CN105829528B

CN105829528B - PRRS病毒变体、欧洲PRRS病毒cDNA克隆及其用途

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Publication number: CN105829528B
Application number: CN201480068965.2A
Authority: CN
Inventors: A·加列; C·凯勒; E·沙赫特; M·赫里尔
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2019-10-22
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: EA039060B1; MX2016007737A; WO2015092058A1; KR102270344B1; JP2017502662A; JP2021104028A; DK3591042T5; AU2014369774A1; JP2020054380A; AU2014369774B2; MX2020010248A; JP7158523B2; HUE061768T2; US20160317642A1; EP3083947B1; CA2930042A1; US10639364B2; US20190151432A1; DK3083947T3; EP3591042A1

Abstract

本发明属于动物健康领域，并且提供方法研究影响猪的病毒疾病猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，以及开发用于预防、治疗和诊断PRRS的疫苗、疗法和诊断。在第一考虑中，本发明涉及一种新的PRRS病毒变体。并且，在第二考虑中，本发明涉及包含感染性基因型I(EU)PRRS病毒克隆的基因组的核酸序列。基于这个，提供具有改善特性的新PRRS疫苗候选物。

Description

PRRS病毒变体、欧洲PRRS病毒cDNA克隆及其用途

技术领域

本发明属于动物健康领域。

在第一考虑中，本发明涉及一种新的PRRS病毒变体。本发明还涉及这样的PRRS病毒在研究影响猪的病毒疾病猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)以及开发用于预防、治疗和诊断PRRS的疫苗、疗法和诊断中的用途。

在第二考虑中，本发明涉及包含感染性基因型I(EU)PRRS病毒克隆的基因组的核酸序列。本发明还涉及感染性基因型I PRRS病毒克隆的核酸序列在制备可用于预防或治疗猪中的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的减毒活病毒以及开发用于预防、治疗或诊断PRRS的疫苗、疗法和诊断中的用途。

合并所述两个考虑，在本发明的第三考虑下提供具有改进特性的更多新PRRS病毒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是病毒动脉炎病毒科(Arteriviridae)的成员，并且与冠状病毒科(Coronaviridae)一起属于病毒网巢病毒目(Nidovirales)。PRRSV是一种有包膜病毒，具有约15千碱基的单链、正义RNA基因组，包含9个开放阅读框(ORF)，即ORF1a、ORF1ab、ORF2a、ORF 2ab以及ORF 3至ORF7。ORF 1a和1ab编码通过病毒蛋白酶nsp1、nsp2和nsp4的自动和反式切割加工为病毒非结构蛋白(nsp)的大多聚蛋白。(Snijder andMeulenberg,1998)。ORF4编码小糖蛋白(GP4)，其是在病毒包膜中发现的紧邻大糖蛋白(GP5)和其他两个小糖蛋白(GP2a和GP3)，其中全部所述糖蛋白对于感染性病毒产生均十分重要。

据认为PRRSV是经济上最重要的猪传染原之一，其引起母猪中的后期繁殖失败和生长猪中的呼吸道疾病。通常，PRRSV感染通过归因于病毒的免疫抑制性质的继发性细菌感染复杂化。而且，PRRSV病毒血症持续数周，然后在淋巴器官中仍然可以检测到病毒几个月，证明宿主免疫应答清除病毒的难度或失败(Allende et al.,2000)。

有两种不同的病毒PRRSV基因型引起相似的临床症状，基因型I(EU)和基因型II(US)，其核苷酸序列水平分歧约40％。北美(US)原型毒株为VR-2332，而欧洲(EU)原型毒株为Lelystad病毒。

但是，在第一考虑中，因为PRRS病毒株具有高生物多样性且在单独农场上迅速进化(Badaoui et al.BMC Veterinary Research 2013,9:58)，需要新的PRRSV分离株用于更好地理解PRRS，以其不同形式再现所述疾病，用于比较测试，以及作为平台用于预防、治疗和诊断PRRS的新疫苗、药物和诊断的开发。

在第二考虑中，越来越多的PRRS病毒的感染性cDNA克隆对于科学界可用，大部分是基于病毒US类型。但是，对于EU类型，仅几个克隆可用。因此，强烈需要新的欧洲(基因型I)PRRS病毒的感染性cDNA克隆，用于更好地理解PRRS，用于比较测试，作为平台用于预防、治疗和诊断PRRS的新疫苗、药物和诊断的开发，其中所述cDNA克隆的使用导致病毒产生的高收率。因此，为了PRRS疫苗研究的实验方便，会需要感染性cDNA克隆，使得能够大量产生基因型I PRRS病毒。

发明内容

上述技术问题的解决通过说明书和权利要求书中表征的实施方案来完成。

因此，本发明在其不同方面和实施方案是根据权利要求书实施的。

1.本发明的第一考虑

根据在本节中详述的第一考虑，本发明是基于一种新PRRS病毒的分离，所述新PRRS病毒令人惊讶地能够在公猪中诱导严重的临床表现。这种PRRS病毒变体的最近分析显示在所述病毒的ORF4基因内的显著缺失。

在一方面，本发明因此涉及猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒，其中所述病毒选自由以下(a)、(b)、c)、d)、(e)和(f)组成的组：

(a)包含ORF4蛋白的PRRS病毒，所述ORF4蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列；

(b)PRRS病毒，优选基因型I PRRS病毒，其包含与野生型基因型I PRRS病毒的ORF4蛋白相比，在位于前两个预测的N-端β–折叠之间的区域中具有9、10、11或更多个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白；

(c)基因型II PRRS病毒，其包含与野生型基因型II PRRS病毒相比，在前两个预测的N-端β–折叠之间的区域中具有5、6、7或更多个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白；

(d)PRRS病毒，优选基因型I PRRS病毒，其包含在氨基酸位置50-71之间具有9、10、11或更多个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列；

(e)基因型II PRRS病毒，其包含在氨基酸位置50-67之间具有5、6、7或更多个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白，其中所述氨基酸位置的编号参考PRRS病毒VR2332的ORF4蛋白的氨基酸序列；

(f)(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的任何组合；

并且，在另一方面，本发明分别涉及选自由以下A)、B)、C)、D)、E)和F)组成的组的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒：

A)PRRS病毒，其基因组包含编码ORF4蛋白的核酸分子，所述ORF4蛋白包含选自SEQID NO:1-12的氨基酸序列；

B)PRRS病毒，优选基因型I PRRS病毒，其基因组包含编码ORF4蛋白的核酸分子，所述ORF4蛋白与野生型基因型I PRRS病毒的ORF4蛋白相比，在位于前两个预测的N-端β–折叠之间的区域中具有9、10、11或更多个氨基酸残基缺失；

C)基因型II PRRS病毒，其基因组包含编码ORF4蛋白的核酸分子，所述ORF4蛋白与野生型基因型II PRRS病毒相比，在前两个预测的N-端β–折叠之间的区域中具有5、6、7或更多个氨基酸残基缺失；

D)PRRS病毒，优选基因型I PRRS病毒，其基因组包含编码ORF4蛋白的核酸分子，所述ORF4蛋白在氨基酸位置50-71之间具有9、10、11或更多个氨基酸残基缺失，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列；

E)基因型II PRRS病毒，其基因组包含编码ORF4蛋白的核酸分子，所述ORF4蛋白在氨基酸位置50-67之间具有5、6、7或更多个氨基酸残基缺失，其中所述氨基酸位置的编号参考PRRS病毒VR2332的ORF4蛋白的氨基酸序列；

F)A)、B)、C)、D)和E)的任何组合；

优选地，此后也称作“本发明的PRRS病毒”的所述PRRS病毒是分离的PRRS病毒。

在本发明的上下文内，特别理解短语“区域中的氨基酸残基”等于短语“位于区域中的氨基酸残”，并且分别地，特别理解术语“氨基酸位置之间的氨基酸残基”与术语“位于氨基酸位置之间的区域中的氨基酸残基”可互换。

进一步理解如在文献中PRRSV的上下文中常用的，术语“基因型I”和“基因型II”等于术语“基因型1”和“基因型2”或者等于术语“1型”和“2型”。

根据第一方面((a))，本发明的PRRS病毒因此为包含ORF4蛋白的PRRS病毒，所述ORF4蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列，其中所述ORF4蛋白优选包含选自SEQ IDNO:13-24的氨基酸序列，并且其中示例性非限制性实施方案中的所述ORF4蛋白包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列。

分别地，根据第一方面((A))，本发明的PRRS病毒为PRRS病毒，其基因组包含编码ORF4蛋白的核酸分子，所述ORF4蛋白包含选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列，其中所述ORF4蛋白优选包含选自SEQ ID NO:13-24的氨基酸序列，并且其中示例性非限制性实施方案中的所述ORF4蛋白包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。

根据第二方面((b))，本发明的PRRS病毒为PRRS病毒，特别是基因型I PRRS病毒，其包含与野生型基因型I PRRS病毒的ORF4蛋白相比，在前两个预测的N-端β–折叠之间的区域中具有9、10、11或更多个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白，其中所述前两个预测的N-端β–折叠优选为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的两个氨基酸序列，或者优选为SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的两个氨基酸序列，并且其中在示例性非限制性实施方案中，所述ORF4蛋白包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

分别地，根据第二方面((B))，本发明的PRRS病毒为PRRS病毒，特别是基因型IPRRS病毒，其基因组包含编码ORF4蛋白的核酸分子，所述ORF4蛋白与野生型基因型I PRRS病毒的ORF4蛋白相比，在前两个预测的N-端β–折叠之间的区域中具有9、10、11或更多个氨基酸残基缺失，其中所述前两个预测的N-端β–折叠优选为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的两个氨基酸序列，或者优选为SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的两个氨基酸序列，并且其中在示例性非限制性实施方案中，所述ORF4蛋白包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

如本文所述，为了比较的目的，野生型基因型I PRRS病毒优选为原型基因型ILelystad病毒。Lelystad病毒的基因组由SEQ ID NO:41的核酸序列编码。

根据第三方面((c))，本发明的PRRS病毒为基因型II PRRS病毒，其包含与野生型基因型II PRRS病毒相比，在前两个预测的N-端β–折叠之间的区域中具有5、6、7或更多个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白，其中所述前两个预测的N-端β–折叠优选为SEQ ID NO:27和SEQID NO:28所示的两个氨基酸序列，并且其中示例性非限制性实例中的所述ORF4蛋白包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。

分别地，根据第三方面((C))，本发明的PRRS病毒为基因型II PRRS病毒，其基因组包含编码ORF4蛋白的核酸分子，所述ORF4蛋白与野生型基因型II PRRS病毒相比，在前两个预测的N-端β–折叠之间的区域中具有5、6、7或更多个氨基酸残基缺失，其中所述前两个预测的N-端β–折叠优选为SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的两个氨基酸序列，并且其中示例性非限制性实例中的所述ORF4蛋白包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。

如本文提到的，为了比较的目的，野生型基因型II PRRS病毒优选为原型基因型II病毒VR2332。病毒VR2332的基因组由SEQ ID NO:42的核酸序列编码。

在本发明的上下文中，氨基酸残基的缺失优选为连续氨基酸残基的缺失。因此，例如，如本文所述，9、10、11或更多个氨基酸残基的缺失优选为9、10、11或更多个连续氨基酸残基的缺失，并且分别地，如本文所述，5、6、7或更多个氨基酸残基的缺失优选为5、6、7或更多个连续氨基酸残基的缺失。

根据第四方面((d))，本发明的PRRS病毒为PRRS病毒，优选基因型I PRRS病毒，其包含ORF4蛋白，所述ORF4蛋白在氨基酸位置50-71之间具有9、10、11或更多个氨基酸残基缺失，或者优选11、12、13、14、15、16或17个氨基酸残基缺失，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列，并且其中在非限制性示例性实施方案中，在氨基酸位置50-71之间具有11个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白是包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的ORF4蛋白。

分别地，根据第四方面((D))，本发明的PRRS病毒为PRRS病毒，优选基因型I PRRS病毒，其基因组包含编码ORF4蛋白的核酸分子，所述ORF4蛋白在氨基酸位置50-71之间具有9、10、11或更多个氨基酸残基缺失，或者优选11、12、13、14、15、16或17个氨基酸残基缺失，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列，并且其中在非限制性示例性实施方案中，在氨基酸位置50-71之间具有11个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白是包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的ORF4蛋白。

如本文所述，涉及Lelystad病毒的氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的全长ORF4蛋白的氨基酸序列。因此，如这个上下文中提到的氨基位置的编号参考具有183个氨基酸残基的Lelystad蛋白的ORF4蛋白，包括在(N-端)氨基酸位置1处的甲硫氨酸残基。

因此，如在本发明的上下文中所用，短语“其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列”涉及如SEQ ID NO:43所示的ORF4蛋白的序列。

根据第五方面((e))，本发明的PRRS病毒为基因型II PRRS病毒，其包含ORF4蛋白，所述ORF4蛋白在氨基酸位置50-67之间具有5、6、7或更多个氨基酸残基缺失，或者优选8、9、10、11或更多个氨基酸残基缺失，其中所述氨基酸位置的编号参考PRRS病毒VR2332的ORF4蛋白的氨基酸序列，并且其中在非限制性示例性实施方案中，在氨基酸位置50-67之间具有7个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白是包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的ORF4蛋白。

分别地，根据第五方面((E))，本发明的PRRS病毒为基因型II PRRS病毒，其基因组包含编码ORF4蛋白的核酸分子，所述ORF4蛋白在氨基酸位置50-67之间具有5、6、7或更多个氨基酸残基缺失，或者优选8、9、10、11或更多个氨基酸残基缺失，其中所述氨基酸位置的编号参考PRRS病毒VR2332的ORF4蛋白的氨基酸序列，并且其中在非限制性示例性实施方案中，在氨基酸位置50-67之间具有7个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白是包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的ORF4蛋白。

如本文所述，涉及PRRS病毒VR2332的氨基酸位置的编号参考PRRS病毒VR2332的全长ORF4蛋白的氨基酸序列。因此，如这个上下文中提到的氨基位置的编号参考具有178个氨基酸残基的VR2332病毒的ORF4蛋白，包括在(N-端)氨基酸位置1处的甲硫氨酸残基。

因此，如在本发明的上下文中所用，短语“其中所述氨基酸位置的编号参考具有178个氨基酸残基的PRRS病毒VR2332的ORF4蛋白的氨基酸序列”涉及如SEQ ID NO:44所示的ORF4蛋白的序列。

根据第六方面((f))，如本文所述，本发明的PRRS病毒是(a)、(b)、(c)、(d)和(e)方面的任何组合，优选(a)、(b)和(d)方面的任何组合或者(a)、(c)和(e)方面的任何组合。在这个上下文内，特别理解短语“(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的任何组合”以及“(a)、(b)、(c)、(d)和(e)方面的任何组合”分别表示如本文所述，具有(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的任何PRRS病毒特征的组合的PRRS病毒，其中特别优选(a)、(b)和/或(c)方面的任何PRRS病毒特征的组合或者(a)、(c)和(e)方面的任何PRRS病毒特征的组合。

分别地，根据第六方面((F))，如本文所述，本发明的PRRS病毒是(A)、(B)、(C)、(D)和(E)方面的任何组合，优选(A)、(B)和(D)方面的任何组合或者(A)、(C)和(E)方面的任何组合。在这个上下文内，特别理解短语“(A)、(B)、(C)、(D)和(E)的任何组合”以及“(A)、(B)、(C)、(D)和(E)方面的任何组合”分别表示如本文所述，具有(A)、(B)、(C)、(D)和(E)的任何PRRS病毒特征的组合的PRRS病毒，其中特别优选(A)、(B)和/或(D)方面的任何PRRS病毒特征的组合或者(A)、(C)和(E)方面的任何PRRS病毒特征的组合。

本发明的PRRS病毒优选包含

-ORF4蛋白，其包含或由与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少84.5％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，并且特别优选至少99％序列相同性的氨基酸序列组成，或者

-ORF4蛋白，其包含或由与SEQ ID NO:37的核酸序列具有至少83.5％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，并且特别优选至少99％序列相同性的核酸序列所编码的氨基酸序列组成，其中所述PRRS病毒优选为基因型I PRRS病毒，

并且其中所述PRRS病毒特别是基因型I PRRS病毒。

如本文所用，特别理解术语“与SEQ ID NO:36的氨基酸序列的序列相同性”分别等于术语“在SEQ ID NO:36的长度与SEQ ID NO:36的氨基酸序列的序列相同性”或术语“在SEQ ID NO:36的整个长度与SEQ ID NO:36的氨基酸序列的序列相同性”。

进一步地，如本文所用，特别理解术语“与SEQ ID NO:37的核酸序列的序列相同性”分别等于术语“在SEQ ID NO:37的长度与SEQ ID NO:37的核酸序列的序列相同性”或术语“在SEQ ID NO:37的整个长度与SEQ ID NO:37的核酸序列的序列相同性”。

在本发明的第一考虑的上下文中，序列相同性理解为是基于渐进比对(Feng,D.F.and Doolittle,R.F.(1987).Progressive sequence alignment as a prerequisiteto correct phylogenetic trees.J.Mol.Evol.,25(4):351–360，援引加入本文)。这种方法是基于将序列组合入比对，其可以转而与其他序列或比对组合以形成较大的比对。重复该过程直至所有的输入序列均已加入单一的多重比对。为了本发明的目的，用软件CLCMAIN WORKBENCH 4.1.1(CLC BIO)确定百分比序列相同性。

在一示例性和非限制性实施方案中，本发明的PRRS病毒为基因型I PRRS，其基因组包含与SEQ ID NO:38的核酸序列具有至少84.5％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，并且最优选至少99％序列相同性的核酸分子所编码的RNA分子。

如本文所用，特别理解术语“与SEQ ID NO:38的核酸序列的序列相同性”分别等于术语“在SEQ ID NO:38的长度与SEQ ID NO:38的核酸序列的序列相同性”或术语“在SEQ IDNO:38的整个长度与SEQ ID NO:38的核酸序列的序列相同性”。

根据另一优选方面，本发明的PRRS能够诱导妊娠母猪中的繁殖症状和/或猪仔中的呼吸症状。

根据另一优选方面，本发明的PRRS病毒能够在公猪中诱导呼吸症状。

因此，本发明的PRRS病毒优选为感染性PRRS病毒。

根据本发明，术语“感染性PRRS病毒”特别理解为感染猪，引起相关疾病猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的PRRS病毒。

所述通过本发明的PRRS病毒感染猪特别包括所述病毒附着至宿主细胞，所述病毒进入细胞，病毒粒子的解体，病毒基因组的复制和转录，病毒蛋白的表达以及新感染性病毒颗粒的组装和释放。

在另一方面，本发明进一步涉及PRRS病毒，优选本发明的PRRS病毒，将其遗传修饰以便其中包含外源RNA，其中将所述外源RNA插入所述病毒的ORF4基因，并且其中所述外源RNA优选插入

a)编码选自SEQ ID NO:1-12或13-24的氨基酸序列的所述病毒ORF4基因的区域；

b)与野生型基因型I PRRS病毒的ORF4蛋白相比，编码位于前两个预测的N-端β–折叠之间的区域的所述病毒ORF4基因的区域；

c)与野生型基因型II PRRS病毒的ORF4蛋白相比，编码位于前两个预测的N-端β–折叠之间的区域的所述病毒ORF4基因的区域；

d)编码位于氨基酸位置50-71之间的区域的所述病毒ORF4基因的区域，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列；或者

e)编码位于氨基酸位置50-67之间的区域的所述病毒ORF4基因的区域，其中所述氨基酸位置的编号参考PRRS病毒VR2332的ORF4蛋白的氨基酸序列。

如本文所用，术语“外源RNA”或“外源核酸序列”特别指从外部来源，如从重组序列引入PRRS病毒基因组的核酸序列。这样的外部来源的实例包含PRRSV衍生的序列以及非PRRSV衍生的序列。更特别地，外源核酸序列的引入导致分别具有非天然存在的部分的基因组或基因。如本文所用，术语“外源RNA”因此特别指在PRRS病毒基因组中未天然发现的核苷酸序列。这样的非天然存在的部分或非天然发现的序列分别还可以是将一个天然存在的核苷酸序列插入另一个天然存在的核苷酸序列的结果。

如本文所述，外源RNA特别编码选自以下的表达产物：感兴趣的表位、生物反应调节剂、生长因子、识别序列和融合蛋白，并且其中所述感兴趣的表位优选来自抗原或者兽医病原体或毒素的感兴趣的表位。

在一优选实施方案中，所述感兴趣的表位是PRRS病毒的ORF5基因编码的肽，其中所述PRRS病毒的ORF5基因编码的肽特别包含或由SEQ ID NO:39所示序列的至少4个连续氨基酸残基组成，或者更特别地，所述PRRS病毒的ORF5基因编码的肽包含或由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成。

在另一优选实施方案中，所述感兴趣的表位是不同PRRS病毒株的ORF4蛋白(GP4)的胞外域，其中所述不同PRRS病毒株的GP4的胞外域特别包含或由SEQ ID NO:40所示序列的至少4个连续氨基酸残基组成，或者更特别地，所述不同PRRS病毒株的GP4的胞外域包含或由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成。

本发明进一步提供如本文所述，遗传修饰以便其中包含外源RNA的PRRS病毒用作药物。

本发明还提供本文所述的PRRS病毒用作攻击病毒，特别是如果所述PRRS病毒在向动物给药时本身诱导免疫接种效应。

本发明额外地提供本发明的PRRS病毒作为攻击病毒的用途，特别是如果所述PRRS病毒在向动物给药时不诱导免疫接种效应。

如本文提到的，术语“动物”特别涉及猪，更特别涉及小猪，优选家猪。

优选地，PRRS病毒分别通过鼻内、肌肉内、口服或子宫内途径待向动物给药或向动物给药。

而且，本发明提供本文所述的PRRS病毒作为检测标记的用途，优选用于感染和免疫接种的动物之间的区分(DIVA)。

根据另一方面，本发明还涉及编码本文所述的PRRS病毒的DNA分子，其中所述DNA分子优选为分离的DNA分子和/或其中所述DNA分子优选包含与SEQ ID NO:38的核酸序列具有至少84.5％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，并且特别优选至少99％序列相同性的核酸分子。

本发明还提供包含本文所述的DNA分子的DNA构建体，其中所述DNA构建体特别是DNA载体如质粒。可以插入本发明的DNA分子的DNA载体或质粒会由本领域技术人员识别。如本文所述，DNA构建体优选为分离的DNA构建体。如本文所用，术语“包含DNA分子”特别理解为等于术语“包含DNA分子的序列”。

此外，本发明提供本文所述DNA构建体的RNA转录物，其中所述RNA转录物优选为分离的RNA转录物。

本发明还提供用本文所述DNA构建体转染的细胞，其中所述细胞优选为分离的细胞。

此外，本发明提供用本文提到的RNA转录物转染的细胞，其中所述细胞优选为分离的细胞。

如本文提到的，术语“细胞(cells)”或“细胞(cell)”优选涉及哺乳动物细胞，特别是猪或猴细胞，如MA-104细胞或MARC-145细胞或Vero细胞，更优选应当理解术语“细胞(cells)”或“细胞(cell)”涉及PRRS病毒的宿主细胞，即猪巨噬细胞。因此，如本文提到的，细胞优选选自猪细胞、猴细胞、MA-104细胞、MARC-145细胞、Vero细胞和猪巨噬细胞。

在另一方面，本发明提供一种制备本文所述PRRS病毒的方法，其中所述方法包括以下步骤：用本文所述DNA构建体转染细胞以及任选地从细胞和/或培养基收获病毒。

在另一方面，本发明提供一种制备本文所述PRRS病毒的方法，其中所述方法包括以下步骤：用本文所述RNA转录物转染宿主细胞以及任选地从细胞和/或培养基收获病毒。

本文所述核酸/DNA分子的制备在本领域的技术内，并且可以根据Sambrook etal.,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,et al.,2003,Current Protocols InMolecular Biology,Greene Publishing Associates&Wiley Interscience,NY；Innis etal.(eds),1995,PCR Strategies,Academic Press,Inc.,San Diego；和Erlich(ed),1994,PCR Technology,Oxford University Press,New York等中描述的重组技术进行，全部援引加入本文。

2.本发明的第二考虑

根据在本节中详述的第二考虑，在一方面，本发明提供一种核酸分子，其编码基因型I PRRS病毒并且能够在转染入细胞时产生活病毒，其中所述分子包含：

-第一核酸序列，其与SEQ ID NO:45的核酸序列具有至少95％序列相同性，

-第二核酸序列，其在所述第一核酸序列的5′端旁侧，并且与SEQ ID NO:46的核酸序列具有至少95％序列相同性，

-第三核酸序列，其在所述第一核酸序列的3′端旁侧，并且与SEQ ID NO:47的核酸序列具有至少95％序列相同性，以及

-多腺嘌呤(polyadenine)核苷酸序列，其在所述第三核酸序列的3′端旁侧。

优选地，

-所述第一核酸序列与SEQ ID NO:45的核酸序列具有至少96％，优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，并且特别优选100％序列相同性；和/或

-所述第二核酸序列与SEQ ID NO:46的核酸序列具有至少96％，优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，并且特别优选100％序列相同性；和/或

-所述第三核酸序列与SEQ ID NO:47的核酸序列具有至少96％，优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，并且特别优选100％序列相同性；和/或

-所述多腺嘌呤核苷酸序列由n个腺嘌呤核苷酸组成，其中n为1-51的任何整数，并且其中n优选为12、13或14。

本发明的核酸分子优选为DNA分子。优选地，所述核酸分子为分离的核酸分子。

在本发明的上下文内，特别理解术语“多腺嘌呤核苷酸序列”分别等于术语“多腺苷酸序列”或“poly(A)尾”。如本文所述，术语“腺嘌呤核苷酸”特别理解为等于术语“脱氧腺苷酸”。

如本文所述的短语“在5′端旁侧的核苷酸序列”特别等于短语“与5′端共价连接的核苷酸序列”，或者分别地，等于短语“核苷酸序列，其中其3'末端核苷酸与5′末端核苷酸共价连接”，并且其中特别理解所述两个末端核苷酸在连接至戊糖的5'碳的磷酸基团和相邻戊糖的3'碳原子之间共价连接。

如本文所述的短语“在3′端旁侧的核苷酸序列”特别等于短语“与3′端共价连接的核苷酸序列”，或者分别地，等于短语“核苷酸序列，其中其5'末端核苷酸与3′末端核苷酸共价连接”，并且其中特别理解所述两个末端核苷酸在戊糖的3'碳原子和连接至相邻戊糖的5'碳的磷酸基团之间共价连接。

进一步特别理解如本文所用，短语“与核酸序列具有100％序列相同性”分别等于短语“与核酸序列相同”或“由核酸序列序列组成”。

在一特别优选的方面，本发明的核酸分子包含与SEQ ID NO:48的核酸序列具有至少99％序列相同性的核酸序列，或者其中所述核酸分子包含或由与SEQ ID NO:48的核酸序列具有至少99％序列相同性的核酸序列的RNA拷贝组成。

根据本发明术语“活病毒”特别理解为具有感染适当个体的能力(与灭活(杀死)的病毒相反)和/或其感染性与天然病毒相似或相同的PRRS病毒。特别地，活病毒可以感染其天然宿主细胞。

所述通过本发明的核酸分子产生的PRRS病毒感染宿主细胞特别包括所述病毒附着至宿主细胞，所述病毒进入细胞，病毒粒子的解体，病毒基因组的复制和转录，病毒蛋白的表达以及新感染性病毒颗粒的组装和释放。所述通过本发明的核酸分子产生的PRRS病毒感染宿主细胞进一步优选包括cDNA序列的转录，特别是在BHK细胞中，以便收获功能性RNA分子，用所述RNA分子转染培养细胞，优选猪细胞、猴细胞、MA-104细胞、MARC-145细胞、Vero细胞和猪巨噬细胞，通过所述培养细胞中的病毒复制产生活病毒粒子，分离这类病毒粒子以及感染宿主细胞。

特别地，本发明的核酸分子优选编码减毒的基因型I PRRS病毒，或者分别地，本发明的核酸分子能够在转染入细胞时产生活减毒病毒。

更特别地，本发明的核酸分子编码不能在猪中诱导严重的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的基因型I PRRS病毒，或者分别地，本发明的核酸分子能够在转染入细胞时产生活病毒，其中所述活病毒不能在猪中诱导如毒性野外PRRS病毒所引起的严重的、野生型病毒样猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。

在一特别实施方案中，本发明的核酸分子编码基因型I PRRS病毒，其能够在MA104细胞感染后24小时内达到至少5x10⁵-1x10⁶组织培养感染剂量50(TCID₅₀)/毫升(ml)的滴度，其中所述MA104细胞优选用0.001-0.1MOI(感染复数)的所述病毒感染。

特别地，本发明的核酸分子编码基因型I PRRS病毒，其能够在MA104细胞感染后48小时内达到5x10⁶-1x10⁷或更多的组织培养感染剂量50(TCID₅₀)/毫升(ml)的滴度，其中所述MA104细胞优选用0.001-0.1MOI(感染复数)的所述病毒感染。

因此，本发明的核酸分子优选编码基因型I PRRS病毒，其能够

-在24小时内达到至少5x10⁵-1x10⁶组织培养感染剂量50(TCID₅₀)/毫升(ml)的滴度和/或

-在MA104细胞感染后48小时内达到至少5x10⁶-1x10⁷组织培养感染剂量50(TCID₅₀)/毫升(ml)的滴度在0.001-0.1的MOI(感染复数)，特别是在0.001或0.01或0.1的MOI。

在如本文所述的PRRS病毒的上下文中，应当理解术语“基因型I”等于如文献中在PRRSV的上下文中常用的术语“基因型1”或“1型”或“欧洲(EU)”。

在另一优选实施方案中，本发明的核酸分子包含与SEQ ID NO:48所示的核酸序列具有至少99.1％或99.2％，优选至少99.3％或99.4％，更优选至少99.5％或99.6％，更优选至少99.8％或99.9％，并且特别优选至少99.95％序列相同性核酸序列。

本发明的第二考虑的上下文中的序列相同性理解为基于核苷酸序列之间成对确定的相似性。两个序列之间百分比相同性的确定优选利用数学算法完成，特别是公知的Smith-Waterman算法(Smith and Waterman,M.S.(1981)J Mol Biol,147(1):195-197)。为了本发明的目的，利用Smith-Waterman同源性搜索算法利用25的空位开放罚分和5的空位延伸罚分确定核苷酸序列的百分比序列相同性。Smith-Waterman同源性搜索算法在Smithand Waterman(1981)Adv.Appl.Math 2:482-489中教导，其援引加入本文。这样的序列相同性的确定可以利用例如来自TimeLogic Version G的DeCypher Hardware Accelerator进行，或者用软件CLC MAIN WORKBENCH 4.1.1(CLC BIO)确定序列相同性。

如本文所用，特别理解术语“与SEQ ID NO:Y的核酸序列具有至少X％序列相同性”(或者，术语“与SEQ ID NO:Y所示的核酸序列具有至少X％序列相同性”)分别等于术语“在SEQ ID NO:Y的长度与SEQ ID NO:Y的核酸序列具有至少X％序列相同性”或术语“在SEQ IDNO:Y的整个长度与SEQ ID NO:Y的核酸序列具有至少X％序列相同性”。在这个上下文中，“X”是95-100的任何数字，特别是选自95-99的任何整数，从而“X％序列相同性”代表本文中提到的任何百分比序列相同性。分别地，这个上下文中的“Y”是选自1-6的任何整数，从而“SEQ ID NO:Y”代表本文中提到的任何SEQ ID NO。

在一特别优选的实施方案中，本发明的核酸分子包含SEQ ID NO:48的核酸序列。

在另一优选实施方案中，本发明的核酸分子编码不能在猪中诱导猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的基因型I PRRS病毒，或者分别地，本发明的核酸分子能够在转染入细胞时产生活病毒，其中所述感染性病毒不能在猪中诱导猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。

如本文所用，术语“不能诱导猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)”特别地分别指与野生型PRRS病毒相比时，PRRS的临床表现或与PRRSV感染相关的表现减少，如猪仔中的肺部病变、妊娠母猪中的繁殖失败和/或延长的PRRSV病毒血症。在一方面，不能在猪中诱导PRRS的基因型I PRRS病毒因此是在向猪给药时，与向猪给药的野生型PRRS病毒相比表现出一种或多种减少的临床表现的病毒。如本文提到的，术语“野生型PRRS病毒”特别涉及野生型基因型IPRRS病毒。

本发明还提供包含本发明的核酸分子的DNA构建体，其中所述DNA构建体特别是DNA载体如质粒。可以插入本发明的核苷酸分子的DNA载体或质粒会由本领域技术人员识别。如本文所述，DNA构建体优选为分离的DNA构建体。如本文所用，术语“包含核酸分子”或“包含DNA分子”分别特别理解为分别等于术语“包含核酸分子的序列”或“包含DNA分子的序列”。

因此，本发明还提供通过上述细胞制备的基因型I PRRS病毒，其中所述基因型IPRRS病毒优选为分离的基因型I PRRS。

本发明还提供基因型I PRRS病毒，其基因组包含本发明的核酸分子或者其基因组包含本发明的核酸分子编码的RNA分子，其中所述基因型I PRRS病毒优选为分离的基因型IPRRS病毒。

在另一方面，本发明提供一种制备基因型I PRRS病毒的方法，所述方法包括用本文所述的DNA构建体转染细胞。

此外，本发明提供一种制备基因型I PRRS病毒的方法，所述方法包括用本文提到的RNA转录物转染细胞。

在另一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含悬浮于合适量的药学可接受的稀释剂或赋形剂中的本发明的核酸分子。

本文所述核酸分子的制备在本领域的技术内，并且可以根据Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,et al.,2003,Current Protocols InMolecular Biology,Greene Publishing Associates&Wiley Interscience,NY；Innis etal.(eds),1995,PCR Strategies,Academic Press,Inc.,San Diego；和Erlich(ed),1994,PCR Technology,Oxford University Press,New York等中描述的重组技术进行，全部援引加入本文。

在另一方面，本发明还涉及本发明的核酸分子或本文所述的DNA构建体在制备减毒的基因型I PRRS病毒中的用途，其中将一个或多个突变引入所述核酸分子或所述DNA构建体。

本发明还提供一种制备减毒的基因型I PRRS病毒的方法，所述方法包括将一个或多个突变引入本发明的核酸分子或本文所述的DNA构建体的步骤。

优选地，将本文所述的一个或多个突变引入与SEQ ID NO:45的核酸序列具有至少95％序列相同性的第一核酸序列。

如本文所述，术语“减毒的PRRS病毒”特别涉及在体外和/或体内，更特别是在易感细胞系和/或宿主中减毒的PRRS病毒。

如本文所用，术语“宿主”特别涉及可用PRRS病毒感染的动物，特别是猪，更特别是小猪，如家猪。

如本文提到的，“减毒”特别涉及病原体，特别是野生型PRRS病毒的毒力减少，其中“毒力”理解为致病性的程度，并且其中“致病性”涉及病原体在宿主或宿主的后代中诱导临床表现的能力，如繁殖失败。

如本文所用，术语“野生型PRRS病毒”或“野生型PRRSV”分别特别涉及感染性致病PRRS病毒，其特别能够在猪中引起PRRS。在一特别优选的实施方案中，术语“野生型PRRS病毒”涉及PRRS病毒，其基因组包含RNA序列或由RNA多核苷酸组成，其中所述RNA序列或RNA多核苷酸是SEQ ID NO:41的RNA拷贝(对应于Lelystad病毒完整基因组)。

优选地，如本文所述，所述一个或多个突变包含或由一个或多个点突变和/或一个或多个基因组缺失和/或一个或多个插入组成。

而且，本发明提供减毒的基因型I PRRS，其基因组包含本发明的核酸分子编码的RNA分子，但是其中与SEQ ID NO:45的核酸序列具有至少95％序列相同性的所述第一核酸序列包含一个或多个突变，所述一个或多个突变减弱所编码的PRRS病毒和/或使得所编码的PRRS不能抑制所述病毒感染的细胞的I型干扰素产生和分泌，并且其中所述减毒的基因型I PRRS病毒优选为分离的减毒的基因型I PRRS病毒。

本发明还提供本文所述减毒的基因型I PRRS病毒在制备药物，特别是疫苗或疫苗组合物中的用途，用于防止动物出现PRRSV感染的临床表现，如通过减少PRRSV感染的临床表现，例如减少PRRSV病毒血症的持续时间。

如本文所用，术语“预防”或“减少”分别表示但不限于一种方法，所述方法包括向动物给药PRRSV抗原，即本文所述减毒的基因型I PRRS，其中所述PRRSV抗原在给药至所述动物时引发或能够引发所述动物中针对PRRSV的免疫应答。总的来说，这样的治疗分别导致PRRS的临床表现或与PRRSV感染相关的表现减少。更特别地，如本文所用，术语“预防”一般表示一种预防方法，其中在诱导或发生疾病过程(PRRS)之前将动物暴露于本发明的免疫原性组合物。

在本文中，“减少PRRSV感染的临床表现”表示但不限于与野生型PRRS病毒感染相比，减少组中感染个体的数量，减少或消除表现出感染的临床表现的个体数量，或者减少个体中存在的任何临床表现的严重程度。例如，其应当指病原体负荷的任何减少，病原体脱落，病原体传播减少或PRRSV感染的任何临床表现典型的减少，特别是繁殖失败和/或诱导肺部病变的减少。优选地，与未接受所述组合物并可能感染的个体相比，在接受本发明的减毒的基因型I PRRS病毒的个体中这些临床表现减少至少10％。更优选地，在接受本发明的组合物的个体中临床表现减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，并且最优选100％。

如本文提到的，术语“个体”特别涉及动物。

术语“减少PRRSV病毒血症的持续时间”表示但不限于与未接受所述组合物并被野生型PRRSV感染的个体相比，PRRS病毒进入动物血流的持续时间减少至少一天。

术语“病毒血症”指如通过例如检测血清中的PRRSV RNA拷贝反映的，在感染动物的血液中存在PRRSV。

而且，本发明涉及一种疫苗组合物，其包含悬浮于合适量的药学可接受的稀释剂或赋形剂中的本文所述的减毒的基因型I PRRS病毒。

如本文提到的，所述一种或多种药学可接受的载体或赋形剂优选选自溶剂、分散介质、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。

在一优选方面，本发明的免疫原性组合物包含10¹-10⁷个本文所述减毒的基因型IPRRS病毒的病毒颗粒/剂量的量，优选10³-10⁶个颗粒/剂量，更优选10⁴-10⁶个颗粒/剂量。

在另一优选方面，本发明的免疫原性组合物包含本发明的PRRS病毒的量等于至少约10³TCID₅₀/mL/剂量的病毒滴度，优选10³-10⁵TCID₅₀/mL/剂量。

如本文所用，术语“疫苗组合物”特别指在已暴露于所述组合物的动物中会引发保护性免疫应答的组合物。免疫应答可以包括诱导抗体和/或诱导T-细胞应答。

通常，“免疫应答”包括但不限于一种或多种以下效应：产生或激活抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞，特异性地针对感兴趣的组合物或疫苗中包括的抗原或多种抗原。优选地，宿主会表现出治疗性或保护性免疫(记忆)应答，从而对新感染的抗性会增强和/或疾病的临床严重程度降低。这样的保护会通过以下证实：与病原体感染相关的一种或多种临床表现的数量或严重程度减少，或者缺少与病原体感染相关的一种或多种临床表现，病毒血症的发生延迟，病毒持久性减少，总病毒负荷减少和/或病毒排出减少。

因此，“免疫应答”特别表示但不限于发展对感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答的子集。

此外，本发明涉及本发明的疫苗组合物用于一种防止动物出现PRRSV感染的临床表现的方法，如通过减少PRRSV感染的临床表现，例如减少PRRSV病毒血症的持续时间。

此外，本发明提供一种防止动物出现PRRSV感染的临床表现的方法，如通过减少PRRSV感染的临床表现，例如减少PRRSV病毒血症的持续时间，其中所述方法包括向有此需要的动物给药本发明的疫苗。

根据本发明的第二考虑的实施方案

本文还描述以下条款：

1.一种核酸分子，其编码基因型I PRRS病毒且能够在转染入细胞时产生活病毒，其中所述分子包含

多腺嘌呤核苷酸序列，其在所述第三核酸序列的3′端旁侧。

2.条款1的核酸分子，其中

3.条款1或2的核酸分子，其中所述病毒是减毒的和/或其中所述病毒能够在猪中感染猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒之后诱导针对疾病的呼吸和/或繁殖表现的保护性免疫应答。

4.条款1-3中任一项的核酸分子，其中所述病毒能够在MA104细胞感染后24小时内达到至少5x10⁵-1x10⁶组织培养感染剂量50(TCID₅₀)/毫升(ml)的滴度，优选在0.001-0.1的MOI(感染复数)。

5.条款1-4中任一项的核酸分子，其中所述病毒能够在MA104细胞感染后48小时内达到至少5x10⁶-1x10⁷组织培养感染剂量50(TCID₅₀)/毫升(ml)的滴度，优选在0.001-0.1的MOI(感染复数)。

6.条款1-5中任一项的核酸分子，其中所述分子包含与SEQ ID NO:48的核酸序列具有至少91％或92％，优选至少93％或94％，更优选至少95％或96％，更优选至少98％或99％，并且特别优选至少99％序列相同性的核酸序列。

7.条款1-6中任一项的核酸分子，其中所述分子包含与SEQ ID NO:48的核酸序列具有至少99.1％或99.2％，优选至少99.3％或99.4％，更优选至少99.5％或99.6％，更优选至少99.8％或99.9％，并且特别优选至少99.95％序列相同性的核酸序列。

8.条款1-7中任一项的核酸分子，其中所述分子包含SEQ ID NO:48的核酸序列。

9.条款1-8中任一项的核酸分子，其中所述病毒不能在猪中诱导如毒性野外PRRS病毒所引起的严重的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。

10.条款1-9中任一项的核酸分子，其中所述分子为DNA分子。

11.包含条款10的DNA分子的DNA构建体。

12.条款11的DNA构建体的RNA转录物。

13.用条款11的DNA构建体转染的细胞。

14.用条款12的RNA转录物转染的细胞。

15.通过条款13的细胞制备的基因型I PRRS病毒。

16.通过条款14的细胞制备的基因型I PRRS病毒。

17.基因型I PRRS病毒，其基因组包含条款1-9中任一项的核酸分子或者其基因组包含条款1-10中任一项的核酸分子编码的RNA分子。

18.一种用于制备基因型I PRRS病毒的方法，所述方法包括用条款11的DNA构建体转染细胞。

19.一种用于制备基因型I PRRS病毒的方法，所述方法包括用条款12的RNA转录物转染细胞。

20.一种组合物，其包含悬浮于合适量的药学可接受的稀释剂或赋形剂中的条款1-10中任一项的核酸分子。

21.条款1-10中任一项的核酸分子或条款11的DNA构建体在制备减毒的基因型IPRRS病毒中的用途，其中将一个或多个突变引入所述核酸分子或所述DNA构建体。

22.制备减毒的基因型I PRRS病毒的方法，所述方法包括将一个或多个突变引入条款1-10中任一项的核酸分子或条款11的DNA构建体的步骤。

23.一种减毒的基因型I PRRS病毒，其基因组包含条款1-10中任一项的核酸分子编码的RNA分子，但是其中所述与SEQ ID NO:45的核酸序列具有至少95％序列相同性的第一核酸序列包含一个或多个突变，所述一个或多个突变使得所编码的PRRS病毒不能抑制所述病毒感染的细胞的I型干扰素产生和分泌。

24.条款21-23中任一项的减毒的基因型I PRRS病毒在制备用于防止动物出现PRRSV感染的临床表现的药物中的用途。

25.一种疫苗组合物，其包含悬浮于合适量的药学可接受的稀释剂或赋形剂中的条款21-23中任一项的减毒的基因型I PRRS病毒。

26.条款25的疫苗组合物，其用于防止动物出现PRRSV感染的临床表现的方法。

27.防止动物出现PRRSV感染的临床表现的方法，所述方法包括向有此需要的动物给药条款26的疫苗组合物的步骤。

3.本发明的第三考虑

根据在本节中详述的第三考虑，本发明是基于这样的发现，本发明的第一考虑可以与本发明的第二考虑组合。因此，本发明的第三考虑涉及(1)本发明的第一考虑的方面和实施方案以及(2)本发明的第二考虑的方面和实施方案的组合。因此，应当理解本发明的第一考虑的所有可能的特征和定义，特别是涉及基因型I PRRS病毒的特征和定义，可以与本发明的第二考虑的所有特征和定义任意组合。

在一方面，如条款36-42中任一项列举的，本发明的第二考虑的核酸分子因此编码本发明的第一考虑的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒。

在另一方面，分别地，如条款56或57中列举的，本发明的第一考虑的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒因此由本发明的第二考虑的核酸分子编码。

因此，本发明的第一考虑的所有可能的方面与本发明的第二考虑的所有可能的方面的组合还特别通过所述权利要求和根据其的权利要求反映。

此外，本发明涉及基因型I PRRS病毒，特别是上述PRRS病毒，其基因组由编码基因型I PRRS病毒且能够在转染入细胞时产生活病毒的核酸分子编码，其中所述分子包含与SEQ ID NO:48的核酸序列具有至少91％或92％，优选至少93％或94％，更优选至少95％或96％，更优选至少98％或99％，并且特别优选至少99％或100％序列相同性的核酸序列，但是其中所述核酸序列包含突变，所述突变导致产生的所述病毒包含在氨基酸位置50-71之间具有9、10、11或更多个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列。

本发明还涉及基因型I PRRS病毒，其基因组由编码基因型I PRRS病毒且能够在转染入细胞时产生活病毒的核酸分子编码，其中所述分子包含与SEQ ID NO:48的核酸序列的核酸序列具有至少91％或92％，优选至少93％或94％，更优选至少95％或96％，更优选至少98％或99％，并且特别优选至少99％或100％序列相同性的核酸序列，但是其中所述核酸序列包含突变，所述突变导致产生的所述病毒包含在氨基酸位置50-71之间具有11、12、13、14、15、16或17个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列。

此外本发明考虑基因型I PRRS病毒，其基因组由编码基因型I PRRS病毒且能够在转染入细胞时产生活病毒的核酸分子编码，其中所述分子包含与SEQ ID NO:48的核酸序列的核酸序列具有至少91％或92％，优选至少93％或94％，更优选至少95％或96％，更优选至少98％或99％，并且特别优选至少99％或100％序列相同性的核酸序列，但是其中所述核酸序列包含突变，所述突变导致产生的所述病毒包含在氨基酸位置56-70之间或在氨基酸位置57-69之间具有13个氨基酸残基缺失的ORF4蛋白，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列。

本文涉及的突变优选为缺失。

优选地，将本发明的PRRS病毒遗传修饰以便其中包含外源RNA，其中将外源RNA插入所述病毒的orf4基因，并且其中特别将外源RNA插入所述病毒的orf4基因的编码位于氨基酸位置50-71之间的区域的区域，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列。

在另一优选方面，将外源RNA插入病毒的orf4基因并代替编码在本发明的上下文内缺失的氨基酸残基的核苷酸序列。

根据另一优选方面，外源RNA特别编码选自以下的表达产物：感兴趣的表位、生物反应调节剂、生长因子、识别序列、融合蛋白，其中感兴趣的表位优选来自抗原或者兽医病原体或毒素的感兴趣的表位。

特别地，感兴趣的表位是PRRS病毒的orf5基因编码的肽或PRRS病毒的orf5基因编码的氨基酸序列，其中所述PRRS病毒的orf5基因编码的肽或氨基酸序列优选包含或由SEQID NO:39或SEQ ID NO:50的氨基酸序列组成或者优选包含或由SEQ ID NO:39或SEQ IDNO:50所示的序列的至少4个连续氨基酸残基组成，或者优选包含或由SEQ ID NO:51或SEQID NO:52的氨基酸序列组成。

根据另一优选方面，外源RNA编码选自SEQ ID NO:53-55的氨基酸序。

在一特别优选的方面，作为非限制性实例，本发明提供基因型I PRRS病毒，其基因组由包含选自SEQ ID NO:56-59中任一个的核酸序列的核酸分子编码。

权利要求58-73中任一项的PRRS病毒，其中所述病毒为分离的病毒和/或其中所述突变为缺失。

如本文中提到的，PRRS病毒优选为分离的病毒和/或非天然存在的病毒。

此外，本发明涉及基因型I PRRS，其中所述病毒包含在氨基酸位置56处具有脯氨酸残基和/或在氨基酸位置66处具有谷氨酰胺残基的ORF4蛋白，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列，并且其中Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO:43所示的序列。

本发明还涉及基因型I PRRS病毒，其基因组包含编码在氨基酸位置56处具有脯氨酸残基和/或在氨基酸位置66处具有谷氨酰胺残基的ORF4蛋白的核酸分子，其中所述氨基酸位置的编号参考Lelystad病毒的ORF4蛋白的氨基酸序列，并且其中所述病毒的基因组优选由核酸分子编码，其中所述分子包含与SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:48的核酸序列的核酸序列具有至少91％或92％，优选至少93％或94％，更优选至少95％或96％，更优选至少98％或99％，并且特别优选至少99％序列相同性的核酸序列。

在一示例性非限制性方面，其基因组包含编码在氨基酸位置56处具有脯氨酸残基的ORF4蛋白的核酸分子的这样的基因型I PRRS病毒为PRRS病毒，其基因组由包含核酸序列SEQ ID NO:58的核酸分子编码。

在另一示例性非限制性方面，其基因组包含编码在氨基酸位置66处具有谷氨酰胺残基的ORF4蛋白的核酸分子的这样的基因型I PRRS病毒为PRRS病毒，其基因组由包含核酸序列SEQ ID NO:57的核酸分子编码。

本发明的PRRS病毒优选用作药物或者用于预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征，特别是在猪中，并且其中任选地所述病毒分别通过鼻内、肌肉内、口服或子宫内途径待给药或给药至动物，特别是猪。

本公开中涉及的药物优选为疫苗。

根据另一方面，本发明的PRRS病毒优选用作检测标记，优选用于感染和免疫接种的动物之间的区分(DIVA)。

在另一方面，本发明涉及编码本发明的PRRS病毒的DNA分子，并且其中所述DNA分子优选包含具有选自SEQ ID NO:56-58的序列的核酸分子。

在另一方面，本发明涉及包含所述DNA分子的优选分离的DNA构建体及其优选分离的RNA转录物。

根据另一方面，本发明还涉及用所述DNA构建体或所述RNA转录物转染的优选分离的细胞。

此外本发明涉及一种制备本发明的PRRS病毒的方法，其中所述方法包括用所述DNA构建体转染细胞的步骤或者包括用所述RNA转录物转染宿主细胞的步骤。

总之，有可能根据本发明的程度将缺失插入编码PRRS病毒如基因型I PRRSV的GP4的胞外域的序列的知识，现在提供许多有益用途：

-基于这个知识的病毒可以用作攻击分离株用于肠胃外、口服、鼻内、子宫内感染以及用于通过PRRSV阳性和PRRSV幼稚和/或PRRSV敏感物种中的精子感染。

-本发明提供缺失标记用于每种可想到的PRRSV毒株与基因型II的PRRSV毒株的血清学区分或序列区分(DIVA概念)，无论缺失是否已存在于各位点。

-此外，还提供缺失标记与其他表位连接或组合用于血清学区分。例如，通过利用针对这个表位的抗体，可以血清学区分没有缺失的PRRS病毒与具有这些表位(例如Lelystad GP4aa60-aa71：如SEQ ID NO:43中包括的AAQEKISFGKS)的完全或部分缺失的PRRS病毒。例如，与其他表位联合可以互相区分在这个区域/结构域具有缺失的两种PRRS病毒。

本发明还提供插入区域/结构域用于在所述位置引入外源RNA代替病毒RNA，其中本发明的缺失位于(GP4的胞外域)。

可以为了各种目的以及对每种可想到的PRRSV毒株，还有对在这个区域中已具有小缺失的基因型II的PRRSV毒株进行插入。

外源序列的插入可以发生在例如本文所述的PRRSV基因型I毒株BI EU中，并且代替具有氨基酸(aa)序列aa54-aa70(QSHRASTAQGTTPLRRS(SEQ ID NO:40))或者其缩短或诱变衍生物的编码所述菌株GP4的胞外域的序列。

此外，为了改善免疫应答，还可以插入一个或多个顺序T-或B-细胞表位

a)来自PRRSV的其他基因/基因组区域，例如来自(i)编码本文所述的PRRSV基因型I毒株BI EU的糖蛋白5(aa)的区域，例如编码氨基酸(aa)aa36-aa52(SSHLQLIYNLTICELNG(SEQ ID NO:39))或者其缩短或诱变衍生物的序列，还具有合适的接头，例如具有aa基序GSS；相应地还来自其他PRRSV分离株，例如来自PRRSV基因型I原型分离株Lelystad，或者相应地，来自PRRSV的其他基因型，例如来自PRRSV基因型II原型分离株VR2332；

b)来自其他病原体，例如来自另一种猪病原体，用于建立或增强针对所述病原体的免疫应答；

c)来自非PRRSV特异性T-或B-细胞表位作为遗传或血清学阳性标记，还与a)组合；

d)来自不同于a)的免疫增强剂，例如细胞因子，如白介素，还与b)组合。

此外，为了改善免疫应答，还可以插入一个或多个顺序T-或B-细胞表位用于减少病毒的致病性。

实施例

实施例1

a)PRRSV的分离

PRRSV分离自以前在PRRSV EU-型检测PCR中测试为阳性的血液样品(bS-720789)。在MA104细胞上进行病毒的分离。在MA104细胞上繁殖分离的EU-型PRRSV之后，通过在蔗糖垫层上超速离心，然后RNase和DNase处理来制备用于全基因组测序的病毒储备。最后，从病毒储备提取病毒RNA并提交用于全基因组测序(Roche 454平台)。将获得的基因组序列(14854个核苷酸)与毒株Lelystad的EU-型参考基因组序列进行比较，显示在ORF4中33个核苷酸的缺失。

b)感染

用a)的病毒感染公猪产生严重的PRRS临床表现。

实施例2

a)新EU型PRRSV感染性cDNA克隆的产生和表征

这个实施例描述了在下文中命名为“BI EU”的新EU型PRRSV感染性cDNA克隆的产生和表征。BI EU是基于但不同于减毒的EU型PRRSV毒株，并且在核苷酸水平分别与EU原型毒株Lelystad病毒89％相同或与EU型PRRSV感染性cDNA克隆LoN94-13(WO 2013017568A1)的PRRSV cDNA插入87％相同。BI EU的cDNA序列在SEQ ID NO:48中提供。

将合成的加帽转录物转染入BHK21细胞随后将来自转染细胞的细胞培养上清液转移至PRRSV-敏感的MA104细胞之后从cDNA克隆BI EU恢复活病毒。在将来自转染的BHK21细胞的细胞培养上清液转移至MA104细胞后3-4天内可检测到强细胞病变效应(CPE)(图1A)。用PRRSV衣壳蛋白特异性单克隆抗体SDOW17(Rural Technologies)将细胞染色之后，在CPE阳性MA104细胞中可检测到强信号(图1B)，但是在接受模拟转染的BHK21细胞上清液的细胞中未检测到(未示出)。

为了测试BI EU cDNA克隆衍生病毒的生长，分别利用0.001、0.01或0.1的感染复数(MOI)用恢复的病毒感染MA104细胞。在感染后0、24、48、72和96小时收集感染细胞的上清液，并且通过在包含MA104细胞的96-孔板上连续病毒稀释来确定病毒滴度。所得的恢复自BI EU的病毒的生长曲线在图2中示出。

独立于用于MA104细胞感染的MOI，病毒BI EU在感染后24小时内达到5x10⁵-1x10⁶组织培养感染剂量50(TCID₅₀)/毫升(ml)的滴度。滴度在用1x10⁶-1x10⁷TCID₅₀/ml感染后48小时左右达到峰值，证实在MA104细胞上BI EU病毒的高效率复制。

这个发现允许使用BI EU作为平台用于PRRSV疫苗研究，例如，作为许多应用之一，研究PRRSV与宿主对病毒感染的免疫应答的相互作用。

b)新EU型PRRSV感染性cDNA克隆在PRRS疫苗研究中的用途

对PRRSV感染的特异性免疫应答通过中和抗体的延迟诱导(Lopez and Osorio,2004)和短细胞介导的免疫应答(Xiao et al.,2004)表征。除了诱骗表位的呈递(Ostrowski et al.,2002；Ansari et al.,2006)和病毒包膜蛋白的聚糖屏蔽(Ansari etal.,2006)，通常接受这些效应可以部分归因于宿主先天免疫系统的病毒抑制。已证实PRRSV感染在敏感细胞系(猪肺泡巨噬细胞、猴肾细胞MARC-145)和/或猪中不诱导或者仅微弱或延迟诱导I型干扰素(IFN)，(干扰素-α和干扰素-β；(Miller et al.,2004))或II型IFN，(干扰素-γ；(Meier et al.,2003))的产生(Buddaert et al.,1998)。

IFN在建立针对病毒感染的有效适应性免疫应答中起重要作用，因此许多病毒已发展策略以对抗宿主先天免疫应答的发生(Haller and Weber,2009)。为了鉴定期望的PRRSV IFN拮抗剂，基于稳定表达感兴趣的基因的细胞系或用表达蛋白的质粒转染的细胞的广泛筛选分析已鉴定了包括nsp1(见下文)、nsp2(Beura et al.,2010；Li et al.,2010)、nsp4(Beura et al.,2010)和nsp11(Beura et al.,2010；Shi et al.,2011a)在内的几种PRRSV非结构蛋白(nsp)参与阻断I型IFN的诱导。

nsp1位于PRRSV ORF1a-衍生的多聚蛋白1a的N-末端，并且加工为两个多功能亚基nsp1α和nsp1β，每个包含对于从病毒多聚蛋白自释放必不可少的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(PCP)(den Boon et al.,1995；Chen et al.,2010)。nsp1α包含N-端锌指结构域和PCPα蛋白酶结构域，而nsp1β包含PCPβ。对于两个nsp1亚基nsp1α和nsp1β，三维晶体结构已解析(Sun et al.,2009；Xue et al.,2010)。根据这些分析，nsp1β由N-端结构域(NTD)、接头结构域(LKD)、PCP结构域(PCPβ)和C-端延伸(CTE)组成；(Xue et al.,2010)。C-端nsp1β介导的从nsp2切割nsp1发生在PRRSV US毒株的WYG/AGR位点(Kroese et al.,2008)，或者预测在PRRSV EU毒株的位点WYG/AAG(Chen et al.,2010)，而nsp1α/nsp1β切割发生在PRRSV US毒株的位点ECAM/AxVYD，或者预测在PRRSV EU毒株的位点EEAH/SxVYR(Chen et al.,2010)。

几个研究证实机制细节，PRRSV nsp1和/或其自我切割衍生的亚基nsp1α和/或nsp1β通过干扰IFN转录来抑制I型IFN产生(Song et al.,2010；Kim et al.,2010；Chen etal.,2010；Beura et al.,2010)。此外，已证实nsp1β干扰对干扰素的细胞应答(干扰素信号传导)；(Chen et al.,2010)。此外，据证实在体外PRRSV感染抑制PRRSV感染细胞中的IFN-α和/或IFN-β产生(Kim et al.,2010；Beura et al.,2010)，确定了nsp1(亚基)的亚细胞定位(Song et al.,2010；Chen et al.,2010)，并且在用PRRSV感染的细胞中证实了其他人从单一蛋白表达实验获得的I型IFN抑制的机械方面(Shi et al.,2010)。最后，基于nsp1蛋白表达的nsp1诱变研究调查了对病毒IFN抑制的影响(Shi et al.,2011b)。

已产生以前的活PRRSV(EU)毒株(如WO 2013017570A1所述)，其在nsp1β基因中包含突变(缺失)，在敏感细胞(MARC145)中诱导I型IFN(IFN-β)产生，并且对I型IFN(IFN-β)敏感。

为了测试这样还有不同的IFN诱导病毒突变体是否可以基于新的感染性克隆BIEU产生，设计一套在nsp1β基因中包含缺失的病毒。更准确地说，这些缺失位于已显示蛋白的同源二聚化需要的nsp1β的N-端结构域(Xue et al.,2010)。图3示出几个US和EU型PRRSV毒株的nsp1β氨基酸序列比对。示出的是预测形成链(蓝色)或α螺旋(红色)结构的氨基酸。

在感染性cDNA克隆BI EU的基础上产生10个nsp1β缺失突变体。缺失包括预测不参与β链或α螺旋形成的氨基酸以及在比对中分析的所有EU型PRRSV毒株内(部分)保守的氨基酸(图3中的红色框架)。

引入nsp1β基因的缺失在图4中示出的氨基酸比对中可见。BI EU-nsp1β缺失突变体分别命名为BI EU-nsp1β-delALEV、BI EU-nsp1β-delEV、BI EU-nsp1β-delLEVL、BI EU-nsp1β-delLE、BI EU-nsp1β-delDD、BI EU-nsp1β-delSDDS、BI EU-nsp1β-delHH、BI EU-nsp1β-delGRSR、BI EU-nsp1β-delRSR和BI EU-nsp1β-delSDGRSR。

为了测试nsp1β缺失突变体的生存力，将包含各缺失的BI EU cDNA的合成转录物转染入BHK21细胞。将来自转染细胞的细胞培养上清液转移至PRRSV敏感的MA104细胞之后，细胞病变效应(CPE)和核衣壳特异性免疫荧光染色表明对所产生的10个nsp1β缺失突变体中的9个可检测到PRRSV突变体生存力(未示出)。这些发现证实除了BI EU-nsp1β-delLEVL，所有nsp1β缺失突变体都是活的。为了进一步分析nsp1β缺失突变体是否可以在有IFN能力(IFN-competent)的MA104细胞中生长至高滴度，基本上如上文对BI EU病毒所述进行生长曲线。简单地说，用9个nsp1β缺失突变体之一或作为对照的病毒BI EU感染MA104细胞。在感染后0、24、48、72和93小时收获细胞培养上清液，并且在96-孔板上于MA104细胞上滴定。基于CPE-阳性细胞计算病毒滴度。图5示出两个独立实验的结果，并且证实BI EU-nsp1β缺失突变体可以与亲本BI EU病毒一样高效地在MA104细胞上生长。在感染后48小时观察到5x10⁶-1x10⁷TCID₅₀/ml的峰值滴度。

然后分析引入nsp1β基因的缺失是否的确会废除nsp1β蛋白的IFN拮抗活性。因此利用人IFN-β特异性的商业ELISA(Invitrogen)测量在上述生长曲线实验中感染后0、24、48、72和93小时收集的100μl样品中的IFN-β水平。根据制造商，这种ELISA还可以用于检测非人灵长类IFN-β，并且对于来自是上皮绿猴肾细胞的MA104细胞的样品工作良好(见图6)。为了定量所得的结果，利用ELISA制造商的阳性对照包括校准曲线。

在用9个活nsp1β缺失突变体之一或亲本BI EU病毒感染的MA104细胞的上清液中测量并获得自两个独立实验的IFN-β水平在图6中示出。

正如预期的，亲本BI EU在感染过程中有效阻断IFN-β的分泌，这归因于功能性病毒IFN拮抗剂。在用各种BI EU-nsp1β缺失突变体感染后0、24和48小时，在细胞培养上清液中没有或仅少量IFN-β可检测。但是，在稍后的时间点，一些突变体不能抑制感染的MA104细胞中的IFN-β表达，表明nsp1βIFN拮抗活性的缺陷。有趣的是，这种缺陷在分析的9个BI EU-nsp1β缺失突变体之间显著变化。虽然大多数突变体诱导IFN-β水平低于50国际单位(IU)/100μl细胞培养上清液，但是突变体BI EU-nsp1β-delALEV完全不能拮抗感染的MA104细胞中的IFN-β表达。在感染后72和93小时测量的IFN-β量甚至超过设置为～200IU/100μl的ELISA测试的限制。这个结果清楚证实nsp1β蛋白的IFN拮抗活性可以通过缺失BI EU感染性cDNA克隆中的氨基酸A₃₀LEV₃₃来废除。

总的来说，产生了一种新的EU型PRRSV感染性cDNA克隆，其可以在绿猴肾MA104细胞中有效生长至1x10⁷TCID₅₀/ml的滴度。基于这个克隆，产生了9个活BI EU-nsp1β突变体，其在已显示蛋白的同源二聚化需要的nsp1β的NTD中包含缺失(Xue et al.,2010)。这些突变体全部可以在MA104细胞上生长至高滴度。突变体BI EU-nsp1β-delALEV、BI EU-nsp1β-delEV、BI EU-nsp1β-delLE、BI EU-nsp1β-delSDDS、BI EU-nsp1β-delGRSR、BI EU-nsp1β-delRSR和BI EU-nsp1β-delSDGRSR全部在感染的后期时间点诱导IFN-β的分泌，这与亲本BIEU病毒形成严格对比。在这7个突变体中，4个突变体BI EU-nsp1β-delALEV、BI EU-nsp1β-delEV、BI EU-nsp1β-delLE和BI EU-nsp1β-delSDDS代表以前在WO 2013017570A1中尚未描述的一类新突变体。特别地，感染突变体BI EU-nsp1β-delALEV在MA104细胞中诱导非常大量的IFN-β，这导致这样的结论，这种病毒的IFN I型诱导的阻断严重受损。

这个发现对PRRSV疫苗开发有强烈影响，因为可以设想天然宿主对PRRSV的免疫应答可以通过引入缺失而显著增强，例如通过缺失基因型I PRRSV毒株的nsp1β蛋白中的氨基酸A₃₀LEV₃₃。

其中描述的nsp1β缺失突变体，单独或与其他减毒突变组合，代表有希望的生命减毒PRRSV疫苗的候选物。

实施例3

a)在EU型PRRSV感染性cDNA克隆BI EU的ORF4蛋白内引入缺失

测试是否可以将根据本发明的第一考虑所述的缺失引入任何PRRS病毒株的ORF4基因而不负面影响病毒复制。因此，将缺失引入EU型PRRSV感染性cDNA克隆BI EU的氨基酸位置50-71之间的编码ORF4蛋白的胞外域的基因组区域(包含SEQ ID NO:48的序列)。BI EU的ORF4蛋白内的缺失包括氨基酸57-69(如SEQ ID NO:49编码的)。

为了测试ORF4缺失突变体的生存力，将包含缺失的BI EU cDNA的合成转录物转染入BHK21细胞。将来自转染细胞的细胞培养上清液转移至PRRSV敏感的MA104细胞上之后，在将来自转染的BHK21细胞的细胞培养上清液转移至MA104细胞后3-4天内可检测到细胞病变效应(CPE)。用PRRSV衣壳蛋白特异性单克隆抗体SDOW17(Rural Technologies)将细胞染色之后，在CPE阳性MA104细胞中可检测到强信号，但是在接受模拟转染的BHK21细胞上清液的细胞中未检测到(未示出)。这些发现证实BI EU-ORF4缺失突变体是活的。在下文中将恢复的突变病毒命名为BI EU-GP5-36-46-ctr(比较例b)。

为了进一步分析BI EU-GP5-36-46-ctr是否可以在MA104细胞上生长至高滴度，进行生长动力学。因此，利用0.01的感染复数(MOI)用恢复的病毒和作为对照的亲本BI EU病毒感染MA104细胞。在感染后0、24、48、72和96小时收集感染细胞的上清液，并且通过在包含MA104细胞的96-孔板上连续病毒稀释来确定病毒滴度。图7示出三个独立实验的结果，并且证实BI EU-GP5-36-46-ctr可以与亲本BI EU病毒一样高效地在MA104细胞上生长。对于两种病毒在感染后48小时观察到～1x10⁷TCID₅₀/ml的峰值滴度。

总的来说，ORF4蛋白内氨基酸57-69的缺失不负面影响BI EU的生长，表明在体外PRRSV对这个区域内的序列变化耐受良好。从这些结果得出结论，位于BI EU ORF4蛋白的氨基酸位置50-71之间的区域还可以用作外源序列的插入位点。

b)ORF4蛋白缺失位点在插入外源RNA中的用途：将PRRSV ORF5蛋白中和表位序列插入感染性cDNA克隆BI EU的ORF4基因

这个实施例描述了将外源RNA插入位于BI EU ORF4蛋白的氨基酸位置50-71之间的区域。这个实施例中的外源RNA编码位于PRRS病毒的ORF5蛋白内的中和表位(Ostrowski,M.et al.)，并且由SEQ ID NO:39的氨基酸1-11组成。选择将这个序列(SEQ ID NO:51)插入ORF4蛋白的胞外域以增加潜在的疫苗候选物中ORF5中和表位的可接近性，允许免疫接种的动物中的免疫应答提高。

为了产生重组病毒，将外源序列引入实施例a)中描述的ORF4缺失位点，并且用旁侧为G-G接头的SEQ ID NO:39的氨基酸1-11(代表2型PRRSV毒株的ORF5蛋白内的氨基酸36-46)代替BI EU ORF4蛋白的氨基酸57-69。所述插入导致BI EU的ORF4蛋白内的最终序列为Gly₅₇-Ser-Ser-His-Leu-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asn-Leu-Thr-Gly₆₉(SEQ ID NO:53)。在下文中将包含所述插入的重组病毒命名为BI EU-GP5-36-46(包含SEQ ID NO:56的序列)。

为了测试BI EU-GP5-36-46是否可以恢复，将包含突变的BI EU cDNA的合成转录物转染入BHK21细胞。通过如上文所述的方法可以拯救重组病毒。在将来自转染的BHK21细胞的细胞培养上清液转移至PRRSV敏感的MA104细胞后3-4天内可观察到细胞病变效应(CPE)。此外，在CPE阳性MA104细胞中可检测到PRRSV衣壳蛋白特异性染色，但是在接受模拟转染的BHK21细胞的上清液的细胞中不可检测(未示出)。

进行生长动力学以测试重组病毒是否可以生长至高滴度。因此，利用0.01的MOI用BI EU-GP5-36-46和作为对照的亲本BI EU病毒感染MA104细胞。在感染后0、24、48、72和96小时收集感染细胞的上清液，并且通过在包含MA104细胞的96-孔板上连续病毒稀释来确定病毒滴度。三个独立实验的结果在图7中示出。在感染后48小时，病毒突变体BI EU-GP5-36-46达到与亲本BI EU病毒相同的～1x10⁷TCID₅₀/ml的峰值滴度，表明ORF4蛋白内的插入序列不负面影响高滴度病毒生长。

在MA104细胞上的进一步实验显示外源RNA序列在多个世代中稳定保持。序列分析证实在分析的所有世代中插入物的稳定性。有趣的是，在独立实验中，在世代1之后可检测到在插入位点上游位置56处导致His至Pro的氨基酸交换的腺嘌呤至胸腺嘧啶的单核苷酸突变。因此，通过反向遗传学将这个额外的突变插入BI EU-GP5-36-46。为了产生这个重组病毒，将外源序列引入实施例a)中描述的ORF4缺失位点，并且用N-端旁侧为氨基酸序列PG且C-端旁侧为G-接头的SEQ ID NO:39的氨基酸1-11(代表2型PRRSV毒株的ORF5蛋白内的氨基酸36-46)代替BI EU ORF4蛋白的氨基酸56-69。所述插入导致BI EU的ORF4蛋白内的最终序列为Pro₅₆-Gly-Ser-Ser-His-Leu-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asn-Leu-Thr-Gly₆₉(SEQ ID NO:55)。在下文中将所得的重组病毒命名为BI EU-GP5-36-46-AtoC(包含SEQ ID NO:58的序列)。图7中示出的生长动力学证实BI EU-GP5-36-46-AtoC可以生长至分别与BI EU-GP5-36-46和BI EU野生型相似的滴度。

为了测试BI EU-GP5-36-46-AtoC中ORF4的胞外域编码区中的ORF5衍生序列是否会使突变病毒对血清中和更敏感，进行血清中和测试(SNT)。假设位于ORF4蛋白胞外域中的插入的ORF5衍生的中和表位的增加的可接近性会导致与亲本病毒BI EU相比，重组病毒对中和抗体作用的敏感性增强。

对于SNT，将用BI EU野生型病毒免疫接种后48天采自6头母猪的血清连续稀释并与BI EU-GP5-36-46-AtoC或野生型BI EU混合。

在37℃和5％CO₂下温育1小时之后，将MA104细胞添加至样品中。4天后基于非中和病毒诱导的CPE确定血清滴度。免疫接种之前采自相同动物的血清用作阴性对照(未示出)。两个独立实验的平均值和标准差在图8中示出。

可以证实无论所分析的6只动物之间可观察到的变化，当与BI EU野生型病毒比较时BI EU-GP5-36-46-AtoC始终对体外中和更敏感。对EU-GP5-36-46-AtoC测量的血清滴度比对亲本病毒BI EU确定的滴度高3-15倍(图8)。获得自不同实验的数据进一步表明通过将ORF5-衍生序列中存在的N-糖基化位点(SEQ ID NO:39的氨基酸N₉)从Asn₉突变至Gln₉(SEQID NO:50和52)，BI EU-GP5-36-46-AtoC的血清滴度可能甚至更可增加，因为N-糖基化天然保护ORF5中和表位((Ansari et al.,2006)并且数据未示出)。总的来说，图8中示出的发现强烈表明插入ORF4蛋白胞外域的ORF5-衍生的中和表位在重组病毒BI EU-GP5-36-46-AtoC中高度可接近，使得后者成为有希望的疫苗候选物。证实的对包含PRRSV特异性中和抗体的血清的较高敏感性应当允许较快清除并增加疫苗病毒的安全性。

而且，可以预期当与用亲本病毒BI EU免疫接种的动物比较时，在用BI EU-GP5-36-46-AtoC免疫接种的猪仔或母猪中PRRSV特异性中和抗体会诱导至较高水平和在较早时间点。免疫接种之后早诱导中和抗体应当导致较快清除，因此疫苗病毒脱落较少(安全性增加)，并且导致用PRRSV自然感染之后更有效的免疫应答(效力增加)。

重组病毒BI EU-GP5-36-46-AtoC因此代表具有改善的安全性和效力的生命减毒PRRSV疫苗的有希望的候选物。

附图说明

图1：A.如通过亮视野显微镜术所示，从BI EU cDNA克隆恢复的感染性病毒在MA104细胞上诱导强CPE。B.BI EU感染的MA104细胞的PRRSV衣壳蛋白特异性免疫荧光(IF)染色。

图2：从感染性cDNA克隆BI EU恢复的病毒在MA104细胞上的生长。

图3：几种US(II型，顶部)和EU(I型，底部)PRRSV毒株的nsp1βN-端结构域(NTD)氨基酸序列比对。BI EU的NTD氨基酸序列在最底部给出。氨基酸R22、PR24、E32、SFP和H52在比对上指示，并且已显示对于nsp1β同源二聚化至关重要(Xue et al.,2010)。nsp1β诱变的靶区域在红色框中。SDGRSR基序对应于使用PRRSV EU cDNA克隆LoN94-13的WO2013017570A1中描述的区域。

图4：BI EU-nsp1β缺失突变体的氨基酸序列比对。

图5：BI EU-nsp1β缺失突变体在有IFN能力的MA104细胞上的生长。

图6：在用BI EU-nsp1β缺失突变体或亲本BI EU病毒感染的MA104细胞的细胞培养上清液中于不同时间点测量的IFN-β水平。

图7：在ORF4蛋白内包含缺失或插入的重组BI EU病毒的生长动力学。

图8：对重组病毒BI EU-GP5-36-46-AtoC和亲本病毒BI EU的血清中和测试。

在序列表中：

SEQ ID NO:1-24对应于具有缺失的PRRSV ORF4蛋白胞外域的序列；

SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26对应于PRRSV(基因型I)ORF4蛋白的前两个预测的N-端β–折叠的序列；

SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28对应于PRRSV(基因型II)ORF4蛋白的前两个预测的N-端β–折叠的序列；

SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30对应于PRRSV(基因型I)ORF4蛋白的前两个预测的N-端β–折叠的序列；

SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32对应于PRRSV(基因型II)ORF4蛋白的前两个预测的N-端β–折叠的序列；

SEQ ID NO:32对应于在前两个预测的N-端β–折叠之间的区域中具有11个氨基酸残基缺失的PRRSV(基因型I)ORF4蛋白的(部分)序列；

SEQ ID NO:33对应于在前两个预测的N-端β–折叠之间的区域中具有7个氨基酸残基缺失的PRRSV(基因型II)ORF4蛋白的(部分)序列；

SEQ ID NO:34对应于具有11个氨基酸残基缺失的PRRSV(基因型I)ORF4蛋白胞外域的序列；

SEQ ID NO:35对应于具有7个氨基酸残基缺失的PRRSV(基因型II)ORF4蛋白胞外域的序列；

SEQ ID NO:36对应于具有11个氨基酸残基缺失(并且分别包括SEQ ID NO:34的序列)的PRRSV(基因型I)ORF4蛋白胞外域的序列；

SEQ ID NO:37对应于编码SEQ ID NO:36的序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:38对应于编码基因型I PRRSV的核苷酸序列，所述基因型I PRRSV的基因组包含编码SEQ ID NO:36的序列的核酸分子；

SEQ ID NO:39对应于PRRS病毒的ORF5基因编码的肽序列；

SEQ ID NO:40对应于PRRS病毒的ORF5基因编码的肽序列；

SEQ ID NO:41对应于Lelystad病毒完整基因组；

SEQ ID NO:42对应于VR2332病毒完整基因组；

SEQ ID NO:43对应于Lelystad病毒的ORF4蛋白的序列；

SEQ ID NO:44对应于VR2332病毒的ORF4蛋白的序列；

SEQ ID NO:45对应于如本文所述的第一核酸序列；

SEQ ID NO:46对应于如本文所述的第二核酸序列，其在第一核酸序列的5′端旁侧；

SEQ ID NO:47对应于如本文所述的第三核酸序列，其在第一核酸序列的3′端旁侧；

SEQ ID NO:48对应于BI EU完整病毒cDNA插入物；

SEQ ID NO:49对应于具有缺失的SEQ ID NO:48的序列，从而编码具有13aa(aa57-69)缺失的ORF4蛋白；

SEQ ID NO:50对应于在位置9处具有取代N->Q的SEQ ID NO:39的序列；

SEQ ID NO:51对应于SEQ ID NO:39的aa 1-11的序列；

SEQ ID NO:52对应于在位置9处具有取代N->Q的SEQ ID NO:51的序列；

SEQ ID NO:53对应于具有Gly-Gly接头的SEQ ID NO:51的序列；

SEQ ID NO:54对应于具有Gly-Gly接头的SEQ ID NO:52的序列；

SEQ ID NO:55对应于具有N-端脯氨酸残基的SEQ ID NO:53的序列；

SEQ ID NO:56对应于具有插入物的SEQ ID NO:49的序列，从而编码SEQ ID NO:53的序列；

SEQ ID NO:57对应于具有插入物的SEQ ID NO:49的序列，从而编码SEQ ID NO:54的序列；

SEQ ID NO:58对应于具有缺失的SEQ ID NO:48的序列，从而编码具有14aa(aa56-69)缺失的ORF4蛋白，其中包括编码SEQ ID NO:55的序列的插入物；

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Claims

1.一种核酸分子，其编码基因型I PRRS病毒且能够在转染入细胞时产生活病毒，其中所述分子由SEQ ID NO:48的核酸序列组成。

2.权利要求1的核酸分子，其中所述病毒是减毒的。

3.权利要求1-2中任一项的核酸分子，其中所述分子为DNA分子。

4.包含权利要求3的DNA分子的DNA构建体。

5.权利要求4的DNA构建体的RNA转录物。

6.用权利要求4的DNA构建体或权利要求5的RNA转录物转染的细胞。

7.通过权利要求6的细胞制备的基因型IPRRS病毒。

8.一种基因型IPRRS病毒，其基因组包含权利要求1-3中任一项的核酸分子编码的RNA分子或者其基因组由权利要求1-3中任一项的核酸分子编码。

9.一种制备基因型I PRRS病毒的方法，所述方法包括用权利要求4的DNA构建体转染细胞或者包括用权利要求5的RNA转录物转染宿主细胞。

10.一种组合物，其包含悬浮于合适量的药学可接受的稀释剂或赋形剂中的权利要求1-2中任一项的核酸分子。

11.权利要求7-8中任一项的PRRS病毒在制备用于预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的用途。

12.权利要求11的用途，其中所述药物用于在猪中预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征。

13.根据权利要求11的用途，其中所述病毒待通过鼻内、肌肉内、口服或子宫内途径给药至动物或通过鼻内、肌肉内、口服或子宫内途径给药至动物。