CN109844121A - 产生北方叶枯病抗性玉蜀黍 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列、经修饰的NLB18序列或两者的植物细胞的组合物和方法。所述方法涉及在内源Ht1编码序列、内源NLB18编码序列或两者中将双链断裂引玉蜀黍基因组中，以修饰基因组序列，从而增强从植物细胞产生的植物的北方叶枯病抗性。进一步提供了将Ht1和/或NLB18的抗性等位基因引入基因组中的特定位点的方法。还包括由植物细胞产生的植物和由植物产生的种子。为了在双链断裂诱导中使用CRISPR‑Cas系统，还提供了指导多核苷酸。
Description
技术领域
该领域属于分子生物学，并且更确切地说，是用于编辑植物细胞的基因组以生产北方叶枯病(northern leaf blight)抗性玉米的方法。
以电子方式提交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为7156WO_SEQLIST.txt，创建于2016年10月13日，并且具有240千字节大小，并且与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
背景技术
由真菌病原体玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)(之前称为大斑病长蠕孢(Helminthosporium turcicum))诱导的北方叶枯病(NLB)是在许多热带和温带环境中严重的玉蜀黍叶枯萎病。症状可以从下部叶片上的雪茄形病变到叶子的完全破坏，从而降低可用于光合作用的叶表面积的量。光合能力的降低导致籽粒灌浆所需的碳水化合物缺乏，这会影响籽粒产量。因为露期很长且温度适中，热带的中海拔区域(海平面以上约900-1600m)存在对北方叶枯病尤其有利的气候。然而，在温带环境中(例如在美国)，在湿季期间，特别是如果在抽丝期在植物的上部叶上确定感染，则北方叶枯病还可能产生30％-50％的损失。
控制北方叶枯病的最有效和最优选的方法是种植抗性杂交种。对病原体的特定种族的抗性可以通过某些天然抗病性玉蜀黍基因来控制，例如Ht1、Ht2、Ht3、Htm1、Htn1、HtN、HtP、ht4和rt(Welz和Geiger 2000.Plant Breeding.[植物育种]119(1)：1-14；Ogliari等人2005.Genet Mol Biol[遗传学与分子生物学]28：435-439；Hurni等人2015 PNAS[美国科学院院报]112(28)：8780-5)。然而，将抗性基因渐渗入其他近交系是一项艰巨的任务，由于连锁累赘，可能会或可能不会产生产量损失。需要更有效地且以某种方式生产北方叶枯病抗性玉蜀黍植物，该种方式将经由常规手段减少与多个抗性基因座渐渗入优良玉蜀黍品系相关的连锁累赘。
发明内容
通过以下方式可以克服对将北方叶枯病抗性渐渗入玉蜀黍品系的常规育种的限制：编辑赋予对北方叶枯病增强的抗性的基因(例如像Ht1和NLB18)；或者将Ht1和NLB18的抗性等位基因移动到基因组中的另一个位点，使得可以通过将包含多个核苷酸序列的单个基因组基因座渐渗入玉蜀黍植物中来获得对北方叶枯病的增强的抗性，所述多个核苷酸序列的每一种都赋予对北方叶枯病的增强的抗性。
本文提供了用于获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞的方法。所述方法包括：在玉蜀黍植物细胞中的内源HT1编码序列中的一个或多个靶位点处引入双链断裂或位点特异性修饰，并且获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞。所述方法可以进一步包括在玉蜀黍植物细胞中引入Ht1取代模板，其中所述Ht1取代模板与内源HT1编码序列相比包含至少一个核酸改变，并且其中所述Ht1取代模板并入内源HT1编码序列中。双链断裂可以由核酸酶诱导，例如但不限于TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶或CRISPR相关核酸酶。所述方法可以进一步包括从具有经修饰的Ht1核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞生长玉蜀黍植物，并且该玉蜀黍植物可以展现出对北方叶枯病的增强的抗性。
在一些方面，经修饰的Ht1核苷酸序列包含在内源HT1编码序列的启动子中的缺失。所述方法可涉及使用Cas9内切核酸酶和一种或多种指导RNA。在一个实施例中，使用至少两种指导RNA，其中第一指导RNA包含与SEQ ID NO：1[Ht1-TS2]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：2[Ht1-TS4]互补的可变靶向结构域。在另一个实施例中，第一指导RNA包含与SEQ ID NO：1[Ht1-TS2]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：3[Ht1-ST1-TS1]互补的可变靶向结构域。
在其他的方面，使用Ht1取代模板，其包含来自PH4GP的Ht1核苷酸序列(Ht1-PH4GP)。Ht1-PH4GP核苷酸序列可包含SEQ ID NO：59。在另一个实施例中，Ht1-PH4GP核苷酸序列可包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：52的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列，其中所述多肽赋予对北方叶枯病的抗性。Ht1-PH4GP核苷酸序列还可包含SEQ ID NO：65。所述方法可涉及使用Cas9内切核酸酶和一种或多种指导RNA。在实施例中，使用至少两种指导RNA，其中第一指导RNA包含与SEQ ID NO：14[Ht1-TS6]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：16[Ht1-TS9]互补的可变靶向结构域。在另一个实施例中，第一指导RNA包含与SEQ ID NO：15[Ht1-TS7]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：17[Ht1-TS10]互补的可变靶向结构域。
本文提供了用于获得具有经修饰的NLB18核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞的方法。所述方法包括：在玉蜀黍植物细胞中的内源NLB18编码序列中的一个或多个靶位点处引入双链断裂或位点特异性修饰，并且获得具有经修饰的NLB18核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞。所述方法可以进一步包括在玉蜀黍植物细胞中引入NLB18取代模板，其中所述NLB18取代模板与内源NLB18编码序列相比包含至少一个核酸改变，并且其中所述NLB18取代模板并入内源NLB18编码序列中。双链断裂可以由核酸酶诱导，例如但不限于TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶或CRISPR相关核酸酶。所述方法可以进一步包括从具有经修饰的NLB18核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞生长玉蜀黍植物，并且该玉蜀黍植物可以展现出对北方叶枯病的增强的抗性。
在一些方面，经修饰的NLB18核苷酸序列包含在内源NLB18编码序列的启动子中的修饰。在一些实施例中，内源Ht1编码序列的启动子中的修饰包含Ht1启动子中具有重复序列的区的缺失。在一个实施例中，内源Ht1编码序列的启动子中的修饰包含来自Ht1启动子的SEQ ID NO：71的缺失。
在其他的方面，使用NLB18取代模板，其包含来自PH26N或PH99N的NLB18核苷酸序列(NLB18-PH26N或NLB18-PH99N)。在一个实施例中，NLB18-PH26N核苷酸序列包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：64的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列，其中所述多肽赋予对北方叶枯病的抗性。在一些方面，NLB18-PH26N核苷酸序列包含SEQ ID NO：70。NLB18-PH99N核苷酸序列可包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：62的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列，其中所述多肽赋予对北方叶枯病的抗性。所述方法可涉及使用Cas9内切核酸酶和一种或多种指导RNA。在一个实施例中，使用至少两种指导RNA，其中第一指导RNA包含与SEQ ID NO：30[NLB18-TS1]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：32[NLB18-TS4]互补的可变靶向结构域。在另一个实施例中，第一指导RNA包含与SEQ ID NO：31[NLB18-TS8]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：32[NLB18-TS4]互补的可变靶向结构域。
本文提供了用于获得具有经编辑的基因组基因座的玉蜀黍植物细胞的方法，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的至少一种核苷酸序列。所述方法包括1)在玉蜀黍植物细胞的基因组基因座中的一个或多个靶位点处引入双链断裂或位点特异性修饰；2)引入编码多肽的一种或多种核苷酸序列，所述多肽赋予对北方叶枯病的增强的抗性，其中每种核苷酸序列侧翼有相应靶位点的5′或3′核苷酸序列的300-500个连续核苷酸；以及3)获得具有基因组基因座的玉蜀黍植物细胞，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的一种或多种核苷酸序列。双链断裂或位点特异性修饰可以由核酸酶诱导，例如但不限于TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶或CRISPR相关核酸酶。所述方法可以进一步包括从具有经编辑的基因组基因座的玉蜀黍植物细胞生长玉蜀黍植物，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的至少一种核苷酸序列，并且所述玉蜀黍植物可以展现出对北方叶枯病的增强的抗性。
在一些方面，经编辑的植物细胞包含一种或多种核苷酸序列，所述核苷酸序列包括以下任何一种：Ht1-PH4GP(SEQ ID NO：51)、NLB18-PH26N(SEQ ID NO：63)和NLB18-PH99N(SEQ ID NO：61)。在另一个方面，基因组基因座是CTL1。Ht1-PH4GP核苷酸序列可包含SEQID NO：59或编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：52的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列，其中所述多肽在玉蜀黍植物中赋予对北方叶枯病的增强的抗性。在一些方面，Ht1-PH4GP核苷酸序列包含SEQ ID NO：65。NLB18-PH26N核苷酸序列可包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ IDNO：64的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列，其中所述多肽在玉蜀黍植物中赋予对北方叶枯病的增强的抗性。在一些方面，NLB18-PH26N核苷酸序列包含SEQ ID NO：70。NLB18-PH99N核苷酸序列可包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：62的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列，其中所述多肽在玉蜀黍植物中赋予对北方叶枯病的增强的抗性。
在仍其他的方面，编码NLB18-PH26N的核苷酸序列靶向CTL1的TS8；编码NLB18-PH4GP的核苷酸序列靶向CTL1的TS10；和/或编码NLB18-PH26N的核苷酸序列靶向CTL1的TS45。
在一个方面，编辑植物细胞的方法包括使用Cas9内切核酸酶作为DSB诱导剂，并且使用一种或多种指导RNA将Cas9靶向CTL1基因座中的位点。一种指导RNA可以包含与SEQ IDNO：36[CTL1-TS8]互补的可变靶向结构域，一种指导RNA可以包含与SEQ ID NO：37[CTL1-TS10]互补的可变靶向结构域，并且一种指导RNA可以包含与SEQ ID NO：38[CTL1-TS45]互补的可变靶向结构域。
还提供了通过本文提供的方法产生的玉蜀黍植物细胞，以及产生玉蜀黍植物细胞的玉蜀黍植物和由玉蜀黍植物产生的种子。
本文还提供了包含与内源Ht1编码序列、内源NLB18编码序列、或CTL1基因组基因座中的靶位点互补的可变靶向结构域的指导多核苷酸。指导多核苷酸可以是RNA序列、DNA序列、或RNA-DNA组合序列。对于Ht1，指导多核苷酸可具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3互补的可变靶向结构域。对于NLB18，指导多核苷酸可具有与SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、或SEQ ID NO：32互补的可变靶向结构域。对于CTL1，指导多核苷酸可具有与SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、或SEQ ID NO：38互补的可变靶向结构域。
附图和序列表的说明
图1示出了Ht1基因座的示意图；Ht1基因组序列中每个靶位点(用于使启动子区中的重复序列缺失)的位置；以及用于验证的引物的位置。外显子之间的内含子是白色的，并且靶位点用上三角形表示。E1代表外显子1；e2代表外显子2；并且pro代表启动子区。
图2A和2B示出了在去除Ht1基因的启动子区中的重复序列后的预期的连接序列。图2A示出了具有CR2/CR4的预期的连接序列(斜体的序列是TS2序列，加下划线的序列是TS4序列)。图2B示出了具有CR2/ST1-CR1的预期的连接序列(斜体的序列是TS2序列，加下划线的序列是ST1-TS1序列)。加框的区指示连接。
图3示出了每个靶位点的位置和Ht1等位基因交换的示意图。PH4GP Ht1等位基因以深灰色示出，并且其替换的等位基因以浅灰色示出。
图4示出了用于评估Ht1等位基因交换的引物的位置。
图5示出了每个靶位点的位置和NLB18等位基因交换的示意图。
图6示出了在玉蜀黍染色体1上CTL1处包含指导RNA/Cas内切核酸酶系统的靶位点(TS8、TS45和TS10)的三个基因座的位置。
图7示出了在TS8处NLB18-PH26N插入的示意图。
图8示出了在TS10处Ht1-PH4GP插入的示意图。
图9示出了在TS45处NLB18-PH26N插入的示意图。
图10示出了在T2 TS45 NLB18-BC26N玉蜀黍植物中使用qRT-PCR的NLB18表达。
图11示出了在T2 TS10 Ht1-ED4GP玉蜀黍植物中使用qRT-PCR的Ht1表达。
SEQ ID NO：1是Ht1-TS2靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是Ht2-TS4靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是Ht1-ST1-TS1靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是Cas9基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是SV40单分型氨基末端核定位信号的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是U6聚合酶III启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是能够表达Ht1-CR2指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是能够表达Ht1-CR4指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是能够表达Ht1-ST1-CR1指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是Ht1f3正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：11是Ht1r4v2反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是次级PCR反应正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：13是次级PCR反应反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：14是Ht1-TS6靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：15是HT1-TS7靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：16是HT1-TS9靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：17是HT1-TS10靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：18是能够表达HT1-CR6指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：19是能够表达HT1-CR9指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20是能够表达HT1-CR7指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21是能够表达HT1-CR10指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22是Ht1HR1f1正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：23是Ht1HR1r1反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：24是Ht1HR2f1正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：25是Ht1HR2r1反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26是hdr2b_f正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：27是hdr2b_r反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：28是hdr2b_PV探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：29是hdr2b_PG探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：30是NLB18-TS1靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：31是NLB18-TS8靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：32是NLB18-TS4靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：33是能够表达NLB18-CR1指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34是能够表达NLB18-CR8指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：35是能够表达NLB18-CR4指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：36是CTL1-TS8靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：37是CTL1-TS45靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：38是CTL1-TS10靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：39是8HR1f1正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：40是PH26NPr反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：41是PH26NTf正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：42是8HR2r1反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：43是10HR1f正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：44是Ht1Pr反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：45是Ht1Tf正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：46是10HR2r反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：47是45hr1f1正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：48是PH26NPr反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：49是PH26NTf正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：50是45hr2r1反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：51是在近交系PH4GP中发现的Ht1 cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：52是由SEQ ID NO：51编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53是在近交系PH1W2中发现的Ht1 cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：54是由SEQ ID NO：53编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55是在近交系B73中发现的Ht1 cDNA的核苷酸序列，并且在本文中被称为“B73-高等位基因”。
SEQ ID NO：56是由SEQ ID NO：55编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：57是在近交系B73中发现的Ht1 cDNA的核苷酸序列，并且在本文中被称为“B73-低等位基因”。
SEQ ID NO：58是由SEQ ID NO：57编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：59是在近交系PH4GP中发现的Ht1基因组DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：60是在抗性等位基因的Ht1多肽中发现的一个区域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：61是来自PH99N的NLB18 cDNA序列。
SEQ ID NO：62是由SEQ ID NO：61编码的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO：63是来自PH26N的NLB18 cDNA序列。
SEQ ID NO：64是由SEQ ID NO：63编码的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO：65是ZM-HT1-PH4GP的核苷酸序列，包括ZM-HT1-PH4GP启动子、外显子1、内含子1和终止子。
SEQ ID NO：66是来自PH184C的NLB18核苷酸序列，包括NLB18-CR8的5′至NLB18-CR4的3′。
SEQ ID NO：67是PH184C中位于NLB18-TS1的5′的侧翼的同源臂序列。
SEQ ID NO：68是PH184C中位于NLB18-TS4的3′的侧翼的同源臂序列。
SEQ ID NO：69是PH184C中位于NLB18-TS8的5′的侧翼的同源臂序列。
SEQ ID NO：70是来自PH26N的NLB18核苷酸序列，包括PH26N NLB18启动子、外显子1、内含子1、外显子2、内含子2、外显子3和终止子。
SEQ ID NO：71是PH184C的Ht1启动子中重复序列区域的核苷酸序列。
SEQ ID NO：72是表达盒的核苷酸序列，包括玉蜀黍(Zea mays)泛素启动子、ZM-泛素基因的5′UTR、ZM-泛素基因的内含子1、SV40核定位信号、Cas9外显子1(ST1)、马铃薯-LS1内含子、Cas9外显子2(ST1)、VirD2内切核酸酶核定位信号和pinII终止子。
SEQ ID NO：73是在实例4中使用的含有Cas9的核苷酸序列；SEQ ID NO：73含有cas9外显子1(SP)、ST-LS1内含子2、Cas9外显子2(SP)和VirD2核定位信号。
SEQ ID NO：74是能够表达ZM-U6：08CR1指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：75是能够表达ZM-U6：45CR1指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：76是能够表达ZM-U6：10CR3指导RNA的DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：77是靶向CTL1的TS8的08CR1HR1-NLB18(PH26N)基因组序列-8CR1HR2修复模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO：78是靶向CTL1的TS45的45CR1HR1-NLB18(PH26N)基因组序列-45CR1HR2修复模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO：79是靶向CTL1的TS10的10CR3HR1-HT1(PH4GP)基因组序列-10CR3HR2修复模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO：80是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)二分型VirD2T-DNA边界内切核酸酶羧基末端核定位信号的氨基酸序列。
SEQ ID NO：81是PH184C中位于HT1-TS6的5′的侧翼的同源臂的核苷酸序列(实例2)。
SEQ ID NO：82是PH184C中位于HT1-TS9的3′的侧翼的同源臂的核苷酸序列(实例2)。
SEQ ID NO：83是PH184C中位于HT1-TS7的5′的侧翼的同源臂的核苷酸序列(实例2)。
SEQ ID NO：84是PH184C中位于HT1-TS10的5′的侧翼的同源臂的核苷酸序列(实例2)。
SEQ ID NO：85是PH184C中位于CTL1-TS8的5′的侧翼的同源臂的核苷酸序列(实例4)。
SEQ ID NO：86是PH184C中位于CTL1-TS8的3′的侧翼的同源臂的核苷酸序列(实例4)。
SEQ ID NO：87是PH184C中位于CTL1-TS45的5′的侧翼的同源臂的核苷酸序列(实例4)。
SEQ ID NO：88是PH184C中位于CTL1-TS45的3′的侧翼的同源臂的核苷酸序列(实例4)。
SEQ ID NO：89是PH184C中位于CTL1-TS10的5′的侧翼的同源臂的核苷酸序列(实例4)。
SEQ ID NO：90是PH184C中位于CTL1-TS10的3′的侧翼的同源臂的核苷酸序列(实例4)。
具体实施方式
还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。当在本说明书和所附权利要求中使用时，单数和单数形式的术语例如“一个/一种”以及“该/所述”包括复数指代物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如提及“植物”、“该/所述植物”、或“一个/一种植物”也包括多个/多种植物；也取决于上下文，使用的术语“植物”也可包括该植物遗传相似或相同的后代；使用的术语“核酸”实际上任选地包括该核酸分子的多个拷贝；同样地，术语“探针”任选地(并且典型地)涵盖许多相似或相同的探针分子。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义，除非另有明确说明。
本文提出了组合物和方法以编辑玉蜀黍基因组以产生对北方叶枯病具有增强的抗性的玉蜀黍植物。
术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同核苷酸序列中的一个。
“玉米大斑病菌”，之前被称为大斑病长蠕孢，是诱导北方叶枯病感染的真菌病原体。所述真菌病原体在本文中也被称为突脐蠕孢属(Exserohilum)或Et。
“抗病性”(例如像，北方叶枯病抗性)是植物的一种特征，其中所述植物避免、最小化、或减轻作为植物-病原体相互作用(例如玉蜀黍-玉米大斑病菌相互作用)的结果的疾病症状。即，防止病原体导致植物疾病和相关的疾病症状，或可替代地，使由病原体引起的疾病症状最小化或减轻。
“基因座”是染色体上基因或标记所处的位置。
“抗性”是一个相对的术语，其表明被感染的植物比另一个相似处理的、更易感的植物产生更好的植物健康或玉蜀黍产量。即，当与易感的玉蜀黍植物相比，所述病症导致在耐受性的玉蜀黍植物中玉蜀黍存活、生长和/或产量的降低减少。技术人员将会理解，对北方叶枯病或引起这种疾病的病原体有抗性的玉蜀黍植物可以代表一系列更多抗性或更少抗性的表型，并且可以根据感染的严重程度而变化。然而，通过简单观察，技术人员可以确定不同植物、植物品系或植物家族对北方叶枯病的相对抗性或易感性，并且此外还将识别“抗性”的表型等级。例如，可以使用表示对北方叶枯病的抗性水平的1至9个视觉等级。分数越高表明抗性越高。只有在测量的实验中存在足够的选择压力时才应收集数据。术语“耐受性”和“抗性”在本文中可互换使用。
抗性可以是“新赋予的”或“增强的”。“新赋予的”或“增强的”抗性是指针对特定病原体、广谱病原体或由一种或多种病原体引起的感染的抗性水平增加。例如，针对特定真菌病原体(例如Et)的增加的抗性水平构成“增强的”或改进的真菌抗性。实施例可以增强或改进真菌植物病原体抗性。
I.基因编辑
在一些实施例中，可以通过在所希望的改变附近的基因组中在限定位置诱导双链断裂(“DSB”)来促进基因编辑。可以使用可用的任何DSB诱导剂诱导DSB，所述诱导剂包括但不限于TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、Cas9-gRNA系统(基于细菌CRISPR-Cas系统)等。在一些实施例中，可以将DSB的引入与多核苷酸修饰模板的引入组合。
可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸修饰模板引入细胞中，所述方法例如但不限于瞬时引入方法、转染、电穿孔、显微注射、颗粒介导的递送、局部施用、晶须介导的递送、经由细胞穿透肽的递送或介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)介导的直接递送。
可以将多核苷酸修饰模板作为单链多核苷酸分子、双链多核苷酸分子或作为环状DNA(载体DNA)的一部分引入细胞中。所述多核苷酸修饰模板还可以与指导RNA和/或Cas内切核酸酶进行系链。系链的DNA可以允许共定位靶标和模板DNA，可用于基因组编辑和靶向的基因组调控，并且还可以用于靶向有丝分裂后的细胞，在这些细胞中内源性同源重组HR机制的功能预期会大大降低(Mali等人2013 Nature Methods[自然方法]第10卷：957-963)。所述多核苷酸修饰模板可以瞬时地存在于细胞中，或可以经由病毒复制子引入。
“经修饰的核苷酸”或“经编辑的核苷酸”是指当与其非修饰的核苷酸序列相比时，包含至少一个改变的目的核苷酸序列。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，或(iv)(i)-(iii)的任何组合。“经编辑的细胞”或“经编辑的植物细胞”是指当与基因组序列中不包括此类改变的对照细胞或植物细胞相比时，在基因组序列中含有至少一种改变的细胞。
如本文所使用的术语“多核苷酸修饰模板”或“修饰模板”是指当与待编辑的靶标核苷酸序列相比时，包含至少一个核苷酸修饰的多核苷酸。核苷酸修饰可以是至少一个核苷酸取代、添加或缺失。任选地，多核苷酸修饰模板可以进一步包含位于至少一个核苷酸修饰的侧翼的同源核苷酸序列，其中所述侧翼同源核苷酸序列为待编辑的所希望的核苷酸序列提供了充足同源性。
用于编辑组合有DSB和修饰模板的基因组序列的方法通常包括：向宿主细胞提供DSB诱导剂或编码DSB诱导剂的核酸(识别染色体序列中的靶序列，并且其中DSB诱导剂能够诱导基因组序列中的DSB)；以及提供当与待编辑的核苷酸序列相比时包含至少一个核苷酸改变的至少一个多核苷酸修饰模板。内切核酸酶可以通过本领域已知的任何方法提供给细胞，所述方法例如但不限于瞬时引入方法、转染、显微注射、和/或局部施用、或间接经由重组构建体。内切核酸酶可以作为蛋白质或作为指导的多核苷酸复合物直接提供给细胞或经由重组构建体间接提供。使用本领域已知的任何方法，可以瞬时地将内切核酸酶引入细胞，或可以将内切核酸酶并入宿主细胞的基因组中。在CRISPR-Cas系统的情况下，可以用如在WO 2016073433中描述的细胞穿透肽(CPP)促进内切核酸酶和/或指导的多核苷酸被摄取到细胞中。
如本文所使用的，“基因组区域”是指在细胞的基因组中的染色体的区段。在一个实施例中，基因组区域包括存在于靶位点任一侧上的细胞的基因组中的染色体的区段，或者可替代地，还包含靶位点的一部分。基因组区域可以包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，使得基因组区域具有足够的同源性以与相应的同源区域进行同源重组。
TAL效应子核酸酶(TALEN)是一类序列特异性核酸酶，所述酶可用于在植物或其他生物体的基因组中的特定靶序列处造成双链断裂。(参见Miller等人(2011)NatureBiotechnology[自然生物技术]29：143-148)。
内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。内切核酸酶包括限制性内切核酸酶(其在特定位点切割DNA而不损害碱基)以及大范围核酸酶(也称为归巢内切核酸酶(HE酶))，所述大范围核酸酶类似于限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合并且切割，然而对于大范围核酸酶，这些识别位点典型地更长，约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请PCT/US12/30061)。基于保守的序列基序将大范围核酸酶分类为四个家族，这些家族是LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H、和His-Cys box家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。HE酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其DNA底物中的一些序列多态性。大范围核酸酶的命名规则相似于其他限制性内切核酸酶的命名规则。大范围核酸酶的特征还在于分别由独立的ORF、内含子、和内含肽编码的酶的前缀F-、I-、或PI-。在重组过程中的一个步骤涉及在识别位点处或在所述识别位点附近的多核苷酸切割。所述切割活性可用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见，Sauer(1994)Curr Op Biotechnol[生物技术新见]5：521-7；和Sadowski(1993)FASEB[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶(Integrase)或解离酶(Resolvase)家族。
锌指核酸酶(ZFN)是由锌指DNA结合结构域和双链断裂诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，所述锌指结构域典型地包含例如具有C2H2结构的两个、三个、或四个锌指，然而其他锌指结构是已知的并且已经被工程化。锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。ZFN包括连接至非特异性内切核酸酶结构域(例如来自II型内切核酸酶例如FokI的核酸酶结构域)的工程化DNA结合锌指结构域。另外的功能性可以融合到锌指结合结构域中，这些另外的功能性包括转录激活子结构域、转录抑制子结构域、和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指在靶DNA中识别三个连续的碱基对。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于所述核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
使用DSB诱导剂(例如Cas9-gRNA复合物)的基因组编辑已经描述于例如美国专利申请US 2015-0082478 A1、WO 2015/026886 A1、WO 2016007347、和WO 201625131中，将其全部通过引用并入本文。
本文的术语“Cas基因”是指通常与细菌系统中侧翼CRISPR基因座偶联的、相关的或接近的、或邻近的基因。术语“Cas基因”、“CRISPR相关的(Cas)基因”在本文中可互换地使用。本文的术语“Cas内切核酸酶”是指由Cas基因编码的蛋白质或蛋白质的复合物。当与合适的多核苷酸组分复合时，如本文公开的Cas内切核酸酶能够识别、结合特定DNA靶序列的全部或部分、并任选地使特定DNA靶序列的全部或部分产生切口或切割特定DNA靶序列的全部或部分。如本文描述的Cas内切核酸酶包含一个或多个核酸酶结构域。本公开的Cas内切核酸酶包括具有HNH或HNH样核酸酶结构域和/或RuvC或RuvC样核酸酶结构域的那些。本公开的Cas内切核酸酶可以包括Cas9蛋白质、Cpf1蛋白质、C2c1蛋白质、C2c2蛋白质、C2c3蛋白质、Cas3、Cas 5、Cas7、Cas8、Cas10或这些的复合物。
如本文所使用的，术语“指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物”、“指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统”、“指导多核苷酸/Cas复合物”、“指导多核苷酸/Cas系统”、“指导Cas系统”在本文中可互换地使用，并且是指能够形成复合物的至少一种指导多核苷酸和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶指导至DNA靶位点，使Cas内切核酸酶能够识别、结合DNA靶位点、并任选地使DNA靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)DNA靶位点。本文中指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以包含四种已知的CRISPR系统(Horvath和Barrangou，2010，Science[科学]327：167-170)(例如I型、II型或III型CRISPR系统)中任一种的一种或多种Cas蛋白和一种或多种合适的多核苷酸组分。Cas内切核酸酶在靶序列处解开DNA双链体并任选地切割至少一条DNA链，如通过由与Cas蛋白复合的多核苷酸(例如但不限于crRNA或指导RNA)识别靶序列所介导的。如果正确的前间区序列邻近基序(PAM)位于或相邻于DNA靶序列的3′末端，则通过Cas内切核酸酶对靶序列进行的此类识别和切割会典型地发生。可替代地，本文的Cas蛋白可能缺乏DNA切割或切口活性，但是当与合适的RNA组分复合时，仍然可以特异性结合DNA靶序列。(还参见美国专利申请US 2015-0082478 A1和US 2015-0059010 A1，两者均通过引用以其全文特此并入)。
指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以切割DNA靶序列的一条或两条链。可以切割DNA靶序列的两条链的指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物典型地包含具有处于功能状态的所有其内切核酸酶结构域(例如野生型内切核酸酶结构域或其在每个内切核酸酶结构域中保留一些或全部活性的变体)的Cas蛋白。因此，野生型Cas蛋白(例如，本文公开的Cas9蛋白)，或其在Cas蛋白的每个内切核酸酶结构域中保留一些或全部活性的变体是可以切割DNA靶序列的两条链的Cas内切核酸酶的合适实例。包含功能性RuvC和HNH核酸酶结构域的Cas9蛋白是可以切割DNA靶序列的两条链的Cas蛋白的实例。可以切割DNA靶序列的一条链的指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以在本文中表征为具有切口酶活性(例如，部分切割能力)。Cas切口酶通常包含一个功能性内切核酸酶结构域，该结构域允许Cas仅切割DNA靶序列的一条链(即，形成切口)。例如，Cas9切口酶可以包含(i)突变的、功能失调的RuvC结构域和(ii)功能性HNH结构域(例如野生型HNH结构域)。作为另一个实例，Cas9切口酶可以包含(i)功能性RuvC结构域(例如野生型RuvC结构域)和(ii)突变的、功能失调的HNH结构域。适用于本文的Cas9切口酶的非限制性实例公开于美国专利申请公开号2014/0189896中，其通过引用并入本文。
可以使用一对Cas9切口酶来增加DNA靶向的特异性。一般来说，这可以通过提供两个Cas9切口酶来进行，这两个Cas9切口酶通过与具有不同指导序列的RNA组分缔合，在希望靶向的区域的相反链上在DNA序列附近进行靶向并产生切口。每个DNA链的这样的附近切割产生双链断裂(即，具有单链突出端的DSB)，其然后被识别为非同源末端连接(NHEJ)(倾向于产生导致突变的不完美修复)或同源重组(HR)的底物。在这些实施例中的每个切口可以例如彼此相距至少约5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或100(或在5与100之间的任何整数)个碱基。本文中的一种或两种Cas9切口酶蛋白可以用于Cas9切口酶对。例如，可以使用具有突变的RuvC结构域但具有功能性HNH结构域的Cas9切口酶(即，Cas9 HNH+/RuvC-)(例如，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9 HNH+/RuvC-)。通过使用本文中的合适的RNA组分(具有将每个切口酶靶向每个特异性DNA位点的指导RNA序列)，将每个Cas9切口酶(例如，Cas9 HNH+/RuvC-)引导到彼此邻近(相距多达100个碱基对)的特定DNA位点。
Cas蛋白可以是包含一个或多个异源蛋白质结构域(例如除Cas蛋白之外的1、2、3或更多个结构域)的融合蛋白的一部分。这样的融合蛋白可以包含任何另外的蛋白质序列，以及任选地在任何两个结构域之间(例如在Cas和第一异源结构域之间)的接头序列。可以与本文中的Cas蛋白融合的蛋白质结构域的实例包括但不限于表位标签(例如，组氨酸[His]、V5、FLAG、流感血球凝集素[HA]、myc、VSV-G、硫氧还蛋白[Trx])；报告基因(例如谷胱甘肽-5-转移酶[GST]、辣根过氧化物酶[HRP]、氯霉素乙酰转移酶[CAT]、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶[GUS]、荧光素酶、绿色荧光蛋白[GFP]、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白[CFP]、黄色荧光蛋白[YFP]、蓝色荧光蛋白[BFP])；以及具有一个或多个以下活性的结构域：甲基化酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性(例如，VP16或VP64)、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。Cas蛋白还可以与结合DNA分子或其他分子的蛋白质融合，例如麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、Lex A DNA结合结构域(DBD)、GAL4A DNA结合结构域和单纯疱疹病毒(HSV)VP16。对于Cas蛋白的更多实例，参见2016年5月12日提交的PCT专利申请PCT/US16/32073和2016年5月12日提交的PCT/US16/32028(这两个申请均通过引用并入本文)。
在某些实施例中，指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以结合DNA靶位点序列，但不切割在靶位点序列处的任何链。这样的复合物可以包含其中所有核酸酶结构域都是突变的、功能失调的Cas蛋白。例如，可以结合DNA靶位点序列但在靶位点序列处不切割任何链的本文的Cas9蛋白可以包含突变的、功能失调的RuvC结构域和突变的、功能失调的HNH结构域。结合但不切割靶DNA序列的本文中的Cas蛋白可以用于调节基因表达，例如，在该情况下，Cas蛋白可以与转录因子(或其部分)(例如抑制子或激活子，例如本文公开的那些中的任一种)融合。在其他的方面，失活的Cas蛋白可以与另一种具有内切核酸酶活性的蛋白质(例如Fok I内切核酸酶)融合。
本文的Cas内切核酸酶基因可以编码II型Cas9内切核酸酶，所述基因例如但不限于WO 2007/025097的SEQ ID NO：462、474、489、494、499、505、和518中列出并通过引用并入本文的Cas9基因。在另一个实施例中，Cas内切核酸酶基因是微生物Cas9内切核酸酶基因或优化的Cas9内切核酸酶基因。Cas内切核酸酶基因可以可操作地连接至Cas密码子区上游的SV40核靶向信号和Cas密码子区下游的二分型VirD2核定位信号(Tinland等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：7442-6)。
其他Cas内切核酸酶系统已经描述于PCT专利申请PCT/US16/32073和PCT/US16/32028中，这两个申请均通过引用并入本文。
本文中的“Cas9”(以前称为Cas5、Csn1、或Csx12)是指与cr核苷酸和tracr核苷酸或与单指导多核苷酸形成复合物的II型CRISPR系统的Cas内切核酸酶，其用于特异性识别和切割DNA靶序列的全部或部分。Cas9蛋白包含RuvC核酸酶结构域和HNH(H-N-H)核酸酶结构域，它们各自可以在靶序列处切割单个DNA链(这两个结构域的协同作用导致DNA双链切割，而一个结构域的活性导致一个缺口)。通常，RuvC结构域包含亚结构域I、II和III，其中结构域I位于Cas9的N-末端附近，并且亚结构域II和III位于该蛋白质的中间，即位于HNH结构域的侧翼(Hsu等人，Cell[细胞]157：1262-1278)。II型CRISPR系统包括利用与至少一种多核苷酸组分复合的Cas9内切核酸酶的DNA切割系统。例如，Cas9可以与CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)复合。在另一个实例中，Cas9可以与单指导RNA复合。
本文中的Cas蛋白(例如Cas9)可以包含异源核定位序列(NLS)。例如，本文中的异源NLS氨基酸序列可能具有足够的强度来驱动在本文的酵母细胞细胞核中可检测的量的Cas蛋白的积累。NLS可以包含碱性、带正电荷的残基(例如赖氨酸和/或精氨酸)的一个(单分型)或多个(例如，二分型)短序列(例如，2至20个残基)，并且可以位于Cas氨基酸序列中的任何地方，但使得其暴露于蛋白质表面上。例如，NLS可以可操作地连接到本文中的Cas蛋白的N-末端或C-末端。两个或更多个NLS序列可以连接到Cas蛋白，例如在Cas蛋白的N-末端和C-末端两者。本文中的合适的NLS序列的非限制性实例包括在美国专利号7309576中公开的那些，将该专利通过引用并入本文。
所述Cas内切核酸酶可以包括Cas9多肽的修饰形式。所述Cas9多肽的修饰形式可以包括降低Cas9蛋白的天然存在的核酸酶活性的氨基酸变化(例如，缺失、插入、或取代)。例如，在一些情况下，所述Cas9蛋白的修饰形式具有低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、或低于1％的相应的野生型Cas9多肽(美国专利申请US20140068797 A1)的核酸酶活性。在一些情况下，该Cas9多肽的修饰形式不具有实质性的核酸酶活性并且被称作催化“失活的Cas9”或“去活的cas9(dCas9)”。催化失活的Cas9变体包括在HNH和RuvC核酸酶结构域中含有突变的Cas9变体。这些催化失活的Cas9变体能够与sgRNA相互作用，并且在体内结合靶位点但不能切割靶DNA的任一链。
催化失活的Cas9可以与异源序列融合(美国专利申请US20140068797 A1)。合适的融合配偶体包括但不限于提供活性的多肽，所述活性通过直接作用于靶标DNA上或与所述靶DNA相关的多肽(例如，组蛋白或其他DNA结合蛋白)上间接地增加转录。另外的合适的融合配偶体包括但不限于提供甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰基转移酶活性、脱乙酰基酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化酶活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、苏素化活性、去苏素化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、豆蔻酰化活性、或去豆蔻酰化活性的多肽。另外的合适的融合配偶体包括但不限于直接提供靶标核酸的增加的转录的多肽(例如，转录激活因子或其片段、募集转录激活因子的蛋白质或其片段、小分子/药物-应答性转录调节因子等)。还可以将催化失活的Cas9与FokI核酸酶融合以产生双链断裂(Guilinger等人Nature Biotechnology[自然生物技术]，第32卷，第6期，2014年6月)。
术语Cas内切核酸酶的“功能性片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换地使用，并且意指本公开的Cas内切核酸酶序列的一部分或子序列，其中保留识别、结合靶位点并任选地使靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)靶位点的能力。
术语Cas内切核酸酶的“功能性变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换地使用，并且意指本公开的Cas内切核酸酶的变体，其中保留识别、结合靶位点并任选地使靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)靶位点的能力。这些片段和变体可以经由例如定点诱变和合成构建等方法来获得。
任何指导的内切核酸酶可以用于本文公开的方法中。这样的内切核酸酶包括但不限于Cas9和Cpf1内切核酸酶。迄今为止已经描述了许多内切核酸酶，所述内切核酸酶可以识别特定PAM序列(参见例如-Jinek等人(2012)Science[科学]337第816-821页，PCT专利申请PCT/US16/32073和PCT/US16/32028，以及Zetsche B等人2015.Cell[细胞]163，1013)并且在特定位置处切割靶DNA。应理解，基于本文所述的使用指导的Cas系统的方法和实施例，现在人们可以定制这些方法这样使得它们可以利用任何指导的内切核酸酶系统。
如本文所使用的，术语“指导多核苷酸”涉及可以与Cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得Cas内切核酸酶能够识别、结合并任选地切割DNA靶标位点。指导多核苷酸可以是单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，指导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟代A、2’-氟代U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导RNA”或“gRNA”(还参见美国专利申请US 2015-0082478 A1和US 2015-0059010 A1，两者均通过引用以其全文特此并入)。
指导多核苷酸可以是包含cr核苷酸序列和tracr核苷酸序列的双分子(也称为双链体指导多核苷酸)。cr核苷酸包括可以与靶DNA中的核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和作为Cas内切核酸酶识别(CER)结构域的一部分的第二核苷酸序列(也称为tracr配对序列)。tracr配对序列可以沿互补区与tracr核苷酸杂交，并一起形成Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域。CER结构域能够与Cas内切核酸酶多肽相互作用。双链体指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸可以是RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。在一些实施例中，双链体指导多核苷酸的cr核苷酸分子被称为“crDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。cr核苷酸可以包含天然存在于细菌和古细菌中的cRNA的片段。可以存在于本文公开的cr核苷酸中的、细菌和古细菌中天然存在的cRNA片段的大小可以是但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施例中，tracr核苷酸被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。在一个实施例中，指导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链体化的RNA。
在5′-至-3′方向上，tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)含有(i)与CRISPR II型crRNA的重复区退火的序列和(ii)含茎环的部分(Deltcheva等人，Nature[自然]471：602-607)。双链体指导多核苷酸可以与Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物(还称作指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统)可以将所述Cas内切核酸酶引导至基因组靶位点，使所述Cas内切核酸酶能够识别、结合靶位点并任选地使靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)靶位点。(还参见2015年3月19日公开的美国专利申请US2015-0082478 A1，和US 2015-0059010 A1，两者均通过引用以其全文特此并入。)
单指导多核苷酸可以与Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物(还称作指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统)可以将Cas内切核酸酶引导至基因组靶位点，使所述Cas内切核酸酶能够识别、结合靶位点、并任选地使靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)靶位点。(还参见美国专利申请US 2015-0082478 A1和US2015-0059010 A1，两者均通过引用特此以其全文并入。)
术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在本文中可互换使用，并且包括可以与双链DNA靶位点的一条链(核苷酸序列)杂交(互补)的核苷酸序列。第一核苷酸序列结构域(VT结构域)与靶序列之间的互补百分比可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶向结构域可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在一些实施例中，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向域可以由DNA序列、RNA序列、经修饰的DNA序列、经修饰的RNA序列或其任何组合构成。
术语(指导多核苷酸的)“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在本文中可互换地使用，并且包括与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列。CER结构域包含tracr核苷酸配对序列，随后是tracr核苷酸序列。CER结构域可以由DNA序列、RNA序列、经修饰的DNA序列、经修饰的RNA序列(参见例如US 2015-0059010 A1，其通过引用以其全文并入本文)或其任何组合构成。
术语指导RNA、crRNA或tracrRNA的“功能性片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换地使用，并且分别意指本公开的指导RNA、crRNA或tracrRNA的一部分或子序列，其中分别保留用作指导RNA、crRNA或tracrRNA的能力。
术语指导RNA、crRNA或tracrRNA(分别地)的“功能性变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换地使用，并且分别意指本公开的指导RNA、crRNA或tracrRNA的变体，其中分别保留用作指导RNA、crRNA或tracrRNA的能力。
术语“单指导RNA”和“sgRNA”在本文中可互换使用，并涉及两个RNA分子的合成融合，其中包含可变靶向结构域(与tracrRNA杂交的tracr配对序列连接)的crRNA(CRISPRRNA)与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)融合。单指导RNA可以包含可与II型Cas内切核酸酶形成复合物的、II型CRISPR/Cas系统的crRNA或crRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述指导RNA/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶引导至DNA靶位点，使得Cas内切核酸酶能够识别、结合DNA靶位点、并任选地使DNA靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)DNA靶位点。
术语“指导RNA/Cas内切核酸酶复合物”、“指导RNA/Cas内切核酸酶系统”、“指导RNA/Cas复合物”、“指导RNA/Cas系统”、“gRNA/Cas复合物”、“gRNA/Cas系统”、“RNA指导的内切核酸酶”、“RGEN”在本文中可互换地使用，并且意指能够形成复合物的至少一种RNA组分和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述指导RNA/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶引导至DNA靶位点，使Cas内切核酸酶能够识别、结合DNA靶位点、并任选地使DNA靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)DNA靶位点。本文中的指导RNA/Cas内切核酸酶复合物可以包含四种已知的CRISPR系统(Horvath和Barrangou，2010，Science[科学]327：167-170)(例如I型、II型或III型CRISPR系统)中任一种的一种或多种Cas蛋白和一种或多种合适的RNA组分。指导RNA/Cas内切核酸酶复合物可以包括II型Cas9内切核酸酶和至少一种RNA组分(例如，crRNA和tracrRNA、或gRNA)。(还参见美国专利申请US 2015-0082478 A1和US 2015-0059010 A1，两者均通过引用以其全文特此并入)。
使用在本领域已知的任何方法(例如，但不限于，粒子轰击、农杆菌转化或局部施用)，可以将作为单链多核苷酸或双链多核苷酸的指导多核苷酸瞬时地引入细胞。指导多核苷酸还可以通过引入(通过例如但不限于粒子轰击或农杆菌转化等方法)包含编码指导多核苷酸的异源核酸片段的重组DNA分子而被间接引入细胞，所述异源核酸片段可操作地连接至能够在所述细胞内转录指导RNA的特异性启动子。特异性启动子可以是但不限于如描述于WO 2016025131(将其通过引用以其全文并入本文)中的RNA聚合酶III启动子，其允许具有精确定义的未修饰的5′-和3′-端的RNA转录(DiCarlo等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]41：4336-4343；Ma等人，Mol.Ther.Nucleic Acids[分子治疗-核酸]3：e161)。
术语“靶位点”、“靶序列”、“靶位点序列”、“靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、“基因组靶基因座”和“前间区”在本文中可互换地使用，并且意指多核苷酸序列，包括但不限于在细胞的染色体、附加体、或基因组中的任何其他DNA分子(包括染色体DNA、叶绿体DNA、线粒体DNA、质粒DNA)内的核苷酸序列，在这些核苷酸序列处指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以进行识别、结合并任选地产生切口或进行切割。靶位点可以是细胞的基因组中的内源性位点，或者可替代地，靶位点可以与细胞异源并且从而不是天然存在于细胞的基因组中，或者与其在自然界发现的位置相比，可以在异质基因组位置中找到靶位点。如本文所使用的，术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换使用，是指对细胞的基因组来说是内源的或天然的靶序列。细胞包括但不限于人类、非人类、动物、细菌、真菌、昆虫、酵母、非常规酵母和植物细胞，以及通过本文所述的方法产生的植物和种子。“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换使用，并且是指已经引入细胞的基因组中的靶序列。这样的人工靶序列可以在序列上与细胞的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于细胞的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。
“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“经修饰的靶位点”、“经修饰的靶序列”在本文中可互换使用，并且是指如本文公开的靶序列，当与未改变的靶序列相比时，所述靶序列包括至少一个改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
靶DNA序列(靶位点)的长度可以变化，并且包括例如为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸长度的靶位点。还有可能靶位点可以是回文的，即，一条链上的序列与互补链上以相反方向的读取相同。切口/切割位点可以在靶序列内，或者切口/切割位点可以在靶序列之外。在另一种变异中，切割可以发生在彼此正好相对的核苷酸位置处，以产生平端切割，或者在其他情况下，切口可以交错以产生单链突出端，也称为“粘性末端”，其可以是5′突出端或3′突出端。还可以使用基因组靶位点的活性变体。这样的活性变体可以包含与给定靶位点至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述活性变体保留生物活性，因此能够被Cas内切核酸酶识别和切割。测量由内切核酸酶引起的靶位点的单链或双链断裂的测定是本领域已知的，并且通常测量试剂对包含识别位点的DNA底物的总体活性和特异性。
本文中的“前间区邻近基序”(PAM)意指与由本文所述的指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统识别的(靶向的)靶序列(前间区)邻近的短核苷酸序列。如果靶DNA序列不在PAM序列后面，则Cas内切核酸酶可能无法成功识别该靶DNA序列。本文中的PAM的序列和长度可以根据所使用的Cas蛋白或Cas蛋白复合物而不同。该PAM序列可以是任何长度，但典型地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸长度。
术语“靶向”、“基因靶向”和“DNA靶向”在本文中可互换地使用。本文中的DNA靶向可能是在特定的DNA序列(例如细胞的染色体或质粒)中特异性引入敲除、编辑、或敲入。通常，DNA靶向可以通过在具有与合适的多核苷酸组分缔合的内切核酸酶的细胞中的特异性DNA序列处切割一条或两条链来进行。这样的DNA切割(如果是双链断裂(DSB))可以促进NHEJ或HDR过程，这可能导致靶位点处的修饰。
本文的靶向方法能以例如在该方法中靶向两个或更多个DNA靶位点的这样的方式进行。这样的方法可以任选地被表征为多重方法。在某些实施例中，可以同时靶向两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个靶位点。多重方法典型地通过本文的靶向方法进行，其中提供了多个不同的RNA组分，每一个被设计成将指导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物指导到独特的DNA靶位点。
术语“敲除”、“基因敲除”和“遗传敲除”在本文中可互换使用。如本文所使用的敲除表示已经通过用Cas蛋白进行靶向使得细胞的DNA序列部分或完全无效；例如，这样的DNA序列在敲除之前可能已编码氨基酸序列，或可能已具有调节功能(例如启动子)。可以通过插入缺失(通过NHEJ在靶DNA序列中插入或缺失核苷酸碱基)，或通过特异性去除在靶向位点处或其附近处降低或完全破坏序列功能的序列来产生敲除。
指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可以与共同递送的多核苷酸修饰模板组合使用以允许编辑(修饰)目的基因组核苷酸序列。(还参见美国专利申请US 2015-0082478 A1，和WO2015/026886 A1，两者均通过引用以其全文特此并入。)
术语“敲入”、“基因敲入”、“基因插入”和“遗传敲入”在本文中可互换地使用。敲入代表通过用Cas蛋白靶向在细胞中的特异性DNA序列处进行的DNA序列的替换或插入(通过HR，其中还使用合适的供体DNA多核苷酸)。敲入的实例包括但不限于异源氨基酸编码序列在基因的编码区中的特异性插入，或转录调节元件在遗传基因座中的特异性插入。
可以采用不同方法和组合物来获得细胞或生物体，所述细胞或生物体具有插入针对Cas内切核酸酶的靶位点中的目的多核苷酸。此类方法可以采用同源重组以提供目的多核苷酸在靶位点处的整合。在提供的一个方法中，将在供体DNA构建体中的目的多核苷酸提供给生物体细胞。如本文所使用的，“供体DNA”是包括待插入到Cas内切核酸酶的靶位点中的目的多核苷酸的DNA构建体。供体DNA构建体可以进一步包含位于目的多核苷酸侧翼的同源第一区和第二区。供体DNA的同源第一区和第二区分别与存在于细胞或生物体基因组的靶位点中或位于所述靶位点侧翼的第一和第二基因组区域共享同源性。“同源”意指DNA序列是类似的。例如，在供体DNA上发现的“与基因组区域同源的区域”是与细胞或生物体基因组中给定的“基因组区域”具有类似序列的DNA区域。同源区域可以具有足以促进在切割的靶位点处的同源重组的任何长度。例如，同源区域的长度可以包括至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，这样使得同源区域具有足够的同源性以与相应的基因组区域进行同源重组。“足够的同源性”表示两个多核苷酸序列具有足够的结构相似性以充当同源重组反应的底物。结构相似性包括每个多核苷酸片段的总长度以及多核苷酸的序列相似性。序列相似性可以通过在序列的整个长度上的百分比序列同一性，和/或通过包含局部相似性的保守区(例如具有100％序列同一性的连续核苷酸)，以及在序列长度的一部分上的百分比序列同一性来描述。
相对于参考序列(主题序列)，“百分比(％)序列同一性”被确定为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性后，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何氨基酸保守取代，候选序列(查询序列)中与参考序列中的相应氨基酸残基或核苷酸同一的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定百分比序列同一性目的而进行的比对能以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公共可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2。本领域的技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在进行比较的序列的全长度上实现最大比对所需的任何算法。为了确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的百分比同一性，出于最佳比较目的，将序列进行比对。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的同一位置的数目的函数(例如，查询序列的百分比同一性＝查询序列和主题序列之间的同一位置的数目/查询序列的位置总数(例如重叠位置)×100)。
由靶标和供体多核苷酸共享的同源性或序列同一性的量可以变化，并且包括总长度和/或在约1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb、或多达并包括靶位点的总长度的范围内具有单位整数值的区域。这些范围包括所述范围内的每个整数，例如1-20bp的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可以通过在两个多核苷酸的完整比对长度上的百分比序列同一性来描述，其包括约至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的百分比序列同一性。足够的同源性包括多核苷酸长度、总体百分比序列同一性、和任选地连续核苷酸的保守区域或局部百分比序列同一性的任何组合，例如，足够的同源性可以被描述为与靶标基因座的区域具有至少80％序列同一性的75-150bp的区域。还可以通过用来在高严格条件下特异性杂交的两个多核苷酸的预测能力来描述足够的同源性，参见例如Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](Cold Spring HarborLaboratory Press，NY[纽约冷泉港实验室出版社])；Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验指南]，Ausubel等人，编辑(1994)Current Protocols[实验指南](Greene Publishing Associates，Inc.[格林出版合伙公司]和John Wiley&Sons，Inc.[约翰威利父子公司])；以及Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学和分子生物学中的实验室技术--与核酸探针杂交](Elsevier[爱思唯尔出版社]，纽约)。
在给定的基因组区域和在供体DNA上发现的相应的同源区域之间的结构相似性可以是允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。例如，由供体DNA的“同源区域”和生物体基因组的“基因组区域”共享的同源性或序列同一性的量可以是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，这样使得序列进行同源重组。
供体DNA上的同源区域可以与位于靶位点侧翼的任何序列具有同源性。虽然在一些实施例中，同源区域与紧邻靶位点侧翼的基因组序列共享显著的序列同源性，但是应当认识到同源区域可以被设计为与可能距靶位点的5′或3′更远的区域具有足够的同源性。在仍其他实施例中，同源区域还可以与靶位点的片段以及下游基因组区域具有同源性。在一个实施例中，第一同源区域进一步包含靶位点的第一片段，并且第二同源区域包含靶位点的第二片段，其中第一片段和第二片段不同。
如本文所使用的，“同源重组”包括在同源的位点处的两个DNA分子之间的DNA片段的交换。同源重组的频率受多个因素影响。不同的生物体相对于同源重组的量和同源与非同源重组的相对比例而变化。通常，同源区域的长度影响同源重组事件的频率：同源区域越长，频率越高。为观察同源重组而需要的同源区域的长度也是随物种而异的。在许多情况下，已经利用了至少5kb的同源性，但已经观察到具有仅25-50bp的同源性的同源重组。参见，例如，Singer等人，(1982)Cell[细胞]31：25-33；Shen和Huang，(1986)Genetics[遗传学]112：441-57；Watt等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]82：4768-72；Sugawara和Haber，(1992)Mol Cell Biol[分子细胞生物学]12：563-75；Rubnitz和Subramani，(1984)Mol Cell Biol[分子细胞生物学]4：2253-8；Ayares等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：5199-203；Liskay等人，(1987)Genetics[遗传学]115：161-7。
同源-定向修复(HDR)是在细胞中用来修复双链DNA和单链DNA断裂的机制。同源-定向修复包括同源重组(HR)和单链退火(SSA)(Lieber.2010 Annu.Rev.Biochem.[生物化学年鉴]79：181-211)。HDR的最常见形式称为同源重组(HR)，其在供体和受体DNA之间具有最长的序列同源性要求。HDR的其他形式包括单链退火(SSA)和断裂诱导的复制，并且这些需要相对于HR更短的序列同源性。缺口(单链断裂)处的同源-定向修复可以经由与在双链断裂处的HDR不同的机制发生(Davis和Maizels.(2014)PNAS[美国科学院院报](0027-8424)，111(10)，第E924-E932页)。
植物细胞的基因组的改变(例如通过同源重组(HR))是对于遗传工程而言的有力工具。已经证明了在植物中(Halfter等人，(1992)Mol Gen Genet[分子和普通遗传学]231：186-93)和昆虫中(Dray和Gloor，1997，Genetics[遗传学]147：689-99)的同源重组。在其他生物体中也可以实现同源重组。例如，在寄生原生动物利什曼原虫(Leishmania)中，至少需要150-200bp的同源性进行同源重组(Papadopoulou和Dumas，(1997)Nucleic Acids Res[核酸研究]25：4278-86)。在丝状真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中，已经用仅50bp侧翼同源性实现了基因替换(Chaveroche等人，(2000)Nucleic Acids Res[核酸研究]28：e97)。在纤毛虫嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中也已经证明了靶向基因替换(Gaertig等人，(1994)Nucleic Acids Res[核酸研究]22：5391-8)。在哺乳动物中，使用可以在培养基中生长、转化、选择、和引入小鼠胚胎中的多能胚胎干细胞系(ES)，同源重组在小鼠中已经是最成功的(Watson等人，1992，Recombinant DNA[重组DNA]，第2版，(Scientific American Books distributed by WH Freeman&Co.[由WH Freeman&Co.公司发行的美国科学图书])。
易错DNA修复机制可以在双链断裂位点处产生突变。非同源末端连接(NHEJ)途径是用来将断裂的末端结合在一起的最常见的修复机制(Bleuyard等人，(2006)DNA Repair[DNA修复]5：1-12)。染色体的结构完整性通常通过修复来保持，但是缺失、插入、或其他重排是可能的。一个双链断裂的两个末端是NHEJ的最普遍的底物(Kirik等人，(2000)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]19：5562-6)，然而如果发生两种不同的双链断裂，则来自不同断裂的游离端可以被连接，并且导致染色体缺失(Siebert和Puchta，(2002)Plant Cell[植物细胞]14：1121-31)或不同染色体之间的染色体易位(Pacher等人，(2007)Genetics[遗传学]175：21-9)。
可以通过本领域已知的任何手段引入供体DNA。可以通过本领域已知的任何转化方法(包括，例如农杆菌介导的转化或生物射弹粒子轰击)提供供体DNA。供体DNA可以瞬时地存在于细胞中，或可以经由病毒复制子引入。在Cas内切核酸酶和靶位点的存在下，供体DNA被插入到转化植物的基因组中。(参见引导语)
指导RNA/Cas内切核酸酶系统的另外的用途已进行了描述(参见美国专利申请US2015-0082478 A1、WO 2015/026886 A1、US 2015-0059010 A1、美国申请62/023246、和美国申请62/036,652，将其全部通过引用并入本文)，并且包括但不限于修饰或取代目的核苷酸序列(例如调节元件)、目的多核苷酸插入、基因敲除、基因敲入、剪接位点的修饰和/或引入交替剪接位点、编码目的蛋白的核苷酸序列的修饰、氨基酸和/或蛋白质融合物、以及通过在目的基因中表达反向重复序列引起的基因沉默。
II.产生具有经修饰的Ht1和/或NLB18核苷酸序列的玉蜀黍植物的方法
A.Ht1
在美国专利申请US2010095395中描述了与染色体2上的北方叶枯病抗性相关的QTL的作图。克隆Ht1基因并鉴定为推定的CC-NB-LRR(卷曲螺旋，核苷酸结合，富含亮氨酸的重复)基因(US 62/242,691)。来自PH4GP和来自PH1W2的Ht1 cDNA序列(Ht1的抗性等位基因的另一来源；美国专利申请US2010095395)分别由SEQ ID NO：51和53表示，而所编码的多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：52和54表示并且具有99.6％同一性。B73(其具有易感等位基因)具有两种剪接变体，并且所述新颖变体(本文称为B73-高)以比已知变体(本文称为B73-低)高得多的水平表达。SEQ ID NO：55是B73-高等位基因的cDNA序列，而所编码的多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：56表示。SEQ ID NO：57是B73-低等位基因的cDNA序列，而所编码的多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：58表示。PH4GP(抗性)等位基因的基因组序列在本文中以SEQ ID NO：59提供。CC和NB结构域在易感等位基因(B73)和抗性等位基因(来自PH4GP和PH1W2)之间高度相似，如US 62/242,691中示出的。但是，B73在LRR中有缺失。在Ht1抗性等位基因中的这一区域的氨基酸序列由SEQ ID NO：60表示。
用于获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞的方法包括：在玉蜀黍植物细胞中的内源HT1编码序列的一个或多个靶位点处引入双链断裂，并获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞。在其他的方面，所述方法包括：在玉蜀黍植物细胞中的内源Ht1编码序列中的一个或多个靶位点处引入双链断裂，并获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞。所述方法可以进一步包括在玉蜀黍植物细胞中引入NLB18取代模板，其中所述Ht1取代模板与内源Ht1编码序列相比包含至少一个核酸改变，并且其中所述Ht1取代模板并入内源Ht1编码序列中。所述方法可以进一步包括在玉蜀黍植物细胞中引入Ht1取代模板，其中所述Ht1取代模板与内源HT1编码序列相比包含至少一个核酸改变，并且其中所述Ht1取代模板并入内源HT1编码序列中。双链断裂可以由核酸酶诱导，包括但不限于TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶或CRISPR相关核酸酶。所述方法可以进一步包括从具有经修饰的Ht1核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞生长玉蜀黍植物，并且该玉蜀黍植物可以展现出对北方叶枯病的增强的抗性。
如本文提出的“Ht1核苷酸序列”可以指作为整体或呈片段的Ht1启动子、外显子、内含子和/或终止子序列。
“内源HT1编码序列”是指存在于未修饰的玉蜀黍植物细胞中并编码HT1多肽的核苷酸序列。
“Ht1取代模板”是含有有利形式的Ht1核苷酸序列(即赋予对北方叶枯病增强的抗性的核苷酸序列)的多核苷酸修饰模板。
当与缺少经修饰的Ht1核苷酸序列的等效的玉蜀黍植物相比，所述玉蜀黍植物展现出对北方叶枯病的增强的抗性。“等效的”意指玉蜀黍植物在遗传上是相似的，除了Ht1序列之外。
在一些方面，经修饰的Ht1核苷酸序列包含在内源HT1编码序列的启动子中的缺失。这可涉及使用Cas9内切核酸酶和一种或多种指导RNA。如果使用两种指导RNA，第一指导RNA可以包含与SEQ ID NO：1[Ht1-TS2]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA可以包含与SEQ ID NO：2[Ht1-TS4]互补的可变靶向结构域；或者第一指导RNA可以包含与SEQ IDNO：1[Ht1-TS2]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA可以包含与SEQ ID NO：3[Ht1-ST1-TS1]互补的可变靶向结构域。
在其他的方面，使用Ht1取代模板，其包含来自PH4GP的Ht1核苷酸序列或其片段，或包含以下Ht1核苷酸序列，所述核苷酸序列当引入玉蜀黍植物细胞时编码具有与SEQ IDNO：52具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列的多肽。这可涉及使用Cas9内切核酸酶和一种或多种指导RNA。如果使用两种指导RNA，第一指导RNA可以包含与SEQ ID NO：14[Ht1-TS6]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA可以包含与SEQ ID NO：16[Ht1-TS9]互补的可变靶向结构域；或者第一指导RNA可以包含与SEQ ID NO：15[Ht1-TS7]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA可以包含与SEQID NO：17[Ht1-TS10]互补的可变靶向结构域。
B.NLB18
在国际专利申请WO 2011163590中描述了与染色体8上的北方叶枯病抗性相关的QTL的作图。具有高度保守的激酶催化结构域的两种蛋白激酶(PK)样基因被鉴定为非常接近，并且在国际专利申请WO 2011163590中称为NLB17和NLB18。NLB18被验证为赋予对北方叶枯病增强的抗性的基因(未公开的)。来自WO 2011163590中描述的两种抗性来源PH26N和PH99N的NLB18 cDNA序列分别由SEQ ID NO：61和63表示，而所编码的多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：62和64表示。SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64具有92.4％同一性。
本文提供了用于获得具有经修饰的NLB18核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞的方法。所述方法包括：在玉蜀黍植物细胞中的内源NLB18编码序列中的一个或多个靶位点处引入双链断裂，并且获得具有经修饰的NLB18核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞。所述方法可以进一步包括在玉蜀黍植物细胞中引入NLB18取代模板，其中所述NLB18取代模板与内源NLB18编码序列相比包含至少一个核酸改变，并且其中所述NLB18取代模板并入内源NLB18编码序列中。双链断裂可以由核酸酶诱导，例如但不限于TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶或CRISPR相关核酸酶。所述方法可以进一步包括从具有经修饰的NLB18核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞生长玉蜀黍植物，并且该玉蜀黍植物可以展现出对北方叶枯病的增强的抗性。
如本文提出的“NLB18核苷酸序列”可以指NLB18启动子、外显子、内含子、终止子序列、和/或位于NLB18基因组基因座内的作为整体或呈片段的任何其他基因组核苷酸序列。
“内源NLB18编码序列”是指存在于未修饰的玉蜀黍植物细胞中并编码NLB18多肽的核苷酸序列。
“NLB18取代模板”是含有有利形式的NLB18核苷酸序列(即赋予对北方叶枯病的增强的抗性的核苷酸序列)的多核苷酸修饰模板。
当与缺少经修饰的NLB18核苷酸序列的等效的玉蜀黍植物相比，所述玉蜀黍植物展现出对北方叶枯病的增强的抗性。“等效的”意指玉蜀黍植物在遗传上是相似的，除了NLB18序列之外。
在一些方面，经修饰的NLB18核苷酸序列包含在内源NLB18编码序列的启动子中的修饰。
在其他的方面，使用NLB18取代模板，其包含来自PH26N或PH99N的NLB18核苷酸序列，或包含以下NLB18核苷酸序列，所述核苷酸序列当引入玉蜀黍植物细胞时编码具有与SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：64具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些方面，NLB18取代模板包含SEQ ID NO：70。在一些实施例中，使用NLB取代模板可涉及使用Cas9内切核酸酶和一种或多种指导RNA。如果使用两种指导RNA，第一指导RNA可以包含与SEQ ID NO：30[NLB18-TS1]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA可以包含与SEQ ID NO：32[NLB18-TS4]互补的可变靶向结构域；或者第一指导RNA可以包含与SEQ ID NO：31[NLB18-TS8]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA可以包含与SEQ ID NO：32[NLB18-TS4]互补的可变靶向结构域。
III.获得具有基因组基因座的玉蜀黍植物细胞的方法，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的核苷酸序列
目的多核苷酸和/或性状可以在复合物性状基因座中堆叠在一起，如在US 2013/0263324-A1和PCT/US13/22891中所述的，将这两个申请通过引用特此并入。
本文提供了用于获得具有基因组基因座的玉蜀黍植物细胞的方法，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的至少一种核苷酸序列。所公开的方法包括在玉蜀黍植物细胞的基因组基因座中的一个或多个靶位点处引入双链断裂；引入赋予对北方叶枯病的增强的抗性的一种或多种核苷酸序列，其中每种核苷酸序列侧翼有相应靶位点的300-500bp的5′或3′核苷酸序列；以及获得具有基因组基因座的玉蜀黍植物细胞，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的一种或多种核苷酸序列。双链断裂可以由核酸酶诱导，例如但不限于TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶或CRISPR相关核酸酶。所述方法可以进一步包括从具有基因组基因座的玉蜀黍植物细胞生长玉蜀黍植物，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的至少一种核苷酸序列，并且所述玉蜀黍植物可以展现出对北方叶枯病的增强的抗性。
当与缺少在目的基因组基因座处赋予对北方叶枯病的增强的抗性的核苷酸序列的等效玉蜀黍植物相比，所述玉蜀黍植物展现出对北方叶枯病的增强的抗性。“等效的”意指玉蜀黍植物在遗传上是相似的，除了目的基因组基因座之外。
在一些方面，赋予对北方叶枯病的增强的抗性的一种或多种核苷酸序列包括以下任何一种：Ht1-PH4GP、NLB18-PH26N和NLB18-PH99N。Ht1-PH4GP核苷酸序列可包含SEQ IDNO：59或编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：52的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列，其中所述多肽在玉蜀黍植物中赋予对北方叶枯病的增强的抗性。在一些方面，Ht1-PH4GP核苷酸序列是SEQ ID NO：65。NLB18-PH26N核苷酸序列可包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ IDNO：64的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列，其中所述多肽在玉蜀黍植物中赋予对北方叶枯病的增强的抗性。在一些方面，NLB18-PH26N核苷酸序列是SEQ ID NO：70。NLB18-PH99N核苷酸序列可包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：62的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列，其中所述多肽在玉蜀黍植物中赋予对北方叶枯病的增强的抗性。
在其他的方面，赋予对北方叶枯病的增强的抗性的基因组基因座包含CTL1。在仍其他的方面，编码NLB18-PH26N的核苷酸序列靶向CTL1的TS8；编码NLB18-PH4GP的核苷酸序列靶向CTL1的TS10；和/或编码NLB18-PH26N的核苷酸序列靶向CTL1的TS45。
如本文所述的指导多核苷酸/Cas9内切核酸酶系统提供了用来产生双链断裂的有效系统，并允许性状在复杂性状基因座中堆叠。因此，在一个方面，将Cas9内切核酸酶用作DSB诱导剂，并且将一种或多种指导RNA用于将Cas9靶向CTL1基因座中的位点。一种指导RNA可以包含与SEQ ID NO：36[CTL1-TS8]互补的可变靶向结构域，一种指导RNA可以包含与SEQID NO：37[CTL1-TS10]互补的可变靶向结构域，并且一种指导RNA可以包含与SEQ ID NO：38[CTL1-TS45]互补的可变靶向结构域。
通过本文所述的方法产生的玉蜀黍植物可以提供对北方叶枯病的持久和广谱的抗性，并且可以协助繁育北方叶枯病抗性玉蜀黍植物。例如，因为赋予对北方叶枯病的增强的抗性的核苷酸序列彼此紧密连锁(在一个基因座处)，这减少了需要通过回交进行性状渐渗的特定基因座的数量，并且使来自非优良抗性供体的连锁累赘最小化。
如本文所使用的，关于序列的“异源性”是指源于外来物种的序列，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生所述多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方从它们的原始形式和/或基因组基因座进行实质性修饰得到，或者所述启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。
IV.玉蜀黍植物细胞、植物和种子
“玉蜀黍(maize)”是指玉蜀黍物种(Zea mays L.ssp.mays)的植物，并且也被称为“玉米(corn)”。在本文描述的物体之前使用“ZM”是指该物体来自玉蜀黍(Zea mays)这一事实。
还提供了具有本文公开的经修饰的Ht1或NLB18序列的玉蜀黍植物、玉蜀黍植物细胞、玉蜀黍植物部分和种子、以及玉蜀黍籽粒。
如本文所使用的，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等)中的完整植物细胞。籽粒旨在意指由商业种植者出于种植或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。
V.指导多核苷酸
本文还提供了包含与内源Ht1编码序列、内源NLB18编码序列、或CTL1基因组基因座中的靶位点互补的可变靶向结构域的指导多核苷酸。这些指导多核苷酸可以是RNA序列、DNA序列、或RNA-DNA组合序列。对于Ht1，指导多核苷酸可具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3互补的可变靶向结构域。对于NLB18，指导多核苷酸可具有与SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、或SEQ ID NO：32互补的可变靶向结构域。对于CTL1，指导多核苷酸可具有与SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、或SEQ ID NO：38互补的可变靶向结构域。
实例
提供以下实例以说明但不限制所附权利要求书。应当理解，本文所述实例和实施例仅用于说明目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明精神或所附权利要求书的范围的情况下可以改变各种试剂或参数。
实例1
经由启动子区中重复序列的缺失来编辑HT1基因
靶位点选择
描述于WO 2015026885、WO 20158026887、WO 2015026883和WO 2015026886中的gRNA/Cas9定点核酸酶系统用于编辑玉蜀黍中的Ht1基因(WO 2017066597，其通过引用并入本文)。以下靶位点对用于缺失PH184C的Ht1启动子区中的重复序列(由SEQ ID NO：71表示)：HT1-TS2与HT1-TS4、和HT1-TS2与HT1-ST1-TS1。Ht1基因组序列中每个靶位点的位置和缺失结果示意图显示在图1中，并且靶序列列于表1中。
表1.Ht1启动子区基因组靶位点序列
Cas9载体构建
来自酿脓链球菌M1 GAS(SF370)的Cas9基因(SEQ ID NO：4)是按本领域已知的标准技术进行玉蜀黍密码子优化的，并且引入马铃薯ST-LS1内含子以便消除该基因在大肠杆菌和农杆菌中的表达。为了促进Cas9蛋白在玉蜀黍细胞中的核定位，将猿猴病毒40(SV40)单分型氨基末端核定位信号(SEQ ID NO：5)并入Cas9可读框的氨基末端。将玉蜀黍优化的Cas9基因使用标准分子生物学技术可操作地连接至玉蜀黍泛素启动子。除了氨基末端核定位信号SV40之外，来自根癌农杆菌VirD2内切核酸酶的C-末端二分型核定位信号在外显子2的末端融合。所得的序列是SEQ ID NO：72，其包括玉蜀黍泛素启动子、ZM-泛素基因的5′UTR、ZM-泛素基因的内含子1、SV40核定位信号、Cas9外显子1(ST1)、马铃薯-LS1内含子、Cas9外显子2(ST1)、VirD2内切核酸酶核定位信号和pinII终止子。
指导RNA载体构建
为了将Cas9核酸酶引导至指定的基因组靶位点(在表1中)，将玉蜀黍U6聚合酶III启动子(SEQ ID NO：6；参见WO 2015026885、WO 20158026887、WO 2015026883和WO2015026886)及其同源U6聚合酶III终止序列(TTTTTTTT)用于引导gRNA表达的起始和终止。用于HT1基因编辑的指导RNA可变靶向结构域被鉴定为HT1-CR2和HT1-CR4，其分别地对应于基因组靶位点HT1-TS2、HT1-TS4，并且HT1-ST1-CR1对应于HT1-ST1-TS。使用双链寡核苷酸通过BsbI位点将编码每个可变核苷酸靶向结构域的DNA克隆到gRNA表达盒中。每个指导RNA表达盒由U6聚合酶III玉蜀黍启动子(所述启动子可操作地连接到指导RNA的DNA版本之一(表2))、以及然后是同源U6聚合酶III终止序列组成。指导RNA的DNA版本由各自的核苷酸可变靶向结构域随后是能够与双链断裂诱导性内切核酸酶相互作用的多核苷酸序列组成。经由标准程序将HT1-ST1-CR1的指导RNA表达盒构建成ST1 Cas9表达盒。
表2.指导RNA表达盒
将指导RNA/Cas9内切核酸酶系统DNA递送至玉蜀黍
将含有上述Cas9和指导RNA表达盒的质粒与含有转化可选择标记NPTII以及转化增强发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2))和Wuschel(20151030-6752USPSP)的质粒共同轰击到优良玉蜀黍品系的基因组中。玉蜀黍未成熟胚的转化可以使用本领域已知的任何方法或下述方法进行。
在一种转化方法中，将穗剥皮并在30％-50％Clorox漂白剂加上0.5％微量洗涤剂中进行表面消毒10分钟，并且然后用无菌水冲洗两次。将未成熟胚分离，并以25个胚/平板将胚轴侧向下(盾片侧向上)放置于13224E培养基上持续2-4小时，并且然后排列在2.5-cm靶标区域内准备进行轰击。
使用-2020(目录号MIR 5404，米卢斯生物有限责任公司(Mirus BioLLC)，麦迪逊，威斯康星州5371)的专有脂质-聚合物混合物将质粒的DNA粘附至0.6μm(平均直径)的金球粒上。使用1μg的质粒DNA制备DNA溶液，并且任选地，使用10ng(0.5μl)的每种质粒制备其他构建体用于共同轰击。向预混的DNA中添加50μl制备的金颗粒(30mg/ml)和1μl-2020并小心混合。允许最终混合物以低速在恒定涡旋下孵育10分钟。在沉淀期后，将管短暂离心，并且去除液体。将金颗粒在微型离心机中以10,000rpm沉淀1分钟并去除水性上清液。添加120μl的100％EtOH，并通过短暂的超声处理将颗粒重悬。然后，将10μl点在每个巨载体的中心上并允许在轰击前干燥约2分钟，从每个制备的颗粒/DNA管中取出总共十个等分试样。
用Biolistic PDA-1000/He(伯乐公司(Bio-Rad))轰击样品板。胚距离巨载体6cm，在200psi破裂盘和巨载体之间具有1/8英寸的间隙。所有样品都接受单次射击。
轰击后，将胚在轰击板上孵育约20小时，然后在26℃-30℃的温度下转移至13266L(静置/诱导培养基)中持续7-9天。然后将胚转移到成熟培养基289H中持续约21天。然后将成熟的体细胞胚转移到萌发培养基272G中并移至光下。在约1至2周内，对含有活芽和根的小植物进行取样分析并送至温室，在那里将它们转移到含有盆栽土壤的平面(等同于2.5″盆)。1-2周后，将植物转移至经典的600盆(1.6加仑)中并使其生长至成熟。
培养基：
轰击培养基(13224E)包含4.0g/l N6基础盐(西格玛公司(SIGMA)C-1416)、1.0ml/l埃里克松氏(Eriksson’s)维生素混合液(1000X西格玛公司(SIGMA)-1511)、0.5mg/l硫胺素HCl、190.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D、以及2.88g/l L-脯氨酸(用D-I H2O定容，之后用KOH调节至pH 5.8)；6.3g/l西格玛公司(Sigma)琼脂(在用D-I H2O定容之后添加)；以及8.5mg/l硝酸银(在对培养基进行灭菌并冷却至室温之后添加)。
选择培养基(13266L)包含1650mg/l硝酸铵、277.8mg/l硫酸铵、5278mg/l硝酸钾、氯化钙、407.4mg/l无水氯化钙、234.92mg/l无水硫酸镁、410mg/l无水磷酸钾、8mg/l一元硼酸、8.6mg/l硫酸锌·7h2o、1.28mg/l碘化钾、44.54mg/l硫酸亚铁·7h2o、59.46mg/lna2edta·2h2o、0.025mg/l氯化钴·6h2o、0.4mg/l钼酸(钠盐)·2h2o、0.025mg/l硫酸铜·5h2o、6mg/l一水硫酸锰、2mg/l硫胺素、0.6ml/l b5h微小盐1000x、0.4ml/l埃里克松氏维生素1000x、6ml/l s&h维生素储液100x、1.98g/l 1-脯氨酸、3.4mg/l硝酸银、0.3g/l酪蛋白水解物(酸)、20g/l蔗糖、0.6g/l葡萄糖、0.8mg/l 2，4-d、1.2mg/l麦草畏、6g/l tc琼脂、100mg/l agribio羧苄青霉素、25mg/l头孢噻肟、和150mg/l遗传霉素(g418)。
植物再生培养基(289H)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素储液(0.100g烟酸、0.02g/l硫胺素HCL、0.10g/l吡哆醇HCL、和0.40g/l甘氨酸，用精制的D-IH2O定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.[植物生理学]15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖、以及1.0ml/l的0.1mM脱落酸(用精制的D-I H2O定容，之后调节至pH 5.6)；8.0g/l西格玛公司(Sigma)琼脂(在用D-1 H2O定容之后添加)；和1.0mg/l吲哚乙酸以及150mg/l遗传霉素(G418)(在将培养基灭菌并且冷却至60℃后添加)。
无激素培养基(272G)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素储液(0.100g/l烟酸、0.02g/l硫胺素HCL、0.10g/l吡哆醇HCL、和0.40g/l甘氨酸，用精制的D-IH2O定容)、0.1g/l肌醇、以及40.0g/l蔗糖(用精制的D-I H2O定容，之后调节pH至5.6)；以及0.5mg/l IBA和150mg/l遗传霉素(G418)以及6g/l细菌用琼脂(在用精制的D-I H2O定容之后添加)，灭菌并冷却至60℃。
筛选T0植物和事件表征
为了鉴定重复序列缺失阳性事件，从T0植物的叶组织中提取基因组DNA，并使用Phusion预混合液(赛默科技公司(Thermo Scientific)F-581)和表3中列出的引物进行PCR。引物位置示于图1中。当切割TS2/TS4或TS2/ST1-TS1时获得扩增子；除去两个位点之间的序列(约35kb)，并将剩余的序列连接在一起。获得具有预期尺寸产物的缺失变体。
下一代测序(NGS)用于评估缺失阳性事件中的连接序列。用快速高保真PCR预混合液(赛默科技公司(Thermo Scientific)，F-531)对连接进行PCR扩增。相同的引物可用于CR2/CR4和CR2/ST1-CR1缺失。初级PCR反应中使用的引物示于表3中，次级PCR反应中使用的引物以SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13提供。反向引物中的“NNNNNNNN”是对应于板上样品位置的条形码序列。图2A显示了在TS2/TSS4缺失时产生的连接序列；并且图2B显示了在TS2/ST1-TS1缺失时产生的连接序列。获得的T0缺失事件的总结示出于表4中。
表3.用于筛选重复序列缺失的引物
表4.T0缺失事件的总结
T1分析
将Ht1重复序列缺失T0植物转移至受控环境中。将来自T0植物的花粉运送到轮回亲本植物中以产生种子。T1植物经历了更全面的分子表征，不仅证实在T0植物中观察到的突变是稳定遗传的，而且还证实T1或后代植物不含转化过程期间使用的任何外源DNA元件。首先，对所有辅助基因(包括Cas9、指导RNA、转化选择标记(NPTII)和转化增强基因ODP2和WUS2)进行qPCR，以确保所述基因与产生的突变体等位基因分离。使用Southern测序(Southem by Sequencing，SbS)分析对T1植物进行取样，以进一步证明所述植物不含任何外源DNA。
实例2
经由等位基因取代而编辑HT1基因
靶位点选择
将描述于WO 2015026885、WO 20158026887、WO 2015026883、和WO 2015026886的gRNA/Cas9定点核酸酶系统用于通过用来自PH4GP的Ht1的抗性等位基因替换天然等位基因来编辑Ht1基因(US2010095395；SEQ ID NO：65)。以下靶位点对用于从PH184C品系(US 8,445,763)中去除整个Ht1等位基因(所述等位基因包括预测的启动子、编码序列、和1kb的3′UTR)：HT1-TS6与HT1-TS9、和HT1-TS7与HT1-TS10。每个靶位点的位置和等位基因交换的示意图显示在图3中。靶序列列于表5中。将DNA修复模板与Cas9和指导RNA质粒共同递送。
表5.HT1等位基因取代靶位点序列
Cas9载体构建
参见实例1。
指导RNA载体构建
为了将Cas9核酸酶引导至指定的基因组靶位点(表4)，将玉蜀黍U6聚合酶III启动子(SEQ ID NO：6；参见WO 2015026885、WO 20158026887、WO 2015026883和WO 2015026886)及其同源U6聚合酶III终止序列(TTTTTTTT)用于引导gRNA表达的起始和终止。用于HT1基因编辑的指导RNA可变靶向结构域被鉴定为HT1-CR6、HT1-CR7、HT1-CR9、和HT1-CR10，其分别地对应于基因组靶位点HT1-TS6、HT1-TS7、HT1-TS9、和HT1-TS10。合成含有编码每个可变核苷酸靶向结构域的DNA的寡核苷酸，并如实例1所述将其克隆到gRNA表达盒中。每个指导RNA表达盒由U6聚合酶III玉蜀黍启动子(所述启动子可操作地连接到指导RNA的DNA版本之一(表6))随后是同源U6聚合酶III终止序列组成。指导RNA的DNA版本由各自的核苷酸可变靶向结构域随后是能够与双链断裂诱导性内切核酸酶相互作用的多核苷酸序列组成。
表6.Ht1等位基因交换指导RNA表达盒
修复模板载体构建
CR6/CR9的取代/替换模板含有ZM-HT1-(PH4GP)的抗性等位基因以及侧翼于HT1-TS6的5′和HT1-TS9的3′的同源序列；CR7/CR10的取代模板含有ZM-HT1-(PH4GP)的同一个抗性等位基因以及侧翼于PH184C品系中HT1-TS7的5′和HT1-TS11的3′的同源序列。合成同源臂序列(SEQ ID NO：81-84)，并且然后经由标准无缝吉布森(Gibson)克隆方法用替代性ZM-HT1-(PH4GP)基因组序列进行克隆。
将指导RNA/Cas9内切核酸酶系统DNA递送至玉蜀黍
将含有上述Cas9、指导RNA表达盒和取代模板的质粒与含有转化可选择标记NPTII以及转化增强发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2))和Wuschel(20151030-6752 USPSP)的质粒共同轰击到优良玉蜀黍品系的基因组中。玉蜀黍未成熟胚的转化可以使用本领域已知的任何方法或实例1中所述的方法进行。
筛选T0植物和事件表征
T0植物叶组织DNA提取方案与实例1中描述的相同。为了鉴定交换阳性事件，使用西格玛公司(Sigma)提取物-N-Amp PCR预混合液进行PCR。使用引物对Ht1HR1f1/Ht1HR1r1进行PCR以测定HR1连接，由于预期的经编辑的变体和未修饰的基因组序列的高度同源性而将使用引物对Ht1HR2 f1和Ht1HR2r1的初级PCR与次级等位基因分化qPCR组合以筛选HR2连接。初级PCR的引物以及次级qPCR的引物和探针列于表7中。之前针对CR6/CR9交换所述的相同测定也用于CR7/CR10等位基因交换事件筛选。
表7.用于筛选Ht1等位基因交换变体的引物
鉴定的等位基因交换变体将进一步进行分子表征，并且qPCR将用于筛选T1(BC0)植物的无效分离体，其预期不含转化起始期间使用的质粒DNA。还将进行Southern测序以确认无效分离体植物。表8显示了从等位基因交换实验获得的T0结果的总结。已经在300个筛选的T0植物中鉴定出作为潜在的等位基因交换变体的三个T0植物。
表8.T0等位基因交换筛选结果的总结
实例3
经由等位基因取代而编辑NLB18基因
靶位点选择
鉴定了壁相关激酶(WAK)基因NLB18，并将其验证为北方叶枯病抗性基因(WO2011163590)。NLB18基因在染色体8的长臂上与NLB17聚类。NLB18和NLB17基因相距6.9kb，并且共享高度同源性；因此，鉴定NLB18等位基因交换的独特靶位点是具有挑战性的。鉴定了多个位点并测试了指导RNA。选择只切割NLB18基因区域而不切割NLB17基因区域的指导用于NLB18等位基因交换。
将描述于WO 2015026885、WO 20158026887、WO 2015026883、和WO 2015026886的gRNA/Cas9定点核酸酶系统用于编辑NLB18基因。以下靶位点对用于从PH184C品系中去除整个NLB18等位基因(所述等位基因包括潜在启动子、编码序列和3′UTR)：NLB18-TS1与NLB18-TS4、和NLB18-TS8与NLB18-TS4。NLB18基因座处的每个靶位点的位置和等位基因交换的示意图显示在图5中。靶序列列于表9中。去除的等位基因被来自PH26N的NLB18(US 6,765,132；SEQ ID NO：70)的抗性等位基因取代；将DNA修复模板与Cas9和指导RNA质粒共同递送。
表9.NLB18等位基因取代靶位点序列
| 靶位点名称 | 玉蜀黍基因组靶位点序列 | PAM序列 |
| NLB18-TS1 | SEQ ID NO：30 | TGG |
| NLB18-TS8 | SEQ ID NO：31 | CGG |
| NLB18-TS4 | SEQ ID NO：32 | GGG |
Cas9载体构建
参见实例1
指导RNA载体构建
为了将Cas9核酸酶引导至指定的基因组靶位点(表9)，将玉蜀黍U6聚合酶III启动子(SEQ ID NO：6；参见WO 2015026885、WO 20158026887、WO 2015026883和WO 2015026886)及其同源U6聚合酶III终止序列(TTTTTTTT)用于引导gRNA表达的起始和终止。NLB18基因的指导RNA可变靶向结构域被鉴定为NLB18-CR1、NLB18-CR8和NLB18-CR4，其分别对应于基因组靶位点NLB18-TS1、NLB18-TS8和NLB18-TS4。合成含有编码每个可变核苷酸靶向结构域的DNA的寡核苷酸，并如以上实例1中所述将其克隆到gRNA表达盒中。每个指导RNA表达盒由U6聚合酶III玉蜀黍启动子(所述启动子可操作地连接到指导RNA的DNA版本之一(表10))、以及然后是同源U6聚合酶III终止序列组成。指导RNA的DNA版本由各自的核苷酸可变靶向结构域随后是能够与双链断裂诱导性内切核酸酶相互作用的多核苷酸序列组成。
表10.NLB18等位基因交换指导RNA表达盒
取代模板载体构建
NLB18-CR1/CR4的取代/替换模板含有ZM-NLB18(来自PH26N)的抗性等位基因以及侧翼于PH184C中的NLB18-TS1的5′(SEQ ID NO：67)和NLB18-TS4的3′(SEQ ID NO：68)的同源序列；NLB18-CR1/CR4的取代模板含有ZM-NLB18(来自PH26N)的抗性等位基因以及侧翼于PH184C中的NLB18-TS8的5′(SEQ ID NO：69)和NLB18-TS4的3′(SEQ ID NO：68)的同源序列。SEQ ID NO：66是来自PH184C的NLB18核苷酸序列，包括NLB18-CR8的5′至NLB18-CR4的3′。用含有限制性位点的另外的序列合成同源臂序列；在限制性消化后，使用标准酵母体内组装方案将它们与所希望的NLB18(来自PH26N)的抗性等位基因一起组装到酵母骨架中。在大肠杆菌中回收来自组装反应的汇集的酵母转化体的质粒，并将通过质量控制的质粒用作共同轰击的模板。
将指导RNA/Cas9内切核酸酶系统DNA递送至玉蜀黍
将含有上述Cas9、指导RNA表达盒和取代模板的质粒与含有转化可选择标记NPTII以及转化增强发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2))和Wuschel(20151030-6752 USPSP)的质粒共同轰击到优良玉蜀黍品系的基因组中。玉蜀黍未成熟胚的转化可以使用本领域已知的任何方法或使用实例1中所述的方法进行。
筛选T0植物和事件表征
将与之前描述的实验类似地进行筛选。
实例4
将HT1和NLB18抗性等位基因重新定位到复合性状基因座
靶位点选择
鉴定染色体1上的横跨ZM01：13.7MM至ZM01：16.4MM的玉蜀黍基因组窗口，并将其开发成复合性状基因座(CTL)1(WO 2016040030)。在CTL1上分别选择三个位点TS8、TS10和TS45用于重新定位NLB抗性基因NLB18-PH26N(SEQ ID NO：70)、Ht1-PH4GP(SEQ ID NO：65)和NLB18-PH26N(SEQ ID NO：70)。表11显示了Cas内切核酸酶靶位点(TS8、TS45、TS10)的遗传图谱位置，并且图6显示了位点位置的示意图。
表11.在玉蜀黍染色体1上的复合性状基因座(CTL1)处的Cas内切核酸酶靶位点
Cas9、指导RNA和供体模板载体构建
来自酿脓链球菌M1 GAS(SF370)的Cas9基因是按本领域已知的标准技术进行玉蜀黍密码子优化的，并且引入马铃薯ST-LS1内含子以便消除该基因在大肠杆菌和农杆菌中的表达。为了促进Cas9蛋白质在玉蜀黍细胞中的核定位，将猿猴病毒40(SV40)单分型氨基端核定位信号(SEQ ID NO：5)和根癌农杆菌二分型VirD2 T-DNA边界内切核酸酶羧基端核定位信号(SEQ ID NO：80)分别并入Cas9可读框的氨基和羧基末端处。SEQ ID NO：73是在实例4中使用的含有Cas9的核苷酸序列；SEQ ID NO：73含有cas9外显子1(SP)、ST-LS1内含子2、Cas9外显子2(SP)和VirD2核定位信号。(Cas9的SP版本与之前实例中使用的ST版本关于密码子使用不同；但是，SP版本和由SEQ ID NO：4编码的ST版本是相同的。)将玉蜀黍优化的Cas9基因通过标准分子生物学技术可操作地连接至玉蜀黍泛素启动子。
玉蜀黍U6聚合酶III启动子(SEQ ID NO：6；参见WO 2015026885、WO 20158026887、WO 2015026883和WO 2015026886)用于表达将Cas9核酸酶引导至指定基因组位点的指导RNA。指导RNA编码序列长77bp，并且包含来自5′端玉蜀黍U6聚合酶III终止子上的选择的玉蜀黍基因组靶位点的12-30bp的可变靶向结构域。
为了使Cas9内切核酸酶和指导RNA形成蛋白质/RNA复合物以介导位点特异性DNA双链切割，Cas9内切核酸酶和指导RNA必须同时存在。为了改善它们的共表达和存在，将Cas9内切核酸酶和指导RNA表达盒连接到单个DNA构建体中。合成480-490bp的序列，所述序列含有指导RNA编码序列、来自所选择的玉蜀黍基因组靶位点的12-30bp的可变靶向结构域、以及U6启动子的一部分。然后将所述序列克隆到已经具有cas9盒并且gRNA表达盒的其余部分通过BstBI/HindIII的限制性位点的骨架上。
CTL1-8CR1的重新定位模板含有ZM-NLB18(来自PH26N)(SEQ ID NO：70)的抗性等位基因以及侧翼于PH184C中的CTL1-TS8的5′(SEQ ID NO：85)和CTL1-TS8的3′(SEQ ID NO：86)的同源序列。CTL1-45CR1的重新定位模板含有ZM-NLB18(来自PH26N)(SEQ ID NO：70)的抗性等位基因以及侧翼于PH184C中的CTL1-TS45的5′(SEQ ID NO：87)和CTL1-TS45的3′(SEQ ID NO：88)的同源序列。CTL1-10CR3的重新定位模板含有ZM-HT1(来自PH4GP)(SEQ IDNO：65)的抗性等位基因以及侧翼于PH184C中的CTL1-TS10的5′(SEQ ID NO：89)和CTL1-TS10的3′(SEQ ID NO：90)的同源序列。合成300-500bp同源臂序列，并且然后经由标准无缝吉布森克隆方法用所希望的抗性等位基因序列进行克隆。
将包含玉蜀黍密码子优化的Cas9内切核酸酶表达盒和指导RNA表达盒的质粒与包含含有NLB18-PH26N(图7或图8)或ZM-HT1(PH4GP)(图9)的DNA模板的质粒共同递送，当通过Cas9切割位点时，在通过同源重组(同源定向修复)进行基因整合时将这两种质粒整合到指定位点。
表12中提供了靶向各种玉蜀黍基因组位点的指导RNA-DNA构建体，以及被构建用于通过同源重组(同源定向修复)将抗性基因引入Cas内切核酸酶靶位点的模板DNA构建体。通过实例1中所述的稳定转化方法将这些指导RNA、Cas9DNA构建体和修复模板DNA共同递送到优良玉蜀黍基因组(例如PH184C)中。
表12.在ZM01 CTL1处插入Ht1-PH4GP或NLB18-PH26N的玉蜀黍稳定转化中使用的
指导RNA/Cas9和修复模板DNA
将指导RNA/Cas9内切核酸酶系统DNA递送至玉蜀黍
参见实例1。
筛选T0植物和事件表征
为了鉴定重新定位事件(插入阳性事件)，从T0植物的叶组织中提取基因组DNA，并使用西格玛公司(Sigma)提取物-N-Amp PCR预混合液进行连接PCR。引物位置显示在图7、8和9中，并且引物序列列于表13中。插入事件的连接PCR筛选显示，对于CTL1-TS8实验，有三个具有HR1和HR2连接的T0植物；对于CTL1-TS10实验，有四个具有HR1和HR2连接的T0植物；以及对于CTL1-TS45实验，有四个具有HR1和HR2连接的T0植物。鉴定的T0植物将在下一代中进一步表征。
表13.用于筛选插入(重新定位)事件筛选的引物
筛选T2植物和事件表征
将含有NLB18(BC26N)和HT1(ED4GP)重新定位的T0植物与野生型轮回(recurring)亲本回交以制备BC0(T1)种子。对BC0幼苗进行连接PCR的分子表征以确认遗传给下一代的在CTL1-TS45处的NLB18(BC26)插入和在CTL1-TS10处的HT1(ED4GP)插入。还对在转化过程期间使用的辅助基因进行了qPCR以确保它们与重新定位的植物分离，还通过SbS(Southern测序)证实了无效分离体。将来自自体植物(self-plants)(BC0F2)的种子种植在田间，在叶样品上进行接合性分析，对于具有BC26N插入的CTL1-TS45和具有HT1(ED4GP)插入的CTL1-TS10都观察到1∶2∶1的纯合子∶半合子∶无效插入比率。在用NLB接种后，还使用qRT-PCR分析植物的RNA表达。与无效相比，半合子和纯合子均显示出对感染的抗性，并且NLB18和HT1表达均升高(图10和11)。
在田间试验中测试事件对北方叶枯病病原体(玉米大斑病菌)的功效。首先，用所述病原体(已知Ht1和NLB18基因对其提供抗性)激发事件。如通过qPCR确定的所有阳性事件都对所述病原体具有抗性。结果显示在表14和15中。每个事件的植物数量在“N”列中示出，其表示测试的植物数量。NLNB的抗性评分范围为1至9，其中9是最具抗性的。
表14：TS10 Ht1-ED4GP
表15：TS45 NLB18-BC26N
Claims (78)
1.一种用于获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列的植物细胞的方法，所述方法包括：
a)在植物细胞中在编码Ht1的内源基因组基因座中的至少一个靶位点处引入位点特异性修饰；和
b)获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列的植物细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在植物细胞中引入Ht1取代模板，其中所述Ht1取代模板与内源Ht1编码序列、等位基因、或基因组基因座相比包含至少一个核酸改变，并且其中所述Ht1取代模板并入编码Ht1的内源基因组基因座中。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述位点特异性修饰由选自下组的核酸酶诱导，该组由以下组成：TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、和CRISPR相关核酸酶。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括从具有经修饰的Ht1核苷酸序列的植物细胞生长植物。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述植物展现出对北方叶枯病的增强的抗性。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的Ht1核苷酸序列包含在内源HT1编码序列的启动子中的缺失。
7.如权利要求6所述的方法，其中在至少一个靶位点处的位点特异性修饰双链断裂由Cas9内切核酸酶引入。
8.如权利要求7所述的方法，其中Cas9内切核酸酶由至少一种指导RNA指导。
9.如权利要求8所述的方法，其中使用两种指导RNA，第一指导RNA包含与SEQ ID NO：1[Ht1-TS2]的靶向区域互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：2[Ht1-TS4]互补的可变靶向结构域。
10.如权利要求8所述的方法，其中使用两种指导RNA，第一指导RNA包含与SEQ ID NO：1[Ht1-TS2]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：3[Ht1-ST1-TS1]互补的可变靶向结构域。
11.如权利要求2所述的方法，其中所述Ht1取代模板包含Ht1-PH4GP核苷酸序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述Ht1-PH4GP核苷酸序列包含SEQ ID NO：59或编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：52的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述Ht1-PH4GP核苷酸序列包含SEQ ID NO：65。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述位点特异性修饰由Cas9内切核酸酶诱导。
15.如权利要求14所述的方法，其中Cas9内切核酸酶由至少一种指导RNA指导。
16.如权利要求15所述的方法，其中使用两种指导RNA，第一指导RNA包含与SEQ ID NO：14[Ht1-TS6]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：16[Ht1-TS9]互补的可变靶向结构域。
17.如权利要求15所述的方法，其中使用两种指导RNA，第一指导RNA包含与SEQ ID NO：15[Ht1-TS7]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：17[Ht1-TS10]互补的可变靶向结构域。
18.一种植物细胞，所述植物细胞通过如权利要求1或2所述的方法产生。
19.一种植物，所述植物包含如权利要求18所述的植物细胞。
20.一种种子，所述种子通过如权利要求19所述的植物产生。
21.一种用于获得具有经修饰的NLB18核苷酸序列的植物细胞的方法，所述方法包括：
a)在植物细胞中在编码NLB18的内源基因组基因座中的至少一个靶位点处引入位点特异性修饰；和
b)获得具有经修饰的NLB18核苷酸序列的植物细胞。
22.如权利要求21所述的方法，所述方法进一步包括在植物细胞中引入NLB18取代模板，其中所述NLB18取代模板与编码NLB18的内源基因组基因座相比包含至少一个核酸改变，并且其中所述NLB18取代模板并入编码NLB18的内源基因组基因座中。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述位点特异性修饰由选自下组的核酸酶诱导，该组由以下组成：TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、和CRISPR相关核酸酶。
24.如权利要求21或22所述的方法，其中所述方法进一步包括从具有经修饰的NLB18核苷酸序列的植物细胞生长植物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述植物展现出对北方叶枯病的增强的抗性。
26.如权利要求21所述的方法，其中所述经修饰的NLB18核苷酸序列包含在内源NLB18编码序列的启动子中的修饰。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述NLB18取代模板包含NLB18-PH26N或NLB18-PH99N核苷酸序列。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述NLB18-PH26N核苷酸序列包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：64的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述NLB18-PH26N核苷酸序列包含SEQ ID NO：70。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述NLB18-PH99N核苷酸序列包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：62的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述位点特异性修饰由Cas9内切核酸酶诱导。
32.如权利要求31所述的方法，其中Cas9内切核酸酶由至少一种指导RNA指导。
33.如权利要求32所述的方法，其中使用两种指导RNA，第一指导RNA包含与SEQ ID NO：30[NLB18-TS1]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：32[NLB18-TS4]互补的可变靶向结构域。
34.如权利要求32所述的方法，其中使用两种指导RNA，第一指导RNA包含与SEQ ID NO：31[NLB18-TS8]互补的可变靶向结构域，并且第二指导RNA包含与SEQ ID NO：32[NLB18-TS4]互补的可变靶向结构域。
35.一种植物细胞，所述植物细胞通过如权利要求21或22所述的方法产生。
36.一种植物，所述植物包含如权利要求35所述的植物细胞。
37.一种种子，所述种子通过如权利要求36所述的植物产生。
38.一种用于获得具有基因组基因座的植物细胞的方法，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的至少一种核苷酸序列，其中所述至少一种核苷酸序列与所述基因组基因座是异源的，所述方法包括：
a)在植物细胞中在基因组基因座中的至少一个靶位点处引入位点特异性修饰；
b)引入赋予对北方叶枯病的增强的抗性的至少一种核苷酸序列，其中所述至少一种核苷酸序列侧翼有相应靶位点的300-500bp的5′或3′核苷酸序列；和
b)获得具有基因组基因座的植物细胞，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的至少一种核苷酸序列。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述位点特异性修饰由选自下组的核酸酶诱导，该组由以下组成：TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、和CRISPR相关核酸酶。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述方法进一步包括从具有所述基因组基因座的植物细胞生长植物，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的至少一种核苷酸序列。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述植物展现出对北方叶枯病的增强的抗性。
42.如权利要求38所述的方法，其中所述至少一种核苷酸序列选自下组，该组由以下组成：Ht1-PH4GP、NLB18-PH26N、和NLB18-PH99N。
43.权利要求42所述的方法，其中所述Ht1-PH4GP核苷酸序列包含SEQ ID NO：59或编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：52的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述Ht1-PH4GP核苷酸序列包含SEQ ID NO：65。
45.如权利要求42所述的方法，其中所述NLB18-PH26N核苷酸序列包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：64的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述NLB18-PH26N核苷酸序列包含SEQ ID NO：70。
47.如权利要求42所述的方法，其中所述NLB18-PH99N核苷酸序列包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：62的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列。
48.如权利要求38所述的方法，其中所述基因组基因座是CTL1。
49.如权利要求48所述的方法，其中核苷酸序列NLB18-PH26N靶向CTL1的TS8，核苷酸序列NLB18-PH4GP靶向CTL1的TS10，并且核苷酸序列NLB18-PH26N靶向CTL1的TS45。
50.如权利要求49所述的方法，其中在至少一个靶位点处的位点特异性修饰双链断裂由Cas9内切核酸酶引入。
51.如权利要求50所述的方法，其中Cas9内切核酸酶由至少一种指导RNA指导。
52.如权利要求51所述的方法，其中一种指导RNA包含与SEQ ID NO：36[CTL1-TS8]互补的可变靶向结构域，一种指导RNA包含与SEQ ID NO：37[CTL1-TS10]互补的可变靶向结构域，并且一种指导RNA包含与SEQ ID NO：38[CTL1-TS45]互补的可变靶向结构域。
53.一种植物细胞，所述植物细胞通过如权利要求38所述的方法产生。
54.一种植物，所述植物包含如权利要求53所述的植物细胞。
55.一种种子，所述种子通过如权利要求54所述的植物产生。
56.一种指导多核苷酸，所述指导多核苷酸包含与内源Ht1编码序列中的靶位点互补的可变靶向结构域。
57.如权利要求56所述的指导多核苷酸，其中所述指导多核苷酸包含RNA序列、DNA序列、或RNA-DNA组合序列。
58.如权利要求56所述的指导多核苷酸，其中所述可变靶向结构域与下组的成员互补，该组由以下组成：
a)SEQ ID NO：1；
b)SEQ ID NO：2；和
c)SEQ ID NO：3。
59.一种指导多核苷酸，所述指导多核苷酸包含与内源NLB181编码序列中的靶位点互补的可变靶向结构域。
60.如权利要求59所述的指导多核苷酸，其中所述指导多核苷酸包含RNA序列、DNA序列、或RNA-DNA组合序列。
61.如权利要求59所述的指导多核苷酸，其中所述可变靶向结构域与下组的成员互补，该组由以下组成：
a)SEQ ID NO：30；
b)SEQ ID NO：31；和
c)SEQ ID NO：32。
62.一种指导多核苷酸，所述指导多核苷酸包含与CTL1中的靶位点互补的可变靶向结构域。
63.如权利要求62所述的指导多核苷酸，其中所述指导多核苷酸包含RNA序列、DNA序列、或RNA-DNA组合序列。
64.如权利要求62所述的指导多核苷酸，其中所述可变靶向结构域与下组的成员互补，该组由以下组成：
a)SEQ ID NO：36；
b)SEQ ID NO：37；和
c)SEQ ID NO：38。
65.一种包含基因组基因座的植物，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的至少一种核苷酸序列，其中所述至少一种核苷酸序列与所述基因组基因座是异源的。
66.如权利要求65所述的植物，其中所述植物展现出对北方叶枯病的增强的抗性。
67.如权利要求65所述的植物，其中所述至少一种核苷酸序列选自下组，该组由以下组成：Ht1-PH4GP、NLB18-PH26N、和NLB18-PH99N。
68.如权利要求65所述的植物，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：59或编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：52的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列。
69.如权利要求65所述的植物，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：65。
70.如权利要求65所述的植物，其中所述核苷酸序列包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：64的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列。
71.如权利要求65所述的植物，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：70。
72.如权利要求65所述的植物，其中所述核苷酸序列包含编码多肽的任何核苷酸序列，所述多肽具有是SEQ ID NO：62的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列。
73.如权利要求65所述的植物，其中所述基因组基因座是CTL1。
74.如权利要求73所述的植物，其中核苷酸序列NLB18-PH26N靶向CTL1的TS8，核苷酸序列NLB18-PH4GP靶向CTL1的TS10，并且核苷酸序列NLB18-PH26N靶向CTL1的TS45。
75.一种用于获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列的植物细胞的方法，所述方法包括：
a.在玉蜀黍植物细胞中在Ht1基因组基因座中的一个或多个靶位点处引入位点特异性修饰；
b.引入编码如SEQ ID NO：52、54、56、58、或60中所示的Ht1多肽、赋予对北方叶枯病的增强的抗性的一种或多种核苷酸序列，其中每个核苷酸序列侧翼有相应靶位点的5′或3′核苷酸序列的300-500个连续核苷酸；和
c.获得具有基因组基因座的玉蜀黍植物细胞，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的一种或多种核苷酸序列。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述Ht1基因组基因座包含SEQ ID NO：59或65中所示的核苷酸序列。
77.一种用于获得具有经修饰的NLB18核苷酸序列的植物细胞的方法，所述方法包括：
a.在玉蜀黍植物细胞中在NLB18基因组基因座中的一个或多个靶位点处引入位点特异性修饰；
b.引入编码如SEQ ID NO：62或64中所示的多肽、赋予对北方叶枯病的增强的抗性的一种或多种核苷酸序列，其中每个核苷酸序列侧翼有相应靶位点的5′或3′核苷酸序列的300-500个连续核苷酸；和
c.获得具有基因组基因座的玉蜀黍植物细胞，所述基因组基因座包含赋予对北方叶枯病的增强的抗性的一种或多种核苷酸序列。
78.如权利要求75所述的方法，其中所述NLB18基因组基因座包含SEQ ID NO：66或70中所示的核苷酸序列。
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