1998年8月11日授予Dujon等人的美国专利5,792,632；2003年8月26日授予Dujon等人的美国专利6,610,545 B2；Chevalier等人，(2002)Mol Cell 10：895-905；Chevalier等人，(2001)Nucleic Acids Res 29：3757-3774；Seligman等人，(2002)Nucleic Acids Res 30：3870-3879。
虽然已开发了若干种方法来靶向特定位点以用于植物基因组中的修饰，但仍然需要用于产生具有改变基因组的能育植物的更高效和有效的方法，所述改变基因组在植物基因组的限定区域中包含特异性修饰。
发明内容
本发明提供了在植物中使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统的组合物和方法，用于对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰，用于选择植物，用于基因编辑，以及用于将目的多核苷酸插入到植物的基因组中。所述方法和组合物采用向导RNA/Cas内切核酸酶系统来提供用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统。一旦鉴定出基因组靶位点，就可采用多种方法来进一步修饰靶位点，使得它们包含多种目的多核苷酸。还公开了使用双组分向导RNA和Cas内切核酸酶系统的育种方法和用于选择植物的方法。还提供了具有向导RNA/Cas内切核酸酶系统的核酸构建体、植物、植物细胞、外植体、种子和谷粒。还提供了使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的组合物和方法，用于对细胞或生物体的基因组中的靶序列进行基因组修饰，用于基因编辑，以及用于将目的多核苷酸插入到细胞或生物体的基因组中或使其从细胞或生物体的基因组中缺失。所述方法和组合物采用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统来提供用于修饰或改变靶位点以及编辑细胞的基因组内的目的核苷酸序列的有效系统，其中向导多核苷酸由RNA序列、DNA序列或DNA-RNA组合序列组成。
因此在本公开的第一实施方案中，方法包括用于选择在植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得包含向导RNA的第二植物，该向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物；c)将(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择具有所述靶位点的期望改变的子代植物。
在另一个实施方案中，方法包括用于选择在植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
在另一个实施方案中，方法包括用于选择在植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得包含向导RNA和供体DNA的第二植物，其中所述向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点改变；e)选择在所述靶位点处包含插入的目的多核苷酸的子代植物。
在另一个实施方案中，方法包括用于选择在植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使表达至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA和供体DNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。
在另一个实施方案中，方法包括用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，该方法包括将向导RNA引入到具有Cas内切核酸酶的植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
在另一个实施方案中，方法包括用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，该方法包括将向导RNA和Cas内切核酸酶引入到所述植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
在另一个实施方案中，方法包括用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，该方法包括将向导RNA和供体DNA引入到具有Cas内切核酸酶的植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。
在另一个实施方案中，方法包括用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，该方法包括：a)将向导RNA和Cas内切核酸酶引入到植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；以及b)鉴定在所述靶位点处具有修饰的至少一个植物细胞，其中该修饰包括所述靶位点中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换。
在另一个实施方案中，方法包括用于修饰植物细胞的基因组中的靶DNA序列的方法，该方法包括：A)将能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体引入到植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；以及，B)鉴定在所述靶位点处具有修饰的至少一个植物细胞，其中该修饰包括所述靶位点中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换。
在另一个实施方案中，方法包括用于将目的多核苷酸引入到植物细胞的基因组中的靶位点中的方法，该方法包括：a)将能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体引入到植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；b)使(a)的植物细胞与包含目的多核苷酸的供体DNA接触；以及c)鉴定来自(b)的至少一个植物细胞，该细胞在其基因组中在所述靶位点处包含整合的目的多核苷酸。
在这些实施方案的一些中，向导RNA可通过粒子轰击直接引入或可通过包含可操作地连接至植物U6聚合酶III启动子的对应的向导DNA的重组DNA构建体的粒子轰击或农杆菌(Agrobacterium)转化来引入。
在这些实施方案的一些中，Cas内切核酸酶基因为植物优化的Cas9内切核酸酶。
在这些实施方案的一些中，Cas内切核酸酶基因可操作地连接至Cas密码子区域上游的SV40核靶向信号以及Cas密码子区域下游的VirD2核定位信号。
这些实施方案中的植物为单子叶植物或双子叶植物。更具体地讲，单子叶植物选自玉米、稻、高粱、裸麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草或柳枝稷。双子叶植物选自大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、棉、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥、或红花。
在一些实施方案中，靶位点位于乙酰乳酸合酶(ALS)基因、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合酶(ESPSP)基因、雄性能育性(MS45、MS26或MSCA1)基因的基因序列中。
在另一个实施方案中，本公开包括包含重组DNA构建体的植物、植物部分或种子，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。
在另一个实施方案中，植物包含重组DNA构建体和向导RNA，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶和向导RNA能够形成复合物，并在所述植物基因组的基因组靶序列中产生双链断裂。
在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。
在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至表达向导RNA的核苷酸序列的启动子，其中所述向导RNA能够与植物优化的Cas9内切核酸酶形成复合物，并且其中所述复合物能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。
在另一个实施方案中，方法包括用于选择雄性不育植物或雄性能育植物的方法，该方法包括选择在位于雄性能育性基因座中的基因组靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使表达Cas9内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述基因组靶位点处引入双链断裂。
在另一个实施方案中，方法包括用于产生雄性不育植物和雄性能育植物的方法，该方法包括：a)获得包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物，所述至少一种Cas内切核酸酶能够在位于植物基因组的雄性能育性基因座中的基因组靶位点处引入双链断裂；b)获得包含向导RNA的第二植物，该向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物；c)将(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择雄性不育或雄性能育的子代植物。雄性能育性基因可选自但不限于：MS26基因、MS45基因、MSCA1基因。
还提供了用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的组合物和方法。在一个实施方案中，本公开描述了用于编辑植物细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种玉米优化的Cas9内切核酸酶，其中所述玉米优化的Cas9内切核酸酶能够在植物基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。待编辑的核苷酸(目的核苷酸序列)可位于由Cas内切核酸酶识别和切割的靶位点之内或之外。细胞包括但不限于人类、动物、细菌、真菌、昆虫和植物细胞以及通过本文所述的方法产生的植物和种子。
现示出本公开的方法和组合物的另外的实施方案。
附图和序列表简述
由以下的“具体实施方式”及构成本申请的一部分的附图和序列表可以更完全地理解本公开。本申请随附的序列说明和序列表符合美国联邦法规37C.F.R.§§1.821-1.825中关于专利申请中的核苷酸和氨基酸序列公开的指导规则。序列说明包含37C.F.R.§§1.821-1.825中定义的氨基酸三字母代码，将其以引用方式并入本文。
附图
图1A示出含有马铃薯ST-LS1内含子、SV40氨基末端核定位序列(NLS)和VirD2羧基末端NLS的玉米优化的Cas9基因(编码Cas9内切核酸酶)，其可操作地连接至植物泛素启动子(SEQ ID NO：5)。玉米优化的Cas9基因(仅有Cas9编码序列，无NLS)对应于SEQ ID NO：5的第2037-2411位和第2601-6329位核苷酸，其中马铃薯内含子存在于SEQ ID NO：5的第2412-2600位处。SV40NLS存在于SEQ ID NO：5的第2010-2036位处。VirD2NLS存在于SEQ ID NO：5的第6330-6386位处。图1B示出了可操作地连接至玉米U6聚合酶III启动子的长向导RNA，该长向导RNA被玉米U6终止子终止(SEQ ID NO：12)。包含对应于玉米LIGCas-3靶位点(SEQ IDNO：8)的可变靶向结构域的长向导RNA转录自/对应于SEQ ID NO：12的第1001-1094位。图1C示出了玉米优化的Cas9和长向导RNA表达盒，二者结合到单个载体DNA上(SEQ ID NO：102)。
图2A示出相对于在玉米LIGCas-3(SEQ ID NO：18，表1)靶位点处适当取向的PAM序列，双工crRNA(SEQ ID NO：6)-tracrRNA(SEQ ID NO：7)/Cas9内切核酸酶系统和靶DNA复合物，三角形指向有义DNA链和反义DNA链两者上的预期切割位点。图2B示出相对于在玉米基因组LIGCas-3靶位点处适当取向的PAM序列(GGA)(SEQ ID NO：18，表1)，与基因组靶位点相互作用的向导RNA/Cas9内切核酸酶复合物。该向导RNA(以浅灰色框示出，SEQ ID NO：8)是crRNA和tracrRNA之间的融合体并且包含与双链DNA基因组靶位点的一条DNA链互补的可变靶向结构域。Cas9内切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有义DNA链和反义DNA链两者上的预期DNA切割位点。
图3A至图3B示出在玉米基因组无叶舌1基因座处，与LIG3-4归巢内切核酸酶对照相比，由本文所述的玉米优化的向导RNA/Cas内切核酸酶系统诱导的前10个最常见NHEJ突变的比对和计数。所述突变通过深度测序进行鉴定。参考序列表示每个靶位点标有下划线的未修饰基因座。还指示了PAM序列和预期的切割位点。由于不完全的NHEJ造成的缺失或插入分别以“-”或斜体下划线的核苷酸示出。参考和LIGCas-1靶位点的第1-10个突变分别对应于SEQ ID NO：55-65。参考和LIGCas-2的第1-10个突变分别对应于SEQ ID NO：55、65-75。参考和LIGCas-3的第1-10个突变分别对应于SEQ ID NO：76-86。参考和LIG3-4归巢内切核酸酶靶位点的第1-10个突变分别对应于SEQ ID NO：76、87-96。
图4示出了如何构建同源重组(HR)修复DNA载体(SEQ ID NO：97)。为了促进通过同源重组插入位点特异性转基因，转基因(以浅灰色示出)的任一侧上侧接有与玉米基因组区域具有同源性的大约1kb的DNA，所述玉米基因组区域紧邻LIGCas3和LIG3-4归巢内切核酸酶的预期切割位点。
图5示出了如何通过PCR对从稳定转化体提取的基因组DNA筛选位点特异性转基因插入。无叶舌1基因座内的基因组引物(对应于SEQ ID NO：98和101)被设计成位于用来构建HR修复DNA载体(SEQ ID NO：97)的区域之外，并且与转基因内部的引物(对应于SEQ ID NO：99和100)配对，以有利于PCR检测通过适当取向的位点特异性转基因整合形成的独特基因组DNA连接区(DNA junction)。
图6示出了当短向导RNA作为RNA直接递送时，由本文所述的玉米优化的向导RNA/Cas内切核酸酶系统诱导的NHEJ突变比对。所述突变通过深度测序进行鉴定。参考示出基因组靶位点标有下划线的未修饰基因座。还指示了PAM序列和预期的切割位点。.由于不完全的NHEJ造成的缺失或插入分别以“-”或斜体下划线的核苷酸示出。参考和55CasRNA-1的第1-6个突变分别对应于SEQ ID NO：104-110。
图7示出包含Cas9表达盒的QC782载体。
图8A示出包含向导RNA表达盒的QC783载体。图8B示出向导RNA的DD43CR1(20bp)可变靶向结构域的DNA序列(编码序列)，以及连接至该向导RNA的终止子序列。该20bp可变靶向结构域DD43CR1以粗体示出。
图9示出连接的大豆优化的Cas9和向导RNA构建体QC815的图谱。
图10A示出4号染色体上的DD20大豆基因座以及DD20CR1和DD20CR2基因组靶位点(用加粗箭头表示)。图10B示出4号染色体上的DD43大豆基因座以及DD43CR1和DD43CR2基因组靶位点(用加粗箭头表示)。
图11A-11D。预期靶位点序列与在四个向导RNA诱导的NHEJ实验中检测到的突变靶序列的比对。图11A示出了DD20CR1 PCR扩增子(参考序列，SEQ ID NO：142，基因组靶位点标有下划线)以及由向导RNA/Cas内切核酸酶系统在DD20CR1基因组靶位点处诱导的10个突变(SEQ ID NO：147-156)。图11B示出了DD20CR2 PCR扩增子(参考序列，SEQ ID NO：143)以及由向导RNA/Cas内切核酸酶系统在DD20CR2基因组靶位点处诱导的10个突变(SEQ ID NO：157-166)。图11C示出了DD43CR1 PCR扩增子(参考序列，SEQ ID NO：144)以及由向导RNA/Cas内切核酸酶系统在DD43CR1基因组靶位点处诱导的10个突变(SEQ ID NO：167-176)。图11D示出了DD43CR2 PCR扩增子(参考序列，SEQ ID NO：145)以及由向导RNA/Cas内切核酸酶系统在DD43CR2基因组靶位点处诱导的10个突变(SEQ ID NO：177-191)。对应于不同向导RNA的靶序列标有下划线。每个核苷酸缺失由“-”表示。插入和替换的序列用粗体表示。每个突变序列的总数列于最后一列。
图12A至图12B示出用于编辑目的核苷酸序列的向导RNA/Cas内切核酸酶系统的示意图。为了能够进行特定核苷酸编辑，将包含至少一个核苷酸修饰的多核苷酸修饰模板(当与待编辑的核苷酸序列比较时)与向导RNA和Cas内切核酸酶表达盒一起引入到细胞中。例如，如本文所示，待编辑的核苷酸序列为玉米细胞中的内源性野生型烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因。Cas内切核酸酶(阴影圆圈)为玉米优化的Cas9内切核酸酶，其使用SEQ ID NO：194的向导RNA切割在epsps基因座内的moCas9靶序列。图12-A示出包含三个核苷酸修饰的多核苷酸修饰模板(当与野生型epsps基因座比较时，如图12-B所示)，其侧接有两个同源性区域HR-1和HR-2。图12-B示出与epsps基因座相互作用的向导RNA/玉米优化的Cas9内切核酸酶复合物。需要被编辑的EPSPS基因的初始核苷酸密码子示为aCT和Cca(图12-B)。具有修饰的核苷酸的核苷酸密码子(以大写示出)示为aTC和Tca(图12-B)。
图13示出玉米优化的Cas9内切核酸酶表达盒的示意图。细菌cas9编码序列经密码子优化以在玉米细胞中表达，并且补充有ST-LS1马铃薯内含子(moCas9编码序列，SEQ IDNO：193)。将编码SV40核定位信号(NLS)的DNA片段融合到moCas9编码序列的5’端。玉米泛素启动子(Ubi启动子)及其同源内含子(Ubi内含子)提供用于在玉米细胞中表达moCas9的控制元件。pinII转录终止序列(pinII)完成了玉米moCAS9基因设计。
图14示出了moCas9靶序列(标有下划线)的一些示例，其位于EPSPS的DNA片段上，通过在玉米细胞中moCas9内切核酸酶的切割位点(粗箭头)处引入双链断裂来诱变。在SEQID NO：206中，moCas9切割位点旁边的三个核苷酸(短线)缺失。SEQ ID NO：207-208表示核苷酸缺失可扩大超出moCas9切割位点。
图15示出了EPSPS模板载体，其用于递送包含三个TIPS核苷酸修饰的EPSPS多核苷酸修饰模板。EPSP多核苷酸修饰模板包含EPSPS基因的部分片段。载体长6,475bp，并且包含两个与epsps基因座同源的区域(epsps-HR1和epsps-HR2)。两个Gateway克隆位点(ATTL4和ATTL3)、抗生素抗性基因(KAN)和复制的pUC起点(PUC ORI)完成了EPSPS模板载体1的合成。
图16示出了基于PCR的筛选策略，该策略用于鉴定玉米细胞中具有TIPS核苷酸修饰的玉米事件。两对PCR引物用于扩增epsps基因座的基因组片段(上段)。它们都包含TIPS特异性引物(带圆点的箭头指示三个TIPS修饰的位点)。较短的片段(780bp F-E2)通过扩增EPSPS多核苷酸修饰模板片段产生(模板检测)。除了4个分析事件，在其它分析事件中都发现了扩增的EPSPS多核苷酸修饰模板片段(板F-E2)。较长的片段(839bp H-T)通过扩增基因组EPSPS序列产生，前提条件是epsps基因座包含负责TIPS修饰的三个核苷酸修饰。六个事件被鉴定为含有三个核苷酸修饰(板H-T)。白色箭头指向包含扩增的EPSPS多核苷酸修饰模板和负责TIPS修饰的核苷酸修饰两者的事件。
图17A示出了用于鉴定所选择事件中经编辑的EPSPS DNA片段的PCR方案的示意图。无论编辑产物如何，都对含有epsps基因座的外显子1、内含子1和外显子2中的一部分的部分基因组片段进行扩增(板A，1050bp F-E3)。对仅代表具有一个或多个突变的部分EPSPS基因序列的扩增产物进行克隆和测序。图17B示出经测序的扩增产物的两个示例。在一些扩增产物中，epsps核苷酸和moCas9靶序列(标有下划线)没有变化，这表明一个EPSPS等位基因未经编辑(野生型等位基因；SEQ ID NO：210)。在其它扩增产物中，三个特异性核苷酸置换(代表TIPS修饰)被鉴定为在moCas9靶序列(标有下划线)(SEQ ID NO：209)处没有突变。
图18示出MHP14、TS8、TS9和TS10基因座的位置，其包含玉米1号染色体上性状A(位于53.14cM处)附近的向导RNA/Cas内切核酸酶系统的靶位点。
图19A示出了MHP14Cas1玉米基因组靶序列(SEQ ID NO：229)和MSP14Cas-3玉米基因组靶序列(SEQ ID NO：230)在1号染色体上MHP14玉米基因组DNA基因座上的位置。5′至3′序列。图19B示出了位于TS8基因座上的TS8Cas-1(SEQ ID NO：231)和TS8Cas-2(SEQ ID NO：232)玉米基因组靶序列的位置。图19C示出了位于TS8基因座上的TS9Cas-2(SEQ ID NO：233)和TS9Cas-3(SEQ ID NO：234)玉米基因组靶序列的位置。图19D示出了位于TS10基因座上的TS10Cas-1(SEQ ID NO：235)和TS10Cas-3(SEQ ID NO：236)玉米基因组靶序列的位置。所有这些玉米基因组靶位点通过本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统识别并切割。每个玉米基因组靶序列(箭头所指)以粗体突出标记，并紧接用框标记示出NGG PAM序列。
图20示出了供体DNA(也称为HR修复DNA)的示意图，其包含带有选择性标记的转基因盒(磷酸甘露糖异构酶，以灰色表示)，侧接约0.5至1kb长度的同源重组序列(HR1和HR2)，用于将转基因盒引入到向导RNA/Cas内切核酸酶系统的基因组靶位点中。箭头表示基因组DNA序列在内切核酸酶切割位点任一侧上的与供体DNA的同源区域对应的区段。该示意图代表在玉米基因组中1号染色体的51.54cM至54.56cM处的8个靶位点(4个基因座)中任一个处发生的同源性重组。
图21示出用于鉴定插入事件的连接PCR筛选。位于转基因供体上的引物1和2是所有靶位点通用的。引物TSHR1f位于同源序列HR1之外的基因组区域。引物组合THR1f/引物1扩增连接区1。引物TSHR2r位于HR2区域之外的基因组区域上。引物组合引物2/TSHR2r扩增连接区2。
图22示出用于鉴定TS10Cas10基因座上的插入事件的连接PCR筛选。凝胶图像显示在TS10Cas10-1靶位点处存在插入事件(泳道02A1)。将HR1和HR2连接区的PCR反应产物上样到相邻的泳道(泳道02-白色标记和泳道02-灰色标记)，白色标记代表HR1连接区的PCR产物，灰色标记代表HR2连接区的PCR产物。
图23A至图23B.gRNA/Cas9介导的基因组修饰实验中使用的DNA表达盒。A)Cas9内切核酸酶盒(EF1A2：CAS9)连接至实验U6-9.1DD20CR1中所用的向导RNA表达盒(U6-9.1：DD20CR1，包含驱动DD20CR1向导RNA的大豆U6启动子)，该Cas9内切核酸酶盒包含驱动大豆密码子优化的Cas9内切核酸酶(CAS9(SO)的大豆EF1A2启动子(GM-EF1A2PRO)、大豆优化的SV40核定位信号(SV40NLS(SO))和PINII终止子(PINII TERM)(表27)。表27中列出的其它向导RNA/Cas9盒是相同的，除了靶向基因组靶位点DD20CR2、DD43CR1或DD43CR2的向导RNA的20bp可变靶向结构域。B)实验U6-9.1DD20CR1中使用的供体DNA盒(DD20HR1-SAMS：HPT-DD20HR2)(表27)。供体DNA盒和侧接在DD20靶位点的基因组DNA序列之间的DD20HR1和DD20HR2同源DNA区域。表27中列出的其它供体DNA盒是相同的，除了其中两个中的DD43HR1和DD43HR2区域。
图24A至图24C.DD20和DD43大豆基因组靶位点位置和qPCR扩增子。A)大豆04号染色体的示意图示出DD20和DD43靶位点的相对位置。DD20和DD43位点的基因映射位置为最近的基因Glyma04g39780.1和Glyma04g39550.1的位置。B)来自04号染色体的DD20qPCR 64bp扩增子45936307-45936370(SEQ ID NO：304)。标记靶位点DD20-CR1和DD20-CR2，qPCR引物和探针DD20-F、DD20-R及DD20-T的相对位置。B)来自04号染色体的DD43qPCR 115bp扩增子45731879-45731993(SEQ ID NO：305)。标记靶位点DD43-CR1和DD43-CR2，qPCR引物和探针DD43-F2、DD43-F、DD43-R及DD43-T的相对位置。
图25A至图25C.通过DD20CR1位点处的同源重组(HR)进行的向导RNA/Cas9系统介导的位点特异性非同源末端连接(NHEJ)和转基因插入的示意图。A)用如表27所列的向导RNA/Cas9和供体DNA盒来共转化大豆植物。由连接的向导RNA/Cas9 DNA盒转录的DD20CR1向导RNA/Cas9复合物将特异性切割04号染色体上的DD20CR1靶位点，以使DNA双链断裂。断裂可以自发修复为NHEJ或通过由侧接的同源区域DD20-HR1和DD20HR2促进的供体DNA修复为HR事件。B)NHEJ由DD20特异性qPCR检测，并且突变序列通过测序克隆的HR1-HR2 PCR片段进行估计。C)由两种边界特异性PCR分析物HR1-SAMS和NOS-HR2揭示HR事件，其表明，引物只能扩增在04号染色体的DD20CR1区域与供体DNA之间重组的DNA。除了使用DD20-CR2向导RNA之外，DD20-CR2位点的向导RNA/Cas9介导的NHEJ和HR遵循相同的过程。除了使用向导RNA和与特异于DD43位点的同源区域之外，DD43CR1和DD43CR2位点的向导RNA/Cas9介导的位点特异性NHEJ和HR遵循相同的过程。
图26A至图26C.gRNA/Cas9系统介导的NHEJ的序列。仅对基因组靶位点(以粗体框表示)周围60bp的序列进行比对以示出突变。PAM序列用框标记。插入序列由标记插入位置的符号＾表示，其后接插入序列的大小。实际插入序列列于序列表中。A)U6-9.1DD20CR1序列。在实验U6-9.1DD20CR1中，针对54个事件中的每个事件，对三个菌落进行测序。共返回150个序列，其中26个被认为是短独特缺失，而事件中的2个包含小插入。B)U6-9.1DD20CR2序列。在实验U6-9.1DD20CR2中，针对28个事件中的每个事件，对三个菌落进行测序。共返回84个序列，其中20个被认为是短独特缺失，而事件中的1个包含单bp插入。C)U6-9.1DD43CR1序列。在实验U6-9.1DD43CR1中，针对46个事件中的每个事件，对三个菌落进行测序。共返回132个序列，其中18个被认为是短独特缺失，而事件中的10个包含小插入。D)U6-9.1DD43CR2序列。
图27A至图27C示出基于crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统恢复的前十个最普遍类型的NHEJ突变。图27A示出了针对LIGCas-1靶位点的NHEJ突变，对应于SEQ ID NO：415-424，图27B示出了针对LIGCas-2靶位点的NHEJ突变，对应于SEQ ID NO：425-434，并且图27V示出了针对LIGCas-3靶位点的NHEJ突变，对应于SEQ ID NO：435-444)。
图28.通过用本文所述的gRNA1/Cas9内切核酸酶系统靶向向导RNA/Cas9靶序列1(CTS1，SEQ ID NO：1)实现的玉米ARGOS8基因的5’-UTR中的Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON插入的示意图。HR1和HR2表示同源重组区域。
图29A至图29C.鉴定和分析玉米植物中的Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON插入事件。(A)Zm-ARGOS8的5’-UTR中的Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON插入的示意图。用本文所述的gRNA1/Cas9内切核酸酶系统靶向CTS1。HR1和HR2表示同源重组区域。P1至P4表示PCR引物。(B)PMI-抗性愈伤组织的PCR筛选，以鉴定插入事件。示出了13个代表性愈伤组织的PCR结果。分别用引物对P1+P2和P3+P4进行左连接PCR和右连接PCR。(C)T0植物的PCR分析。用引物P3和P4扩增预期大小(2.4kb，泳道T0)的PCR产物。
图30.通过靶向CTS3(SEQ ID NO：3)和CTS2(SEQ ID NO：2)采用Zm-GOS2 PRO：GOS2INTRON置换的Zm-ARGOS8启动子的示意图。HR1和HR2表示同源重组区域。
图31A至图31D.在玉米植物中用Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON置换ARGOS8基因的天然启动子。(A)通过启动子更换生成的Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON：ARGOS8等位基因的示意图。用gRNA3/gRNA2/Cas9系统靶向两个向导RNA/Cas9靶位点、CTS3(SEQ ID NO：3)和CTS2(SEQ ID NO：2)。HR1和HR2表示同源重组区域。P1至P5表示PCR引物。(B)PMI-抗性愈伤组织的PCR筛选，以鉴定更换事件。示出了10个代表性愈伤组织的PCR结果。其中一个愈伤组织样本12A09，对于左连接区(L，引物P1+P2)和右连接区(R，引物P5+P4)PCR产物两者都显阳性，这表明12A09是更换事件。(C)在初级筛选中鉴定的愈伤组织事件的PCR分析。使用3、4、6、8和9号事件中的引物P3和P4扩增预期大小(2.4kb)的PCR产物，这表明存在Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON：ARGOS8等位基因。(D)T0植物的PCR分析。用引物P3和P4扩增预期大小(2.4kb，泳道T0)的PCR产物。
图32A至图32B.玉米植物中ARGOS8基因的天然启动子的缺失。(A)启动子缺失的示意图。两个向导RNA和Cas9内切核酸酶系统(称为gRNA3/gRNA2/Cas9系统)用于靶向Zm-ARGOS8中的CTS3和CTS2位点。P1和P4表示用于缺失事件筛选的PCR引物。(B)PMI-抗性愈伤组织的PCR筛选，以鉴定缺失事件。示出了15个代表性愈伤组织的PCR结果。A1.1kp PCR产物表示CTS3/CTS2片段的缺失。
图33.使用向导RNA/Cas9靶序列实现的增强子元件缺失的示意图。待待缺失的增强子元件可以是，但不限于，35S增强子元件。
图34A至图34C.玉米EPSPS聚泛素化位点的修饰。(A)比较所选择的玉米EPSPS聚泛素化位点与其它植物物种的类似位点。(B)玉米EPSPS编码序列中待编辑的核苷酸(标有下划线，编码氨基酸以粗体是示出)。(C)在所选择的T0植物中鉴定编辑的EPSPS编码序列。
图35A至图35C.内含子介导的增强元件(A)。EPSPS基因的第一内含子的5′区段(编辑：置换以下划线标出，点表示缺失)(B)及其赋予三个IME元件的经编辑型式(标有下划线)。编辑的核苷酸以粗体示出(C)。
图36A至图36B.另选地，剪接玉米细胞中的EPSPS mRNA。(A)左板代表EPSPS cDNA的分析。图36A中的I4泳道示出了包含未剪接的第三内含子的EPSPS前mRNA的扩增(图36B所示的804bp的诊断片段表示替代剪接事件)。泳道E3和F8显示具有剪接内含子的EPSPS PCR扩增片段。除非合成cDNA，否则不会扩增这些诊断片段(显然，泳道E3、I4和F8中不存在包含总RNA的带(在图36A的右边以总RNA板示出))。图36B中的灰色方框表示八个EPSPS外显子(在每个方框上标记出了它们的大小)。
图37.第二EPSPS内含子和第三外显子之间的连接区处的剪接位点(粗体)。待编辑的核苷酸标有下划线。
图38.T0和T1玉米植物的Southern杂交分析的示意图。
序列
SEQ ID NO：1为来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)M1GAS(SF370)的Cas9基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2为马铃薯ST-LS1内含子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3为SV40氨基N末端的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4为根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)双分型VirD2T-DNA边界内切核酸酶羧基末端的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5为表达玉米优化的Cas9的表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6为在可变靶向结构域中包含LIGCas-3靶序列的crRNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7为tracrRNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8为在可变靶向结构域中包含LIGCas-3靶序列的长向导RNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9为8号染色体玉米U6聚合酶III启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10列出了玉米U6聚合酶III终止子的核苷酸序列的两份拷贝。
SEQ ID NO：11为包含LIGCas-3可变靶向结构域的玉米优化的短向导RNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12为包含LIGCas-3可变靶向结构域的玉米优化的长向导RNA表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：13为玉米基因组靶位点MS26Cas-1的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：14为玉米基因组靶位点MS26Cas-2的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：15为玉米基因组靶位点MS26Cas-3的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：16为玉米基因组靶位点LIGCas-2的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：17为玉米基因组靶位点LIGCas-3的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：18为玉米基因组靶位点LIGCas-4的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：19为玉米基因组靶位点MS45Cas-1的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：20为玉米基因组靶位点MS45Cas-2的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：21为玉米基因组靶位点MS45Cas-3的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：22为玉米基因组靶位点ALSCas-1的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：23为玉米基因组靶位点ALSCas-2的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：24为玉米基因组靶位点ALSCas-3的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：25为玉米基因组靶位点EPSPSCas-1的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：26为玉米基因组靶位点EPSPSCas-2的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：27为玉米基因组靶位点EPSPSCas-3的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：28-52为表2所示的一级PCR的靶位点特异性正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：53为二级PCR的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：54为二级PCR的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：55为LIGCas-1和LIGCas-2基因座的未修饰参考序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：56-65为LIGCas-1的第1-10个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：66-75为LIGCas-2的第1-10个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：76为LIGCas-3和LIG3-4归巢内切核酸酶基因座的未修饰参考序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：77-86为LIGCas-3的第1-10个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：88-96为LIG3-4归巢内切核酸酶基因座的第1-10个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：97为称为HR修复DNA的供体载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：98为用于在连接区1处插入位点特异性转基因的正向PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：99为用于在连接区1处插入位点特异性转基因的反向PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：100为用于在连接区2处插入位点特异性转基因的正向PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：101为用于在连接区2处插入位点特异性转基因的反向PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：102为连接的Cas9内切核酸酶和LIGCas-3长向导RNA表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：103为玉米基因组靶位点55CasRNA-1的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：104为55CasRNA-1基因座的未修饰参考序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：105-110为55CasRNA-1的第1-6个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：111为LIG3-4归巢内切核酸酶靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：112为LIG3-4归巢内切核酸酶编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：113为MS26++归巢内切核酸酶靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：114为MS26++归巢内切核酸酶编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：115为大豆密码子优化的Cas9基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：116为大豆组成型启动子GM-EF1A2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：117为接头SV40NLS的核苷酸序列。
SEQ ID NO：118为大豆优化的Cas9以及SV40NLS的氨基酸序列。
SEQ ID NO：119为载体QC782的核苷酸序列。
SEQ ID NO：120为本文所述大豆U6聚合酶III启动子GM-U6-13.1PRO的核苷酸序列。
SEQ ID NO：121为图8B中的向导RNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：122为载体QC783的核苷酸序列。
SEQ ID NO：123为载体QC815的核苷酸序列。
SEQ ID NO：124为来自酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9内切核酸酶(cas9-2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：125为DD20CR1大豆靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：126为DD20CR2大豆靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：127为DD43CR1大豆靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：128为DD43CR2大豆靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：129为图10A中的DD20序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：130为图10A中的DD20互补序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：131为DD43序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：132为DD43互补序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：133-141为引物序列。
SEQ ID NO：142为DD20CR1PCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：143为DD20CR2PCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：144为DD43CR1PCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：145为DD43CR2PCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：146为DD43CR2PCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：147-156为DD20CR1靶位点的第1-10个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：157-166为DD20CR2靶位点的第1-10个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：167-176为DD43CR1靶位点的第1-10个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：177-191为DD43CR2靶位点的第1-10个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：192为Cas9蛋白质的玉米优化型式的氨基酸序列。
SEQ ID NO：193为SEQ ID NO：192的Cas9基因的玉米优化型式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：194为向导RNA(EPSPS sgRNA)的DNA型式。
SEQ ID NO：195为EPSPS多核苷酸修饰模板。
SEQ ID NO：196为包含TIPS核苷酸修饰的核苷酸片段。
SEQ ID NO：197-204为表15中所示的引物序列。
SEQ ID NO：205-208为图14中所示的核苷酸片段。
SEQ ID NO：209为图17中所示的TIPS编辑的EPSPS核苷酸序列片段的示例。
SEQ ID NO：210为图17中所示的野生型EPSPS核苷酸序列片段的示例。
SEQ ID NO：211为玉米烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)基因座的核苷酸序列。
SEQ ID NO：212为来自嗜热链球菌(S.thermophiles)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571758.1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：213为来自嗜热链球菌的Cas9内切核酸酶(genbank CS571770.1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：214为来自无乳链球菌(S.agalactiae)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571785.1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：215为来自无乳链球菌的Cas9内切核酸酶(genbank CS571790.1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：216为来自变形链球菌(S.mutant)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571790.1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：217-228为实施例17所述的引物和探针核苷酸序列。
SEQ ID NO：229为MHP14Cas1靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：230为MHP14Cas3靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：231为TS8Cas1靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：232为TS8Cas2靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：233为TS9Cas2靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：234为TS9Cas3靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：235为TS10Cas1靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：236为TS10Cas3靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：237-244为图19A至图19D中所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO：245-252为实施例18中所述的向导RNA表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：253-260为实施例18中所述的供体DNA表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：261-270为实施例18中所述的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：271-294为实施例18中所述的引物和探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：295为本文所述大豆U6聚合酶III启动子GM-U6-13.1PRO的核苷酸序列。
SEQ ID NO：298、300、301和303为连接的向导RNA/Cas9表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：299和302为供体DNA表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：271-294为实施例18中所述的引物和探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：304为DD20qPCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：305为DD43qPCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：306-328为本文所述的引物和探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：329-334为本文所述的PCR扩增子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：335为包含DD20CR1靶位点的大豆基因组区域的核苷酸序列。
SEQ ID NO：364为包含DD20CR2靶位点的大豆基因组区域的核苷酸序列。
SEQ ID NO：386为包含DD43CR1靶位点的大豆基因组区域的核苷酸序列。
SEQ ID NO：336-363、365-385和387-414为图26A至图26C所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO：415-444为基于图27A至图27C所示的crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统恢复的NHEJ突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：445-447分别为LIGCas-1、LIGCas2和LIGCas3crRNA表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：448为tracrRNA表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：449为一级PCR的LIGCas-2正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：450为一级PCR的LIGCas-3正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：451为玉米基因组Cas9内切核酸酶靶位点Zm-ARGOS8-CTS1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：452为玉米基因组Cas9内切核酸酶靶位点Zm-ARGQS8-CTS2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：453为玉米基因组Cas9内切核酸酶靶位点Zm-ARGOS8-CTS3的核苷酸序列。
SEQ ID NO：454-458分别为引物P1、P2、P3、P4、P5的核苷酸序列。
SEQ ID NO：459为引物结合位点(PBS)的核苷酸序列，该序列为促进事件筛选的序列。
SEQ ID NO：460为Zm-GOS2 PRO-GOS2 INTRON、玉米GOS2启动子和GOS2内含子1的核苷酸序列，其包括启动子、5′-UTR1、INTRON1和5′-UTR2。
SEQ ID NO：461为玉米Zm-ARGOS8启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：462为玉米Zm-ARGOS8 5′-UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：463为玉米Zm-ARGOS8密码子序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：464为玉米Zm-GOS2基因的核苷酸序列，包括启动子、5′-UTR、CDS、3′-UTR和内含子。
SEQ ID NO：465为玉米Zm-GOS2 PRO启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：466为玉米GOS2 INTRON、玉米GOS2 5′-UTR1和内含子1以及5′-UTR2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：467-468、490-491、503-504分别为大豆基因组Cas内切核酸酶靶序列大豆EPSPS-CR1、大豆EPSPS-CR2、大豆EPSPS-CR4、大豆EPSPS-CR5、大豆EPSPS-CR6、大豆EPSPS-CR7的核苷酸序列。
SEQ ID NO：469为大豆U6小核RNA启动子GM-U6-13.1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：470、471分别为质粒QC868、QC879的核苷酸序列。
SEQ ID NO：472、473、492、493、494、505、506、507分别为RTW1013A、RTW1012A、RTW1199、RTW1200、RTW1190A、RTW1201、RTW1202、RTW1192A的核苷酸序列。
SEQ ID NO：474-488、495-402、508-512为引物和探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：489为大豆密码子优化的Cas9的核苷酸序列。
SEQ ID NO：513为35S增强子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：514为在第163-181位处gRNA1的35S-CRTS的核苷酸序列(包含3′端的PAM)。
SEQ ID NO：515为在第295-319位处gRNA2的35S-CRTS的核苷酸序列(包含3′端的PAM)。
SEQ ID NO：516为在第331-350位处gRNA3的35S-CRT的核苷酸序列(包含3′端的PAM)。
SEQ ID NO：517为EPSPS-K90R模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO：518为EPSPS-IME模板的核苷酸序列。S SEQ ID NO：519为EPSPS-T剪接的模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO：520为ZM-RAP2.7肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：521为ZM-RAP2.7编码DNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：522为ZM-NPK1B肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：523为ZM-NPK1B编码DNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：524为RAB17启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：525为玉米FTM1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：526为玉米FTM1编码DNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：527-532为图34、35和37中所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO：533-534分别为图38的Southern基因组探针和Southern MoPAT探针的核苷酸序列。SEQ ID NO：535-541分别为RF-FPCas-1、RF-FPCas-2、ALSCas-4、ALS修饰修复模板804、ALS修饰修复模板127、ALS正向引物和ALS反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：542-549分别为大豆ALS1-CR1的核苷酸序列(Cas9靶序列)、大豆ALS2-CR2的核苷酸序列(Cas9靶序列)、QC880的核苷酸序列、QC881的核苷酸序列、RTW1026A的核苷酸序列、WOL900的核苷酸序列(正向引物)、WOL578的核苷酸序列(反向引物)和WOL573的核苷酸序列(反向引物)。
SEQ ID NO：550为玉米ALS蛋白的核苷酸序列。
具体实施方式
本公开包括组合物和方法以用于对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰，用于选择植物，用于基因编辑，以及用于将目的多核苷酸插入到植物的基因组中。该方法采用向导RNA/Cas内切核酸酶系统，其中所述Cas内切核酸酶通过向导RNA引导以识别且任选地向细胞的基因组中的特定靶位点处引入双链断裂。提供向导RNA/Cas内切核酸酶系统用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点的有效系统。还提供采用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的方法和组合物，以提供用于修饰细胞的基因组内的靶位点以及用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的有效系统。一旦鉴定了基因组靶位点，便可采用多种方法来进一步修饰靶位点，使得它们包含多种目的多核苷酸。还公开了使用双组分向导RNA/Cas内切核酸酶系统的育种方法。还提供了用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的组合物和方法。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)可位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点之内或之外。
CRISPR基因座(规律成簇间隔短回文重复序列)(也称为SPIDRs--间隔区散在同向重复序列)构成目前描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由短且高度保守的DNA重复序列(通常24至40bp，重复1至140次，也称CRISPR重复序列)组成，所述DNA重复序列是部分回文的。重复的序列(通常是物种特异性的)被恒定长度的可变序列(通常20至58bp，取决于CRISPR基因座(2007年3月1日公布的WO2007/025097))间隔。
CRISPR基因座首先在大肠杆菌(E.coli)中识别(Ishino等人，(1987)J.Bacterial.169：5429-5433；Nakata等人(1989)J.Bacterial.171：3553-3556)。类似的插入短重复序列已经在地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、项圈藻(Anabaena)和肺结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中鉴定(Groenen等人，(1993)Mol.Microbiol.10：1057-1065；Hoe等人(1999)Emerg.Infect.Dis.5：254-263；Masepohl等人(1996)Biochim.Biophys.Acta 1307：26-30；Mojica等人(1995)Mol.Microbiol.17：85-93)。CRISPR基因座与其它SSR的不同之处在于重复序列的结构，其被称为短规则间隔的重复序列(SRSR)(Janssen等人(2002)OMICSJ.Integ.Biol6：23-33；Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。所述重复序列是成簇出现的短元件，其通常被恒定长度的可变序列规则地间隔(Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。
“Cas基因”包括这样的基因，该基因通常与旁侧CRISPR基因座偶联、相关或接近或在邻近旁侧CRISPR基因座的位置。术语“Cas基因”、“CRISPR相关(Cas)基因”在本文中可互换使用。Cas蛋白质家族的全面综述在Haft等人，(2005)Computational Biology，PLo SComput Biol 1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060中提出。
如本文所述，除了四种先前已知的基因家族之外，还描述了41种CRISPR相关(Cas)基因家族。其示出CRISPR体系属于不同的类，具有不同的重复图案、基因组和物种范围。在给定CRISPR基因座处的Cas基因数在物种之间可以不同。
Cas内切核酸酶与由Cas基因编码的Cas蛋白质相关，其中所述Cas蛋白质能够将双链断裂引入到DNA靶序列中。Cas内切核酸酶通过向导多核苷酸引导来识别并任选地在细胞的基因组中的特定靶位点处引入双链断裂。如本文所用，术语“向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统”包括能够将双链断裂引入到DNA靶序列中的Cas内切核酸酶和向导多核苷酸的复合物。Cas内切核酸酶接近基因组靶位点解旋DNA双链体并且在通过向导RNA识别靶序列时切割两条DNA链，但唯一条件是正确的原间隔序列相邻基序(PAM)大致在靶序列的3′端处取向(图2A，图2B)。
在一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因为Cas9内切核酸酶，诸如但不限于2007年3月1日公布并且以引用方式并入本文中的WO2007/025097中以SEQ ID NO：462、474、489、494、499、505和518列出的Cas9基因。在另一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因为植物如玉米或大豆优化的Cas9内切核酸酶(图1A)。在另一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因可操作地连接至Cas密码子区域上游的SV40核靶向信号以及Cas密码子区域下游的双分型VirD2核定位信号(Tinland等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7442-6)。
在一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因为SEQ ID NO：1、124、212、213、214、215、216、193的Cas9内切核酸酶基因或SEQ ID NO：5的第2037-6329位核苷酸，或它们的任意功能片段或变体。
术语“功能片段”、“功能上等同的片段”和“功能等同片段”在本文中可互换使用。这些术语是指其中产生双链断裂的能力得以保持的本公开的Cas内切核酸酶序列的一部分或亚序列。
术语“功能变体”、“功能上等同的变体”和“功能等同变体”在本文中可互换使用。这些术语是指其中产生双链断裂的能力得以保持的本公开的Cas内切核酸酶的变体。片段和变体能够通过诸如定点诱变和合成构建的方法获得。
在一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因为植物密码子优化的酿脓链球菌Cas9基因，其可识别原则上N(12-30)NGG可被靶向的形式的任何基因组序列。
在一个实施方案中，Cas内切核酸酶通过本领域已知的任何方法直接引入到细胞中，例如但不限于瞬时引入方法、转染和/或局部应用。
内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点切割DNA而不损伤碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括I型、II型、III型和IV型内切核酸酶，其还包括亚型。在I型和III型系统中，甲基化酶活性和限制酶活性两者都包含在单一复合物中。内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称为归巢核酸内切核酸酶(HEase)，其类似限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合和切割，然而用于大范围核酸酶的识别位点通常较长，约18bp或更长。(2012年3月22日提交的专利申请WO-PCT PCT/US12/30061)大范围核酸酶已基于保守序列基序分类为四个家族，这四个家族为LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H和His-Cys盒家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。HE酶值得注意的是其长识别位点，以及在其DNA底物中容忍一些序列多态性。大范围核酸酶的命名规则类似于其它限制性内切核酸酶的命名规则。对于分别由独立式ORF、内含子和内含肽编码的大范围核酸酶，它们也通过前缀F-、I-或者PI-进行表征。重组过程中的一个步骤涉及在识别位点处或者附近进行多核苷酸切割。该切割活性可用来产生双链断裂。有关位点特异性重组酶及其识别位点的综述，参见Sauer(1994)Curr Op Biotechnol 5：521-7；以及Sadowski(1993)FASEB 7：760-7。在一些示例中，重组酶来自整合酶或者解离酶家族。
TAL效应物核酸酶是一类新的序列特异性核酸酶，其可用于在植物或其它生物体的基因组中的特定靶序列处形成双链断裂。(Miller等人(2011)Nature Biotechnology29：143-148)。锌指核酸酶(ZFN)为工程化的双链断裂诱导剂，由锌指DNA结合结构域和双链断裂诱导剂结构域构成。识别位点特异性由锌指结构域赋予，锌指结构域通常包含两个、三个或者四个例如具有C2H2结构的锌指，但是其它锌指结构也是已知的并被工程化。锌指结构域易于设计特异性结合选择的多核苷酸识别序列的多肽。ZFN包括与非特异性内切核酸酶结构域连接的工程化的DNA结合锌指结构域，所述非特异性内切核酸酶结构域例如来自IIs型内切核酸酶(诸如FokI)的核酸酶结构域。可将另外的功能性融合到锌指结合结构域，包括转录激活因子结构域、转录阻遏蛋白结构域和甲基化酶。在一些示例中，核酸酶结构域的二聚化为切割活性所需。每个锌指能识别靶DNA中的三个连续碱基对。例如，一个3锌指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于该核酸酶要求二聚化，使用两组锌指三联体来结合一条18个核苷酸的识别序列。
细菌和古细菌已进化出适应性免疫防御机制，又称为规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)系统，其使用短RNA来指导外源核酸的降解(2007年3月1日公布的WO2007/025097)。来自细菌的II型CRISPR/Cas系统采用crRNA和tracrRNA来将Cas内切核酸酶引导至其DNA靶标。crRNA(CRISPR RNA)包含与双链DNA靶标中的一条链互补的区域并且与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)碱基配对，从而形成指导Cas内切核酸酶切割DNA靶标的RNA双链体(图2B)。
如本文所用，术语“向导RNA”是指两个RNA分子即包含可变靶向结构域的crRNA(CRISPR RNA)以及tracrRNA的合成融合体(图2B)。在一个实施方案中，向导RNA包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域以及可与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。
如本文所用，术语“向导多核苷酸”涉及如下多核苷酸序列，该多核苷酸序列可与Cas内切核酸酶形成复合物并且使Cas内切核酸酶能够识别并且任选地切割DNA靶位点。向导多核苷酸可为单分子或双分子。向导多核苷酸序列可为RNA序列、DNA序列、或它们的组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，向导多核苷酸可包含至少一个核苷酸、磷酸二酯键或键修饰，诸如但不限于锁定核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2’-氟A、2’-氟U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18(六乙二醇链)分子)，或导致环化的5’至3’共价键。单独包含核糖核酸的向导多核苷酸也称为“向导RNA”。
向导多核苷酸可为双分子(也称为双链体向导多核苷酸)，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)以及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。双分子向导多核苷酸的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独分子。这两个单独分子可为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。在一些实施方案中，包含连接到CER结构域的VT结构域的双链体向导多核苷酸的第一分子被称为“crDNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)，或“crDNA-RNA”(当由DNA核苷酸和RNA核苷酸的组合构成时)。cr核苷酸可包括细菌和古细菌中天然存在的cRNA的片段。在一个实施方案中，细菌和古细菌中天然存在的cRNA的片段以本文所公开的cr核苷酸形式存在，其大小范围可为，但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，包含CER结构域的双链体向导多核苷酸的第二分子被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)，或“tracrDNA-RNA”(当由DNA核苷酸和RNA核苷酸的组合构成时)。在一个实施方案中，引导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA为包含双链体crRNA-tracrRNA的双工RNA。
向导多核苷酸也可为单分子，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)以及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。所谓“结构域”，意指核苷酸的连续片段，该连续片段可为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。单向导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一些实施方案中，单向导多核苷酸包括连接到tracr核苷酸(包含CER结构域)的cr核苷酸(包含连接到CER结构域的VT结构域)，其中所述键为包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列的核苷酸序列。由来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列构成的单向导多核苷酸可被称为“单向导RNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)或“单向导DNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)或“单向导RNA-DNA”(当由RNA核苷酸和DNA核苷酸的组合构成时)。在本发明的一个实施方案中，单向导RNA包括cRNA或cRNA片段以及能与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述向导RNA/Cas内切核酸酶复合物可引导Cas内切核酸酶至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶将双链断裂引入到基因组靶位点中。使用单向导多核苷酸与双链体向导多核苷酸相比的一个方面是仅需要形成一个表达盒即可表达单向导多核苷酸。
术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在本文中可互换使用并且包括与双链DNA靶位点的一条链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列(图2A和图2B)。第一核苷酸序列结构域(VT结构域)和靶序列之间的互补性％可为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域的长度可为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续片段。可变靶向结构域可由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列、或它们的任意组合构成。
术语向导多核苷酸的“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在本文中可互换使用并且包括与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(诸如向导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如本文所述的修饰)，或它们的任何组合组成。
连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一个实施方案中，连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列的长度可为至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸。在另一个实施方案中，连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含四环序列，诸如但不限于GAAA四环序列。
向导多核苷酸、VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰可选自但不限于5′帽、3′聚腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、将向导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供追踪的修饰或序列、提供用于蛋白质的结合位点的修饰或序列、锁定核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、或它们的任意组合。这些修饰可产生至少一种另外的有益特征，其中所述另外的有益特征选自经修饰或调控的稳定性，亚细胞靶向，跟踪，荧光标记，蛋白或蛋白复合物的结合位点，与互补靶序列的经修饰的结合亲和力，经修饰的对细胞降解的抗性，或增加的细胞渗透性。
在一个实施方案中，向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使Cas内切核酸酶能够在DNA靶位点处引入双链断裂。
在本公开的一个实施方案中，可变靶结构域的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在本公开的一个实施方案中，向导RNA包括cRNA(或cRNA片段)以及能与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的tracrRNA(或tracrRNA片段)，其中所述向导RNA/Cas内切核酸酶复合物可引导Cas内切核酸酶至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶将双链断裂引入到基因组靶位点中。
在一个实施方案中，可采用本领域已知的任何方法将向导RNA直接引入到植物或植物细胞中，所述方法诸如但不限于粒子轰击或局部应用。
在另一个实施方案中，可通过引入包含可操作地连接至植物特异性启动子的对应向导DNA序列的重组DNA分子间接引入向导RNA(如图1B所示)，该植物特异性启动子能够转录所述植物细胞中的向导RNA。术语“对应的向导DNA”包括如下DNA分子，该DNA分子与RNA分子相同但是RNA分子的每个“U”置换为“T”。
在一些实施方案中，向导RNA通过粒子轰击或包含可操作地连接至植物U6聚合酶III启动子的对应的向导DNA的重组DNA构建体的农杆菌(Agrobacterium)转化来引入。
在一个实施方案中，引导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA为包含双链体crRNA-tracrRNA的双工RNA(如图2B所示)。使用向导RNA与双工crRNA-tracrRNA相比的一个优点是仅需要形成一个表达盒即可表达融合的向导RNA。
术语“靶位点”、“靶序列”、”靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”和“基因组靶基因座”在本文中可互换使用并且指植物细胞的基因组(包括叶绿体和线粒体DNA)中的多核苷酸序列，在植物细胞基因组中在该多核苷酸序列处通过Cas内切核酸酶诱导双链断裂。靶位点可为植物基因组中的内源位点，或者作为另外一种选择，靶位点可与植物是异源的，从而不天然存在于基因组中，或者靶位点与其天然出现的位置相比可存在于异源基因组位置中。如本文所用，术语“内源靶序列”和“天然靶序列”可在本文中互换使用以指对植物的基因组为内源或天然的靶序列，并且位于该靶序列在植物基因组中的内源或天然位置处。
在一个实施方案中，靶位点可类似于DNA识别位点或由双链断裂诱导剂特异性识别和/或结合的靶位点，所述双链断裂诱导剂诸如LIG3-4内切核酸酶(2009年5月21日公布的美国专利公布2009-0133152A1)或MS26++大范围核酸酶(2012年6月19日提交的美国专利申请13/526912)。
“人工靶位点”或“人工靶序列”可在本文中互换使用并且指已被引入到植物的基因组中的靶序列。这种人工靶序列可在序列上与植物的基因组中的内源或天然靶序列相同，但可位于植物的基因组中的另一不同位置(即，非内源或者非天然位置)。
“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”、“修饰的靶序列”在本文中可互换使用，并且指如本文所公开的当与未改变的靶序列相比时包含至少一个改变的靶序列。此类“改变”包括例如：(i)替换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
本文中公开了用于修饰植物基因组靶位点的方法。在一个实施方案中，用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法包括将向导RNA引入到具有Cas内切核酸酶的植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
还提供用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，该方法包括将向导RNA和Cas内切核酸酶引入到所述植物中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
还提供用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，该方法包括将向导RNA和供体DNA引入到具有Cas内切核酸酶的植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。
还提供用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，该方法包括：a)将包含可变靶向结构域的向导RNA和Cas内切核酸酶引入到植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；以及b)鉴定在所述靶位点处具有修饰的至少一个植物细胞，其中该修饰包括所述靶位点中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换。
还提供用于修饰植物细胞的基因组中的靶DNA序列的方法，该方法包括：a)将能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体引入到植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；以及，b)鉴定在所述靶位点处具有修饰的至少一个植物细胞，其中该修饰包括所述靶位点中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换。
靶位点的长度可改变，并且包括例如长度为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸的靶位点。靶位点还有可能是回文的，即一条链上的序列在互补链上从相反方向读起来是一样的。切口/切割位点可位于靶序列内，或者切口/切割位点可位于靶序列之外。在另一个变型形式中，切割可发生在互相相对的核苷酸位置处以产生平端切口，或者在其它情况中，切口可交错以产生单链突出端，也称“粘性末端”，其可以为5′突出端或者3′突出端。
在一些实施方案中，能够由Cas内切核酸酶切割的基因组靶位点包括雄性能育性基因的12至30个核苷酸片段，诸如MS26(参见例如美国专利7,098,388、7,517,975、7,612,251)、MS45(参见例如美国专利5,478,369、6,265,640)或MSCA1(参见例如美国专利7,919,676)、ALS或ESPS基因。
还可使用基因组靶位点的活性变体。此类活性变体可与给定靶位点具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中活性变体保留生物活性并且因此能够由Cas内切核酸酶识别和切割。通过内切核酸酶测量靶位点的双链断裂的测定法是本领域中已知的，并且通常测量包含识别位点的DNA底物上的试剂的整体活性和特异性。
各种方法和组合物均可用于获得具有插入到Cas内切核酸酶的靶位点中的目的多核苷酸的植物。此类方法可采用同源重组来提供目的多核苷酸在靶位点处的整合。在所提供的一种方法中，向植物细胞提供采用供体DNA构建体形式的目的多核苷酸。如本文所用，“供体DNA”是包含待插入到Cas内切核酸酶的靶位点中的目的多核苷酸的DNA构建体。供体DNA构建体还包含目的多核苷酸旁侧的第一同源性区域和第二同源性区域。供体DNA的第一同源性区域和第二同源性区域分别与存在于植物基因组的靶位点中或旁侧的第一基因组区域和第二基因组区域共享同源性。所谓“同源性”是指类似的DNA序列。例如，存在于供体DNA上的“基因组区域的同源性区域”是与植物基因组中的给定“基因组区域”具有类似序列的DNA区域。同源性区域可具有任何长度，该长度足以促进切割靶位点处的同源重组。例如，同源性区域的长度可为至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，使得同源性区域具有充分的同源性与对应的基因组区域发生同源重组。“充分的同源性”表明两个多核苷酸序列具有充分的结构相似性以充当同源重组反应的底物。结构相似性包括每个多核苷酸片段的总体长度，以及多核苷酸的序列相似性。序列相似性可通过序列的总长度上的序列同一性百分比，和/或通过包含局部化相似性的保守区域(诸如具有100％序列同一性的连续的核苷酸)以及序列长度的一部分上的序列同一性百分比来描述。
靶标和供体多核苷酸共享的同源性或者序列同一性的量可变化，包括总长度和/或具有在以下范围内的单位整数值的区域：约1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb、或者直到并包括该靶位点的总长度。这些范围包括该范围内的每个整数，例如1-20bp的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可通过两个多核苷酸的完全比对长度上的序列同一性百分比来描述，所述序列同一性百分比包括约至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性百分比。充分的同源性包括多核苷酸长度、全局序列同一性百分比和连续的核苷酸的任选保守区域或者局部序列同一性百分比的任何组合，例如充分的同源性可描述为75-150bp的与靶基因座区域具有至少80％序列同一性的区域。充分的同源性还可通过所预测的两个多核苷酸在高严格条件下特异性杂交的能力来描述，参见例如Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，(1994)Current Protocols，(Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.)；以及Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，(Elsevier，New York)。
如本文所用，“基因组区域”是植物细胞的基因组中的染色体的区段，该区段存在于靶位点的任一侧上，或者作为另外一种选择，还包含靶位点的一部分。基因组区域可包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，使得基因组区域具有充分的同源性与对应的同源性区域发生同源重组。
目的多核苷酸和/或性状可在复合性状基因座中堆叠在一起，如2013年10月3日公布的US-2013-0263324-A1和2013年1月24日公布的PCT/US13/22891中所述，两项申请都据此以引用方式并入本文。本文所述向导多核苷酸/Cas9内切核酸酶系统提供高效系统来生成双链断裂以及允许复合性状基因座中的多个性状堆叠。
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统用于通过向植物细胞提供一种或多种向导多核苷酸、一种Cas内切核酸酶以及任选地一种或多种供体DNA来将一种或多种目的多核苷酸或者一种或多种目的性状引入到一个或多个靶位点中。可从在所述一个或多个靶位点处包含改变的植物细胞产生能育植物，其中所述改变选自(i)替换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，和(iv)(i)-(iii)的任何组合。包含这些改变的靶位点的植物可与在相同复合性状基因座中包含至少一个目的基因或性状的植物杂交，从而进一步在所述复合性状基因座中堆叠多个性状。(还参见2013年10月3日公布的US-2013-0263324-A1和2013年1月24日公布的PCT/US13/22891)。
在一个实施方案中，方法包括用于在植物中产生复合性状基因座的方法，所述复合性状基因座在目的基因组区域中包含至少两个改变的靶序列，所述方法包括：(a)在植物中选择基因组区域，其中所述基因组区域包含第一靶序列和第二靶序列；(b)使至少一个植物细胞与至少第一向导多核苷酸、第二多核苷酸、以及任选地至少一个供体DNA和Cas内切核酸酶接触，其中该第一向导多核苷酸和第二向导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在至少第一靶序列和第二靶序列处引入双链断裂；(c)鉴定(b)的在第一靶序列处包含第一改变且在第二靶序列处包含第二改变的细胞；以及(d)从(c)的细胞再生第一能育植物，所述能育植物包含第一改变和第二改变，其中该第一改变和第二改变物理地连接在一起。
在一个实施方案中，方法包括用于在植物中产生复合性状基因座的方法，所述复合性状基因座在目的基因组区域中包含至少两个改变的靶序列，所述方法包括：(a)在植物中选择基因组区域，其中所述基因组区域包含第一靶序列和第二靶序列；(b)使至少一个植物细胞与第一向导多核苷酸、Cas内切核酸酶以及任选地第一供体DNA接触，其中第一向导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在第一靶序列处引入双链断裂；(c)鉴定(b)的在第一靶序列处包含第一改变的细胞；(d)从(c)的细胞再生第一能育植物，所述第一能育植物包含第一改变；(e)使至少一个植物细胞与第二向导多核苷酸、Cas内切核酸酶以及任选地第二供体DNA接触；(f)鉴定(e)的在第二靶序列处包含第二改变的细胞；(g)从(f)的细胞再生第二能育植物，所述第二能育植物包含第二改变；以及(h)从(g)的第二能育植物获得能育子代植物，所述能育子代植物包含第一改变和第二改变，其中该第一改变和第二改变物理地连接在一起。
给定基因组区域和存在于供体DNA上的对应的同源性区域之间的结构相似性可为任何程度的序列同一性，其允许发生同源重组。例如，供体DNA的“同源性区域”和植物基因组的“基因组区域”共享的同源性或者序列同一性的量可为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，使得序列发生同源重组。
供体DNA上的同源性区域可与靶位点旁侧的任何序列具有同源性。虽然在一些实施方案中，同源性区域与紧邻靶位点旁侧的基因组序列共享显著的序列同源性，但应当认识到，同源性区域可被设计为与如下区域具有充分的同源性，该区域可进一步位于靶位点的5′或3′处。在另外的实施方案中，同源性区域还可与靶位点的片段连同下游基因组区域具有同源性。在一个实施方案中，第一同源性区域还包含靶位点的第一片段并且第二同源性区域包含靶位点的第二片段，其中第一片段和第二片段不相似。
如本文所用，“同源重组”包括两个DNA分子之间在同源性位点处的DNA片段的交换。同源重组的频率受多个因素影响。不同的生物体在同源重组的量以及同源重组与非同源重组的相对比例方面不同。一般地讲，同源性区域的长度影响同源重组事件的频率，同源性区域越长，频率越高。为观察到同源重组而需要的同源性区域的长度也是随物种而异的。在许多情况下，至少5kb的同源性已被利用，但在少至25-50bp的同源性的情况下就已观察到同源重组。参见例如Singer等人，(1982)Cell 31：25-33；Shen和Huang，(1986)Genetics112：441-57；Watt等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4768-72；Sugawara和Haber，(1992)Mol Cell Biol 12：563-75；Rubnitz和Subramani，(1984)Mol Cell Biol 4：2253-8；Ayares等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5199-203；Liskay等人，(1987)Genetics 115：161-7。
同源性介导的修复(HDR)是细胞内修复双链DNA断裂和单链DNA断裂的机制。同源性介导的修复包括同源重组(HR)和单链退火(SSA)(Lieber.2010Annu.Rev.Biochem.79：181-211)。HDR的最常见形式称为同源重组(HR)，其要求供体和受体DNA之间具有最长的序列同源性。HDR的其它形式包括单链退火(SSA)以及断裂诱导的复制，这些相对于HR需要较短的序列同源性。在切口(单链断裂)处同源性介导的修复可通过采用不同于在双链断裂处HDR的机制来进行(Davis和Maizels.PNAS(0027-8424)，111(10)，第E924-E932页)。
植物细胞的基因组改变，例如通过同源重组(HR)改变，是基因工程的强大工具。尽管高等植物中的同源重组频率低，但还是存在植物内源性基因的同源重组的少数成功例子。植物中同源重组的参数已主要通过拯救(rescue)所引入的截短的选择性标记基因进行了研究。在这些实验中，同源DNA片段通常在0.3kb至2kb之间。观察到的同源重组频率为大约10-4至10-5。参见例如Halfter等人，(1992)Mol Gen Genet 231：186-93；Offringa等人，(1990)EMBO J 9：3077-84；Offringa等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7346-50；Paszkowski等人，(1988)EMBO J 7：4021-6；Hourda和Paszkowski，(1994)Mol Gen Genet243：106-11；以及Risseeuw等人，(1995)Plant J 7：109-19。
同源重组在昆虫中已得到证明。Dray和Gloor在果蝇属中发现，少至3kb的总模板：靶标同源性就足够以适当的效率将大的非同源DNA区段拷贝到靶标中(Dray和Gloor，(1997)Genetics 147：689-99)。Golic等人采用在果蝇属中的靶标FRT处FLP介导的DNA整合，证实了当供体和靶标共享4.1kb的同源性时，与1.1kb的同源性时相比，整合效率为大约10倍(Golic等人，(1997)Nucleic Acids Res 25：3665)。来自果蝇属的数据表明，2-4kb的同源性对于有效靶向是充足的，但是存在一些证据证明低得多的同源性——约30bp至约100bp——可能就足够(Nassif和Engels，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1262-6；Keeler和Gloor，(1997)Mol Cell Biol 17：627-34)。
也在其它生物体中实现了同源重组。例如，在寄生性原生动物利什曼原虫属中进行同源重组需要至少150-200bp的同源性(Papadopoulou和Dumas，(1997)Nucleic AcidsRes 25：4278-86)。在丝状真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中，用少至50bp旁侧同源性实现了基因替换(Chaveroche等人，(2000)Nucleic Acids Res 28：e97)。在纤毛虫嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中也证明了所靶向的基因替换(Gaertig等人，(1994)Nucleic Acids Res 22：5391-8)。在哺乳动物中，本领域已成功培养繁殖、转化、选择多能胚胎干细胞系(ES)，再将其引入到小鼠胚胎中，从而在小鼠体内极其顺利地实现了同源重组。再使承载插入的转基因ES细胞的胚胎发育成遗传学后代。通过将同胞小鼠进行杂种繁殖，可获得携带选择的基因的纯合小鼠。该方法的概述在以下文献中提供：Watson等人，(1992)Recombinant DNA，第2版，(Scientific American Books distributed by WHFreeman&Co.)；Capecchi，(1989)Trends Genet 5：70-6；以及Bronson，(1994)J Biol Chem269：27155-8。由于缺乏能够移植到卵母细胞或者发育的胚胎中的干细胞，在小鼠以外的哺乳动物中的同源重组曾是有限的。但是，McCreath等人，Nature 405：1066-9(2000)报道了通过在原代胚胎成纤维细胞中进行转化和选择而在绵羊中成功进行了同源重组。
易错DNA修复机制可在双链断裂位点处产生突变。将断裂端连到一起的最常用修复机制是非同源末端连接(NHEJ)途径(Bleuyard等人，(2006)DNA Repair 5：1-12)。染色体的结构完整性通常通过修复来保持，但缺失、插入或其它重排都是可能的。一个双链断裂的两个末端是NHEJ的最普遍的底物(Kirik等人，(2000)EMBO J 19：5562-6)，但是，如果发生两个不同的双链断裂，则来自不同断裂的游离末端可连接并导致染色体缺失(Siebert和Puchta，(2002)Plant Cell 14：1121-31)，或不同染色体之间的染色体易位(Pacher等人，(2007)Genetics 175：21-9)。
也可将附加型DNA分子连接到双链断裂中，例如将T-DNA整合到染色体双链断裂中(Chilton和Que，(2003)Plant Physiol 133：956-65；Salomon和Puchta，(1998)EMBO J 17：6086-95)。一旦双链断裂周围的序列被改变，例如被参与双链断裂成熟的外切核酸酶活性改变，则基因转换途径可恢复初始结构，如果同源序列可用，如非分裂的体细胞中的同源染色体，或者DNA复制后的姊妹染色单体(Molinier等人，(2004)Plant Cell 16：342-52)。异位的和/或表成的DNA序列也可充当DNA修复模板用于同源重组(Puchta，(1999)Genetics152：1173-81)。
一旦在DNA中诱导产生双链断裂，细胞的DNA修复机制就被激活以修复断裂。易错DNA修复机制可在双链断裂位点处产生突变。使断裂端到一起的最常用修复机制是非同源末端连接(NHEJ)途径(Bleuyard等人，(2006)DNA Repair 5：1-12)。染色体的结构完整性通常通过修复来保持，但缺失、插入或其它重排都是可能的(Siebert和Puchta，(2002)PlantCell 14：1121-31；Pacher等人，(2007)Genetics 175：21-9)。
另选地，双链断裂可通过同源DNA序列之间的同源重组来修复。一旦双链断裂周围的序列被改变，例如被参与双链断裂成熟的外切核酸酶活性改变，如果同源序列可以，如非分裂的体细胞中的同源染色体，或者DNA复制后的姊妹染色单体(Molinier等人，(2004)Plant Cell 16：342-52)，则基因转换途径可恢复初始结构。异位的和/或表成的DNA序列也可充当DNA修复模板用于同源重组(Puchta，(1999)Genetics 152：1173-81)。
DNA双链断裂似乎是刺激同源重组途径的有效因子(Puchta等人，(1995)PlantMol Biol 28：281-92；Tzfira和White，(2005)Trends Biotechnol 23：567-9；Puchta，(2005)J Exp Bot 56：1-14)。使用DNA断裂剂，在植物中人工构建的同源DNA重复序列之间观察到同源重组增加两倍至九倍(Puchta等人，(1995)Plant Mol Biol 28：281-92)。在玉米原生质体中，用线状DNA分子进行实验证明了质粒之间的同源重组增强(Lyznik等人，(1991)Mol Gen Genet 230：209-18)。
在本文提供的一个实施方案中，方法包括使植物细胞与供体DNA和内切核酸酶接触。一旦通过内切核酸酶将双链断裂引入到靶位点中，则供体DNA的第一同源性区域和第二同源性区域可经历与其对应的同源性基因组区域的同源重组，从而在供体和基因组之间进行DNA交换。因此，所提供的方法使供体DNA的目的多核苷酸整合到植物基因组的靶位点中的双链断裂中，从而改变初始靶位点并产生改变的基因组靶位点。
可通过本领域已知的任何方法引入供体DNA。例如，提供具有靶位点的植物。供体DNA可通过本领域中已知的任何转化方法来提供，所述转化方法包括例如农杆菌介导的转化或粒子枪轰击。供体DNA可瞬时地存在于细胞中或者其可通过病毒复制子引入。在Cas内切核酸酶和靶位点的存在下，供体DNA被插入到转化的植物基因组中。
另一个方法采用对现有的归巢内切核酸酶进行蛋白质工程化以改变它们的靶标特异性。归巢内切核酸酶，诸如I-SceI或I-CreI，结合和切割相对较长的DNA识别序列(分别为18bp和22bp)。这些序列据预测在基因组中很少天然发生，通常仅1或者2个位点/基因组。归巢内切核酸酶的切割特异性可通过合理设计在DNA结合结构域处的氨基酸置换和/或突变单体的组合装配和选择来改变(参见例如Arnould等人，(2006)J Mol Biol 355：443-58；Ashworth等人，(2006)Nature 441：656-9；Doyon等人，(2006)J Am Chem Soc 128：2477-84；Rosen等人，(2006)Nucleic Acids Res 34：4791-800；以及Smith等人，(2006)NucleicAcids Res 34：e149；Lyznik等人，2009年，美国专利申请公布20090133152A1；Smith等人，2007年，美国专利申请公布20070117128A1)。已证明了工程化大范围核酸酶能切割同族突变位点而不扩大它们的特异性。将对野生型酵母I-SceI归巢核酸酶具有特异性的人工识别位点引入玉米基因组，并且当转基因I-SceI通过杂交引入并且通过基因切除激活时，检测到在1％的被分析的F1植物中的识别序列的突变(Yang等人，(2009)Plant Mol Biol 70：669-79)。更具体的是，使用基于I-CreI大范围核酸酶序列进行设计的工程化单链内切核酸酶靶向玉米无舌叶基因座(liguleless locus)。当设计的归巢核酸酶通过农杆菌介导转化未成熟胚芽来引入时，在3％的TO转基因植物中检测到选择的无舌叶基因座识别序列的突变(Gao等人，(2010)Plant J 61：176-87)。
目的多核苷酸在本文中进一步描述并且反映出作物开发参与者的商业市场和利益。目的作物和市场在变化，随着发展中国家开放了世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性诸如收率和杂种优势的理解逐渐深入，对用于基因工程的基因的选择将相应地变化。
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统进行的基因组编辑
如本文所述，向导RNA/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸修饰模板组合使用，以允许编辑目的基因组核苷酸序列。此外，如本文所述，对于使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统的每一实施方案，在向导多核苷酸不单独包含核糖核酸而是其中向导多核苷酸包含RNA-DNA分子的组合或者单独包含DNA分子的情况下可部署类似的向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统。
虽然存在许多双链断裂制造系统，但其用于基因编辑的实际应用可能由于所诱导的双链断裂(DSB)的频率相对较低而被限制。迄今为止，许多基因组修饰方法依赖于同源重组系统。同源重组(HR)可提供用于找到目的基因组DNA序列并且根据实验规范修饰它们的分子方法。同源重组以低频率在植物体细胞中发生。该过程可通过在所选择的内切核酸酶靶位点处引入双链断裂(DSB)而增强到用于基因组工程化的实际水平。所面临的挑战是有效地在目的基因组位点处形成DSB，因为两个相互作用的DNA分子之间的信息传递的方向性存在偏差(断裂的分子充当遗传学信息的受体)。本文描述了向导RNA/Cas系统的用途，即，提供灵活的基因组切割特异性并且在DNA靶位点处产生高频率的双链断裂，从而实现在目的核苷酸序列中的高效基因编辑，其中待编辑的目的核苷酸序列可位于由Cas内切核酸酶识别和切割的靶位点之内或之外。
“修饰的核苷酸”或“编辑的核苷酸”是指在与其未修饰的核苷酸序列相比时包含至少一个改变的目的核苷酸序列。此类“改变”包括例如：(i)替换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
术语“多核苷酸修饰模板”包括当与待编辑的核苷酸序列相比时包含至少一个核苷酸修饰的多核苷酸。核苷酸修饰可为至少一个核苷酸的置换、添加或缺失。任选地，多核苷酸修饰模板还可包含至少一个核苷酸修饰旁侧的同源核苷酸序列，其中旁侧同源核苷酸序列向待编辑的所需核苷酸序列提供充分的同源性。
在一个实施方案中，本公开描述了用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括向细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述细胞的基因组中的靶序列处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。细胞包括但不限于人类、动物、细菌、真菌、昆虫和植物细胞以及通过本文所述的方法产生的植物和种子。待编辑的核苷酸可位于由Cas内切核酸酶识别和切割的靶位点之内或之外。在一个实施方案中，所述至少一个核苷酸修饰不是在由Cas内切核酸酶识别和切割的靶位点处的修饰。在另一个实施方案中，待编辑的至少一个核苷酸与基因组靶位点之间存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、900或1000个核苷酸。
在另一个实施方案中，本公开描述了用于编辑植物细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种玉米优化的Cas9内切核酸酶，其中所述玉米优化的Cas9内切核酸酶能够在所述植物基因组中的moCas9靶序列处提供双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
在另一个实施方案中，本公开描述了用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括向细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
在基因组编辑的另一实施方案中，在本文中公开了内源性烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的编辑(实施例16)。在此实施方案中，多核苷酸修饰模板(EPSPS多核苷酸修饰模板)包括EPSPS基因的部分片段(并且因此其本身不编码全功能性的EPSPS多肽)。EPSPS多核苷酸修饰模板含有负责形成T102I/P106S(TIPS)双突变体的三个点突变(Funke，T等人，J.Biol.Chem.2009，284：9854-9860)，所述双突变体为表达为EPSPS双突变体转基因的转基因植物提供草甘膦耐受性。
如本文所定义，“草甘膦”包括N-膦酰甲基甘氨酸的任意除草有效形式(包括其任意盐)，导致在植物中产生草甘膦阴离子的其它形式，以及膦酰甲基甘氨酸家族中的任意其它除草剂。
在本公开的一个实施方案中，epsps突变植物通过本文描述的方法产生，所述方法包括：a)向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述Cas内切核酸酶在植物基因组中的epsps(烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)基因组序列中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述epsps基因组序列的至少一个核苷酸修饰；b)由(a)的植物细胞获得植物；c)评估(b)的植物中所述至少一个核苷酸修饰的存在；以及d)选择表现出草甘膦抗性的子代植物。
当表现出抗除草剂性增强的植物经受除草剂，并且与由适当的对照植物提供的剂量/响应曲线比较，其剂量/响应曲线向右偏移时，证明抗除草剂性增强。此类剂量/响应曲线具有绘制在x轴上的“剂量”和绘制在y轴上的“伤害率”、“除草效果”等等。实质上抵抗除草剂的植物当经受农业界通常用来杀灭田地中杂草的浓度和比率的除草剂时，表现出很少的(如果有的话)脱色、枯斑、溶解性病变、失绿病斑或者其它病变并且不矮化、凋萎或者畸变。术语抗性和耐受性可互换地使用。
图12示出基因组编辑程序中所使用的组分的示意图。向植物细胞提供玉米优化的Cas内切核酸酶、向导RNA和多核苷酸修饰模板。例如，如图12所示，相比于待编辑的EPSPS基因组序列，该多核苷酸修饰模板包含三个核苷酸修饰(用箭头指出)。这三个核苷酸修饰导致以下氨基酸改变：T-102改变为I-102，P-106改变为S-106，所以被称为TIPS突变。第一点突变由密码子序列ACT中的C核苷酸被T核苷酸置换引起；第二点突变由相同密码子序列ACT中的T核苷酸被C核苷酸置换，形成异亮氨酸密码子ATC引起；第三点突变由密码子序列CCA中的第一个C核苷酸被T核苷酸置换，形成丝氨酸密码子TCA引起(图12)。
在一个实施方案中，本公开描述了用于产生epsps(烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)突变植物的方法，所述方法包括：a)向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述Cas内切核酸酶在植物基因组中的epsps基因组序列内的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述epsps基因组序列的至少一个核苷酸修饰；b)由(a)的植物细胞获得植物；c)评估(b)的植物中所述至少一种核苷酸修饰的存在；以及d)筛选不含所述向导RNA和Cas内切核酸酶的(c)的子代植物。
待编辑的核苷酸序列可为对于正在被编辑的细胞为内源的、人工、预先存在、或转基因的序列。例如，细胞的基因组中的核苷酸序列可为稳定地掺入到细胞基因组中的天然基因、突变基因、非天然基因、外来基因、或转基因。编辑此类核苷酸可得到另外的所需表型或基因型。
使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的调控序列修饰
在一个实施方案中，待修饰的核苷酸序列可为调控序列，诸如启动子，其中编辑启动子包括将启动子或启动子片段替换(也称为“启动子更换”或“启动子替换”)为不同的启动子(也称为替换启动子)或启动子片段(也称为替换启动子片段)，其中启动子替换导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：增加的启动子活性、增加的启动子组织特异性、降低的启动子活性、降低的启动子组织特异性、新的启动子活性、诱导型启动子活性、延长的基因表达窗口、同一细胞层或其它细胞层中基因表达的时机或发育进度的修饰(诸如但不限于延长玉米花药的绒毡层中基因表达的时机(1998年11月17日公布的US 5,837,850))、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的缺失或添加。待修饰的启动子(或启动子片段)可为对于正在编辑的细胞为内源的、人工、预先存在、或转基因的启动子(或启动子片段)。替换启动子(或替换启动子片段)可为对于正在编辑的细胞为内源的、人工、预先存在、或转基因的启动子(或启动子片段)。
在一个实施方案中，核苷酸序列可为启动子，其中编辑启动子包括将ARGOS 8启动子替换为玉米(Zea mays)GOS2 PRO：GOS2-内含子启动子。
在一个实施方案中，核苷酸序列可为启动子，其中编辑启动子包括将天然EPSPS1启动子替换为植物泛素启动子。
在一个实施方案中，核苷酸序列可为启动子，其中编辑启动子包括将内源玉米NPK1启动子替换为胁迫诱导型玉米RAB17启动子。
在一个实施方案中，核苷酸序列可为启动子，其中待编辑启动子选自：玉米(Zeamays)-PEPC 1启动子(Kausch等人，Plant Molecular Biology，45：1-15，2001)、玉米(Zeamays)泛素启动子(UBI1ZM PRO，Christensen等人，plant Molecular Biology 18：675-689，1992)、玉米(Zea mays)-Rootmet2启动子(US 7,214,855)、稻肌动蛋白启动子(OS-ACTIN PRO，US5641876；McElroy等人，The Plant Cell，第2卷，163-171，1990年2月)、高粱RCC3启动子(提交于2012年2月13日的US 2012/0210463)、玉米(Zea mays)-GOS2启动子(US6,504,083)、玉米(Zea mays)-ACO2启动子(提交于2014年3月14日的美国申请14/210,711)或者玉米(Zea mays)-油质蛋白启动子(US 8466341 B2)。
在另一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸修饰模板或供体DNA序列组合使用以允许将启动子或启动子元件插入到目的基因组核苷酸序列中，其中启动子插入(或启动子元件插入)导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：增加的启动子活性(增加的启动子强度)、增加的启动子组织特异性、降低的启动子活性、降低的启动子组织特异性、新的启动子活性、诱导型启动子活性、延长的基因表达窗口、基因表达的时机或发育进度的修饰、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待插入的启动子元件可为但不限于启动子核心元件(诸如但不限于CAAT盒、CCAAT盒、普里布诺盒和/或TATA盒)、用于诱导型表达的翻译调控序列和/或阻遏子系统(诸如TET操纵子阻遏子/操纵子/诱导物元件、或磺酰脲类(Su)阻遏子/操纵子/诱导物元件)。脱水响应元件(DRE)首先被鉴定为干旱响应基因rd29A的启动子中的顺式作用启动子元件，其包含9bp保守核心序列，TACCGACAT(Yamaguchi-Shinozaki，K.，和Shinozaki，K.(1994)Plant Cell 6，251264)。将DRE插入到内源启动子中可赋予下游基因干旱诱导型表达。另一个示例是ABA响应元件(ABRE)，其包含据发现存在于许多ABA和/或胁迫调控的基因中的(C/T)ACGTGGC共有序列(Busk P.K.，Pages M.(1998)Plant Mol.Biol37：425-435)。将35S增强子或MMV增强子插入到内源启动子区中将增加基因表达(美国专利5196525)。待插入的启动子(或启动子元件)可为对于正在编辑的细胞为内源的、人工、预先存在、或转基因的启动子(或启动子元件)。
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于在内源FMT1启动子前面插入增强子元件(诸如但不限于花椰菜花叶病毒35S增强子)以增强FTM1的表达。
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于将TET操纵子阻遏子/操纵子/诱导物系统的组分、或磺酰脲类(Su)阻遏子/操纵子/诱导物系统的组分插入到植物基因组中，以生成或控制诱导型表达系统。
在另一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于允许启动子或启动子元件的缺失，其中启动子缺失(或启动子元件缺失)导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：永久失活的基因座、增加的启动子活性(增加的启动子强度)、增加的启动子组织特异性、降低的启动子活性、降低的启动子组织特异性、新的启动子活性、诱导型启动子活性、延长的基因表达窗口、基因表达的时机或发育进度的修饰、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待缺失的启动子元件可为但不限于启动子核心元件、启动子增强子元件或35S增强子元件(如实施例32中所述)。待缺失的启动子或启动子片段对于正在编辑的细胞可为内源的、人工、预先存在、或转基因的。
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于使存在于玉米基因组中的ARGOS 8启动子缺失，如本文所述。
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于使存在于植物基因组中的35S增强子元件缺失，如本文所述。
使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的终止子修饰
在一个实施方案中，待修饰的核苷酸序列可为终止子，其中编辑终止子包括将终止子或终止子片段替换(也称为“终止子交换”或“终止子替换”)为不同的终止子(也称为替换终止子)或终止子片段(也称为替换终止子片段)，其中终止子替换导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：增加的终止子活性、增加的终止子组织特异性、降低的终止子活性、降低的终止子组织特异性、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的缺失或添加。待修饰的终止子(或终止子片段)可为对于正在编辑的细胞为内源的、人工、预先存在、或转基因的终止子(或终止子片段)。替换终止子(或替换终止子片段)可为对于正在编辑的细胞为内源的、人工、预先存在、或转基因的终止子(或终止子片段)。
在一个实施方案中，待修饰的核苷酸序列可为终止子，其中待编辑的终止子选自来自玉米Argos 8或SRTF18基因的终止子，或其它终止子，诸如马铃薯PinII终止子、高粱肌动蛋白终止子(SB-ACTIN TERM，2013年12月公布的WO 2013/184537 A1)、高粱SB-GKAFTERM(WO2013019461)、稻T28终止子(OS-T28TERM，WO 2013/012729A2)、AT-T9TERM(WO2013/012729 A2)或GZ-W64A TERM(US7053282)。
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸修饰模板或供体DNA序列组合使用以允许将终止子或终止子元件插入到目的基因组核苷酸序列中，其中终止子插入(或终止子元件插入)导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：增加的终止子活性(增加的终止子强度)、增加的终止子组织特异性、降低的终止子活性、降低的终止子组织特异性、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。
待插入的终止子(或终止子元件)可为对于正在编辑的细胞为内源的、人工、预先存在、或转基因的终止子(或终止子元件)。
在另一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于允许终止子或终止子元件的缺失，其中终止子缺失(或终止子元件缺失)导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：增加的终止子活性(增加的终止子强度)、增加的终止子组织特异性、降低的终止子活性、降低的终止子组织特异性、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待缺失的终止子或终止子片段对于正在编辑的细胞可为内源的、人工、预先存在、或转基因的。
使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的另外的调控序列修饰
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于修饰或替换细胞的基因组中的调控序列。调控序列为能够增加或降低生物体内特定基因的表达和/或能够改变生物体内基因的组织特异性表达的核酸分子的区段。调控序列的示例包括但不限于3’UTR(非翻译区)区、5’UTR区、转录激活因子、转录增强子、转录阻遏子、翻译阻遏子、剪接因子、miRNAs、siRNA、人工miRNA、启动子元件、CAMV 35S增强子、MMV增强子元件(2013年3月11日提交的PCT/US14/23451)、SECIS元件、聚腺苷酸化信号、以及聚泛素化位点。在一些实施方案中，编辑(修饰)或替换调控元件导致改变的蛋白质翻译、RNA切割、RNA剪接、转录终止或翻译后修饰。在一个实施方案中，可鉴定启动子内的调控元件并且可编辑或修饰这些调控元件，从而优化这些调控元件对启动子的上调或下调。
在一个实施方案中，待修饰的目的基因组序列是聚泛素化位点，其中聚泛素化位点的修饰导致蛋白质降解速度的修饰。泛素标签使蛋白质通过蛋白酶体或自体吞噬降解。已知蛋白酶体抑制剂导致蛋白质生产过剩。对编码目的蛋白质的DNA序列的修饰可导致目的蛋白质的至少一个氨基酸修饰，其中所述修饰允许蛋白质的聚泛素化(翻译后修饰)，从而导致对蛋白质降解的修饰。
在一个实施方案中，待修饰的目的基因组序列为玉米EPSPS基因上的聚泛素化位点，其中聚泛素化位点经修饰后，由于EPSPS蛋白质降解速度减慢，所以蛋白质含量增加。
在一个实施方案中，待修饰的目的基因组序列为内含子位点，其中该修饰包括将内含子增强基序插入到内含子中，这导致对包含所述内含子的基因的转录活性的调节。
在一个实施方案中，待修饰的目的基因组序列为内含子位点，其中该修饰包括将大豆EPSP1内含子替换为大豆泛素内含子1，如本文所述(实施例25)。
在一个实施方案中，待修饰的目的基因组序列为内含子或UTR位点，其中该修饰包括将至少一个微RNA插入到所述内含子或UTR位点中，其中包含内含子或UTR位点的基因的表达还导致所述微RNA的表达，这继而可沉默由微RNA靶向的任何基因而不破坏包含所述内含子的天然基因/转基因的基因表达。
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于允许锌指转录因子的缺失或突变，其中锌指转录因子的缺失或突变导致或允许形成显性阴性锌指转录因子突变体(Li等人，2013Rice zinc finger protein DST enhances grain productionthrough controlling Gn1a/OsCKX2expression PNAS 110：3167-3172)。在锌指结构域下游插入单个碱基对将导致移码并且产生新蛋白质，该新蛋白质可在没有转录活性的情况下仍结合到DNA。突变型蛋白将竞争结合到细胞分裂素氧化酶基因启动子并且阻断细胞分裂素氧化酶基因的表达。细胞分裂素氧化酶基因表达的减少将提高细胞分裂素水平并且促进稻中的稻穗生长和玉米中的穗生长，并且增加在正常和胁迫条件下的收率。
使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统修饰剪接位点和/或引入替代剪接位点
蛋白质合成使用由前mRNA分子经受成熟过程产生的mRNA分子。通过添加聚A尾对前mRNA分子进行加帽、剪接和稳定化。真核细胞进化出复杂的剪接过程，该过程导致初始前mRNA分子的备选变体。真核细胞中的一些可能不产生用于蛋白质合成的功能模板。在玉米细胞中，剪接过程受外显子-内含子连接位点处的剪接位点影响。典型的剪接位点的示例是AGGT。基因编码序列可包含多个替代剪接位点，其可影响前mRNA成熟过程的总体效率并且因此可限制细胞中的蛋白质积聚。向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸修饰模板组合使用来编辑目的基因，以便在所述连接区或剪接位点的任意变型处引入典型的剪接位点，所述剪接位点改变前mRNA分子的剪接模式。
在一个实施方案中，待修饰的目的核苷酸序列为玉米EPSPS基因，其中基因的修饰包括修饰可选的剪接位点，从而提高功能基因转录物和基因产物(蛋白质)的产量。
在一个实施方案中，待修饰的目的核苷酸序列为基因，其中基因的修饰包括编辑可选地剪接的基因的内含子边界以改变剪接变体的积聚。
使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统修饰编码目的蛋白质的核苷酸序列
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于修饰或替换细胞的基因组中的编码序列，其中修饰或替换导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：增加的蛋白(酶)活性、增加的蛋白功能性、降低的蛋白活性、降低的蛋白功能性、位点特异性突变、蛋白结构域更换、蛋白敲除、新的蛋白功能性、修饰的蛋白功能性。
在一个实施方案中，蛋白敲除是由于将终止密码子引入到目的编码序列中造成的。
在一个实施方案中，蛋白敲除是由于目的编码序列中的起始密码子的缺失造成的。
使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的氨基酸和/或蛋白质融合
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以将编码第一蛋白质的第一编码序列融合到编码细胞基因组中的第二蛋白质的第二编码序列，其中蛋白质融合导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：增加的蛋白(酶)活性、增加的蛋白功能性、降低的蛋白活性、降低的蛋白功能性、新的蛋白功能性、修饰的蛋白功能性、新的蛋白定位、新的蛋白表达时机、修饰的蛋白表达模式、嵌合蛋白、或具有显性表型功能性的修饰的蛋白。
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以将编码叶绿体定位信号的第一编码序列融合到编码目的蛋白质的第二编码序列，其中蛋白质融合导致将目的蛋白质靶向到叶绿体。
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以将编码叶绿体定位信号的第一编码序列融合到编码目的蛋白质的第二编码序列，其中蛋白质融合导致将目的蛋白质靶向到叶绿体。
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以将编码叶绿体定位信号(例如，叶绿体转运肽)的第一编码序列融合到第二编码序列，其中蛋白质融合导致具有显性表型功能性的修饰的蛋白质。
通过使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统在目的基因中表达反向重复进行的 基因沉默
在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸序列组合使用以将反向基因片段插入到生物体基因组中的目的基因中，其中插入反向基因片段可允许在体内创建反向重复(发夹)并且导致所述内源性基因的沉默。
在一个实施方案中，插入反向基因片段可导致在基因的天然(或修饰的)启动子和/或天然基因的天然5’端中形成体内创建的反向重复(发夹)。反向基因片段还可包含内含子，其可导致所靶向基因的增强沉默。
用于性状基因座表征的基因组缺失
植物育种中的性状定位通常导致检测其中含有控制目的性状表达的一个或多个基因的染色体区域。对于质量性状，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于消除所鉴定的染色体区域中的候选基因，以确定所述基因的缺失是否影响性状的表达。对于数量性状，目的性状的表达由在一个或多个染色体上不同作用大小、复杂性和统计显著性的多个数量性状基因座(QTL)控制。在负面效应或有害QTL区域影响复合性状的情况下，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于消除由标记辅助的精细定位界定的整个区域，以及用于靶向特定区域来进行其选择性消除或重排。类似地，存在/不存在变异(PAV)或拷贝数变异(CNV)可使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统用选择性基因组缺失操纵。
在一个实施方案中，目的区域可侧接有两个独立的向导多核苷酸/CAS内切核酸酶靶序列。切割将同时进行。缺失事件将为不具有目的区域的两个染色体末端的修复。可选结果将包括目的区域的倒位，在切割位点处的突变以及目的区域的复制。
用于识别在其基因组中在所述靶位点处包含整合的目的多核苷酸的至少一个植 物细胞的方法。
还提供了用于鉴定在其基因组中在所述靶位点处包含整合的目的多核苷酸的至少一个植物细胞的方法。多种方法可用于鉴定在靶位点处或附近具有对基因组的插入的那些植物细胞，而无须使用可筛选的标记表型。这种方法可认为是直接分析靶序列以检测靶序列中的任何变化，包括但不限于PCR方法、测序方法、核酸酶消化、DNA印迹法以及它们的任何组合。参见例如，美国专利申请12/147,834以本文所述方法所需的程度以引用方式并入本文中。该方法还包括由包含整合到其基因组中的目的多核苷酸的植物细胞再生植物。该植物可为不育的或能育的。已经认识到任何目的多核苷酸均可在靶位点处提供、整合到植物基因组中，并且在植物中表达。
目的多核苷酸/多肽包括但不限于抗除草剂性编码序列、杀虫编码序列、杀线虫编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物和生物胁迫耐受性编码序列、或修饰植物性状诸如收率、谷粒质量、营养成分、淀粉质量和数量、固氮和/或氮利用、脂肪酸以及含油量和/或油组成的序列。更具体的目的多核苷酸包括但不限于改善作物收率的基因，改善作物合意性的多肽，编码赋予对非生物胁迫(诸如干旱、氮、温度、盐度、有毒金属或微量元素)的抗性的蛋白或者赋予对毒素(诸如杀虫剂和除草剂)的抗性的那些蛋白或者赋予对生物胁迫(诸如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫入侵)的抗性及对与这些生物体相关联疾病的发展的抗性的那些蛋白的基因。目的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(诸如锌指)、涉及通信的那些基因(诸如激酶)和涉及持家的那些基因(诸如热激蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农学、抗昆虫性、病害抗性、抗除草剂性、能育性或不育性、谷粒特性和商业产品重要的性状的基因。一般而言，目的基因包括涉及油、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响籽粒大小、蔗糖载量等的那些，所述性状可与其它性状堆叠或者组合使用，所述其它性状诸如但不限于本文所述的抗除草剂性。
除了使用传统的育种方法外，还可通过遗传方式改变农学上重要的性状，诸如油含量、淀粉含量和蛋白质含量。修饰包括增加油酸、饱和油与不饱和脂的含量，提升赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸，以及修饰淀粉。在美国专利5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中描述了Hordothionin蛋白修饰，这些专利都以引用方式并入本文。另一个示例是美国专利5,850,016中所述的由大豆2S白蛋白基因编码的富含赖氨酸和/或富含硫的种子蛋白，以及Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中描述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，这些文献的公开内容都以引用方式并入本文。
商业性状也能被编码在目的多核苷酸上，其能够增加例如，用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白的表达。转化的植物的另一个重要商业用途是生产聚合物和生物塑料诸如美国专利5,602,321中所述的。基因诸如β-酮硫酶、PHBase(聚羟基丁酸酯合酶)、以及乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物，以增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因源自大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂(1996年11月1日提交的美国申请序列号08/740,682，以及WO 98/20133，这些专利的公开内容以引用方式并入本文)。其它蛋白包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，诸如来自向日葵种子的蛋白(Lilley等人(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable ProteinUtilization in Human Foods and Animal Feedstuffs，Applewhite编辑(American OilChemists Society，Champaign，Illinois)，第497-502页)；将该文献以引用方式并入本文)；来自玉米的蛋白(Pedersen等人(1986)J. Biol.Chem.261：6279)；Kirihara等人(1988)Gene 71：359；这些文献都以引用方式并入本文)；以及来自稻的蛋白(Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.12：123，这篇文献以引用方式并入本文)。其它农学上重要的基因编码胶乳、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
改善作物收率的多核苷酸包括矮化基因，诸如Rht1和Rht2(Peng等人(1999)Nature 400：256-261)，以及增加植物生长的那些，诸如铵诱导型谷氨酸脱氢酶。改善作物合意性的多核苷酸包括例如允许植物具有减少的饱和脂肪含量的那些多核苷酸、提高植物营养价值的那些多核苷酸、以及增加谷粒蛋白的那些多核苷酸。改善耐盐性的多核苷酸是增加或允许植物在与已引入耐盐基因的该植物的天然环境相比更高盐度的环境中生长的那些多核苷酸。
影响氨基酸生物合成的多核苷酸/多肽包括例如邻氨基苯甲酸盐合酶(AS；EC4.1.3.27)，该酶催化植物、真菌和细菌中从芳族氨基酸途径分支到色氨酸生物合成的第一反应。在植物中，色氨酸的生物合成的化学过程是区室化于叶绿体中的。参见例如美国公布20080050506，这篇文献以引用方式并入本文。另外的目的序列包括分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)，其是指编码催化分支酸转化为丙酮酸和pHBA的酶的基因。表征最充分的CPL基因已从大肠杆菌(E.coli)中分离并具有GenBank登录号M96268。参见美国专利7,361,811，其以引用方式并入本文。
这些目的多核苷酸序列可编码涉及提供病害抗性或害虫抗性的蛋白。所谓“病害抗性”或“害虫抗性”意指植物避开作为植物-病原体相互作用的后果的有害症状。害虫抗性基因可编码针对严重导致收率下降的害虫诸如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等的抗性。病害抗性基因和抗昆虫性基因，诸如用于抗细菌保护的溶菌酶或天蚕抗菌肽(cecropin)，或者用于抗真菌保护的蛋白质诸如防御素、葡聚糖酶或几丁质酶，或者用于防治线虫或昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、凝集素或糖苷酶，都是可用的基因产物的示例。编码病害抗性性状的基因包括解毒基因，诸如抗伏马毒素(美国专利5,792,931)；无毒性(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science 266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；和Mindrinos等人(1994)Cell 78：1089)；等等。抗昆虫性基因可编码针对严重导致收率下降的害虫(诸如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等)的抗性。这种基因包括例如苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(美国专利5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene 48：109)；等等。
“抗除草剂性蛋白”或由“抗除草剂性编码核酸分子”表达生成的蛋白质包括这样的蛋白质，其赋予细胞与未表达该蛋白质的细胞相比耐受更高浓度除草剂的能力，或赋予细胞与未表达该蛋白质的细胞相比对某种浓度除草剂耐受更长时间的能力。抗除草剂性性状可通过如下基因引入到植物中：编码对乙酰乳酸合酶(ALS)起到抑制作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因、编码对谷氨酰胺合酶起到抑制作用的除草剂诸如草胺膦或basta的抗性的基因(如，bar基因)、对草甘膦的抗性的基因(如，EPSP合酶基因和GAT基因)、对HPPD抑制剂的抗性的基因(如，HPPD基因)或者本领域已知的其它此类基因。参见例如美国专利7,626,077、5,310,667、5,866,775、6,225,114、6,248,876、7,169,970、6,867,293和美国临时申请61/401,456，将所述专利中的每个以引用的方式并入本文。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，并且ALS基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。
不育性基因也可编码在表达盒中，并且为物理去雄提供备选方案。以此类方式使用的基因的示例包括雄性能育性基因，诸如MS26(参见例如美国专利7,098,388、7,517,975、7,612,251)、MS45(参见例如美国专利5,478,369、6,265,640)或MSCA1(参见例如美国专利7,919,676)。玉米植物(玉米(Zea mays L.))可通过自花授粉和异花授粉两种技术来进行育种。在相同植物上，玉米具有位于雄穗上的雄花，以及位于雌穗上的雌花。其可自花授粉(“自交”)或异花授粉。当风将花粉从雄穗吹至从初始雌穗顶部突出的穗丝时在玉米中发生天然的授粉。授粉可通过本领域的技术人员已知的技术容易地控制。玉米杂交体的开发需要纯合近交系的开发、这些近交系的杂交和杂交的评估。谱系选择和轮回选择是用于从群体开发近交系的两种育种方法。育种程序将来自两种或更多种近交系或各种广泛基础来源的所需性状结合到育种库中，从育种库通过自交和选择所需表型来开发新的近交系。杂交玉米品种是两个此类近交系的杂交，所述近交系中的每个可能具有一种或多种在另一近交系中缺乏的所需特性，或补充另一近交系的所需特性。使新的近交系与其它近交系杂交，并且对来自这些杂交的杂交体进行评估以确定哪些具有商业潜力。第一代杂交子代称为F1。F1杂交体比其自交亲本更有活力。该杂交体活力或者杂种优势可以多种方式体现，包括增加的营养生长和提高的收率。
杂交玉米种子可通过结合了人工去雄的雄性不育性系统产生。为了产生杂交种子，将雄穗从生长的雌性近交亲本移除，其可以与雄性近交亲本成交替行的多种模式种植。因此，在与外来玉米花粉的来源充分隔离的前提条件下，雌性近交株的雌穗将仅通过来自雄性近交株的花粉受精。因此所得种子是杂交体(F1)并且将形成杂交植物。
影响植物发育的田地变化可导致植物在雌性亲本的人工去雄完成之后抽穗。或者，雌性近交植物雄穗可能无法在去雄过程期间被完全移除。在任何情况下，结果是雌性植物将成功地散出花粉并且一些雌性植物将自花授粉。这将导致雌性近交株的种子连同正常产生的杂交种子一起收获。雌性近交株种子不表现出杂种优势并且因此不如F1种子高产。此外，雌性近交株种子的存在对于生产杂交体的公司可能意味着种质安全风险。
另选地，雌性近交株可通过机器机械地去雄。机械去雄大致如手工去雄一样可靠，但是更快并且成本更低。然而，大多数去雄机器比手工去雄对植物产生更多损害。因此，目前没有一种去雄形式是完全令人满意的，并且仍然需要进一步降低生产成本的替代品以及消除杂交种子生产中雌性亲本的自花授粉。
造成植物中雄性不育性的突变有潜力可用于作物植物(诸如玉米)的杂交种子生产的方法中，并且可通过以下方式来降低生产成本：消除耗费劳力地从用作杂交亲本的母本植物移除雄花(也称为去雄)的需要。已有多种方法可产生造成玉米中雄性不育性的突变，诸如X射线或紫外线照射、化学处理或转座元件插入(ms23、ms25、ms26、ms32)(Chaubal等人(2000)Am J Bot 87：1193-1201)。通过能育性/不育性“分子开关”对能育性基因进行条件调控可增强设计用于作物改良的新雄性不育性系统的选择性(Unger等人(2002)Transgenic Res 11：455-465)。
除了识别影响雄性能育性的新型基因之外，还需要提供产生遗传雄性不育性的可靠系统。
在美国专利5,478,369中，描述了一种方法，通过该方法将Ms45雄性能育性基因加标签并克隆在玉米9号染色体上。此前，已描述了9号染色体上的从未被克隆和测序的雄性能育性基因ms2。该基因不是‘369专利中提到的基因的等位基因。参见Albertsen，M.和Phillips，R.L.，“Developmental Cytology of 13Genetic Male Sterile Loci inMaize”Canadian Journal of Genetics&Cytology 23：195-208(1981年1月)。在此之前克隆的仅有的能育性基因是Aarts等人(出处同上)描述的拟南芥基因。
随后发现的对于雄性能育性重要的基因的示例有很多并且包括拟南芥败育小孢子(AMS)基因(Sorensen等人，The Plant Journal(2003)33(2)：413-423)；拟南芥MS1基因(Wilson等人，The Plant Journal(2001)39(2)：170-181)；NEF1基因(Ariizumi等人，ThePlant Journal(2004)39(2)：170-181)；拟南芥AtGPAT1基因(Zheng等人，The Plant Cell(2003)15：1872-1887)；拟南芥dde2-2突变被示为缺乏丙二烯氧合酶基因(Malek等人，Planta(2002)216：187-192)；拟南芥匿名(faceless)花粉-1基因(flp1)(Ariizumi等人，Plant Mol.Biol.(2003)53：107-116)；拟南芥雄性性母细胞死亡1基因(Yang等人，ThePlant Cell(2003)15：1281-1295)；绒毡层特异性锌指基因TAZ1(Kapoor等人，The PlantCell(2002)14：2353-2367)；以及绒毡层决定子1基因(Lan等人，The Plant Cell(2003)15：2792-2804)。
其它已知的来自玉米(Zea mays)的雄性能育性突变体或基因在美国专利7,919,676中列出，该专利以引用方式并入本文。
其它基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些基因。
此外，已经认识到目的多核苷酸可还包含与所靶向的目的基因序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的反义序列。构建反义核苷酸以与对应的mRNA杂交。可对反义序列作出修饰，只要该序列能与对应的mRNA杂交并干扰其表达。以此方式，可使用与对应的反义序列具有70％、80％或85％序列同一性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般而言，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或者更多个核苷酸的序列。
另外，目的多核苷酸还可以有义取向使用来抑制植物中的内源性基因的表达。用于使用有义取向的多核苷酸抑制植物中的基因表达的方法是本领域已知的。该方法通常涉及用包含这样的启动子的DNA构建体转化植物，该启动子可操作地连接至对应于该内源性基因的转录物的核苷酸序列的至少一部分，能驱动在植物中的表达。通常，这种核苷酸序列与内源性基因的转录物的序列具有实质的序列同一性，通常高于约65％的序列同一性、约85％的序列同一性或高于约95％的序列同一性。参见美国专利5,283,184和5,034,323；将这些专利以引用方式并入本文。
目的多核苷酸还可以是表型标记。表型标记是可筛选或可选择的标记，其包括可视标记和选择性标记，无论它是阳性还是阴性选择性标记。可使用任何表型标记。具体地讲，可选择的或可筛选的标记包含这样的DNA区段，该DNA区段使得可以常常在特定条件下鉴定或选择或不选择含有它的分子或细胞。这些标记可编码活性，诸如但不限于RNA、肽或蛋白质的产生，或者可为RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或者组合物等提供结合位点。
选择性标记的示例包括但不限于包含限制性酶位点的DNA区段；编码提供对于有毒化合物的抗性的产物的DNA区段，所述有毒化合物包括抗生素，诸如壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、Basta、新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)；编码另外缺乏受体细胞的产物的DNA区段(例如，tRNA基因、营养缺陷标记)；编码可易于鉴定的产物的DNA区段(例如，表型标记，诸如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)，青色荧光蛋白(CFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，红色荧光蛋白(RFP)，以及细胞表面蛋白)；生成用于PCR的新引物位点(例如，之前尚未并置的两个DNA序列的并置)的DNA区段；包含未受限制性内切核酸酶或其它DNA修饰酶、化学品等作用或者受其作用的DNA序列的DNA区段；以及包含特异性修饰(例如，甲基化)所需的DNA序列的DNA区段，该特异性修饰使得可以鉴定该DNA序列。
另外的选择性标记包括能赋予对除草化合物诸如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。参见例如Yarranton，(1992)Curr Opin Biotech3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff，(1992)Mol Microbiol 6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell48：555-66；Brown等人，(1987)Cell 49：603-12；Figge等人，(1988)Cell 52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science 248：480-3；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-21；Labow等人，(1990)Mol Cell Biol 10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-6；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res 19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)Topics Mol Struc Biol 10：143-62；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob Agents Chemother 35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry 27：1094-104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Bonin，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-51；Oliva等人，(1992)Antimicrob Agents Chemother36：913-9；Hlavka等人，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature 334：721-4。也可以在一种或多种基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质表达。转化的植物的另一个重要商业用途是生产聚合物和生物塑料诸如美国专利5,602,321中所述。基因诸如β-酮硫酶、PHBase(聚羟基丁酸酯合酶)、以及乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和植物产物，以及来自包括原核生物和其它真核生物的其它来源的那些产物。这类产物包括酶、辅因子、激素等。可增加蛋白质的水平，特别是具有能够提高植物营养价值的改善氨基酸分布的经修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。
目的转基因、重组DNA分子、DNA序列以及目的多核苷酸可包含一个或者多个用于基因沉默的DNA序列。涉及在植物中表达DNA序列的基因沉默方法是本领域已知的，包括但不限于共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA(hpRNA)干扰、含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰、转录基因沉默以及微RNA(miRNA)干扰。
如本文所用，“核酸”是指多核苷酸，并且包括脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的单链或者双链聚合物。核酸也可包括片段和修饰的核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用，表示单链或者双链的RNA和/或DNA聚合物，其任选含有合成的、非天然的或者改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5′单磷酸形式存在)通过它们的单字母命名指代如下：“A”指代腺苷或脱氧腺苷(分别对于RNA或者DNA)，“C”指代胞嘧啶或脱氧胞嘧啶，“G”指代鸟苷或脱氧鸟苷，“U”指代尿苷，“T”指代脱氧胸苷，“R”指代嘌呤(A或G)，“Y”指代嘧啶(C或者T)，“K”指代G或者T，“H”指代A或者C或者T，“I”指代肌苷，并且“N”指代任何核苷酸。
“开放阅读框”缩写为ORF。
术语“功能上等同的亚片段”和“功能等同亚片段”在本文中可互换使用。这些术语指代分离的核酸片段的这样的部分或者亚序列，其中改变基因表达或者产生某种表型的能力得到保持，无论该片段或者亚序列是否编码活性酶。例如，该片段或者亚片段可用于设计在转化的植物中产生所需表型的基因。可以通过将该核酸片段或其亚片段以相对于植物启动子序列有义或反义的方向连接，从而设计出用于抑制的基因，其中所述核酸片段或其亚片段无论是否编码活性酶均可。
术语“保守结构域”或者“基序”是指在进化上相关的蛋白质的经比对的序列上特定位置处保守的一组氨基酸。虽然其它位置处的氨基酸在同源蛋白质之间可变，但在特定位置处高度保守的氨基酸表示对于蛋白质的结构、稳定性或者活性而言必需的氨基酸。由于它们在蛋白质同源物家族的经比对的序列中的高保守度而被鉴定，它们可用作鉴定物或者“识别标志(signature)”，以测定具有新确定的序列的蛋白质是否属于之前鉴定的蛋白质家族。
多核苷酸和多肽序列、其变体以及这些序列的结构关系，可用术语“同源性”、“同源的”、“实质上相同的”、“实质上相似的”和“实质上对应”描述，这些术语在本文中可互换使用。这些是指多肽或者核酸片段，其中一个或者多个氨基酸或者核苷酸碱基的变化不影响分子的功能，诸如介导基因表达或者产生某种表型的能力。这些术语还指代核酸片段的这样的修饰，相对于初始的未修饰的片段，所述修饰不实质上改变所得的核酸片段的功能性质。这些修饰包括在核酸片段中缺失、置换和/或插入一个或多个核苷酸。
所涵盖的实质上相似的核酸序列，可通过其与本文所例示的序列杂交，或者与本文所公开的且与任何本文所公开的核酸序列在功能上等同的核苷酸序列的任何部分杂交(在中等严格条件下，例如0.5X SSC，0.1％SDS，60℃)的能力来定义。可调整严格条件以筛选中等相似片段，诸如来自远缘生物的同源序列，以及高度相似片段，诸如来自近缘生物的复制功能酶的基因。杂交后的洗涤决定了严格条件。
术语“选择性杂交”包括指代在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度相比于其与非靶核酸序列杂交的程度具有更高的可检测程度(例如，至少2倍于背景)，并且实质上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少80％的序列同一性，或者90％的序列同一性，最多至100％并包括100％的序列同一性(即完全互补)。
术语“严格条件”或者“严格杂交条件”包括指代在体外杂交测定中探针将与其靶序列选择性杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，任选地长度少于500个核苷酸。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01M至1.0M钠离子浓度(或者其它盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少约30℃，对长探针(例如大于50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。示例性的低严格条件包括用30％-35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃下杂交并在1倍至2倍SSC(20倍SSC＝3.0M NaCI/0.3M柠檬酸三钠)中在50-55℃下洗涤。示例性的中等严格条件包括在40％-45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交并在0.5倍至1倍SSC中在55-60℃下洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交并在0.1倍SSC中在60-65℃下洗涤。
在核酸或多肽序列的情形中，“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗口范围为获得最大对应而比对时两条序列中相同的核酸碱基或者氨基酸残基。
术语“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸或者多肽序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以用于两个序列的最佳比对。通过以下方式计算这种百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。序列同一性百分比的可用示例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或者95％，或者50％至100％的任何整数百分数。这些同一性可用本文描述的任何程序确定。
序列比对和百分比同一性或者相似性计算可用多种被设计用于检测同源序列的比较方法来确定，包括但不限于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序。在本申请的上下文中，应理解，在使用序列分析软件进行分析的情况中，除非另有指明，否则分析的结果将基于所提到的程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将意指软件第一次初始化时初始装载在该软件中的任何数值或者参数组。
“Clustal V比对方法”对应于标记为Clustal V的比对方法(通过以下文献描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-153；Higgins等人，(1992)Comput Appl Biosci 8：189-191并且可见于LASERGENE生物信息学计算软件包的MegAlignTM程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)。对于多重比对，默认值对应于空位罚分＝10，空位长度罚分＝10。使用Clustal方法进行蛋白质序列的逐对比对和百分比同一性计算的默认参数是KTUPLE＝1、空位罚分＝3，窗口＝5，对角线保存(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、空位罚分＝5，窗口＝4，对角线保存＝4。在用Clustal V程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
“Clustal W比对方法”对应于标记为Clustal W的比对方法(通过以下文献描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-153；Higgins等人，(1992)Comput Appl Biosci 8：189-191)并且可见于LASERGENE生物信息学计算软件包的MegAlignTM v6.1程序(DNASTARInc.，Madison，WI))。用于多重比对的默认参数(空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30，DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB)。在用Clustal W程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
除非另作说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10(GCG，Accelrys，San Diego，CA)用以下参数获得的值：使用空位产生罚分权重50和空位长度延伸罚分权重3以及nwsgapdna.cmp计分矩阵获得的核苷酸序列的同一性％和相似性％；使用空位产生罚分权重8和空位长度延伸罚分2以及BLOSUM62计分矩阵获得的氨基酸序列的同一性％和相似性％(Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。GAP利用Needleman和Wunsch，(1970)J Mol Biol 48：443-53的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并使用以匹配碱基为单位的空位形生罚分和空位延伸罚分产生出具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。
“BLAST”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的用于寻找生物序列之间的相似性区域的搜索算法。该程序将核苷酸或者蛋白质序列与序列数据库比较，并计算各匹配的统计学显著性以鉴定出与查询序列具有足够的相似性的序列，使得相似性不会被预测为随机发生。BLAST报告所鉴定的序列以及它们与查询序列的局部比对。
本领域的技术人员熟知，许多序列同一性水平可用于鉴定来自其它物种的或者经天然修饰或合成来源的多肽，其中这种多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的可用示例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或者95％，或者50％至100％的任何整数百分数。实际上，50％至100％的任何整数氨基酸同一性可用于描述本公开，诸如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
“基因”包括表达功能分子(诸如但不限于特定蛋白质)的核酸片段，包括位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指天然存在的具有其自身的调控序列的基因。
“突变基因”是已通过人为干预被改变的基因。这种“突变基因”的序列与对应的非突变基因的序列不同之处在于至少一个核苷酸的添加、缺失或置换。在本公开的某些实施方案中，突变基因包含由本文所公开的向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统引起的改变。突变植物是包含突变基因的植物。
如本文所用，“靶向突变”是天然基因中的通过如下方式产生的突变：使用涉及本文所公开的或者本领域已知的能够在靶序列的DNA中诱导双链断裂的双链断裂诱导剂的方法，对天然基因内的靶序列进行改变。
在一个实施方案中，靶向突变是向导RNA/Cas内切核酸酶诱导的基因编辑的结果，如本文所述。向导RNA/Cas内切核酸酶诱导的靶向突变可发生于位于基因组靶位点之内或之外的核苷酸序列中，该基因组靶位点由Cas内切核酸酶识别和切割。
术语“基因组”应用于植物细胞时，不仅涵盖细胞核内存在的染色体DNA，也涵盖细胞的亚细胞组分(例如线粒体或者质体)中存在的细胞器DNA。
“密码子修饰的基因”或者“密码子优选的基因”或者“密码子优化的基因”是这样的基因，其密码子用法的频率被设计成模拟宿主细胞的优选的密码子用法的频率。
“等位基因”是染色体上占据给定基因座的基因的几种供选择替代形式的其中一种。当染色体上给定基因座处存在的所有等位基因都相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果染色体上给定基因座处存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。
“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的多核苷酸序列。“调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、其中或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，并且该核苷酸序列影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控序列可包括但不限于：启动子、翻译前导序列、5′非翻译序列、3′非翻译序列、内含子、聚腺苷酸化靶序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎环结构。
“植物优化的核苷酸序列”是已经过优化以提高在植物中的表达、特别是提高在植物中或者一种或者多种目的植物中的表达的核苷酸序列。例如，可通过使用一个或多个用于改善表达的植物优选的密码子，对本文所公开的编码蛋白质诸如例如双链断裂诱导剂(例如内切核酸酶)的核苷酸序列进行修饰，来合成植物优化的核苷酸序列。对于宿主优选的密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。
在本领域中用于合成植物优选的基因的方法是可用的。参见例如美国专利5,380,831和5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，它们以引用方式并入本文。已知有另外的序列修饰可增强在植物宿主中的基因表达。这些修饰包括例如消除以下序列：一个或多个编码假聚腺苷酸化信号的序列、一个或多个外显子-内含子剪接位点信号的序列，一个或多个转座子样重复序列，以及其它此类得到很好表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的植物宿主的平均水平，这通过参考在宿主植物细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免一个或多个预测的发夹二级mRNA结构。因此，本公开的“植物优化的核苷酸序列”包含此类序列修饰中的一个或多个。
“启动子”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。启动子序列由近端上游元件和更远端的上游元件组成，后一类元件经常称作增强子。因此，“增强子”是这样的DNA序列，其可以刺激启动子活性，并且可以是启动子的固有元件或经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整体源自天然基因，或由源自天然存在的不同启动子的不同元件构成，和/或甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以引导基因在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或应答于不同的环境条件时表达。还认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切界限仍未完全确定，因此存在一定变异的各DNA片段可以具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。
已经证实，某些启动子能够以高于其它启动子的速率指导RNA合成。这些被称为“强启动子”。已经证实，某些其它启动子仅在特定类型的细胞或组织中以较高水平指导RNA合成，并且如果启动子优选地在某些组织中指导RNA合成，但在其它组织中以降低的水平指导RNA合成，则其通常被称为“组织特异性启动子”或“组织优选的启动子”。由于引入到植物中的一个或多个嵌合基因的表达模式使用启动子来控制，因此人们对下述新型启动子的分离一直有兴趣，该新型启动子能够在特定组织类型中或在特定植物发育阶段以一定水平控制一个或多个嵌合基因的表达。
本公开的一些实施方案涉及如在实施例12中所描述的新发现的U6 RNA聚合酶III启动子GM-U6-13.1(SEQ ID NO：120)和如在实施例19中所描述的GM-U6-9.1(SEQ ID NO：295)。
与本文描述的大豆启动子相关的方法和组合物的非限制性实施例如下：
A1.一种包含核苷酸序列的重组DNA构建体，所述核苷酸序列包含以SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：295示出、可操作地连接至至少一个异源序列的任何序列或其功能片段，其中所述核苷酸序列是启动子。
A2.根据实施方案A1所述的重组DNA构建体，其中使用逐对比对默认参数(KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4，以及对角线保存＝4)基于Clustal V比对方法，所述核苷酸序列在与以SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：295示出的序列比较时具有至少95％的同一性。
A3.一种载体，所述载体包含根据实施方案A1所述的重组DNA构建体。
A4.一种细胞，所述细胞包含根据实施方案A1所述的重组DNA构建体。
A5.根据实施方案A4所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
A6.一种转基因植物，所述转基因植物具有稳定地掺入到其基因组中的根据实施方案A1所述的重组DNA构建体。
A7.根据实施方案A6所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。
A8.根据实施方案A7所述的转基因植物，其中所述植物是大豆。
A9.一种由实施方案A7所述的转基因植物产生的转基因种子，其中所述转基因种子包含所述重组DNA构建体。
A10.根据实施方案A1所述的重组DNA构建体，其中至少一个异源序列编码选自以下的基因：植物中的报告基因、选择标记、赋予病害抗性的基因、赋予抗除草剂性的基因、赋予抗昆虫性的基因；碳水化合物代谢所涉及的基因、脂肪酸代谢所涉及的基因、氨基酸代谢所涉及的基因、植物发育所涉及的基因、植物生长调控所涉及的基因、收率改善所涉及的基因、抗旱性所涉及的基因、抗寒性所涉及的基因、抗热性所涉及的基因、以及抗盐性所涉及的基因。
A11.根据实施方案A1所述的重组DNA构建体，其中至少一个异源序列编码选自以下的蛋白：植物中的报告蛋白、选择标记、赋予病害抗性的蛋白、赋予抗除草剂性的蛋白、赋予抗昆虫性的蛋白；碳水化合物代谢所涉及的蛋白、脂肪酸代谢所涉及的蛋白、氨基酸代谢所涉及的蛋白、植物发育所涉及的蛋白、植物生长调控所涉及的蛋白、收率改善所涉及的蛋白、抗旱性所涉及的蛋白、抗寒性所涉及的蛋白、抗热性所涉及的蛋白、以及抗盐性所涉及的蛋白。
A12.一种在植物中表达编码序列或功能RNA的方法，所述方法包括：
a)将根据实施方案A1所述的重组DNA构建体引入到植物中，其中所述至少一个异源序列包含编码序列或者编码功能RNA；
b)使步骤a)的植物生长；以及
c)选择显示表达重组DNA构建体的编码序列或功能RNA的植物。
A13.一种以转基因方式改变可标记的植物性状的方法，所述方法包括：
a)将根据实施方案A1所述的重组DNA构建体引入到植物中；
b)使从步骤a)获得的植物生长成能育成熟植物；以及
c)基于所改变的可标记性状选择在至少一种植物组织中表达所述至少一个异源序列的植物。
A14.根据实施方案A13所述的方法，其中所述可标记性状选自：病害抗性、抗除草剂性、抗昆虫性、碳水化合物代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、植物发育、植物生长调控、收率改善、抗旱性、抗寒性、抗热性、以及抗盐性。
A15.一种用于改变至少一个异源序列在植物中的表达的方法，所述方法包括：
(a)用根据实施方案A1所述的重组DNA构建体来转化植物细胞；
(b)使步骤(a)的经转化植物细胞生长成能育成熟植物；以及
(c)选择包含所述经转化植物细胞的植物，其中所述异源序列的表达增加或减少。
A16.根据实施方案A15所述的方法，其中所述植物是大豆植物。
A17.一种用包含大豆启动子和可操作地连接至所述启动子的异源核酸片段的重组DNA构建体稳定转化的植物，其中所述启动子能够控制所述异源核酸片段在植物细胞中的表达，并且此外其中所述启动子包含以SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：295示出的任何序列。
不断发现可用于植物细胞中的各种类型的新启动子，在以下汇编中可以找到许多示例：Okamuro和Goldberg，(1989)The Biochemistry of Plants，第115卷，Stumpf和Conn编辑(New York，NY：Academic Press)，第1-82页。
“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的多核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的mRNA中。翻译前导序列可影响初级转录物加工成mRNA、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的示例已有描述(例如Turner和Foster，(1995)Mol Biotechnol 3：225-236)。
“3′非编码序列”、“转录终止子”或“终止序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并且包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。聚腺苷酸化信号通常以影响添加聚腺苷酸片至mRNA前体的3′端为特征。不同的3′非编码序列的用途由Ingelbrecht等人，(1989)Plant Cell 1：671-680例示。
“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补拷贝时，它被称为初级转录物或前mRNA。当RNA转录物是由初级转录物前mRNAt的转录后加工衍生的RNA序列时，它被称为成熟RNA或mRNA。“信使RNA”或者“mRNA”是指没有内含子且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”是指与mRNA模板互补且用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或通过使用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链形式。“有义”RNA是指包含mRNA并且可被翻译成细胞内或体外的蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”是指与靶初级转录物或者mRNA的全部或者部分互补，并且能阻断靶基因的表达的RNA转录物(参见例如美国专利5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。“功能RNA”是指反义RNA、核糖酶RNA或者其它可能不被翻译但仍对细胞过程具有作用的RNA。术语“互补的”和“反向互补的”对mRNA转录来说可互换使用，并且用以定义信使反义RNA。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的调控。例如，当启动子能够调控编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以有义或者反义方向与调控序列可操作地连接。在另一个示例中，互补的RNA区域可直接或者间接地与靶mRNA的上游(5′)可操作地连接，或者与靶mRNA的下游(3′)可操作地连接，或者在靶mRNA内部可操作地连接，或者第一互补区在靶mRNA的上游(5′)，而其互补序列在靶mRNA的下游(3′)。
本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的，并且在以下文献中有更完全的描述：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)。转化方法是本领域技术人员熟知的，并在下文中描述。
“PCR”或“聚合酶链反应”是一项用于合成特定DNA区段的技术，并且由一系列的重复的变性、退火和延伸循环组成。通常，将双链DNA进行热变性，并将两条与靶区段的3′边界互补的引物与该DNA在低温下退火，然后在中等温度下延伸。一组这三个连续步骤称为一个“循环”。
术语“重组的”是指序列的两个本来分开的区段例如通过化学合成人工组合在一起，或者通过基因工程技术对核酸的分离的区段进行操纵。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指这样的染色体外元件，其通常携带不是细胞的中心代谢的一部分的基因，并且通常为双链DNA的形式。这种元件可以是衍自任何来源的、单链或者双链DNA或者RNA的、线状或环状形式的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中多个核苷酸序列已连接或者重组成能够将目的多核苷酸引入到细胞中的独特构建体。“转化盒”是指含有一种基因并且除该基因之外还具有能促进特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。“表达盒”是指含有一种基因并且除该基因之外还具有使该基因在宿主中表达的元件的特定载体。
术语“重组DNA分子”、“重组构建体”、“表达构建体”、“构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文中可互换使用。重组构建体包含在自然界中不全部在一起的核酸片段(例如调控序列和编码序列)的人工组合。例如，构建体可以包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可单独使用或者可与载体一起使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将被用来转化宿主细胞的方法，这是本领域技术人员熟知的。例如可使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、选择和繁殖宿主细胞而必须在载体上存在的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可导致不同的表达水平和表达模式(Jones等人，(1985)EMBO J 4：2411-2418；De Almeida等人，(1989)Mol Gen Genetics 218：78-86)，因此通常对多个事件进行筛选以获得显示所需表达水平和表达模式的细胞系。这种筛选可通过标准的分子生物学测定法、生物化学测定法和其它测定法完成，所述测定法包括DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、反转录PCR(RT-PCR)、蛋白质表达的免疫印迹分析、酶或者活性测定和/或表型分析。
如本文所用，术语“表达”是指产生前体形式或者成熟形式的功能性最终产物(例如mRNA、向导RNA或者蛋白质)。
术语“引入”意指向细胞提供核酸(例如表达构建体)或者蛋白质。引入包括指代核酸掺入到真核或者原核细胞中，其中该核酸可掺入到该细胞的基因组中，并且包括指代核酸或者蛋白质短暂提供给细胞。引入包括指代稳定的或者短暂的转化方法，以及有性杂交。因此，在将核酸片段(例如，重组DNA构建体/表达构建体)插入到细胞中的上下文中，“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指代将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸片段可掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
“成熟”蛋白质是指经翻译后加工的多肽(即，已从初级翻译产物移除了任何存在的原肽或者前肽所得的多肽)。“前体”蛋白是指mRNA的初级翻译产物(即，仍存在原肽和前肽)。原肽和前肽可以是但不限于胞内定位信号。
“稳定转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组(包括核基因组和细胞器基因组)中，导致基因稳定遗传。相反，“瞬时转化”是指核酸片段转移到宿主生物体的细胞核或者其它含DNA的细胞器中，从而导致基因表达而不整合或不稳定遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因”生物体。
遗传改善的种质的商业开发也已进展到将多种性状引入到作物植物中的阶段，通常称为基因堆叠方法。在该方法中，可将赋予不同目的特性的多种基因引入到植物中。基因堆叠可通过许多方法实现，包括但不限于共转化、再转化以及使具有不同目的基因的品系的杂交。
术语“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、同一植株的种子和子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于根、茎、苗、叶、花粉、种子、瘤组织和各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以在植物中或者在植物器官、组织或者培养物中。术语“植物器官”是指构成植株的形态上和功能上不同的部分的植物组织或组织群。术语“基因组”是指生物体每个细胞或病毒或细胞器中存在的全部互补遗传物质(基因和非编码序列)；和/或作为(单倍体)单元从一个亲本继承的完整组的染色体。“子代”包括植物的任何后续世代。
转基因植物包括例如这样的植物，该植物在其基因组内包含通过转化步骤引入的异源多核苷酸。异源多核苷酸可稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。转基因植物还可在其基因组内包含多于一个异源多核苷酸。每个异源多核苷酸可赋予转基因植物不同性状。异源多核苷酸可包括源自外来物种的序列，或者，如果源自相同物种，则可为对其天然形式进行了实质性修饰的序列。“转基因”可包括其基因型已因异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初经如此改变的转基因植物以及通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因植物产生的那些。通过常规植物育种方法，通过本文所述的不导致外来多核苷酸插入的基因组编辑程序，或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变不旨在被认为是转基因的。
在本公开的某些实施方案中，能育植物是能产生活的雄配子和雌配子并且自身能育的植物。这种自身能育植物可在没有任何其它植物贡献配子及其中所含的遗传物质的情况下产生子代植物。本公开的其它实施方案可涉及使用不是自身能育的植物，因为该植物不产生活的或者能够授受精的雄配子或雌配子，或者两者。如本文所用，“雄性不育植物”是不产生活的或者能够授精的雄配子的植物。如本文所用，“雌性不育植物”是不产生活的或者能够受精的雌配子的植物。应当认识到，雄性不育植物和雌性不育植物可以分别是雌性能育和雄性能育的。还应认识到，雄性能育(但雌性不育)植物当与雌性能育植物杂交时可产生活的子代，而雌性能育(但雄性不育)植物当与雄性能育植物杂交时可产生活的子代。
“厘摩”(cM)或者“图距单位(map unit)”是两个连接的基因、标记、靶位点、基因座或者它们的任何配对之间的距离，其中1％的减数分裂产物是重组的。因此，一厘摩与等于两个连接的基因、标记、靶位点、基因座或者它们的任何配对之间的1％平均重组频率的距离相当。
使用双组分向导RNA和Cas内切核酸酶系统的育种方法和选择植物的方法
本公开可用于培育包含一个或者多个转基因性状的植物。最通常地，转基因性状是作为基于农杆菌、基因枪法或其它常用程序的转化系统的结果而随机插入在植物基因组当中。最近，已开发出了能够定向插入转基因的基因打靶方案。一种重要的技术即位点特异性整合(SSI)能使转基因靶向与之前插入的转基因相同的染色体位置。定制的大范围核酸酶和定制的锌指大范围核酸酶使研究者能够设计核酸酶以靶向特定的染色体位置，并且这些试剂使得可以将转基因靶向于被这些核酸酶切割的染色体位点。
用于真核基因组(例如，植物基因组)的精确遗传工程的目前所使用的系统依赖于归巢内切核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶、以及转录激活因子类效应核酸酶(TALEN)，这需要对于每个新靶基因座的从头蛋白质工程。本文所述的高度特异性、RNA指导的DNA核酸酶，即向导RNA/Cas9内切核酸酶系统更易于定制，并且因此在以许多不同靶序列的修饰为目标时更有用。本公开进一步利用向导RNA/Cas系统的双组分性质，其中其恒定蛋白质组分为Cas内切核酸酶，并且其可变和易于重复编程的靶向组分为向导RNA或crRNA。
在核酸酶脱靶切割对于靶细胞可能有毒的情况下，本文所述的向导RNA/Cas系统对于基因组工程(尤其是植物基因组工程)特别有用。在本文所述的向导RNA/Cas系统的一个实施方案中，将表达优化的Cas9基因形式的恒定组分稳定地整合到靶基因组中，例如植物基因组。Cas9基因的表达在启动子(例如，植物启动子)的控制下，该启动子可为组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子，例如温度诱导型、胁迫诱导型、发育阶段诱导型、或化学诱导型启动子。在不存在可变组分(即，向导RNA或crRNA)的情况下，Cas9蛋白质不能够切割DNA，并且因此其在植物细胞中的存在应具有很小影响或没有影响。因此，本文所述的向导RNA/Cas系统的关键优点是形成和保持细胞系或转基因生物体的能力，所述细胞系或转基因生物体能够有效地表达对于细胞活力具有很小影响或没有影响的Cas9蛋白质。为了诱导在所需基因组位点处的切割来实现靶向遗传修饰，可通过多种方法将向导RNA或crRNA引入到包含稳定整合且表达的Cas9基因的细胞中。例如，向导RNA或crRNA可通过化学或酶促合成，并且通过直接递送方法(诸如粒子轰击或电穿孔)引入到Cas9表达细胞中。
另选地，能够有效地表达靶细胞中的向导RNA或crRNA的基因可通过化学、酶促合成或在生物系统中合成，并且这些基因可通过直接递送方法(诸如粒子轰击、电穿孔)或生物递送方法(诸如农杆菌介导的DNA递送)引入到Cas9表达细胞中。
本公开的一个实施方案是用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得包含向导RNA的第二植物，该向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择具有所述靶位点的期望改变的子代植物。
本公开的另一个实施方案是用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得包含向导RNA和供体DNA的第二植物，其中所述向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择在所述靶位点处包含插入的目的多核苷酸的子代植物。
本公开的另一个实施方案是用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使表达至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA和供体DNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。
如本文所公开，向导RNA/Cas系统介导的基因靶向可在用于指导转基因插入和/或用于制备包含多个转基因的复合转基因性状基因座的方法中以类似于WO2013/0198888(2013年8月1日公布)中公开的方式使用，其中使用如本文所公开的向导RNA/Cas系统或向导多核苷酸/Cas系统代替使用双链断裂诱导剂来引入目的基因。在一个实施方案中，复合转基因性状基因座是具有多个在遗传上互相连接的转基因的基因组基因座。通过距离彼此0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2或甚至5厘摩(cM)插入独立的转基因，转基因可作为单个遗传基因座培育(参见例如，美国专利申请13/427,138或PCT申请PCT/US2012/030061)。在选择包含转基因的植物之后，包含(至少)一个转基因的植物可杂交以形成包含两种转基因的F1。在来自这些F1的子代(F2或者BC1)中，1/500的子代将具有被重组到同一染色体上的两个不同的转基因。该复合基因座然后可作为具有两种转基因性状的单个遗传基因座培育。可重复这个过程以按需堆叠尽可能多的性状。
可鉴定与目的表型或性状关联的染色体区间。本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。此类染色体区间的边界扩展到涵盖将与控制受关注性状的基因连锁的标记。换句话说，扩展染色体区间使得位于区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)可用作玉米大斑病抗性标记。在一个实施方案中，染色体区间包含至少一个QTL，此外可实际上包含多于一个的QTL。相同区间中非常接近的多个QTL可搅乱特定标记与特定QTL的关联，因为一个标记可显示与多于一个的QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分离，有时分不清楚是否那些标记中的每个鉴定相同QTL或两个不同的QTL。术语“数量性状基因座”或“QTL”是指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群中)，具有与数量表型性状的差异表达相关联的DNA区域。QTL的区域涵盖影响所考虑的性状的一个或多个基因或与其密切相关。“QTL的等位基因”能够包含连续的基因组区域或连锁群中的多个基因或其它遗传因子，诸如单倍型。QTL的等位基因能够表示特定窗口内的单倍型，其中所述窗口是能够用一组的一个或多个多态性标记限定和追踪的连续的基因组区域。单倍型能够被特定窗口内的每一标记的等位基因的独特“指纹”限定。
多种方法可用于鉴定在靶位点处或附近具有改变的基因组的那些细胞，而无须使用可筛选的标记表型。这种方法可认为是直接分析靶序列以检测靶序列中的任何变化，包括但不限于PCR方法、测序方法、核酸酶消化、DNA印迹法以及它们的任何组合。
蛋白质可以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法一般来讲是已知的。例如，可通过在DNA中的突变来制备蛋白质的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法包括例如Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-92；Kunkel等人，(1987)Meth Enzymol 154：367-82；美国专利4,873,192；Walker和Gaastra编辑(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan PublishingCompany，New York)，这些参考文献以引用方式并入本文。有关不太可能影响蛋白质的生物活性的氨基酸置换的指导，见于例如Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequenceand Structure(Natl Biomed Res Found，Washington，D.C.)的模型。保守置换，诸如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可以是优选的。保守缺失、插入和氨基酸置换预期不会造成蛋白质特征的根本性变化，并且任何置换、缺失、插入或者它们的组合的效应可通过常规筛选测定法进行评估。测定双链断裂诱导活性的测定法是已知的，一般是测量该试剂对含有靶位点的DNA底物的总体活性和特异性。
已知有多种方法可用来将核苷酸序列和多肽引入到生物体中，包括例如转化、有性杂交，以及将多肽、DNA或者mRNA引入到细胞中。
用于接触、提供和/或引入组合物到各种生物体中的方法是已知的，并且包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法、病毒介导的方法和有性育种。稳定转化表示所引入的多核苷酸整合到生物体的基因组中并能够被其子代遗传。瞬时转化表示所引入的组合物仅仅在生物体中暂时表达或者存在。
用于将多核苷酸或多肽引入到植物中的方案可根据作为转化目标的植物或者植物细胞的类型(如单子叶植物或双子叶植物)而异。将多核苷酸和多肽引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques4：320-34，以及美国专利6,300,543)、分生组织转化(美国专利5,736,369)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-6)、农杆菌介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J 3：2717-22)，以及弹道粒子加速法(美国专利4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes等人，(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment”in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人，(1988)Biotechnology 6：923-6；Weissinger等人，(1988)Ann Rev Genet 22：421-77；Sanford等人，(1987)ParticulateScience and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol 87：671-4(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In Vitro Cell Dev Biol 27P：175-82(大豆)；Singh等人，(1998)Theor Appl Genet 96：319-24(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology 8：736-40(稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-9(玉米)；Klein等人，(1988)Biotechnology 6：559-63(玉米)；美国专利5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)Plant Physiol 91：440-4(玉米)；Fromm等人，(1990)Biotechnology 8：833-9(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人，(1984)Nature 311：763-4；美国专利5,736,369(谷类)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-9(百合科(Liliaceae))；De Wet等人，(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，Chapman等人编辑(Longman，New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人，(1990)PlantCell Rep 9：415-8和Kaeppler等人，(1992)Theor Appl Genet 84：560-6(触须介导的转化)；D′Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant CellRep 12：250-5；Christou和Ford(1995)Annals Botany 75：407-13(稻)，以及Osjoda等人，(1996)Nat Biotechnol 14：745-50(玉米，通过根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens))。
另选地，可通过使植物与病毒或者病毒核酸接触来将多核苷酸引入到植物中。一般地讲，这种方法涉及将多核苷酸掺入在病毒DNA或者RNA分子内。在一些示例中，目的多肽可最初作为病毒聚蛋白的一部分合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白。涉及病毒DNA或者RNA分子的、用于将多核苷酸引入到植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是已知的，参见例如美国专利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931。瞬时转化方法包括但不限于将多肽诸如双链断裂诱导剂直接引入生物体、引入多核苷酸诸如DNA和/或RNA多核苷酸、以及将RNA转录物诸如编码双链断裂诱导剂的mRNA引入生物体。此类方法包括例如显微注射法或粒子轰击法。参见例如Crossway等人，(1986)Mol Gen Genet 202：179-85；Nomura等人，(1986)Plant Sci 44：53-8；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2176-80；以及Hush等人，(1994)J Cell Sci 107：775-84。
术语“双子叶植物”是指也被称为“双子叶植物纲”的被子植物的子类，并且包括整个植株、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞及其子代。本文所用的植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
在本公开的上下文中的术语“杂交的”或“杂交”或“正在杂交”意指配子通过授粉而融合以产生子代(即，细胞、种子或植物)。该术语涵盖有性杂交(一株植物由另一株植物授粉)和自交(自花授粉，即，当花粉和胚珠(或者小孢子和大孢子)来自相同植物或遗传上相同的植物时)。
术语“基因渗入”是指遗传基因座的所需等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景。例如，所需等位基因在特定基因座的基因渗入能够通过两个亲本植株间的有性杂交被传递到至少一个子代植株，其中至少一个亲本植株在其基因组中具有所需等位基因。另选地，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有所需等位基因。所需等位基因可为例如转基因、经修饰(经突变或编辑)天然等位基因，或者所选择的标记或QTL的等位基因。
标准的DNA分离、纯化、分子克隆、载体构建和验证/表征方法是已建立的，参见例如Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY)。载体和构建体包括含有目的多核苷酸和任选其它组分的环状质粒和线性多核苷酸，所述其它组分包括接头、衔接子、调控区、内含子、限制位点、增强子、隔离子、选择性标记、目的核苷酸序列、启动子和/或其它有助于载体构建或者分析的位点。在一些示例中，识别位点和/或靶位点可包含在内含子、编码序列、5′UTR、3′UTR和/或调控区内。
本公开进一步提供了表达构建体，以用于在植物、植物细胞或者植物部分中表达能够结合到靶位点并在靶位点中产生双链断裂的向导RNA/Cas系统。在一个实施方案中，本公开的表达构建体包含可操作地连接至编码Cas基因的核苷酸序列的启动子以及可操作地连接至本公开的向导RNA的启动子。该启动子能够驱动可操作地连接的核苷酸序列在植物细胞中的表达。
启动子是参与RNA聚合酶和其它蛋白质的识别和结合以引发转录的DNA区域。植物启动子是能够在植物细胞中引发转录的启动子，有关植物启动子的综述参见Potenza等人，(2004)In Vitro Cell Dev Biol 40：1-22。组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子以及WO99/43838和美国专利6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-2)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)PlantCell 2：163-71)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol Biol 12：619-32；Christensen等人，(1992)Plant Mol Biol 18：675-89)；pEMU(Last等人，(1991)TheorAppl Genet 81：581-8)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J 3：2723-30)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其它组成型启动子在例如美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611中有所描述。在一些示例中，可使用诱导型启动子。病原体感染后被诱导的病原体诱导型启动子包括但不限于那些调节PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等的表达的启动子。
化学调控的启动子可用于通过施用外来化学调节剂来调节基因在植物中的表达。该启动子可以是化学诱导型启动子，其中化学剂的施加可诱导基因表达，或者是化学阻遏型启动子，其中化学剂的施加可阻遏基因表达。化学诱导型启动子包括但不限于玉米In2-2启动子，其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活(De Veylder等人，(1997)Plant Cell Physiol38：568-77)；玉米GST启动子(GST-II-27，WO93/01294)，其由用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物激活；以及烟草PR-1a启动子(Ono等人，(2004)Biosci Biotechnol Biochem 68：803-7)，其由水杨酸激活。其它化学调控的启动子包括甾类化合物响应性启动子(参见例如糖皮质激素诱导型启动子(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-5；McNellis等人，(1998)Plant J 14：247-257)；四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(Gatz等人，(1991)Mol Gen Genet 227：229-37；美国专利5,814,618和5,789,156)。
组织优选的启动子可用来靶向特定植物组织内的增强的表达。组织优选的启动子包括例如Kawamata等人，(1997)Plant Cell Physiol 38：792-803；Hansen等人，(1997)MolGen Genet 254：337-43；Russell等人，(1997)Transgenic Res 6：157-68；Rinehart等人，(1996)Plant Physiol 112：1331-41；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol 112：525-35；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol 112：513-524；Lam，(1994)Results Probl CellDiffer 20：181-96；以及Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J 4：495-505。叶优选的启动子包括例如Yamamoto等人，(1997)Plant J 12：255-65；Kwon等人，(1994)Plant Physiol105：357-67；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol 35：773-8；Gotor等人，(1993)Plant J 3：509-18；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol 23：1129-38；Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：9586-90；Simpson等人，(1958)EMBO J 4：2723-9；Timko等人，(1988)Nature 318：57-8。根优选的启动子包括例如Hire等人，(1992)PlantMol Biol 20：207-18(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Miao等人，(1991)Plant Cell3：11-22(胞质谷氨酰胺合成酶(GS))；Keller和Baumgartner，(1991)Plant Cell 3：1051-61(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)Plant Mol Biol14：433-43(根瘤农杆菌甘露氨酸合酶(MAS)的根特异性启动子)；Bogusz等人，(1990)PlantCell 2：633-41(从榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和鸡屎藤山麻黄(Trematomentosa)分离的根特异性启动子)；Leach和Aoyagi，(1991)Plant Sci 79：69-76(毛根农杆菌(A.rhizogenes)rolC和rolD根诱导基因)；Teeri等人，(1989)EMBO J 8：343-50(农杆菌创伤诱导的TR1′和TR2’基因)；VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，(1995)Plant MolBiol 29：759-72)；以及rolB启动子(Capana等人，(1994)Plant Mol Biol 25：681-91)；菜豆素基因(Murai等人，(1983)Science 23：476-82；Sengopta-Gopalen等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3320-4)。还参见美国专利5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和5,023,179。
种子优选的启动子包括种子发育过程中活跃的种子特异性启动子和在种子萌发过程中活跃的种子萌发启动子。参见Thompson等人，(1989)BioEssays 10：108。种子优选的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；以及milps(肌醇-1-磷酸合酶)；(WO00/11177和美国专利6,225,529)。对于双子叶植物，种子优选的启动子包括但不限于豆类β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子优选地启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDaγ玉米醇溶蛋白、糯性蛋白、超甜蛋白1、超甜蛋白2、球蛋白1、油质蛋白、以及nuc1。另参见WO00/12733，其中公开了来自END1和END2基因的种子优选的启动子。
表型标记是可筛选或可选择的标记，其包括可视标记和选择性标记，无论它是阳性还是阴性的选择性标记。可使用任何表型标记。具体地讲，可选择的或可筛选的标记包含这样的DNA区段，该DNA区段使得可以常常在特定条件下鉴定或选择或不选择含有它的分子或细胞。这些标记可编码活性，诸如但不限于RNA、肽或蛋白质的产生，或者可为RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等提供结合位点。
选择性标记的示例包括但不限于包含限制性酶位点的DNA区段；编码提供对于有毒化合物的抗性的产物的DNA区段，所述有毒化合物包括抗生素，诸如壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、Basta、新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)；编码另外缺乏受体细胞的产物的DNA区段(例如，tRNA基因、营养缺陷标记)；编码可易于鉴定的产物的DNA区段(例如，表型标记，诸如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)，青色荧光蛋白(CFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，红色荧光蛋白(RFP)，以及细胞表面蛋白)；生成用于PCR的新引物位点(例如，之前尚未并置的两个DNA序列的并置)的DNA区段；包含未受限制性内切核酸酶或其它DNA修饰酶、化学品等作用或者受其作用的DNA序列的DNA区段；以及包含特异性修饰(例如，甲基化)所需的DNA序列的DNA区段，该特异性修饰使得可以鉴定该DNA序列。
另外的选择性标记包括能赋予对除草化合物诸如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。参见例如Yarranton，(1992)Curr Opin Biotech3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff，(1992)Mol Microbiol 6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell48：555-66；Brown等人，(1987)Cell 49：603-12；Figge等人，(1988)Cell 52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science 248：480-3；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-21；Labow等人，(1990)Mol Cell Biol 10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-6；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res 19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)Topics Mol Struc Biol 10：143-62；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob Agents Chemother 35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry 27：1094-104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-51，；Oliva等人，(1992)Antimicrob Agents Chemother 36：913-9；Hlavka等人，(1985)Handbook ofExperimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature 334：721-4。
可采用常规条件使具有所引入的序列的细胞生长或者再生成植株，参见例如McCormick等人，(1986)Plant Cell Rep 5：81-4。然后可使这些植物生长，并用相同转化株或者用不同转化株或未转化株进行授粉，并鉴定出具有所需特性和/或包含所引入的多核苷酸或者多肽的所得子代。可生长两代或者更多代以确保多核苷酸得到稳定保持和遗传，并收获种子。
可使用任何植物，包括单子叶植物和双子叶植物。可使用的单子叶植物的示例包括但不限于玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbicolor、Sorghum vulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、小麦(Triticumaestivum)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦(Avena)、大麦(Hordeum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、菠萝(Ananas comosus)、香蕉(Musa spp.)、棕榈、观赏植物、草坪草和其它草类。可使用的双子叶植物的示例包括但不限于大豆(Glycine max)、卡诺拉(Brassicanapus和B.campestris)、苜蓿(Medicago sativa)、烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、向日葵(Helianthus annuus)、棉(Gossypium arboreum)和花生(Arachis hypogaea)、西红柿(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)等。
目的转基因、重组DNA分子、DNA序列以及目的多核苷酸可包含一个或者多个目的基因。这种目的基因可编码例如为植物提供农学优势的蛋白质。
标记辅助选择和植物育种
在作物中开发分子标记的主要动力是通过标记辅助选择(MAS)在植物育种中提高效率的潜能。遗传标记等位基因，或另选地，数量性状基因座(QTL)等位基因用于识别植物，该植物在一个或多个基因座处包含所需基因型，并且预期将所需基因型连同所需表型转移到其子代。遗传标记等位基因(或QTL等位基因)能够被用于鉴定在一个基因座或若干个不连锁或连锁基因座处包含所需基因型的植物(例如单倍型)，并且该植物预期将所需基因型连同所需表型一起传递至它们的子代。应当理解，出于MAS的目的，术语标记可涵盖标记和QTL基因座两者。
在确定所需表型和多态性染色体基因座(例如，标记基因座或QTL)同时分离之后，可以使用那些多态性基因座来选择对应于所需表型的等位基因一称为标记辅助选择(MAS)的过程。简而言之，检测来自待选择的植物的生物样品中对应于标记核酸的核酸。这种检测能够采取探针核酸与标记杂交的形式，例如，使用等位基因特异性杂交、DNA印迹分析、RNA印迹分析、原位杂交、引物杂交后进行标记区域的PCR扩增等。用于检测标记的各种程序是本领域中已知的。在生物样品中的特定标记的存在(或不存在)被验证之后，选择植物，即，用于通过选择性育种形成子代植物。
植物育种需要组合目的性状与用于高收率的基因以及其它所需性状以开发改良的植物品种。筛选大量样品可能是昂贵、耗时且不可靠的。使用标记和/或遗传连接的核酸是用于选择在育种程序中具有所需性状的植物的有效方法。例如，经过田地评估的标记辅助选择的一个优点在于，MAS可在一年中的任何时候进行，无论生长季节如何。此外，环境效应与标记辅助选择无关。
当群体对于影响一个或多个性状的多个基因座进行分离时，MAS的效率与表型筛选相比变得甚至更高，这是因为所有基因座在实验室中可从DNA的单个样品一起处理。
细胞的DNA修复机制是引入外源DNA或者在内源性基因中诱导突变的基础。DNA同源重组是细胞使用同源序列修复DNA损伤的专门DNA修复方式。在植物中，DNA同源重组发生频率过低而不能按常规用于基因打靶或基因编辑，后来发现该过程可通过DNA双链断裂刺激(Bibikova等人，(2001)Mol.Cell Biol.21：289-297；Puchta和Baltimore，(2003)Science 300：763；Wright等人，(2005)Plant J.44：693-705)。
缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔，“mM”表示毫摩尔，“M”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，并且“kb”表示千碱基对。
此外，如本文所述，对于引用向导RNA的每一实施例或实施方案，可设计类似的向导多核苷酸，其中所述向导多核苷酸不单独包含核糖核酸而是其中所述向导多核苷酸包含RNA-DNA分子的组合或者单独包含DNA分子。
本文所公开的组合物和方法的非限制性实施例如下：
1.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：
a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；
b)获得包含向导RNA的第二植物，该向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物；
c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；
d)评估(c)的子代的靶位点改变；以及
e)选择具有所述靶位点的期望改变的子代植物。
2.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
3.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：
a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；
b)获得包含向导RNA和供体DNA的第二植物，其中所述向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸；
c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；
d)评估(c)的子代的靶位点改变；以及
e)选择在所述靶位点处包含插入的目的多核苷酸的子代植物。
4.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使表达至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA和供体DNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。
5.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括将向导RNA引入到具有Cas内切核酸酶的植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
6.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括将向导RNA和Cas内切核酸酶引入到所述植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
7.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括将向导RNA和供体DNA引入到具有Cas内切核酸酶的植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。
8.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括：
a)将向导RNA和Cas内切核酸酶引入到植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；以及
b)鉴定在所述靶标处具有修饰的至少一个植物细胞，其中该修饰包括所述靶位点中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换。
9.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶DNA序列的方法，所述方法包括：
a)将能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体引入到植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；以及
b)鉴定在所述靶位点处具有修饰的至少一个植物细胞，其中该修饰包括所述靶位点中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换。
10.一种用于将目的多核苷酸引入到植物细胞的基因组中的靶位点中的方法，所述方法包括：
a)将能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体引入到植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；
b)使(a)的植物细胞与包含目的多核苷酸的供体DNA接触；以及
c)鉴定来自(b)的至少一个植物细胞，该细胞在其基因组中包含整合在所述靶位点处的目的多核苷酸。
10-B一种用于将目的多核苷酸引入到植物细胞的基因组中的靶位点中的方法，所述方法包括：
a)将向导RNA和Cas内切核酸酶引入到植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；
b)使(a)的植物细胞与包含目的多核苷酸的供体DNA接触；以及
c)鉴定来自(b)的至少一个植物细胞，该细胞在其基因组中包含整合在所述靶位点处的目的多核苷酸。
11.根据实施方案5-8中任一项所述的方法，其中所述向导RNA通过粒子轰击直接引入。
12.根据实施方案5-9中任一项所述的方法，其中所述向导RNA通过粒子轰击或包含可操作地连接至植物U6聚合酶III启动子的对应的向导DNA的重组DNA构建体的农杆菌转化来引入。
13.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶基因是植物优化的Cas9内切核酸酶基因。
14.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶基因可操作地连接至Cas密码子区域上游的SV40核靶向信号以及Cas密码子区域下游的VirD2核定位信号。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
16.根据实施方案15所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、高粱、裸麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草或者柳枝稷。
17.根据实施方案16所述的方法，其中所述双子叶植物选自大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、棉、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥或红花。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述靶位点位于乙酰乳酸合酶(ALS)基因、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合酶(ESPSP)基因、雄性能育性(MS45、MS26或MSCA1)基因的基因序列中。
19.一种通过根据实施方案1-17中任一项所述的方法产生的植物或种子。
20.一种包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。
21.一种包含重组DNA构建体和向导RNA的植物，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶和向导RNA能够形成复合物，并在所述植物基因组的基因组靶序列中产生双链断裂。
22.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。
23.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至表达向导RNA的核苷酸序列的启动子，其中所述向导RNA能够与植物优化的Cas9内切核酸酶形成复合物，并且其中所述复合物能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。
24.一种用于选择雄性不育植物的方法，所述方法包括选择在位于雄性能育性基因座中的基因组靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使表达Cas9内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述基因组靶位点处引入双链断裂。
25.一种用于产生雄性不育植物的方法，所述方法包括：
a)获得包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物，所述至少一种Cas内切核酸酶能够在位于植物基因组的雄性能育性基因座中的基因组靶位点处引入双链断裂；
b)获得第二植物，该第二植物包含向导RNA，所述向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物；
c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；
d)评估(c)的子代的靶位点改变；以及
e)选择雄性不育的子代植物。
26.根据实施方案23-24中任一项所述的方法，其中所述雄性能育性基因选自包括MS26、MS45、M的列表。
27.根据实施方案24-26中任一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、高粱、裸麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草或者柳枝稷。
29.一种用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括将向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述Cas内切核酸酶在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。
31.根据实施方案29所述的方法，其中所述核苷酸序列是启动子、调控序列或目的基因。
32.根据实施方案31所述的方法，其中所述目的基因是EPSPS基因。
33.根据实施方案30所述的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。
34.一种用于产生epsps突变植物的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述Cas内切核酸酶在植物基因组的epsps基因组序列中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述epsps基因组序列的至少一个核苷酸修饰。
b)由(a)的植物细胞获得植物；
c)评估(b)的植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及
c)选择表现出草甘膦耐受性的子代植物。
35.一种用于产生epsps突变植物的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述Cas内切核酸酶在植物基因组的epsps基因组序列中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述epsps基因组序列的至少一个核苷酸修饰。
b)由(a)的植物细胞获得植物；
c)评估(b)的植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及
d)筛选(c)的不含所述向导RNA和Cas内切核酸酶的子代植物。
36.根据实施方案35所述的方法，还包括选择表现出草甘膦抗性的植物。
37.一种通过根据实施方案29-36中任一项所述的方法产生的植物、植物细胞或种子。
38.根据实施方案29-36中任一项所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶是Cas9内切核酸酶。
39.根据实施方案38所述的方法，其中Cas9内切核酸酶通过SEQ ID NO：5表达。
40.根据实施方案38所述的方法，其中Cas9内切核酸酶由SEQ ID NO：1、124、212、213、214、215、216、193，或者SEQ ID NO：5的第2037-6329位核苷酸，或它们的任意功能片段或变体中的任一项编码。
41.根据实施方案37所述的植物或植物细胞，其中所述植物细胞表现出草甘膦抗性。
42.一种包含修饰的核苷酸序列的植物细胞，其中所述修饰的核苷酸序列通过向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶而产生，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
43.根据实施方案29、34和35所述的方法，其中所述至少一个核苷酸修饰不是在所述靶位点处的修饰。
44.一种用于产生雄性不育植物的方法，所述方法包括：
a)将向导RNA和Cas内切核酸酶引入到植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在位于雄性能育性基因中或附近的靶位点处引入双链断裂；
b)鉴定在所述雄性能育性基因中具有修饰的至少一个植物细胞，其中所述修饰包括在所述雄性不育性基因中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换；以及
c)由b)的植物细胞获得植物。
45.根据实施方案43所述的方法，该方法还包括选择来自c)的植物的子代植物，其中所述子代植物是雄性不育的。
46.根据实施方案43所述的方法，其中所述雄性能育性基因选自MS26、MS45和MSCA1。
47.一种包含至少一个改变的靶位点的植物，其中所述至少一个改变的靶位点源自由向导RNA/Cas内切核酸酶系统识别和切割的对应的靶位点，并且其中所述至少一个改变的靶位点位于目的基因组区域中，该基因组区域从SEQ ID NO：229示出的靶序列延伸至以SEQ ID NO：235示出的靶序列。
48.根据实施方案47所述的植物，其中所述至少一个改变的靶位点具有选自以下的改变：(i)替换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，和(iv)(i)-(iii)的任何组合。
49.根据实施方案47所述的植物，其中所述至少一个改变的靶位点包含重组DNA分子。
50.根据实施方案47所述的植物，其中所述植物包含至少两个改变的靶位点，其中所述改变的靶位点中的每个源自由向导RNA/Cas内切核酸酶系统识别和切割的对应的靶位点，其中所述对应的靶位点选自SEQ ID NO：229、230、231、232、233、234、235和236。
51.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含以SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：295示出、可操作地连接至至少一个异源序列的核苷酸序列或其功能片段，其中所述核苷酸序列是启动子。
52.一种用包含大豆启动子和可操作地连接至所述大豆启动子的异源核酸片段的重组DNA构建体稳定转化的植物，其中所述启动子能够控制所述异源核酸片段在植物细胞中的表达，并且此外其中所述启动子包含以SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：295示出的任何序列。
53.一种用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，所述方法包括将向导多核苷酸、Cas内切核酸酶以及任选地多核苷酸修饰模板引入到细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
54.根据实施方案53所述的方法，其中细胞的基因组中的所述核苷酸序列选自启动子序列、终止子序列、调控元件序列、剪接位点、编码序列、聚泛素化位点、内含子位点、以及内含子增强基序。
55.一种用于编辑细胞的基因组中的启动子序列的方法，所述方法包括将向导多核苷酸、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
56.一种用于替换细胞中的第一启动子序列的方法，所述方法包括将向导RNA、多核苷酸修饰模板和Cas内切核酸酶引入到所述细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含与所述第一启动子序列不同的第二启动子或第二启动子片段。
57.根据实施方案56所述的方法，其中所述第一启动子序列的替换导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：相同细胞层或其它细胞层中增加的启动子活性、增加的启动子组织特异性、降低的启动子活性、降低的启动子组织特异性、新的启动子活性、诱导型启动子活性、延长的基因表达窗口、或者基因表达的时机或发育进度的修饰。
58.根据实施方案56所述的方法，其中所述第一启动子序列选自玉米(Zea mays)ARGOS 8启动子、大豆EPSPS1启动子、玉米EPSPS启动子、玉米NPK1启动子，其中所述第二启动子序列选自玉米(Zea mays)GOS2 PRO：GOS2-内含子启动子、大豆泛素启动子、胁迫诱导型玉米RAB17启动子、玉米(Zea mays)-PEPC1启动子、玉米(Zea mays)泛素启动子、玉米(Zea mays)-Rootmet2启动子、稻肌动蛋白启动子、高粱RCC3启动子、玉米(Zea mays)-GOS2启动子、玉米(Zea mays)-ACO2启动子和玉米(Zea mays)油质蛋白启动子。
59.一种用于使细胞的基因组中的启动子序列缺失的方法，所述方法包括将向导多核苷酸、Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在位于所述启动子序列的内部或外部的至少一个靶位点处引入双链断裂。
60.一种用于在细胞的基因组中插入启动子或启动子元件的方法，所述方法包括将向导多核苷酸、包含所述启动子或启动子元件的多核苷酸修饰模板、以及Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂。
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述启动子或启动子元件的插入导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：增加的启动子活性、增加的启动子组织特异性、降低的启动子活性、降低的启动子组织特异性、新的启动子活性、诱导型启动子活性、延长的基因表达窗口、基因表达的时机或发育进度的修饰、DNA结合元件的突变、或DNA结合元件的添加。
62.一种用于编辑锌指转录因子的方法，所述方法包括将向导多核苷酸、Cas内切核酸酶以及任选地多核苷酸修饰模板引入到细胞中，其中所述Cas内切核酸酶在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述锌指转录因子的至少一个核苷酸修饰或缺失，其中所述锌指转录因子的缺失或修饰导致形成显性阴性锌指转录因子突变体。
63.一种用于产生融合蛋白的方法，所述方法包括将向导多核苷酸、Cas内切核酸酶和多核苷酸修饰模板引入到细胞中，其中所述Cas内切核酸酶在位于所述细胞的基因组中的第一编码序列内部或外部的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含编码目的蛋白的第二编码序列，其中所述蛋白融合导致以下情况中的任一种或者以下情况的任一组合：融合蛋白靶向到所述细胞的叶绿体、蛋白活性增加、蛋白功能性增强、蛋白活性降低、蛋白功能性减弱、新的蛋白功能性、修饰的蛋白功能性、新的蛋白定位、新的蛋白表达时机、修饰的蛋白表达模式、嵌合蛋白、或具有显性表型功能性的修饰的蛋白。
64.一种用于在植物中产生在目的基因组区域中包含至少两个改变的靶序列的复合性状基因座的方法，所述方法包括：
(a)选择植物中的基因组区域，其中所述基因组区域包含第一靶序列和第二靶序列；
(b)使至少一个植物细胞与至少第一向导多核苷酸、第二多核苷酸和任选地至少一种供体DNA以及Cas内切核酸酶接触，其中所述第一向导多核苷酸和第二向导多核苷酸与所述Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在至少第一靶序列和第二靶序列中引入双链断裂；
(c)从(b)鉴定在第一靶序列处包含第一改变并且在第二靶序列处包含第二改变的细胞；以及
(d)从(c)的细胞再生第一能育植物，所述能育植物包含第一改变和第二改变，其中该第一改变和第二改变物理地连接在一起。
65.一种用于在植物中产生在目的基因组区域中包含至少两个改变的靶序列的复合性状基因座的方法，所述方法包括：
(a)选择植物中的基因组区域，其中所述基因组区域包含第一靶序列和第二靶序列；
(b)使至少一个植物细胞与第一向导多核苷酸、Cas内切核酸酶和任选地第一供体DNA接触，其中所述第一向导多核苷酸和所述Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在第一靶序列处引入双链断裂；
(c)鉴定(b)的在第一靶序列处包含第一改变的细胞；
(d)从(c)的细胞再生第一能育植物，所述第一能育植物包含第一改变；
(e)使至少一个植物细胞与第二向导多核苷酸、Cas内切核酸酶和任选地第二供体DNA接触；
(f)鉴定(e)的在第二靶序列处包含第二改变的细胞；
(g)从(f)的细胞再生第二能育植物，所述第二能育植物包含第二改变；以及
(h)由(g)的第二能育植物获得能育子代植物，所述能育子代植物包含第一改变和第二改变，其中所述第一改变和所述第二改变物理地连接在一起。
66.一种用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，所述方法包括将至少一种向导RNA、至少一种多核苷酸修饰模板和至少一种Cas核酸内切酶引入到细胞中，其中所述Cas核酸内切酶在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
67.根据实施方案66所述的方法，其中所述核苷酸序列的编辑使得所述核苷酸序列能够赋予所述细胞抗除草剂性。
68.根据实施方案67所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。
69.根据实施方案66所述的方法，其中所述核苷酸序列是启动子、调控序列或目的基因。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述目的基因是烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因或ALS基因。
71.根据实施方案66所述的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。
72.一种用于产生乙酰乳酸合酶(ALS)突变植物的方法，所述方法包括：
a)向包含ALS核苷酸序列的植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述植物细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述ALS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
b)由(a)的植物细胞获得植物；
c)评估(b)的植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及
c)选择表现出磺酰脲类抗性的子代植物。
73.一种用于产生乙酰乳酸合酶(ALS)突变植物的方法，所述方法包括：
a)向包含Cas内切核酸酶和ALS核苷酸序列的植物细胞提供向导RNA和多核苷酸修饰模板，其中所述Cas内切核酸酶在所述植物细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述ALS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
b)由(a)的植物细胞获得植物；
c)评估(b)的植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及
d)选择表现出磺酰脲类抗性的子代植物。
74.根据实施方案72-73中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸修饰模板包含ALS核苷酸序列的非功能片段或部分片段。
75.根据实施方案72-73中任一项所述的方法，其中所述靶位点位于所述ALS核苷酸序列中。
76.根据实施方案72-73中任一项所述的方法，还包括选择不含所述向导RNA和Cas内切核酸酶的子代植物。
77.一种用于产生乙酰乳酸合酶(ALS)突变植物的方法，所述方法包括：
a)获得植物或其种子，其中所述植物或种子包含内源性ALS基因中的修饰、由Cas内切核酸酶产生的修饰、向导RNA和多核苷酸修饰模板，其中所述植物或种子是抗磺酰脲类的；以及
d)产生不含所述向导RNA和Cas内切核酸酶的子代植物。
78.根据实施方案77所述的方法，还包括选择表现出磺酰脲类抗性的植物。
79.根据实施方案72-78中任一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
80.根据实施方案79所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、高粱、裸麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草或柳枝稷。
81.根据实施方案79所述的方法，其中所述双子叶植物选自大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、棉、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥或红花。
82.一种产生磺酰脲类抗性植物的方法，所述方法包括提供植物细胞，其中所述植物细胞的内源性染色体ALS基因已经由向导RNA/Cas内切核酸酶系统修饰以产生磺酰脲类抗性ALS蛋白，以及由所述玉米植物细胞生长植株，其中所述植株是抗磺酰脲类的。
83.根据实施方案82所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
84.一种通过根据实施方案82所述的方法产生的植物。
85.一种通过根据实施方案84所述的植物产生的种子。
86.一种向导RNA，其中所述可变靶向结构域靶向于植物EPSPS或ALS核苷酸序列的片段。
87.一种用于产生乙酰乳酸合酶(ALS)突变植物细胞的方法，所述方法包括：
a)向包含ALS核苷酸序列的细胞提供向导RNA、Cas内切核酸酶和多核苷酸修饰模板，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述ALS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰；以及
b)获得在所述ALS核苷酸序列处具有至少一个核苷酸修饰的至少一个(a)的植物细胞，其中所述修饰包括所述ALS核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失、插入或置换。
88.一种用于产生乙酰乳酸合酶(ALS)突变植物细胞的方法，所述方法包括：
a)向包含Cas内切核酸酶和ALS核苷酸序列的植物细胞提供向导RNA和多核苷酸修饰模板，其中所述Cas内切核酸酶在所述植物细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述ALS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰；以及
b)鉴定(a)的在所述ALS核苷酸序列处具有至少一个核苷酸修饰的至少一个植物细胞，其中所述修饰包括所述ALS核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失、插入或置换。
89.一种用于产生乙酰乳酸合酶(ALS)突变细胞的方法，所述方法包括：
a)向包含ALS核苷酸序列的细胞提供能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体、能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体、和多核苷酸修饰模板，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述ALS基因的非功能片段和所述ALS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰；以及
b)鉴定(a)的在所述ALS核苷酸序列处具有至少一个核苷酸修饰的至少一个细胞，其中所述修饰包括所述ALS核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失、插入或置换。
实施例
在以下实施例中，除非另行指出，否则份数和百分比均按重量计，并且度数的单位都是摄氏度。应当理解，尽管以下实施例讲述了本公开的实施方案，但仅用于举例说明。根据上文的论述内容和下文的实施例，本领域技术人员能够对本公开做出各种变化和修改，使其适用于各种用途和条件。这些修改都旨在落入所附权利要求的范围内。
实施例1
以玉米植株中的基因组修饰为基础的向导RNA/Cas内切核酸酶的玉米优化表达盒
针对基因组工程应用，II型CRISPR/Cas系统最小限度需要包含Cas9蛋白以及双工crRNA/tracrRNA分子或crRNA与tracrRNA合成融合的分子(向导RNA)，以用于识别并切割DNA靶位点(Gasiunas等人(2012)Proc.Natl.Acad Sci.USA 109：E2579-86；Jinek等人(2012)Science 337：816-21；Mali等人(2013)Science 339：823-26；Cong等人(2013)Science 339：819-23)。本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统基于II型CRISPR/Cas系统，由Cas内切核酸酶与向导RNA(或双工crRNA和tracrRNA)组成；其中Cas内切核酸酶与向导RNA可一起形成复合物，该复合物可识别植物的基因组靶位点，然后向该靶位点引入双链断裂。
为了检测玉米中的向导RNA/Cas内切核酸酶系统，步骤如下：首先，将来自酿脓链球菌M1 GAS(SF370)的Cas9基因(SEQ ID NO：1)按本领域已知的标准技术进行玉米密码子优化，然后引入马铃薯ST-LSl内含子(SEQ ID NO：2)，使该Cas9基因不能在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌属菌株中表达(参见图1A)。为有利于Cas9蛋白在玉米细胞中核定位，我们分别在Cas9开放阅读框的氨基和羧基末端引入了猿猴病毒40(Simian virus40)(SV40)单分型氨基末端核定位信号(MAPKKKRKV，SEQ ID NO：3)和根癌农杆菌双分型VirD2T-DNA边界内切核酸酶羧基末端核定位信号(KRPRDRHDGELGGRKRAR，SEQ ID NO：4)(参见图1A)。采用标准分子生物学技术将玉米优化Cas9基因可操作地连接至玉米组成型或调控型启动子。图1A示出了玉米优化Cas9表达盒的一个实施例(SEQ ID NO：5)。图1A所示的玉米优化Cas9基因包含ST-LS1内含子、SV40氨基末端核定位信号(NLS)以及由植物泛素启动子驱动的VirD2羧基末端NLS。
针对基因组工程应用，功能向导RNA/Cas内切核酸酶系统必须包含第二成分，也就是crRNA/tracrRNA分子的双链体、或者crRNA与tracrRNA合成融合的分子(向导RNA)。为赋予玉米有效表达向导RNA(或有效表达双工crRNA/tracrRNA)的能力，分离出了存在于8号染色体上的玉米U6聚合酶III启动子(SEQ ID NO：9)和玉米U6聚合酶III终止子(SEQ ID NO：10中前8个碱基)，并采用标准分子生物学技术将它们可操作地融合至向导RNA的末端(参见图1B)。开发了两种不同的向导RNA构型用于分别在玉米中的检测：一种是基于Jinek等人(2012)Science 337：816-21中提出的短向导RNA(SEQ ID NO：11)，另一种是基于Mali等人(2013)Science 339：823-26中提出的长向导RNA(SEQ ID NO：8)。图1B示出一个示例性的表达盒(SEQ ID NO：12)，示出了驱动长向导RNA表达的玉米U6聚合酶III启动子，该启动子的末端为U6聚合酶III终止子。
如图2A和图2B所示，向导RNA或crRNA分子包含与双链DNA靶标的一条链互补的区域(称为可变靶向结构域)，其长度为约12至30个核苷酸，位于用来识别并切割靶位点的PAM序列上游(图2A至图2B中反义链上的5’NGG3’，对应于图2A至图2B中正义链上的5’CCN3’)(Gasiunas等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109：E2579-86；Jinek等人(2012)Science337：816-21；Mali等人(2013)Science 339：823-26；以及Cong等人(2013)Science 339：819-23)。为有利于向crRNA或向导RNA表达构建体快速引入玉米基因组DNA靶序列，以反向串联取向(切割方向朝外)引入了两个IIS型BbsI限制性内切核酸酶靶位点，具体操作参见Cong等人(2013)Science 339：819-23。IIS型限制性内切核酸酶在切割时，将其靶位点从crRNA或向导RNA表达质粒切除，生成突出端，此时技术人员便能够把包含所需玉米基因组DNA靶位点的双工寡核苷酸框内定向克隆进可变靶向结构域。在本实施例中，只用以鸟嘌呤核苷酸开头的靶序列来促进向导RNA或crRNA的有利表达聚合酶III。
然后，Cas内切核酸酶基因和向导RNA两者的表达使得形成了向导RNA/Cas复合物，如图2B所示(SEQ ID NO：8)。另选地，Cas内切核酸酶基因、crRNA和tracrRNA表达使得形成了crRNA/tracrRNA/Cas复合物，如图2A所示(SEQ ID NO：6-7)。
实施例2
向导RNA/Cas内切核酸酶系统通过不完全的非同源末端连接机制切割玉米中的染 色体DNA并引入突变
为检测实施例1描述的玉米优化的向导RNA/Cas内切核酸酶是否能够经由不精确的非同源末端连接(NHEJ)修复途径识别、切割玉米染色体DNA并使其发生突变，使5个玉米基因座中的三个不同的基因组靶序列为切割靶标(参见表1)，并通过深度测序技术检查是存在NHEJ突变。
表1.向导RNA/Cas内切核酸酶系统靶向的玉米基因组靶位点。
MS26＝雄性不育性基因26，LIG＝无叶舌1号基因启动子，MS45＝雄性不育性基因45，ALS＝乙酰乳酸合酶基因，EPSPS＝烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合酶基因
通过粒子介导递送技术(参见实施例10)，在存在BBM和WUS2基因的情况下，将玉米优化的Cas9内切核酸酶和长向导RNA表达盒(包含特定的玉米可变靶向结构域)共递送到60至90个Hi-II玉米未成熟胚芽中(参见实施例11)。将用靶向与LIGCas或MS26Cas靶位点所处玉米基因座相同的基因座的LIG3-4或MS26++归巢内切核酸酶转化的Hi-II玉米胚芽(参见实施例9)用作阳性对照，而将仅用Cas9或向导RNA表达盒转化的玉米胚芽用作阴性对照。7天后，将每个处理组的20至30个转化最为均匀的胚芽合并，并且提取总基因组DNA。用高保真度PCR主混合物(New England Biolabs，M0531L)对预期靶位点周围的区域进行PCR扩增，将该主混合物添加到扩增子特异性条形码所必需的序列上，然后利用“加尾”引物，在两轮PCR过程中进行Illumnia测序。一级PCR反应使用的引物示于表2；二级PCR反应使用的引物为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG(正向，SEQ ID NO：53)和CAAGCAGAAGACGGCATA(反向，SEQ ID NO：54)。
表2.PCR引物序列
用Qiagen PCR纯化离心柱纯化所得的PCR扩增产物，等摩尔比混合，采用基于Hoechst染料的荧光测定法测量浓度，并且在Illumina MiSeq个人型测序系统中，用PhiXcontrol v3(Illumina，FC-110-3001)以30％至40％(v/v)加标(用于抵消序列偏差)，对含100个核苷酸的单个读段进行深度测序。只有那些读段长度≥1个核苷酸插入缺失(indel)(出现在以预期切割位点为中心、且涵盖10个核苷酸的窗口内)，而且阴性对照中未见类似含量的突变，才被归入NHEJ突变。含同一突变的多个NHEJ突变读段被折合为单个读段，只计一次；目视确认出现频率排名前十的那些突变都出现在预期的切割位点内。然后，使用目视确认的NHEJ突变总数，基于读段总数，计算具有核苷酸与条形码和正向引物完全匹配的突变读段的一段适宜长度的百分比(％)。
通过深度测序，靶向三个LIGCas靶标(SEQ ID NO：16、17、18)的向导RNA/Cas内切核酸酶系统相比于靶向相同基因座的LIG3-4归巢内切核酸酶的NHEJ突变恢复频率示于表3。相比于LIG3-4归巢内切核酸酶，基于向导RNA/Cas内切核酸酶系统、恢复频率排名前十的NHEJ突变示于图3A(对应SEQ ID NO：55-75)和图3B(对应SEQ ID NO：76-96)。在使用向导RNA/Cas系统在玉米基因组靶位点(Cas靶位点)处引入双链断裂时，观察到NHEJ突变频率是LIG3-4归巢内切核酸酶对照的大约12至23倍。如表4所示，在MS26基因座处也观察到向导RNA/Cas系统与大范围核酸酶双链断裂技术间的类似差异，使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统时，NHEJ突变的频率为使用大范围核酸酶双链断裂技术的约14至25倍。在使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统时，MS45、ALS和EPSPS Cas靶标处也恢复了NHEJ突变的高频率(参见表5)。这些数据表明，本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统可用于在目的基因组位点处有效引入改变(例如那些与雄性能育性相关的改变)，其中所述改变导致产生雄性不育基因座和雄性不育植株。改变EPSPS靶标可以产生对基于草甘膦的除草剂有耐受性和/或抗性的植株。改变乙酰乳酸合酶(ALS)基因靶位点可以产生对咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂有耐受性和/或抗性的植株。
表3.通过向导RNA/Cas系统在玉米无叶舌1号靶基因座处产生的突变读段百分比 (％)同归巢内切核酸酶系统所产生突变读段百分比(％)进行比较。
系统 读段总数 突变读段数 突变读段百分比(％)
只用Cas9对照 640,063 1 0.00％
只用向导RNA对照 646,774 1 0.00％
LIG3-4归巢内切核酸酶 616,536 1,211 0.20％
LIGCas-1向导/Cas9 716,854 33,050 4.61％
LIGCas-2向导/Cas9 711,047 16,675 2.35％
LIGCas-3向导/Cas9 713,183 27，959 3.92％
表4.通过向导RNA/Cas系统在玉米雄性不育性26号靶基因座处产生的突变读段百 分比(％)同归巢内切核酸酶所产生突变读段百分比(％)进行比较。
表5.通过向导RNA/Cas系统在玉米雄性不育性45号靶基因座、乙酰乳酸合酶靶基 因座及烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合酶靶基因座处产生的突变读段百分比(％)。
系统 读段总数 突变读段数 突变读段百分比(％)
只用Cas9对照(MS45) 899,500 27 0.00％
MS45Cas-1向导/Cas9 812,644 3,795 0.47％
MS45Cas-2向导/Cas9 785,183 14,704 1.87％
MS45Cas-3向导/Cas9 728,023 9,203 1.26％
只用Cas9对照(ALS) 534,764 19 0.00％
ALSCas-1向导/Cas9 434,452 9,669 2.23％
ALSCas-2向导/Cas9 472,351 6,352 1.345％
ALSCas-3向导/Cas9 497,786 8,535 1.715％
只用Cas9对照(EPSPS) 1,347,086 6 0.00％
EPSPSCas-1向导/Cas9 1,420,274 13,051 0.92％
EPSPSCas-2向导/Cas9 1,225,082 26,340 2.15％
EPSPSCas-3向导/Cas9 1,406,905 53,603 3.81％
合在一起，数据表明：本文所述使用长向导RNA表达盒的玉米优化的向导RNA/Cas内切核酸酶系统有有效切割玉米染色体DNA，并且生成不完全NHEJ突变的频率高于使用工程化的LIG3-4与MS26++归巢内切核酸酶时的频率。
实施例3
玉米优化的向导RNA/Cas内切核酸酶系统的长向导RNA比短向导RNA更有效地切割 玉米染色体DNA
为确定在玉米中使用时最有效的向导RNA(包含crRNA与tracrRNA的融合体)，使用基于Jinek等人(2012)Science 337：816-21中提出的短向导RNA(SEQ ID NO：11)，和基于Mali等人(2013)Science 339：823-26中提出的长向导RNA(SEQ ID NO：8)，检查NHEJ突变恢复率。
按实施例1所述步骤，将靶向玉米LIG基因座处的基因组靶位点的向导RNA的可变靶向结构域(参见表1，LIGCas-1、LIGCas-2和LIGCas-3，SEQ ID NO：16、17和18)引入玉米优化的长向导RNA表达盒和短向导RNA表达盒，然后连同玉米优化的Cas9内切核酸酶表达盒一起共转化到玉米未成熟胚芽中，并且按实施例2所述执行深度测序。将只用Cas9内切核酸酶表达盒转化过的胚芽用作阴性对照。
如下表6所示，使用长向导RNA时NHEJ突变恢复的频率远高于使用短向导RNA时获得的恢复频率。这些数据表明，长向导RNA与本文所述的玉米优化的Cas9内切核酸酶基因配对更有效地切割玉米染色体DNA。
表6.由具有长向导RNA的向导RNA/Cas系统在玉米无叶舌1号靶基因座处产生的突 变读段百分比(％)同含短向导RNA的向导RNA/Cas系统所产生的突变读段百分比(％)进行 比较。
实施例4
向导RNA/Cas内切核酸酶系统通过不完全的非同源末端连接机制可同时多重靶向 玉米中的多个染色体基因座用于诱变
为检测用本文所述的向导RNA/玉米优化的Cas内切核酸酶系统可否同时诱变多个染色体基因座，将靶向MS26Cas-2靶位点(SEQ ID NO：14)、LIGCas-3靶位点(SEQ ID NO：18)和MS45Cas-2靶位点(SEQ ID NO：20)的长向导RNA表达盒(双链体或三链体形式)连同Cas9内切核酸酶表达盒共转化进玉米胚芽，并按实施例2所述，通过深度测序检查是否存在不精确的NHEJ突变。
用Cas9表达盒和对应的向导RNA表达盒共转化的Hi-II玉米胚芽单独用作阳性对照，只用Cas9表达盒转化的玉米胚芽用作阴性对照。
如下表7所示，在同时引入多个向导RNA表达盒(双链体或三链体形式)的情况下，相关基因座处由不精确NHEJ导致的突变全部恢复，而且突变读段的频率与阳性对照的突变读段的频率接近。因此表明，本文所述的玉米优化的向导RNA/Cas内切核酸酶系统可用于在玉米中的多个基因座处同时引入不精确NHEJ突变。
表7.通过多重向导RNA/Cas系统在玉米靶基因座处产生的突变读段百分比(％)
实施例5
在玉米染色体基因座中向导RNA/Cas内切核酸酶介导的DNA切割能够刺激同源重 组修复作用介导的转基因插入
为检测本文所述的玉米优化的向导RNA/Cas系统切割玉米染色体基因座并刺激同源重组(HR)修复途径以位点特异性地插入转基因的实用性，采用标准分子生物学技术，如图4所示构建HR修复DNA载体(也称作供体DNA)(SEQ ID NO：97)，然后将其连同长向导RNA表达盒(包含对应于LIGCas-3基因组靶位点的可变靶向结构域)和Cas9内切核酸酶表达盒，按实施例2所述步骤共转化到玉米未成熟胚芽中。
将用靶向与LIGCas-3相同的基因组靶位点的HR修复DNA载体和LIG3-4归巢内切核酸酶共转化的玉米胚芽(参见实施例9)用作阳性对照。因为成功递送HR修复DNA载体赋予双丙氨磷抗除草剂性，因此通过将愈伤组织置于含除草剂的培养基中，来选择包含推定的HR介导的转基因插入的愈伤组织事件。选择后，采集稳定的愈伤组织事件样品，提取其总基因组DNA，并且使用图5示出的引物对(对应于于SEQ ID NO：98-101)，在两处可能为转基因基因组DNA连接的位置进行PCR扩增，由此鉴定推定的HR介导的转基因插入。对所得的PCR扩增产物进行测序以用于确认扩增结果。
序列确认的PCR扩增产物表明，在384个稳定转化株中的37个转化株内检测到了向导RNA/Cas系统的位点特异性转基因插入，其中有15个转化株在两处转基因基因组DNA连接处从头到尾包含扩增产物，表明几乎完全以位点特异性方式插入了转基因。对LIG3-4归巢内切核酸酶阳性对照产生的PCR扩增产物表明在192个稳定转化株中的3个转化株内检测到了位点特异性转基因插入，其中有1个转化株在两处转基因基因组DNA连接处从头到尾包含扩增序列。这些数据清楚地表明，用本文所述的玉米优化的向导RNA/Cas系统切割的玉米染色体基因座可用于刺激HR修复途径，导致位点特异性插入转基因的频率高于LIG3-4归巢内切核酸酶。
实施例6
向导RNA/Cas内切核酸酶系统在单个载体上共同转化，导致不完全的非同源末端 连接突变的更大的恢复率
为评估本文所述的玉米优化的向导RNA/Cas内切核酸酶系统的不同递送方法，按实施例2、3、4和5中所述将向导RNA/Cas表达盒作为单独的DNA载体共转化、或将向导RNA/Cas表达盒作为单个载体DNA(图1C所示，既包含向导RNA又包含Cas内切核酸酶表达盒)转化，在此期间检查NHEJ突变的恢复。
通过标准分子生物学技术将LIGCas-3的长向导RNA表达盒与Cas9表达盒合并到单个载体DNA(图1C，SEQ ID NO：102)上，然后通过粒子介导递送技术，按实施例10和11所述将该载体DNA转化到Hi-II玉米胚芽中。用Cas9表达盒和LIGCas-3长向导RNA表达盒共转化的Hi-II胚芽用作阳性对照，只用Cas9表达盒转化的幼芽用作阴性对照。按实施例2所述进行NHEJ突变的深度测序。
如下表8所示，在将Cas内切核酸酶与长向导RNA表达盒作为单个载体DNA共同递送时，NHEJ突变恢复的频率是同等共转化实验观察到的频率的约2倍。该结果表明，在单个载体DNA上一同递送向导RNA/Cas系统表达盒导致不完全的非同源末端连接突变的更大恢复率。
表8.由向导RNA/Cas系统中Cas9表达盒与向导RNA表达盒合并为一个DNA载体在玉 米无叶舌1号靶基因座处产生的突变读段百分比(％)同Cas9表达盒与向导RNA表达盒作为 两个单独的DNA载体产生的突变读段百分比(％)进行比较。
实施例7
用于使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统编辑植物基因组的递送方法
本实施例描述了向植物中分别递送Cas9内切核酸酶和向导RNA(或单独的crRNA和tracrRNA)或在植物内分别保持Cas9内切核酸酶和向导RNA，继而在植物内分别表达Cas9内切核酸酶和向导RNA的多种方法，从而使得通过同源重组来定向DNA修饰或插入基因。更具体地，本实施例描述了多种方法，这些方法包括但不限于以DNA、RNA(5′端加帽RNA和聚腺苷酸化RNA)或蛋白分子形式递送Cas9内切核酸酶。此外，还能以DNA或RNA分子形式递送向导RNA。
如实施例2所示，在以DNA载体形式递送Cas9内切核酸酶和向导RNA时，通过基因枪转化玉米未成熟胚芽，观察到高突变频率。本公开的其它实施方案能以DNA、RNA或蛋白形式递送Cas9内切核酸酶，以DNA或RNA分子形式递送向导RNA，或者以RNA或DNA或其组合形式递送crRNA/tracrRNA双链体分子。递送Cas9内切核酸酶、向导RNA和crRNA/tracrRNA方法的各种组合可为但不限于表9所示方法。
表9：递送Cas9内切核酸酶、向导RNA或cRNA+tracrRNA的各种组合。
组合 递送的组分。(递送方法在括号内示出)
1 Cas9(DNA载体)，向导RNA(DNA载体)
2 Cas9(DNA载体)，向导RNA(RNA)
3 Cas9(RNA)，向导RNA(DNA)
4 Cas9(RNA)，向导RNA(RNA)
5 Cas9(蛋白)，向导RNA(DNA)
6 Cas9(蛋白)，向导RNA(RNA)
7 Cas9(DNA载体)，crRNA(DNA)，tracrRNA(DNA)
8 Cas9(DNA载体)，crRNA(RNA)，tracrRNA(DNA)
9 Cas9(DNA载体)，crRNA(RNA)，tracrRNA(RNA)
10 Cas9(DNA载体)，crRNA(DNA)，tracrRNA(RNA)
11 Cas9(RNA)，crRNA(DNA)，tracrRNA(DNA)
12 Cas9(RNA)，crRNA(RNA)，tracrRNA(DNA)
13 Cas9(RNA)，crRNA(RNA)，tracrRNA(RNA)
14 Cas9(RNA)，crRNA(DNA)，tracrRNA(RNA)
15 Cas9(蛋白)，crRNA(DNA)，tracrRNA(DNA)
16 Cas9(蛋白)，crRNA(RNA)，tracrRNA(DNA)
17 Cas9(蛋白)，crRNA(RNA)，tracrRNA 18(RNA)
18 Cas9(蛋白)，crRNA(DNA)，tracrRNA(RNA)
递送Cas9(以DNA载体)和向导RNA(以DNA载体)的实施例(表9中组合1)也可通过在单个或多个农杆菌载体上共递送这些DNA盒，然后转化由农杆菌介导转化的植物组织而实现。此外，可首先将包含组成型、组织特异性或条件式调控的Cas9基因的载体递送到植物细胞中，以使该Cas9基因能够稳定整合到植物基因组中，从而建立植物基因组中只含Cas9基因的植物品系。在该实施例中，在用向导RNA共递送用于靶向整合的HR修复DNA载体时，为了生成突变或促进同源重组，可将单个或多个向导RNA、或者单个或多个crRNA和tracrRNA作为DNA、或RNA或DNA与RNA的组合递送到包含基因组整合型式的Cas9基因的植物品系中。作为该实施例的延伸，也可建立包含基因组整合型式的Cas9基因和tracrRNA(作为DNA分子)的植物品系。在该实施例中，当由crRNA分子共递送用于靶向整合的HR修复DNA载体时，可将单个或多个crRNA分子作为RNA或DNA递送，以促进突变生成或促进同源重组，使植物基因组中的单个或多个位点处能够出现靶向诱变或同源重组。
实施例8
向导RNA/Cas内切核酸酶系统的成分直接作为RNA在植物中递送
该实施例示出使用表9所述的方法、实施例7的构型[Cas9(DNA载体)，向导RNA(RNA)]来修饰或诱变植物中的染色体基因座。如实施例2所述，用基因枪共递送实施例1所述的玉米优化的Cas9内切核酸酶表达盒与单链RNA分子(由Integrated DNA Technologies公司合成)，构成短向导RNA，该短向导RNA靶向表10所示的玉米基因座和序列。将只用Cas9表达盒或短向导RNA分子转化的胚芽用作阴性对照。基因枪轰击后第七天，收集未成熟胚芽，如实施例2所述执行深度测序，分析NHEJ突变。在图6所示位点处发现了阴性对照没有的突变(对应于SEQ ID NO：104-110)。这些突变与实施例2、3、4和6中发现的突变类似。该数据表明，本文所述的玉米优化的向导RNA/Cas内切核酸酶系统的组分可直接作为RNA递送。
表10.玉米基因组靶位点和作为RNA递送的短向导RNA的位置。
实施例9
产生罕见切割工程化的大范围核酸酶
LIG3-4大范围核酸酶和LIG3-4预期识别序列
选择包含LIG3-4预期识别序列(SEQ ID NO：111)的内源玉米基因组靶位点，用于如美国专利公布2009-0133152A1(2009年5月21日公布)所述设计罕见切割双链断裂诱导剂(SEQ ID NO：112)。LIG3-4预期识别序列为具有以下序列的22bp多核苷酸：ATATACCTCACACGTACGCGTA(SEQ ID NO：111)。
MS26++大范围核酸酶
选择被命名为“TS-MS26”(SEQ ID NO：113)的内源玉米基因组靶位点，用于如美国专利申请13/526912(2012年6月19日提交)所述设计定制的双链断裂诱导剂MS26++。TS-MS26靶位点为22bp多核苷酸，距玉米MS26基因的第五外显子的5’端62bp，并具有以下序列：gatggtgacgtac^gtgccctac(SEQ ID NO：113)。双链断裂位点和突出端区域带下划线，C13之后的酶切用^指示。将编码工程化MS26++内切核酸酶的工程化内切核酸酶的植物优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：114)设计为在选定的TS-MS26靶位点处结合并产生双链断裂。
实施例10
玉米未成熟胚芽的转化
转化可通过已知在植物中有效的各种方法来实现，包括粒子介导递送、农杆菌介导转化、PEG介导递送和电穿孔。
a.粒子介导递送
按以下步骤，利用粒子递送技术转化玉米未成熟胚芽。培养基配方如下所示。
给穗去皮，用30％Clorox漂白剂加0.5％微洗涤剂表面消毒20分钟，再用无菌水漂洗两次。分离未成熟胚芽，胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板放25个胚芽，置于560Y培养基中保持4小时，随后在2.5cm靶区域内对准，准备接受轰击。另选地，将分离的胚芽置于560L(起始培养基)上，并且置于暗处，26℃至37℃温度范围内放置8小时至24小时，然后置于560Y上，在26℃下保持4小时，再如上所述进行轰击。
使用标准分子生物学技术构建包含双链断裂诱导剂和供体DNA的质粒，然后与包含发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2)；US20090328252A1)和Wushel(US2011/0167516)的质粒共轰击。
使用水溶性阳离子脂质转染试剂，按下述步骤使质粒和目的DNA沉淀到0.6μm(平均直径)金颗粒上。首先使用1μg质粒DNA，以及任选地其它共轰击用构建体诸如各50ng(0.5μl)、包含发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2)；US20090328252A1)和Wushel的质粒，在冰上制备DNA溶液。取20μl制备好的金颗粒(15mg/ml)和5μl水溶性阳离子脂质转染试剂添加到水中，小心混合，得到预混DNA。将金颗粒在微量离心管中以10,000rpm粒化1分钟，然后弃去上清液。用100ml的无水乙醇(100％EtOH)小心冲洗得到的颗粒，注意不使颗粒重悬，然后小心除去冲洗用乙醇。加入105μl无水乙醇，并且通过短暂超声处理使颗粒重悬。然后，将10μl悬浮液点样到每个大载体中心，在轰击前使其干燥约2分钟。
另选地，通过将100μl含所制备钨颗粒的水、以Tris EDTA缓冲液为溶剂的10μl(1μg)DNA(DNA共计1μg)、100μl 2.5M CaC12和10μl 0.1M亚精胺混合，采用氯化钙(CaCl2)沉淀程序，将质粒和目的DNA沉淀到1.1μm(平均直径)钨颗粒上。在搅拌的同时，依次将每种试剂加入钨颗粒悬浮液。短暂超声处理最终混合物，并且使其置于恒定涡旋环境中温育10分钟。沉淀期之后，将各管短暂离心，弃去液体，用500ml无水乙醇洗涤颗粒，然后离心30秒。再次弃去液体，并且将105μl无水乙醇加入最终的钨颗粒中。为了进行粒子枪轰击，先短暂超声处理钨/DNA颗粒。将10μl钨/DNA颗粒点样到每个大载体的中心，在轰击之前使点样的颗粒干燥约2分钟。
用Biorad氦基因枪以第四档(level#4)轰击样品板。从具有制备好的颗粒/DNA的每管取等分试样，共计十份，以450PSI轰击所有样品各一次。
轰击之后，将胚芽置于560P(维持培养基)上，在26℃至37℃范围内的温度下培养12至48小时，然后置于26℃温度下。5至7天后，将胚芽转移到含3mg/L双丙氨磷的560R选择培养基上，并且在26℃下每两周继代一次。在选择的约10周之后，抗选择愈伤组织克隆体转移到288J培养基中，以引发植物再生。在体细胞胚成熟(2-4周)之后，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中用于发芽并转移到光照培养室。约7-10天之后，将发育中的苗转移到管中的272V无激素培养基中7-10天，直至苗良好地构建。然后将植物转移以插入包含盆栽土的平地(相当于2.5″盆)中，并在生长室中生长1周，随后在温室中生长另外的1-2周，然后转移到Classic600盆(1.6加仑)并生长至成熟。监测植物，并对转换效率、和/或再生能力的修饰进行评分。
起始培养基(560L)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、20.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用D-I H2O定容，之后用KOH调节至pH 5.8)；2.0g/l固化剂(在用D-IH2O定容之后添加)；以及8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却至室温之后添加)。
维持培养基(560P)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖、2.0mg/l 2，4-D和0.69g/l L-脯氨酸(用D-I H2O定容，之后用KOH调节至pH 5.8)；3.0g/l固化剂(在用D-IH2O定容之后添加)；以及0.85mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却至室温之后添加)。
轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用D-I H2O定容，之后用KOH调节至pH 5.8)；2.0g/l固化剂(在用D-IH2O定容之后添加)；以及8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却至室温之后添加)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖、和2.0mg/l 2，4-D(用D-I H2O定容，之后用KOH调节至pH 5.8)；3.0g/l固化剂(在用D-I H2O定容之后添加)；以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨磷(两者均在将培养基灭菌并冷却至室温之后添加)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素原液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇、以及0.40g/l甘氨酸(用精制D-I H2O定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)，100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖、以及1.0ml/l 0.1mM脱落酸(在调节至pH 5.6之后用精制D-I H2O定容)；3.0g/l固化剂(用D-I H2O定容之后添加)；以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨磷(将培养基灭菌并冷却至60℃之后添加)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/l MS维生素原液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇、以及0.40g/l甘氨酸(用精制D-I H2O定容)、0.1g/l肌醇、以及40.0g/l蔗糖(调节pH至5.6之后，用精制D-I H2O定容)；以及6g/l细菌培养用琼脂(用精制D-I H2O定容之后加入)，灭菌并冷却至60℃。
b.农杆菌介导转化
农杆菌介导转化基本上如Djukanovic等人(2006)Plant Biotech J 4：345-57中所述执行。简而言之，将10-12日龄的未成熟胚芽(尺寸为0.8-2.5mm)从灭菌内核进行解剖并且置于液体培养基中(4.0g/L N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/L Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)、1.0mg/L盐酸硫胺素、1.5mg/L 2，4-D、0.690g/L L-脯氨酸、68.5g/L蔗糖、36.0g/L葡萄糖，pH 5.2)。胚芽收集后，用浓度为0.35-0.45OD550的1ml农杆菌替换培养基。在室温下将玉米胚芽与农杆菌温育5分钟，然后将混合物倒入培养基板中，所述培养基板包含4.0g/L N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/L Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)、1.0mg/L盐酸硫胺素、1.5mg/L 2，4-D、0.690g/L L-脯氨酸、30.0g/L蔗糖、0.85mg/L硝酸银、0.1nM乙酰丁香酮以及3.0g/L固化剂，pH5.8。将胚轴向下在黑暗中于20℃下温育3天，然后在黑暗中于28℃下温育4天，然后转移到新的培养基板中，所述新培养基板包含4.0g/L N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/L Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)、1.0mg/L盐酸硫胺素、1.5mg/L 2，4-D、0.69g/L L-脯氨酸、30.0g/L蔗糖、0.5g/L MES缓冲液、0.85mg/L硝酸银、3.0mg/L双丙氨磷、100mg/L羧苄青霉素以及6.0g/L琼脂，pH 5.8。将胚芽每三周继代培养直至鉴定转基因事件。将少量组织转移至再生培养基(4.3g/L MS盐(Gibco 11117)、5.0ml/L MS维生素原液、100mg/L肌醇、0.1μM ABA、1mg/L IAA、0.5mg/L玉米素、60.0g/L蔗糖、1.5mg/L双丙氨磷、100mg/L羧苄青霉素、3.0g/L固化剂，pH 5.6)，并且在黑暗中于28℃培养两周，从而诱导体细胞胚发生。随后，将所有长出芽和根的材料转移到含有4.3g/L MS盐(Gibco 11117)、5.0ml/L MS维生素原液、100mg/L肌醇、40.0g/L蔗糖、1.5g/L固化剂，pH为5.6的培养基上，并且在人造光下于28℃温育。一周后，将小植株移入装有相同培养基的玻璃管中，并且使其生长直至再采样和/或将其移植到土壤中。
实施例11
BBM增强转化的瞬时表达
可修改转化方案的参数以确保BBM活性是瞬时的。一种此类方法涉及以某种方式将包含BBM的质粒沉淀，该方式允许转录和表达但阻止后续DNA释放，例如通过使用化学PEI。
在一个实施例中，BBM质粒沉淀到具有PEI的金颗粒上，同时使用标准氯化钙方法将待整合的转基因表达盒(UBI：：moPAT～GFPm：：PinII；moPAT为玉米优化的PAT基因)沉积到金颗粒上。
简而言之，如下所述用PEI包被金颗粒。首先，洗涤金颗粒。将三十五毫克金颗粒，平均直径1.0(A.S.I.#162-0010)称量到微量离心管中，并加入1.2ml无水EtOH，并涡旋一分钟。室温下温育微量离心管15分钟，然后使用微量离心机内在4℃下高速离心15分钟。弃去上清液，添加新的1.2ml乙醇等分试样，涡旋1分钟，再离心1分钟，再次弃去上清液(重复两次)。添加新的1.2ml乙醇等分试样，并且将该悬浮液(金颗粒悬于乙醇)在-20℃保存数周。为用聚氮丙啶(PEI；Sigma＃P3143)包被颗粒，将250μl经洗涤的金颗粒/乙醇混合物离心，并且弃去乙醇。将颗粒在100μl ddH2O中洗涤一次以除去残余的乙醇，添加250μl 0.25mMPEI，之后脉冲-超声处理以使颗粒悬浮，并且然后将管投入干冰/EtOH浴中以闪冻悬浮液，然后将其冷冻干燥过夜。此时的干燥的经包被颗粒可在-80℃下保存至少三周。在使用前，将颗粒用2.5mM HEPES缓冲液(pH 7.1)的250μl等分试样冲洗3次，并进行1x脉冲-超声处理，然后在每次离心之前快速涡旋。然后将颗粒悬浮到最终体积为250μl的HEPES缓冲液中。在附接DNA之前，将颗粒的25μl等分试样添加到新的管中。为附接未包被的DNA，将颗粒进行脉冲-超声波处理，然后添加1μg DNA(5μl水溶液)，之后通过利用微量分注器上下吸移数次来混合并温育10分钟。使颗粒简单旋转(即，10秒)，然后除去上清液，并加入60μl EtOH。将具有PEI沉淀的DNA-1的颗粒在60μl EtOH中洗涤两次。将该颗粒离心，丢弃上清液，并且将颗粒重新悬浮于45μl水中。为附接第二DNA(DNA-2)，利用水溶性阳离子脂质转染试剂进行沉淀。将45μl的颗粒/DNA-1悬浮液短暂超声处理，然后添加5μl 100ng/μl DNA-2和2.5μl水溶性阳离子脂质转染试剂。将溶液置于旋转振荡器上10分钟，以10,000g离心1分钟。除去上清液，并使颗粒重新悬浮于60μl EtOH中。将溶液点样到大载体上并且使用PDS-1000的标准方案将其上已经依次附接DNA-1和DNA-2的金颗粒递送到10DAP Hi-II未成熟胚芽的盾片细胞中。就该实验而言，DNA-1质粒包含UBI：：RFP：：pinII表达盒，并且DNA-2包含UBI：：CFP：：pinII表达盒。在轰击之后两天，CFP和RFP荧光标记两者的瞬时表达作为在未成熟胚芽表面上的大量红色&蓝色细胞被观察到。然后将胚芽置于非选择性培养基上，使其生长3周，然后对稳定的菌落评分。在该3周周期之后，相比于仅一个红色菌落，观察到10个多细胞稳定表达的蓝色菌落。这展示了PEI沉淀可用于有效引入DNA以用于瞬时表达，然而显著减少引入PEI的DNA的整合，从而减少RFP表达转基因事件的恢复。以这种方式，可将PEI沉淀用于递送BBM和/或WUS2的瞬时表达。
例如，首先用PEI使颗粒包被有UBI：：BBM：：pinII，接着用水溶性阳离子脂质转染试剂使颗粒包被有UBI：：moPAT～YFP，然后将颗粒轰入未成熟胚芽表面上的盾片细胞。PEI介导的沉淀导致未成熟胚芽表面上高频率的瞬时表达细胞，并且稳定转化体恢复的频率极低。因此，预期PEI沉淀的BBM盒瞬时表达，并刺激组织的受轰击表面(即，盾片表面)上的胚发生生长的爆发，但该质粒不会整合。预期从Ca++/金颗粒中释放的PAT～GFP质粒整合并以一定频率表达可选择标记，所述频率导致转基因事件的显著改善的恢复。作为对照处理，将包含UBI：：GUS：：pinII(代替BBM)的PEI-沉淀颗粒与PAT～GFP/Ca++颗粒混合。将两次处理的未成熟胚芽移到包含3mg/l双丙氨磷的培养基中。6-8周之后，预期将以相对于对照处理(PEI/GUS)高得多的频率，在PEI/BBM处理中观察到GFP+，抗双丙氨磷愈伤组织。
作为另选的方法，将BBM质粒沉淀到具有PEI的金颗粒上，然后引入到未成熟胚芽表面上的盾片细胞中，并且BBM基因的后续瞬时表达引起胚发生生长的快速增殖。在该诱导生长时期中，使用用于玉米的标准方法用农杆菌处理外植体(参见实施例1)，其中T-DNA递送到细胞中，从而引入转基因表达盒诸如UBI：：moPAT～GFPm：：pinII。在共培养之后，在正常培养基上回收外植体，然后将其移动到包含3mg/L双丙氨磷的培养基中。6-8周之后，预期将以相对于对照处理(PEI/GUS)高得多的频率，在PEI/BBM处理中观察到GFP+，抗双丙氨磷愈伤组织。
可能期望通过瞬时表达BBM和/或WUS2多核苷酸产物来“启动”愈伤组织生长。这可通过递送BBM以及WUS2 5′-封端的聚腺苷酸化RNA，含有BBM和WUS2DNA的表达盒，或者BBM和/或WUS2蛋白质来进行。这些分子全部均可使用基因枪来递送。例如，5′封端的聚腺苷酸化BBM和/或WUS2RNA可容易地使用Ambion的mMessage mMachine试剂盒在体外制备。将RNA连同包含目的多核苷酸的DNA和用于选择/筛选的标记诸如Ubi：：moPAT～GFPm：：PinII共递送。预期接收RNA的细胞将立即开始更快速地分裂并这些细胞中的大部分将整合农学基因。这些事件可进一步被验证为是转基因的克隆菌落，因为它们也将表达PAT～GFP融合蛋白(并且因此将在适当的照明下显示绿色荧光)。然后将从这些胚芽再生的植物针对目的多核苷酸的存在进行筛选。
实施例12
用DNA构建体测试向导RNA/Cas内切核酸酶系统是否在大豆基因组中引入修饰
为测试向导RNA/Cas内切核酸酶系统(与实施例1所述用于玉米的相似)是否在双子叶植物(诸如大豆)中起作用，用大豆强组成型启动子GM-EF1A2(美国专利申请20090133159(SEQ ID NO：116))表达来自酿脓链球菌M1 GAS(SF370)的优化的Cas9(SO)基因(SEQ ID NO：115)大豆密码子。将猿猴空泡病毒40(SV40)大T抗原核定位信号(SEQ IDNO：117)(代表氨基酸分子PKKKRKV(带接头SRAD(SRADPKKKRKV)))添加到密码子优化的Cas9的羧基端，以有助于将密码子优化的Cas9蛋白(SEQ ID NO：118)运送到细胞核。美国GenScript公司(Piscataway，NJ)将这种密码子优化的Cas9基因分两段合成，在框内克隆到GM-EF1A2启动子下游，以制出图7所示的DNA构建体QC782(SEQ ID NO：119)。
已由诸如拟南芥属和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)克隆出植物U6 RNA聚合酶III启动子并加以表征(Waibel and Filipowicz，NAR 18：3451-3458(1990)；Li等人，J.Integrat.Plant Biol.49：222-229(2007)；Kim和Nam，Plant Mol.Biol.Rep.31：581-593(2013)；Wang等人，RNA 14：903-913(2008))。本文通过使用拟南芥属U6基因编码序列搜索公开的大豆品种Williams82基因组序列，鉴定了大豆U6小核RNA(snRNA)基因。选择U6基因中第一个G核苷酸上游大约0.5kb的基因组DNA序列，以用作RNA聚合酶III启动子(例如GM-U6-13.1启动子(SEQ ID NO：120))，以表达向导RNA，从而引导Cas9核酸酶到达指定基因组位点。向导RNA编码序列长76bp(图8B)，并且在5’端包含来自选择的大豆基因组靶位点的20bp可变靶向结构域，在3’端包含4个或更多个T残基片作为转录终止子(SEQ ID NO：121，图8B)。这种20bp可变靶向结构域的第一核苷酸是G残基，将被RNA聚合酶III用于转录。合成U6基因启动子和完整的向导RNA，然后克隆进适当的载体，从而制备(例如)图8A所示DNA构建体QC783(SEQ ID NO：122)。类似地克隆出其它的大豆U6同源基因启动子，并且用于小RNA表达。
由于Cas9内切核酸酶和向导RNA需要形成蛋白/RNA复合物来介导位点特异性DNA双链切割，所以必须在同一细胞内表达Cas9内切核酸酶和向导RNA。为提高Cas9内切核酸酶和向导RNA表达盒的共表达水平和含量，将它们连接到单个DNA构建体(例如，图9A所示QC815(SEQ ID NO：123))，用于转化大豆细胞，以测试大豆优化的向导RNA/Cas系统的基因组修饰。使用包含不同靶序列的向导RNA制备类似的DNA构建体，来靶向不同的基因组位点。
实施例13
选择待被向导RNA/Cas内切核酸酶系统切割的大豆基因组位点
选择大豆染色体4(Gm04)的一个区域，以测试大豆优化的向导RNA/Cas内切核酸酶系统是否能通过不精确非同源末端连接(NHEJ)修复机制识别、切割大豆染色体DNA并使其突变。还选择了两个基因组靶位点，一个靠近114.13cM处的预测基因Glyma04g39780.1，本文命名为DD20基因座(图10A)；另一个靠近111.95cM处的Glyma04g39550.1，本文命名为DD43基因座(图10B)。向导RNA的每个20bp可变靶向结构域开始于G残基(RNA聚合酶III转录所需)，随后是大豆基因组中的3bp PAM基序(表11)。通过源序列搜索公开的大豆品种Williams82基因组序列，确定了靠近PAM序列的大豆基因组靶位点的染色体位置。经鉴定，大豆基因组靶位点DD20CR1(SEQ ID NO：125)、DD20CR2(SEQ ID NO：126)和DD43CR1(SEQ IDNO：127)在大豆基因组中都是独特的位点，同时在Gm06：12072339-12072361处找到了第二完全相同的23bp基因组靶位点DD43CR2(SEQ ID NO：128)，因此存在DD43CR2向导RNA靶向的两个潜在的切割位点。DD43CR1与DD43CR2是互补链序列，在相应位置后标注“c”。
表11.向导RNA/Cas内切核酸酶系统的大豆基因组靶位点。
类似地构建出包含以DD20CR1、DD20CR2和DD43CR2基因组靶位点之一为靶标的可变靶向结构域的向导RNA表达盒，将其连接至大豆Cas9表达盒，以制备与图9A所示QC815(SEQ ID NO：123)相似的DNA构建体QC817、QC818和QC816(不同的是向导RNA的20bp可变靶向结构域)。
因为可容许基因组靶位点(原间隔序列)的5’区域与20bp可变靶向结构域中至多6个连续错配，也就是说，可变靶向结构域和邻近PAM的crRNA序列之间的14个碱基对组成的连续片段必然足以支持高效靶向切割，所以遵循N(20)NGG模式的任意23bp基因组DNA序列都可被选作向导RNA/Cas内切核酸酶系统的靶位点。最后一个NGG是PAM序列，其不应被包含在向导RNA的20bp可变靶向结构域中。如果第一个N不是内源性G残基，则必须被向导RNA靶序列中的G残基替换，以适应RNA聚合酶III，不牺牲靶位点被向导RNA特异性识别的程度。
实施例14
通过瞬时转化将向导RNA/Cas内切核酸酶系统DNA递送到大豆
通过粒子枪轰击将大豆优化的Cas9内切核酸酶和向导RNA表达盒递送到胚发生悬浮培养物形式的大豆体细胞幼胚芽。按下列步骤诱导大豆胚发生悬浮培养物：从表面灭菌的未成熟种子中剖出子叶(长约3mm)，置于Murashige和Skoog(MS)培养基(含0.7％琼脂，补充有10mg/ml 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸))中，在26℃下光照培养6至10周。然后切下球形期体细胞胚(产生次生胚)，置于装有液体MS培养基(补充有2，4-D(10mg/ml))的烧瓶中，在旋转振荡器上光照培养。重复选择成簇体细胞胚，繁殖成球形期早期胚，然后将大豆胚发生悬浮培养物保持在旋转振荡器上的35ml液体培养基中，150rpm，26℃，每天用荧光连续照射16小时白天/8小时夜晚。通过将约35mg组织接种到35ml相同的新鲜液体MS培养基中，每两周将培养物继代一次。
然后使用DuPont BiolisticTM PDS 1000/HE仪器(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，采用粒子枪轰击方法转化大豆的胚发生悬浮培养物。向50μl 60mg/ml金颗粒(1.0mm)悬浮液中依次添加下列物质：例如，30μl 30ng/μl QC815DNA片段U6-13.1：DD43CR1+EF1A2：CAS9，20μl 0.1M亚精胺，以及25μl 5M CaCl2。搅拌颗粒制备物3分钟，放入离心机离心10秒，弃去上清液。用400μl无水乙醇洗涤DNA包被的颗粒一次，然后重悬于45μl无水乙醇中。用超声波处理DNA/颗粒悬浮液三次，每次1秒。将5μl的DNA包被的金颗粒加载到每个大载体盘上。
将大约100mg的培养两周的悬浮培养物置于60×15mm空培养皿中，并且用移液管从组织移除多余的液体。将膜破裂压力设定为1100psi，将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于距阻挡网约3.5英寸的位置，轰击一次。重新整理组织块，再轰击一次。向组织添加极少量不含2，4-D补充剂的液体MS培养基，防止培养物变干或过度生长。另一种防止组织变干的方法是，将60mm×15mm培养皿密封在装有固体MS琼脂培养基的100mm×25mm培养皿中。七天后收获组织，提取基因组DNA进行PCR分析。
实施例15
通过深度测序分析向导RNA/Cas内切核酸酶系统介导的位点特异性NHEJ
为评估由向导RNA/Cas内切核酸酶系统介导的大豆基因组靶位点处的DNA双链切割，通过PCR扩增该靶位点周围约100bp基因组DNA的区域，然后对PCR产物进行测序，以检测该靶位点处由NHEJ导致的突变。首先，取100ng基因组DNA，利用基因特异性引物，由Phusion高保真度主混合物(New England Biolabs)对前述区域进行20轮PCR扩增，所述基因特异性引物还包含第二轮PCR和后续序列分析所需的衔接子和扩增子特异性条形码序列。例如，利用引物DD20-S3(SEQ ID NO：133)/DD20-A(SEQ ID NO：134)、DD20-S4(SEQ ID NO：135)/DD20-A、DD43-S3(SEQ ID NO：136)/DD43-A(SEQ ID NO：137)以及DD43-S4(SEQ ID NO：138)/DD43-A进行表2所列四个实验中的第一PCR。利用通用引物(SEQ ID NO：140、141)，由Phusion高保真度主混合物将1微升第一轮PCR产物进一步PCR扩增，再扩增20轮。在1.5％琼脂糖凝胶上分离所得的PCR产物，再用Qiagen凝胶纯化离心柱纯化特定的DNA条带。然后，用DNA生物分析仪(Agilent)测量DNA浓度，将多达12个不同样品(各样品具有特定的条形码)的等摩尔量DNA混合为一个样品，用于Illumina深度测序分析。在杜邦核心实验室的Illumnia MiSeq个人型测序仪上用PhiX control v3(Illumina，FC-110-3001)以40％(v/v)加标(用于抵消序列偏差)，对100个核苷酸长的单个读段进行深度测序。
由于基因组靶位点位于长约100bp的PCR扩增子(SEQ ID NO：142、143、144、145)中央，所以对100个核苷酸长度进行深度测序足以覆盖该靶位点区域。选择以预期切割位点为中心、且涵盖10个核苷酸的窗口(即，PAM上游3bp)进行序列分析。只有那些读段长度为一个或多个核苷酸插入缺失(出现在涵盖10个核苷酸的窗口内)，而且阴性对照中未见类似含量的读段，才被归入NHEJ突变。将长度不同但含同一突变的多个NHEJ突变读段只计为一个读段，目视确认多达10种最常见的突变为特定突变，然后，使用目视确认的NHEJ突变总数，基于包含特定条形码和正向引物的分析读段总数计算突变读段百分比(％)。
利用一个RNA聚合酶III启动子GM-U6-13.1对四个靶位点DD20CR1、DD20CR2、DD43CR1、DD43CR2进行深度测序揭示的NHEJ突变频率示于表2。目视确认的最常见NHEJ突变示于图11A至图11D。图11A至图11E中的突变序列作为SEQ ID NO：147至SEQ ID NO：201列出。顶行是初始参考序列，靶位点序列加下划线。突变序列中，缺失由“---”指示，添加和替换由粗体字母指示。最后一列示出不同读段的每个突变的总数。以类似方式分析了只用Cas9核酸酶的构建体、只用向导RNA的构建体，以及未受DNA轰击的阴性对照，但由于未检测到特定突变，所以未示出分析数据。还测试了其它靶位点和向导RNA，得到相似的阳性结果，因而数据也未示出。
表12.由向导RNA/Cas内切核酸酶介导的NHEJ引入的靶位点特异性突变。
**至少前15个读段为特异性突变，但为与其它实验保持一致，表中只列出前10个读段。若将所有前15个突变计算在内，则突变读段总数为1080，突变百分比(％)为0.200％。
总之，分析数据指出，大豆优化的向导RNA/Cas内切核酸酶系统能够有效切割大豆内源性基因组DNA，并在指定基因组靶位点处产生不完全的NHEJ突变。
实施例16
向导RNA/Cas内切核酸酶系统将双链断裂(DBS)递送到玉米epsps基因座，从而得 到所需的点突变
开发了两种玉米优化的Cas9内切核酸酶，评估它们在基因组靶序列处引入双链断裂的能力。第一玉米优化的Cas9内切核酸酶如图1A所示(实施例2和表达盒SEQ ID NO：5)。第二玉米优化的Cas9内切核酸酶是moCas9内切核酸酶(SEQ ID NO：192)，通过将信号编码序列添加到moCas9编码序列的5’端(图13)，为该内切核酸酶补充SV40核定位信号。随后，为增强植物moCas9表达盒在玉米细胞中的表达并消除其在大肠杆菌和农杆菌中的表达，通过将ST-LS1内含子插入到moCas9编码序列中，对植物moCas9表达盒进行修饰。玉米泛素启动子序列和马铃薯蛋白酶抑制剂II基因终止子序列与moCas9内切核酸酶基因设计互补。moCas9表达盒的结构元件示于图13，其氨基酸序列和核苷酸序列作为SEQ ID NO：192和SEQID NO：193列出。
单向导RNA(sgRNA)表达盒基本上如实施例1所述并且在图1B中示出。由U6聚合酶III玉米启动子(SEQ ID NO：9)及其同族U6聚合酶III终止序列(TTTTTTTT)组成。单向导RNA(SEQ ID NO：194)包含20个核苷酸长的可变靶向结构域(SEQ ID NO：194中第1至20位核苷酸)，随后是能与诱导双链断裂的内切核酸酶相互作用的RNA序列。
EPSPS密码子序列内的玉米优化的Cas9内切核酸酶靶序列(moCas9靶序列)与向导sgRNA(确定Cas9内切核酸酶在EPSPS编码序列内切割的位点)的20个核苷酸长的可变序列互补。
合成moCAS9靶序列(SEQ ID NO：209中第25至44位核苷酸)，并且将其克隆进向导RNA-Cas9表达载体，该载体被设计成通过农杆菌介导转化将向导RNA-Cas9系统的组分递送到BMS(墨西哥黑甜玉米(Black Mexican Sweet))细胞。还利用农杆菌T-DNA递送了酵母FLP位点特异性重组酶和WDV(小麦矮小病毒)复制相关蛋白(复制酶)。由于moCas9靶序列侧接有FLP重组靶点(FRT)，因而被玉米细胞中的FLP切除，形成附加体(染色体样)结构。这种环状DNA片段通过WDV复制酶(复制起点嵌入WDV启动子)进行复制，这使它们能够在大肠杆菌细胞内恢复。如果玉米优化的Cas9内切核酸酶在moCas9靶序列处造成双链断裂，其修复便可能产生突变。下列文献详细讲述了该过程：Lyznik，L.A.，Djukanovic，V.，Yang，M.和Jones，S.(2012)Double-strand break-induced targeted mutagenesis in plants.发表于：Transgenic plants：Methods and Protocols(Dunwell，J.M.和Wetten，A.C.eds).NewYork Heidelberg Dordrecht London：Springer，第399-416页。
使用本文所述玉米优化的Cas9内切核酸酶之一的向导RNA/Cas内切核酸酶系统在moCas9靶序列中生成双链断裂(表13)。表13示出玉米BMS细胞中用SEQ ID NO：192的moCas9内切核酸酶或图1A所示玉米优化的cas9内切核酸酶诱变并且通过SEQ ID NO：5的表达盒表达的moCas9靶序列的百分比。两种向导RNA/Cas内切核酸酶系统都在玉米BMS细胞中附加体DNA分子上可用的67％至84％的moCas9靶序列处生成双链断裂(根据靶向诱变事件的数目判断)。经诱变的EPSPS靶序列的实施例示于图14。该观察结果表明，本文所述的玉米优化的Cas9内切核酸酶在玉米细胞中起作用，并在moCas9靶序列处有效生成双链断裂。
表13.玉米BMS细胞中由玉米优化的Cas9内切核酸酶诱变的moCas9靶序列的百分 比。
为完成玉米染色体EPSPS基因的靶向基因组编辑，创建多核苷酸修饰模板，用于为编辑EPSPS编码序列提供遗传信息，并将该多核苷酸修饰模板与向导RNA/Cas9系统组分共递送。
如图12所示，相比待编辑的EPSPS基因组序列，该多核苷酸修饰模板包含三个核苷酸修饰(用箭头指出)。这三个核苷酸修饰导致以下氨基酸改变：T-102改变为I-102，P-106改变为S-106，所以被称为TIPS突变。第一点突变由密码子序列ACT中的C核苷酸被T核苷酸置换为T核苷酸引起；第二点突变由相同密码子序列ACT中的T核苷酸被C核苷酸置换，形成异亮氨酸密码子(ATC)引起；第三点突变由密码子序列CCA中的第一C核苷酸被T核苷酸置换，形成丝氨酸密码子TCA引起(图12)。如SEQ ID NO：196：atcgcaatgcggtca所示，前述两种密码子序列彼此相距不足9个核苷酸。这三种核苷酸修饰以粗体示出。前述两种密码子序列之间的核苷酸与epsps基因座上未编辑的EPSPS基因是同源的。该多核苷酸修饰模板还包含玉米EPSPS基因组序列的DNA片段，这些DNA片段在EPSPS基因编辑过程中用作同源序列。同源序列的短臂(HR1，图12)为810个碱基对长，并且同源序列的长臂(HR2，图12)为2,883个碱基对长(SEQ ID NO：195)。
在该实施例中，EPSPS多核苷酸修饰模板作为质粒(参见图15所示模板载体1)，采用粒子枪轰击法，与向导sgRNA表达盒和玉米优化的Cas9内切核酸酶表达载体共递送，其中玉米优化的Cas9内切核酸酶表达载体包含图1A所示玉米优化的Cas9内切核酸酶表达盒(实施例1，SEQ ID NO：5)，并且还包含moPAT选择性标记基因。将10至11天龄未成熟胚芽的胚轴朝下置于装有N6培养基(表14)的板中，并且在28℃下温育4至6小时，再进行轰击。将这些板置于PDS-1000装置中底部起第三层搁架上，并且以200psi轰击。后轰击，在黑暗中于28℃温育胚芽过夜，然后转移至装有N6-2培养基的板中，在28℃下培养6至8天。将胚芽转移到装有N6-3培养基的板中培养3周，然后转移相应的愈伤组织至装有N6-4培养基的板中，再进行三周选择培养。经共计六周28℃选择培养后，将少量所选组织转移到MS再生培养基上，并且在黑暗中于28℃温育三周。
表14.培养基成分
通过以下步骤提取DNA：将愈伤组织细胞样品、两个不锈钢珠和450μL提取缓冲液(250mM NaCl，200mM Tris-HCl(pH 7.4)，25mM EDTA，4.2M盐酸胍)放入Mega滴定架的每个管中。将滴定架在Genogrinder中以1650r.p.m.振荡60秒，然后4℃下以3000×g离心20min。将300μl上清液转移到Unifilter96孔DNA结合GF/F微板(770-2810，Whatman，GEHealthcare)的孔中。将微板置于多孔板真空歧管(5017，Pall Life Sciences)的顶部。施加真空压力，直到孔完全变干。用100μL提取缓冲液重复一遍真空过滤过程，然后用250μL洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)，200mM NaCl，70％乙醇)重复两遍真空过滤过程。通过将GF/F过滤板置于空的废液收集板上，除去残余乙醇，并且以3000×g离心10min。在100μL洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.3)中洗脱DNA，并且以3000×g离心1min。每个样品进行四次PCR反应。在20μl总体积中，包含大约40ng基因组DNA、10μl REDExtract-N-Amp PCRReadyMix(R4775，Sigma-Aldrich Co.)和5皮摩尔每种引物。每个PCR反应的引物组合列于表15中。
表15.PCR反应的引物组合。
对五个得自未转化玉米近交小植株的基因组DNA样品进行同样的PCR反应。在95℃初始变性5分钟后，然后使用DNA Engine Tetrad2热循环仪(BioRad Laboratories，Hercules，CA)进行每个PCR扩增，每次扩增执行35个以上循环：94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min。将PCR产物F-E2、F-T和H-T与100bp DNA Ladder(N0467S，NewEnglandBiolabs)在1％琼脂糖凝胶中以100伏特分离45分钟。为进行测序，使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)将来自所选择的愈伤组织的F-F3PCR扩增片段克隆进pCR2.1-TOPO载体。在ABI 3700毛细管测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上，用BigDye Terminator chemistry进行DNA测序。每个样品包含约0.5μg Topo质粒DNA和6.4皮摩尔引物E3-EPex3Rev(ACCAAGCTGCTTCAATCCGACAAC，SEQ ID NO：204)。使用测序仪程序对序列进行分析。
筛选在包含双丙氨磷的培养基上选择的31个愈伤组织事件的样品(moPAT选择性标记基因为向导RNA-moCas9表达载体的一部分)是否存在TIPS点突变。24个事件包含已整合到基因组DNA中的TIPS点突变(图16，F-E2处理)。其中，6个事件显示染色体EPSPS基因的PCR扩增产物具有TIPS突变(图16，H-T处理)。PCR引物对(其中一个引物可与EPSPS多核苷酸修饰模板上没有的epsps基因组序列杂交，并且另一个引物结合到EPSPS多核苷酸修饰模板上的经编辑的EPSPS序列)将EPSPS-TIPS编辑产物与野生型epsps等位基因或TIPS突变的随机插入区分开。如果编辑一个EPSPS等位基因以包含TIPS置换，则无论在PCR扩增过程期间是否选择TIPS置换，这种经编辑的等位基因都应被检测为源自基因组epsps基因座的DNA片段。用野生型EPSPS引物替换TIPS引物(表15，F-E3引物对)，并且将PCR扩增产物克隆进TOPO克隆载体，然后测序。测序数据代表所选事件之一中基因组epsps基因座序列的随机样品(图17，愈伤组织A123360.92)。图17示出，在不改变任何其它epsps核苷酸的情况下，本文所公开的方法使得成功编辑了三种负责TIPS突变的核苷酸(图17中以粗体示出)，同时未诱变moCas9靶序列(向导RNA的结合位点在图17中加下划线)。
另外，其它EPSPS等位基因未被编辑，表明在该特定事件中只编辑了一个EPSPS等位基因(图17下面部分)。
从这些数据还示出，本公开使用向导RNA/Cas系统来进行基因编辑，展示出能够高效恢复基因编辑事件，所述高效为不到10个所选择的事件就有一个事件恢复)。
实施例17
向导RNA/Cas内切核酸酶系统将双链断裂递送到玉米epsps基因座，导致玉米植株 含有经编辑的EPSPS-TIPS基因。
如实施例16所述产生并选择EPSPS基因编辑事件。简而言之，EPSPS多核苷酸修饰模板作为质粒(参见图15所示模板载体1)，采用粒子枪轰击法，与向导RNA表达盒和玉米优化的Cas9内切核酸酶表达载体共递送，其中玉米优化的Cas9内切核酸酶表达载体包含图1A所示的玉米优化的Cas9内切核酸酶表达盒(实施例1，SEQ ID NO：5)，并且还包含moPAT选择性标记基因。
在28℃下选择培养6周后，将少量所选择的组织转移到MS再生培养基上，并且在黑暗中于28℃下温育3周。3周后，将可见苗转移到包含MS-1培养基的平板上，并且在26℃下光照培养1至2周，直至苗生长至适宜送入温室，然后将其转移至平地土壤。Ms-1培养基包含：4.3g/L MS盐(Gibco 11117)，5.0ml/L MS维生素原液(Sigma M3900)，100mg/L肌醇，40.0g/L蔗糖，和6.0g/L细菌用琼脂(pH 5.6)。
采用上述程序，由3282个胚芽培育出了390株T0玉米植株，因此，转化总效率为12％，这进一步表明本文所用的向导RNA/Cas系统只产生较低毒性或无毒性(表16)。
表16.EPSPS编辑的转化效率。
将T0小植株移至温室7至10天后，从每个T0小植株提取DNA，如实施例16所述进行PCR程序，以筛选T0植株在epsps基因座处是否有突变。
如实施例16所述的终点PCR程序测定，所分析的T0植株中的72％(270/375，表17)包含经诱变EPSPS等位基因。大多数突变(230/375或89％)是易错非同源末端连接(NHEJ)造成的，然而40株T0植株(40/375或11％)包含TIPS编辑EPSPS等位基因，这表明涉及模板化双链断裂修复机制(表17)。
表17.epsps基因座处的突变。
用引物对(表15，F-E3引物对)来扩增包含来自所选择的T0植株基因组DNA的moCas6靶序列和EPSPS编辑位点的epsps基因座的天然同源片段。将PCR扩增产物克隆进TOPO克隆载体，并且如实施例16所述进行测序。测序数据表示来自特定T0植株的基因组epsps基因座序列的随机样品(表18)，并且还指明所选择的T0植株的基因型。转移到盆中的含EPSPS-TIPS等位基因的T0植株列于表18中(选自初始40个含TIPS事件的一组T0植株)。
表18.在T0植株中观察到的epsps基因座的基因型。TIPS是指包含TIPS编辑EPSPS 序列的克隆。NHEJ是指存在NHEJ突变；并且WT是指存在由天然epsps基因座扩增的野生型 EPSPS序列。
如表18所示，所选择的植株E1以及E3至E9包含EPSPS-TIPS编辑型式的EPSPS基因，要么随附野生型EPSPS等位基因(WT)，要么随附NHEJ诱变的EPSPS等位基因(NHEJ)。表18中TIPS、WT、NHEJ前的数字指明鉴定特定型式EPSPS等位基因的频率。如果所有克隆都包含TIPS编辑的EPSPS序列，则所分析的植株可能是EPSPS-TIPS等位基因纯合植株(参见例如E2)。如果仅约50％的克隆包含TIPS编辑的EPSPS序列，则所分析的植株可能是EPSPS-TIPS等位基因半合植株(参见例如E1)。其它植株(诸如E3或E4)可能是TIPS嵌合植株。在一个事件E2中，T0植株在epsps基因座处仅包含TIPS编辑的序列，这表明，本文公开的向导RNA/Cas内切核酸酶系统在玉米植株中epsps基因座处成功编辑了负责两个EPSPS-TIPS等位基因的三个核苷酸(图17中以粗体示出)。
对所选择的T0植株执行qPCR分析，以估计野生型EPSPS基因和moCas9内切核酸酶序列的拷贝数。对于来自T0植株的DNA样品，进行玉米EPSPS基因和ADH持家基因的多重qPCR扩增。PCR反应所用的引物和探针示于表19。
表19.用于T0植株qPCR分析的引物。
所有分析都是使用LightCycler 480实时PCR系统(Roche Diagnostics)进行的。将wtEPSPS基因型的阈值设定为1.76。将EPSPS拷贝数小于1.76，终点荧光测量值最高也不足野生型对照两倍的每种样品归类为一种等位基因EPSPS基因型(相对野生型EPSPS等位基因为半合子)。
采用qPCR方法估计TIPS序列拷贝数。qPCR反应所用的引物和探针示于表20。
表20.qPCR分析中为估计TIPS序列拷贝数而使用的引物。
将具有ΔCt值的比较Ct值法归一化为双等位基因TIPS基因型的平均ΔCt值，提供了对所分析植株样品中检测到的TIPS序列的拷贝数估计。
表21：所选择的TO植株的qPCR基因分型和拷贝数。
qPCR基因分型表明，在所选择的T0植株的事件E1、E2、E7、E8和E9中未检测到野生型EPSPS等位基因(表21)。所选择的T0植株中存在TIPS模板序列和moCas9编码序列两者，据推测，这是由于与转化过程相关联的随机插入所致(表21：就TIPS模板序列而言，T0植株的E1、E7和E9事件)。如果两种遗传因子(随机插入的TIPS模板和moCas9表达盒)并非都连接至编辑的EPSPS-TIPS基因，则可采用标准育种程序在T1子代中将这两种遗传因子分离。
T0植株在温室中生长良好，并可繁殖。使用设定为每英亩20加仑的喷雾室，用1倍剂量草甘膦(Roundup Powermax)喷洒处于V3生长阶段的T0植株样本。1倍剂量草甘膦如下制备：将2.55ml Powermax溶于300ml水(活性成分：草甘膦即N-(膦酰基甲基)甘氨酸的钾盐形式，48.7％)。施用草甘膦后第7天，一些T0植株未观察到叶组织损坏。这些小植株是EPSPS-TIPS等位基因半合植株，而其它小植株严重损坏。施用除草剂后第14天，观察到一棵植株的叶组织仍未出现损坏，该植株在epsps基因座的44个基因组克隆中包含21个EPSPS-TIPS等位基因(如实施例16所述克隆并测序)。
这些数据表明，向导RNA/Cas系统可用于在玉米中产生TIPS编辑的EPSPS等位基因。获得在EPSPS-TIPS基因座处纯合(两个EPSPS等位基因得到编辑)且未插入附加的TIPS模板的玉米植株(植株E2)。此外，一些EPSPS-TIPS编辑的玉米植株的确显示出对1倍剂量草甘膦具有一定程度耐受性。
实施例18
玉米染色体基因座中向导RNA/Cas内切核酸酶介导的DNA切割允许在优质玉米品 系中插入转基因
为检测玉米优化的向导RNA/Cas系统是否能够切割玉米染色体基因座，并使同源重组(HR)介导的途径在优质玉米品系中位点特异性插入转基因，在玉米染色体1上选择位于51.54cM至54.56cM之间的4个基因座(图18)。在这4个基因座的每个处共识别出Cas内切核酸酶靶位点，分别表示为MHP14Cas-1、MHP14Cas-3、TS8Cas-1、TS8Cas2、TS9Cas-2、TS9Cas-3、TS10Cas-1和TS10Cas-3(图19，表22，SEQ ID NO：229至SEQ ID NO：236)。
表22.向导RNA/Cas内切核酸酶靶向的玉米基因组靶位点。
玉米优化的Cas内切核酸酶盒(SEQ ID NO：5)如实施例1所述制备。如实施例1和3所述设计出长向导RNA表达盒并且列于表23中，该长向导RNA表达盒包含以8个基因组靶位点之一为靶标的可变靶向结构域，由玉米U6聚合酶III启动子驱动，并由玉米U6聚合酶III终止子终止。使用标准分子生物学技术构建包含选择性标记(磷酸甘露糖异构酶(PMI)表达盒)的供体DNA(HR修复DNA)，该供体DNA侧接有两个同源区域。
表23.
向导RNA(gRNA)和供体DNA表达盒的列表
按实施例10所述，通过粒子介导递送将包含以SEQ ID NO：5示出的玉米优化的Cas9内切核酸酶的载体、包含以SEQ ID NO：245至SEQ ID NO：252示出的八个长向导RNA表达盒之一的载体、和包含以SEQ ID NO：253至SEQ ID NO：260示出的八个供体DNA之一的载体共递送到优质玉米品系的未成熟胚芽中。针对每个靶位点，轰击大约1000个胚芽。因为供体DNA包含选择性标记PMI，因此成功递送供体DNA使愈伤组织能够在甘露糖培养基上生长。通过将愈伤组织置于含甘露糖的培养基中，选择推定的HR介导的转基因插入。选择后，对成熟板上稳定的苗取样，提取总基因组DNA，然后使用表24所示的引物对(对应于于SEQ IDNO：261-270)，在两处可能为转基因基因组DNA连接的位置进行PCR扩增，由此鉴定推定的HR介导的转基因插入。
表24.用于在每个靶位点处筛选整合事件的引物序列。
针对一个基因座处的两个靶位点中的每个，使用相同的基因组引物。对所得的扩增产物进行测序，以确定这些位点是否突变或是否包含插入的转基因。
将恢复事件数除以轰击的胚芽总数，计算出“事件恢复频率”，该频率可以指示内切核酸酶是否具有某种毒性效应(表26)。因此，如果轰击了1000个胚芽，其中240个胚芽得以恢复，则事件恢复频率为24％。表26指示对于所有分析的靶位点，事件恢复频率介于17％至28％之间的范围内，这表明本文所用的向导RNA/Cas系统只产生较低毒性或无毒性。还通过确定“靶位点突变频率”(表26)测量了Cas内切核酸酶在植物中的活性，其中“靶位点突变频率”被定义为：(具有靶位点修饰的事件数/恢复事件总数)*100％。因此，如果240个事件恢复，而180个事件显示出突变，则靶位点突变频率为75％。如2013年5月3日提交的美国申请13/886317中实施例9所述，使用靶位点等位基因拷贝数测量靶位点突变频率。为获得靶位点拷贝数，在每个位点处进行qPCR使用的引物和探针列于表25(SEQ ID NO：271-294)。
表25.用于评估8个玉米基因组靶位点处的DNA切割的引物和探针序列
如表26所示，所有8个向导RNA/Cas9系统在切割其靶标DNA和诱导突变(通过非同源末端连接(NHEJ))方面均非常有效，突变频率在33％至90％的范围内证实了这一点。
还筛选了所有事件是否存在插入的转基因。针对每个靶位点筛选的插入事件示于图21。在每个位点处用于插入PCR分析的引物列于表24。图22示出了用于插入事件筛选的PCR结果的一个实施例。通过计算“插入频率”来确定转基因插入频率，其中“插入频率”被定义为：(具有靶位点插入的事件数/恢复事件总数)*100％。因此，如果恢复240个事件，而21个事件显示转基因插入，则插入频率为9％。
表26.由玉米植株组织中期望靶位点处的靶位点突变频率和转基因插入频率确定 的向导RNA/Cas9系统在8个靶位点处的活性
*HR1和HR2连接都为显性的事件数
**仅HR2连接可用
序列确认的PCR扩增结果表明，8个靶位点中的每个靶位点均以位点特异性方式插入了转基因，如表26(插入频率列)所示。而且，转基因盒在所有8个靶位点处均高效插入(2％至16％)。在两处转基因基因组DNA连接处从头到尾包含扩增产物的事件数(示于表26的括号中)表明，几乎完全以位点特异性方式插入了转基因。
合在一起，这些数据展示：用本文所述的玉米优化的向导RNA/Cas系统切割的玉米染色体基因座可用于在优质玉米近交品系中高频插入转基因。
实施例19
通过稳定转化将向导RNA/Cas9内切核酸酶系统DNA递送到大豆中
以与实施例12中针对大豆启动子GM-U6-13.1(SEQ ID NO：120)所述类似的方式，鉴定大豆U6小核RNA启动子(GM-U6-9.1；SEQ ID NO：295)。然后使用GM-U6-9.1启动子来表达向导RNA，以引导Cas9核酸酶至指定的基因组靶位点。
将大豆密码子优化的Cas9内切核酸酶表达盒(诸如例如EF1A2：CAS9，SEQ ID NO：296)与向导RNA表达盒(诸如例如U6-9.1：DD20CR1：SEQ ID NO：297)连接(诸如U6-9.1：DD20CR1+EF1A2：CAS9；SEQ ID NO：298，图23A)，并且整合到DNA质粒中，该DNA质粒与另一个包含供体DNA(修复DNA)盒(诸如DD20HR1-SAMS：HPT-DD20HR2；SEQ ID NO：299)的质粒通过粒子枪轰击共递送到胚发生悬浮培养物形式的大豆体细胞幼胚芽中(图23A，图23B)。类似地构造其它靶向各个大豆基因组位点的向导RNA/Cas9DNA构建体，和用于通过同源重组以位点特异性方式整合转基因的供体DNA构建体，并且列于表27。这四种gRNA/Cas9构建体的不同只在于20bp向导RNA靶向结构域(可变靶向结构域)，这些可变靶向结构域靶向大豆基因组靶位点DD20CR1(SEQ ID NO：125)、DD20CR2(SEQ ID NO：126)、DD43CR1(SEQ ID NO：127)、或DD43CR2(SEQ ID NO：128)。这两种供体DNA构建体的不同只在于同源区域，诸如DD20HR1和DD20HR(图23B)，或DD43HR1和DD43HR2。采用下文将描述的稳定转化程序将这些向导RNA/Cas9DNA构建体和供体DNA共递送到优质(93B86)或非优质(Jack)大豆基因组。
表27.向导RNA/Cas9介导的大豆稳定转化。
按下述步骤诱导DuPont Pioneer专有的优质品种93B86，获得大豆体细胞胚发生悬浮培养物。从表面灭菌的未成熟种子中解剖出子叶(长约3mm)，在Murashige和Skoog(MS)培养基(含0.7％琼脂，补充有10mg/ml 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸))中，在光照中于26℃培养6至10周。然后切下球形期体细胞胚(其产生次生胚)，并且置于含有液体MS培养基(补充有2，4-D(10mg/ml))的烧瓶中，并在旋转振荡器上光照培养。重复选择繁殖成球形期早期胚的成簇体细胞胚后，然后将大豆胚发生悬浮培养物保持在旋转振荡器上的35ml液体培养基中，150rpm，温度26℃，每天用荧光连续照射16小时白天/8小时夜晚。通过将约35mg组织接种到35ml相同的新鲜液体MS培养基中，每两周将培养物继代一次。
然后使用DuPont BiolisticTM PDS 1000/HE仪器(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，通过粒子枪轰击方法转化大豆的胚发生悬浮培养物。向50μl 60mg/ml金颗粒(1.0mm)悬浮液中依次添加下列物质：30μl等量(30ng/μl)质粒DNA，其包含例如U6-9.1：DD20CR1+EF1A2：CAS9(SEQ ID NO：298)和质粒DNA，其包含例如DD20HR1-SAMS：HPT-DD20HR2(SEQ ID NO：299)(表27所列实验U6-9.1DD20CR1)，20μl 0.1M亚精胺，以及25μl的5MCaCl2。搅拌颗粒制备物3分钟，放入离心机离心10秒，并且弃去上清液。用400μl无水乙醇洗涤DNA包被的颗粒一次，然后重悬于45μl无水乙醇中。用超声波处理DNA/颗粒悬浮液三次，每次1秒。将5μl这种DNA包被的金颗粒装到每个大载体盘上。
将大约300-400mg两周龄的悬浮培养物置于60×15mm空培养皿中，用移液管从组织移除残余的液体。对于每次转化实验，轰击大约5至10块板的组织。将膜破裂压力设定为1100psi，并且将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于距阻挡网约3.5英寸的位置，轰击一次。轰击后，将组织分成两半，放回液体培养基，并且如上所述培养。
后轰击五至七天，用含有30mg/ml潮霉素(作为选择剂)的新鲜培养基替换上述液体培养基。每周更换一次这种选择性培养基。后轰击七至八周，观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚芽发生簇长出。移除分离的绿色组织，并且接种到各个烧瓶，生成新的无性繁殖转化胚发生悬浮培养物。将每份无性繁殖培养物作为独立的转化事件进行处理，在相同的液体MS培养基(补充有2，4-D(10mg/ml)和30ng/ml潮霉素选择剂)中继代培养，以增加质量。然后将胚发生悬浮培养物转移到不含2，4-D补充剂的琼脂固体MS培养基平板上，以允许体细胞胚发育。收集该阶段的每个事件的样品用于定量PCR分析。
使子叶期体细胞胚(通过转移到10cm培养皿(含有一些琼脂凝胶，以允许缓慢干燥)的顶部密封的空的小培养皿中)干燥，从而模拟大豆种子发育的最后阶段。将干燥的胚芽置于发芽发固体培养基上，再生出转基因大豆小植株。然后将转基因植株转移到生长室内的土壤中，维持其生长，用于制种。在体细胞胚期或T0叶期对转基因事件取样用于分子分析。
使用优质品种93B86和表27所列组分，如上所述进行类似的转化实验(U6-9.1DD20CR2，U6-9.1DD43CR1，U6-9.1DD43CR2)。
还采用非优质大豆品种“Jack”执行了表27列出的两个转化实验U6-9.1DD20CR1和U6-9.1DD43CR1，以检测gRNA/Cas9系统在不同大豆基因型中的性能。
实施例20
检测稳定转化大豆中的向导RNA/Cas9系统介导的位点特异性NHEJ
从体细胞胚样本中提取基因组DNA，采用7500实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)用靶位点特异性引物FAM标记荧光探针通过定量PCR进行分析，以检查靶位点DD20或DD43的拷贝数变化(图24A至图24C)。以双重反应形式执行qPCR分析，采用热激蛋白(HSP)基因作为内源性对照，采用包含靶位点(带2个等位基因)的一个拷贝的野生型93B86基因组DNA样品作为单拷贝校准品(calibrator)。HSP内源性对照qPCR采用引物探针组HSP-F/HSP-T/HSP-R。DD20-CR1(SEQ ID NO：306)和DD20-CR2(SEQ ID NO：307)特异性qPCR采用引物探针组DD20-F(SEQ ID NO：308)/DD20-T(SEQ ID NO：309)/DD20-R(SEQ IDNO：310)。DD43-CR1(SEQ ID NO：311)特异性qPCR采用引物探针组DD43-F(SEQ ID NO：313)/DD43-T(SEQ ID NO：315)/DD43-R(SEQ ID NO：316)，而DD43-CR2(SEQ ID NO：312)特异性qPCR采用引物探针组DD43-F2(SEQ ID NO：314)/DD43-T/DD43-R。向导RNA/Cas9DNA(SEQ IDNO：298、300、301和303)特异性qPCR采用引物探针组Cas9-F(SEQ ID NO：317/Cas9-T(SEQID NO：318)/Cas-9-R(SEQ ID NO：319)。供体DNA(SEQ ID NO：299和302)特异性qPCR采用引物探针组Sams-76F(SEQ ID NO：320)/FRT1I63-T(SEQ ID NO：321)/FRT1I-41F(SEQ ID NO：322)。用VIC标记内源性对照探针HSP-T，用FAM标记基因特异性探针DD20-T、DD43-T、Cas9-T和FRT1I63-T，以此同时检测两根荧光探针(Applied Biosystems)。捕集集PCR反应数据，使用7500实时PCR系统提供的序列检测软件进行分析，并使用相对定量方法(AppliedBiosystems)计算基因拷贝数。
由于带靶位点的两个等位基因的野生型93B86基因组DNA被用作单拷贝校准品，所以，靶位点没有任何改变的事件将作为一个拷贝被检测到，本文称为Wt-Homo(qPCR值＞＝0.7)；一个等位基因改变的事件不再可被靶位点特异性qPCR检测到，将作为半个拷贝被检测到，本文称为NHEJ-Hemi(0.1＜qPCR值＜0.7)；两个等位基因都改变的事件将作为无效事件被检测到，本文称为NHEJ-Null(qPCR值＝＜0.1)。宽范围的qPCR值表明，大多数事件既包含靶位点的突变序列，又包含靶位点的野生型序列。在所有四个实验中都检测到较高的NHEJ-Hemi百分比(10.1％至33.5％，表28)和NHEJ-Null百分比(32.3％至46.4％，表21)，且组合的NHEJ的平均频率高于60％(表28)。
表28.优质大豆种质中向导RNA/Cas9系统诱导的靶位点突变和位点特异性基因整 合。数字表示事件的数量(括号内的数字为百分比)。NA＝未分析。
表29.非优质大豆种质中向导RNA/Cas9系统诱导的靶位点突变和位点特异性基因 整合。数字表示事件的数量(括号内的数字是占分析事件总数的百分比)。
NHEJ-Hemi和NHEJ-Null是在两个实验U6-9.1DD20CR1-Jack和U6-9.1DD43CR1-Jack中用“Jack”基因型重复检测得到的数据，但频率较低(表29)。NHEJ频率的差别可能是转化实验之间的变化引起的。
使用分别对DD20-HR1和DD20-HR2有特异性的DD20-LB引物(SEQ ID NO：323)和DD20-RB引物(SEQ ID NO：326)，或者分别对DD43-HR1和DD43-HR2有特异性的DD43-LB引物(SEQ ID NO：327)和DD43-RB引物(SEQ ID NO：328)，对相同的基因组DNA样品进行常规PCR扩增，从而将NHEJ-Null事件的靶区域分别扩增为DD20靶位点特异性HR1-HR2PCR扩增子(图25A至图25C；SEQ ID NO：329)，或DD43靶位点特异性HR1-HR2PCR扩增子(SEQ ID NO：332)。使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR条带克隆进pCR2.1载体，然后对多个克隆进行测序，以检查NHEJ所导致的靶位点序列变化。所有四个受检靶位点都在Cas9切割位点处(即PAM上游3bp)显示各种小缺失(图26A至图26C)。还在一些序列中检测到较小插入。从一些相同的事件中识别出了不同的突变序列，指示这些事件具有嵌合属性。还从不同的事件中识别出了一些相同的突变序列，表明相同的突变可能是独立发生的，或者这些事件中的一些可能是克隆事件。这些序列的分析结果证实，特定的Cas9靶位点处发生了向导RNA/Cas9系统介导的NHEJ。
实施例21
鉴定稳定转化大豆中的向导RNA/Cas9系统介导的同源重组引起的位点特异性基 因整合
通过边界特异性PCR分析来确定向导RNA/Cas9系统介导的DNA同源重组引起的位点特异性基因整合。用引物DD20-LB(SEQ ID NO：323)和Sams-A1(SEQ ID NO：324)，通过PCR将DD20CR1事件和DD20CR2事件的5’端边界扩增为1204bp DD20HR1-SAMS PCR扩增子(SEQID NO：330)，并用引物QC498A-S1和DD20-RB，将同样事件的3’端边界扩增为1459bpDD20NOS-HR2PCR扩增子(SEQ ID NO：331)(图25A至图25C)。任何具有扩增的5’边界和3’边界特异性条带的事件都被视为通过同源重组得到的位点特异性整合事件，这些事件都包含来自供体DNA片段DD20HR1-SAMS：HPT-DD20HR2或其环状形式的转基因(图23)。用引物DD43-LB和Sams-A1，通过PCR将DD43CR1事件和DD43CR2事件的5’端边界扩增为1202bp DD43HR1-SAMS PCR扩增子(SEQ ID NO：333)，并用引物QC498A-S1(SEQ ID NO：325)和DD43-RB(SEQID NO：328)，将同样事件的3’端边界扩增为1454bp DD43NOS-HR2PCR扩增子(SEQ ID NO：334)。任何具有扩增的5’边界和3’边界特异性条带的事件都被视为通过同源重组得到的位点特异性整合事件，这些事件都包含来自修复DNA片段DD43HR1-SAMS：HPT-DD43HR2或其环状形式的转基因。我们对边界特异性PCR片段中的一些进行测序，结果证实，这些片段都是预期源自同源重组的重组序列。平均来说，向导RNA/Cas9介导的同源重组引起基因整合的概率为转基因事件总数的约4％(参见表28和表29的插入频率)。重复采用“Jack”基因型，从实验U6-9.1DD43CR1-Jack中鉴定出了一个同源重组事件(表29)。
实施例22
crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统通过不完全的非同源末端连接机制切割玉 米中的染色体DNA并引入突变
为检测实施例1描述的玉米优化的crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统是否能够经由不精确的非同源末端连接(NHEJ)修复途径识别、切割玉米染色体DNA并使其发生突变，以三个不同的基因组靶序列为切割靶标(参见表30)，并通过深度测序检查NHEJ突变的存在与否。
表30.crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统靶向的玉米基因组靶序列。
LIG＝无叶舌1号基因启动子
通过粒子介导递送技术(参见实施例5)，在存在BBM和WUS2基因的情况下，将玉米优化Cas9内切核酸酶表达盒、包含与表30中所列玉米基因组靶序列的反义链互补的特定玉米可变靶向结构域(SEQ ID NO：445-447)的crRNA表达盒，和tracrRNA表达盒(SEQ ID NO：448)共递送到60至90个Hi-II未成熟玉米胚芽中(参见实施例6)。用靶向LIGCas-3基因组靶位点(SEQ ID NO：18)进行切割的Cas9表达盒与长向导RNA表达盒转化的Hi-II玉米胚芽用作阳性对照，仅用Cas9表达盒转化的玉米胚芽用作阴性对照。7天后，将每个处理组的20至30个转化最为均匀的胚芽合并，提取总基因组DNA。用高保真度PCR主混合物(NewEngland Biolabs，M0531L)对预期靶位点周围的区域进行PCR扩增，将该主混合物添加到扩增子特异性条形码所必需的序列上，然后利用“加尾”引物，在两轮PCR过程中进行Illumnia测序。一级PCR反应使用的引物示于表31；二级PCR反应使用的引物为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG(正向，SEQ ID NO：53)和CAAGCAGAAGACGGCATA(反向，SEQ ID NO：54)。
表31.PCR引物序列
用Qiagen PCR纯化离心柱纯化PCR扩增产物，等摩尔比混合，采用基于Hoechst染料的荧光测定法测量浓度，再将扩增产物于Illumina MiSeq个人型测序系统中，用PhiXcontrol v3(Illumina，FC-110-3001)以30％至40％(v/v)加标(用于抵消序列偏差)，对100个核苷酸长的单个读段进行深度测序。只有那些读段长度≥1个核苷酸插入缺失(indel)(在以预期切割位点为中心、且含10个核苷酸的窗口内)，而且阴性对照中未见类似含量的突变，才被归入NHEJ突变。具有相同突变的多个NHEJ突变读段被计数为单个读段，只计一次；目视确认出现频率排名前十的那些突变都出现在预期的切割位点内。然后，使用目视确认的NHEJ突变总数，基于读段总数，计算一段长度适宜读段与条形码和正向引物完全匹配的突变体读段的百分比(％)。
通过深度测序，靶向三个LIGCas靶标(SEQ ID NO：16、17、18)的crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统相比靶向相同基因座的长向导RNA/Cas内切核酸酶系统的NHEJ突变恢复频率，结果示于表32。
表32.crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统在玉米无叶舌1号靶基因座处产生的 突变读段百分比(％)同长向导RNA/Cas内切核酸酶系统所产生突变读段百分比(％)进行比 较
基于crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统、恢复频率排名前十的NHEJ突变示于图27A(就LIGCas-1靶位点而言，对应于SEQ ID NO：415-424)、图27B(就LIGCas-2靶位点而言，对应于SEQ ID NO：425-434)和图27C(就LIGCas-3靶位点而言，对应于SEQ ID NO：435-444)。使用crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统在玉米基因组靶位点处引入双链断裂时，相比使用长向导RNA/Cas内切核酸酶系统对照，观察到NHEJ突变频率大约低9-16倍。
合在一起，这些数据表明：本文所述的玉米优化的crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统切割玉米染色体DNA，并且产生不完全的NHEJ突变。
实施例23
修饰ARGOS8基因以提高玉米植株的耐旱性和氮利用效率
ARGOS是植物中乙烯反应的负调节因子(2013年5月10日公布的WO 2013/066805A1)。ARGOS蛋白靶向乙烯信号转导途径。一旦ARGOS在玉米植株中过表达，就会降低植物对乙烯的敏感性，并促进器官生长，从而导致耐旱性(DRT)提高，改善氮利用效率(NUE)(2013年5月10日公布的WO 2013/066805 A1)。为实现最佳的乙烯敏感性，检测了用于驱动Zm-ARGOS8在转基因玉米植株中过表达的启动子。现场试验表明，玉米启动子Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON(SEQ ID NO：460，2003年1月7日公布的美国专利6,504,083；Zm-GOS2为玉米中与稻GOS2同源的基因。稻GOS2代表来自水稻(Oryza Sativa)2)的基因，为Zm-ARGOS8提供了有利的表达水平和组织覆盖率；而且，在干旱胁迫和低氮条件下，转基因植物相比非转基因对照具有更高的谷粒收率(2013年5月10日公布的WO 2013/066805 A1)。然而，这些转基因植物含有两种ARGOS8基因：内源性基因和转基因。因此，ARGOS8蛋白水平由这两种基因决定。由于内源性ARGOS8基因的序列、以及在不同近交系中的表达水平不同，所以将该转基因整合到不同近交株中时，ARGOS8蛋白水平将会不同。我们在这里提出诱变(基因编辑)方法，用来修饰内源性ARGOS8基因的启动子区域，旨在获得期望的表达模式并消除对转基因的需求。
使用向导RNA/Cas9系统，将启动子Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON(SEQ ID NO：460；2003年1月7日公布的美国专利6,504,083)插入到Zm-ARGOS8的5’-UTR(SEQ ID NO：462)中。Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON片段还在其5’端包含引物结合位点，以有利于采用PCR筛选事件。我们还用Zm-GOS2 PRO：：GOS2 INTRON(SEQ ID NO：460)置换了Zm-ARGOS8的天然启动子(SEQ ID NO：461)。所得的玉米品系携带新的ARGOS8等位基因，该等位基因的表达水平和组织特异性将与天然形式不同。我们预期这些品系将重现耐旱性提高且NUE改善的表型，这种表型与Zm-GOS2 PRO：Zm-ARGOS8转基因植物中观察到的表型(参见2013年5月10日公布的WO2013/066805 A1)相同。这些玉米品系不同于下列常规的转基因事件：(1)基因组中只存在一种ARGOS8基因；(2)经修饰的Zm-ARGOS8型式存在于其天然基因座处；(3)ARGOS8蛋白水平和基因表达的组织特异性完全由经编辑的等位基因控制。诱变期间使用的DNA试剂(诸如向导RNA、Cas9内切核酸酶、转化选择标记和其它DNA片段)不是新生成的ARGOS8等位基因发挥作用所必需的，并且可通过标准育种方法从基因组中分离来消除。由于启动子Zm-GOS2PRO：GOS2 INTRON从玉米GOS2基因(SEQ ID NO：464)拷贝得到，并通过同源重组插入ARGOS8基因座，所以该ARGOS8等位基因无法与天然突变体等位基因区分开。
A.将玉米(Zea mays)GOS2 PRO：GOS2 INTRON插入到玉米ARGOS 8启动子中
为将Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON插入到玉米ARGOS8基因的5’-UTR中，使用本文所述的玉米U6启动子和终止子制成向导RNA构建体gRNA1。向导RNA的5’端包含19bp的可变靶向结构域，其靶向Zm-ARGOS8的5’-UTR中的基因组靶序列1(CTS1；SEQ ID NO：451)(图28)。由CTS1的上游区域和下游区域衍生出多核苷酸修饰模板，该模板包含侧接有两个基因组DNA片段(HR1和HR2，长度分别为370bp和430bp)的Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON(图28)。采用粒子轰击法，将gRNA1构建体、多核苷酸修饰模板、Cas9表达盒和转化选择标记磷酸甘露糖异构酶(PMI)引入到玉米未成熟胚芽细胞中。用PCR筛选对PMI有抗性的愈伤组织中是否插入了Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON(图29A和图29B)。鉴定多个愈伤组织事件，并且再生植株。通过用PCR扩增T0植株中的Zm-ARGOS8区域(图29C)，并且对PCR产物进行测序，由此确认插入事件。
B.用Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON启动子替换Zm-ARGOS 8启动子(启动子更换)。
为用Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON置换(替换)Zm-ARGOS8的天然启动子，制备向导RNA构建体gRNA3来靶向基因组靶位点CTS3(SEQ ID NO：453)(位于Zm-ARGOS8起始密码子上游710bp处)(图30)。还设计了另一个向导RNA(gRNA2)以靶向基因组靶位点CTS2(SEQ IDNO：452)(位于Zm-ARGOSO8的5′-UTR)(图30)。多核苷酸修饰模板包含由CTS3的上游区域Zm-GOS2 PRO：GOS2 INTRON衍生出的400bp基因组DNA片段，和由CTS2的下游区域衍生出的360bp基因组DNA片段(图30)。然后用gRNA3和gRNA2、Cas9盒、多核苷酸修饰模板和PMI选择标记来转化未成熟胚芽细胞。通过PCR筛选对PMI有抗性的愈伤组织，鉴定多个启动子更换(启动子替换)事件(图31A、图31B及图31C)，并且再生植株。由T0植株Zm-ARGOS8区域的PCR分析结果确认更换事件(图31D)。
C.缺失Zm-ARGOS 8启动子
为缺失Zm-ARGOS8的启动子，筛选由上述gRNA3/gRNA2实验获得的对PMI有抗性的愈伤组织，以寻找产生1.1kb长PCR产物的事件(图32A)。鉴定多个缺失事件(图32B)，并且再生植株。通过用PCR扩增T0植株中的Zm-ARGOS8区域并且对PCR产物进行测序，由此确认缺失事件。
实施例24
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统对大豆EPSPS1基因进行基因编辑
A.设计大豆EPSPS基因上的向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点。
在大豆EPSPS1基因Glyma01g33660的外显子2中鉴定出了两个向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点(大豆EPSPS-CR1和大豆EPSPS-CR2)(表33)。
表33.大豆EPSPS1基因上的向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点
B.使用向导RNA表达盒、Cas9内切核酸酶表达盒和多核苷酸修饰模板将特定氨基 酸变化引入大豆EPSPS1基因
使用大豆U6小核RNA启动子GM-U6-13.1(SEQ ID.NO：469)来表达向导RNA，以引导Cas9核酸酶至指定的基因组靶位点(表34)。在第一质粒中连接大豆密码子优化的Cas9内切核酸酶(SEQ ID NO：489)表达盒与向导RNA表达盒，该第一质粒与多核苷酸修饰模板共递送。该多核苷酸修饰模板包含特定的核苷酸变化，该变化用于编码EPSPS1多肽(Glyma01g33660)中的氨基酸变化，诸如外显子2中的T183I和P187S(TIPS)。也可使用本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统获得EPSPS1多肽中的其它氨基酸变化。特定氨基酸修饰可通过基因组DNA和多核苷酸修饰模板之间的同源重组，在向导RNA/Cas内切核酸酶系统的促进下实现。
表34.将向导RNA/Cas9表达盒与多核苷酸修饰模板用于稳定转化大豆，以获得 EPSPS1基因的特定氨基酸修饰。
C.检测稳定转化的大豆中的向导RNA/Cas9系统介导的位点特异性非同源末端连 接(NHEJ)
从体细胞胚芽样本中提取基因组DNA，并且采用7500实时PCR系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA)通过使用靶位点特异性引物和FAM标记荧光探针进行定量PCR分析，以检查双链断裂靶位点的拷贝数变化。以双重反应形式执行qPCR分析，采用syringolide诱导蛋白(SIP)作为内源性对照，采用包含靶位点(带2个等位基因)的一个拷贝的野生型93B86基因组DNA样品作为单拷贝校准品(calibrator)。还使用了向导RNA/Cas9的qPCR引物/探针(SEQ ID：477-479)和PinII的qPCR引物/探针(SEQ ID：480-482)，分析转基因事件中是否存在向导RNA-Cas9表达盒。qPCR引物/探针列于表35。
表35.用于转基因大豆事件的qPCR分析的引物/探针
用VIC标记内源性对照探针SIP-T，用FAM标记用于所有靶位点的基因特异性探针，以同时检测两根荧光探针(Applied Biosystems)。捕集PCR反应数据，使用7500实时PCR系统提供的序列检测软件进行分析，并使用相对定量方法(Applied Biosystems)计算基因拷贝数。
由于带双链断裂靶位点的两个等位基因的野生型93B86基因组DNA被用作单拷贝校准品，所以，靶位点没有任何变化的事件将作为一个拷贝被检测到，本文称为Wt-Homo(qPCR值＞＝0.7)；一个等位基因变化的事件不再可被靶位点特异性qPCR检测到，将作为半个拷贝被检测到，本文称为NHEJ-Hemi(0.1＜qPCR值＜0.7)；两个等位基因都变化的事件将作为无效事件被检测到，本文称为NHEJ-Null(qPCR值＝＜0.1)。如表36所示，靶向大豆EPSPS-CR1位点和EPSPS-CR2位点的向导RNA/Cas内切核酸酶系统都能在其指定的靶位点处有效引入双链断裂(DSB)。我们在93B86基因型中检测到了NHEJ-Hemi和NHEJ-Null两者。通过PCR/TOPO克隆/测序确认向导RNA/Cas9系统在特定的Cas9靶位点处介导了NHEJ(非同源末端连接)突变。
表36.向导RNA/Cas9系统在大豆EPSPS1基因上诱导靶位点双链断裂突变率。数字 表示事件的数量(括号内的数字为百分比)。
D.检测大豆EPSPS基因中的TIPS突变
为在天然EPSPS基因上编辑特定氨基酸(诸如导致TIPS修饰的那些)，将多核苷酸修饰模板(诸如RTW1013A或RTW1012A(表34))与向导RNA/Cas9表达盒共递送到大豆细胞中。
通过特异性PCR分析确定向导RNA/Cas9系统介导的DNA同源重组引起的天然EPSPS1基因的修饰。使用引物对WOL569(SEQ ID NO：486)和WOL876(SEQ ID NO：487)执行特异性PCR测定，检测天然EPSPS1基因中的完全的TIPS修饰。使用第二引物对WOL569(SEQ IDNO：486)和WOL570(SEQ ID NO：488)来扩增TIPS修饰的EPSPS1等位基因和WT(野生型)/NHEJ突变的等位基因。使用TOPO克隆/测序来验证序列。
实施例25
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统进行大豆基因的内含子替换
A.设计向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点。
在大豆EPSPS1基因Glyma01g33660中鉴定出了四个向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点(表37)。经鉴定，这四个靶位点中的两个(大豆EPSPS-CR1和大豆EPSPS-CR2)靶向大豆EPSPS基因的外显子2，如实施例24所述。另两个靶位点(大豆EPSPS-CR4和大豆EPSPS-CR5)被设计成邻近大豆EPSPS基因的内含子1的5’端。
表37.大豆EPSPS1基因上的向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点。
B.用向导RNA/Cas9内切核酸酶表达盒和多核苷酸修饰模板，实现用大豆泛素 (UBO)内含子1替换大豆EPSPS1基因的内含子1，完成大豆稳定转化
使用大豆U6小核RNA启动子GM-U6-13.1(SEQ ID.NO：469)表达两种向导RNA(大豆EPSPS-CR1和大豆EPSPS-CR4，或大豆EPSPS-CR1和大豆EPSPS-CR5)，以引导Cas9内切核酸酶至指定的基因组靶位点(表38)。靶位点之一(大豆EPSPS-CR1)位于外显子2中，如实施例24所述，第二靶位点(大豆EPSPS-CR4或大豆EPSPS-CR5)位于天然EPSPS1基因的内含子1的5’端附近。在表达质粒QC878/RTW1199(SEQ ID NO：470/492)或QC878/RTW1200(SEQ ID NO：470/493)中连接大豆密码子优化的Cas9内切核酸酶表达盒与向导RNA表达盒，这些表达质粒与多核苷酸修饰模板共递送。该多核苷酸修饰模板RTW1190A(SEQ ID NO：494)包含大豆UBQ基因的532bp内含子1和TIPS修饰的外显子2。可使用向导RNA/Cas系统，通过基因组DNA与多核苷酸修饰模板之间的同源重组，实现大豆UBQ内含子1替换大豆EPSPS1内含子1，从而增强天然或经修饰的大豆EPSPS1基因表达。
表38.在大豆稳定转化过程中，为用大豆泛素(UBQ)内含子1替换大豆EPSPS1基因 的内含子1而使用的向导RNA/Cas9内切核酸酶表达盒和多核苷酸修饰模板
C.检测稳定转化的大豆中的向导RNA/Cas9系统介导的位点特异性NHLJ
使用表39列出的qPCR引物/探针，如实施例24C所述检测了位点特异性NHEJ。
表39.用于转基因大豆事件的qPCR分析的引物/探针。
D.使用向导RNA/Cas9内切核酸酶系统检测大豆UBQ内含子1对大豆EPSPS1内含子1 的替换
为将天然EPSPS1基因处的大豆EPSPS1内含子1替换为大豆UBQ内含子1，使用表38所示的两种向导RNA表达载体。QC878载体(SEQ ID NO：470)靶向外显子2，并且RTW1199(SEQID NO：492)或RTW1200(SEQ ID NO：493)靶向内含子1的5’端。使用两个向导RNA/Cas系统在双重切割大豆EPSPS基因，导致除去天然的EPSPS1内含子1/部分外显子2片段。同时，将多核苷酸修饰模板RTW1190A(SEQ ID NO：494)共递送到大豆细胞中，多核苷酸修饰模板与基因组DNA之间的同源重组导致EPSPS1内含子1被替换为大豆UBQ内含子1，并且由PCR分析证实外显子2中的所需氨基酸修饰。然后使用引物对WOL1001/WOL1002(SEQ ID NO：499和500)以及WOL1003/WOL1004(SEQ ID NO：501和502)进行PCR测定，以检测内含子替换事件。
实施例26
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统完成大豆基因的启动子替换(启动子更换)
A.设计向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点。
在大豆EPSPS1基因Glyma01g33660中鉴定出了四个向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点(表40)。经鉴定，这四个靶位点中的两个(大豆EPSPS-CR1和大豆EPSPS-CR2)靶向大豆EPSPS基因的外显子2，如实施例24所述。还鉴定出，大豆EPSPS-CR6和大豆EPSPS-CR7位于-798bp天然EPSPS启动子的5’端附近。
表40.大豆EPSPS1基因上的向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点。
B.用向导RNA/Cas9内切核酸酶表达盒和多核苷酸修饰模板，实现用大豆UBQ启动 子叠换-798bp大豆EPSPS1启动子，完成大豆稳定转化。
使用大豆U6小核RNA启动子GM-U6-13.1(SEQ ID.NO：469)表达两种向导RNA(大豆EPSPS-CR1和大豆EPSPS-CR6，或大豆EPSPS-CR1和大豆EPSPS-CR7)，从而引导Cas9核酸酶至指定的基因组靶位点(表41)。靶位点之一(大豆EPSPS-CR1)位于外显子2中，如实施例24所述，第二靶位点(大豆EPSPS-CR6或大豆EPSPS-CR7)位于-798bp天然EPSPS1启动子的5’端附近。在表达质粒QC878/RTW1201(SEQ ID NO：470/505)或QC878/RTW1202(SEQ ID NO：470/506)中连接大豆密码子优化的Cas9内切核酸酶表达盒与向导RNA表达盒，这些表达质粒与多核苷酸修饰模板RTW1192A(SEQ ID NO：507)共递送。多核苷酸修饰模板包含1369bp大豆UBQ基因启动子、47bp 5UTR和532bp UBQ内含子1。可使用向导RNA/Cas系统，通过基因组DNA与多核苷酸修饰模板之间的同源重组，实现大豆UBQ启动子替换特定的大豆EPSPS1启动子，从而增强天然或经修饰的大豆EPSPS1基因表达。
表41.在大豆稳定转化中，为用大豆UBQ启动子替换-798bp大豆EPSPS1启动子而使 用的向导RNA/Cas9内切核酸酶表达盒和多核苷酸修饰模板
C.检测稳定转化的大豆中的向导RNA/Cas9系统介导的位点特异性NHEJ
使用表42列出的qPCR引物/探针，如实施例24C所述检测了位点特异性NHEJ。
表42.用于转基因大豆事件的qPCR分析的引物/探针
D.使用向导RNA/Cas9内切核酸酶系统检测大豆UBQ启动子替换大豆EPSPS1启动 子。
为将天然EPSPS1基因处的大豆EPSPS1启动子替换为大豆UBQ启动子，在每个大豆转化实验中，使用表41所示的两种向导RNA表达载体。QC878(SEQ ID NO：470)靶向外显子2，并且RTW1201(SEQ ID NO：505)或RTW1202(SEQ ID NO：506)靶向大豆-798bp启动子的5’端。使用两个向导RNA/Cas系统双重切割大豆EPSPS1基因，导致除去天然EPSPS基因中的天然EPSPS1启动子/5’UTR-外显子1/内含子1/部分外显子2片段。同时，将多核苷酸修饰模板RTW1192A(SEQ ID NO：507)共递送到大豆细胞中。该RTW1192A DNA包含1369bp大豆UBQ启动子、其47bp 5-UTR、以及位于EPSPS1外显子1-内含子1修饰的外显子2前面的532bp UBQ内含子1。该多核苷酸修饰模板与基因组DNA之间的同源重组导致EPSPS1启动子/5’UTR被替换为大豆UBQ启动子/5’UTR/内含子1，并且通过PCR分析证实了所需的氨基酸修饰。然后使用引物对WOL1005/WOL1006(SEQ ID NO：511和512)以及WOL1003/WOL1004(SEQ ID NO：501和502)进行PCR测定，以检测启动子替换事件。
实施例27
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统进行的增强子元件缺失
本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统可用于允许来自转基因(预先存在的，人造的)或内源性基因的启动子元件缺失。为检测性状基因或为产生表达特定性状的转基因植株，通常将启动子元件(诸如增强子元件)以多拷贝形式(图33中，3X＝增强子元件的3个拷贝)引入启动子驱动基因表达盒。增强子元件可以是(但不限于)35S增强子元件(Benfey等人，EMBO J，1989年8月；8(8)：2195-2202，SEQ ID NO：513)。在一些植株(事件)中，增强子元件可能引起不希望的表型、收率下降或目的性状的表达模式改变，这是不期望的。例如，如图33所示，对基因组DNA中包含位于两个性状盒(性状A与性状B)之间的多个增强子元件(3个拷贝，3X)的植株进行表征，以显示不需要的表型。因此，希望除去增强子元件的多余拷贝，同时保持性状基因盒在其整合基因组位置处的完整性。本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统可用于从植物基因组中除去不需要的增强元件。可将向导RNA设计成包含可变靶向区域，该靶向区域靶向增强子中与NGG(PAM)相邻的12bp至30bp靶位点序列。如果Cas内切核酸酶靶位点序列存在于增强子元件的所有拷贝中(诸如35S-CRTS1(SEQ ID NO：514)、35S-CRTS2(SEQ ID NO：515)和35S-CRTS3(SEQ ID NO：516)这三个Cas内切核酸酶靶位点)，则只需一个向导RNA来引导Cas内切核酸酶至靶位点，并诱导所有增强子元件中的双链一起断裂。Cas内切核酸酶可进行切割以除去一个或多个增强子。这种向导RNA/Cas内切核酸酶系统可通过农杆菌或粒子枪轰击而引入。另选地，可使用两种不同的向导RNA(靶向两个不同的基因组靶位点)，以类似本文所述的除去(转基因或同源性)启动子的方式，从生物体的基因组中除去所有3X增强子元件。
实施例28
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统进行调控序列修饰
A.聚泛素化位点的修饰
待降解的蛋白质上存在限定的泛素化位点，通过利用专用计算机程序(例如CKSAAP_UbSite(张子丁蛋白质生物信息学实验室，
中国农业大学生物学院，中国北京，100193)，已在玉米EPSPS蛋白内发现了这些泛素化位点。图34A示出玉米EPSPS编码序列内的一个所选择的聚泛素化位点，并将该位点的氨基酸特征序列与来自其它植物的同等EPSPS位点进行比较(图34A)。将第90位氨基酸赖氨酸(K)(在其它种类植物中高度保守)选择为EPSPS蛋白质聚泛素化的潜在位点。用于编辑epsps基因座的多核苷酸修饰模板(称为玉米EPSPS多核苷酸K90R模板)以SEQ ID NO：517列出。该模板允许编辑epsps基因座，以使其第90位氨基酸赖氨酸(K)被置换成精氨酸(R)(K90R)，还使其第102位与第106位的氨基酸出现另外两种TIPS置换(图34B和34C)。使用本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统编辑玉米基因组DNA，并如本文所述产生T0植株。通过本文所述的基因分型方法选择包含核苷酸修饰(由K90R模板上的信息(图34C)指定)的T0植株。为了升高的蛋白含量，可选择F1EPSPS-K90R植株，因为这种植株的EPSPS蛋白降解速率较慢。
B.编辑内含子元件以引入内含子介导的增强子元件(IME)
可使用在邻近其它转录控制元件的位置处的转录增强子来调控天然EPSPS基因的转录活性。已知内含子包含增强子元件，从而影响天然启动子(包括EPSPS启动子)转录的总体速率。例如，玉米泛素5’UTR的第一内含子赋予单子叶植物高表达水平，如专利申请WO2011/156535 A1所指明。通过被授予专利的分析法(2011年12月15日公布的WO2011/156535A1中提出)鉴定了内含子增强基序CATATCTG(图35A)(也称为内含子介导的增强子元件IME)，并在EPSPS第一内含子的5’端选择适当的核苷酸位点用于进行编辑，从而引入内含子介导的增强子元件(IME)(图35B至图35C)。多核苷酸修饰模板(称为玉米EPSPS多核苷酸IME模板)以SEQ ID NO：518列出。该多核苷酸修饰模板允许编辑epsps基因座，使其在EPSPS第一内含子中包含三个IME(两个IME位于DNA的一条链上，另一个IME位于DNA的反向链上)，并在第102位和第106位处具有TIPS置换。然后，使用本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统来编辑玉米植物的基因组DNA。通过T0植株进行基因分型，可选择包含IME编辑的EPSPS编码序列的玉米植株，然后可进一步评估这些玉米植株由于天然EPSPS基因的转录速率增大而引起的EPSPS-TIPS蛋白含量提高。
实施例29
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统修饰剪接位点和/或引入替代性剪接位点
在玉米细胞中，剪接过程受外显子-内含子连接位点处的剪接位点影响，如生产EPSPS mRNA的过程所示(图36A至36B)。图36A示出EPSPS扩增的前mRNA的分析结果(左侧cDNA板)。图36A中泳道14显示包含未剪接的第三内含子的EPSPS的前mRNA的扩增，导致产生表征替代性剪接事件的804bp诊断片段。泳道E3和F8显示由常规剪接内含子产生的EPSPSPCR扩增片段。除非合成了cDNA，否则不扩增诊断片段(诸如泳道14的804bp片段)，包含总RNA的泳道E3、14和F8中未出现谱带(如图36A右侧的总RNA组所示)证实了这一点。玉米EPSPS基因中以及来自其它物种的基因中典型的剪接位点是AGGT，而其它(改变的)剪接位点变体可能导致对前mRNA分子的处理异常。EPSPS编码序列包含多个替代性剪接位点，这些替代性剪接位点可能影响前mRNA成熟过程的总效率，因而可能限制EPSPS蛋白在玉米细胞中积聚。
为限制EPSPS基因表达期间替代性剪接事件的发生率，可使用本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统来编辑剪接位点。第二天然EPSPS内含子与第三外显子的连接处的剪接位点是AGTT，可对该剪接位点进行编辑，以便在该连接处引入典型的剪接位点AGGT(图37)。T被置换为G不影响天然EPSPS开放阅读框，也未改变EPSPS氨基酸序列。多核苷酸修饰模板(称为玉米EPSPS多核苷酸T剪接模板)以SEQ ID NO：519列出。该多核苷酸修饰模板允许编辑epsps基因座，使其在第二内含子与第三外显子的连接位点处包含典型的AGGT剪接位点，并在第102位和第106位处具有TIPS置换。使用本文所述的过程编辑玉米植物。然后可评估由于功能EPSPS mRNA信息产量增加，引起F1EPSPS-T剪接玉米植株蛋白含量的提高。
实施例30
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统，经由减量调控ZmRap2.7而操纵早开花表型，从 而缩短成熟期
可通过调节玉米ZmRap2.7基因来调节植株的花期表型，从而缩短植株的总成熟期。可通过早开花表型来缩短植株的成熟期。
RAP2.7是“与APETALA 2.7相关”这一短语的首字母缩略词。RAPL是指类似RAP2.7，RAP2.7充当AP2家族转录因子，用于抑制开花转型(SEQ ID NO：520和SEQ ID NO：521)。转基因表型一旦发生Rap2.7沉默或压制，便导致植株提早开花、植株高度降低，但令人惊讶的是，相比野生型植株发育出了垂直的雌穗和雄穗(2014年3月13日提交的专利申请PCT/US14/26279)。可使用本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统来靶向并诱导位于RAP2.7基因内的Cas内切核酸酶靶位点处的双链断裂。然后可选择在RAP2.7基因内包含NHEJ的植株，评估其是否存在缩短成熟期的表型。
实施例31
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统调节玉米NPK1B基因的表达，从而工程化玉米的 耐霜冻性
烟草蛋白激酶1(NPK1)是丝裂原活化的蛋白激酶，其参与胞质分裂调控和氧化应激反应信号转导。ZM-NPK1B(SEQ ID NO：522和SEQ ID NO：523)与稻NPKL3具有约70％的氨基酸相似度，已在玉米的幼苗和生殖期检测了其耐霜冻性(2014年3月13日提交的专利申请PCT/US14/26279)。包含由诱导型启动子Rab17驱动的ZM-NPK1B的转基因幼苗和植株相比对照幼苗和对照植株，耐霜冻性明显提高。低温驯化之后，在-3℃处理期间，基因在大多数事件中似乎都被诱导了，但诱导程度较低。(2014年3月13日提交的专利申请PCT/US14/26279)。
可使用本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统将NPK1基因的内源性启动子替换为胁迫诱导型启动子，诸如玉米RAB17启动子阶段(SEQ ID NO：524；2014年3月13日提交的专利申请PCT/US14/26279)，从而以胁迫响应方式调节NPK1B表达，并赋予受调节玉米植株耐霜冻性。
实施例32
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统，经由FTM1表达而操纵早开花表型，从而缩短成 熟期
可通过表达转基因来调节植株的花期表型，从而缩短植株的总成熟期。这种表型修饰也可由另外的转基因实现，或通过育种途径实现。
FTM1代表“开花转型MADS 1”转录因子(SEQ ID NO：525和SEQ ID NO：526)。这是一种MADS框转录因子并且诱导开花转型。一旦FTM1在组成型启动子作用下表达，转基因植株就表现出开花，并且成熟期缩短，但令人惊讶的是，相比野生型植株发育出了垂直的雌穗和雄穗(2014年3月13日提交的专利申请PCT/US14/26279)。
表达FTM1的玉米植株表明，操纵开花转型基因，便可显著缩短开花时间，导致植株成熟期缩短。成熟期通常可表示从播种到采收的时间，因而期望缩短成熟期，确保作物能够在北部大陆的干燥气候环境下存活到最终收获(2014年3月13日提交的专利申请PCT/US14/26279)。
本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统可用于引入增强子元件，诸如CaMV35S增强子(Benfey等人，EMBO J，1989年8月；8(8)：2195-2202，SEQ ID NO：512)，这些增强子元件明确靶向内源性FMT1启动子前方以增强FTM1表达，同时保存天然表达的大部分组织特异性和时间特异性，导致受调节植株的成熟期缩短。
实施例33
向植株基因组中插入诱导型响应元件
目的基因的表达水平改变可随之引起表型修饰，因此，受外部刺激控制的诱导型表达系统是细胞蛋白的功能分析以及性状开发所期望的。理想的是，这种系统不仅介导基因表达的“开/关”状态，还允许基因以限定水平有限地表达。
本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统可用于引入阻遏子/操纵子/诱导物系统的组分，以调控生物体的基因表达。阻遏子/操纵子/诱导物系统及其组分是本领域熟知的(2003年10月2日公布的US 2003/0186281；美国专利6,271,348)。例如但不限于，已发现大肠杆菌的四环素(Tc)抗性系统的组分可在真核细胞中起作用，并已使用这些组分来调控基因表达(US 6,271,348)。本领域已知的不同类别TET操纵子的核苷酸序列参见(例如)：A类、B类、C类、D类、E类TET操纵子序列，分别以US 6,271,348中的SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：15列出。
也可将磺酰脲类响应性阻遏子系统的组分(如2012年9月4日公布的US 8,257,956中所述)引入到植物基因组中，从而在所述植物中生成阻遏子/操纵子/诱导物系统，此时植株中的多肽便可特异性结合至操作子，其中特异性结合受磺酰脲类化合物的调控。
实施例34
缺失用于表征性状基因座的基因组
植物育种中的性状定位通常导致检测其中含有控制目的性状表达的一个或多个基因的染色体区域。对于数量性状，目的性状的表达取决于在一个或多个染色体上效应量、复杂性和统计显著性不同的多个数量性状基因座(QTL)。与抑制玉米雌穗籽粒行数相关联的QTL或单倍型可能是优质育种种质中特有的。这种QTL对籽粒行数的负作用可精确定位到可接受的分辨率，从而希望选择性消除特定受体种质内的这种负作用QTL区段。由单倍型、标记和/或靶向QTL区域前后的DNA序列设计出向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的两个旁侧切割位点，并同时或依次部署两个向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统来生成两种独立双链断裂(切割)(从染色体释放间插区域)的所需末端产物。凭借去除DNA间插区域，以及两个染色体末端的NHEJ修复，产生了具有所需缺失事件的个体。鉴定这些个体的方法是基于存在旁侧DNA标记区，但不存在DNA间插标记。此方法创造了针对籽粒行数的专有单倍型，该单倍型不在此前定义的优质育种种质库中。
另一种可选方法是缺失包含荧光基因的区域。具有荧光和不具有荧光的植株的回收率大致指示了缺失操作的效率。
实施例35
通过使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统在ACS6基因中表达反向重复序列完成的基 因沉默，来工程化玉米的耐旱性和氮利用效率
ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)合酶(ACS)基因编码的酶催化乙烯生物合成过程中的限速步骤。呈反向重复构型的构建体ZM-ACS6包含一种玉米ACS基因，即ZM-ACS6，针对玉米中改善的非生物胁迫耐受性全面检测了该构建体(2010年10月4日提交的PCT/US2010/051358；2010年4月14日提交的PCT/US2010/031008)。包含由泛素组成型启动子驱动的ZM-ACS6 RNAi序列的多个转基因玉米事件在农田既干旱又低氮的条件下，相比对照，乙烯产生量下降，同时谷粒收率增加(Plant Biotechnology Journal：2014年3月12日，DOI：10.1111/pbi.12172)。
在一个实施方案中，可将向导RNA/Cas内切核酸酶系统与共递送的多核苷酸序列组合使用，以将反向ZM-ACS6基因片段插入到玉米基因组中，其中插入反向基因片段允许在体内创造反向重复序列(发夹结构)，并导致内源性乙烯生物合成基因沉默。
在一个实施方案中，插入反向基因片段可导致ACS6基因的天然(或经修饰)启动子和/或天然ACS6基因的天然5’端中形成体内创造的反向重复序列(发夹结构)。反向基因片段还可包含内含子，该内含子可导致靶向乙烯生物合成基因的沉默增强。
实施例36
来自多重向导RNA/Cas实验的T0植株具有高双等位基因突变率频率，并在T1群体 中显示出已正确继承了经诱变等位基因。
本实施例表明，使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统可高效生成具有多个经诱变基因座的玉米植株，并且这些玉米植株的后代可继承这些经诱变基因座。
我们使用实施例4所述多重实验中生成的突变事件，再生出在下列3个不同靶位点处具有突变的T0植株：MS26Cas-2靶位点(SEQ ID NO：14)，LIGCas-3靶位点(SEQ ID NO：18)，和MS45Cas-2靶位点(SEQ ID NO：20)。
为进一步分析，从各单独T0植株的叶组织中提取出总基因组DNA。使用针对对应的靶位点的引物对，对横跨所有3个靶位点的片段进行PCR扩增，然后克隆进pCR2.1-TOPO克隆载体(Invitrogen)，并测序。表43示出当分别以双重(见TS＝Lig34/MS26)或三重(见TS＝Lig34/MS26/MS45)方式同时引入多个向导RNA表达盒时，在4个T0植株中所有相关基因座处检测到的由不精确NHEJ导致的突变的实施例。
表43.多重向导RNA/Cas系统在玉米靶基因座处产生的突变的实施例
*NULL表示两个等位基因都发生突变，**INDEL表示两个等位基因之一发生了突变，del＝缺失，ins＝插入，bp＝个碱基对
将所有T0植株与野生型玉米植株杂交，产生T1种子。对来自三重实验(见表43，Lig34/MS26/MS45)的第二T0植株的T1子代植株(32株)进行测序分析，以评估突变的等位基因的分离频率。结果显示，子代植株已正确继承这些突变，并且在所有三个靶位点处，突变等位基因之间、以及突变等位基因与野生型等位基因之间出现了期望的(1：1)分离。
这些数据清楚地显示，本文所述的向导RNA/玉米优化的Cas内切核酸酶系统可用于同时诱变多个染色体基因座，并且产生包含稳定遗传的多个基因敲除的子代植株。
实施例37
在玉米染色体基因座中以向导RNA/Cas内切核酸酶介导的DNA切割，能够刺激同源 重组修复介导的转基因插入，并且所得的T1子代植株显示正确继承了经修饰的等位基因。
使用实施例5所述实验中生成的玉米事件再生出T0植株。由7个独立的愈伤组织事件(在两处转基因基因组DNA连接处从头到尾包含正确的扩增产物)再生T0植株，然后分析。对叶组织取样，提取总基因组DNA，然后使用引物对(对应于SEQ ID NO：98-101)，在两处转基因基因组DNA连接处进行PCR扩增。对所得的扩增产物进行测序用于确认。使用两个探针，即基因组探针(HR1区域外，SEQ ID：533)与转基因探针(MoPAT基因内，SEQ ID：534)，通过DNA印迹杂交进一步分析在两个端部处具有确认的连接的植株(图38)。PCR、测序和DNA印迹杂交数据表明，由7个事件中的2个事件(事件1和2)再生的植株通过同源重组在期望的靶位点处完全、干净地整合了单拷贝转基因。由其余5个事件再生的植株包含另外的随机整合的转基因拷贝(事件4、5和6)，或整合到靶位点中的重排转基因拷贝(事件3和7)。
将来自事件1和2的T0植株与野生型玉米植株杂交，产生T1种子。然后对来自事件1和2的96株T1植株进行DNA印迹杂交分析(使用与上文相同的探针)，评估转基因基因座的分离频率。DNA印迹杂交分析的结果显示，T1植株已正确地继承，并且转基因与野生型基因座出现了期望的(1：1)分离。
这些数据清楚显示，用本文所述的玉米优化的向导RNA/Cas系统切割的玉米染色体基因座可用于刺激HR修复途径，导致位点特异性插入转基因，并产生稳定遗传所插入转基因的子代植株。
实施例38
产生具有预整合Cas9的转基因玉米品系来瞬时递送向导RNA
本实施例描述了具有受组成型启动子和温度诱导型启动子控制的整合的Cas9基因的转基因玉米品系的基本原理、产生和检测。
如实施例2所示，在将Cas9内切核酸酶和向导RNA作为DNA载体递送时，通过用基因枪转化玉米未成熟胚芽细胞，观察到高突变频率。在将Cas9内切核酸酶作为DNA载体递送，而将向导RNA作为RNA分子递送时，观察到突变频率下降(表44)。
表44.由瞬时递送的向导RNA生成的LigCas-3靶位点处的突变读段
Cas9蛋白和向导RNA同时存在于细胞中时，突变效率可能提高(突变读段数可能增加)。为有利于Cas9内切核酸酶和向导RNA存在于同一细胞内，可首先将包含组成型和条件式调控的Cas9基因的载体递送到植物细胞中，使该Cas9基因能够稳定整合进植物基因组，从而建立植物基因组中只含Cas9基因的植物品系。然后，可将单个或多个向导RNA作为DNA或RNA或DNA与RNA的组合递送到包含基因组整合型式的Cas9基因的植物品系的胚细胞中。
经由农杆菌介导的转化，生成转基因玉米(基因型Hi-II)品系，该品系具有整合的由组成型启动子(Ubi)或诱导型启动子(CAS)驱动的Cas9基因。除Cas9基因外，Agro载体还包含可见标记(END2：Cyan)和插入有318bp长接头(H2B：RF-FP)的红色荧光蛋白序列(如2012年6月19日提交的美国专利13/526,912所述)。接头序列侧接有370bp长的同向重复序列，一旦接头内的双链断裂，这种同向重复序列便可促进功能RFP基因序列的重组和修复。
鉴定了含有转基因的单拷贝的品系并用于进一步实验。采用粒子轰击法将两个靶向两个不同位点(在表45的接头序列中)的向导RNA构建体递送到未成熟胚芽细胞中。之前曾用于类似实验中的切割活性非常高的大范围核酸酶变体LIG3-4B65用作阳性对照。
表45.向导RNA/Cas内切核酸酶系统中RF-FP接头的靶位点。
转化后，28℃下温育携带受泛素启动子控制的Cas9基因的胚芽，同时首先在37℃下温育携带受温度诱导型CAS启动子控制的Cas9基因的胚芽15至20小时，然后转移至28℃环境。轰击后第3至5天，用冷光显微镜检查这些胚芽。基于表达了RFP蛋白的胚细胞数目，目视评估预整合的Cas9蛋白的表达及活性水平。在大多数品系中，向导RNA/Cas内切核酸酶系统显示出与LIG3-4 B65大范围核酸酶类似、或相比LIG3-4 B65大范围核酸酶更高的RFP修复频率，这表明生成的转基因品系中的Cas9蛋白表达及活性水平较高。
本实施例描述了产生具有预整合的Cas9基因的转基因品系，这种品系可用于进一步实验，以评估向导RNA以RNA分子形式瞬时递送时靶位点处发生诱变的效率。
实施例39
向导RNA/Cas内切核酸酶系统将双链断裂递送到玉米ALS基因座并且有利于编辑 ALS基因
本实施例表明，可使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统将特定变化有效引入玉米ALS基因的核苷酸序列，导致对磺酰脲类除草剂(尤其是氯磺隆)的抗性。
内源性ALS蛋白是ALS抑制剂磺酰脲类除草剂的靶位点。除草剂耐受性型式的ALS蛋白在作物中的表达赋予作物对这类除草剂的耐受性。ALS蛋白包含N端转运肽，ALS蛋白在移入叶绿体，随后其中的转运肽被切下后，形成成熟蛋白。该成熟蛋白的起点为残基S41，导致成熟蛋白包含598个氨基酸，预测其分子量为65kDa(SEQ ID NO：550)。
表46：全长ZM-ALS蛋白的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：550)
来自内源性玉米乙酸乙酯合酶蛋白的单个氨基酸残基(P165A或P165S，以粗体示出)的修饰赋予玉米对除草剂的抗性。
玉米中存在两种ALS基因，ALS1与ALS2，分别位于5号和4号染色体上。如实施例2所述，检测针对ALS基因内3个不同靶位点的向导RNA表达构建体。基于ALS1和ALS2核苷酸序列的多态性，鉴定ALS1特异性靶位点和ALSCas-4靶位点，并进行检测。将以ALS1基因和ALS2基因为靶标的ALSCas-1向导RNA表达构建体用作对照(表47)。
表47.受检的玉米ALS基因组靶位点。
*ALS1基因中的靶位点；加粗的核苷酸在ALS2基因中是不同的。
如实施例2所述进行实验并测定突变频率，实验结果示于表48。
表48.通过深度测序计算出的两个ALS靶位点处NHEJ突变恢复的频率。
TS 读段总数 突变读段数(ALS1) 突变读段数(ALS2)
ALSCas-1 204,230 5072(2.5％) 2704(1.3％)
ALSCas-4 120,766 3294(2.7％) 40(0.03％)
实验结果表明，ALSCas-4向导RNA/Cas9系统使ALS1基因突变的效率是使ALS2基因突变的效率的约90倍。因此，选择ALSCas-4靶位点和对应的向导RNA来进行ALS基因编辑实验。
为产生编辑事件，采用粒子轰击方法，将ALS多核苷酸修饰修复模板作为质粒与804bp长同源区域(SEQ ID NO：538)共递送，或作为单链127bp DNA片段(SEQ ID NO：539)与实施例1所述的玉米优化Cas9内切核酸酶表达载体、向导RNA表达盒(靶向ALSCas-4位点)、moPAT-DsRed融合体(作为可见的选择性标记)以及发育基因(ODP-2和WUS)共递送。使用上文所述的两种修复模板中的每个轰击大约1000个Hi-II未成熟胚芽。轰击后第40天，采集600个幼嫩愈伤组织事件(每种修复模板采集300个)，转移到含双丙氨磷的选择性培养基中。将含剩余事件的胚芽转移到含100ppm氯磺隆的培养基中进行选择。一个月后，采集氯磺隆选择条件下继续生长的事件，并且用于分析。
使用来自每个所选择的事件的少量愈伤组织来提取总DNA。使用修复/供体DNA片段外的一对基因组引物(SEQ ID NO：540和SEQ ID NO：541)来扩增ALS1基因座中包含ALSCas4靶序列的内源性片段。用凝胶纯化PCR扩增产物，克隆进pCR2.1 TOPO克隆载体(Invitrogen)，并且测序。共有6个事件显示存在被明确编辑的ALS1等位基因，以及野生型或诱变的第二等位基因。
这些数据表明，向导RNA/Cas系统可用于在玉米中成功创造经编辑的ALS等位基因。这些数据可以显示，本文所述的向导RNA/玉米优化的Cas内切核酸酶系统可用于产生包含稳定遗传的基因编辑的子代植株。
实施例40
使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统对大豆ALS1基因进行基因编辑，并将编辑过的 大豆ALS1基因用作大豆转化中的转化选择性标记
A.大豆ALS1基因上的向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点的设计。
大豆中存在四种ALS基因(Glyma04g37270，Glyma06g17790，Glyma13g31470和Glyma15g07860)。在大豆ALS1基因Glyma04g37270的第178位脯氨酸附近设计出两种向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点(大豆ALS1-CR1和大豆ALS1-CR2)(表49)。
表49.大豆ALS1基因上的向导RNA/Cas9内切核酸酶靶位点
B.使用向导RNA表达盒、Cas9内切核酸酶表达盒和多核苷酸修饰模板引入特定氨 基酸变化，并将P178S修饰的ALS1等位基因用作大豆转化选择性标记
使用大豆U6小核RNA启动子GM-U6-13.1(SEQ ID.NO：469)表达向导RNA，以引导Cas9核酸酶至指定的基因组靶位点(表50)。在第一质粒中连接大豆密码子优化的Cas9内切核酸酶(SEQ ID NO：489)表达盒与向导RNA表达盒，该第一质粒与多核苷酸修饰模板共递送。该多核苷酸修饰模板包含特定的核苷酸变化，用于编码大豆ALS1多肽(Glyma04g37270)中的氨基酸变化，诸如P178S。也可使用本文所述的向导RNA/Cas内切核酸酶系统获得ALS1多肽中的其它氨基酸变化。特定氨基酸修饰可通过基因组DNA和多核苷酸修饰模板之间的同源重组，在向导RNA/Cas内切核酸酶系统的促进下实现。
表50.将向导RNA/Cas9表达盒与多核苷酸修饰模板用于稳定转化大豆，获得大豆 ALS1基因的特定氨基酸修饰。
C.检测在由氯磺隆选择的事件中大豆ALS1基因中的P178S突变
为在天然ALS1基因上编辑特定氨基酸(诸如，P178S修饰)，将多核苷酸修饰模板(诸如RTW1026A(表50))与向导RNA/Cas9表达盒共递送到大豆细胞中。在大豆转化过程中使用氯磺隆(100ppb)来选择P178S ALS1基因编辑事件。
通过特异性PCR分析确定向导RNA/Cas9系统介导的DNA同源重组引起的天然ALS1基因修饰。使用引物对WOL900(SEQ ID NO：547)和WOL578(SEQ ID NO：548)进行特异性PCR测定，以检测天然ALS1基因处的完全的P178S修饰。使用第二引物对WOL573(SEQ ID NO：549)和WOL578(SEQ ID NO：548)来扩增P178S修饰的大豆ALS1等位基因和NHEJ突变的等位基因两者。由大豆ALS1-CR2实验生成耐受氯磺隆的事件(MSE3772-18)。该事件包含完全的P178S修饰的等位基因以及在大豆ALS1-CR2切割位点处具有5bp缺失的第二等位基因。使用TOPO克隆/测序来验证序列。结果显示，一个P178S修饰的ALS1等位基因就足以在大豆转化过程中提供氯磺隆选择。

Claims (66)

1.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：
a)获得第一植物，所述第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；
b)获得第二植物，所述第二植物包含向导RNA，所述向导RNA能够与(a)的所述Cas内切核酸酶形成复合物；
c)将(a)的所述第一植物与(b)的所述第二植物杂交；
d)评估(c)的子代在所述靶位点中的改变；以及
e)选择具有所述靶位点的期望改变的子代植物。
2.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
3.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：
a)获得第一植物，所述第一植物包含至少一种能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；
b)获得第二植物，所述第二植物包含向导RNA和供体DNA，其中所述向导RNA能够与(a)的所述Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸；
c)将(a)的所述第一植物与(b)的所述第二植物杂交；
d)评估(c)的子代在所述靶位点中的改变；以及
e)选择在所述靶位点处包含插入的目的多核苷酸的子代植物。
4.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括选择在其植物基因组中的靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使表达至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA和供体DNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。
5.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括向具有Cas内切核酸酶的植物细胞提供向导RNA，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
6.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括向所述植物细胞提供向导RNA和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。
7.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括向具有Cas内切核酸酶的植物细胞提供向导RNA和供体DNA，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。
8.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶位点的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供向导RNA和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；以及
b)鉴定在所述靶位点处具有修饰的至少一个植物细胞，其中所述修饰包括所述靶位点中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换。
9.一种用于修饰植物细胞的基因组中的靶DNA序列的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体，以及能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；以及
b)鉴定在所述靶位点处具有修饰的至少一个植物细胞，其中所述修饰包括所述靶位点中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失或置换。
10.一种用于将目的多核苷酸引入到植物细胞的基因组中的靶位点中的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体，以及能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂；
b)使(a)的所述植物细胞与包含目的多核苷酸的供体DNA接触；以及
c)鉴定来自(b)的至少一个植物细胞，所述至少一个细胞在其基因组中包含整合在所述靶位点处的目的多核苷酸。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述向导RNA通过粒子轰击直接引入。
12.根据权利要求5所述的方法，其中所述向导RNA通过粒子轰击或重组DNA构建体的农杆菌(Agrobacterium)转化而引入，所述重组DNA构建体包含对应的向导DNA，所述向导DNA可操作地连接至植物U6聚合酶III启动子。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶基因为植物优化的Cas9内切核酸酶。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶基因可操作地连接至Cas密码子区域上游的SV40核靶向信号以及该Cas密码子区域下游的VirD2核定位信号。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、高粱、裸麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草或柳枝稷。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述双子叶植物选自大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、棉、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥或红花。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶位点位于乙酰乳酸合酶(ALS)基因、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合酶(ESPSP)基因、雄性能育性(MS45、MS26或MSCA1)基因的基因序列中。
19.一种通过根据权利要求5所述的方法制备的植物或种子。
20.一种包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在所述基因组靶序列中产生双链断裂。
21.一种包含重组DNA构建体和向导RNA的植物，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶和向导RNA能够形成复合物，并在所述植物基因组的基因组靶序列中产生双链断裂。
22.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在所述基因组靶序列中产生双链断裂。
23.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至表达向导RNA的核苷酸序列的启动子，其中所述向导RNA能够与植物优化的Cas9内切核酸酶形成复合物，并且其中所述复合物能够结合到所述植物基因组的基因组靶序列并在所述基因组靶序列中产生双链断裂。
24.一种用于选择雄性不育植物的方法，所述方法包括选择在位于雄性能育性基因座中的基因组靶位点处包含改变的至少一个子代植物，其中所述子代植物通过使表达Cas9内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述基因组靶位点处引入双链断裂。
25.一种用于产生雄性不育植物的方法，所述方法包括：
a)获得第一植物，所述第一植物包含至少一种Cas内切核酸酶，所述至少一种Cas内切核酸酶能够在位于所述植物基因组的雄性能育性基因座中的基因组靶位点处引入双链断裂；
b)获得第二植物，所述第二植物包含向导RNA，所述向导RNA能够与(a)的所述Cas内切核酸酶形成复合物；
c)将(a)的所述第一植物与(b)的所述第二植物杂交；
d)评估(c)的子代在所述靶位点中的改变；以及
e)选择雄性不育的子代植物。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述雄性能育性基因选自MS26、MS45和MSCA1。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、高粱、裸麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草或柳枝稷。
29.一种用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，所述方法包括将至少一种向导RNA、至少一种多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述Cas内切核酸酶在所述细胞的所述基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述核苷酸序列为启动子、调控序列或目的基因。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述目的基因为烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因或乙酰乳酸合酶(ALS)基因。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。
34.一种用于产生epsps突变植物的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述Cas内切核酸酶在所述植物基因组的epsps基因组序列内的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述epsps基因组序列的至少一个核苷酸修饰；
b)由(a)的所述植物细胞获得植物；
c)评估(b)的所述植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及
d)选择表现出草甘膦耐受性的子代植物。
35.一种用于产生epsps突变植物的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述Cas内切核酸酶在所述植物基因组的epsps基因组序列内的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述epsps基因组序列的至少一个核苷酸修饰；
b)由(a)的所述植物细胞获得植物；
c)评估(b)的所述植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及
d)筛选(c)的不含所述向导RNA和Cas内切核酸酶的子代植物。
36.根据权利要求35所述的方法，还包括选择表现出草甘膦抗性的植物。
37.一种通过根据权利要求29所述的方法产生的植物、植物细胞或种子。
38.根据权利要求29所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶为Cas9内切核酸酶。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述Cas9内切核酸酶由SEQ ID NO：5表示。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述Cas9内切核酸酶由SEQ ID NO：1、124、212、213、214、215、216、193中的任一序列，或SEQ ID NO：5的第2037至6329位核苷酸，或它们的任意功能片段编码。
41.根据权利要求37所述的植物或植物细胞，其中所述植物细胞表现出草甘膦抗性。
42.一种包含经修饰的核苷酸序列的植物细胞，其中所述经修饰的核苷酸序列通过向植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶而产生，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
43.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一个核苷酸修饰不是在所述靶位点处的修饰。
44.一种用于产生雄性不育植物的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供向导RNA和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在位于雄性能育性基因中或附近的靶位点处引入双链断裂；
b)鉴定在所述雄性能育性基因中具有修饰的至少一个植物细胞，其中所述修饰包括所述雄性不育性基因中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失、插入或置换；
c)由b)的所述植物细胞获得植物。
45.根据权利要求44所述的方法，还包括从c)的所述植物中选择子代植物，其中所述子代植物是雄性不育的。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述雄性能育性基因选自MS26、MS45和MSCA1。
47.一种包含至少一个改变的靶位点的植物，其中所述至少一个改变的靶位点源自被向导RNA/Cas内切核酸酶系统识别并切割的对应的靶位点，并且其中所述至少一个改变的靶位点位于目的基因组区域中，所述目的基因组区域从SEQ ID NO：229中示出的靶序列延伸至SEQ ID NO：235中示出的靶位点。
48.根据权利要求47所述的植物，其中所述至少一个改变的靶位点具有选自下列的改变：(i)替换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，以及(iv)(i)-(iii)的任意组合。
49.根据权利要求47所述的植物，其中所述至少一个改变的靶位点包含重组DNA分子。
50.根据权利要求47所述的植物，其中所述植物包含至少两个改变的靶位点，其中所述改变的靶位点中的每个都源自被向导RNA/Cas内切核酸酶系统识别并切割的对应的靶位点，其中所述对应的靶位点选自SEQ ID NO：229、230、231、232、233、234、235和236。
51.一种用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，所述方法包括向细胞提供向导多核苷酸、Cas内切核酸酶、和任选地多核苷酸修饰模板，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述细胞的所述基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述细胞的基因组中的所述核苷酸序列选自启动子序列、终止子序列、调控元件序列、剪接位点、编码序列、聚泛素化位点、内含子位点和内含子增强基序。
53.一种用于编辑细胞的基因组中的启动子序列的方法，所述方法包括向细胞提供向导多核苷酸、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述细胞的所述基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述待编辑的启动子序列的至少一个核苷酸修饰。
54.一种用于替换细胞中的第一启动子序列的方法，所述方法包括向所述细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述细胞的所述基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含不同于所述第一启动子序列的第二启动子或第二启动子片段。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述第一启动子序列的替换导致下列情况中的任一种或下列情况的任一组合：启动子活性增加、启动子的组织特异性增加、启动子活性降低、启动子的组织特异性降低、新的启动子活性、诱导型启动子活性、基因表达窗口延长、或者在同一细胞层或其它细胞层中基因表达的时机或发育进度的修饰。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述第一启动子序列选自玉米(Zea mays)ARGOS8启动子、大豆EPSPS1启动子、玉米EPSPS启动子、玉米NPK1启动子，其中所述第二启动子序列选自玉米(Zea mays)GOS2 PRO：GOS2-内含子启动子、大豆泛素启动子、玉米胁迫诱导型RAB17启动子、玉米(Zea mays)-PEPC1启动子、玉米(Zea mays)泛素启动子、玉米(Zeamays)-Rootmet2启动子、稻肌动蛋白启动子、高粱RCC3启动子、玉米(Zea mays)-GOS2启动子、玉米(Zea mays)-ACO2启动子、和玉米(Zea mays)油质蛋白启动子。
57.一种用于使细胞的基因组中的启动子序列缺失的方法，所述方法包括向细胞提供向导多核苷酸、Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在位于所述启动子序列内部或外部的至少一个靶位点处引入双链断裂。
58.一种用于在细胞的基因组中插入启动子或启动子元件的方法，所述方法包括向细胞提供向导多核苷酸、包含所述启动子或所述启动子元件的多核苷酸修饰模板、以及Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在位于所述细胞的所述基因组中的靶位点处引入双链断裂。
59.根据权利要求58所述的方法，其中插入所述启动子或启动子元件导致下列情况中的任一种或下列情况的任一组合：启动子活性增加、启动子的组织特异性增加、启动子活性降低、启动子的组织特异性降低、新的启动子活性、诱导型启动子活性、基因表达窗口延长、基因表达的时机或发育进度的修饰、DNA结合元件突变、或DNA结合元件的添加。
60.一种用于编辑锌指转录因子的方法，所述方法包括向细胞提供向导多核苷酸、Cas内切核酸酶、和任选地多核苷酸修饰模板，其中所述Cas内切核酸酶在所述细胞的所述基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述锌指转录因子的至少一个核苷酸修饰或缺失，其中所述锌指转录因子的所述缺失或修饰导致形成显性阴性的锌指转录因子突变体。
61.一种用于产生融合蛋白的方法，所述方法包括将向导多核苷酸、Cas内切核酸酶和多核苷酸修饰模板引入到细胞中，其中所述Cas内切核酸酶在位于所述细胞的所述基因组中的第一编码序列内部或外部的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含编码目的蛋白的第二编码序列，其中所述蛋白融合导致下列情况中的任一种或下列情况的任一组合：所述融合蛋白靶向所述细胞的叶绿体、蛋白活性增加、蛋白功能性增强、蛋白活性降低、蛋白功能性减弱、新的蛋白功能性、修饰的蛋白功能性、新的蛋白定位、新的蛋白表达时机、修饰的蛋白表达模式、嵌合蛋白、或具有显性表型功能性的修饰的蛋白。
62.一种用于在植物中产生复合性状基因座的方法，所述复合性状基因座在目的基因组区域中包含至少两个改变的靶序列，所述方法包括：
(a)在植物中选择基因组区域，其中所述基因组区域包含第一靶序列和第二靶序列；
(b)使至少一个植物细胞与至少第一向导多核苷酸、第二多核苷酸、和任选地至少一个供体DNA、和Cas内切核酸酶接触，其中所述第一向导多核苷酸和所述第二向导多核苷酸和所述Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶至少能够在第一靶序列和第二靶序列中引入双链断裂；
(c)从(b)的细胞中鉴定在所述第一靶序列处包含第一改变并且在所述第二靶序列处包含第二改变的细胞；以及
(d)由(c)的所述细胞再生第一能育植物，所述能育植物包含所述第一改变和所述第二改变，其中所述第一改变和所述第二改变物理地连接在一起。
63.一种用于在植物中产生复合性状基因座的方法，所述复合性状基因座在目的基因组区域中包含至少两个改变的靶序列，所述方法包括：
(a)在植物中选择基因组区域，其中所述基因组区域包含第一靶序列和第二靶序列；
(b)使至少一个植物细胞与第一向导多核苷酸、Cas内切核酸酶、和任选地第一供体DNA接触，其中所述第一向导多核苷酸和所述Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在第一靶序列中引入双链断裂；
(c)从(b)的细胞中鉴定在所述第一靶序列处包含第一改变的细胞；
(d)由(c)的所述细胞再生第一能育植物，所述第一能育植物包含所述第一改变；
(e)使至少一个植物细胞与第二向导多核苷酸、Cas内切核酸酶、和任选地第二供体DNA接触；
(f)从(e)的细胞中鉴定在所述第二靶序列处包含第二改变的细胞；
(g)由(f)的所述细胞再生第二能育植物，所述第二能育植物包含所述第二改变；以及
(h)由(g)的所述第二能育植物获得能育子代植物，所述能育子代植物包含所述第一改变和所述第二改变，其中所述第一改变和所述第二改变物理地连接在一起。
64.根据权利要求29所述的方法，其中对所述核苷酸序列的编辑使得所述核苷酸序列能够赋予所述细胞抗除草剂性。
65.一种用于产生乙酰乳酸合酶(ALS)突变植物的方法，所述方法包括：
a)获得植物或植物的种子，其中所述植物或所述种子在内源性ALS基因中包含修饰，所述修饰通过Cas内切核酸酶、向导RNA和多核苷酸修饰模板生成，其中所述植物或所述种子对磺酰脲类化合物具有抗性；以及
d)产生不含所述向导RNA和Cas内切核酸酶的子代植物。
66.一种生成磺酰脲类化合物抗性植物的方法，所述方法包括提供植物细胞，其中所述植物细胞的内源性染色体ALS基因已通过向导RNA/Cas内切核酸酶系统进行修饰以产生磺酰脲类化合物抗性ALS蛋白；以及由所述玉米植物细胞培育植物，其中所述植物对磺酰脲类化合物具有抗性。
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