KR102335864B1 - 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스 및 이를 이용한 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백신으로 사용할 수 있는 돼지생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스의 키메라 바이러스에 관한 것이다. 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스는 모균주보다 약독화되어 있어 병원성이 낮고 안정성이 높으면서, 중화항체의 분비를 향상시켜 PRRS 질환의 효과적인 예방 및 치료용 백신으로 사용할 수 있다.

Description

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스 및 이를 이용한 백신{Chimeric strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and antiviral vaccines including the same}

본 발명은 백신으로 사용할 수 있는 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 키메라 바이러스에 관한 것으로, 본 발명의 키메라 바이러스는 모균주에 비해 병원성이 낮고 안전성이 높다. 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스는 교차면역과 관련된 중화항체의 분비를 향상시키며, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군을 효과적으로 방어할 수 있는 백신을 제공할 수 있다.

돼지 생식기 및 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, 이하 PRRS)은 돼지 써코바이러스 감염증 및 구제역과 함께 국내 양돈산업에 가장 큰 피해를 주는 전염병에 해당한다. PRRS는 임신한 암퇘지의 생식 불능, 유산이나 조산, 사산의 번식장애를 유발하며, 젖먹이 돼지와 비육돈에게 재채기, 발열 등의 호흡기 증상을 유발한다. 일반적으로 바이러스에 이환된 이후 세균 등의 2차 감염에 의해 심한 호흡기 증상을 야기하지만, 만성적으로 감염된 경우에는 특징적인 임상 증상 없이 증체량 감소 및 폐사율의 증가를 나타나게 된다.

이 바이러스 질환은 미국에서 1987년에 최초로 발견되었고, 이어서 유럽에서 발견되었으며, 1990년대 초에 아시아에서 동정되었다. 지금까지, PRRS는 양돈국가에서 풍토병의 특징을 가지며 세계적으로 확산되어, 매년 막대한 경제적 손실을 일으켰다.

PRRS의 원인이 되는 병원체는 Arterivirus 속, Arteriviridae 과, Nidovirales 목에 속하는 PRRS 바이러스이다. PRRS 바이러스는 positive-sense single stranded RNA genome을 갖고 있으며, 크기는 약 15.4 kilobase이다. PRRS 바이러스의 genome은 9개의 ORF를 갖고 있다(Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993). 그 중 비구조단백질(Non Structural Protein, NSP)을 코딩하는 ORF1a 및 ORF1b가 바이러스 지놈의 약 80%를 차지하고 있다(Bautista et al., 2002; Meulenberg et al., 1993; Snijder and Meulenberg, 1998, 2001). 상기 비구조단백질 중 NSP1-alpha, NSP-1 beta, NSP2 내지 NSP8은 ORF1a에, NSP9 내지 NSP12는 ORF1b에 위치하는 것으로 알려져 있다. 글리코실화된 구조 단백질인 GP2, GP3, GP4, GP5와, 비글리코실화된 막(Membrane, M) 단백질, 뉴클레오캡시드 (N) 단백질은 나머지 20%를 차지하는 ORF2-7에 의하여 코딩된다. minor 구조단백질인 GP2, GP3, GP4가 heterotrimer를 형성하여 바이러스가 숙주 세포 내로 침입할 때 작용하며, major 구조단백질인 GP5, M은 heterodimer를 형성하여 바이러스의 감염력을 높여주는 작용을 한다.

PRRS 바이러스는 RNA 바이러스의 특성상 변이가 심하여 바이러스 간에 차이가 많이 난다. PRRS 바이러스는 크게 북미형과 유럽형으로 나뉜다. 유럽형을 대표하는 타입 I형(Lelystad virus, LV) 및 북미형 바이러스주(Northern American strain) ATCC VR2332를 대표하는 타입 II 형(VR2332의 게놈 서열은 GenBank 등록번호 AY150564 참조)(Murtaugh et al., Arch Virol. 1995; 140:1451-1460) 이 있다.

북미형과 유럽형 간에는 최대 40%까지 유전자 차이가 존재하여 서로 교차 방어가 되지 않는 것으로 알려져 있다. 또한 같은 타입에 속하는 변이주 간에도 교차 방어가 되지 않는 경우가 많다(Meng, X. J. et al., 2000). 이로 인해, 각각에 대해 표준 변이주 기반의 백신은 제작되어 있지만 교차 방어능이 좋지 못하기 때문에 PRRS를 효과적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다. 이를 극복하기 위하여 안전성, 면역원성, 및 방어능을 효과적으로 갖춘 백신을 제작하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있다.

이 같은 질병의 심각성 때문에 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)의 원인체인 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 발견한 이후, 약 20년 동안 이 바이러스에 대한 예방법을 개발하기 위하여 많은 노력이 투자되었음에도 아직까지 효과적인 예방법 및 관리법이 개발되지 않은 실정이다. 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV) 제어를 위해 불활화 백신과 약독화 생백신 등 다양한 백신이 개발되었으나, 오직 감염성이 확보된 약독화 백신만이 만족스러운 수준의 방어 효과를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)가 유전적으로 매우 다양하게 존재하기 때문에 다양한 바이러스 종류간의 교차면역이 부재하여 하나의 백신으로 다양한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 방어하기는 어렵다. 또한 현재 약독화 백신은 다른 동물 종의 세포 주에서 100~200 계대 이상의 연속 계대를 통해서만 생산이 가능하므로 개발 기간이 길고 효능과 안전성의 보장이 어려운 문제가 있다. 이로 인해 각각에 대해 표준 변이주 기반의 백신은 제작되어 있지만 교차 방어능이 좋지 못하기 때문에 PRRS를 효과적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다.

이를 극복하기 위하여 안전성, 면역원성, 및 방어능을 효과적으로 갖춘 백신을 제작하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있다(출원번호 제10-2011-7004020호, 발명의 명칭: 고병원성 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(HP PRRS)에 대한 백신).

본 발명은 병원성이 낮고 안정성이 높으며, 중화항체의 분비를 향상시킨 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 키메라 바이러스, 이를 포함하는 백신, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

일 예에서, 상기 키메라 바이러스는

(1) 수탁번호 KCTC 13394BP의 LMY ver2 변이주에서 유래한 ORF1a 및 ORF1b의 핵산 서열 또는 이와 기능적 동등성을 유지하면서 상기 핵산 서열과 70% 이상 서열 상동성을 갖는 핵산 서열, 및

(2) 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 분리주의 ORF2 내지 ORF7 부위의 핵산 서열 또는 이와 기능적 동등성을 유지하면서 상기 핵산 서열과 70% 이상 서열 상동성을 갖는 핵산 서열

을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 백신으로 사용할 수 있는 돼지생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스의 키메라 바이러스에 관한 것이다. 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스는 모균주보다 약독화되어 있어 병원성이 낮고 안정성이 높으며, 교차면역이 가능한 중화항체의 분비를 향상시킴으로써 돼지의 면역력을 현저히 증진시킨다. 이에, PRRS 질환의 효과적인 예방 및 치료용 백신으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.

본 명세서에 사용된 "약독화된 바이러스"는 PRRS 질환의 임상 징후를 유발하지 않고 표적 포유동물에서 면역반응을 유발할 수 있는 무독성 바이러스를 의미하기도 하고, 또한 약독화된 바이러스로 감염되고 약독화된 바이러스를 투여받지 못한 동물에서 임상 징후의 발생빈도를 낮추거나, 징후의 중증도가 비-약독화된 PRRS 바이러스로 감염된 "대조군" 동물에 비해 감소된 것을 의미하기도 한다. 이러한 상황에서, "감소/감소된"이란 용어는 앞에서 정의한 대조군에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 더욱 바람직하게는 50%, 가장 바람직하게는 100% 이상의 감소를 의미한다.

본 명세서에 사용된 "백신 조성물"은 PRRS 키메라 바이러스 또는 이의 임의의 면역원성 단편 또는 분획, 바람직하게는 약독화된 PRRS 키메라 바이러스, 예컨대 상기 본 발명의 PRRS 키메라 바이러스일 수 있다. 이는 숙주의 "면역학적 반응"을 PRRSV에 대한 세포 및/또는 항체 매개의 면역 반응으로 유발한다. 백신 조성물은 PRRSV 감염 및 이와 관련된 임상 징후들에 대해 예방 면역을 부여할 수 있는 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용된 "면역 반응"은 상기 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스, 또는 이를 포함하는 백신 조성물을 투여받은 동물에게 투여된 키메라 바이러스 또는 백신에 대한 임의의 세포- 및/또는 항체-매개의 면역 반응을 의미한다. 보통, "면역 반응"은 다음과 같은 효과 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다: 당해 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 γδ T 세포의 생산 또는 활성화. 숙주는 면역원성 조성물이나 백신을 투여받지 않은 대조군에 비해 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질환의 임상 중증도가 감소되도록 치료적 또는 예방적 면역학적 반응을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 예방은 최대 전술한 숙주 감염과 관련된 증상들의 결여 및 이를 비롯하여 빈도 또는 중증도의 감소에 의해 증명될 것이다.

본 명세서에 사용된 "돼지들", "돼지" 및 "새끼돼지"는 호환 사용될 수 있다.

"백신을 접종하다"는 PRRS 질환에 노출되기 전에 본 명세서에 기술된 PRRSV 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신을 투여하는 것을 의미한다.

"예방하다" 또는 "예방"은 본 발명의 PRRSV 바이러스 또는 이를 포함하는 백신조성물을 투여받은 결과로서, PRRS의 임상의 발생 빈도, 징후의 중증도 또는 빈도가 감소하는 것을 의미한다. 중증도 또는 빈도의 감소는 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신조성물을 투여받지 않은 동물 또는 동물 그룹과 비교한 결과이다. 상기 동물은 바람직하게는 돼지일 수 있다.

본 명세서의 염기 서열은 편의를 위해 DNA 뉴클레오타이드를 기준으로 기재되었으며, 폴리뉴클레오타이드의 종류가 RNA인 경우에는 염기서열 내 모든 또는 일부 티민(Thymine, T)이 우라실(Uracil, U)로 치환된 서열을 의미한다.

본 명세서에서 특정 염기서열 및/또는 아미노산 "서열로 구성되는"은 상기 서열을 포함하는, 상기 서열을 필수적으로 포함하는, 및/또는 상기 서열로 이루어지는을 모두 포함하며, 필요에 따라 적절히 치환하여 사용될 수 있다.

본 발명은 돼지에 영향을 미치는 바이러스 질환인 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRSV)에 대해 약독화된 키메라 바이러스를 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 구조식 1의 구조를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다:

[구조식 1]

5'-[X]-[Y]-3'

상기 식에서, [X]는 수탁번호 KCTC 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1 유전자 (NSP1-alpha 유전자 및 NSP1-beta 유전자)의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 동등한 기능이 유지되는 범위 내에서 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 예를 들어 LMY ver2 변이주의 NSP1 유전자의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 동등한 기능이 유지되는 범위 내에서 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 ORF1a 및 ORF1b 부위의 유전자의 핵산 서열 또는 상기 ORF1a 및 ORF1b 부위의 유전자의 핵산 서열과 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열이며, 상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위의 유전자 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 동등한 기능이 유지되는 범위 내에서 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열이다. 본 명세서에 사용된 바로서, 상기 "동등한 기능"은 목적하는 기능과 질적(활성) 및/또는 양적(수준)으로 동일 또는 유사한 기능을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 아미노산 서열이 야생형 유전자가 암호화하는 단백질의 아미노산 서열과 동일한 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 [X]는 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 NSP1 유전자의 핵산 서열에서, 상기 NSP1 유전자에 의해 암호화되는 NSP1 단백질의 아미노산 서열이 동일하게 유지되는 범위 내에서 발생하는 모든 종류의 점 돌연변이 (침묵 돌연변이)를 포함할 수 있으며, 예를 들어 NSP1 유전자의 CBP 수치를 낮추기 위한 목적 범위에서 자유롭게 선택되어 사용될 수 있다.

예를 들어, 상기 [X]는 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 NSP1 유전자의 핵산 서열에서, 222번 위치, 225번 위치, 237번 위치, 240번 위치, 252번 위치, 306번 위치, 309번 위치, 312번 위치, 315번 위치, 324번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 333번 위치, 336번 위치, 339번 위치, 342번 위치, 345번 위치, 357번 위치, 363번 위치, 366번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 381번 위치, 393번 위치, 396번 위치, 543번 위치, 546번 위치, 549번 위치, 555번 위치, 558번 위치, 561번 위치, 573번 위치, 579번 위치, 582번 위치, 588번 위치, 612번 위치, 618번 위치, 621번 위치, 627번 위치, 633번 위치, 639번 위치, 654번 위치, 673번 위치, 675번 위치, 678번 위치, 681번 위치, 684번 위치, 705번 위치, 708번 위치, 729번 위치, 735번 위치, 738번 위치, 741번 위치, 744번 위치, 747번 위치, 771번 위치, 786번 위치, 789번 위치, 792번 위치, 810번 위치, 825번 위치, 828번 위치, 838번 위치, 840번 위치, 846번 위치, 849번 위치, 858번 위치, 867번 위치, 879번 위치, 882번 위치, 885번 위치, 891번 위치, 900번 위치, 903번 위치, 906번 위치, 924번 위치, 936번 위치, 939번 위치, 948번 위치, 954번 위치, 963번 위치, 966번 위치, 1026번 위치, 1029번 위치, 1038번 위치, 1047번 위치, 1053번 위치, 1066번 위치, 1068번 위치, 1086번 위치, 및 1110번 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 25 이상, 66 이상, 80 이상 또는 91개 전체 위치의 염기가 치환된 변이일 수 있다.

일 예에서, 상기 [X]는 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 NSP1 유전자의 핵산 서열에서, 222번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 225번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 237번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 240번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 252번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 306번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 309번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 312번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 315번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 324번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 327번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 330번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 333번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 336번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 339번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 342번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 345번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 357번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 363번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 366번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 378번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 379번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 381번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 393번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 396번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 543번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 546번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 549번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 555번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 558번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 561번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 573번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 579번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 582번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 588번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 612번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 618번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 621번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 627번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 633번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 639번 위치의 T가 G로 치환된 변이, 654번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 673번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 675번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 678번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 681번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 684번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 705번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 708번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 729번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 735번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 738번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 741번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 744번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 747번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 771번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 786번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 789번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 792번 위치의 T가 G로 치환된 변이, 810번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 825번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 828번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 838번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 840번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 846번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 849번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 858번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 867번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 879번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 882번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 885번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 891번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 900번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 903번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 906번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 924번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 936번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 939번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 948번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 954번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 963번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 966번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1026번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 1029번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 1038번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 1047번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1053번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1066번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 1068번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 1086번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 및 1110번 위치의 T가 C로 치환된 변이로 이루어진 군에서 선택된 1 이상, 25 이상, 66 이상, 80 이상, 또는 상기 91개 변이 모두를 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 [X]는 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1 유전자(서열번호 12) 및/또는 NSP1-beta (서열번호 1; 서열번호 12의 5 ' 말단 609개 염기 부위)의 핵산 서열, 또는 상기 핵산서열과 동등한 기능을 유지하는 범위 내에서 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.

또한, 상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위의 유전자 핵산 서열 또는 상기 서열과 동등한 기능을 유지하는 범위 내에서 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 구조식 1의 [Y]의 3'말단에 [A]n을 추가로 포함할 수 있다. 상기 n은 염기 A를 포함하는 뉴클레오타이드의 개수로, 10 내지 100의 정수일 수 있다. 바람직하게는 10 내지 80, 10 내지 70, 10 내지 60, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 30, 15 내지 80, 15 내지 70, 15 내지 60, 15 내지 50, 15 내지 40, 15 내지 30, 20 내지 30, 20 내지 26의 정수일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA, 상기 RNA의 역전사체 (DNA), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 PRRSV 키메라 바이러스의 지놈(genome)으로서의 기능을 가질 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 예는 상기 구조식 1의 구조를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 키메라 바이러스를 제공한다. 상기 PRRSV 키메라 바이러스의 지놈은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 RNA일 수 있다.

상기 [X]는 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1-beta를 포함하는, NSP1 유전자 부위에 해당하는 것으로, 상기 LMY ver2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI과 PacI 로 처리하여 얻어지는 유전자 단편일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 1 및/또는 서열번호 12의 핵산 서열, 또는 상기 염기 서열과 동등한 기능을 유지하는 범위 내에서 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위에 해당하는 것으로, BP2017-2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI 와 PacI 로 처리하여 얻어지는 유전자 단편일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 2의 핵산 서열 또는 상기 서열과 동등한 기능을 유지하는 범위 내에서 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열 을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 구조식 1은 서열번호 4의 핵산서열 또는 상기 핵산 서열과 동등한 기능을 유지하는 범위 내에서 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 서열번호 4의 핵산서열일 수 있다.

하기 표 1에서, LMY ver2의 NSP1 유전자의 염기서열 중 굵은 글씨료 표시된 부분은 NSP1-beta 부위를 의미한다.

균주 유래	염기서열(5' > 3')	서열번호
LMY ver2의NSP1	ATGTCTGGGATACTTGATCGGTGCACGTGTACCCCCAATGCCAGGGTGTTTATGGCGGAGGGCCAAGTTTACTGCACACGATGTCTCAGTGCACGGTCTCTCCTTCCCCTGAATCTCCAAGTTTCTGAGCTCGGGGTGCTGGGCCTATTCTACAGGCCCGAAGAGCCACTCCGGTGGACGTTGCCACGTGCATTCCCCACTGTTGAGTGCTCCCCCGCCGGCGCATGCTGGCTTTCCGCTATCTTTCCAATCGCACGAATGACCAGTGGAAACCTAAACTTCCAACAAAGAATGGTACGGGTCGCCGCCGAAATATACAGAGTCGGGCAACTTACGCCCGCTGTATTGAAGGCTCTGCAAGTATACGAGCGGGGTTGTAGGTGGTATCCCATCGTAGGACCTGTCCCTGGAGTGGCCGTTTTCGCCAACTCCCTGCATGTGAGTGATAGACCTTTCCCGGGAGCAACTCACGTATTAACCAACCTGCCACTCCCGCAGAGACCCAAGCCTGAGGACTTTTGCCCCTTCGAGTGTGCTATGGCCGCCGTATACGACGTCGGACATGGCGCCGTTATGTACGTTGCCGACGAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCGCGGCGGCGACGAAGTTAGATTCGAAACGGTCCCACAGGAGCTTAAGTCGGTTGCGAACCAATTATGTACGTCGTTCCCACCCCACCACGTAGTCGATATGTCTAAGTTCGCCTTTACCGCCCCCGGTTGCGGCGTATCTATGCGGGTCGAACGTCAATACGGCTGTCTCCCCGCCGATACGGTCCCCGAAGGCAACTGTTGGTGGAGCTTGTTCGATTCGCTCCCACTCGAAGTGCAAGGCAAAGAGATTCGCCACGCTAACCAATTCGGGTATCAGACTAAGCATGGCGTATCCGGTAAGTACCTACAGCGTAGGCTGCAAATCAACGGTCTCCGCGCAGTCGCTGACCCTAACGGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACTGGCCGAAGAACCTAGTTACCCCGGGTTCGAGGACCTCCTCCGCATAAGGGTTGAGTCTAATACGTCACCATTGGCTAACAAGGACGAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC	12
BP2017-2의ORF2-ORF7	ATGAAATGGGGTCCATGCAAAGCCTTTTTTACAAAATTGGCCAACTTTTTGTGGATGCTTTCACGGAGTTCTTGGTGTCCATTGTTGATATCATTATATTTTTGGCCATTTTGTTTGGCTTCACCATCGCCGGTTGGCTGGTGGTCTTTTGCATCAGATTGGTTTGCTCCGCGATACTCCGTACGCGCCCTGCCATTCACTCTGAGCAATTACAGAAGATCTTATGAGGCCTTTCTTTCCCAGTGCCAAGTGGACATTCCCACCTGGGGAACTAAACATCCTTTGGGGATGCTTTGGCACCATAAGGTGTCAACCCTGATTGATGAAATGGTGTCGCGTCGAATGTACCGCATCATGGAAAAAGCAGGGCAGGCTGCCTGGAAACAGGTGGTGAGCGAGGCTACGCTGTCTCGCATTAGTAGTTTGGATGTGGTGGCTCATTTTCAGCATCTAGCCGCCATTGAAGCCGAGACCTGTAAATATTTGGCCTCCCGGCTGCCCATGCTACACAACCTGCGCATGACAGGTTCAAATGTAACCATAGTGTATAATAGCACTTTGAATCAGGTGTTTGCTATTTTTCCAACCCCTGGTTCCCGGCCAAAGCTTCATGATTTTCAGCAATGGTTAATAGCTGTACATTCCTCCATATTTTCCTCTGTTGCAGCTTCTTGTACTCTTTTTGTTGTGCTGTGGTTGCGGGTTCCAATACTACGTACTGTTTTTGGTTTCCGCTGGTTAGGGGCAATTTTTCTTTCGAACTCACAGTGAATTACACGGTGTGTCCACCTTGCCTCACCCGGCAAGCAGCCACAGAGATCTACGAACCCGGTAGGTCTCTTTGGTGCAGGATAGGGTATGACCGATGTGAGGAGGATGATCATGACGAGCTAGGGTTTATGGTACCGCCTGGCCTCTCCAGCGAAGGCCACTTGACTAGTGTTTACGCCTGGTTGGCGTTCTTGTCCTTCAGCTACACGGCCCAGTTCCATCCCGAGATATTCGGGATAGGGAATGTGAGTCGAGTTTATGTTGACATCAAACATCAACTCATCTGCGCCGAACATGACGGGCAGAACACCACCTTGCCTCGTCATGACAACATTTCAGCCGTGTTTCAGACCTATTACCAACATCAAGTCGACGGCGGCAATTGGTTTCACCTAGAATGGCTTCGTCCCTTCTTTTCCTCGTGGTTGGTTTTAAATGTCTCTTGGTTTCTCAGGCGTTCGCCTGCAAACCATGTTTCAGTTCGAGTCTTGCAGATATTAAGACCAACACCACCGCAGCGGCAAGCTTTGCTGTCCTCCAAGACATCAGTTGCCTTAGGCATCGCGACTCGGCCTCTGAGGCGATTCGCAAAATCCCTCAGTGCCGTACGGCGATAGGGACACCCGTGTATGTTACCATCACAGCCAATGTGACAGATGAGAATTATTTACATTCTTCTGATCTCCTCATGCTTTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTCTGAGATGAGTGAAAAGGGATTTAAGGTGGTATTTGGCAATGTGTCAGGCATCGTGGCTGTGTGTGTCAATTTTACCAGCTACGTCCAACATGTCAAGGAGTTTACCCAACGCTCCCTGGTGGTCGACCATGTGCGGTTGCTCCATTTCATGACACCTGAGACCATGAGGTGGGCAACTGTTTTAGCCTGTCTTTTTGCCATTCTGTTGGCAATTTGAATGTTTAAGTATGTTGGAGAAATGCTTGACCGCGGGCTGTTGCTCGCAATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCCGTTCTGTTTTGCTGTGCTCGCCAACGCCAGCAACGACAGCAGCTCCCATCTACAGCTGATTTACAACTTGACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTAGCTAACAAATTTGATTGGGCAGTGGAGAGTTTTGTCATCTTTCCCGTTTTGACTCACATTGTCTCCTATGGTGCCCTCACTACCAGCCATTTCCTTGACACAGTCGCTTTAGTCACTGTGTCTACCGCCGGGTTTGTTCACGGGCGGTATGTCCTAAGTAGCATCTACGCGGTCTGTGCCCTGGCTGCGTTGACTTGCTTCGTCATTAGGTTTGCAAAGAATTGCATGTCCTGGCGCTACGCGTGTACCAGATATACCAACTTTCTTCTGGACACTAAGGGCGGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCTGTCATCATAGAGAAAAGGGGCAAAGTTGAGGTCGAAGGTCATCTGATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGTGGCAACCCCTATAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCCTTAGATGACTTCTGTCATGATAGCACGGCTCCAGAAAAGGTGCTTTTGGCGTTTTCTATTACCTACACGCCAGTGATGATATATGCCCTAAAGGTGAGTCGCGGCCGACTGCTAGGGCTTCTGCACCTTTTGATCTTCCTGAATTGTGCTTTCACCTTCGGGTACATGACTTTCGCGCACTTTCAGAGTACAAATAAGGTCGCGCTCACTATGGGAGCAGTAGTTGCACTCCTTTGGGGGGTGTACTCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTTGAAAGTGCCGCAGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTAAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAACAGGGAGTGGTAAACCTTGTCAAATATGCCAAATAACAACGGCAAGCAGCAGAAGAGAAAGAAGGGGGATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAGATGCTGGGTAAGATCATCGCTCAGCAAAACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGAAAGAAAAATAAGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTTCCTCTAGCGACTGAAGATGATGTCAGACATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTCTGTCGTCAATCCAGACCGCCTTTAATCAAGGCGCTGGGACTTGCACCCTGTCAGATTCAGGGAGGATAAGTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCTACGCATCATACTGTGCGCCTGATCCGCGTCACAGCATCACCCTCAGCATGA	2
[A]n	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3

(상기 표에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오타이드(RNA)는 서열번호 1 내지 4에 제시된 서열 중 T가 U로 치환된 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.)

본 발명은 구조식 1의 폴리뉴클레오타이드를 지놈으로 포함하는 PRRSV 키메라 바이러스를 제공한다. 상기 PRRSV 키메라 바이러스는 1 내지 80계대, 1 내지 70계대, 1 내지 60계대, 1 내지 50 계대, 1 내지 40 계대, 1 내지 30 계대, 1 내지 20 계대, 또는 1 내지 10 계대 배양된 자손 바이러스를 포함하는 것일 수 있다.

[구조식 1]

5'-[X]-[Y]-3'

상기 식에서, [X]는 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1 유전자 및/또는 NSP1-beta의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열이며, 상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위의 유전자 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열이다.

예컨대, 상기 [X]는 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1 유전자 및/또는 NSP1-beta의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.

또한, 상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위의 유전자 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 구조식 1의 [Y]의 3'말단에 [A]n을 추가로 포함할 수 있다. 상기 n은 염기 A를 포함하는 뉴클레오타이드의 개수로, 10 내지 100의 정수일 수 있으며, 예컨대, 10 내지 80, 10 내지 70, 10 내지 60, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 30, 15 내지 80, 15 내지 70, 15 내지 60, 15 내지 50, 15 내지 40, 15 내지 30, 20 내지 30, 20 내지 26의 정수일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA, 상기 RNA의 역전사체 (DNA), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 PRRSV 키메라 바이러스의 지놈(genome)으로서의 기능을 가질 수 있다. 이에, 본 발명의 다른 예는 상기 구조식 1의 구조를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 키메라 바이러스를 제공한다. 상기 PRRSV 키메라 바이러스의 지놈은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 RNA일 수 있다.

상기 [X]는 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1-beta를 포함하는, NSP1 유전자 부위에 해당하는 것으로, 상기 LMY ver2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI과 PacI 로 처리하여 얻어지는 유전자 단편일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 1의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위에 해당하는 것으로, BP2017-2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI 와 PacI 로 처리하여 얻어지는 유전자 단편일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 2의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 구조식 1은 서열번호 4의 핵산서열 또는 상기 핵산 서열과을 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 서열번호 4의 핵산서열일 수 있다.

일 구체예는 지놈으로서 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산서열을 포함하는 상기 PRRSV 키메라 바이러스를 제공하며, 이를 LMY+BP2017라고 명명하였다. 상기 LMY+BP2017 바이러스는 수탁번호 KCTC 13675BP 을 갖는 바이러스일 수 있다.

상기 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 뼈대가 되는, LMY ver2 변이주는 LMY 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)의 서열번호 5의 Nonstructural protein 1 (NSP1)에 포함된 적어도 하나의 염기가 치환된 변이 NSP1-beta를 포함하는 PRRSV 변이주일 수 있다.

상기 LMY 균주의 NSP1 및/또는 NSP1-beta를 암호화하는 유전자의 염기서열에서 치환되는 염기서열은 공지되어 있는 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램을 사용하여 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는, 본 발명자들이 개발한 SAVE 프로그램을 이용하여 선택한 것일 수 있다. 구체적으로, 모균주인 LMY 의 genome에서 유전적으로 안전성이 높은 NSP1 부위를 본 발명자들이 자체 개발한 SAVE 프로그램으로 분석하여 비교적 Codon Pair Bias (CPB)가 높은 곳을 나타난 염기 서열의 일부 또는 전체를 선택해 치환하여 Deoptimization 시킨 염기서열일 수 있다. 상기 Deoptimization시킨 염기 서열은, 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 LMY 균주의 NSP1 단백질을 암호화하는 유전자의 222번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 225번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 237번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 240번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 252번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 306번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 309번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 312번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 315번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 324번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 327번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 330번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 333번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 336번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 339번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 342번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 345번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 357번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 363번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 366번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 378번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 379번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 381번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 393번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 396번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 543번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 546번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 549번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 555번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 558번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 561번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 573번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 579번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 582번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 588번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 612번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 618번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 621번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 627번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 633번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 639번 위치의 T가 G로 치환된 변이, 654번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 673번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 675번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 678번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 681번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 684번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 705번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 708번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 729번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 735번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 738번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 741번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 744번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 747번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 771번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 786번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 789번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 792번 위치의 T가 G로 치환된 변이, 810번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 825번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 828번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 838번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 840번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 846번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 849번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 858번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 867번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 879번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 882번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 885번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 891번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 900번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 903번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 906번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 924번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 936번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 939번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 948번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 954번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 963번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 966번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1026번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 1029번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 1038번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 1047번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1053번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1066번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 1068번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 1086번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 및 1110번 위치의 T가 C로 치환된 변이로 이루어진 군에서 선택된 1 이상, 25 이상, 66 이상, 80 이상, 또는 상기 91개 변이 모두를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 SAVE 프로그램을 사용해 바이러스 유전자 코돈이 쌍으로 배열 시 상호작용하여 생기는 편향성인, CPB를 컴퓨터 알고리즘을 이용해 수치화할 수 있으며, 바이러스의 증식성은 CPB 수치가 감소(deoptimization)되면 증식성이 감소하고, 약독화 되므로(Virus Attenuation by Genome-Scale Changes in Codon Pair Bias, Science, 2008, J. Robert Coleman et al.), CPB 수치가 높은 일부 염기서열을 CPB 수치가 낮은 염기서열로 치환하거나, 바람직하게는 Codon Pair Deoptimization 원리에 따라 침묵 돌연변이(silent mutation) 시켜 본 발명의 키메라 바이러스 제조에 사용되는 약독화된 LMY ver2 변이주를 제조할 수 있다. 상기 LMY ver2 변이주는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진, NSP1-beta 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진, NSP1 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스의 지놈를 포함하는 세포를 제공할 수 있다. 상기 세포는 상기 키메라 바이러스를 다량 제조하기 위해, 상기 키메라 바이러스의 지놈(DNA, RNA, 또는 이를 포함하는 벡터), 또는 상기 지놈을 포함하는 키메라 바이러스가 트랜스펙션되는 세포를 의미하며, 상기 목적 범위 내라면 세포의 종류를 특별히 한정하지는 않는다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 PRRSV의 키메라 바이러스 또는 이의 계대 배양된 자손을 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신 조성물을 제공할 수 있다.

상기 계대 배양된 자손은 1 내지 80계대, 1 내지 70계대, 1 내지 60계대, 1 내지 50 계대, 1 내지 40 계대, 1 내지 30 계대, 1 내지 20 계대, 또는 1 내지 10 계대 배양된 자손 바이러스를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 백신은 생백신 또는 사백신일 수 있으나, 생백신인 것이 바람직하다. 구체적으로, 본원에 기술된 약독화된 PRRS 키메라 바이러스는 약제학적으로 허용되는 담체에 전술한 하나 이상의 바이러스주를 생존 상태로 함유하는 변형 생백신일 수 있다. 또한, 또는 대안적으로, 불활성화된 바이러스를 사백신을 제조하는 데에도 사용할 수 있다.

상기 백신은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트(adhuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 안정제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함할 수 있다.

한편, 백신 조성물에 포함된 본 발명의 약독화 키메라 바이러스의 유효량은 바이러스의 유효 용량이 투여된 동물에서 면역 반응을 유인하거나 유인할 수 있는 바이러스의 양일 수 있다. 유효한 양은 백신 성분 및 투여 스케줄에 의존적일 수 있다. 백신 조성물의 투여량은 TCID₅₀ 2 내지 6, 바람직하게는 3 내지 4, 범위이나, 개체의 종류에 따라 달라 질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 LMY-BP2017 키메라 바이러스의 지놈, 및 이를 포함하는 백신 조성물은 PRRS 질환의 영향으로부터 돼지를 예방하기 위해 사용될 수 있다. 또한, PRRS 키메라 바이러스의 면역원성 단편 또는 분획을 비롯한 서브유닛도 PRRS 질환의 영향으로부터 돼지를 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 약독화된 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 PRRS를 유발하는 PRRS 바이러스주에 돼지가 노출되기 전에 예방적으로 투여될 수 있고, 상기 바이러스주에 돼지가 노출됨과 동시에 돼지에 투여될 수 있고, 바이러스주에 표적 돼지가 노출된 후 치료적으로 투여될 수 있다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)의 예방, 예를 들어 북미형 PRRSV에 의해 발병하는 PRRS의 예방에 이용될 수 있다. 일 예에서 상기 북미형 PRRSV는 타입 II형 VR2332 바이러스 균주(strain)일 수 있다.

본 발명의 약독화된 PRRSV 키메라 바이러스, 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 경구, 비경구, 피하, 근육내, 피내, 설하, 경피, 직장, 경점막, 흡입을 통한 표면적, 협측 투여를 통해, 또는 이의 조합으로 투여될 수 있다. 또한, 약독화된 PRRS 키메라 바이러스는 약독화된 바이러스의 서방출을 허용할 수 있는 이식체 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약독화된 PRRSV 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 주사, 흡입 또는 이식을 통해 투여될 수 있고, 주사가 특히 바람직하다. 백신접종 또는 치료의 원하는 기간 및 유효성에 따라 약독화된 PRRSV 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 1회 또는 여러 번, 또한 간헐적으로, 예컨대 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 다른 투여량으로 투여될 수 있다. 주사는 원하는 양으로 주사하거나 피하 혹은 비강에 분무하여 주입할 수 있다, 또는 대안적으로 연속 주입할 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면 상기 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스는 상기 키메라 바이러스와 이의 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)를 돼지의 폐 대식세포에 접종하고 측정한 바이러스의 TCID₅₀의 값이, 모균주의 TCID₅₀ 값에 비해 0.01 배 내지 0.1배의 TCID₅₀ 값을 갖는 바이러스일 수 있다. 바람직하게는 상기 측정기간은 2일 후이며, 상기 TCID₅₀ 값은 0.05배 내지 0.1배 일 수 있다. 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스는 모균주 보다 낮은 TCID₅₀ 값을 가지며, 모균주보다 증식성이 감소되고 약독화 되어있다.

또한, 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스와 이의 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)를 돼지에 접종하고 측정한 변이주의 중화 항체 함량이, 모균주의 2배 내지 8배, 바람직하게는 2배 내지 4배를 갖는 바이러스를 제공한다. 상기 측정기간은 적절하게는 28일 후인 것이 바람직하다. 중화항체라 함은 대표적인 북미형 PRRSV 균주인 VR2332에 대항하는 중화능력을 보유한 항체를 의미한다. 따라서, 본 발명의 약독화된 키메라 바이러스 또는, 이를 포함하는 백신조성물을 돼지에 접종할 경우, 돼지의 중화항체의 역가가 증가시키며 돼지의 면역인자의 발현을 증가시켜 PRRS에 대한 면역 효과를 현저히 상승시킬 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기에서 기술한 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스 LMY+BP2017의 CPB수치는 LMY 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)보다 낮은 수치를 나타내며, 바람직하게는 -0.39 내지 0, 더욱 바람직하게는 -0.35 내지 -0.20, 적절하게는 -0.35 내지 -0.26, 예를 들어 -0.2393184052058128일 수 있다. CPB 수치가 -0.39 미만일 경우, 바이러스 작출에 어려움이 있으며, 0을 초과할 경우, 작출은 가능하나 증식성이 감소하지 않아 약독화 되지 않는다는 문제점이 있다. 따라서, 본 발명의 약독화된 LMY+BP2017 키메라 바이러스는 상기 CPB 수치를 갖는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 CpG, UpA 수치가 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.) 의 1.0배 내지 3.0배를 갖는 LMY+BP2017 키메라 바이러스를 제공한다. CpG, UpA 비율의 변화는 deoptimization 과정에서 필연적으로 발생하는 결과로서, 진핵세포 유전자의 CpG, UpA의 수치를 증가시키면, cell stress를 유발하여 바이러스의 증식성이 감소되어 바이러스를 약독화 시킬 수 있다. 본 발명의 LMY+BP2017 키메라 바이러스는 모균주보다 높은 CpG, UpA 수치를 가지며, 바람직하게는 모균주의 1.0배 내지 3.0배 높은 수치를 갖고, 예를 들어 상기 본 발명의 약독화된 키메라 바이러스의 CpG는 1.1753, UpA 는 1.03 일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI과 PacI 로 처리하여 폴리뉴클레오타이드 절편을 제조하는 단계, 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI 와 PacI 로 처리하여 폴리뉴클레오타이드 절편을 제조하는 단계, 및 상기 LMY ver 2의 폴리뉴클레오타이드 절편과 BP2017-2의 폴리뉴클레오타이드 절편을 재조합하여 감염성 클론(infectious clone)을 제조하는 단계를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스를 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 LMY ver2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI과 PacI 로 처리하여 제조된 폴리뉴클레오타이드 절편은 NSP1-beta를 암호화하는 부위를 포함할 수 있다.

상기 BP2017-2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI 와 PacI 로 처리하여 제조된 폴리뉴클레오타이드 절편은 ORF2 내지 ORF7 부위를 포함할 수 있다.

상기 절편을 재조합하는 단계에서 리가아제(ligase)를 사용할 수 있으며, 상기 제조한 감염성 클론을 세포에 접종해 키메라 바이러스를 제조할 수 있다.

상기 세포는 키메라 바이러스를 다량 제조하기 위해, 키메라 바이러스 DNA 또는 RNA, 또는 이를 포함하는 벡터, 감염성 클론, 키메라 바이러스가 트랜스펙션되는 세포를 의미하며, 세포의 종류를 특별히 한정하지는 않는다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 백신 조성물을 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

바람직한 형태로서, 본 발명의 돼지 생식기 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 조성물은 당업자에게 공지된 추가 성분을 포함할 수 있고, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 1,000 mg/kg(체중)의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명의 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군을 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 키메라 바이러스 지놈을 포함하는 백신 조성물을 돼지에 투여함으로써 PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도할 수 있으며, PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도해, 돼지 생식기 호흡기 증후군을 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 바람직하게는 예방할 수 있다.

구체적으로, 상기 방법은 조성물을 피하 주사, 정맥내 주사, 진피내 주사, 비경구 주사, 근육내 주사, 무침(needle free) 주사, 전기천공, 경구 전달, 비내 전달, 구비강(oronasal) 전달, 또는 그의 임의의 조합에 의해 투여할 수 있다.

본 발명은 전술한 임의의 방법을 수행하기 위한 키트(kit)를 제공할 수 있다. 이 키트는 용기, 바람직하게는 본 발명의 약독화된 PRRS 키메라 바이러스를 함유하는 백신 조성물, 약제학적으로 허용되는 담체, 보강제 및 PRRS 감염의 임상 징후 또는 효과, 바람직하게는 PRRS의 빈도 또는 중증도를 경감시키도록 이를 필요로 하는 동물에게 상기 면역원성 조성물을 투여하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 주사 수단 및/또는 다른 형태의 투여 수단을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 용매를 포함할 수 있다. 약독화된 백신은 동결건조될 수 있고, 용매로 복원되어 주사 및/또는 흡입용 용액이 될 수 있다. 용매는 물, 생리식염수, 완충액 또는 보강 용매일 수 있다. 키트는 약독화된 바이러스, 용매 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 분리 용기를 포함할 수 있다. 사용설명서는 하나 이상의 용기에 부착된 라벨 및/또는 인쇄물일 수 있다.

본 발명에 따른 PRRSV 바이러스 키메라 바이러스는 돼지에 접종시 중화항체의분비량을 현저히 증가시킴으로써 PRRS 를 효과적으로 방어하는데 이용할 수 있으며, PRRS 치료용 백신으로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 PRRS 바이러스의 일반적인 지놈 배열(genomic arrangement)을 나타낸다.
도 2는 LMY ver2 바이러스와 BP2017-2 바이러스의 클론의 일부를 각각 절단하고 연결하여 합성한 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 지놈 배열을 나타낸 모식도이다.
도 3은 PRRSV LMY ver2 바이러스와 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 계통수(Phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 4는 PRRSV LMY ver2 바이러스와 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 돼지폐포대식세포(Porcine Alveolar Macrophage cell; PAM cell) 에서의 증식성 차이를 나타낸다.
도 5는 돼지에 PRRSV LMY, LMY+BP2017 키메라 바이러스, PBS 접종 후 중화항체 분비 차이를 비교한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

RNA는 쉽게 파괴되기 때문에 DNA로 바꾸어 모든 작업을 수행한 후에 이로부터 RNA를 합성하여 세포를 형질감염시켰다.

실시예 1: 키메라 바이러스의 제조

1-1. 키메라 바이러스의 디자인

PRRS 키메라 바이러스는LMY 균주의 변이주의 비구조단백질(Non structural Protein 1, NSP1; 서열번호: 11) 부위 및 충남 공주시 남산리 남산농장에서 2017년에 분리된 BP2017-2의 ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, 및 ORF7 부위를 포함하도록 디자인하였다.

1-2. 약독화된 LMY 변이주 제조

기존 검역본부에서 분리한 PRRS 균주인, LMY 균주(GenBank accession no.DQ473474.1.)를 사용해 NSP1 부위의 유전자의 염기서열 중 91개의 염기를 치환하여 LMY ver2변이주를 제조하였다. 상기 NSP1 부위의 유전자는 NSP1-alpha 부위에서 25개 염기가, NSP1-beta 부위에서 66개 염기가 치환되었다.

구체적으로, 상기 재조합 균주 LMY ver2는 일반적으로 알려진 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램 또는, 본 발명자들이 개발한 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램을 이용하여 Codon Pair Deoptimization 원리(표 3)에 따라 염기서열의 일부를 침묵 돌연변이(silent mutation) 시켜 제조하였다. 우선, SAVE 프로그램을 사용해 LMY 바이러스의 유전자 코돈이 쌍으로 배열시 상호작용하여 생기는 편향성인 CPB(codon pair base)값을 컴퓨터 알고리즘을 이용해 수치화하였다. CPB 수치는 LMY 바이러스 유전자의 일부 염기서열이 다른 염기서열로 치환될 시 변동되며, 바이러스의 증식성과 밀접한 관련이 있다. 바이러스의 증식성은 염기서열 치환을 통해 CPB 수치가 감소(deoptimization)되면, 증식성이 감소하고 약독화된다(Virus Attenuation by Genome-Scale Changes in Codon Pair Bias, Science, 2008, J. Robert Coleman et al.). 본 발명자들은 LNY 모균주의 genome에서 유전적으로 안정성이 높은 NSP1 부위(NSP1-alphe 및 NSP1-beta, 서열번호 11)를 선정하여 SAVE 프로그램으로 분석하였으며, CPB값이 비교적 높게 나타난 염기 부위 중 NSP1-alpha 부위에서 25개, NSP1-beta 부위에서 66개, 총 91개의 염기를 선택해 다른 염기로 치환하여 Deoptimization 시켜 LMY 바이러스 변이주를 제조하였다. 상기 방법으로 제조된 NSP1의 91개 염기서열이 돌연변이(서열번호 12)된 LMY 바이러스 변이주를 LMY ver2로 지칭하였으며, 염기서열을 아래 표 3에 나타냈다. 상기 LMY ver2는 수탁번호 13394BP를 갖는다.

명칭	염기서열	서열번호
LMY의 NSP1 beta 유전자	GCTGCTGTCTACGATGTTGGTCATGGCGCCGTCATGTATGTGGCCGATGAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCGTGGCGGGGATGAAGTAAGATTTGAAACTGTCCCACAGGAGCTCAAGTCGGTTGCGAACCAACTCTGCACCTCCTTCCCACCCCACCACGTAGTGGACATGTCTAAGTTCGCCTTTACAGCCCCTGGGTGTGGTGTTTCTATGCGGGTCGAACGTCAATATGGCTGTCTCCCCGCTGACACTGTCCCCGAAGGCAACTGCTGGTGGAGCTTGTTTGACTCGCTCCCATTGGAAGTCCAGGGCAAAGAAATTCGCCATGCTAACCAATTTGGCTACCAGACCAAGCATGGTGTCTCTGGTAAGTACCTACAGCGGAGGCTGCAAATTAATGGTCTCCGAGCAGTAGCTGACCCAAATGGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACTAGCGGAAGAACCCAGTTACCCTGGGTTTGAGGACCTCCTCAGAATAAGGGTTGAGTCTAACACGTCACCATTGGCTAACAAGGATGAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC	5
LMY ver2NSP1 beta 유전자	GC C GC C GT A TACGA C GT C GG A CATGGCGCCGT T ATGTA C GT T GCCGA C GAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCG C GGCGG C GA C GAAGT T AGATT C GAAAC G GTCCCACAGGAGCT T AAGTCGGTTGCGAACCAA T T A TG T AC G TC G TTCCCACCCCACCACGTAGT C GA T ATGTCTAAGTTCGCCTTTAC C GCCCC C GG T TG C GG C GT A TCTATGCGGGTCGAACGTCAATA C GGCTGTCTCCCCGC C GA T AC G GTCCCCGAAGGCAACTG T TGGTGGAGCTTGTT C GA T TCGCTCCCA C T C GAAGT G CA A GGCAAAGA G ATTCGCCA C GCTAACCAATT C GG G TA T CAGAC T AAGCATGG C GT A TC C GGTAAGTACCTACAGCG T AGGCTGCAAAT C AA C GGTCTCCG C GCAGT C GCTGACCC T AA C GGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACT G GC C GAAGAACC T AGTTACCC C GGGTT C GAGGACCTCCTC C G C ATAAGGGTTGAGTCTAA T ACGTCACCATTGGCTAACAAGGA C GAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC	6
LMY의 NSP1 유전자	ATGTCTGGGATACTTGATCGGTGCACGTGTACCCCCAATGCCAGGGTGTTTATGGCGGAGGGCCAAGTTTACTGCACACGATGTCTCAGTGCACGGTCTCTCCTTCCCCTGAATCTCCAAGTTTCTGAGCTCGGGGTGCTGGGCCTATTCTACAGGCCCGAAGAGCCACTCCGGTGGACGTTGCCACGTGCATTCCCCACTGTTGAGTGCTCCCCCGCCGGGGCCTGCTGGCTTTCTGCAATCTTTCCAATTGCACGAATGACCAGTGGAAACCTAAACTTCCAACAAAGAATGGTACGGGTCGCAGCTGAGATCTACAGAGTTGGCCAGCTCACCCCTGCAGTTTTGAAGGCTCTACAAGTTTATGAGCGGGGTTGCCGCTGGTATCCCATTGTTGGACCTGTCCCTGGAGTGGCCGTTTTCGCCAACTCCCTGCATGTGAGTGATAGACCTTTCCCGGGAGCAACTCACGTATTAACCAACCTGCCACTCCCGCAGAGACCCAAGCCTGAGGACTTTTGCCCCTTCGAGTGTGCTATGGCTGCTGTCTACGATGTTGGTCATGGCGCCGTCATGTATGTGGCCGATGAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCGTGGCGGGGATGAAGTAAGATTTGAAACTGTCCCACAGGAGCTCAAGTCGGTTGCGAACCAACTCTGCACCTCCTTCCCACCCCACCACGTAGTGGACATGTCTAAGTTCGCCTTTACAGCCCCTGGGTGTGGTGTTTCTATGCGGGTCGAACGTCAATATGGCTGTCTCCCCGCTGACACTGTCCCCGAAGGCAACTGCTGGTGGAGCTTGTTTGACTCGCTCCCATTGGAAGTCCAGGGCAAAGAAATTCGCCATGCTAACCAATTTGGCTACCAGACCAAGCATGGTGTCTCTGGTAAGTACCTACAGCGGAGGCTGCAAATTAATGGTCTCCGAGCAGTAGCTGACCCAAATGGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACTAGCGGAAGAACCCAGTTACCCTGGGTTTGAGGACCTCCTCAGAATAAGGGTTGAGTCTAACACGTCACCATTGGCTAACAAGGATGAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC	11
LMY ver2 NSP1 유전자	ATGTCTGGGATACTTGATCGGTGCACGTGTACCCCCAATGCCAGGGTGTTTATGGCGGAGGGCCAAGTTTACTGCACACGATGTCTCAGTGCACGGTCTCTCCTTCCCCTGAATCTCCAAGTTTCTGAGCTCGGGGTGCTGGGCCTATTCTACAGGCCCGAAGAGCCACTCCGGTGGACGTTGCCACGTGCATTCCCCACTGTTGAGTGCTCCCCCGCCGG C GC A TGCTGGCTTTC C GC T ATCTTTCCAAT C GCACGAATGACCAGTGGAAACCTAAACTTCCAACAAAGAATGGTACGGGTCGC C GC C GA A AT A TACAGAGT C GG G CA A CT T AC G CC C GC T GT A TTGAAGGCTCT G CAAGT A TA C GAGCGGGGTTG TA G G TGGTATCCCAT C GT A GGACCTGTCCCTGGAGTGGCCGTTTTCGCCAACTCCCTGCATGTGAGTGATAGACCTTTCCCGGGAGCAACTCACGTATTAACCAACCTGCCACTCCCGCAGAGACCCAAGCCTGAGGACTTTTGCCCCTTCGAGTGTGCTATGGC C GC C GT A TACGA C GT C GG A CATGGCGCCGT T ATGTA C GT T GCCGA C GAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCG C GGCGG C GA C GAAGT T AGATT C GAAAC G GTCCCACAGGAGCT T AAGTCGGTTGCGAACCAA TTA TG T AC G TC G TTCCCACCCCACCACGTAGT C GA T ATGTCTAAGTTCGCCTTTAC C GCCCC C GG T TG C GG C GT A TCTATGCGGGTCGAACGTCAATA C GGCTGTCTCCCCGC C GA T AC G GTCCCCGAAGGCAACTG T TGGTGGAGCTTGTT C GA T TCGCTCCCA C T C GAAGT G CA A GGCAAAGA G ATTCGCCA C GCTAACCAATT C GG G TA T CAGAC T AAGCATGG C GT A TC C GGTAAGTACCTACAGCG T AGGCTGCAAAT C AA C GGTCTCCG C GCAGT C GCTGACCC T AA C GGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACT G GC C GAAGAACC T AGTTACCC C GGGTT C GAGGACCTCCTC C G C ATAAGGGTTGAGTCTAA T ACGTCACCATTGGCTAACAAGGA C GAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC	12

(상기 표 3에서, LMY ver2 NSP1 유전자의 핵산 서열 중 굵은 글씨와 밑줄로 표시한 부분은 LMY NSP1 유전자 또는 LMY NSP1-beta 유전자에서 변이가 일어난 염기부분이다.)

다음으로, LMY ver2 변이주의 약독화정도를 확인하기 위해, CPB 값을 측정하였다. LMY 모균주의 NSP1 CPB 값은 약 0.0139, NSP1-beta CBP 값은 약 0.016 정도로 측정되었으나, 본 발명의 LMY ver2 변이주의 CPB 값은 약 NSP1에서 -0.2393, NSP1-beta에서 약 -0.33 정도로 측정되었다. 이로부터 본 발명의 LMY ver2 변이주의 증식성이 기존 모균주보다 감소되어 있고, 약독화된 균주임을 알 수 있었다.

바이러스 균주	NSP1 부위	Codon Pare Deoptimization (CBP)
LMY	NSP1	0.01392516640897059
LMY ver2	NSP1	-0.2393184052058128
LMY	NSP1-beta	0.016079236408108866
LMY ver2	NSP1-beta	-0.3377269630038442

다음으로, LMY ver2의 감염성클론(infectious clone)을 제조하였다.

우선, LMY 균주의 전체 유전자 서열(GenBank accession no.DQ473474.1.)을 7개의 단편(Fragments)으로 나누어 각각 합성하였다. 상기 7개의 단편 중 단편 1이 NPS-1 부위이며, 상기 부위를 LMY 균주의 NSP1 부위의 유전자 염기서열 중 91개 염기가 치환된 DNA 단편(서열번호 12)으로 합성하였다. 합성된 단편 유전자는 순서대로 하기 표 5의 제한효소로 자른 뒤 ligase로 연결하여 하나의 감염성 클론(infectious clone)을 제조하였다.

단편	제한효소	Tm (	완충액	제한효소 인식부위
1	AsiSI	37	CutSmart	GCGATCGC
	XhoI	37	CutSmart	CTCGAG
2	XhoI	37	NEB3.1	CTCGAG
	MluI	37	NEB3.1	ACGCGT
3	MluI	37	NEB3.1	ACGCGT
	NsiI	37	NEB3.1	ATGCAT
4	NsiI	37	CutSmart	ATGCAT
	SpeI	37	CutSmart	ACTAGT
5	SpeI	37	CutSmart	ACTAGT
	AscI	37	CutSmart	GGCGCGCC
6	AscI	37	CutSmart	GGCGCGCC
	AfeI (blunt)	37	CutSmart	AGCGCT
7	AfeI (blunt)	37	CutSmart	AGCGCT
	PacI	37	CutSmart	TTAATTAA

1-3. 키메라 바이러스 클론의 제작

도 1의 모식도와 같이, PRRS 바이러스는 총 8개의 ORF, 즉 ORF1a, ORF1b, 및 ORF2 내지 7을 포함하고 있다.

앞선 실시예 1-1에서 증폭한 LMY ver2 변이주의 전체 구조 유전자를 포함하는 지놈영역에서 ORF2 내지 ORF7의 부위를 제한효소인 AscI 및 PacI를 사용하여 절단하였다. 이어서, BP2017 균주의 지놈영역 중 LMY ver2 변이주의 ORF2 내지 ORF7의 부위에 대응하는 부분을 동일한 AscI 및 PacI 제한효소로 자른 후, 상기 LMY ver2 변이주의 ORF1a 및 ORF1b 영역과 BP2017 균주의 ORF2 내지 ORF7 영역에 해당하는 부위를 ligase로 연결하여 하나의 재조합 감염성 클론(infectious clone)을 제조하였으며, LMY+BP2017 로 명명하였다. 사용한 제한효소를 아래 표 6에 나타냈다.

단편	제한효소	Tm (℃)	완충액	제한효소 인식부위	서열번호
ORF2~7	AscI	37	CutSmart	GGCGCGCC	7
	PacI	37	CutSmart	TTAATTAA	8

상기 완성된 감염성 클론을 CMV 프로모터 및 앰피실린(ampicillin) 저항성 유전자를 탑재한 high copy vector에 삽입한 후, lipofectamine을 이용해 BHK cell(한국세포주은행)에 형질감염 하고, 최종적으로 본 발명의 LMY+BP2017 키메라 바이러스를 작출하였다.

상기 LMY+BP2017 키메라 바이러스는 2018년 10월 24일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC13675BP를 수여받았다.

실시예 2. LMY+BP2017 키메라 바이러스의 CpG 및 UpA 수치 측정

실시예 1에서 제조한 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 증식성을 평가하기 위해, LMY+BP2017 키메라 바이러스의 NSP1 유전자 내 CpG, UpA의 비율과 모균주인 LMY의 NSP1 beta 유전자 내 CpG 및 UpA 수치를 측정하였다.

바이러스 유전자의 CpG, UpA 비율의 변화는 deoptimization 과정에서 필연적으로 발생하는 결과로, 유전자의 CpG, UpA의 수치가 증가되면, cell stress를 유발하여 바이러스의 증식성이 감소된다. LMY+BP2017 키메라 바이러스와 LMY 바이러스의 NSP1 beta 유전자 내 CpG, UpA의 비율을 SSE program (version 1.2)을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 아래 표 7에 나타냈다.

구분	CpG	UpA
LMY	0.6394	0.7066
LMY+BP2017 키메라	1.1753	1.03

표 7에 나타난 바와 같이, LMY+BP2017 키메라 바이러스의 CpG 및 UpA의 수치가 모균주 LMY와 대비해 상승함을 확인하였으며, 이로부터 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 증식성이 LMY 모균주와 비교해 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다.

실시예 3. LMY+BP2017 키메라 균주의 동정

3-1. LMY+BP2017 키메라 균주의 동정

실시예 1에서 합성한 LMY+BP2017 키메라 균주와 LMY균주(GenBank accession no.DQ473474.1.)의 NSP1 부위를 sequencing 하여 LMY+BP2017 키메라 균주를 동정하였다.

구체적으로 LMY 바이러스의 NSP1 부위를 포함해 1~1654nt까지 탐지 가능한 표 8의 프라이머 세트와 one step RT PCR 키트(Intron)를 이용해 PCR을 수행하였으며, 구체적으로, 45℃에서 30분, 95℃에서 5분간 initial RT 과정을 거친 후 94℃에서 30초, 61℃에서 30초 72℃에서 2분 동안 반응시켰으며, 이 과정을 38회 반복하였다. 다음으로 PCR결과 증폭산물을 sequencing 하여 각각 균주의 동정을 완료하였다.

프라이머	염기서열(5'> 3')	서열번호
Forward primer	ATGACGTATAGGTGTTGGCTCTA	9
Reverse primer	CTGAGGATTTGGATGGCATT	10

3-2. 타 균주와의 상동성 비교 및 계통수

실시예 1에서 재조한 본 발명의 재조합 바이러스 균주 LMY ver2와 알려진 PRRS 바이러스 균주와의 유전적 차이를 확인하기 위해, bioedit program을 사용하여 각 균주의 NSP1 부위 sequence identity 측정하였으며, 상동성 비교 결과를 표 9에 나타냈다.

바이러스 종류	염기서열 상동성 (%)
	NSP-1 alpha	NSP-1 beta	NSP-1
LMY	95.3	92.4	92
P129	90.7	80.1	84.2
DC	89.2	79.4	83
JA142	90.9	79.8	83.8
PL97-1	92.4	85	87.2
Henan-A14	88.3	78.3	82.1
VR 2332	92.5	85	87.2
KNU-12-KJ4	85.5	75.5	79.9
CA-2	88.8	77.9	82.3
VR 2385	91.6	84.7	86.9

표 9에 나타난 바와 같이, 상동성 비교 결과 LMY+BP chimera바이러스가 여타의 PRRS 균주와는 다른 고유한 서열을 보유하고 있음을 알 수 있었다.

상동성 비교 결과를 바탕으로, bioedit program을 사용하여 계통수를 분석하였으며 Bootstrap을 1000회 반복하였다. 이를 바탕으로 대략적인 LMY+BP2017 키메라 바이러스와 LMY의 계통수(Phylogenetic tree) 를 작성하였으며, 이를 도 3에 나타냈다. 도 3의 계통수로부터, 본 바이러스의 계통을 알 수 있었다.

3-3. 세포 계대 연구

실시예 1에서 제작한 LMY+BP2017 키메라 바이러스를 계대했을 때 변형된 부위가 언제까지 유지되는지를 확인하였다. PRRS 바이러스 수용성 세포주로 알려진 MARC-145 세포에서 본 발명의 LMY+BP2017 키메라 바이러스를 30회 계대 과정을 거쳐 안정화시켰으며, 10계대 마다 유전자 변이를 확인하기 위해 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 사용해 Sequencing 작업을 진행하였다.

Sequencing 확인결과, 30계대 안정화 이후에도 본 바이러스의 유전자 치환부위가 유지됨을 확인하였다. 하기 표 10에 각 계대수에 따른 염기 변이의 수 (nt change), 변이 위치 (mutataion site), 및 아미노산 변이 여부 (a.a change)를 나타내었다.

계대수	P1	P10	P20	P30	P40
nt change	-	1	2	3	4
mutation site	-	NSP2(867nt, C>T)	NSP2 (867nt, C>T) ORF2a (72nt, T>G)	NSP2 (867nt, C>T) ORF2a (72nt, T>G) (291nt, G>T)	NSP2 (867nt, C>T) (1718~2251nt deletion) ORF2a (72nt, T>G) (291nt, G>T)
a.a change	-	0(Asp>Asp)	0 (Asp>Asp) (Ser>Ser)	1 (Asp>Asp) (Ser>Ser) (Met>Ile)	2 (Asp>Asp) (179aa deletion) (Ser>Ser) (Met>Ile)

상기 표 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 30회 이상 계대를 진행한 경우에도 ORF1a의 NSP1a 또는 NSP1b 유전자 상의 변이는 그대로 유지하였으며, NSP2 단백질 또는 ORF2a에서의 변이만이 확인되었다. 따라서 40회 계대가 이루어진 후에도 실시예 1에서 제작된 바이러스의 NSP1 단백질을 암호화하는 유전자의 변이가 유지됨을 확인하였다.

실시예 4: LMY와 LMY+BP chimera의 증식성 비교

실시예 1에서 제조한 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 증식성을 확인하기 위해, 돼지 폐 대식세포(PAM, Porcine Alveolar Macrophage)에서 LMY+BP2017 키메라 바이러스와 이의 모균주인 LMY를 접종한 이후, 작출되는 바이러스의 양을 TCID₅₀으로 측정하여 확인하였다.

구체적으로, RPMI 배지(10% FBS, 1% penicillin, streptomycin 포함) 2ml 가포함된 6 웰 플레이트에 PAM 세포를 웰당 2 X 10⁶ cell/well의 비율로 분주하였다. 다음으로, LMY와 LMY+BP2017 키메라 바이러스를 각각 서로 다른 웰에 MOI 0.01의 비율로 접종하고 접종 1시간 후에 모든 상층액을 제거하였으며, 유지액 RPMI 배지(10% FBS, 1% penicillin, streptomycin 포함)를 2ml 분주하였다. 분주하고 2일이 지난 후, 각각의 웰의 상층액을 수거하여 TCID₅₀(Tissue culture infective dose₅₀)을 측정하였다. 이후 실험에서 사용되는 세포는 TCID₅₀ 측정 전날에 미리 96웰에 MARC-145 세포 2X10⁵ cell/well을 DMEM 배지(10%(v/v) FBS, 1%(w/v) penicillin, streptomycin) 100ul와 함께 분주하여 부착시킨 것을 사용하였다.

접종할 바이러스는 다음과 같이 준비하였다. 앞서 수거한 상층액을 200uL씩 96 웰 플레이트의 맨 왼쪽 웰에 일렬로 분주하였으며, 나머지 웰에는 DMEM 배지(FBS, 항생제 무첨가)를 180㎕씩 분주하였다. 다음으로, 왼쪽에서부터 차례로 multi-pipet을 사용해 20㎕씩 채취하고 오른쪽 웰에 분주하면서 10진 희석하였다. Tip을 바꾸며 차례로 희석하고 마지막 12번째 웰은 음성 대조군으로 유지하였다. 준비된 바이러스 희석액을 MARC-145 cell이 부착된 plate에 접종하였다. 이때, MARC-145 cell의 배양액은 모두 제거하고 PBS 200㎕를 각 웰에 분주하고 버리기를 3회 반복하여 washing 과정을 수행하였다. 이후 준비된 바이러스 희석액을 웰당 100㎕씩 분주하여 접종하였으며, 접종 2시간 이후 접종액을 모두 제거하고 새로운 유지액(DMEM 배지, 10% FBS, 1% penicillin, streptomycin)을 100㎕ 분주하였다.

분주 후, 약 7일간 세포에서 CPE(Cytopathogenic effect)의 일종인 Clumping과 apoptosis의 발생여부를 확인하였으며, 최종적으로 CPE가 보이지 않은 웰의 바로 이전 희석배수를 기준으로 8개 바이러스 접종액 중 절반인 4개 웰이 CPE를 보일 수 있는 희석배수를 구하였다. 1ml를 기준으로 10을 곱해 최종 수치를 계산하였다.

LMY+BP2017 키메라 균주와 모균주 LMY 균주를 돼지 폐 대식세포(PAM cell)에 접종하고 1일 내지 2일이 지난 후 측정한 TCID₅₀ 값을 하기 표 10 및 도 4에 나타냈다.

바이러스 종류	바이러스 접종일에 따른 TCID50 값
	1일	2일
LMY	5.2	7.3
LMY+BP2017	5.1	5.2

표 10 및 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 균주를 접종하고 바이러스가 본격적으로 작출되기 시작하는 2일에 측정한 TCID₅₀의 값이 LMY+BP2017 키메라가 LMY 보다 100배 낮은 TCID₅₀ 값을 나타냈다. 이로부터 PRRS의 주요 감염 세포인 PAM(Porcine Alveolar Macrophage) cell에서 본 발명의 LMY+BP2017 키메라 바이러스는 증식성이 LMY에 비해 최소 10배 이상 감소함을 알 수 있었으며, 본 발명의 LMY+BP2017 키메라 바이러스가 모균주 LMY 보다 증식성이 감소되어 약독화 되어있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 중화항체 분비 양상 확인

본 발명의 키메라 바이러스를 접종한 이후, 중화항체 분비 양상을 확인하기 위하여, 3주령 돼지 12두를 4마리씩 3개의 그룹으로 나누어 각각 LMY(10⁵ TCID₅₀)_, LMY+BP2017 키메라 바이러스 (10⁵ TCID₅₀), PBS 를 2ml씩 접종하였다. 4주 후 각 그룹의 돼지의 정맥에서 혈액을 채혈하여 혈청을 2ml 분리하였으며, 혈청 내 중화항체의 양을 측정하였다.

구체적으로 검사방법은 기존에 알려진 방법에 준하여 실시하였다. 모든 혈청 sample을 검사 시작 전에 45분 동안 56

에서 heat inactivation시켰다. Inactivation되어 있는 혈청을 RPMI 1640 배지(10% FCS, 20mM L-glutamine, antibiotic-antimycotic mixture-100IU/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 50μg/ml gentamycin, 0.25 mg/ml amphotericin B)에 넣고 2배씩 차례로 희석시켰다. 이어서 각각의 희석된 혈청을 100㎕씩 채취해, 미리 준비된 VR2332균주 200 TCID₅₀/ml 100μl와 섞어 37

에서 한 시간 동안 인큐베이션 시킨 후, 전날 미리 배양해 둔 monolayer 상태의 Marc-145 세포를 접종하였다. 이어서 37

에서 한 시간 배앙한 후의 모든 접종액은 제거하였으며, 이를 RPMI 배양액 200㎕로 대체하였다. 이 후, 37

에서 배양하면서 매일 cytopathic effect(CPE)를 확인하였으며, 5일 간 배양한 후 각 웰의 CPE를 확인하였다. CPE가 없는 well은 SDOW 17 항체를 이용한 염색을 통해 바이러스의 성장을 확인하였다. 중화항체 역가(titer)는 바이러스의 성장의 징후가 전혀 없는 가장 높은 희석배수의 역수를 산출해 측정하였으며, 측정결과를 아래 표 11 및 도 5에 나타냈다.

접종 균주	LMY	LMY+BP2017 chimera	PBS (대조군)
중화항체(Log2)	2.75	4.75	0

표 11 및 도 5에 나타낸 바와 같이, LMY+BP2017 키메라 바이러스가 LMY 모균주에 비해 세포에서 유의적으로 높은 중화항체를 분비시킴을 확인할 수 있었다.

한국생명공학연구원 KCTC13393BP 20171114 한국생명공학연구원 KCTC13394BP 20171114 한국생명공학연구원 KCTC13675BP 20181024

<110> BioPoA, Inc. REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Chimeric strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and antiviral vaccines including the same <130> DPP20194622KR <150> KR 10-2018-0171306 <151> 2018-12-27 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 609 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMY ver2 NSP1-beta <400> 1 gctgctgtct acgatgttgg tcatggcgcc gtcatgtatg tggccgatga gagagtctcc 60 tgggcccctc gcggcgggga cgaagttaga ttcgaaacgg tcccacagga gcttaagtcg 120 gttgcgaacc aactctgcac gtcgttccca ccccaccacg tagtcgatat gtctaagttc 180 gcctttaccg cccccggttg cggcgtatct atgcgggtcg aacgtcaata cggctgtctc 240 cccgccgata cggtccccga aggcaactgc tggtggagct tgttcgattc gctcccactc 300 gaagtgcaag gcaaagagat tcgccacgct aaccaattcg ggtatcagac taagcatggc 360 gtatccggta agtacctaca gcggaggctg caaattaacg gtctccgcgc agtcgctgac 420 cctaacggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 480 aaactagcgg aagaacctag ttaccccggg ttcgaggacc tcctccgcat aagggttgag 540 tctaacacgt caccattggc taacaaggac gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 600 tggtacggc 609 <210> 2 <211> 3188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BP2017-2 ORF2-ORF7 <400> 2 atgaaatggg gtccatgcaa agcctttttt acaaaattgg ccaacttttt gtggatgctt 60 tcacggagtt cttggtgtcc attgttgata tcattatatt tttggccatt ttgtttggct 120 tcaccatcgc cggttggctg gtggtctttt gcatcagatt ggtttgctcc gcgatactcc 180 gtacgcgccc tgccattcac tctgagcaat tacagaagat cttatgaggc ctttctttcc 240 cagtgccaag tggacattcc cacctgggga actaaacatc ctttggggat gctttggcac 300 cataaggtgt caaccctgat tgatgaaatg gtgtcgcgtc gaatgtaccg catcatggaa 360 aaagcagggc aggctgcctg gaaacaggtg gtgagcgagg ctacgctgtc tcgcattagt 420 agtttggatg tggtggctca ttttcagcat ctagccgcca ttgaagccga gacctgtaaa 480 tatttggcct cccggctgcc catgctacac aacctgcgca tgacaggttc aaatgtaacc 540 atagtgtata atagcacttt gaatcaggtg tttgctattt ttccaacccc tggttcccgg 600 ccaaagcttc atgattttca gcaatggtta atagctgtac attcctccat attttcctct 660 gttgcagctt cttgtactct ttttgttgtg ctgtggttgc gggttccaat actacgtact 720 gtttttggtt tccgctggtt aggggcaatt tttctttcga actcacagtg aattacacgg 780 tgtgtccacc ttgcctcacc cggcaagcag ccacagagat ctacgaaccc ggtaggtctc 840 tttggtgcag gatagggtat gaccgatgtg aggaggatga tcatgacgag ctagggttta 900 tggtaccgcc tggcctctcc agcgaaggcc acttgactag tgtttacgcc tggttggcgt 960 tcttgtcctt cagctacacg gcccagttcc atcccgagat attcgggata gggaatgtga 1020 gtcgagttta tgttgacatc aaacatcaac tcatctgcgc cgaacatgac gggcagaaca 1080 ccaccttgcc tcgtcatgac aacatttcag ccgtgtttca gacctattac caacatcaag 1140 tcgacggcgg caattggttt cacctagaat ggcttcgtcc cttcttttcc tcgtggttgg 1200 ttttaaatgt ctcttggttt ctcaggcgtt cgcctgcaaa ccatgtttca gttcgagtct 1260 tgcagatatt aagaccaaca ccaccgcagc ggcaagcttt gctgtcctcc aagacatcag 1320 ttgccttagg catcgcgact cggcctctga ggcgattcgc aaaatccctc agtgccgtac 1380 ggcgataggg acacccgtgt atgttaccat cacagccaat gtgacagatg agaattattt 1440 acattcttct gatctcctca tgctttcttc ttgccttttc tatgcttctg agatgagtga 1500 aaagggattt aaggtggtat ttggcaatgt gtcaggcatc gtggctgtgt gtgtcaattt 1560 taccagctac gtccaacatg tcaaggagtt tacccaacgc tccctggtgg tcgaccatgt 1620 gcggttgctc catttcatga cacctgagac catgaggtgg gcaactgttt tagcctgtct 1680 ttttgccatt ctgttggcaa tttgaatgtt taagtatgtt ggagaaatgc ttgaccgcgg 1740 gctgttgctc gcaattgctt tctttgtggt gtatcgtgcc gttctgtttt gctgtgctcg 1800 ccaacgccag caacgacagc agctcccatc tacagctgat ttacaacttg acgctatgtg 1860 agctgaatgg cacagattgg ctagctaaca aatttgattg ggcagtggag agttttgtca 1920 tctttcccgt tttgactcac attgtctcct atggtgccct cactaccagc catttccttg 1980 acacagtcgc tttagtcact gtgtctaccg ccgggtttgt tcacgggcgg tatgtcctaa 2040 gtagcatcta cgcggtctgt gccctggctg cgttgacttg cttcgtcatt aggtttgcaa 2100 agaattgcat gtcctggcgc tacgcgtgta ccagatatac caactttctt ctggacacta 2160 agggcggact ctatcgttgg cggtcgcctg tcatcataga gaaaaggggc aaagttgagg 2220 tcgaaggtca tctgatcgac ctcaaaagag ttgtgcttga tggttccgtg gcaaccccta 2280 taaccagagt ttcagcggaa caatggggtc gtccttagat gacttctgtc atgatagcac 2340 ggctccagaa aaggtgcttt tggcgttttc tattacctac acgccagtga tgatatatgc 2400 cctaaaggtg agtcgcggcc gactgctagg gcttctgcac cttttgatct tcctgaattg 2460 tgctttcacc ttcgggtaca tgactttcgc gcactttcag agtacaaata aggtcgcgct 2520 cactatggga gcagtagttg cactcctttg gggggtgtac tcagccatag aaacctggaa 2580 attcatcacc tccagatgcc gtttgtgctt gctaggccgc aagtacattc tggcccctgc 2640 ccaccacgtt gaaagtgccg caggctttca tccgattgcg gcaaatgata accacgcatt 2700 tgtcgtccgg cgtcccggct ccactacggt caacggcaca ttggtgcccg ggttaaaaag 2760 cctcgtgttg ggtggcagaa aagctgttaa acagggagtg gtaaaccttg tcaaatatgc 2820 caaataacaa cggcaagcag cagaagagaa agaaggggga tggccagcca gtcaatcagc 2880 tgtgccagat gctgggtaag atcatcgctc agcaaaacca gtccagaggc aagggaccgg 2940 gaaagaaaaa taagaagaaa aacccggaga agccccattt tcctctagcg actgaagatg 3000 atgtcagaca tcactttacc cctagtgagc ggcaattgtg tctgtcgtca atccagaccg 3060 cctttaatca aggcgctggg acttgcaccc tgtcagattc agggaggata agttacactg 3120 tggagtttag tttgcctacg catcatactg tgcgcctgat ccgcgtcaca gcatcaccct 3180 cagcatga 3188 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> [A]n <400> 3 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24 <210> 4 <211> 15443 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMY-BP2017 chimeric virus sequence <400> 4 atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg acatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60 ggcacagtcc aaaacttgct gcgcagaaac acccttctgc gacagcctcc ttcaggggag 120 cttggggtct atccctagca ccttgcttct ggagttgcac tgctttacgg tctctccacc 180 cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc cagggtgttt 240 atggcggagg gccaagttta ctgcacacga tgtctcagtg cacggtctct ccttcccctg 300 aatctccaag tttctgagct cggggtgctg ggcctattct acaggcccga agagccactc 360 cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gttgagtgct cccccgccgg ggcctgctgg 420 ctttctgcaa tctttccaat tgcacgaatg accagtggaa acctaaactt ccaacaaaga 480 atggtacggg tcgcagctga gatctacaga gttggccagc tcacccctgc agttttgaag 540 gctctacaag tttatgagcg gggttgccgc tggtatccca ttgttggacc tgtccctgga 600 gtggccgttt tcgccaactc cctgcatgtg agtgatagac ctttcccggg agcaactcac 660 gtattaacca acctgccact cccgcagaga cccaagcctg aggacttttg ccccttcgag 720 tgtgctatgg ctgctgtcta cgatgttggt catggcgccg tcatgtatgt ggccgatgag 780 agagtctcct gggcccctcg cggcggggac gaagttagat tcgaaacggt cccacaggag 840 cttaagtcgg ttgcgaacca actctgcacg tcgttcccac cccaccacgt agtcgatatg 900 tctaagttcg cctttaccgc ccccggttgc ggcgtatcta tgcgggtcga acgtcaatac 960 ggctgtctcc ccgccgatac ggtccccgaa ggcaactgct ggtggagctt gttcgattcg 1020 ctcccactcg aagtgcaagg caaagagatt cgccacgcta accaattcgg gtatcagact 1080 aagcatggcg tatccggtaa gtacctacag cggaggctgc aaattaacgg tctccgcgca 1140 gtcgctgacc ctaacggacc tttcgtcgta cagtacttct ccgtcaagga gagttggatc 1200 cgccacttga aactagcgga agaacctagt taccccgggt tcgaggacct cctccgcata 1260 agggttgagt ctaacacgtc accattggct aacaaggacg aaaaaatttt ccggtttggc 1320 agtcataagt ggtacggcgc tggtaagaga gcaaggaaag cacgctctcg tgcgactaat 1380 acagtcgctg accgcgcttt gtccgttcgt gaaatctggc aggccaagga gcatgaggtt 1440 accggcgcca ataaggctga gcacctcaaa cactactccc cacctgccga agggaattgt 1500 ggttggcact gcatttccgc catcgtcaac cggatggtta attccaaatt tgaaaccacc 1560 cttcccgaaa gagtgagacc tccagatgac tgggctaccg acgaggatct tgcgaatgcc 1620 atccaaatcc tcagactccc tgcggcctta gacaggaacg gtgcttgtgc tagcgccaag 1680 tacgtactta agctggaagg tgagcattgg actgtcactg tgacccctgg gatgtcccct 1740 tctttgctcc ctcttgaatg tgttcagggc tgttgtgggc acaagggcgg tcttggttcc 1800 ccagacgcag tcgaggtctc cggatttgac cctgcctgcc ttgaccgtct ggctgaggtg 1860 atgcacctgc ctagcagtgc tatcccagcc gctctggccg aaatgtctgg tgattccgat 1920 cgttcggctt ctccggtcac caccgtgtgg actgtttcgc agttctttgc ccgtcacagc 1980 ggaggaaatc accctgacca agtgcgctta gggaaaatca tcagcctttg tcaggtgatt 2040 gaggactgct gctgttccca gaacaaaacc aaccgggtca ccccggagga ggttgcagca 2100 aagattgacc tgtacctccg cggtgcaaca aatcttgaag aatgcttggc caggctcgag 2160 aaagcgcgcc cgccacgggt aatcgacacc ttctttgatt gggacgttgt gctccctggg 2220 gttgaggcag caacccaaac gaccaagctg ccccaggtca accagtgtcg tgctctggtc 2280 cctgttgtga ctcaaaagtc cttggacaac aactcggtcc ccctgaccgc cttttcactg 2340 gctaactact actaccgcgc gcaaggtgac gaagtttgtc accgtgaaag acttaatgcc 2400 gtgctttcca agctggaaga ggttgtccga gaagagtacg ggctcatgcc taccgggcct 2460 ggcccacggc ccacattgcc acgcgggctc gacgaactca aagaccagat ggaggtggac 2520 ttgctgaaac tggctaacgc ccaggcgact tctgacatga tggcttgggc agtcgagcag 2580 gttgacctaa aaacttgggt caagaactac ccgcggtgga tgccaccacc tcctccgcca 2640 aaagttcggc ctcgaaaaac gaagcctgtc aagagcttgc cagagggaaa gcccgccccc 2700 gcccctcgca ggagggttgg gactggttgt ggcagcccga cttcattggg cgatgatgtt 2760 cttaacagtt gggaagattt ggctgttggc agcccctcgg gtctcccgac cccccctgag 2820 ccggcaacac cttcgagtga gccagtggtt gtgtcagcac cgcagtgcat cttcagaccg 2880 gcgacgccct tgagtgagcc gaccccaatt cccgcacccc gtgggactgc gtctcgacca 2940 gtgacacctt tgagcgagcc gatccctgtg cctgcaccgc ggcgtaaatt tcagcaggcg 3000 agaaagttga gttcggcggt ggtaattccg ccgtaccagg acgagcccct ggatttgtcc 3060 gcttcctcgc tgactgaata tgaagccctt cctctagcgc cgccgcaaag cgagggcgct 3120 ctaagagtgg aggggcatga agttgaggaa gccctgagtg aaatctcaga catgtcgggt 3180 ggcactaaac ctgcgcccgt atcatcaagc agctccttgt ccagcgtgag aatcacacgc 3240 ccaaaacact cagctcaagc catcatcgac tcggtcgggc cctgcagtgg gcatctccaa 3300 gaggtgaagg agatatgcct tagtgtcatg cgcgaggcat gtgatgcgac taagctcaat 3360 gaccccgcta cgcaggaatg gctctctcgc atgtgggatc gggtggacat gctgacttgg 3420 cgcaacacgt ctgcttacca gacgcttagc accttaggtg gctggtcaag gttcctccca 3480 aaattgatac ttgagacacc gccgccctac ccgtgtgagt ttgtgatgat gccttacacg 3540 cctgcacctt ccgtgggtgc ggagagcgac ctcaccattg gctcagttgc tactgaggat 3600 gttccacgca tccttgagaa catggagaat gtcggcgaga tgactaacca gggacccttg 3660 gccttctccg aggataaacc ggtggatgac caaccttccg aagacctccg gacatcgtcg 3720 caaggacctg acgggagcac atcagctccg tccgcagata cagctggcgc cggctcatcc 3780 accgatttgc cgtcttcagg cggcgtggat gcggacggag ggggaccgct tcgggcggta 3840 aaaagaaaaa ccgaacggct ctttgaccaa ctgagtcgtc aggtttttga cctcgtctcc 3900 catctcccta ttttcttctc acgcctcttc aaccctggcg gtggttactc tccgggtgat 3960 tggggttttg cagcttttac tctattgtgc ctctttttat gttacagtta cccagcattt 4020 ggcatcgttc ccctcttggg tgtattttct gggtcttctc ggcgcgtgcg aatgggggtt 4080 tttggctgct ggttggcttt tgctgttggt ctgttcaagc ctgtgtccga cccagtcggc 4140 gctgcttgtg agtttgactc gccagaatgc agaaacatcc ttcattcttt tgagcttctc 4200 aaaccttggg accctgttcg cagccttgtt gtgggccccg tcggtctcgg ttttgccatt 4260 cttggcaggc tactgggcgg ggcacgcagc atctggcact ttttgcttag gcttggcatt 4320 gttgcagact gtgtcttggc tggagcttat gtgctttctc aaggtaggtg caaaaagtgt 4380 tggggatctt gtataagaac cgctcctaat gaggtcgctt tcaacgtgtt tccttttacg 4440 cgtgcaacca ggtcgtcact tgttgacctt tgcgatcggt tttgtgcgcc gagaggcatg 4500 gaccccattt ttctcgccac tgggtggcgt ggatgctggg ccggtcggag ccccattgag 4560 caaccctctg aaaaacccat cgcgtttgcc caattggatg aaaagaagat tacggctagg 4620 actgtggtcg cccagcctta tgatcccaac caagccgtaa agtgcctgcg ggtattgcag 4680 gcgggagggg cgatggtggc tgaggcggtc ccaaaagtgg tcagggtttc cgctgttcca 4740 tttcgagccc ccttttttcc taccggagtg aaggttgacc ctgaatgtag agtagtggtt 4800 gaccctgaca ctttcactgc agctctccgg tctggttact ccaccacaaa cctcgtcctc 4860 ggtgtggggg actttgccca gctgaatgga ttaaaaatca ggcaaatttc taagccttca 4920 ggggggggcc 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aggcaactgc tggtggagct tgtttgactc gctcccattg 300 gaagtccagg gcaaagaaat tcgccatgct aaccaatttg gctaccagac caagcatggt 360 gtctctggta agtacctaca gcggaggctg caaattaatg gtctccgagc agtagctgac 420 ccaaatggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 480 aaactagcgg aagaacccag ttaccctggg tttgaggacc tcctcagaat aagggttgag 540 tctaacacgt caccattggc taacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 600 tggtacggc 609 <210> 6 <211> 609 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMY ver2 NSP1 beta sequence <400> 6 gccgccgtat acgacgtcgg acatggcgcc gttatgtacg ttgccgacga gagagtctcc 60 tgggcccctc gcggcggcga cgaagttaga ttcgaaacgg tcccacagga gcttaagtcg 120 gttgcgaacc aattatgtac gtcgttccca ccccaccacg tagtcgatat gtctaagttc 180 gcctttaccg cccccggttg cggcgtatct atgcgggtcg aacgtcaata cggctgtctc 240 cccgccgata cggtccccga aggcaactgt tggtggagct tgttcgattc gctcccactc 300 gaagtgcaag gcaaagagat tcgccacgct aaccaattcg ggtatcagac taagcatggc 360 gtatccggta agtacctaca gcgtaggctg caaatcaacg gtctccgcgc agtcgctgac 420 cctaacggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 480 aaactggccg aagaacctag ttaccccggg ttcgaggacc tcctccgcat aagggttgag 540 tctaatacgt caccattggc taacaaggac gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 600 tggtacggc 609 <210> 7 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AscI restriction enzyme recognition site <400> 7 ggcgcgcc 8 <210> 8 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PacI restriction enzyme recognition site <400> 8 ttaattaa 8 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for LMY DNA amplification <400> 9 atgacgtata ggtgttggct cta 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for LMY DNA amplification <400> 10 ctgaggattt ggatggcatt 20 <210> 11 <211> 1149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMY NSP1 gene <400> 11 atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt tatggcggag 60 ggccaagttt actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcccct gaatctccaa 120 gtttctgagc tcggggtgct gggcctattc tacaggcccg aagagccact ccggtggacg 180 ttgccacgtg cattccccac tgttgagtgc tcccccgccg gggcctgctg gctttctgca 240 atctttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aacctaaact tccaacaaag aatggtacgg 300 gtcgcagctg agatctacag agttggccag ctcacccctg cagttttgaa ggctctacaa 360 gtttatgagc ggggttgccg ctggtatccc attgttggac ctgtccctgg agtggccgtt 420 ttcgccaact ccctgcatgt gagtgataga cctttcccgg gagcaactca cgtattaacc 480 aacctgccac tcccgcagag acccaagcct gaggactttt gccccttcga gtgtgctatg 540 gctgctgtct acgatgttgg tcatggcgcc gtcatgtatg tggccgatga gagagtctcc 600 tgggcccctc gtggcgggga tgaagtaaga tttgaaactg tcccacagga gctcaagtcg 660 gttgcgaacc aactctgcac ctccttccca ccccaccacg tagtggacat gtctaagttc 720 gcctttacag cccctgggtg tggtgtttct atgcgggtcg aacgtcaata tggctgtctc 780 cccgctgaca ctgtccccga aggcaactgc tggtggagct tgtttgactc gctcccattg 840 gaagtccagg gcaaagaaat tcgccatgct aaccaatttg gctaccagac caagcatggt 900 gtctctggta agtacctaca gcggaggctg caaattaatg gtctccgagc agtagctgac 960 ccaaatggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 1020 aaactagcgg aagaacccag ttaccctggg tttgaggacc tcctcagaat aagggttgag 1080 tctaacacgt caccattggc taacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 1140 tggtacggc 1149 <210> 12 <211> 1149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMY ver2 NSP1 gene <400> 12 atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt tatggcggag 60 ggccaagttt actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcccct gaatctccaa 120 gtttctgagc tcggggtgct gggcctattc tacaggcccg aagagccact ccggtggacg 180 ttgccacgtg cattccccac tgttgagtgc tcccccgccg gcgcatgctg gctttccgct 240 atctttccaa tcgcacgaat gaccagtgga aacctaaact tccaacaaag aatggtacgg 300 gtcgccgccg aaatatacag agtcgggcaa cttacgcccg ctgtattgaa ggctctgcaa 360 gtatacgagc ggggttgtag gtggtatccc atcgtaggac ctgtccctgg agtggccgtt 420 ttcgccaact ccctgcatgt gagtgataga cctttcccgg gagcaactca cgtattaacc 480 aacctgccac tcccgcagag acccaagcct gaggactttt gccccttcga gtgtgctatg 540 gccgccgtat acgacgtcgg acatggcgcc gttatgtacg ttgccgacga gagagtctcc 600 tgggcccctc gcggcggcga cgaagttaga ttcgaaacgg tcccacagga gcttaagtcg 660 gttgcgaacc aattatgtac gtcgttccca ccccaccacg tagtcgatat gtctaagttc 720 gcctttaccg cccccggttg cggcgtatct atgcgggtcg aacgtcaata cggctgtctc 780 cccgccgata cggtccccga aggcaactgt tggtggagct tgttcgattc gctcccactc 840 gaagtgcaag gcaaagagat tcgccacgct aaccaattcg ggtatcagac taagcatggc 900 gtatccggta agtacctaca gcgtaggctg caaatcaacg gtctccgcgc agtcgctgac 960 cctaacggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 1020 aaactggccg aagaacctag ttaccccggg ttcgaggacc tcctccgcat aagggttgag 1080 tctaatacgt caccattggc taacaaggac gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 1140 tggtacggc 1149

Claims (22)

1. 구조식 1의 구조로 구성된 폴리뉴클레오타이드로서, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 키메라 바이러스의 유전체인, 폴리뉴클레오타이드:
   [구조식 1]
   5'-[X]-[Y]-3'
   상기 [X]는 수탁번호 KCTC 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI와 PacI로 처리하여 얻어지고 NSP1 유전자를 포함하는 유전자 단편이고,
   상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI와 PacI로 처리하여 얻어지고 ORF2 내지 ORF7 부위를 포함하는 유전자 단편임.
2. 제1항에 있어서, 상기 구조식 1의 [Y]의 3'말단에 [A]n을 추가로 포함하고,
   상기 n은 염기 아데닌(Adenine, A)의 뉴클레오타이드의 개수로, 1 내지 100의 정수인, 폴리뉴클레오타이드.
3. 제1항에 있어서, 상기 PRRSV 키메라 바이러스의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA인 것인, 폴리뉴클레오타이드.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 [X]는, 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 NSP1 유전자의 핵산 서열에서, 222번 위치, 225번 위치, 237번 위치, 240번 위치, 252번 위치, 306번 위치, 309번 위치, 312번 위치, 315번 위치, 324번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 333번 위치, 336번 위치, 339번 위치, 342번 위치, 345번 위치, 357번 위치, 363번 위치, 366번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 381번 위치, 393번 위치, 396번 위치, 543번 위치, 546번 위치, 549번 위치, 555번 위치, 558번 위치, 561번 위치, 573번 위치, 579번 위치, 582번 위치, 588번 위치, 612번 위치, 618번 위치, 621번 위치, 627번 위치, 633번 위치, 639번 위치, 654번 위치, 673번 위치, 675번 위치, 678번 위치, 681번 위치, 684번 위치, 705번 위치, 708번 위치, 729번 위치, 735번 위치, 738번 위치, 741번 위치, 744번 위치, 747번 위치, 771번 위치, 786번 위치, 789번 위치, 792번 위치, 810번 위치, 825번 위치, 828번 위치, 838번 위치, 840번 위치, 846번 위치, 849번 위치, 858번 위치, 867번 위치, 879번 위치, 882번 위치, 885번 위치, 891번 위치, 900번 위치, 903번 위치, 906번 위치, 924번 위치, 936번 위치, 939번 위치, 948번 위치, 954번 위치, 963번 위치, 966번 위치, 1026번 위치, 1029번 위치, 1038번 위치, 1047번 위치, 1053번 위치, 1066번 위치, 1068번 위치, 1086번 위치, 및 1110번 위치의 염기가 치환된 변이 NSP1 유전자를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
7. 제6항에 있어서, 상기 변이 NSP1 유전자는 서열번호 12의 핵산 서열을 갖는 핵산 서열로 표시되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
8. 제1항에 있어서, 상기 [Y]는 서열번호 2의 핵산 서열로 표시되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
9. 제1항에 있어서, 상기 구조식 1은 서열번호 4의 핵산 서열로 표시되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
10. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 지놈으로 포함하는 PRRSV 키메라 바이러스.
11. 제10항에 있어서, 상기 키메라 바이러스는 수탁번호 KCTC13675BP를 갖는 것인, 바이러스.
12. 제10항의 PRRSV의 키메라 바이러스 또는 이의 계대 배양된 자손을 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 키메라 바이러스는 수탁번호 KCTC13675BP를 갖는 것인, 백신 조성물.
14. 제12항에 있어서, 상기 백신은 생백신인, 백신 조성물.
15. 제12항에 있어서, 상기 백신은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트(adhuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함하는 것인, 백신 조성물.
16. 제12항에 있어서, 상기 백신 조성물과 Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.를 가지는 이의 모균주를 돼지의 폐 대식세포에 접종한 후, 측정한 상기 키메라 바이러스의 TCID₅₀의 값이, 모균주의 TCID₅₀ 값에 비해 0.01 배 내지 0.1배의 TCID₅₀ 값을 갖는 것인, 백신 조성물.
17. 제12항에 있어서, 상기 백신 조성물과 Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.를 가지는 이의 모균주를 돼지에 접종한 후, 측정한 상기 키메라 바이러스의 중화항체 값이, 모균주의 중화항체 값에 비해 2배 내지 8배인 것인, 백신 조성물.
18. 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI 와 PacI 로 처리하여 NSP1 단백질을 암호화하는 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 절편을 제조하는 단계;
    수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI 와 PacI 로 처리하여 ORF2 내지 ORF7 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 절편을 제조하는 단계; 및
    상기 LMY ver 2의 폴리뉴클레오타이드 절편과 BP2017-2의 폴리뉴클레오타이드 절편을 재조합하여 감염성 클론(infectious clone)을 제조하는 단계를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스를 생산하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 NSP1 단백질은 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는, 키메라 바이러스를 생산하는 방법.
20. 제18항에 있어서, 상기 ORF2 내지 ORF7 부위는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는, 키메라 바이러스를 생산하는 방법.
21. 제12항의 백신 조성물을 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
22. 제12항의 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군을 예방 또는 치료하는 방법.

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