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KR101253692B1 - 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감수성 세포주 - Google Patents

돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감수성 세포주 Download PDF

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KR101253692B1
KR101253692B1 KR1020100073887A KR20100073887A KR101253692B1 KR 101253692 B1 KR101253692 B1 KR 101253692B1 KR 1020100073887 A KR1020100073887 A KR 1020100073887A KR 20100073887 A KR20100073887 A KR 20100073887A KR 101253692 B1 KR101253692 B1 KR 101253692B1
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respiratory syndrome
pcd163
tailless
prrs virus
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이창희
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경북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주는 돼지 CD163의 세포질 도메인이 결손된 tailless pCD163 발현을 통해 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대해 높은 감염성으로 바이러스의 증식률을 향상시킬 수 있기 때문에, 상기 세포주를 이용할 경우 돼지생식기호흡기증후군 바이러스를 높은 효율로 얻을 수 있으며, 이렇게 얻어진 돼지생식기호흡기증후군 바이러스는 돼지생식기호흡기증후군을 예방할 수 있는 백신 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감수성 세포주{Permissive Cell Lines to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus}
본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 생산방법, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 항원 생산방법, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 생산방법에 따라 생산된 바이러스 (PRRS 바이러스) 항원을 포함하는 면역원성 조성물 및 면역원성 조성물을 동물에게 투여하여 동물에서 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감염을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
돼지생식기호흡기증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome; PRRS)은 1980년대 말 북미에서 최초로 발생 보고 된 이후 현재 국내뿐만 아니라 전 세계 양돈 산업 국가에 만연되어있는 돼지 전염성 질병이다. 이 질병으로 인한 경제적 피해를 수치로 환산하면 미국에서는 연간 약 6억불 정도(약 5,400억원)로 보고되어지고 있으며 우리나라에서는 연간 약 1,000억원의 손실을 입히는 것으로 추정하고 있다.
PRRS의 원인체인 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)는 항원적 그리고 유전학적 특성들에 따라 유럽형 type 1(European genotype)과 북미형 type 2(North American genotype)로 구분된다. 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)는 natural target 숙주인 돼지 내 폐포대식세포(porcine alveolar macrophage; PAM)에 주로 감염을 유발하며 정상적인 면역 기능을 변화시켜 감염에 대한 숙주 방어 반응을 저하시키며 또한 감염 후 5-6개월까지 지속감염을 일으킬 수 있다. 더군다나 RNA 바이러스의 특징인 유전자의 높은 돌연변이율로 인해 다양한 바이러스 변이주들이 발생하여 보고되고 있는 상황이다. 질환은 경산돈(sow) 및 미경산돈(gilt)에서의 생식기 기능상실 (말기 유산, 사산 및 미이라), 자돈에서의 높은 사망률 및 모든 연령의 돼지에서의 호흡기 질환을 특징으로 한다.
현재까지 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 분리와 배양을 위해서는 돼지 폐에서 직접 PAM 세포를 수거하여 이용하는 초대세포배양(primary cell culture) 방법과 기존 원숭이 신장 세포 유래주인 Marc-145 세포를 사용해오고 있다.
대부분의 북미형 바이러스는 Marc-145 세포주를 이용하여 배양되고 있는데 반해 유럽형 바이러스는 분리가 잘 되지 않는 단점이 있다. 경우에 따라 이미 분리된 유럽형 바이러스를 Marc-145 세포에 blind-passage를 통하여 적응시켜 차후 배양은 가능하지만, 유럽형 및 일부 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 분리와 배양은 Marc-145 세포에서는 상당히 제한적인 것으로 알려져 있다.
따라서 유럽형 바이러스 분리를 위해서는 돼지 폐유래 초대배양 대식세포를 이용하는 것이 일반적이다. 하지만 바이러스 증식이 가능한 초대배양 PAM 세포의 유효계대수가 1-2회로 짧고 초저온 동결 후 해동 시 감수성이 떨어지기 때문에 한번 작성된 초대배양세포의 사용기간이 제한적이므로 사용하려면 매번 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 음성 돼지 폐에서 추출해야하는 번거로움과 경제적인 비용에 대한 문제점이 존재한다.
이런 단점을 극복하고자 최근에 초대배양 돼지 폐포대식세포를 이용하여 불멸화 유도를 통해 PAM 세포주를 구축한 바 있다. 하지만 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 테스트 결과 이 구축되어진 PAM 세포주(ATCC CRL-2843, -2844, -2845)에서는 바이러스 감염 및 증식이 불가능하였고 현재까지 원숭이 신장 세포주 외에는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)에 감수성 있는 돼지유래 세포주가 확립되지 않아 바이러스 분리 및 in vitro 연구에 여전히 많은 제한을 주고 있는 실정이다.
최근에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 세포 수용체로 porcine sialoadhesin(pSn) 및 porcine CD163(pCD163)이 확인되어졌고 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 비감수성 세포들에 이들 pSn 및 pCD163 공동 발현 또는 pCD163 단독 발현으로 바이러스의 증식이 허용되는 감수성 세포주를 제작할 수 있다는 보고가 있다. 또한 기존 바이러스 비감수성 불멸화 PAM 세포주에 pCD163 발현 유도에 의해 유럽형 및 북미형 바이러스 모두에 감수성이 확인된 바 있다. 이들 세포주들은 향후 차세대 백신 개발에 있어 중요한 재료로 제공될 것으로 사료된다.
또한 고효능 백신 개발을 위해서는 수용체 발현 세포주를 이용한 바이러스 증식 및 배양 시스템 구축과 더불어 실제 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)의 증식능 및 감염능을 증진시켜 고역가의 바이러스를 생산할 수 있는 세포주의 구축 또한 필요한 상황이다.
이에 본 발명자는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 분리 시 사용되는 돼지 폐유래 초대배양 대식세포 또는 MARC-145 (원숭이 신장 배아세포)의 단점을 극복하고, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대해 높은 감염성으로 유럽형 및 북미형 PRRS 바이러스의 증식능이 향상된 세포주를 개발하였으며, 상기 세포주가 돼지생식기호흡기증후군을 예방할 수 있는 백신 생산에 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 이 발명을 완성하였다.
본 발명은 tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은
tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)를 감염시키는 단계; 및
상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)로 감염된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 증식불용성 동물 세포주를 tailless pCD163 유전자가 포함된 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시키는 단계;
상기 형질전환체에서 tailless pCD163의 발현을 유도하여 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 증식불용성 동물 세포주의 PRRS 바이러스 감염에 대한 감수성을 증가시키는 단계;
상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성이 증가된 세포주를 생체외에서(ex vivo) 또는 시험관내에서 PRRS 바이러스로 감염시키는 단계;
상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)로 감염된 세포를 배양하는 단계; 및
상기 세포 배양물로부터 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 항원을 분리하는 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 항원 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주에서 생산된 PRRS 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주에서 생산된 PRRS 바이러스 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 동물에 투여하여 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세포주는 돼지(Procine)CD163의 세포질 도메인이 결손된 tailless pCD163 발현을 통해 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)에 대해 높은 감염성으로 바이러스의 증식률을 향상시킬 수 있기 때문에, 상기 세포주를 이용할 경우 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)를 높은 효율로 얻을 수 있으며, 이렇게 얻어진 돼지생식기호흡기증후군 바이러스는 돼지생식기호흡기증후군을 예방할 수 있는 백신 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 야생형 pCD163 및 tailless pCD163의 구조 도메인 모식도이다(WT CD163 : 야생형 pCD163, tailless CD163 : tailless pCD163).
도 2는 tailless pCD163의 정기영동 사진이다.
도 3은 pFB-Neo-tailless pCD163 벡터 유전자 지도 모식도이다.
도 4는 형광항체법을 이용해 BHK-pCD163 (대조군) 및 본 발명의 BHK-tailless pCD163 형질전환 세포주에서의 각 발현 단백질을 비교한 사진이다(WT CD163 : 야생형 pCD163, tailless CD163 : tailless pCD163).
도 5는 웨스턴 블랏을 이용해 BHK-pCD163 (대조군) 및 본 발명의 BHK-tailless pCD163 형질전환 세포주에서의 각 발현 단백질을 비교한 사진이다(WT CD163 : 야생형 pCD163, tailless CD163 : tailless pCD163).
도 6은 형광항체법을 이용해 BHK-pCD163 (대조군) 및 본 발명의 BHK-tailless pCD163 형질전환 세포주에 PRRS 바이러스 접종 후 감염률을 비교한 사진이다(WT CD163 : 야생형 pCD163, tailless CD163 : tailless pCD163).
도 7은 BHK-pCD163 (대조군) 및 본 발명의 BHK-tailless pCD163 형질전환 세포주에 PRRS 바이러스 접종 후 바이러스 감염된 세포 비율을 나타낸 그래프이다(WT CD163 : 야생형 pCD163, tailless CD163 : tailless pCD163).
도 8은 BHK-pCD163 (대조군) 및 본 발명의 BHK-tailless pCD163 형질전환 세포주에 PRRS 바이러스 접종 후 FACS 분석을 이용한 감염율 비교 사진(WT CD163 : 야생형 pCD163, tailless CD163 : tailless pCD163).
도 9는 BHK-pCD163 (대조군) 및 본 발명의 BHK-tailless pCD163 형질전환 세포주에 PRRS 바이러스 접종 후 웨스턴 블랏을 이용한 바이러스 단백질 및 CD163 단백질 발현을 비교한 것이다(WT CD163 : 야생형 pCD163, tailless CD163 : tailless pCD163).
도 10은 BHK-pCD163 (대조군) 및 본 발명의 BHK-tailless pCD163 형질전환 세포주의 바이러스 증식률을 비교한 그래프이다(WT CD163 : 야생형 pCD163, tailless CD163 : tailless pCD163).
본 발명은 tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주를 제공한다.
먼저, CD163에 대해서 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
CD163은 130kDa (킬로달톤)의 크기의 당단백질로서, 이는 오직 단핵구(monocyte) 및 대식세포(macrophage)의 세포 표면에서만 발현되는 특징을 가진다. 상기 당단백질은 9개의 시스테인이 풍부한 스캐빈저 리셉터 (scavenger receptor cysteine-rich (SRCR)) 도메인으로 구성된 extracellular 영역, 단일 막횡단 (transmembrane) 도메인 및 짧은 세포질 도메인 (cytoplasmic tail)으로 구성되어 있다. CD163의 주요 역할은 혈장으로부터 헤모글로빈을 제거하기 위한 것이다. CD163의 extracellular 영역은 리간드-결합과정을 위한 중요한 구성요소를 포함하기 때문에, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스와 상호작용할 수 있는 부위가 이와 유사한 영역에 위치할 것이라고 논리적으로 추측되었다. 최근 분자 기능적 연구에서는 CD163의 SRCR 도메인 5가 돼지생식기호흡기증후군의 감염을 위해 필요하다는 것을 보여주었다. (Van Gorp H, Van Breedam W, Van Doorsselaere J, Delputte PL, Nauwynck HJ (2010) Identification of the CD163 protein domains involved in infection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus, J Virol 84:3101-3105).
본 발명에서 ‘tailless pCD163’이란 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 세포수용체인 돼지(porcine) CD163의 세포질 도메인 (cytoplasmic tail)이 결손된 것을 의미한다.
본 발명에서 ‘돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주’란 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 감염이 쉽게 되어 바이러스 감염률 및 증식률이 높은 세포주를 의미한다.
본 발명의 PRRS 바이러스 감수성 세포주는 동물 세포에 tailless pCD163 유전자를 도입한 후, tailless pCD163의 발현을 유도하여 PRRS 바이러스 감염에 대한 감수성을 증가시키는 과정을 통해 만들어질 수 있다.
본 발명에서 tailless pCD163 유전자를 동물 세포에 도입하는 방법으로는, 당업계에 주지되어 있고 통상적으로 실행되는 형질전환, 형질감염, 전기천공, 핵 주사, 리포좀, 미셀(micelle), 고스트(ghost) 세포 또는 원형질체와 같은 케리어로의 융합방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 형질전환을 사용하는 것이 좋다.
상기 tailless pCD163 유전자가 도입되는 동물 세포는, 바람직한 실시양태에서 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 증식불용성 동물 세포주일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 ‘돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 증식불용성 동물 세포주'란 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 의해 감염되지 않는 동물 세포주를 의미한다.
상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 증식불용성 동물 세포주는, 바람직한 실시양태에서 BHK-21 (새끼 햄스터 신장), PK15 (돼지 신장), PAM (ATCC CRL-2843, -2844, -2845), ST (돼지고환), Vero (원숭이 신장 세포), Marc-145 (원숭이 신장 세포 유래), MDBK (Madin-Darby bovine kidney) 및 MDCK (Madin-Darby canine kidney) 세포로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 세포일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주는 PRRS 바이러스 생산에 이용될 수 있으며, 본 발명의 세포주를 사용하여 생산된 PRRS 바이러스는 사멸 백신 또는 약독화된 생백신으로 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주는 진단 키트용 바이러스 항원을 생산하기 위한 목적으로 바이러스를 성장시키기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 돼지 혈청 내의 바이러스에 대한 항체를 검출 및 정량하기 위해 감염되지 않은 세포로부터의 용해물 (임으로 바이러스 입자를 정제하거나 선택된 바이러스 단백질을 추출함)을 ELISA 플레이트 상에 코팅할 수 있다.
게다가 tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주에서 성장된 생 바이러스 또는 비활성화 바이러스를 사용하여, 폴리클로날, 단일특이성 또는 모노클로날 항체를 생성시키기 위해 동물을 면역화시킬 수 있다. 이렇게 생성된 항체는 돼지 혈청 및 기타 생물학적 샘플 내의 바이러스의 검출 및 정량을 위한 진단 분석법의 기초로 사용할 수 있다.
본 발명은 또한,
tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)를 감염시키는 단계; 및
상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)로 감염된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 생산방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 증식불용성 동물 세포주를 tailless pCD163 유전자가 포함된 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시키는 단계;
(b) 상기 형질전환체에서 tailless pCD163의 발현을 유도하여 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 증식불용성 동물 세포주의 PRRS 바이러스 감염에 대한 감수성을 증가시키는 단계;
(c) 상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성이 증가된 세포주를 생체외에서(ex vivo) 또는 시험관내에서 PRRS 바이러스로 감염시키는 단계;
(d) 상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)로 감염된 세포를 배양하는 단계; 및
(e) 상기 세포 배양물로부터 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 항원을 분리하는 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 항원 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 ‘돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 항원’이란 숙주에서 PRRS에 대한 면역 반응을 유도하는 아미노산 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 항원은 PRRS 단백질의 전장의 서열, 이의 유사체 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 개념이다.
본 발명에서 ‘면역원성 단편’이란 하나 이상의 에피토프를 포함하여 숙주에서 면역 반응을 유도하는 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당업계에 공지된 임의의 수의 에피토프 지도작성 기술을 이용하여 동정할 수 있다. 예컨대, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 단백질 분자의 일부에 대응하는 다수의 펩타이드를 고상 지지체에서 동시 합성하고, 이 펩타이드들이 지지체에 부착되어 있는 동안 펩타이드들을 항체와 반응시키는 방법 등으로 결정할 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 문헌 [미국 특허 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715]에 기술되어 있다. 또한 합성 항원도 이러한 정의에 포함되며, 그 예로는 폴리에피토프, 인접 (flanking) 에피토프 및 기타 재조합 또는 합성 유래의 항원이 있다. 예컨대, 문헌 [Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhbier, A. (1997), Immunol, and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998]을 참조한다.
상기 (a) 단계의 tailless pCD163 유전자는 서열번호1의 염기서열을 갖는다.
상기 (a) 단계의 PRRS 바이러스 증식불용성 동물 세포주는 BHK-21 (새끼 햄스터 신장), PK15 (돼지 신장), PAM (ATCC CRL-2843, -2844, -2845), ST (돼지고환), Vero (원숭이 신장 세포), Marc-145 (원숭이 신장 세포 유래), MDBK (Madin-Darby bovine kidney) 및 MDCK (Madin-Darby canine kidney) 세포로 구성된 군으로부터 선택된 1종 일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
상기 (a) 단계의 tailless pCD163 유전자가 포함된 재조합 벡터를 제조하기 위해 사용되는 벡터는 항생제 내성 오픈리딩프레임을 포함하는 pFB-Neo 레트로바이럴 벡터, pFB-Zeo 레트로바이럴 벡터 및 포유동물용 발현 벡터 (mammalian expression vector)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
상기 (b) 단계의 발현 유도하기 위하여 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법으로 발현을 유도할 수 있다. 예를 들어 일반 항생제 (neomycin, zeocin, puromycin, hygromycin 등) 내성 오픈리딩프레임을 포함하는 포유동물용 발현 벡터 (mammalian expression vector)를 이용하여 트렌스펙션 시약 (transfection reagent)을 이용하여 타겟 동물 세포주에 안전하게 트렌스펙션시켜 유전자를 지속적으로 발현시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 레트로바이럴 벡터 시스템을 이용한 안정된 세포주 제작을 통하여 tailless pCD163 유전자를 발현시키는 방법을 사용하였다.
본 발명은 또한,
tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주에서 생산된 PRRS 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
상기 PRRS 바이러스 항원은 PRRS 단백질의 전장의 서열, 이의 유사체 또는 이의 면역원성 단편일 수 있다.
본 발명에서 ‘면역원성 조성물’은 PRRS 바이러스 항원을 포함하는 임의의 약제학적 조성물을 의미하는 것으로, 백신과 동의어로 사용된다.
이러한 면역원성 조성물은 피검체의 PRRS 바이러스 감염 관련 질환 또는 상태를 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직한 면역원성 조성물은 PRRS 바이러스에 대한 면역반응을 유도, 자극 또는 증강시킬 수 있다. 따라서 본 명세서에서 사용되는 용어 면역원성 조성물은 이하에서 기술되는 면역원성 단편 조성물뿐만 아니라 완전 사멸된 또는 약독화된 PRRS 바이러스를 함유하는 조성물도 포함된다.
본 발명에서 ‘면역원성 단편 조성물’은 PRRS 바이러스에서 유래하거나 또는 PRRS 바이러스 유래의 항원과 상동성인, 항원 전부를 함유하는 것이 아니라 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드 또는 항원을 포함하는, 즉 면역원성 단편 항원을 포함하는 조성물을 의미한다. 이러한 조성물에는 완전한 PRRS 바이러스가 실질적으로 없다. 따라서 면역원상 단편 조성물은 PRRS 바이러스로부터 적어도 부분적으로 정제된 또는 분획화된 면역원성 폴리펩티드 또는 이의 재조합 유사체로부터 제조된다.
본 발명의 면역원성 조성물은 상기 PRRS 바이러스 항원에 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 약제학적으로 허용 가능한 담체는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제, 항진균제, 등장제, 흡수제연제 등을 포함한다.
당업자는 본 발명에 사용된 조성물이 공지된 주사성 생리학적으로 허용되는 멸균 용액을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입을 위한 즉석제조 용액 (ready-to-use solution)의 제조 시에는 식염수 또는 대응하는 혈장 단백질 용액과 같은 등장성 수용액을 쉽게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물 (백신)은 희석제, 등정제, 안정제 또는 보강제를 포함할 수 있다. 희석제는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장제는 특히 염화나트륨, 덱스트로서, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정제는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염을 포함한다. 보강제는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 사포닌, 유증수 에멜젼, 수증유 에멀젼을 포함할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 상기 희석제, 등정제, 안정제 및 보강제 이 외에 추가로 약제학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 인산염을 생리학적으로 허용되는 농도로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 면역원성 조성물은 추가로 하나 이상의 다른 면역조절제, 예컨대 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인을 포함할 수 있다.
이를 좀 더 자세히 살펴보면 아래와 같다.
본 발명의 면역원성 조성물이 완전 사멸된 PRRS 바이러스를 함유하는 조성물 (이하 ‘사멸 백신’이라 함)인 경우, 사멸 백신은 본 기술 분야의 통상의 백신 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이러스가 높은 역가로 증식되면, 바이러스 항원성 덩어리를 수득한 후 이들을 포르말린, 베타프로프리오락톤 (BPL), 이성분 에틸렌이민 (BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화시킨다. 이어서 비활성화된 바이러스를 제약상 허용 가능한 캐리어 (예컨대 염수 용액) 및 임의의 보조제와 함께 혼합한다. 보조제의 예로는 수산화알루미늄, 수중유 및 유중수 에멀젼, AMPHIGEN, 사포닌, 인터류킨, 인터페론 및 사이토카인이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
포르말린에 의한 비활성화는 바이러스 현탁액을 37% 포름알데히드와 0.05%의 최종 포름알데히드 농도로 혼합함으로써 수행될 수 있다. 바이러스-포름알데히드 혼합물을 약 24시간 동안의 실온에서의 일정한 교반에 의해 혼합하고, 이어서 비활성화된 바이러스 혼합물을 적절한 세포주 상에서의 성장에 대해 분석함으로써 잔류 생 바이러스에 대해 테스트한다.
BEI에 의한 비활성화는 바이러스 현탁액을 0.1M BEI (0.175 N NaOH 내의 2-브로모-에틸아민)과 1mM의 최종 BEI 농도로 혼합함으로써 수행될 수 있다. 바이러스-BEI 혼합물을 약 48시간 동안의 실온에서의 일정한 교반에 의해 혼합한 후, 1.0M 소듐 티오술페이트를 0.1mM의 최종 농도로 참가한다. 추가로 2시간 동안 계속 혼합한다. 비활성화된 바이러스 혼합물을 적절한 세포주 상에서의 성장에 대해 분석함으로써 잔류 생 바이러스에 대해 테스트한다.
본 발명의 면역원성 조성물이 약독화된 PRRS 바이러스를 함유하는 조성물 (이하 ‘약독화된 생백신'이라 함)인 경우, 약독화된 생백신을 제조하는 방법은 본 기술 분야의 통상의 백신 제조방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기의 PRRS 바이러스 생산방법을 통해 생산된 바이러스를 농축시키고 동결시켜 보관하다가 예방접종 전에, 바이러스를 제약상 허용 가능한 캐리어 (예컨대 염수 용액) 및 임의의 보조제와 함께 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물 (백신)은 당업계에 알려진 임의의 형태 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물 (백신)은 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경피, 점막, 기관내 또는 피하로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 백신은 전신으로 또는 국부로 투여될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물 (백신)은 포유동물에 투여될 수 있으며, 포유동물의 예로는 인간, 소, 돼지, 염소, 개, 양 등일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 포유동물은 돼지이다.
본 발명의 면역원성 조성물 (백신)은 유효량으로 투여될 수 있다. ‘ 유효량’은 치료 또는 예방하고자 하는 증상을 완화 또는 제거하는데 요구되는 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 유효량은 상기 약독화된 생백신일 경우 바이러스 균주를 1일당 1×10 6 내지 1×1010 cfu (colony forming unit)/㎖ 바람직하게는 1일당 1×106 내지 1×108 cfu/㎖ 범위일 수 있다.
본 발명은 또한,
tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주에서 생산된 PRRS 바이러스 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여하여 동물에서 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 동물은 포유동물일 수 있으며, 포유동물의 종류로는 인간, 소, 돼지, 염소, 개, 양 등일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 포유동물은 돼지이다.
본 발명은 또한, 포유동물에서 PRRS 바이러스에 의해 유발된 감염을 예방 또는 치료하기 위한 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 1: tailless pCD163 제조
기존에 클로닝 되어진 wild-type CD163 open reading frame(ORF)이 삽입된 pGEM-T-pCD163 plasmid DNA를 주형으로 하여 CD163 유전자 조작을 실시하였다. 먼저 PCR-based site-directed mutagenesis를 이용하여 막횡단 도메인 (transmembrane domain) 바로 다음 아미노산 서열 (cytoplasmic tail 이 시작되는 아미노산 서열)인 1,067번째 글루타민 코돈 CAG를 stop 코돈인 TAG로 대체시켰다. 이로써 단백질 번역이 이 부위에서 더 이상 진행되지 않아 세포질 도메인 (cytoplasmic tail) 부위가 결손되어 기존 wild-type CD163보다 짧은 형태의 tailless pCD163 단백질이 합성된다. 전체길이 wild-type pCD163과 tailless pCD163 단백질의 구조 및 도메인 구성에 대한 모식도는 도 1에 나타내었다.
재조합 tailless pCD163 유전자를 구축하기 위하여 먼저 mutagenic 센스프라이머 (5'-CTCATTTGGACT T AGAAGCGAAGAC-3')와 안티센스프라이머(5'-GTCTTCGCTTCT A AGTCCAAATGAG-3')를 설계하였다. 상기 프라이머를 이용하여 DNA template(5ng/) 3, 10pmole의 센스 및 안티센스프라이머 및 high-fidelity pfx DNA 중합효소를 이용하여 95 30초 반응 후 95 30초, 55 1분, 68 12분 조건에서 16사이클의 PCR을 실시하였다. 전체 PCR 산물은 DpnI 제한효소로 2시간 처리한 후 2의 최종 산물을 이용하여 E. coli XL1 Blue에 형질전환을 실시하였다. 다음날 생성된 콜로니들을 overnight 배양한 후 이를 이용하여 plasmid DNA를 추출한 후 해당 부위를 센스프라이머 (5'-CGGGATCCATGGACAAACTCAGAATGG-3')와 안티센스프라이머(5'-GTCTTCGCTTGGATCCCTAAGTCCAAATGA-3')를 이용하여 약 3.2kb의 증폭된 유전자를 0.8% 아가로즈겔에서 전기영동분석으로 검출하였고(도 2 참조) 또한 DNA 염기서열 분석을 통해 해당부위의 결손 (mutation)을 확인하였다. 구축된 tailless pCD163의 전체 염기서열은 서열목록 서열번호 1로 나타내었다.
실시예 2: tailless pCD163 유전자 및 야생형 pCD163 유전자가 삽입된 벡터 제조
세포수용체 tailless pCD163 유전자 포함 플라스미드를 제조하기 위한 벡터로는 네오마이신 (neomycin) 내성 오픈리딩프레임을 포함하는 pFB-Neo retroviral vector (Stratagene)를 이용하였다. pGEM-pCD163 및 pGEM-tailless pCD163 그리고 pFB-Neo plasmid를 BamHI으로 절단하고 0.8% 아가로즈겔에 전기영동하여 밴드를 확인한 후 gel extraction kit를 이용하여 절편을 분리하였다. BamHI으로 잘린 야생형 pCD163(약 3.3 kb) 및 tailless pCD163(약 3.2 kb)를 pFB-Neo vector(약 6.6 kb)와 ligation 시켜 최종적으로 pFB-Neo-pCD163 및 pFB-Neo-tailless pCD163 플라스미드를 각각 작성하였으며, pFB-Neo-tailless pCD163 벡터의 유전자 지도는 도 3에 나타내었다.
실시예 3: Retroviral gene transfer system 을 이용한 tailless pCD163 및 야생형 pCD163 발현하는 형질전환 세포주 선발
고역가의 replication-defective 레트로바이러스를 얻기 위하여 HEK-293T 세포주에 pFB-Neo-pCD163 (야생형 pCD163이 코딩된 플라스미드) 또는 pFB-Neo-tailless pCD163 (tailless pCD163이 코딩된 플라스미드), pVPack-VSV-G (Stratagene, vesicular stomatitis virus G glycoprotein이 코딩된 플라스미드) 및 pVPack-GP(Stratagene, Molony Murine Leukemia virus (MMLV) gag/pol gene이 코딩된 플라스미드)를 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 이용하여 트렌스펙션시켰다. 각 타겟 유전자가 packaging된 재조합 레트로바이러스를 함유한 상층액을 BHK-21 세포주 (PRRS 바이러스 증식불용성 동물 세포주)에 접종하고 48시간 이후에 네오마이신 (Invitrogen)을 500/ 농도로 첨가하여 선택배양 하였다. 항생제 처리에 의해 선택된 각각의 cell clone (BHK-pCD163 및 BHK-tailless pCD163)들에서 RT-PCR을 통하여 야생형 pCD163 및 tailless pCD163의 mRNA 발현을 검출하였으며, 결과적으로 각각의 pCD163 유전자가 성공적으로 세포내에 삽입되었음을 확인하였다.
상기에서 pVPack-VSV-G 및 pVPack-GP는 레트로바이러스가 세포 흡착을 포함한 복제 기전에 필요한 역할을 담당하는 바이러스 단백질 및 효소들을 코딩하는 역할을 한다. 즉 vesicular stomatitis virus G glycoprotein은 레트로바이러스 조립 시 바이러스 표면을 구성하여 타겟 세포의 수용체와 결합 및 흡착 역할을 담당하며, Molony Murine Leukemia virus (MMLV) gag/pol gene은 레트로바이러스 캡시드 및 바이러스 효소들(reverse transcriptase, integrase, protease)로서 타겟 유전자의 역전사 및 삽입 역할을 담당함으로 이들이 코딩된 플라스미드를 넣어줌으로써 세포 흡착을 포함한 복제 기전에 필요한 역할을 담당하는 바이러스 단백질 및 효소들을 포함하는 레트로바이러스 입자를 조립할 수 있게 한다.
실시예 4: 형질전화 세포주의 tailless pCD163 및 야생형 pCD163 발현 능력을 분석
<4-1> 형광항체법 이용
먼저 CD163 단백질의 세포 표면 발현을 증명하기 위하여 형광항체법을 실시하였다. 이를 위해 각각의 세포를 배양한 후 4% paraformaldehyde로 세포를 고정하였으며, 고정된 세포에 anti-CD163항체를 반응시키고 2차 항체로는 형광항체인 goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor를 사용하여 발현 단백질을 확인한 결과 도5에서와 같이 BHK-pCD163 및 BHK-tailless pCD163 세포 클론에서 강한 세포 표면 염색을 확인할 수 있었고 이는 각각의 세포들에서 해당 CD163 단백질을 높은 수준으로 발현하고 있음을 증명하였다(도 4 참조).
<4-2> 웨스턴 블랏 ( western blot )
또한 웨스턴 블랏 기법을 이용하여 BHK-pCD163 및 BHK-tailless pCD163 세포에서 야생형 및 tailless CD163 단백질 검출을 시도하였다. SDS-PAGE에서 세포단백 분획을 통해 얻고, nitrocellulose membrane에 세포분획을 전이시킨 후 1차 항체로는 anti-CD163항체를 사용하고 2차 항체로는 goat anti-mouse IgG-HRP를 사용하여 단백질의 발현 및 분자량을 확인하였다. 도6에서 보는 바와 같이 각각의 세포 클론에서 130 kDa의 야생형 CD163 및 그 보다 약간 작은 tailless CD163 단백질 밴드를 확인하였다(도 5 참조).
실시예 5: tailless pCD163 발현 세포주에서 증가된 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 ( PRRS 바이러스) 감염률 및 증식률 확인
확립된 BHK-pCD163 및 BHK-tailless pCD163 세포주들을 이용하여 PRRS 바이러스(VR-2332)의 감수성 테스트를 실시하였다. 바이러스 접종 후 각각의 세포에서 PRRS 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 특이 단클론항체(SDOW17)를 이용한 형광항체법을 이용하여 바이러스 감염된 세포 cluster들을 확인할 수 있었고 BHK-tailless pCD163에서 육안으로 보다 많은 수의 염색된 세포들을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
바이러스에 감염된 세포수를 계수하고 비율을 분석한 결과 역시 BHK-pCD163 세포 (대조군)에 비하여 BHK-tailless pCD163에서 약 3배까지의 증가를 확인할 수 있었다(도 7 참조).
그리고 PRRS 바이러스 특이 단클론항체로 염색된 세포 비율을 FACS 분석을 통해 확인한 결과, 바이러스 접종 후 BHK-pCD163 (대조군)에서는 약 28%인 반면, BHK-tailless pCD163에서는 약 75% 세포들이 바이러스에 감염된 것으로 판단되었다. 이 결과는 형광항체법과 마찬가지로 BHK-tailless pCD163 세포에서 약 3배 정도의 상승된 바이러스 감염능을 보여주는 것이다(도 8 참조).
또한 바이러스 접종 후 새로이 합성된 PRRS 바이러스 비구조(NSP2) 및 구조(N) 단백질의 발현율을 비교 분석한 결과 BHK-tailless pCD163 세포주에서 유의성 있게 상승된 증가를 확인할 수 있었고 반면에 각각의 세포주에서 발현되는 해당 CD163의 생성률은 큰 차이를 보이지 않았다(도 9 참조).
마지막으로 각각의 세포주에서 바이러스 증식률을 비교한 결과 BHK-tailless pCD163 세포주에서 약 2log 이상의 증가된 바이러스 역가를 보여 주었고 one-step growth curve 분석에서도 상승된 growth kinetics를 확인할 수 있었다(도 10 참조).
WT CD163 : 야생형 pCD163, tailless CD163 : tailless pCD163
서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 표시되는 tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주.
  2. 서열번호 1로 표시되는 tailless pCD163 폴리펩티드가 발현되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성 세포주에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)를 감염시키는 단계; 및
    상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)로 감염된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 생산방법.
  3. 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 증식불용성 동물 세포주를 서열번호 1로 표시되는 tailless pCD163 유전자가 포함된 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시키는 단계;
    상기 형질전환체에서 서열번호 1로 표시되는 tailless pCD163의 발현을 유도하여 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 증식불용성 동물 세포주의 PRRS 바이러스 감염에 대한 감수성을 증가시키는 단계;
    상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 감수성이 증가된 세포주를 생체외에서(ex vivo) 또는 시험관내에서 PRRS 바이러스로 감염시키는 단계;
    상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스)로 감염된 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 세포 배양물로부터 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 항원을 분리하는 단계를 포함하는 PRRS 바이러스 항원 생산방법.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서,
    상기 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (PRRS 바이러스) 증식불용성 동물 세포주는 BHK-21 (새끼 햄스터 신장), PK15 (돼지 신장), PAM (ATCC CRL-2843, -2844, -2845), ST (돼지고환), Vero (원숭이 신장 세포), Marc-145 (원숭이 신장 세포 유래), MDBK (Madin-Darby bovine kidney) 및 MDCK (Madin-Darby canine kidney)세포로 구성된 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 PRRS 바이러스 항원 생산방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 tailless pCD163 유전자가 포함된 재조합 벡터를 제조하기 위한 벡터는 pFB-Neo 레트로바이럴 벡터, pFB-Zeo 레트로바이럴 벡터 및 일반 포유동물 발현 벡터 (mammalian expression vector)로 구성된 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 PRRS 바이러스 항원 생산방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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