ES2940691T3

ES2940691T3 - Variante de virus PRRS, clon de ADNc de virus PRRS europeo y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2940691T3
Application number: ES19165389T
Authority: ES
Inventors: Andreas Gallei; Marieke Herrel; Christoph Keller; Erik Schacht
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2023-05-10
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: EA039060B1; MX2016007737A; WO2015092058A1; KR102270344B1; JP2017502662A; JP2021104028A; DK3591042T5; AU2014369774A1; JP2020054380A; AU2014369774B2; MX2020010248A; JP7158523B2; HUE061768T2; US20160317642A1; EP3083947B1; CA2930042A1; US10639364B2; US20190151432A1; DK3083947T3; EP3591042A1

Abstract

La presente invención pertenece al campo de la salud animal y proporciona medios para estudiar el Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS), una enfermedad viral que afecta a los cerdos, y para el desarrollo de vacunas, terapias y diagnósticos para la profilaxis, tratamiento y diagnóstico del PRRS. En una primera consideración, la invención se refiere a una nueva variante del virus PRRS. y, en una segunda consideración, a una secuencia de ácido nucleico que comprende el genoma de un clon del virus PRRS infeccioso de genotipo I (EU). En base a esto, se proporcionan nuevos candidatos vacunales contra el PRRS con propiedades mejoradas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variante de virus PRRS, clon de ADNc de virus PRRS europeo y usos de los mismos

Antecedentes de la invención

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la salud animal.

En una primera consideración, la exposición se refiere a una nueva variante del virus PRRS La exposición se refiere, además, a la utilización de dicho virus PRRS para estudiar el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS, por sus siglas en inglés), una enfermedad vírica que afecta a los cerdos, y en el desarrollo de vacunas, terapéuticos y diagnósticos para la profilaxis, tratamiento y diagnóstico del PRRS.

En una segunda consideración, la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende el genoma de un clon de virus PRRS (EU) de genotipo I infeccioso. La invención se refiere, además, a la utilización de la secuencia de ácido nucleico del clon de virus PRRs de genotipo I infeccioso para producir virus vivos atenuados que resulten útiles para prevenir o tratar el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) en cerdos y en el desarrollo de vacunas, terapéuticos y diagnósticos para la profilaxis, tratamiento y diagnóstico del PRRS.

Mediante la combinación de ambas consideraciones mencionadas, se proporcionan adicionalmente nuevos virus PRRS con propiedades mejoradas en una tercera consideración de la exposición.

Información de antecedentes

El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) es un miembro de la familia de virus Arteriviridae y pertenece, junto con los Coronaviridae, al orden de virus Nidovirales. El PRRSV es un virus con cubierta con un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo de aproximadamente 15 kilobases que comprende nueve marcos de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés): ORF1a, ORF1ab, ORF2a, ORF 2ab y ORF3 a ORF7. Los ORF 1a y 1ab codifican poliproteínas grandes que se procesan en proteínas no estructurales víricas (nsp, por sus siglas en inglés) mediante autocortes y cortes en trans de las proteasas víricas nsp1, nsp2 y nsp4 (Snijder y Meulenberg, 1998). ORF4 codifica una glucoproteína menor (GP4) que se encuentra, en contigüidad a una glucoproteína mayor (GP5) y dos otras glucoproteínas menores (GP2a y GP3), en la cubierta vírica, en la que la totalidad de dichas glucoproteínas son importantes para la producción de virus infeccioso.

PRRSV se considera uno de los agentes infecciosos económicamente más importantes en cerdos. Causa el fracaso reproductivo en fase tardía en cerdas y enfermedad respiratoria en los cerdos en crecimiento. Con frecuencia, la infección por PRRSV se ve complicada por infecciones bacterianas secundarias, lo que se atribuye a la naturaleza inmunosupresora del virus. Además, la viremia de PRRSV dura varias semanas y posteriormente todavía puede detectarse el virus en órganos linfoides durante varios meses, demostrando la dificultad o fracaso de la respuesta inmunitaria del huésped para eliminar el virus (Allende et al., 2000).

Existen dos genotipos víricos diferentes del PRRSV que causan síntomas clínicos similares y que divergen en aproximadamente el 40 % respecto a la secuencia de nucleótidos: el genotipo I (UE) y el genotipo II (EE. UU.). La cepa prototipo norteamericana (EE. UU.) es VR-2332, mientras que la cepa prototipo europea (UE) es el virus Lelystad.

Sin embargo, en un primer aspecto, debido a que las cepas de virus PRRS presentan una elevada diversidad biológica y evolucionan rápidamente en cada granja (Badaoui et al., BMC Veterinary Research 2013, 9:58), se requieren nuevos aislados del PRRSV para entender mejor el PRRS, a fin de reproducir dicha enfermedad en sus diferentes formas, con fines comparativos y como plataforma para el desarrollo de nuevas vacunas, medicamentos y diagnósticos para la profilaxis, tratamiento y diagnóstico del PRRS.

En un segundo aspecto, se está poniendo a disposición de la comunidad científica un número creciente de clones de ADNc infecciosos del virus PRRS; la mayoría de los cuales está basado en el tipo de EE. UU. del virus. Sin embargo, para el tipo de UE, solo se dispone de unos cuantos clones. De esta manera, existe una fuerte necesidad de nuevos clones de ADNc infecciosos del virus PRRS europeo (genotipo I), para una mejor comprensión del PRRS, para pruebas comparativas, como plataforma para el desarrollo de nuevas vacunas, medicamentos y diagnósticos para la profilaxis, tratamiento y diagnóstico del PRRS, en el que la utilización del clon de ADNc resulta en un alto rendimiento de producción de virus. De esta manera, por conveniencia experimental en la investigación de vacunas del PRRS, se requeriría un clon de ADNc infeccioso que permitiese la producción de virus PRRS de genotipo I en cantidades elevadas.

Descripción de la invención

La invención se define en las reivindicaciones y cualesquiera otros aspectos, consideraciones, configuraciones o realizaciones proporcionadas en la presente memoria no comprendidas dentro del alcance según las reivindicaciones se proporcionan exclusivamente a título informativo.

Cualesquiera referencias en la descripción a métodos de tratamiento se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para la utilización en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).

Según un primer aspecto, la invención se refiere a un virus de síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) de genotipo I cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.° 49, 56, 57 y 58.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a una vacuna que comprende un virus, en el que el virus es un virus de síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) de genotipo I cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.° 49, 56, 57 y 58, en el que la vacuna que comprende el virus opcionalmente comprende, además, un excipiente farmacéuticamente aceptable, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en: un solvente, un medio de dispersión, un adyuvante, un agente estabilizante, un diluyente, un conservante, un agente antibacteriano, un agente antifúngico, un agente isotónico y un agente retardante de la adsorción.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, que codifica un virus, en la que el virus es el virus del síndrome reproductivo y respiratorio del ganado porcino (PRRS) de genotipo I cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.° 49, 56, 57 y 58.

Según una realización, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a un constructo de ADN que comprende la molécula de ADN anteriormente indicada.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a un transcrito de ARN que comprende el constructo de ADN anteriormente indicado.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula que comprende el constructo de ADN indicado anteriormente o el transcrito de ARN indicado anteriormente.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, que codifica un virus, en la que el virus es el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) de genotipo I cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.° 49, 56, 57 y 58, y/o en el que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN, en el que la molécula de ácido nucleico se suspende en una cantidad adecuada de un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

1. Consideración adicional de la presente exposición que no es parte de la presente invención

Según una primera consideración, que se detalla en la presente sección, se describe el aislamiento de un nuevo virus PRRS que inesperadamente es capaz de inducir manifestaciones clínicas graves en verracos. Análisis más detallados de dicho virus PRRS han revelado una deleción significativa dentro del gen ORF4 de dicho virus.

De esta manera, en un aspecto la exposición se refiere a un virus reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) en el que dicho virus se selecciona del grupo que consiste en (a), (b), (c), (d), (e) y (f), a continuación:

(a) un virus PRRS que comprende una proteína ORF4 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n.° 1-12;

(b) un virus PRRS, preferentemente un virus PRRS de genotipo I, que comprende una proteína ORF4 con una deleción de 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos en la región situada en las primeras dos láminas p N-terminales predichas, respecto a la proteína ORF4 de un virus PRRS de genotipo I de tipo salvaje;

(c) un virus PRRS de genotipo II que comprende una proteína ORF4 con una deleción de 5, 6, 7 o más residuos aminoácidos en la región entre las primeras dos láminas p N-terminales predichas, respecto a un virus PRRS de genotipo II de tipo salvaje;

(d) un virus PRRS, preferentemente un virus PRRS de genotipo I, que comprende una proteína ORF4 con una deleción de 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 50 a 71, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad;

(e) un virus PRRS de genotipo II que comprende una proteína ORF4 con una deleción de 5, 6, 7 o más residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 50 y 67, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus PRRS VR2332;

(f) una combinación de cualquiera de (a), (b), (c), (d) y (e);

y, en un aspecto adicional, la exposición se refiere, respectivamente, a un virus reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) seleccionado del grupo que consiste en A), B), C), D), E) y F), a continuación:

A) un virus PRRS cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n.° 1-12;

B) un virus PRRS, preferentemente un virus PRRS de genotipo I, cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 con una deleción de 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos en la región situada en las primeras dos láminas p N-terminales predichas, respecto a la proteína ORF4 de un virus PRRS de genotipo I de tipo salvaje;

C) un virus PRRs de genotipo II cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 con una deleción de 5, 6, 7 o más residuos aminoácidos en la región entre las primeras dos láminas p N -terminales predichas, respecto a un virus PRRS de genotipo II de tipo salvaje;

D) un virus PRRS, preferentemente un virus PRRS de genotipo I, cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 con una deleción de 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 50 y 71, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad;

E) un virus PRRS de genotipo II, cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 con una deleción de 5, 6, 7 o más residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 50 y 67, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus PRRS VR2332;

F) una combinación de cualquiera de A), B), C), D) y E).

Preferentemente, dicho virus PRRS, que en lo sucesivo también se denomina "virus PRRS de la presente exposición" es un virus PRRS aislado.

Dentro del contexto de la invención, en particular se entiende que la expresión "residuos aminoácidos en la región" es equivalente a la expresión "residuos aminoácidos situados en la región" y, respectivamente, se entiende particularmente que la expresión "residuos aminoácidos entre posiciones aminoácidos" es intercambiable con la expresión "residuos aminoácidos situados en la región entre las posiciones de aminoácido".

Se entiende, además, que los términos "genotipo I" y "genotipo II" son equivalentes a los términos "genotipo 1" y "genotipo 2", o a los términos "tipo 1" y "tipo 2", tal como se utilizan con frecuencia en la literatura en el contexto del PRRSV.

Según el aspecto dado a conocer ((a)), el virus PRRS de esta manera es un virus PRRS que comprende una proteína ORF4 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n.° 1-12, en el que dicha proteína ORF4 preferentemente comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n.° 13-24, y en el que dicha proteína ORF4 en una realización no limitativa ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 31.

Respectivamente, según el aspecto dado a conocer ((A)), el virus PRRS es un virus PRRS cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n.° 1-12, en el que dicha proteína ORF4 preferentemente comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n.° 13-24, y en el que dicha proteína ORF4 en una realización no limitativa ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 31.

Según otro aspecto dado a conocer, ((b)), el virus PRRS es un virus PRRS, en particular un virus PRRS de genotipo I, que comprende una proteína ORF4 con una deleción de 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos en la región entre las primeras dos láminas p N-terminales predichas, en comparación con la proteína ORF4 de un virus PRRS de genotipo I de tipo salvaje, en la que dichas primeras dos láminas p N-terminales predichas preferentemente son las dos secuencias de aminoácidos indicadas en SEC ID n.° 25 y SEC ID n.° 26 o preferentemente son las dos secuencias de aminoácidos indicadas en SEC ID n.° 29 y SEC ID n.° 30, y en la que, en una realización no limitativa ejemplar, dicha proteína ORF4 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 32.

Respectivamente, según otro aspecto dado a conocer, ((B)), el virus PRRS es un virus PRRS, en particular un virus PRRS de genotipo I, cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 con una deleción de 9, 10, 1l o más residuos aminoácidos en la región entre las primeras dos láminas p N-terminales predichas, en comparación con la proteína ORF4 de un virus PRRS de genotipo I de tipo salvaje, en la que dichas primeras dos láminas p N-terminales predichas preferentemente son las dos secuencias de aminoácidos indicadas en SEC ID n.° 25 y SEC ID n.° 26 o preferentemente son las dos secuencias de aminoácidos indicadas en SEC ID n.° 29 y SEC ID n.° 30, y en la que, en una realización no limitativa ejemplar, dicha proteína ORF4 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 32.

Tal como se indica en la presente memoria, con fines comparativos, el virus PRRS de genotipo I de tipo salvaje es preferentemente el virus Lelystad de genotipo I prototipo. El genoma del virus Lelystad está codificado por la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 41.

Según otro aspecto dado a conocer, ((c)), el virus PRRS es un virus PRRS de genotipo II, que comprende una proteína ORF4 con una deleción de 5, 6, 7 o más residuos aminoácidos en la región entre las primeras dos láminas p N-terminales predichas, en comparación con un virus PRRS de genotipo II de tipo salvaje, en el que las primeras dos láminas p N-terminales predichas son preferentemente las dos secuencias de aminoácidos indicadas en SEC ID n.° 27 y SEC ID n.° 28, y en el que dicha proteína ORF4 en un ejemplo no limitativo ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos SEC iD n.° 33.

Respectivamente, según otro aspecto dado a conocer, ((C)), el virus PRRS es un virus PRRS de genotipo II cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 con una deleción de 5, 6, 7 o más residuos aminoácidos en la región entre las primeras dos láminas p N-terminales predichas, en comparación con un virus PRRS de genotipo II de tipo salvaje, en el que las dos primeras láminas p N-terminales predichas son preferentemente las dos secuencias de aminoácidos indicadas en SEC ID n.° 27 y SEC ID n.° 28, y en el que dicha proteína ORF4 en un ejemplo no limitativo ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 33.

Tal como se menciona en la presente memoria, con fines comparativos, el virus PRRS de genotipo II de tipo salvaje es preferentemente el virus VR2332 de genotipo II prototipo. El genoma del virus VR2332 está codificado por la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 42.

En el contexto de la invención, una deleción de residuos aminoácidos es preferentemente una deleción de residuos aminoácidos consecutivos. De esta manera, por ejemplo, una deleción de 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos, tal como se indica en la presente memoria, es preferentemente una deleción de 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos consecutivos y, respectivamente, una deleción de 5, 6, 7 o más residuos aminoácidos, tal como se indica en la presente memoria, es preferentemente una deleción de 5, 6, 7 o más residuos aminoácidos consecutivos.

Según otro aspecto dado a conocer, ((d)), el virus PRRS es un virus PRRS, preferentemente un virus PRRS de genotipo I, que comprende una proteína ORF4 con una deleción de 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos, o preferentemente una deleción de 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 residuos aminoácidos, entre las posiciones de aminoácido 50 a 71, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad, y en la que, en una realización ejemplar no limitativa, una proteína ORF4 con una deleción de 11 residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 50 a 71 es una proteína ORF4 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 34.

Respectivamente, según otro aspecto dado a conocer, ((D)), el virus PRRS es un virus PRRS, preferentemente un virus PRRS de genotipo I, cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 con una deleción de 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos, o preferentemente una deleción de 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 residuos aminoácidos, entre las posiciones de aminoácido 50 a 71, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad, y en la que, en una realización ejemplar no limitativa, una proteína ORF4 con una deleción de 11 residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 50 a 71 es una proteína ORF4 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 34.

Tal como se indica en la presente memoria, la numeración de posiciones de aminoácido referidas al virus Lelystad se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 de longitud completa del virus Lelystad. Por lo tanto, la numeración de las posiciones de aminoácido tal como se menciona en el presente contexto es en referencia a la proteína ORF4 de la proteína Lelystad que presenta 183 residuos aminoácidos, incluyendo un residuo metionina en el extremo N-terminal posición de aminoácido n.° 1.

De esta manera, la expresión "en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad", tal como se utiliza en el contexto de la presente exposición, se refiere a la secuencia de la proteína ORF4 tal como se indica en SEC ID n.° 43.

Según otro aspecto dado a conocer, ((e)), el virus PRRS es un virus PRRS de genotipo II que comprende una proteína ORF4 con una deleción de 5, 6, 7 o más residuos aminoácidos, o preferentemente una deleción de 8, 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos, entre las posiciones de aminoácido 50 a 67, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus PRRS VR2332, y en la que, en una realización ejemplar no limitativa, una proteína ORF4 con una deleción de 7 residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 50 a 67 es una proteína ORF4 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 35.

Respectivamente, según el otro aspecto dado a conocer, ((E)), el virus PRRS es un virus PRRS de genotipo II cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifican una proteína ORF4 con una deleción de 5, 6, 7 o más residuos aminoácidos, o preferentemente una deleción de 8, 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos, entre las posiciones de aminoácido 50 a 67, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus PRRS VR2332, y en la que, en una realización ejemplar no limitativa, una proteína ORF4 con una deleción de 7 residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 50 a 67 es una proteína ORF4 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 35.

Tal como se indica en la presente memoria, la numeración de posiciones de aminoácido referidas al virus PRRS VR2332 se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 de longitud completa del virus PRRS VR2332. Por lo tanto, la numeración de las posiciones de aminoácido tal como se menciona en el presente contexto es en referencia a la proteína ORF4 de la proteína VR2332 que presenta 178 residuos aminoácidos, incluyendo un residuo metionina en el extremo N-terminal posición de aminoácido n.° 1.

De esta manera, la expresión "en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus PRRS VR2332 que presenta 178 residuos aminoácidos", tal como se utiliza en el contexto de la presente exposición, se refiere a la secuencia de la proteína ORF4 tal como se indica en SEC ID n.° 44.

Según otro aspecto dado a conocer, ((f)), el virus PRRS es una combinación de cualquiera de los aspectos (a), (b), (c), (d) y (e), tal como se indican en la presente memoria, preferentemente una combinación de cualquiera de los aspectos (a), (b) y (d), o una combinación de cualquiera de los aspectos (a), (c) y (e). Dentro de este contexto se entiende en particular que la expresión "combinación de cualquiera de (a), (b), (c), (d) y (e)" y "combinación de cualquiera de los aspectos (a), (b), (c), (d) y (e)", respectivamente, se refieren a un virus PRRS que presenta una combinación de las características de cualquiera de los virus PRRS de (a), (b), (c), (d) y (e), tal como se indican en la presente memoria, en el que una combinación de las características de cualquiera de los virus PRRS de los aspectos (a), (b) y/o (c), o una combinación de las características de cualquiera de los virus PRRS de los aspectos (a), (c) y (e) resulta en particular preferente.

Respectivamente, según el otro aspecto dado a conocer, ((F)), el virus PRRS es una combinación de cualquiera de los aspectos (A), (B), (C), (D) y (E), tal como se indican en la presente memoria, preferentemente una combinación de cualquiera de los aspectos (A), (B) y (D), o una combinación de cualquiera de los aspectos (A), (C) y (E). Dentro de este contexto se entiende en particular que la expresión "combinación de cualquiera de (A), (B), (C) y (E)" y "combinación de cualquiera de los aspectos (A), (B), (C), (D) y (E)", respectivamente, se refieren a un virus PRRS que presenta una combinación de las características de cualquiera de los virus PRRS de (A), (B), (C), (E) y (E), tal como se indican en la presente memoria, en el que una combinación de las características de cualquiera de los virus PRRS de los aspectos (A), (B) y/o (D), o una combinación de las características de cualquiera de los virus PRRS de los aspectos (A), (C y (E) resulta en particular preferente.

El virus PRRS de la exposición preferentemente comprende:

• una proteína ORF4 que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 84,5 %, preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95 %, todavía más preferentemente de por lo menos 97 %, y en particular preferentemente de por lo menos 99 %, respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 36, o

• una proteína ORF4 que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 83,5 %, preferentemente de por lo menos 90 %, más preferentemente de por lo menos 95 %, todavía más preferentemente de por lo menos 97 %, y en particular, preferentemente de por lo menos 99 %, respecto a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n° 37, en la que dicho virus PRRS es preferentemente un virus PRRS de genotipo I,

y en el que dicho virus PRRS es, en particular, un virus PRRS de genotipo I.

Tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende en particular que la expresión "identidad de secuencia respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 36" es equivalente a la expresión "identidad de secuencia respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 36 a lo largo de la secuencia SEC ID n.° 36" o la expresión "identidad de secuencia respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 36 a lo largo de la secuencia completa de SEC ID n.° 36", respectivamente.

Además, tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende en particular que la expresión "identidad de secuencia respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 37" es equivalente a la expresión "identidad de secuencia respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 37 a lo largo de la secuencia SEC ID n.° 37" o la expresión "identidad de secuencia respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 37 a lo largo de la secuencia completa de SEC ID n.° 37", respectivamente.

La identidad de secuencia en el contexto de la primera consideración anteriormente indicada se entiende que se basa en la alineación progresiva (Feng, D. F. y Doolittle, R. F. (1987). Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees. J. Mol. Evol., 25(4):351-360). Dicho método se basa en combinar secuencias en alineaciones, que a su vez pueden combinarse con otras secuencias o alineaciones para formar alineaciones más grandes. El procedimiento se repite hasta que se han unido todas las secuencias de entrada en una única alineación múltiple. Para los fines de la presente invención, se determina el porcentaje de identidad de las secuencias con el software CLC MAIN WORKBENCH 4.1.1 (CLC BIO).

En una realización ejemplar y no limitativa, el virus PRRS de la presente exposición es un PRRS de genotipo I cuyo genoma comprende una molécula de ARN codificada por una molécula de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 84,5 %, preferentemente de por lo menos 90 %, más preferentemente de por lo menos 95 %, todavía más preferentemente de por lo menos 97 %, y en particular preferentemente de por lo menos 99 %, respecto a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 38.

Tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende en particular que la expresión "identidad de secuencia respecto a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 38" es equivalente a la expresión "identidad de secuencia respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 38 a lo largo de la secuencia SEC ID n.° 38" o la expresión "identidad de secuencia respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 38 a lo largo de la secuencia completa de SEC ID n.° 38", respectivamente.

Según otro aspecto preferente, el virus PRRS de la presente exposición es capaz de inducir síntomas reproductivos en cerdas gestantes y/o síntomas respiratorios en lechones.

Según un aspecto preferente adicional, el virus PRRS de la presente exposición es capaz de inducir síntomas respiratorios en verracos.

De esta manera, el virus PRRS de la presente exposición es preferentemente un virus PRRS infeccioso.

La expresión "virus PRRS infeccioso" según la invención se entiende particularmente como un virus PRRS que infecta cerdos, causando la enfermedad asociada, el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS).

Dicha infección de cerdo por el virus PRRS de la presente exposición en particular incluye la unión del virus a una célula huésped, la entrada del virus en la célula, el desensamblaje del virión, la replicación y transcripción del genoma vírico, la expresión de proteínas víricas y el ensamblaje y liberación de nuevas partículas víricas infecciosas.

En otro aspecto, la exposición se refiere, además, a un virus PRRS, preferentemente el virus PRRS de la presente exposición, modificado genéticamente para contener en el mismo ARN exógeno, en el que el ARN exógeno se inserta en el gen ORF4 de dicho virus, y en el que preferentemente se inserta el ARN exógeno.

a) en la región del gen ORF4 de dicho virus codificante de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n.° 1-12 o 13-24;

b) en la región del gen ORF4 de dicho virus codificante de la región situada entre las primeras dos láminas p N-terminales predichas, en comparación con la proteína ORF4 de un virus PRRS de genotipo I de tipo salvaje; c) en la región del gen ORF4 de dicho virus codificante de la región situada entre las primeras dos láminas p N -terminales predichas, en comparación con la proteína ORF4 de un virus PRRS de genotipo II de tipo salvaje; d) en la región del gen ORF4 de dicho virus codificante de la región situada entre las posiciones de aminoácido 50 y 71, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad, o

e) en la región del gen ORF4 de dicho virus codificante de la región situada entre las posiciones de aminoácido 50 y 67, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína O^rF4 del virus PRRS VR2332.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ARN exógeno" o "secuencia de ácido nucleico exógena" en particular se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se introdujo en el genoma de un virus PRRS procedente de una fuente externa, tal como de una secuencia recombinante. Los ejemplos de dicha fuente externa comprenden secuencias derivadas del PRRSV, así como secuencias no derivadas del PRRSV. Más en particular, la introducción de la secuencia de ácido nucleico exógena resulta en un genoma o en un gen, respectivamente, que presenta una parte de origen no natural. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ARN exógeno" de esta manera se refiere, en particular, a una secuencia de nucleótidos que no se encuentra naturalmente en el genoma del virus PRRS. Dicha parte de origen no natural o secuencia de origen no natural, respectivamente, también puede ser el resultado de la inserción de una secuencia de nucleótidos de origen no natural en otra secuencia de nucleótido de origen natural.

El ARN exógeno, tal como se indica en la presente memoria, en particular codifica un producto de expresión seleccionado del grupo que consiste en un epítopo de interés, un modulador de la respuesta biológica, un factor de crecimiento, una secuencia de reconocimiento y una proteína de fusión, y en el que dicho epítopo de interés es preferentemente un epítopo de interés procedente de un antígeno o de un patógeno o toxina veterinario.

En una realización preferente de la exposición, dicho epítopo de interés es un péptido codificado por el gen ORF5 del virus PRRS, en el que dicho péptido codificado por el gen ORF5 del virus PRRS en particular comprende o consiste en por lo menos 4 residuos aminoácidos consecutivos de la secuencia indicada en la SEC ID n.° 39 o, más en particular, dicho péptido codificado por el gen ORF5 del virus PRRS comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEC iD n.° 39.

En otra realización preferente de la exposición, dicho epítopo de interés es el ectodominio de la proteína ORF4 (GP4) de una cepa de virus PRRS diferente, en la que dicho ectodominio de GP4 de una cepa de virus PRRS diferente en particular comprende o consiste en por lo menos 4 residuos aminoácidos consecutivos de la secuencia indicada en SEC ID n.° 40 o, más en particular, dicho ectodominio de GP4 de una cepa de virus PRRS diferente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 40.

La exposición proporciona, además, un virus PRRS genéticamente modificado para contener en el mismo ARN exógeno tal como se indica en la presente memoria, para la utilización como medicamento.

La presente exposición proporciona, además, el virus PRRS indicado en la presente memoria para la utilización como virus de reto, en particular en el caso de que dicho virus PRRS induzca inherentemente un efecto vacunador al administrarlo en un animal.

La presente exposición proporciona adicionalmente la utilización del virus PRRS de la presente exposición como virus de reto, en particular en el caso de que dicho virus PRRS no induzca un efecto de vacunación al administrarlo en un animal.

El término "animal", tal como se menciona en la presente memoria, en particular se refiere a porcinos, más particularmente a cerdos, preferentemente cerdos domésticos.

Preferentemente, el virus PRRS debe administrarse, o se administra, respectivamente, por vía intranasal, intramuscular, oral o intrauterina en un animal.

Además, la presente exposición proporciona la utilización del virus PRRS indicado en la presente memoria como marcador de detección, preferentemente para la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DAIV).

Según un aspecto adicional, la exposición se refiere, además, a una molécula de ADN que codifica el virus PRRS indicado en la presente memoria, en el que dicha molécula de ADN es preferentemente una molécula de ADN aislada. Según la exposición, dicha molécula de ADN preferentemente comprende una molécula de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 84,5 %, preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95 %, todavía más preferentemente de por lo menos 97 %, y en particular preferentemente de por lo menos 99 %, respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 38.

Además, en la presente memoria se describe un constructo de ADN que comprende la molécula de ADN, en el que dicho constructo de ADN es, en particular, un vector de ADN, tal como un plásmido. Los vectores o plásmidos de ADN en los que puede insertarse la molécula de ADN de la presente exposición serán reconocidos por el experto ordinario en la materia. El constructo de ADN, tal como se indica en la presente memoria, es preferentemente un constructo de ADN aislado. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "que comprende la molécula de ADN" se entiende en particular que es equivalente a la expresión "que comprende la secuencia de la molécula de ADN".

Además, la presente exposición proporciona un transcrito de ARN del constructo de ADN indicado en la presente memoria, en el que dicho transcrito de ARN es preferentemente un transcrito de ARN aislado.

La presente exposición proporciona, además, una célula transfectada con el constructo de ADN indicado en la presente memoria, en la que dicha célula es preferentemente una célula aislada.

Además, la presente exposición proporciona una célula transfectada con el transcrito de ARN indicado en la presente memoria, en la que dicha célula es preferentemente una célula aislada.

El término "células" o "célula", tal como se menciona en la presente memoria, preferentemente se refiere a células de mamífero, en particular células porcinas o de simio, tales como las células SMA-104, las células MARC-145 o las células Vero, más preferentemente se entiende que el término "células" o "célula" se refiere a las células huésped del virus PRRS, es decir, macrófagos porcinos. Por lo tanto, una célula, tal como se menciona en la presente memoria, se selecciona preferentemente del grupo que consiste en célula porcina, célula de simio, célula MA-104, célula MARC-145, célula Vero y macrófago porcino.

En un aspecto adicional, la exposición proporciona un método para producir el virus PPRS indicado en la presente memoria, en el que el método comprende la etapa de transfectar una célula con el constructo de ADN indicado en la presente memoria y opcionalmente recolectar el virus a partir de la célula y/o el medio.

En otro aspecto, la exposición proporciona un método para producir el virus PPRS indicado en la presente memoria, en el que el método comprende la etapa de transfectar una célula huésped con el transcrito de ARN indicado en la presente memoria y opcionalmente recolectar el virus a partir de la célula y/o el medio.

La producción de las moléculas de ácido nucleico/ADN indicadas en la presente memoria se encuentra comprendida dentro de los conocimientos de la técnica y puede llevarse a cabo de acuerdo con las técnicas recombinantes descritas, entre otros sitios, en Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 2003, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego y Erlich (ed), 1994, PCR Technology, Oxford University Press, New York.

2. Segunda consideración de la presente exposición que no es parte de la presente invención

Según una segunda consideración, que se detalla en la presente sección, la exposición proporciona, en un aspecto, una molécula de ácido nucleico que codifica un virus PRRS de genotipo I y que es capaz de producir virus vivo al transfectarse en células, en la que dicha célula comprende:

• una primera secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95 % respecto a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 45;

• una segunda secuencia de ácido nucleico flanqueante del extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico y que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95 % respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 46;

• una tercera secuencia de ácido nucleico flanqueante del extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico y que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95 % respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 47, y

• una secuencia de nucleótidos poliadenina flanqueante del extremo 3' de la tercera secuencia de ácido nucleico.

Preferentemente,

• dicha primera secuencia de ácido nucleico presenta una identidad de secuencia de por lo menos 96 %, preferentemente por lo menos 97 %, más preferentemente por lo menos 98 %, todavía más preferentemente por lo menos 99 %, y en particular preferentemente de 100 % respecto a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 45 y/o

• dicha segunda secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 96 %, preferentemente de por lo menos 97 %, más preferentemente de por lo menos 98 %, todavía más preferentemente de por lo menos 99 %, y en particular preferentemente de 100 % respecto a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 46 y/o

• dicha tercera secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 96 %, preferentemente de por lo menos 97 %, más preferentemente de por lo menos 98 %, todavía más preferentemente de por lo menos 99 %, y en particular preferentemente de 100 % respecto a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 47 y/o

• dicha secuencia de nucleótidos poliadenina está compuesta de n nucleótidos adenina, en la que 'n' es cualquier número entero entre 1 y 51, y en la que 'n' es preferentemente 12, 13 o 14.

La molécula de ácido nucleico de la presente exposición es preferentemente una molécula de ADN. Preferentemente, dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico aislada.

Dentro del contexto de la presente invención en particular se entiende que la expresión "secuencia de nucleótidos poliadenina" es equivalente a la expresión "secuencia de ácido poliadenílico" o "cola poli(A)", respectivamente. La expresión "uno o más nucleótidos de adenina", tal como se indica en la presente memoria, en particular se entiende que es equivalente a la expresión "uno o más desoxiadenilatos".

La expresión "secuencia de nucleótidos flanqueante del extremo 5' de" tal como se indica en la presente memoria es equivalente, en particular, de la expresión "secuencia de nucleótidos unida covalentemente al extremo 5' de" o, respectivamente, de la expresión "secuencia de nucleótidos, en la que el nucleótido 3'-terminal de la misma está unida covalentemente al nucleótido 5'-terminal de", y en la que se entiende particularmente que dichos dos nucleótidos terminales están unidos covalentemente entre el grupo fosfato unido al carbono 5' de la pentosa y el átomo de carbono 3' de la pentosa contigua.

La expresión "secuencia de nucleótidos flanqueante del extremo 3' de" tal como se indica en la presente memoria es equivalente, en particular, de la expresión "secuencia de nucleótidos unida covalentemente al extremo 3' de" o, respectivamente, de la expresión "secuencia de nucleótidos, en la que el nucleótido 5'-terminal de la misma está unida covalentemente al nucleótido 3'-terminal de", y en la que se entiende particularmente que dichos dos nucleótidos terminales están unidos covalentemente entre el átomo de carbono 3' de la pentosa y el grupo fosfato unido al carbono 5' de la pentosa contigua.

Se entiende particularmente, además, que la expresión "que presenta una identidad de secuencia de 100 % respecto a la secuencia de ácido nucleico de", tal como se utiliza en la presente memoria, es equivalente a la expresión "es idéntica a la secuencia de ácido nucleico de" o a "que consiste en la secuencia de ácido nucleico de", respectivamente.

En un aspecto preferente particular, la molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 99 % respecto a la secuencia de ácido nucleico de la SEC iD n.° 48, o en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una copia de ARN de una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 99 % respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 48.

El término "células" o "célula", tal como se utiliza en la presente memoria, preferentemente se refiere a células de mamífero, en particular células porcinas o de simio, tales como las células SMA-104, las células MARC-145 o las células Vero, más preferentemente se entiende que el término "células" o "célula" se refiere a las células huésped del virus PRRS, es decir, macrófagos porcinos. Por lo tanto, una célula, tal como se menciona en la presente memoria, se selecciona preferentemente del grupo que consiste en célula porcina, célula de simio, célula MA-104, célula MARC-145, célula Vero y macrófago porcino.

La expresión "virus vivo" según la invención se entiende particularmente como un virus PRRS que presenta la capacidad de infectar un sujeto apropiado (al contrario que un virus inactivado (muerto)) y/o cuya infectividad es similar o idéntica a la de un virus nativo. En particular, un virus vivo puede infectar sus células huésped nativas.

Dicha infección de células huésped por el virus PRRS producido por la molécula de ácido nucleico de la presente invención en particular incluye la unión del virus a una célula huésped, la entrada del virus en la célula, el desensamblaje del virión, la replicación y transcripción del genoma vírico, la expresión de proteínas víricas y el ensamblaje y liberación de nuevas partículas víricas infecciosas. Dicha infección de células huésped por el virus PRRS producido por la molécula de ácido nucleico de la presente invención incluye preferentemente, además, la transcripción de la secuencia de ADNc, en particular en células BHK, rindiendo una molécula de ARN funcional, la transfección de células en cultivo, preferentemente células porcinas, células de simio, células MA-104, células MARC-145, células Vero y macrófagos porcinos, con dicha molécula de ARN, la generación de viriones vivos mediante replicación vírica en dichas células en cultivo, el aislamiento de dichos viriones y la infección de células huésped.

En particular, la molécula de ácido nucleico de la presente exposición preferentemente codifica un virus PRRS de genotipo I atenuado o, respectivamente, la molécula de ácido nucleico de la presente invención es capaz de producir virus vivo atenuado al transfectarla en células.

Más particularmente, la molécula de ácido nucleico de la presente exposición codifica un virus PRRS de genotipo I que no es capaz de inducir un síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) en cerdos o, respectivamente, la molécula de ácido nucleico de la presente invención es capaz de producir virus vivo al transfectarlo en células, en las que dicho virus vivo no es capaz de inducir un síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) de tipo salvaje grave en cerdos tal como el causado por los virus PRRS naturales virulentos.

En una realización particular, la molécula de ácido nucleico de la presente exposición codifica un virus PRRS de genotipo I que es capaz de alcanzar títulos de por lo menos 5*105 a 1*106 de dosis infecciosa 50 en cultivo de tejidos (TCID⁵⁰) por mililitro (ml) en 24 horas tras la infección de células MA104, en donde dichas células MA104 se infectan preferentemente con dicho virus a una MDI (multiplicidad de infección) de entre 0,001 y 0,1.

En particular, la molécula de ácido nucleico de la presente exposición codifica un virus PRRS de genotipo I que es capaz de alcanzar títulos de por lo menos 5*106 a 1*107 o superiores de dosis infecciosa 50 en cultivo de tejidos (TCID⁵⁰) por mililitro (ml) en 48 horas tras la infección de células MA104, en donde dichas células MA104 se infectan preferentemente con dicho virus a una MDI (multiplicidad de infección) de entre 0,001 y 0,1.

De esta manera, la molécula de ácido nucleico de la presente exposición preferentemente codifica un virus PRRS de genotipo I que es capaz de

• alcanzar títulos de entre por lo menos 5*105 y 1x106 de dosis infecciosa 50 en cultivo de tejidos (TCID⁵⁰) por mililitro (ml) en 24 horas y/o

• de alcanzar títulos de entre por lo menos 5*106 y 1*107 de dosis infecciosa 50 en cultivo de tejidos (TCID⁵⁰) por mililitro (ml) en 48 horas tras la infección de células MA104

a una MDI (multiplicidad de infección) de entre 0,001 y 0,1, en particular a una MDI de 0,001, 0,01 o 0,1.

En el contexto del virus PRRS tal como se indica en la presente memoria, se entiende que el término "genotipo I" es equivalente a las expresiones "genotipo 1", "tipo 1" o "europeo (UE)", tal como se utilizan frecuentemente en la literatura en el contexto del PRRSV.

La molécula de ácido nucleico de la presente exposición puede comprender una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 99,1 % o 99,2 %, preferentemente de por lo menos 99,3 % o 99,4 %, más preferentemente de por lo menos 99,5 % o 99,6 %, todavía más preferentemente de por lo menos 99,8 % o 99,9 %, y en particular preferentemente de por lo menos 99,95 %, respecto a la secuencia de ácido nucleico indicada en SEC ID n.° 48.

La identidad de secuencias en el contexto de la segunda consideración se entiende que está basada en la similitud determinada por pares entre secuencias de nucleótidos. La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias preferentemente se lleva a cabo mediante la utilización de un algoritmo matemático, en particular el bien conocido algoritmo de Smith-Waterman (Smith y Waterman, M. S. (1981) J. Mol. Biol., 147(1):195-197). Para los fines de la presente exposición, el porcentaje de identidad de secuencia de una secuencia de nucleótidos se determina mediante la utilización del algoritmo de búsqueda de homologías de Smith-Waterman mediante la utilización de una penalización por abertura de hueco de 25 y una penalización por extensión de hueco de 5. El algoritmo de búsqueda de homologías de Smith-Waterman se enseña en Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489. Dicha determinación de la identidad de secuencias puede llevarse a cabo mediante la utilización de, por ejemplo, el acelerador de hardware DeCypher de TimeLogic Version G, o la identidad de secuencia se determina con el software CLC MAIN WORKBENCH 4.1.1 (CLC BIO).

Tal como se utiliza en la presente memoria, en particular se entiende que la expresión "que presenta una identidad de secuencia de por lo menos X % respecto a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° Y" (o, alternativamente, la expresión "que presenta una identidad de secuencia de por lo menos X % respecto a la secuencia de ácido nucleico indicada en SEC ID n.° Y") es equivalente a la expresión "que presenta una identidad de secuencia de por lo menos X % respecto a la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° Y a lo largo de la longitud de SEC ID n.° Y" o la expresión "que presenta una identidad de secuencia de por lo menos X % respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° Y a lo largo de toda la longitud de SEC ID n.° Y", respectivamente. En el presente contexto, "X" es cualquier número entre 95 y 100, en particular cualquier número entero seleccionado de entre 95 y 99, de manera que "X % de identidad de secuencia" representa cualquiera de los porcentajes de identidad de secuencia mencionados en la presente memoria. Respectivamente, "Y" en el presente contexto es cualquier número entero seleccionado de entre 1 y 6, de manera que "SEC ID n.° y" representa cualquiera de las SEC ID n.° mencionados en la presente memoria.

La molécula de ácido nucleico de la presente exposición puede comprender la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 48.

La molécula de ácido nucleico de la presente exposición puede codificar un virus PRRS de genotipo I que no es capaz de inducir síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) en cerdos o, respectivamente, la molécula de ácido nucleico de la presente invención es capaz de producir virus vivo al transfectarlo en células, en las que dicho virus infeccioso no es capaz de inducir síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) en cerdos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "no es capaz de inducir síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS)", en particular, se refiere a una reducción de las manifestaciones clínicas de PRRS o de las manifestaciones asociadas a la infección por PRRSV, respectivamente, tal como lesiones pulmonares en lechones, fracaso reproductivo en cerdas gestantes y/o una viremia de PRRSV prolongada, en comparación con un virus PRRS de tipo salvaje. En un aspecto, el virus p Rr S de genotipo I que no es capaz de inducir PRRS en cerdos es, de esta manera, un virus que muestra uno o más manifestaciones clínicas reducidas al administrarlo en cerdos, en comparación con un virus PRRS de tipo salvaje administrado en cerdos. La expresión "virus PRRS de tipo salvaje", tal como se menciona en la presente memoria, en particular se refiere a un virus PRRS de genotipo I de tipo salvaje.

La presente exposición proporciona, además, un constructo de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico según la exposición, en la que dicho constructo de ADN es, en particular, un vector de ADN, tal como un plásmido. Los vectores o plásmidos de ADN en los que puede insertarse la molécula de nucleótidos de la presente exposición serán reconocidos por el experto ordinario en la materia. El constructo de ADN, tal como se indica en la presente memoria, es preferentemente un constructo de ADN aislado. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "que comprende la molécula de ácido nucleico" o "que comprende una molécula de ADN", respectivamente, se entiende ne particular que es equivalente a la expresión "que comprende la secuencia de la molécula de ácido nucleico" o a "que comprende la secuencia de una molécula de ADN", respectivamente.

De esta manera, la presente exposición proporciona, además, un virus PRRS de genotipo I producido mediante la célula anteriormente indicada, en la que dicho virus PRRS de genotipo I es preferentemente un virus PRRS de genotipo I aislado.

Por lo tanto, la presente exposición proporciona, además, un virus PRRS de genotipo I producido mediante la célula anteriormente indicada, en la que dicho virus PRRS de genotipo I es preferentemente un virus PRRS de genotipo I aislado.

La presente exposición proporciona, además, un virus PRRS de genotipo I cuyo genoma comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención o cuyo genoma comprende una molécula de ARN codificada por una molécula de ácido nucleico de la presente invención, en la que dicho virus PRRS de genotipo I es preferentemente un virus PRRS de genotipo I aislado.

En otro aspecto, la presente exposición proporciona un método para producir un virus PRRS de genotipo I, en el que dicho método comprende transfectar una célula con el constructo de ADN indicado en la presente memoria.

Además, la presente exposición proporciona un método para producir un virus PRRS de genotipo I, en el que dicho método comprende transfectar una célula con el transcrito de ARN mencionado en la presente memoria.

En todavía otro aspecto, la presente exposición proporciona una composición, en la que dicha composición comprende la molécula de ácido nucleico según la invención suspendida en una cantidad adecuada de un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La producción de las moléculas de ácido nucleico indicadas en la presente memoria se encuentra comprendida dentro de los conocimientos de la técnica y puede llevarse a cabo de acuerdo con las técnicas recombinantes descritas, entre otros sitios, en Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 2003, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego y Erlich (ed), 1994, PCR Technology, Oxford University Press, New York.

En todavía otro aspecto, la exposición se refiere, además, a la utilización de la molécula de ácido nucleico según la invención o del constructo de ADN indicado en la presente memoria para producir un virus PRRS de genotipo I atenuado, en el que se introduce una o más mutaciones en la molécula de ácido nucleico o en el constructo de ADN.

La exposición proporciona, además, un método para producir un virus PRRS de genotipo I atenuado, que comprende la etapa de introducir una o más mutaciones en la molécula de ácido nucleico según la invención o en el constructo de ADN indicado en la presente memoria.

La expresión "virus PRRS atenuado", tal como se indica en la presente memoria, en particular se refiere a un virus PRRS que está atenuado in vitro y/o in vivo, más particularmente en líneas celulares susceptibles y/o en el huésped.

El término "huésped", tal como se utiliza en la presente memoria, en particular se refiere a animales infectables por el virus PRRS, en particular porcinos, más particularmente cerdos, tales como cerdos domésticos.

Tal como se indica en la presente memoria, el término "atenuado" se refiere particularmente a una virulencia reducida de un patógeno, en particular de un virus PRRS de tipo salvaje, en el que "virulencia" se entiende que es el grado de patogenicidad, y en el que "patogenicidad" se refiere a la capacidad del patógeno de inducir signos clínicos en el huésped o en la progenie del huésped, tal como el fracaso reproductivo.

La expresión "virus PRRS de tipo salvaje" o "PRRSV de tipo salvaje", respectivamente, tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren en particular a un virus PRRS patogénico infeccioso, que en particular es capaz de causar PRRS en porcinos. En una realización preferente particular, la expresión "virus PRRS de tipo salvaje" se refiere a un virus PRRS cuyo genoma comprende una secuencia de ARN o consiste en un polinucleótido de ARN, en el que dicha secuencia de ARN o polinucleótido de ARN es una copia de ARN de SEC ID n.° 41 (correspondiente al genoma completo del virus Lelystad).

Preferentemente, la mutación o mutaciones, tal como se indica en la presente memoria, comprende o consiste en una o más mutaciones puntuales y/o una o más deleciones genómicas y/o una o más inserciones.

La exposición proporciona, además, la utilización del virus PRRS de genotipo I atenuado indicado en la presente memoria para la preparación de un medicamento, en particular de una vacuna o composición de vacuna, destinado a prevenir en un animal las manifestaciones clínicas de una infección por PRRSV, tal como la reducción de las manifestaciones clínicas de una infección por PRRSV, p. ej., la reducción de la duración de la viremia de PRRSV.

El término "prevención" o "reducción", respectivamente, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere, aunque sin limitación, a un procedimiento que incluye la administración de un antígeno de PRRSV, es decir, del virus PRRS de genotipo I atenuado indicado en la presente memoria, en un animal, en el que dicho antígeno de PRRSV, al administrarlo en dicho animal, induce, o es capaz de inducir, una respuesta inmunitaria en dicho animal contra el PRRSV. En general, dicho tratamiento resulta en la reducción de las manifestaciones clínicas de PRRS o de las manifestaciones asociadas a la infección por PRRSV. Más específicamente, el término "prevención", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere de manera general a un procedimiento de profilaxis en el que se expone un animal a la composición inmunogénica de la presente invención antes de la inducción o aparición del proceso patológico (PRRS).

En la presente memoria, "reducción de las manifestaciones clínicas de una infección por PRRSV" se refiere, aunque sin limitación, a reducir el número de sujetos infectados en un grupo, a reducir o eliminar el número de sujetos que muestran manifestaciones clínicas de infección, o a reducir la gravedad de cualesquiera manifestaciones clínicas que estén presentes en los sujetos, en comparación con la infección por virus PRRS de tipo salvaje. Por ejemplo, debe referirse a cualquier reducción de la carga de patógenos, excreción de patógenos, reducción de la transmisión de patógenos, o reducción de cualquier manifestación clínica de infección por PRRSV, en particular de fracaso reproductivo y/o la inducción de lesiones pulmonares. Preferentemente, dichas manifestaciones clínicas están reducidas en los sujetos que reciben el virus PRRS de genotipo I atenuado de la presente invención por lo menos en 10 % en comparación con los sujetos que no reciben la composición y pueden resultar infectados. Más preferentemente, los signos clínicos están reducidos en sujetos que reciben la composición de la presente invención en por lo menos 20 %, preferentemente en por lo menos 30 %, más preferentemente en por lo menos 40 %, todavía más preferentemente en por lo menos 50 %, todavía más preferentemente en por lo menos 60 %, todavía más preferentemente en por lo menos 70 %, todavía más preferentemente en por lo menos 80 %, todavía más preferentemente en por lo menos 90 %, y lo más preferentemente en 100 %.

El término "sujeto", tal como se ha mencionado en la presente memoria, en particular se refiere a un animal.

La expresión "reducir la duración de la viremia de PRRSV" se refiere, aunque sin limitación, a la reducción de la duración de la entrada del virus PRRS en el torrente sanguíneo de un animal por como mínimo un día en comparación con sujetos que no han recibido la composición y resultan infectados por un PRRSV de tipo salvaje.

El término "viremia" se refiere a la presencia del PRRSV en la sangre de los animales infectados según indica, p. ej., la detección de copias de ARN del PRRSV en el suero sanguíneo.

Además, la invención se refiere a una composición de vacuna que comprende el virus PRRS de genotipo I atenuado indicado en la presente memoria, suspendido en una cantidad adecuada de un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

El portador o portadores, o excipiente o excipientes, farmacéuticamente aceptables, tal como se mencionan en la presente memoria, se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en solventes, medios de dispersión, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la adsorción.

En un aspecto preferente, la composición inmunogénica de la exposición comprende una cantidad de entre 101 y 107 partículas víricas del virus PRRS de genotipo I atenuado que se indica en la presente memoria, preferentemente entre 103 y 106 partículas, en cada dosis, más preferentemente entre 104 y 106 partículas en cada dosis.

En otro aspecto preferente, la composición inmunogénica de la exposición comprende una cantidad del virus PRRS según la invención que es equivalente a un título de virus de por lo menos aproximadamente 103 TCIÜ50/ml en cada dosis, preferentemente de entre 103 y 105 TCIÜ50/ml en cada dosis.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "composición de vacuna" en particular se refiere a una composición que inducirá una respuesta inmunitaria protectora en un animal que ha sido expuesto a la composición. Una respuesta inmunitaria puede incluir la inducción de anticuerpos y/o la inducción de una respuesta de células T.

Habitualmente, una "respuesta inmunitaria" incluye, aunque sin limitación, uno o más de los efectos siguientes: producción o activación de anticuerpos, células B, células T ayudantes, células T supresoras y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente contra un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará una respuesta inmunitaria (de memoria) terapéutica o protectora, de manera que se potencia la resistencia a la nueva infección y/o se reduce la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demuestra por una reducción del número o gravedad, o la falta, de una o más de las manifestaciones asociadas a las infecciones por el patógeno, en el retraso de la aparición de viremia, en una persistencia vírica reducida, en una reducción de la carga vírica total y/o en una reducción de la excreción vírica.

De esta manera, una "respuesta inmunitaria" en particular se refiere, aunque sin limitación, al desarrollo en un subgrupo de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos contra la composición o vacuna de interés.

Además, la exposición se refiere a la utilización de la composición de vacuna de la invención para la utilización en un método de prevención de la aparición en un animal de las manifestaciones clínicas de una infección por el PRRSV, tal como mediante la reducción de las manifestaciones clínicas de una infección por PRRSV, p. ej., la reducción de la duración de la viremia de PRRSV.

Además, la exposición proporciona un método para prevenir en un animal las manifestaciones clínicas de una infección por el PRRSV, tal como mediante la reducción de las manifestaciones clínicas de una infección por PRRSV, p. ej., la reducción de la duración de la viremia de PRRSV, en la que dicho método comprende la etapa de administrar la vacuna de la invención en un animal que lo necesita.

3. Tercera consideración de la presente exposición que no es parte de la presente invención

Según una tercera consideración, que se detalla en la presente sección, la invención se basa en el resultado de que la primera consideración puede combinarse con la segunda consideración de la presente exposición. De esta manera, la tercera consideración se relaciona con una combinación de: (1) los aspectos y realizaciones de la primera consideración de la presente exposición, y (2) los aspectos y realizaciones de la segunda consideración de la presente exposición. Por lo tanto, se entiende que todas las posibles características y definiciones, en particular las características y definiciones relacionadas con un virus PRRS de genotipo I, de la primera consideración de la presente exposición pueden combinarse arbitrariamente con todas las características y definiciones de la segunda consideración de la presente exposición.

En un aspecto, la molécula de ácido nucleico según la segunda consideración de la presente exposición codifica, de esta manera, el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) según la primera consideración de la presente exposición.

En otro aspecto, respectivamente, el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) según la primera consideración de la presente exposición está codificado, de esta manera, por la molécula de ácido nucleico según la segunda consideración de la presente exposición.

Por lo tanto, también se refleja la combinación de todos los posibles aspectos de la primera consideración de la presente exposición con todos los posibles aspectos de la segunda consideración de la presente exposición.

La exposición se refiere, además, a un virus PRRS de genotipo I, en particular al virus PRRS anteriormente mencionado, cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que codifica un virus PRRS de genotipo I y que es capaz de producir virus vivos al transfectarlo en células, en el que dicha molécula comprende una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 91 % o 92 %, preferentemente de por lo menos 93 % o 94 %, más preferentemente de por lo menos 95 % o 96 %, todavía más preferentemente de por lo menos 98 % o 99 %, y en particular preferentemente de por lo menos 99 % o 100 %, respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 48, pero en la que dicha secuencia de ácido nucleico contiene una mutación que resulta en la producción de dichos virus, que comprende una proteína oRF4 con una deleción de 9, 10, 11 o más residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 50 y 71, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad.

La exposición se refiere, además, a un virus PRRS de genotipo I, cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que codifica un virus PRRS de genotipo I y que es capaz de producir virus vivos al transfectarlo en células, en el que dicha molécula comprende una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 91 % o 92 %, preferentemente de por lo menos 93 % o 94 %, más preferentemente de por lo menos 95 % o 96 %, todavía más preferentemente de por lo menos 98 % o 99 %, y en particular preferentemente de por lo menos 99 % o 100 %, respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 48, pero en la que dicha secuencia de ácido nucleico contiene una mutación que resulta en la producción de dichos virus, que comprende una proteína ORF4 con una deleción de 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 50 y 71, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad.

La exposición contempla, además, un virus PRRS de genotipo I, cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que codifica un virus PRRS de genotipo I y que es capaz de producir virus vivos al transfectarlo en células, en el que dicha molécula comprende una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 91 % o 92 %, preferentemente de por lo menos 93 % o 94 %, más preferentemente de por lo menos 95 % o 96 %, todavía más preferentemente de por lo menos 98 % o 99 %, y en particular preferentemente de por lo menos 99 % o 100 %, respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 48, pero en la que dicha secuencia de ácido nucleico contiene una mutación que resulta en la producción de dichos virus, que comprende una proteína ORF4 con una deleción de 13 residuos aminoácidos entre las posiciones de aminoácido 56 y 70 o entre las posiciones de aminoácido 57 y 69, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad.

La mutación, tal como se indica en la presente memoria, es preferentemente una deleción.

Preferentemente, el virus PRRS de la exposición se modifica genéticamente para que contenga en el mismo ARN exógeno, en el que el ARN exógeno se inserta en el gen orf4 de dicho virus, y en el que el ARN exógeno se inserta, en particular, en la región del gen orf4 de dicho virus que codifica la región situada entre las posiciones de aminoácido 50 y 71, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad.

En otro aspecto de la exposición, el ARN exógeno se inserta en el gen orf4 del virus y sustituye la secuencia de nucleótidos codificante de los residuos aminoácidos delecionados dentro del contexto de la exposición.

Según un aspecto adicional de la exposición, el ARN exógeno codifica un producto de expresión seleccionado del grupo que consiste en un epítopo de interés, un modulador de la respuesta biológica, un factor de crecimiento, una secuencia de reconocimiento y una proteína de fusión, y en el que el epítopo de interés es preferentemente un epítopo de interés procedente de un antígeno o de un patógeno o toxina veterinario.

En particular, el epítopo de interés es un péptido codificado por el gen orf5 del virus PRRS o es una secuencia de aminoácidos codificada por el gen orf5 del virus PRRS, en el que dicha secuencia peptídica o de aminoácidos codificada por el gen orf5 del virus PRRS preferentemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 39 o SEC ID n.° 50, o preferentemente comprende o consiste en por lo menos 4 residuos aminoácidos consecutivos de la secuencia indicada en SEC ID n.° 39 o SEC ID n.° 50, o preferentemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 51 o SEC ID n.° 52.

Según otro aspecto de la exposición, el ARN exógeno codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n.° 53-55.

En un aspecto preferente particular, la invención proporciona un virus PRRS de genotipo I, cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en una cualquiera de las SEC ID n.° 49, 56, 57 y 58.

El virus PRRS, tal como se menciona en la presente memoria, es preferentemente un virus aislado y/o un virus de origen no natural.

La exposición se refiere, además, a un virus PRRS de genotipo I, en el que dicho virus comprende una proteína ORF4 que presenta un residuo de prolina en la posición de aminoácido 56 y/o que presenta un residuo de glutamina en la posición de aminoácido 66, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad, y en la que la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad es la secuencia indicada en SEC ID n.° 43.

La exposición se refiere, además, a un virus PRRS de genotipo I, cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 que presenta un residuo de prolina en la posición de aminoácido 56 y/o que presenta un residuo de glutamina en la posición de aminoácido 66, en la que la numeración de las posiciones de aminoácido se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF4 del virus Lelystad, y en la que el genoma de dicho virus está codificado preferentemente por una molécula de ácido nucleico, en la que dicha molécula comprende una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 91 % o 92 %, preferentemente de por lo menos 93 % o 94 %, más preferentemente de por lo menos 95 % o 96 %, todavía más preferentemente de por lo menos 98 % o 99 %, y en particular preferentemente de por lo menos 99 % respecto a la ^{secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 45 o SEC}I^{d n.° 48.}

Dicho virus PRRS de genotipo I, cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 que presenta un residuo de prolina en la posición de aminoácido 56 es, en un aspecto no limitativo ejemplar, un virus PRRS, cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 58.

En otro aspecto no limitativo ejemplar, dicho virus PRRS de genotipo I, cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ORF4 que presenta un residuo de glutamina en la posición de aminoácido 66 es, es un virus PRRS, cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico SEC ID n.° 57.

El virus PRRS de la exposición es preferentemente para la utilización como medicamento o para la utilización en la profilaxis o el tratamiento del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, en particular en porcinos, y en el que opcionalmente dicho virus debe administrarse, o se administra, respectivamente, por vía intranasal, intramuscular, oral o intrauterina en un animal, en particular en un cerdo.

El medicamento al que se hace referencia en toda la presente exposición es preferentemente una vacuna.

Según otro aspecto, el virus PRRS de la invención se utiliza preferentemente como un marcador de detección, preferentemente para la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DAIV).

En un aspecto todavía adicional, la invención se refiere a una molécula de ADN que codifica el virus PRRS de la invención, y en el que dicha molécula de ADN comprende una molécula de ácido nucleico que presenta una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC iD n.° 49, 56, 57 y 58.

En un aspecto todavía adicional, la invención se refiere a un constructo de ADN preferentemente aislado que comprende dicha molécula de ADN y a un transcrito de ARN de la misma preferentemente aislado. Según todavía otro aspecto, la invención se refiere, además, a una célula preferentemente aislada que está transfectada con dicho constructo de ADN o dicho transcrito de ARN.

La exposición se refiere, además, a un método para producir el virus PRRS de la invención, en el que dicho método comprende la etapa de transfectar una célula con dicho constructo de ADN o comprende la etapa de transfectar una célula huésped con dicho transcrito de ARN.

En conclusión, el conocimiento de que es posible insertar una deleción en la medida de la presente exposición en la secuencia codificante del ectodominio de GP4 de un virus PRRS, tal como PRRSV de genotipo I, ahora proporciona varios usos beneficiosos:

• El virus basado en dicho conocimiento puede utilizarse como un aislado de reto para la infección parenteral, oral, intranasal o intrauterina y para la infección mediante esperma en una especie positiva para PRRSV, nunca expuesta a PRRSV y/o sensible a PRRSV.

• La exposición proporciona marcadores de deleción para la diferenciación sérica o para la diferenciación por secuencia (concepto DAIV) de cada cepa PRRSV concebible, respecto a cepas de PRRSV de genotipo II, con independencia de si ya hay presentes deleciones en el sitio respectivo o no.

• Además, se proporcionan marcadores de deleción para la diferenciación sérica también en relación o en combinación con otros epítopos. Por ejemplo, los virus PRRS sin deleción podrían distinguirse serológicamente de los virus PRRS con una deleción total o parcial de dichos epítopos (p. ej., Lelystad GP4 aa60-aa71; AAQEKISFGKS tal como se incluye en la SEC ID n° 43) mediante la utilización de anticuerpos dirigidos contra dicho epítopo. Por ejemplo, podrían diferenciarse dos virus PRRS con una deleción en dicha región/dominio uno respecto a otro junto con otros epítopos.

La exposición proporciona, además, una región/dominio de inserción para la introducción de "ARN foráneo en lugar del a Rn vírico en la posición, en donde está localizada la deleción según la invención (ectodominio de GP4)".

La inserción puede llevarse a cabo con diversos fines y para cualquier cepa de PRRSV concebible, también para cepas de PRRSV del genotipo II que ya presentan una pequeña deleción en esta región.

La inserción de la secuencia foránea puede tener lugar en, p. ej., la cepa BI EU del PRRSV de genotipo I indicada en la presente memoria, y sustituir la secuencia codificante del ectodominio de GP4 de dicha cepa por la secuencia de aminoácidos (aa) aa54-aa70 (QSHRASTAQGTTPLRRS (SEC ID n.° 40)) o con derivados acortados o mutagenizados de la misma.

Además, para la mejora de la respuesta inmunitaria también resulta posible insertar en secuencia uno o más epítopos de célula T o D,

a) de otras regiones génicas/genómicas del PRRSV, p. ej., de: (i) la región codificante de la glucoproteína 5 (aa) de la cepa BI EU del PRRSV de genotipo I indicada en la presente memoria, p. ej., secuencias codificantes de los aminoácidos (aa) aa36-aa52 (SSHLQLIYNLTICELNG (SEC ID n.° 39)) o para derivados acortados o mutagenizados de la misma, también con uno o más conectores adecuados, por ejemplo con el motivo de aminoácidos GG; de acuerdo con lo anterior, también otros aislados del PRRSV, p. ej., el aislado del prototipo de PRRSV de genotipo I Lelystad o, correspondientemente, de otros genotipos de PRRSV, tal como, p. ej., del aislado de prototipo VR2332 de PRRSV de genotipo II;

b) de otros patógenos, p. ej., de otro patógeno porcino, para establecer o potenciar la respuesta inmunitaria contra dicho patógeno o patógenos;

c) de epítopos de células T o B no específicos de PRRSV como marcador genético o sérico positivo, también en combinación con a);

d) de inmunopotenciadores diferentes de a), p. ej., citoquinas, tales como, por ejemplo, interleuquinas, también en combinación con b).

Para la mejora de la respuesta inmunitaria también resulta posible insertar en secuencia uno o más epítopos de célula T o B para la reducción de la patogenicidad del virus.

Ejemplos

Ejemplo 1

a) Aislamiento de PRRSV

Se aisló el PRRSV a partir de muestras de sangre (bS-720789) con resultado previamente positivo en una PCR de detección de PRRSV de tipo UE. El aislamiento del virus se llevó a cabo en células MA104. Tras la propagación del PRRSV de tipo EU aislado en células MA104, se preparó una solución concentrada de virus para la secuenciación del genoma completo mediante ultracentrifugación en un colchón de sacarosa, seguido de tratamiento con ARNasa y ADNasa. Finalmente, se extrajo el ARN vírico a partir de la solución concentrada de virus y se sometió a secuenciación del genoma completo (plataforma 454 de Roche). La secuencia genómica obtenida (14.854 nucleótidos) se comparó con la secuencia genómica de referencia de tipo UE de cepa Lelystad, revelando una deleción de 33 nucleótidos en ORF4.

b) Infección

La infección de verracos con el virus de a) provoca manifestaciones clínicas graves de PRRS.

Ejemplo 2

a) Generación y caracterización de un nuevo clon de ADNc infeccioso del PRRSV de tipo UE

El presente ejemplo describe la generación y caracterización de un nuevo clon de ADNc infeccioso de PRRSV de tipo UE que se denomina "BI EU" a continuación. El clon BI EU se basa, aunque no es idéntico, a una cepa atenuada de PRRSV de tipo UE y que es idéntica al 89 % a nivel de nucleótidos al virus Lelystad de la cepa prototipo de tipo UE o idéntica al 87 % a la inserción de ADNc de PRRSV del clon de ADNc infeccioso de PR^rS^vde tipo UE LoN94-13 (documento n.° WO 2013017568 A1) respectivamente. La secuencia de ADNc de BI EU se proporciona en SEC ID n.° 48.

Se recuperaron virus vivos a partir del clon de ADNc BI EU después de la transfección de transcritos con caperuza sintéticos en células BHK21 y posterior transferencia del sobrenadante de cultivo de las células transfectadas a células MA104 sensibles a PRRSV. Era detectable un fuerte efecto citopático (CPE) en los 3 a 4 días después de la transferencia del sobrenadante de cultivo celular a partir de células BHK21 transfectadas a células MA104 (figura 1A). Tras la tinción de las células con el anticuerpo monoclonal específico de proteína de cápside del PRRSV, SDOW17 (Rural Technologies), podía detectarse una señal fuerte en las células MA104 positivas para CPE (figura 1B), pero no en las células que recibieron sobrenadantes de células BHK21 transfectadas simuladamente (no mostradas).

Para someter a ensayo el crecimiento del virus derivado del clon de ADNc BI EU, se infectaron células MA104 con el virus recuperado utilizando una multiplicidad de infección (MDI) de 0,001, 0,01 o 0,1, respectivamente. Se recogieron los sobrenadantes de las células infectadas 0, 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección y se determinaron los títulos víricos mediante diluciones víricas en serie en placas de 96 pocillos que contenían células MA104. La curva de crecimiento resultante para los virus recuperados a partir de BI EU se muestra en la figura 2.

Con independencia de la MDI utilizada para la infección de células MA104, el virus BI EU alcanzó títulos de entre 5*105 y 1*106 de dosis infecciosa en cultivo tisular 50 (TCID⁵⁰) por mililitro (ml) en las 24 horas posteriores a la infección. Los títulos alcanzaron un pico 48 horas después de la infección, con 1*106 a 1*107 TCID50/ml, demostrando una replicación altamente eficiente del virus BI EU en las células MA104.

Este resultado permite utilizar BI EU como una plataforma para la investigación de vacunas para PRRSV, p. ej., como una de entre muchas aplicaciones, con el fin de investigar las interacciones de PRRSV con las respuestas inmunitarias del huésped a la infección vírica.

b) Utilización del nuevo clon de ADNc infeccioso de PRRSV de tipo UE en la investigación de vacunas para PRRS

La respuesta inmunitaria específica a la infección por PRRSV caracterizada por una inducción retardada de los anticuerpos neutralizantes (López y Osorio, 2004) y una respuesta inmunitaria celular corta (Xiao et al., 2004). Se acepta comúnmente que estos efectos pueden atribuirse en parte, junto con la presentación de epítopos señuelo (Ostrowski et al., 2002; Ansari et al., 2006) y la protección con glicanos de las proteínas de la cubierta vírica (Ansari et al., 2006), a la inhibición vírica del sistema inmunitario innato del huésped. se ha demostrado que la infección por el PRRSV no induce, o lo hace débil o con retardo, la producción de interferón de tipo I (IFN) (interferón-a e interferónp; (Miller et al., 2004)) o IFN de tipo II (interferón-y; (Meier et al., 2003)) en líneas celulares susceptibles (macrófagos alveolares pulmonares porcinos, células renales de mono MARC-145) y/o cerdos (Buddaert et al., 1998).

Los IFN desempeñan un papel importante en el establecimiento de una respuesta inmunitaria adaptativa eficaz contra las infecciones víricas, por lo que muchos virus han desarrollado estrategias para contrarrestar la inducción del sistema inmunitario innato del huésped (Haller y Weber, 2009). Con el fin de identificar el antagonista o antagonistas previstos de IFN del PRRSV, algunos análisis amplios de cribado basados en líneas celulares que expresan establemente genes de interés o sobre células transfectadas con plásmidos expresantes de proteínas han identificado varias proteínas no estructurales (nsps, por sus siglas en inglés) del PRRSV, incluyendo nsp1 (ver posteriormente), nsp2 (Beura et al., 2010; Li et al., 2010), nsp4 (Beura et al., 2010) y nsp11 (Beura et al., 2010; Shi et al., 2011a) que participan en el bloqueo de la inducción de IFN de tipo I.

La proteína nsp1 está situada en el extremo N-terminal de la poliproteína 1a derivada de ORF1a del PRRSV y se procesa para formar dos subunidades multifuncionales: nspla y nsp1p, cada una de las cuales contiene un dominio de cisteína proteasa similar a papaína (PCP, por sus siglas en inglés) esencial para la autoliberación de la poliproteína vírica (den Boon et al., 1995; Chen et al., 2010). nspla contiene un dominio de dedo de cinc N-terminal y el dominio de proteasa PCPa, mientras que nsp1p contiene PcPp. Para ambas subunidades de nspl, nspla y nsplp, se ha resuelto la estructura cristalina tridimensional (Sun et al., 2009; Xue et al., 2010). Según dichos análisis, nsplp consiste en un dominio N-terminal (NTD), un dominio de conector (LKD), el dominio PCP (PCP-beta) y una extensión C-terminal (CTE, por sus siglas en inglés) (Xue et al., 2010). El corte C-terminal mediado por nsplp de nspl respecto de nsp2 ocurre en el sitio WYG/AGR en las cepas de EE. UU. de PRRSV (Kroese et al., 2008) o se predice que ocurre en el sitio WYG/AAG para las cepas UE de PRRSV (Chen et al., 2010), mientras que el corte de nspla/nsplp ocurre en el sitio ECAM/AxVYD para las cepas de EE. UU. de PRRSV o se predice que ocurre en el sitio EEAH/SxVYR para las cepas UE de PRRSV (Chen et al., 2010).

Varios estudios han demostrado en detalle de mecanismo que nsp1 de PRRSV y/o sus subunidades derivadas del autoclave, nsp1a y/o nsp1p, inhiben la producción de IFN de tipo I mediante interferencia en la transcripción del IFN (Song et al., 2010; Kim et al., 2010; Chen et al., 2010; Beura et al., 2010). Además, se ha demostrado que nsp1p interfiere con la respuesta celular al interferón (señalización de interferón) (Chen et al., 2010). Además, se ha demostrado que la infección por PRRSV inhibe la producción de IFN-a y/o IFN-p en las células infectadas por PRRSV in vitro (Kim et al., 2010; Beura et al., 2010); se ha demostrado la localización subcelular de (subunidades de) nsp1 (Song et al., 2010; Chen et al., 2010) y aspectos de mecanismo de la inhibición de IFN de tipo I que han sido obtenidos por otros a partir de experimentos de expresión de proteínas individuales han sido confirmados en células infectadas por PRRSV (Shi et al., 2010). Finalmente, un estudio de mutagénesis de nsp1 basado en la expresión de la proteína nsp1 ha investigado los efectos sobre la inhibición del IFN vírico (Shi et al., 2011b).

Anteriormente se han generado cepas (UE) de PRRSV viables (tal como se indica en el documento n.° WO 2013017570 A1) que contenían mutaciones (deleciones) en el gen nsp1p que inducen la producción de IFN de tipo I (IFN-p) en células susceptibles (MARC145) y que son sensibles al IFN de tipo I (IFN-p).

Con el fin de someter a ensayo si podían generarse dichos mutantes víricos, y otros diferentes, inductores de IFN basándose en el nuevo clon infeccioso BI EU, se diseñó un grupo de virus que portaba deleciones en el gen nsp1p. Más exactamente, se localizaron dichas deleciones en el dominio N-terminal (NTD) de nsp1p, que se ha demostrado que resulta necesario para la homodimerización de la proteína (Xue et al., 2010). La figura 3 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de nsp1p de varias cepas de tipo EE. UU. y UE del PRRSV. Se indican los aminoácidos que se predice que forman cadenas (azul) o hélices alfa (rojo).

Se generaron diez mutantes por deleción de nsp1p basándose en el clon de ADNc infeccioso BI EU. Las deleciones incluían aminoácidos que se predecía no participaban en la formación de cadenas beta o hélices alfa y que se encontraban conservadas (parcialmente) dentro de las cepas de tipo UE de PRRSV analizadas en la alineación (marco en rojo en la figura 3).

Las deleciones introducidas en el gen de nsp1 p se visualizan en la alineación de secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 4. Los mutantes por deleción de BI EU-nsp1p se denominan BI EU-nsp1p-delALEV, BI EU-nsp1p-delEV, BI EU-nsp1p-delLEVL, BI EU-nsp1p-delLE, BI EU-nsp1p-deIDD, BI EU-nsp1 p-deISDDS, BI EU-nsp1p-deIHH, BI EU-nsp1p-deIGRSR, BI EU-nsp1p-delRSR y BI EU-nsp1p-delSDGRSR, respectivamente.

Con el fin de someter a ensayo la viabilidad de los mutantes por deleción de nsp1 p, se transfectaron en células BHK21 transcritos sintéticos de ADNc de BI EU que portaban la deleción respectiva. Tras la transferencia de sobrenadante de cultivo celular procedente de células transfectadas en células MA104 susceptibles al PRRSV, eran detectables efectos citopáticos (CPE) y tinción de inmunofluorescencia específica de nucleocápside indicativos de viabilidad del PRRSV mutante en nueve de los diez mutantes por deleción de nsp1 p generados (no mostrados). Estos resultados demuestran que, con la excepción de BI EU-nsp1p-delLEVL, todos los mutantes por deleción de nsp1p eran viables. Con el fin de analizar adicionalmente si los mutantes por deleción de nsp1p podían cultivarse hasta títulos elevados en células MA104 competentes para IFN, se llevaron a cabo curvas de crecimiento esencialmente tal como se ha indicado anteriormente para el virus BI EU. En resumen, se infectaron células MA104 con uno de los nueve mutantes por deleción de nsp1p o el virus BI EU a modo de control. Se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular 0, 24, 48, 72 y 93 horas después de la infección y se titularon en células MA104 en placas de 96 pocillos. Se calcularon los títulos víricos basándose en los pocilios positivos para CPE. La figura 5 muestra el resultado de dos experimentos independientes y demuestra que los mutantes por deleción BI EU-nsp1p pueden cultivarse en células MA104 tan eficientemente como el virus Bl EU parental. Se observaron títulos pico de entre 5*106 y 1x107 TCIÜ50/ml 48 horas después de la infección.

A continuación, se analizó si las deleciones introducidas en el gen nsplp en efecto podían anular la actividad antagonista de IFN de la proteína nsplp. Por lo tanto, se midieron los niveles de IFN-1 p en muestras de 100 pl recogidas 0, 24, 48, 72 y 93 horas después de la infección durante todo el experimento de curva de crecimiento indicado anteriormente, utilizando un ELISA comercial específico para el IFN-p humano (Invitrogen). Según el fabricante, dicho ELISA también puede aplicarse a la detección de IFN-p de primate no humano y funciona bien con muestras de células MA104 que son células renales de mono verde epiteliales (ver la figura 6). Para la cuantificación de los resultados obtenidos, se incluyó una curva de calibración utilizando un control positivo del fabricante del ELISA.

Los niveles medidos de IFN-p en los sobrenadantes de células MA104 infectadas por uno de los nueve mutantes por deleción de nspl p viables o por el virus BI EU parental y obtenidos en dos experimentos independientes se muestran en la figura 6.

Tal como se esperaba, BI EU bloqueó eficientemente la secreción de IFN-p durante todo el curso de la infección, lo que se atribuye a uno o más antagonistas de IFN vírico funcionales. Podían detectarse cantidades pequeñas o nulas de IFN-p en el sobrenadante de cultivo celular 0, 24 y 48 horas después de la infección con los diversos mutantes por deleción de BI EU-nsp1p. Sin embargo, en tiempos posteriores, algunos mutantes eran incapaces de inhibir la expresión de IFN-p en células MA104 infectadas, indicando un detecto en la actividad antagonista de IFN de nsplp. Resulta interesante que este defecto variaba significativamente entre los nueve mutantes por deleción BI EU-nsp1p analizados. Mientras que la mayoría de los mutantes indujo niveles de IFN-p inferiores a 50 unidades internacionales (UI) por 100 pl de sobrenadante de cultivo celular, el mutante BI EU-nsp1p-deIALEV era totalmente incapaz de antagonizar la expresión de IFN-p en las células MA104 infectadas. Las cantidades de IFN-p medidas 72 y 93 horas después de la infección incluso excedían el límite del ensayo ELISA, que se había fijado en -200 UI por 100 pl. Este resultado muestra claramente que la actividad antagonista de IFN de la proteína nsplp puede anularse mediante deleción de los aminoácidos A³⁰LEV³³en el clon de ADNc infeccioso BI EU.

Conjuntamente estos resultados muestran que se generó un nuevo clon de ADNc infeccioso de PRRSV de tipo UE que puede cultivarse eficientemente hasta títulos de 1*107 TCID50/ml en células MA104 renales de mono verde. Basándose en dicho clon, se generaron nueve mutantes de BI EU-nsp1p viables que portaban deleciones en el NTD de nsplp que se ha demostrado que resulta necesario para la homodimerización de la proteína (Xue et al., 2010). Todos estos mutantes pudieron cultivarse hasta títulos elevados en células MA104. Todos los mutantes BI EU-nsp1pdeIALEV, BI EU-nspip-delEV, BI EU-nspip-deILE, BI EU-nsp1 p-deISDDS, BI EU-nsp1p-deIGRSR, BI EU-nspipdeIRSR y BI EU-nsp1p-deISDGRSR indujeron la secreción de IFN-p en tiempos posteriores de la infección, lo que contrasta agudamente con el virus BI EU parental. De entre dichos siete mutantes, los cuatro mutantes BI EU-nsp1pdeIALEV, BI EU-nsplp-delEV, BI EU-nsp1p-deILE, and BI EU-nsp1p-deISDDS representan una nueva clase de mutantes que no ha sido descrita anteriormente en el documento n.° WO 2013017570 A1. En particular, la infección con el mutante BI EU-nsp1p-deIALEV indujo cantidades extremadamente elevadas de IFN-p en células MA104, lo que lleva a la conclusión de que este virus es gravemente defectuoso en el bloqueo de la inducción de IFN de tipo I.

Este resultado tiene fuertes implicaciones para el desarrollo de una vacuna para el PRRSV, ya que puede suponerse que la respuesta inmunitaria del huésped natural contra PRRSV puede potenciarse significativamente mediante la introducción de deleciones, p. ej., mediante deleción de los aminoácidos A ³⁰LEV³³en la proteína nsplp de las cepas de PRRSV de genotipo I.

Los mutantes por deleción de nsplp indicadas en dicha referencia, solos o en combinación con otras mutaciones atenuantes, constituyen candidatos prometedores para vacunas de PRRSV vivas atenuadas.

Ejemplo 3

a) Introducción de una deleción dentro de la proteína ORF4 del clon de ADNc infeccioso de PRRSV de tipo UE, BI EU

Se sometió a ensayo si una deleción, tal como se ha indicado según la primera consideración de la presente invención, podía introducirse en el gen ORF4 de cualquier cepa de virus PRRS sin afectar negativamente a la replicación del virus. Por lo tanto, se introdujo una deleción en la región genómica codificante del ectodominio de la proteína ORF4 entre las posiciones de aminoácido 50 y 71 del clon de ADNc infeccioso de PRRSV de tipo UE, BI EU (que comprende la secuencia SEC ID n.° 48). La deleción dentro de la proteína ORF4 de BI EU incluía los aminoácidos 57 a 69 (tal como se codifican en la SEC ID n.° 49).

Con el fin de someter a ensayo la viabilidad del mutante por deleción de ORF4, se transfectó en células BHK21 un transcrito sintético del ADNc de BI EU que portaba la deleción. Después de la transferencia de sobrenadantes de cultivo celular procedentes de células trasfectadas en células MA104 sensibles a PRRSV, pudo detectarse un efecto citopático (CPE) en los 3 a 4 días posteriores a la transferencia de los sobrenadantes de cultivo de las células BHK21 transfectadas a las células MA104. Tras la tinción de las células con el anticuerpo monoclonal específico de proteína de cápside del PRRSV, SDOW17 (Rural Technologies), pudo detectarse una señal fuerte en las células MA104 positivas para CPE, pero no en las células que recibieron sobrenadantes de células BHK21 transfectadas simuladamente (no mostradas). Estos resultados muestran que el mutante por deleción BI EU-ORF4 era viable. A continuación el virus mutante recuperado se denomina BI EU-GP5-36-46-ctr (comparar con el Ejemplo b).

Con el fin de analizar adicionalmente si BI EU-GP5-36-46-ctr podía cultivarse hasta títulos elevados en células MA104, se realizó un estudio de la cinética de crecimiento. Por lo tanto, se infectaron células MA104 con el virus recuperado y con el virus BI EU parental a modo de control utilizando una multiplicidad de infección (MDI) de 0,01. Se recogieron los sobrenadantes de las células infectadas 0, 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección y se determinaron los títulos víricos mediante diluciones víricas en serie en placas de 96 pocillos que contenían células MA104. La figura 7 muestra el resultado de tres experimentos independientes y demuestra que los mutantes por deleción BI EU-GP5-36-46-ctr pueden cultivarse en células MA104 tan eficientemente como el virus BI EU parental. Se observaron títulos pico de ~1 *107 TCID50/ml para ambos virus 48 horas después de la infección.

Conjuntamente estos resultados muestran que la deleción de los aminoácidos 57 a 69 en la proteína ORF4 no influye negativamente sobre el crecimiento de BI EU, indicando que la variación de la secuencia dentro de esta región resulta bien tolerada por PRRSV in vitro. Concluyendo a partir de estos resultados, la región situada entre las posiciones de aminoácido 50 y 71 de la proteína BI EU ORF4 también podría utilizarse como sitio de inserción para secuencias exógenas.

b) Utilización del sitio de deleción de la proteína ORF4 para la inserción de ARN exógeno: inserción de la secuencia de epítopo neutralizante de proteína ORF5 de PRRSV en el gen ORF4 del clon de ADNc infeccioso BI EU.

El presente ejemplo describe la inserción de un ARN exógeno en la región situada entre las posiciones de aminoácido 50 y 71 de la proteína ORF4 de BI EU. El ARN exógeno en el presente ejemplo codifica el epítopo neutralizante situado dentro de la proteína ORF4 del virus PRRS (Ostrowski, M. et al.) y consiste en los aminoácidos 1 a 11 de la SEC ID n.° 39. Se seleccionó dicha secuencia (SEC ID n.° 51) para la inserción en el ectodominio de la proteína ORF4 con el fin de incrementar la accesibilidad del epítopo neutralizante de ORF5 en un potencial candidato a vacuna que proporcione respuestas inmunitarias mejoradas en los animales vacunados.

Para generar el virus recombinante, se introdujo la secuencia exógeno en el sitio de deleción de ORF4 indicado en el Ejemplo a) y se sustituyeron los aminoácidos 57 a 69 de la proteína ORF4 de BI EU por los aminoácidos 1 a 11 de la SEC ID n.° 39 (que representa los aminoácidos 36 a 46 en la proteína ORF5 de las cepas de PRRSV de tipo 2) flanqueada por un conector G-G. La inserción resultó en una secuencia final de Gly57-Ser-Ser-His-Leu-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asn-Leu-Thr-Gly69 (SEC ID n.° 53) en la proteína ORF4 de BI EU. El virus recombinante que incluía la inserción se denomina BI EU-GP5-36-46 (que comprende la secuencia SEC ID n.° 56) a continuación.

Con el fin de someter a ensayo si podía recuperarse BI EU-GP5-36-46, se transfectó en células BHK21 un transcrito sintético de ADNc de BI EU que incluía la mutación. El virus recombinante pudo rescatarse mediante el mismo método que el indicado anteriormente. Podía observarse un efecto citopático (CPE) en los 3 a 4 días posteriores a la transferencia de sobrenadantes de cultivo de células BHK21 transfectadas a células MA104 sensibles al PRRSV. Además, era detectable una tinción específica de proteína de cápside del PRRSV en las células MA104 positivas para CPE, pero no en las células que habían recibido sobrenadantes de células BHK21 transfectadas simuladamente (no mostradas).

Se llevó a cabo una cinética del crecimiento con el fin de someter a ensayo si el virus recombinante podía cultivarse ^{hasta títulos elevados. Por lo tanto, se infectaron células MA104 con BI EU-GP5-36-46 y con el virus}B^{i EU parental a}modo de control utilizando una multiplicidad de infección (MDI) de 0,01. Se recogieron los sobrenadantes de las células infectadas 0, 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección y se determinaron los títulos víricos mediante diluciones víricas en serie en placas de 96 pocillos que contenían células MA104. Los resultados de tres experimentos independientes se ilustran en la figura 7. A las 48 horas de la infección, el virus mutante BI EU-GP5-36-46 alcanzó el mismo título pico de ~1*107 TCID50/ml que el virus BI EU parental, mostrando que la secuencia insertada en la proteína ORF4 no influye negativamente sobre el crecimiento vírico de título elevado.

Unos experimentos adicionales con células MA104 revelaron que la secuencia de ARN exógeno se mantenía establemente a lo largo de múltiples pases. Los análisis de secuenciación demostraron la estabilidad del inserto durante todos los pases analizados. Resulta interesante que podía detectarse una única mutación de nucleótido, de adenina a timina, que resultaba en un intercambio de aminoácido, de His a Pro, en la posición 56 cadena arriba del sitio de inserción después del pase 1, en experimentos independientes. Por lo tanto, se insertó dicha mutación adicional en BI-EU-GP5-36-46 mediante genética inversa. Para generar este virus recombinante, se introdujo la secuencia exógena en el sitio de deleción de ORF4 indicado en el Ejemplo a) y se sustituyeron los aminoácidos 56 a 69 de la proteína ORF4 de BI EU por los aminoácidos 1 a 11 de la SEC ID n.° 39 (que representa los aminoácidos 36 a 46 en la proteína ORF5 de las cepas de PRRSV de tipo 2) flanqueados N-terminalmente por la secuencia de aminoácidos PG y flanqueados C-terminalmente por un conector G. La inserción resultó en una secuencia final de Pro56-Gly-Ser-Ser-His-Leu-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asn-Leu-Thr-Gly69 (SEC ID n.° 55) en la proteína ORF4 de BI EU. El virus recombinante resultante se denomina BI EU-GP5-36-46-AtoC (que comprende la secuencia SEC ID n.° 58) a continuación. La cinética de crecimiento, ilustrada en la figura 7, demuestra que BI EU-GP5-36-46-AtoC podía cultivarse hasta títulos similares a los de BI-EU-GP5-36-46 y BI EU de tipo salvaje, respectivamente.

Con el fin de someter a ensayo si las secuencias derivadas de ORF5 en la región codificante de ectodominio de ORF4 en BI EU-GP5-36-46-AtoC podían hacer que el virus mutante fuese más sensible a la neutralización del suero, se llevaron a cabo ensayos de neutralización sérica (SNT, por sus siglas en inglés). Se planteó que la mayor accesibilidad del epítopo neutralizante derivado de ORF5 insertado que estaba situado en el ectodominio de la proteína ORF4 podía resultar en una mayor sensibilidad del virus recombinante a la acción de anticuerpos neutralizantes, en comparación con el virus BI EU parental.

Para los SNT, los sueros de seis cerdas madre obtenidos 48 días después de la vacunación con virus de tipo salvaje BI EU se diluyeron en serie y se mezclaron con BI EU-GP5-36-46-AtoC o con BI EU de tipo salvaje.

Tras la incubación durante una hora a 37°C y 5 % de CO², se añadieron células MA104 a las muestras. Se determinaron los títulos séricos cuatro días después basándose en el CPE inducido por el virus no neutralizado. Los sueros obtenidos de los mismos animales antes de la vacunación sirvieron como controles negativos (no mostrados). Los valores medios y las desviaciones estándar de dos experimentos independientes se ilustran en la figura 8.

Pudo demostrarse que BI EU-GP5-36-46-AtoC era consistentemente más sensible a la neutralización in vitro que el virus BI EU de tipo salvaje, a pesar de variaciones detectables entre los seis animales analizados. Los títulos séricos medidos para BI EU-GP5-36-46-AtoC eran 3 a 15 veces más altos que los títulos determinados para el virus BI EU parental (figura 8). Los datos obtenidos de un experimento diferente sugieren, además, que los títulos séricos para BI EU-GP5-36-46-AtoC podrían ser incluso más incrementables mediante la generación de una mutación en el sitio de N-glucosilación (aminoácido N⁹de la SEC ID n.° 39) presente en la secuencia derivada de ORF5, de Asng a Glng (SEC ID n.° 50 y 52), ya que la N-glucosilación protege naturalmente al epítopo neutralizante de ORF5 ((Ansari et al., 2006) y datos no mostrados). En resumen, los resultados ilustrados en la figura 8 indican fuertemente que el epítopo neutralizante derivado de ORF5 insertado en el ectodominio de la proteína ORF4 es altamente accesible en el virus recombinante BI EU-GP5-36-46-AtoC, convirtiendo a este último en un candidato prometedor para una vacuna. La mayor sensibilidad demostrada en sueros que contenían anticuerpos neutralizantes específicos de PRRSV debería permitir una eliminación más rápida y una mayor seguridad del virus de vacuna.

Además, podría esperarse que los anticuerpos neutralizantes específicos del PRRSV sean inducidos a niveles más altos y más precozmente en lechones o cerdas madre que han sido vacunadas con BI EU-GP5-36-46-AtoC en comparación con animales que han sido vacunados con el virus BI EU parental. La inducción temprana de los anticuerpos neutralizantes después de la vacunación debería resultar en una eliminación más rápida y, por lo tanto, en menor expulsión del virus de la vacuna (mayor seguridad) y en una respuesta inmunitaria más eficiente tras la infección natural con PRRSV (mayor eficacia).

Por lo tanto, el virus recombinante BI EU-GP5-36-46-Atoc representa un candidato prometedor para una vacuna viva atenuada para el PRRSV con seguridad y eficacia incrementadas.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: A. El virus infeccioso recuperado a partir del clon de ADNc de BI EU indujo un fuerte CPE en las células MA104, observado mediante microscopía de campo brillante. B. Tinción de inmunofluorescencia (IF) específica de proteína de cápside de PRRSV en células MA104 infectadas por BI EU.

Figura 2: crecimiento de virus recuperado a partir del clon de ADNc infeccioso BI EU en células MA104.

Figura 3: alineación de secuencia de aminoácidos del dominio N-terminal (NTD) de nspl p de varias cepas de EE. UU. (tipo II, parte superior) y UE (tipo I, parte inferior) del PRRSV. La secuencia de aminoácidos del NTD de BI EU se muestra abajo de todo de la figura. Los aminoácidos R22, PR24, E32, SFP y H52 se indican sobre la alineación y se ha mostrado que resultan cruciales para la homodimerización de nsplp (Xue et al., 2010). Las regiones diana para la mutagénesis de nsp1p se muestran dentro de un marco rojo. El motivo SDGRSR corresponde a la región indicada en el documento n.° WO 2013017570 A1 utilizando el clon de ADNc LoN94-13 del virus de tipo EU PRRSV.

Figura 4: alineación de la secuencia de aminoácidos de los mutantes por deleción de BI-EU-nspI p.

Figura 5: crecimiento de los mutantes por deleción de BI EU-nsp1p en células MA104 competentes para IFN. Figura 6: niveles de IFN-p medidos en diferentes tiempos en el sobrenadante de cultivo de células MA104 infectadas con los mutantes por deleción de BI-EU-nspl p o con el virus BI-EU parental.

Figura 7: cinética de crecimiento de virus BI EU recombinantes que portaban deleciones o inserciones en la proteína ORF4.

Figura 8: ensayos de neutralización sérica del virus recombinante BI EU-GP5-36-46-AtoC y del virus BI EU parental.

En el listado de secuencias:

Las SEC ID n.° 1-24 corresponden a secuencias del ectodominio de la proteína ORF4 del PRRSV con una deleción; SEC ID n.° 25 y SEC ID n.° 26 corresponden a secuencias de las primeras dos láminas p N-terminales predichas de la proteína Or F4 del PRRSV (genotipo I);

SEC ID n.° 27 y SEC ID n.° 28 corresponden a secuencias de las primeras dos láminas p N-terminales predichas de la proteína Or F4 del PRRSV;

SEC ID n.° 29 y SEC ID n.° 30 corresponden a secuencias de las primeras dos láminas p N-terminales predichas de la proteína Or F4 del PRRSV (genotipo I);

SEC ID n.° 31 y SEC ID n.° 32 corresponden a secuencias de las primeras dos láminas p N-terminales predichas de la proteína Or F4 del PRRSV;

SEC ID n.° 32 corresponde a una secuencia (parcial) de una proteína ORF4 del PRRSV (genotipo I) con una deleción de 11 residuos aminoácidos en la región entre las primeras dos láminas p N-terminales predichas; SEC ID n.° 33 corresponde a una secuencia (parcial) de una proteína ORF4 del PRRSV (genotipo II) con una deleción de 7 residuos aminoácidos en la región entre las primeras dos láminas p N-terminales predichas;

SEC ID n.° 34 corresponde a una secuencia del ectodominio de una proteína ORF4 del PRRSV (genotipo I) con una deleción de 11 residuos aminoácidos;

SEC ID n.° 35 corresponde a una secuencia del ectodominio de una proteína ORF4 del PRRSV (genotipo II) con una deleción de 7 residuos aminoácidos;

SEC ID n.° 36 corresponde a una secuencia (parcial) de una proteína ORF4 del PRRSV (genotipo I) con una deleción de 11 residuos aminoácidos (y que incluye la secuencia SEC ID n.° 34, respectivamente);

SEC ID n.° 37 corresponde a una secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia SEC ID n.° 36;

SEC ID n.° 38 corresponde a una secuencia de nucleótidos codificante de un PRRSV de genotipo I cuyo genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia SEC ID n.° 36;

SEC ID n.° 39 corresponde a la secuencia de un péptido codificado por el gen ORF5 del virus PRRS;

SEC ID n.° 40 corresponde a la secuencia de un péptido codificado por el gen ORF5 del virus PRRS;

SEC ID n.° 41 corresponde al genoma completo del virus Lelystad;

SEC ID n.° 42 corresponde al genoma completo del virus VR2332;

SEC ID n.° 43 corresponde a la secuencia de la proteína ORF4 del virus Lelystad;

SEC ID n.° 44 corresponde a la secuencia de la proteína ORF4 del virus VR2332;

SEC ID n.° 45 corresponde a la primera secuencia de ácido nucleico tal como se indica en la presente memoria; SEC ID n.° 46 corresponde a la segunda secuencia de ácido nucleico tal como se indica en la presente memoria, que flanquea el extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico;

SEC ID n.° 47 corresponde a la tercera secuencia de ácido nucleico tal como se indica en la presente memoria, que flanquea el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico;

SEC ID n.° 48 corresponde a la inserción de ADNc vírico completo de BI EU;

SEC ID n.° 49 corresponde a la secuencia SEC ID n.° 48 con una deleción, codificante de esta manera de una proteína ORF4 con una deleción de 13 aa (aa 57-69);

SEC ID n.° 50 corresponde a la secuencia SEC ID n.° 39 con la sustitución N->Q en la posición 9;

SEC ID n.° 51 corresponde a una secuencia de aa 1-11 de SEC ID n.° 39;

SEC ID n.° 52 corresponde a la secuencia SEC ID n.° 51 con la sustitución N->Q en la posición 9;

SEC ID n.° 53 corresponde a la secuencia SEC ID n.° 51 con un conector Gly-Gly;

SEC ID n.° 54 corresponde a la secuencia SEC ID n.° 52 con un conector Gly-Gly;

SEC ID n.° 55 corresponde a la secuencia SEC ID n.° 53 con un residuo de prolina N-terminal;

SEC ID n.° 56 corresponde a la secuencia SEC ID n.° 49 con una inserción, codificante de esta manera de la secuencia SEC ID n.° 53;

SEC ID n.° 57 corresponde a la secuencia SEC ID n.° 49 con una inserción, codificante de esta manera de la secuencia SEC ID n.° 54;

SEC ID n.° 58 corresponde a la secuencia SEC ID n.° 48 con una deleción, codificante de esta manera de una proteína ORF4 con una deleción de 14 aa (aa 56-69), en la que está incluido un inserto codificante de la secuencia SEC ID n.° 55.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) de genotipo I cuyo genoma está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.° 49, 56, 57 y 58.

2. Virus según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico comprende la secuencia SEC ID n.° 49.

3. Virus según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico comprende la secuencia SEC ID n.° 56.

4. Virus según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico comprende la secuencia SEC ID n.° 57.

5. Virus según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico comprende la secuencia SEC ID n.° 58.

6. Vacuna que comprende el virus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que opcionalmente comprende, además, un excipiente farmacéuticamente aceptable, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en: un solvente, un medio de dispersión, un adyuvante, un agente estabilizante, un diluyente, un conservante, un agente antibacteriano, un agente antifúngico, un agente isotónico y un agente retardante de la adsorción.

7. Vacuna según la reivindicación 6, en la que la vacuna comprende entre 104 y 106 partículas del virus en cada dosis.

8. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 para la utilización en un método de tratamiento y/o profilaxis del PRRS en cerdos.

9. Vacuna para la utilización según la reivindicación 8, en la que la vacuna se administra por una vía intranasal, intramuscular, oral o intrauterina.

10. Vacuna para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en la que la administración induce una respuesta inmunitaria protectora contra el PRRS en cerdos que reduce y/o previene los síntomas del PRRS.

11. Vacuna para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que el ácido nucleico comprende la secuencia SEC ID n.° 56 o la secuencia SEC ID n.° 58.

12. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la utilización como un marcador de detección para la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DAIV).

13. Molécula de ácido nucleico, que codifica el virus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

14. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13, en la que dicha molécula es una molécula de ADN.

15. Constructo de ADN que comprende la molécula de ADN según la reivindicación 14.

16. Transcrito de ARN del constructo de ADN según la reivindicación 15.

17. Célula que comprende el constructo de ADN según la reivindicación 15 o el transcrito de ARN según la reivindicación 16.

18. Composición que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14 suspendido en una cantidad adecuada de un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.