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CN105624174A - 一种促进丙酮酸分泌的基因、其提取方法和应用 - Google Patents

一种促进丙酮酸分泌的基因、其提取方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种基因psa？C，所述基因psa？C的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。由所述的基因psa？C编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？No.2所示。本发明还提出所述基因psa？C的提取方法和应用。本发明提供了基因psa？C的核苷酸序列；通过异源表达克隆得到的基因，利用大肠杆菌可高效产生丙酮酸；克隆得到的溶磷基因具有将难溶磷转化为有效磷的效果。

Description

一种促进丙酮酸分泌的基因、其提取方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进丙酮酸分泌的基因及其应用。
背景技术
微生物在生长过程中能够分泌各种有机酸，比较常见的有机酸有琥珀酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、富马酸和草酸。这些有机酸具有多种作用，在农业上，能够溶解土壤无机磷提高土壤磷素的利用率，有机酸与土壤中铁、铝、钙等离子螯合，从而使难溶磷转化为有效磷，提高磷肥利用率。
丙酮酸分子式CH3COCOOH，可通过乙酰CoA和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用，是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一。丙酮酸用途和广泛，可用于生产色氨酸、苯丙氨酸和维生素B的主要原料，是生物合成L-多巴的原料，也是乙烯聚合物的起始剂，是杀菌剂噻菌灵的中间体，也是一种食品用香料；丙酮酸及它生成的盐，在医药领域应用很广，用于生产镇静剂、抗氧剂、抗病毒剂、合成治疗高血压的药物等等。
微生物的溶磷机理大致分为5种：有机酸、氢质子(NH4-N供应)、磷酸酶(蛋白质)、螯合作用和氧化还原，其中产生有机酸是一种主要的溶磷方式，有机酸能与铁、铝、钙等离子螯合，从而使难溶磷转化为有效磷(唐超西,龚明波，2012，中国农业科学,45(18):3792-3800.)。
关于溶磷相关基因研究以细菌为主，其主要机制是将葡萄糖直接氧化产生葡萄糖酸(GA)，其中葡萄糖酸的合成是由葡萄糖脱氢酶(GDH)和协同因子吡咯喹啉奎宁(PQQ)完成(GoldsteinAH，1999，FEMSMicrobiologyEcology,30(4):295-300.)。目前关于真菌溶磷相关基因的克隆也有报道，主要是以黑曲霉和草酸青霉为主，但其数量非常少，主要机制也不是很明确，也有报道从草酸青霉中克隆到的基因编码合成苹果酸脱氢酶在大肠杆菌中表达，分泌苹果酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、草酸等有机酸从而使难溶磷溶解(GongMB,2014,CanadianJournalofMicrobiology,60:1-5)。
目前，在ncbi数据库中发布了真菌AspergillusnigerCBS513.88(XM_001398218.2)的全基因组序列，与本发明序列同源性都为99％，该基因编码的蛋白与AspergillusnigerCBS513.88编码的蛋白disulfideisomerase(XP_001399725.1)的蛋白同源性为100％以及AspergilluskawachiiIFO4308编码的蛋白disulfideisomerase(GAA82152.1)的蛋白同源性为99％，但未报到其具有产生丙酮酸的功能。其它报道的都为假定蛋白，没有进行功能分析。
发明内容
针对本领域存在的不足之处，本发明的目的是提出一种促进分泌丙酮酸的基因psaC。
本发明的另一目的是提出所述基因psaC的提取方法。
本发明的第三个目的是提出所述基因psaC的应用。
实现本发明上述目的技术方案为：
一种基因psaC，所述基因psaC的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
一种所述的基因psaC编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
本发明所述基因psaC的提取方法，包括步骤：
1)在难溶磷无机盐培养基上培养黑曲霉菌H1(AspergillusnigerH1)，从培养的黑曲霉菌H1基因组中提取总RNA，再从总RNA中纯化出mRNA，用引物5'-(GA)10ACTAGTCTCGAG(T)18V-3’(V:AorCorG扩增，合成cDNA第一链；
2)cDNA第一链以5'-AAGCTTAAGGGTATCAACGCAGAGTAC-3为引物，通过LD-PCR合成双链cDNA，
3)将cDNA序列连接到pBluescriptSKII(+)上，连接产物电转化到大肠杆菌上，通过难溶磷培养基筛选具有溶磷透明圈的转化子；
4)筛选出的转化子进行转接培养，筛选克隆子进行测序分析，得到全长为1007bp的cDNA序列，利用DNAMAN分析其基因开放阅读框为208个氨基酸。
其中，步骤1)可用RNAisoplus试剂盒提取总RNA，用OligotexmRNAMiniKit试剂盒从总RNA中纯化mRNA。
PCR反应条件可以为：95℃预变性1min；95℃变性15s；65℃退火30s,68℃延伸6min，30cycles4℃forever。
其中，步骤3)所述电转化的条件为：每50μL大肠杆菌感受态细胞施加电量25μF，电击的电压为1.5KV。
本发明还提出含有本发明所述基因的载体。
其中，所述载体可以为表达载体pBluescriptSKII(+)。
含有本发明所述基因的工程菌。
其中，所述工程菌为大肠杆菌。所述大肠杆菌可以为E.coliHST08。
本发明还提出所述基因的应用，即，基因psaC在生产丙酮酸中的应用。
以及，基因psaC在溶解无机难溶磷中的应用。
本发明从黑曲霉H1中克隆溶磷基因，其编码的蛋白导入大肠杆菌中，在难溶磷无机盐培养基中培养36h时，促进大肠杆菌分泌丙酮酸，含量达到1706μg/mL，溶液的pH值从6.45降到3.34，释放的可溶磷含量为0.18mg/mL。
本发明的有益效果在于：
1、本发明首先提供了溶磷基因psaC的核苷酸序列；
2、本发明通过异源表达克隆得到的溶磷基因，利用大肠杆菌可高效产生丙酮酸；
3、本发明通过异源表达克隆到的溶磷基因具有将难溶磷转化为有效磷的效果。
附图说明
图1为实施例1黑曲霉菌H1在难溶磷无机盐培养基上培养3d的形态。
图2为实施例1黑曲霉菌H1的总RNA图。
图3为实施例2中携带溶磷基因的克隆子。
图4为工程菌培养不同溶液pH值的变化。
图5为工程菌培养不同溶液可溶磷含量的变化。
图6为实施例5大肠杆菌产丙酮酸的液相色谱图。
图7为5200mg/L的丙酮酸标准样品液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。本领域技术人员应当知晓，本发明的范围不仅限于特定的实施方案，在不脱离本发明的精神下可以进行各种修饰和改变。
实施例中，大肠杆菌菌种购自大肠杆菌菌种购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
如未特别说明，具体实施方式中所采用的手段均为本领域常规的技术手段。
实施例1黑曲霉菌的cDNA全长文库构建
实验所用菌株黑曲霉H1为中国农业科学院农业资源与农业区划研究所农业菌种保藏中心从土壤样品中筛选，在难溶磷无机盐培养基上培养3d，取0.2g左右新鲜菌丝(如图1)，液氮研磨，利用RNAisoplus试剂盒提取总RNA，用OligotexmRNAMiniKit试剂盒从总RNA中纯化出mRNA。每个离心管加入2μL纯化的mRNA，1μL浓度为12μM的3’SMARTCDSPrimerIIA(5'-(GA)10ACTAGTCTCGAG(T)18V-3’(V:AorCorG))，最后用RNaseFreeH2O补足至终体积为4.5μL，使溶液充分混匀后离心，72℃水浴3min，立即转到42℃水浴2min，立即向每个离心管中加入5.5μL混合液(表1)，充分混匀后离心，置于42℃水浴90min，立即放置冰上，cDNA第一链合成，产物立即进行LD-PCR或-20℃保存备用。
表1第一链合成混合液
以2μL第一链cDNA产物为模板，SMARTerIIA(5'-AAGCTTAAGGGTATCAACGCAGAGTAC-3)为引物，通过LD-PCR合成双链cDNA，反应体系见表2，PCR反应条件设定：95℃预变性1min；95℃变性15s；65℃退火30s,68℃延伸6min，30cycles4℃forever。将PCR扩增产物取3.0μL用1.0％琼脂糖凝胶中电泳检测。
表2第二链合成反应体系
利用CHROMASPIN+TE-1000纯化cDNA，去除小于500bp的片段，沉淀回收cDNA片段。用T4DNA聚合酶补平cDNA的末端后，在其两端连接EcoRI/XhoI定向接头，并用EcoRI/XhoI对接头进行酶切，得到5’端为EcoRI、3’端为HindIII酶切位点的双黏性末端cDNA。纯化后的cDNA片段通过T4DNA连接酶连接到经过EcoRI/XhoI双酶切的pBluescriptSKII(+)载体上，将连接产物电转化到宿主菌E.coliHST08，具体操作如下：
1)超低温冰箱中取出E.coliHST08感受态细胞(50μL)置于冰中融化。
2)E.coliHST08感受态细胞完全融化后立即加入2μL重组质粒，并均匀。
3)将混匀液立即加到预冷的0.1cm冲击槽内。
4)电转化条件为1.5KV，200Ω，25μF，电转化结束后迅速将离心管置于冰中冷却，并加入1mLLB培养基。
5)将加入LB的离心管于37℃200r/min振荡培养1h。
取10μL转化液涂布LB培养基上过夜培养，随机挑取转化后的克隆子，在LB培养液中培养过夜，提取质粒，将质粒用EcoRI和XhoI酶切质粒，检测连接片段的大小，结果显示插入大小为600bp～3kb(图2)。将转化后的宿主菌接种在2mLLB液体培养基中37℃温浴2h，得到初级cDNA文库，4℃保存备用。
实施例2基因的筛选及生物信息学分析
将含有文库细菌的培养液稀释涂布到含有氨苄青霉素(100μg/mL)难溶磷培养基上，37℃培养3-4d，观察是否有溶磷透明圈产生，以大肠杆菌E.coliHST08为受体菌，将产生透明圈的转化子转接培养，如图3所示，一共有169个克隆子在难溶磷培养基上出现透明圈，其中该克隆子的效果相对较好，将该克隆子提质粒测序得到DNA的序列，该cDNA序列全长1007bp，在NCBI上通过Blast进行比对分析，并利用DNAMAN6.0进行开放阅读框分析，该基因开放阅读框为208个氨基酸，标记为基因psaC，并将翻译蛋白在PDB数据库上比对分析。
实施例3基因psaC对难溶磷无机盐培养液pH的影响
将上述筛选出的克隆子接种到50mL带抗性(氨苄100ppm)的难溶磷无机盐培养液的150mL三角瓶中，培养基配方为：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，Ca3(PO4)210.0g，蒸馏水1000mL，pH值为6.45。
以大肠杆菌E.coliHST08为受体菌，接种含有基因的转化子和不含目的基因(只带有pBluescriptSKII(+)质粒)的大肠杆菌各1mL，37℃，200r/min培养，设置三个重复，在2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h和36h测定溶液的pH值，在2h时，pH值开始明显下降，为6.0，随着时间的延长，接种转化子的溶液pH值迅速降低，在20h时，溶液pH值趋于稳定，在36h时，降到最低值达到3.34(图4)，而不携带基因的大肠杆菌溶液pH最终降到5.6左右时不再变化。
实施例4基因psaC对难溶磷无机盐培养液难溶磷的溶解
实验操作同实验3，在4、8、12、16、24、36h时，将溶液离心取上清，105～110℃干燥后的磷酸二氢钾作为标样，用钒钼黄比色法测定可溶磷含量。溶液可溶磷的含量变化与溶液pH值成负相关，溶液pH值越低，释放的可溶磷含量越高，在36h溶液中可溶磷含量升到最高，达到0.18mg/mL(图5)，不携带该基因的大肠杆菌培养液可溶磷含量没有变化。
实施例5基因psaC对大肠杆菌E.coliHST08产酸的影响
实验设计如同实施例3，在36h取出溶液上清，20000rpm离心，过滤后通过美国戴安公司ICS-3000液相色谱仪分析溶液中有机酸的种类和含量。采用的安捷伦的1100液相色谱，色谱柱为C18柱5μm(4×250mm)，进柱体积10μL，流动相：甲醇，0.01mol/LKH2PO4缓冲液(pH2.80),淋洗液梯度洗脱程序为0～5min，100％磷酸缓冲液(pH2.80),5～15min,95％的磷酸缓冲液(pH2.80)和5％的甲醇，15～25min，55％的磷酸缓冲液(pH2.80)和45％的甲醇,25～30min,95％的磷酸缓冲液(pH2.80)和5％的甲醇,检测波长215nm，流速0.7ml/min，柱温25℃。培养36h后，不含psaC的E.coliHST08只产生少量乙酸，含量为18.5μg/mL，而含psaC的E.coliHST08分泌大量丙酮酸，液相色谱图显示，在4.874分钟时峰面积为11577.4，对应丙酮酸含量达到为1706μg/mL(图4，图5)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种基因psaC，其特征在于，所述基因psaC的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.一种由权利要求1所述的基因psaC编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
3.权利要求1所述基因psaC的提取方法，其特征在于，包括步骤：
1)在难溶磷无机盐培养基上培养黑曲霉菌H1(AspergillusnigerH1)，从培养的黑曲霉菌H1基因组中提取总RNA，再从总RNA中纯化出mRNA，用引物5'-(GA)10ACTAGTCTCGAG(T)18V-3’(V:AorCorG扩增，合成cDNA第一链；
2)cDNA第一链以5'-AAGCTTAAGGGTATCAACGCAGAGTAC-3为引物，通过LD-PCR合成双链cDNA，
3)将cDNA序列连接到pBluescriptSKII(+)上，连接产物电转化到大肠杆菌上，通过难溶磷培养基筛选具有溶磷透明圈的转化子；
4)筛选出的转化子进行转接培养，筛选克隆子进行测序分析，得到全长为1007bp的cDNA序列，利用DNAMAN分析其基因开放阅读框为208个氨基酸。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，步骤3)所述电转化的条件为：每50μL大肠杆菌感受态细胞施加电量25μF，电击的电压为1.5KV。
5.含有权利要求1所述基因的载体。
6.含有权利要求1所述基因的工程菌。
7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌。
8.基因psaC在生产丙酮酸中的应用。
9.基因psaC在溶解无机难溶磷中的应用。
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