CN106011184A - 2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种2‑苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用。本发明利用重组酶ARO8、ARO10和ADH1这三种重组酶构成共反应体系，将微生物体内Ehrlich途径需要多步连续反应、多种酶参与才能合成2‑苯乙醇这样复杂的代谢过程，简化为在体外的同一反应体系内进行，从而减少了环境污染、缩短了反应流程。进一步地，本发明采用戊二醛作为交联剂，将三种重组单酶进行无载体共固定化，制备共交联酶聚集体(Combi‑CLEAs)，体外合成目标产物，从而在上述有益效果的基础上进一步实现酶的循环使用，降低生产成本，本发明填补了多酶体外制备2‑苯乙醇的技术空白，为生物制备2‑苯乙醇提供重要的借鉴。

Description

2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物合成技术领域，更具体地，涉及一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用。

背景技术

2-苯乙醇(2-Phenylethanol,2-PE)又称β-苯乙醇(β-Phenylethanol)，化学名2-苯基乙醇(2-Phenylethyl alcohol,2-PEA)，分子量122.16，结构式为：

2-苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰气味的芳香醇，天然存在于许多植物的精油中，2-苯乙醇香气轻柔甜和，颇受人们欢迎，是目前全球使用量仅次于香兰素的第二大香料成分，广泛应用于食品、化妆品、烟草和日化用品领域，它不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分，而且因其具有协合及增效作用，成为多种香型配方所需的组分，是具有很高价值的香料物质；在医药上，2-苯乙醇是传统的抑菌剂。

目前，全球2-苯乙醇的年产量近万吨，基本上都是采用廉价的化工原料苯或苯乙烯化学合成，仅有很少一部分从玫瑰油中提取。化学合成所使用的原料大多对人体健康和环境有巨大危害，而且所合成的产品2-苯乙醇中常含有气味不良、难以除去的杂质，如联二苯、β-氯代乙苯、氯乙醇等，严重影响产品质量。随着消费观念的改变，人们越来越崇尚“绿色”、“天然”的食品和添加剂。在欧美国家，能被标记为“天然”的调味剂和芳香剂必须是采用物理方法从天然材料中提取和酶催化或微生物发酵法生产的。若从玫瑰中提取天然2-苯乙醇，每5t玫瑰鲜花仅能萃取玫瑰精油1kg，生产成本极其昂贵，无法大规模生产。国际上天然2-苯乙醇基本都是以微生物转化L-苯丙氨酸生产，主要集中在法国、德国、日本等发达国家，但生产量远不能满足消费需求。

2-苯乙醇的一个重要的生产途径是采用微生物发酵，该途径方法原料和合成过程绿色环保、反应条件温和、产物安全、生产周期短、可大规模生产。微生物菌体内2-苯乙醇的生物合成有三条途径：第一条途径是从头合成的莽草酸途径，广泛存在于微生物体内，但代谢途径长、支路多、存在多种抑制，2-苯乙醇产量极低；第二条是L-苯丙氨酸脱羧生成苯乙胺、去氨基还原生成2-苯乙醇，此途径较少发生；第三条是Ehrlich途径，L-苯丙氨酸通过转氨作用生成苯丙酮酸、再脱羧形成苯乙醛、最后还原生成2-苯乙醇。Ehrlich途径是微生物合成2-苯乙醇的首选途径，是分别在芳香族氨基转氨酶、苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶3种酶的作用下进行的，研究者们已在基因水平上对其进行了深入的研究，重点研究编码3种酶的结构基因及其转录和调控方式。

生物界所有物质代谢都由多酶共同作用来完成，这些不同的酶能高度有序地自组装形成多酶复合体(multienzyme complexes，MECs)参与反应，通过提高中间产物在不同酶之间的转运浓度，实现高效催化(Lopez-Gallego et al.,2010；Schoffelen et al.,2012；Zhang,2011)。但是多酶共反应后存在酶分离回收困难、重复利用率低、稳定性较差等问题，也存在2-苯乙醇的产量一直较低，成本增加，香气品质受到影响等较多缺点。

目前尚未发现多酶体外制备2-苯乙醇的相关研究和文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备技术的不足，拟利用多酶复合体高效催化的这一优点，在体外人工制备多酶反应体系，即将高效表达Ehrlich途径的3种酶3种重组酶置于一个适宜的反应体系中，构建3种重组酶体外共反应制备2-苯乙醇的最优反应体系，不经过生物体内复杂的代谢系统，直接体外制备目标产物2-苯乙醇，建立一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，是在同一反应体系内通过重组转氨酶ⅠARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10和醇脱氢酶ADH1组成的共催化体系催化转化，L-苯丙氨酸经由苯丙酮酸、苯乙醛，转化为2-苯乙醇；其中，所述反应体系内，是L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，重组酶ARO8、ARO10和ADH1按酶活力以1:0.25:1、1:1:1、1:0.5:1或1:0.25:2(U/U/U)配比确定，加入量为100μL，在pH值为5.5～7.5、Mg²⁺浓度为1.0～5mM的反应体系中，水浴温度为30～40℃条件下，反应转化4～7min后，以等体积的乙腈终止反应，即制得2-苯乙醇。

本发明创造性地总结得到由重组芳香族转氨酶Ⅰ、苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶组成的游离多酶体系，能以L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，体外制备2-苯乙醇，具有催化效率高、操作简单、不需提纯中间产物等优点。

在所述游离多酶体系条件下，优选L-苯丙氨酸和草酰乙酸地摩尔比为0.75:l。

优选ARO8、ARO10和ADH1以1:0.25:1(U/U/U)配比。优选Mg²⁺浓度为1.0～2.5mM；进一步优选为1.5mM。优选地，水浴温度为33～40℃；进一步优选为37℃，优选在37℃水浴反应5min。优选地，pH值为5.5～6.5；进一步优选地，所述pH值为6。最优选地，在所述游离多酶体系条件下，所述L-苯丙氨酸和草酰乙酸的摩尔比为0.75:l，重组酶ARO8、ARO10和ADH1按酶活力以1:0.25:1配比，加入量为100μL，pH值6.0、Mg²⁺浓度为1.5mM，37℃水浴5min后以等体积的乙腈终止反应即得。

所述多酶体系在实际应用中还未能完全解决中间体性质不稳定引起的产率不够高、反应后酶分离回收存在一定困难，重复利用率低，稳定性较差等不足，为进一步完善本发明技术方案，本发明进一步将所述3种重组酶同时固定在同一个载体中，提高酶的稳定性和重复利用率，增加反应的局部浓度以提高产品的得率。在实际研究试验过程中，只有科学确定酶作用的最适温度、最适pH、酶的共固定化比例、固定化次序等各个因素的作用效果和机制以及相互之间影响制约的规律和关系，才能总结出所述3中重组酶的共固定化技术方案。

因此本发明提供一种优选的技术方案是先将所述重组转氨酶ⅠARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10和醇脱氢酶ADH1通过共固定方法制得共催化体系Combi-CLEAs，然后利用Combi-CLEAs对L-苯丙氨酸进行催化转化，经由苯丙酮酸、苯乙醛，转化为2-苯乙醇。

在共固定技术方案条件下，其中，所述反应体系内，是以L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，优选pH值为5.0、Mg²⁺浓度为1.0～5mM，水浴温度为40℃，反应转化时间为5min。

所述共催化体系Combi-CLEAs的制备方法为：将ARO8、ARO10和ADH1按照1:1:1、1:0.5:1或1:0.25:1配比后，经沉淀剂硫酸铵沉淀后形成多酶聚集体，加入戊二醛对多酶聚集体进行交联，制得多酶共固定体系；其中，硫酸铵的饱和度为60～90％，pH值为4～6，戊二醛的加入量按照其终浓度为0.05～0.25％(V/V)确定。

优选地，沉淀剂硫酸铵的饱和度70％。优选地，沉淀剂硫酸铵的pH值为5优选地，ARO8、ARO10和ADH1的酶配比为1:0.5:1。优选地，所述戊二醛的加入量按照其终浓度为0.1％(V/V)确定。优选地，所述交联的温度为20～35℃，进一步优选30℃。优选地，所述交联的时间为30～150min，进一步优选120min。

本发明所述Combi-CLEAs具有优良的重复操作性，重复使用4次后，仍能维持66％的初始酶活。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，利用3种重组酶构成共反应体系，将微生物体内Ehrlich途径需要多步连续反应、多种酶参与才能合成2-苯乙醇这样复杂的代谢过程，简化为在体外的同一反应体系内进行，从而减少了环境污染、缩短了反应流程。进一步地，本发明采用戊二醛作为交联剂，将3种重组单酶进行无载体共固定化，制备共交联酶聚集体(Combi-CLEAs)，体外合成目标产物，从而在上述有益效果的基础上进一步实现酶的循环使用，降低生产成本。本发明填补了多酶体外制备2-苯乙醇的技术空白，为生物制备2-苯乙醇提供重要的借鉴，为制备天然2-苯乙醇提供创新思路。

附图说明

图1多酶体系催化L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇的路线示意图。图2依次添加三种酶后的高效液相色谱检测2-苯乙醇结果。图3三酶共反应的高效液相色谱检测2-苯乙醇结果。图4三酶共反应的反应产物2-苯乙醇经气相质谱联用分析结果。图5三酶共反应的反应产物2-苯乙醇经离子质谱分析结果。图6三酶共反应的反应时间对多酶活力的影响情况。图7三酶共反应的多酶配比对反应的影响情况。图8三酶共反应的Mg²⁺浓度对多酶活力的影响情况。图9三酶共反应的温度对多酶活力的影响情况。图10三酶共反应的pH值对多酶活力的影响情况。图11三酶共反应的底物浓度对多酶活力的影响情况。图12优化三酶共反应条件下高效液相色谱测定2-苯乙醇结果。图13三酶共固定中沉淀剂对多酶聚集体活力的影响情况。图14三酶共固定中硫酸铵饱和度对多酶聚集体活力的影响情况。图15三酶共固定中pH对多酶聚集体活力的影响情况。图16三酶共固定中多酶配比对Combi-CLEAs活力的影响情况。图17三酶共固定中戊二醛浓度对Combi-CLEAs活力的影响情况。图18三酶共固定中交联温度对Combi-CLEAs活力的影响情况。图19三酶共固定中交联时间对Combi-CLEAs活力的影响情况。图20三酶共固定中温度对共固定化多酶和游离多酶活力的影响情况。图21共固定化多酶和游离多酶的温度稳定性。图22 pH对共固定化多酶和游离多酶活力的影响。图23底物配比对共固定化多酶和游离多酶活力的影响。图24共固定化多酶和游离多酶的贮存稳定性。图25共固定化多酶的操作稳定性。图26 Aro8基因的克隆鉴定结果。图27 Aro10基因的克隆鉴定结果。图28 ADH1基因的克隆鉴定结果。图29表达载体p32-YT0801-Aro8电泳分析图。图30表达载体p32-YT0801-Aro10电泳分析图。图31表达载体p32-DV10-Adh1电泳分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原料为常规市购或商业途径获得的原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

主要试剂:重组芳香族氨基转氨酶I、苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶，常规市购或参照现有技术文献构建或者参照本发明实施例5方法构建。化学标准品：L-苯丙氨酸、草酰乙酸、2-苯乙醇，购自美国Sigma-Aldrich公司。其他化学试剂均为国产分析纯或色谱纯。主要仪器：数显恒温水浴锅HH-2(江苏常州国华电器有限公司)，恒温金属浴CHB-100(江苏杭州博日科技有限公司)，精密pH计PHS-3C(上海精密科学仪器有限公司)，Mettler-Toledo电子天平AB204-N(上海Mettler-Toledo仪器有限公司)，超声破碎仪(宁波科技有限公司)，液相色谱仪(上海天美公司)，气相色谱质谱仪GC-MSQP2010Plus(日本岛津公司)。

图1显示了L-苯丙氨酸转化为2-苯乙醇的过程。在同一反应体系内，依次通过重组转氨酶ⅠARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10和醇脱氢酶ADH1的转化，L-苯丙氨酸经由苯丙酮酸、苯乙醛，转化为2-苯乙醇。所有反应体系都为0.5mL，缓冲液中包含0.01mM的磷酸吡哆醛、0.2mM的焦磷酸硫胺素和0.1mM的NADPH。

1.多酶共反应的活性测定：以L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，HPLC检测多酶共用的催化活性。反应体系总体积500μL，含有：10mM L-苯丙氨酸，10mM草酰乙酸，0.5mM Mg²⁺，0.01mM磷酸吡多醛，0.1mM焦磷酸硫胺素，0.1mM NADPH，ARO8、ARO10和ADH1三种重组酶各10μL。加入酶液混合均匀，开始计时，33℃反应3min，加入500μL乙腈终止反应，过滤上清液，HPLC测定2-苯乙醇的含量。

反应分两组：第一组按第三章单酶的作用时间依次加入三种酶，即ARO8作用10min后，加入ARO10充分反应30min，最后加入ADH1作用3min；第二组同时加入三种重组酶，混合均匀后反应3min。测定两组中2-苯乙醇的含量。

多酶共反应的酶活力定义：在最适条件下，每分钟每毫升多酶混合液所催化生成的2-苯乙醇的μmol量。酶活单位为μmol/(min·mL)。

2. 2-苯乙醇测定条件：

仪器：天美液相色谱仪；色谱柱：Phenomenex luna C18 250mm×4.6mm；参照方法，流动相为乙腈-水(50/50，V/V)，使用前经0.22μm微孔滤膜过滤并超声脱气；检测波长为216nm；流速1.0mL/min；柱温为室温。20μl定量环定量。

3. 2-苯乙醇的GC-MS检测条件

仪器采用GC-MSQP2010PlusD，柱子(0.25mm ID,30m)，分流进样。升温程序：进样温度250℃，初始温度40℃，保留5min，4.0℃/min升至℃，再以30.0℃/min加热到250℃保留5min。

4.多酶共反应的反应条件确定验证和试验方法

(1)多酶共反应的时间：分别测定在不同反应时间下多酶的酶活，测得重组酶ARO8、ARO10、ADH1的酶活分别为：0.87、0.22和1.75μmol/(min·mL)(测定方法参照现有常规)。以最大酶活为100％，结果用相对酶活表示。

(2)多酶共反应的酶配比：在设计多酶配比时，固定其中一个重组酶的量，例如固定ARO8的量，按照酶活力对酶以不同比例搭配：1:1:1，1:0.5:1，1:0.25:2，1:0.25:1，1:0.25:0.5，1:0.15:0.5和1:0.15:0.25，分别测定不同配比下的酶活，以最大酶活为100％，结果用相对酶活表示。

(3)多酶共反应的Mg²⁺浓度：设定反应体系中不同的Mg²⁺终浓度，测定不同条件下的酶活。例如分别设Mg²⁺终浓度为0、0.3、0.5、0.6、1.0、1.5和2.0mM，不同条件下的酶活测定结果用相对酶活表示，以测定的最大酶活为100％。

(4)多酶共反应的最适温度：分别测定多酶在30℃、33℃、35℃、37℃和40℃共反应时的酶活，以最大酶活为100％，结果用相对酶活表示。

(5)多酶共反应的最适pH：将三种重组酶ARO8、ARO10、ADH1依酶活力以不同配比，加入不同pH的0.1M磷酸钠缓冲液中，混合均匀，4℃放置30min，在最适条件下反应，测定酶活。pH体系分别为5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，结果用相对酶活表示，以测定的最大酶活为100％。

(6)底物浓度对酶活性的影响：测定在底物L-苯丙氨酸与草酰乙酸的不同摩尔比条件下的多酶酶活，结果用相对酶活表示，以最大酶活为100％。为免赘述，本实施例分别以底物L-苯丙氨酸与草酰乙酸的的摩尔比为0.2:1、0.5:1、0.75:1、1:1、1.5:1和2:1进行说明。所有独立实验重复至少三次。

5.试验结果：

(1)多酶共反应的活性鉴定：本实施例以ARO8酶促反应的底物L-苯丙氨酸和草酰乙酸作为起始底物，以ADH1的催化产物2-苯乙醇作为终产物，在同一体系内共同反应，检测三酶共用的催化活性，以验证三酶共用体外合成2-苯乙醇的可行性。反应同时设二组：第一组按单酶的作用时间依次加入三种酶(ARO8在30℃时的反应时间为10min，而ARO10和ADH1的作用时间分别为30min和3min)；第二组同时加入三种重组酶反应3min。参照2-苯乙醇标准品，用HPLC检测反应产物，第一组只有底物峰及其他中间产物杂峰，没有检测到反应产物的存在，分析是因为形成的中间产物不稳定所致；第二组在与标准品2-苯乙醇出峰时间相同的位置，即4.650min处出现了一个小峰，且底物峰面积减少，显示体系生成了目标产物2-苯乙醇，浓度为11.51μM，见图2和图3所示。表明ARO8、ARO10和ADH1共同存在于反应体系时，具有催化活性。

对三酶共反应体系的反应产物进一步进行GC-MS检测，在32.563min处发现有目标产物2-苯乙醇的存在，见图4所示，对该峰进行进行离子碎片分析，通过比对，进一步证实产物为2-苯乙醇，见图5所示。结果表明ARO8、ARO10和ADH1三酶共反应，能成功催化底物L-苯丙氨酸转化为2-苯乙醇。

(2)多酶共反应的时间精确确定

单酶体系的反应时间各不相同，ARO8在30℃时的反应时间为10min，而ARO10和ADH1的作用时间分别为30min和3min。本发明研究分析多酶共反应得到的中间产物性质不稳定，如果酶作用时间过长，易聚合变稠甚至被氧化，因此有必要考察多酶体系的最佳共反应时间。

以等摩尔的L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，反应体系中Mg²⁺浓度为0.5mM，加入酶活力相等的三种重组酶，在33℃下反应不同时间，用HPLC方法测定反应液中2-苯乙醇的含量，计算相对酶活，得出三酶体系的反应时间为5min，见图6所示。

(3)多酶共反应的酶配比精确确定试验

在多酶反应体系中，L-苯丙氨酸依次经转氨酶Ⅰ、苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的催化，生成2-苯乙醇，因三种酶的酶活以及酶促反应速度不同，为使L-苯丙氨酸的转化率达到最大，本实施例进一步确定三种酶的最佳比例。由于转氨酶ⅠARO8是反应的第一个酶，因而在讨论多酶配比问题时，固定ARO8的酶量，按照酶活力对三种酶以不同比例搭配，共测定7种不同比例的反应。所有反应体系都为0.5mL，包含有0.01mM的磷酸吡哆醛、0.2mM的焦磷酸硫胺素、0.1mM的NADPH以及0.5mM的Mg²⁺。33℃水浴5min后，HPLC测定2-苯乙醇的含量，计算相对酶活。图7所示为本发明主要的实验结果显示图。若ARO8不足，则产生的苯丙酮酸浓度低，2-苯乙醇的产率也低；若ARO8过量而ARO10和ADH1不足，则苯丙酮酸浓度增大，易导致产物抑制，对L-苯丙氨酸的转化率产生影响；因此，合适的多酶配比有利于产物的形成。由图7可知，三酶按照酶活力以1:0.25:1配比的活力最大；而分别以1:1:1、1:0.5:1和1:0.25:2配比的酶活虽然较1:0.25:1次之，但同样可以是保障足够的活力，只是说明此三组的ARO10和ADH1酶量已饱和或者过量；而1:0.25:0.5、1:0.15:0.5和1:0.15:0.25配比时的酶活较低，说明此三组中ADH1和ARO10酶量不足。因此多酶共反应时，ARO8、ARO10和ADH1以1:1:1(U/U/U)、1:0.5:1(U/U/U)和1:0.25:2(U/U/U)或1:0.25:1(U/U/U)为优选，进一步地，以1:0.25:1(U/U/U)为最佳配比。

(4)多酶共反应的Mg²⁺浓度确定试验

本发明人研究分析因为Mg²⁺是带二个正电荷的镁离子，可参与酶的催化活性，使得Mg²⁺具有比酸更强的催化作用，有利于酶活性中心的形成和空间结构的稳定。此外，Mg²⁺通过静电屏蔽负电荷，可促进反应的进行。但同时，较高浓度的Mg²⁺对酶具有抑制作用，本发明人研究分析认为是Mg²⁺与富电子中心形成配位键，阻断了底物与酶的活性中心结合。与此同时，本发明人大量前期实验总结ARO8单酶催化体系中Mg²⁺浓度为0.6mM，ARO10体系的Mg²⁺为0.5mM，而5mM Mg²⁺有利于ADH1的活性，进一步证实了本发明人的研究分析结论。因此，按一定比例相互构成的多酶反应体系必须考虑Mg²⁺的最佳浓度范围。根据三种重组单酶作用的适宜Mg²⁺浓度范围，测定若干组不同Mg²⁺浓度的反应。图8中显示了其中6组不同Mg²⁺浓度的反应结果。ARO8/ARO10/ADH1依酶活力以1:0.25:1配比，33℃水浴5min，测定各组相对酶活。由图8可知，当反应体系内不添加Mg²⁺时，重组酶ARO8和ARO10不能发挥其催化活性；Mg²⁺浓度在1.0～2.5mM范围时，多酶活性一直维持较高且稳定的水平，没有很明显的变化；Mg²⁺浓度继续增大到5.0mM时，酶活力稍下降，表明酶的活性受到Mg²⁺的抑制；Mg²⁺浓度为1.5mM时，多酶体系的催化活力最大。

(5)多酶共反应的最适温度确定试验

试验总结，重组酶ARO8、ARO10和ADH1的最适温度分别为30℃、37℃和35℃，图9显示了在不同温度下反应的酶活力变化情况。多酶反应体系中，ARO8/ARO10/ADH1依酶活力以1:0.25:1配比，Mg²⁺浓度为1.5mM，水浴5min后加入等体积乙腈终止反应。

结果显示，在30～40℃的温度范围内，温度对三酶体系的活性影响不很明显。30℃是ARO8的最适温度，但对ARO10和ADH1活性稍有影响，多酶体系的相对酶活为75％；40℃对三种重组酶都有影响，多酶体系的相对酶活降为65％。多酶共用的最适反应温度与ARO10的最适温度一致，都为37℃，分析总结认为ARO10是三酶体系的关键酶，在30～40℃温度范围内发挥更强的作用。

(6)多酶共反应的最适pH确定试验

试验总结三个重组单酶的最适pH有差异，分别为7.0、6.0、6.0，因此本发明人分析，三者构成的多酶体系的最适pH，会受到三种单酶体系pH差异的影响，为此，进行了不同的试验，在pH5.5～7.5范围内调节pH，研究三酶体系的最适pH。图10的试验结果是以Mg²⁺浓度为1.5mM、ARO8/ARO10/ADH1依酶活力以1:0.25:1配比、37℃水浴5min等条件下进行说明。试验总结结合图10可看出，多酶体系的最适pH范围为5.5～6.5，pH6.0时的相对酶活最大。在pH5.5～7.5范围内，多酶的催化活性没有大幅下降，最低的相对活性能保持66％左右。

(7)底物浓度对酶活性的影响试验

研究总结底物L-苯丙氨酸和草酰乙酸的浓度配比会影响ARO8对底物的转化率，继而影响ARO10和ADH1的转化率。因此，在保持底物草酰乙酸浓度为10mM不变的情况下，对底物L-苯丙氨酸和草酰乙酸采用不同的摩尔比，在三酶共反应的最适条件下保持5min后，测定2-苯乙醇的含量，计算相对酶活，结果如图11所示。由图11可以看出，L-苯丙氨酸与草酰乙酸摩尔比低于0.75:l时，多酶共反应的相对酶活随L-苯丙氨酸配比的增加而增大；当进一步增大底物L-苯丙氨酸的浓度时，多酶活力没有明显的变化，一直维持在最高水平，说明L-苯丙氨酸浓度已达到饱和状态；摩尔比从1.5:1增大到2:1时，相对酶活小幅下降到96％，是因为L-苯丙氨酸的抑制作用所致。由此可见，L-苯丙氨酸与草酰乙酸的摩尔比为0.75:l时，相对酶活最大。

实施例2最适条件下多酶共反应合成2-苯乙醇

本实施例仪器、试剂和检测方法等参照实施例1。以L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，研究了重组芳香族氨基转氨酶ⅠARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10和醇脱氢酶ADH1，共同作用于同一体系合成2-苯乙醇的最适条件，所有反应体系都为0.5mL，包含0.01mM的磷酸吡哆醛、0.2mM的焦磷酸硫胺素和0.1mM的NADPH。

以摩尔比为0.75:l的L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，按照前述最佳条件合成2-苯乙醇。重组酶ARO8、ARO10和ADH1按酶活力以1:0.25:1配比，加入量为100μL，在pH6.0、Mg²⁺浓度为1.5mM的反应体系中，37℃水浴5min后，以等体积的乙腈终止反应，用HPLC测定2-苯乙醇的含量，为40.92μM，见图12所示。在本发明最佳的多酶共反应条件下，2-苯乙醇浓度达到较高的值。重组多酶的酶活力为0.082μmol/(min·mL)。

实施例3三酶共固定体系参与的共反应试验

主要试剂：重组芳香族氨基转氨酶I、苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶常规市购或参照领域常规技术构建，或者参照本发明实施例5方法构建。化学标准品：L-苯丙氨酸、草酰乙酸、2-苯乙醇，购自美国Sigma-Aldrich公司。其他试剂常规市购，以上化学试剂均为国产分析纯或色谱纯。主要仪器：数显恒温水浴锅HH-2(江苏常州国华电器有限公司)，电热鼓风干燥箱101A-3S(广东广州富民测控科技有限公司)，恒温金属浴CHB-100(江苏杭州博日科技有限公司)，伊莱克斯冷藏冰冻箱BCD-263C(伊莱特(中国)有限公司)，Eppendorf离心机5810R(德国Eppendorf公司)，精密pH计PHS-3C(上海精密科学仪器有限公司)，Mettler-Toledo电子天平AB204-N(上海Mettler-Toledo仪器有限公司)，超声破碎仪(宁波科技有限公司)，液相色谱仪(上海天美公司)。一、试验方法：

酶活力测定方法：以L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，HPLC检测共固定化多酶(Combi-CLEAs)的催化活性。反应体系总体积500μL，含有：10mM L-苯丙氨酸，10mM草酰乙酸，1.5mM Mg²⁺，0.01mM磷酸吡多醛，0.1mM焦磷酸硫胺素，0.1mM NADPH，共固定化多酶30μL。加入酶液混合均匀后，开始计时，最适温度下反应5min，迅速加入500μL乙腈终止反应，上清液用22μm滤膜过滤后，HPLC测定216nm波长的吸光值，计算2-苯乙醇的含量。

三酶共固定体系Combi-CLEAs的酶活力定义：在最适条件下，每分钟每毫升Combi-CLEAs混合液所催化生成的2-苯乙醇的μmol量。酶活单位为μmol/(min·mL)。

2-苯乙醇测定条件同实施例1。

酶活力回收率计算：酶活力回收率是指Combi-CLEAs所表现的活力占初始游离多酶液总活力的百分数。

1.共固定化多酶(Combi-CLEAs)制备

多酶聚集体的制备：重组转氨酶Ⅰ、苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶按酶活力以1:0.25:1比例混合，取100μL混合酶液装于试管内，向其中缓慢滴加900μL沉淀剂，同时边滴加边轻微搅拌，每隔30min取样一次，在8000rpm下低温离心5min，取上清液测定酶活，直至所有蛋白被沉淀。

多酶聚集体的交联：在加入沉淀剂的多酶聚集体悬浮液中缓慢加入一定浓度的交联剂戊二醛，持续轻微搅拌，在一定温度下交联一定时间，4000rpm离心10min，弃上清，以1mL pH7.0的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液洗涤沉淀后离心，1mL缓冲液重悬沉淀，于4℃保存备用。

2.多酶共固定化条件研究

沉淀剂种类的确定：分别采用90％硫酸铵、90％异丙醇、90％丁醇、60％PEG6000、90％乙醇、90％丙酮、90％叔丁醇和90％乙腈作为沉淀剂，取100μL以1:0.25:1(U:U:U)比例混合混合的多酶液，分别加入900μL上述沉淀剂，25℃沉淀30min，8000rpm离心5min，洗涤，以1mL pH7.0的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液重悬沉淀，测定各酶活，计算酶活回收率。

沉淀剂饱和度的确定：取100μL混合酶液，向其中缓慢加入900μL饱和度分别为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％的pH7.0的硫酸铵溶液，25℃沉淀30min，测定各酶活，计算酶活回收率。

沉淀pH的确定：取100μL混合酶液，缓慢加入900μL，pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的饱和硫酸铵溶液，25℃沉淀30min，测定各酶活，计算酶活回收率。

多酶配比的确定：参照实施例1，固定第一个酶ARO8的酶量，按照酶活力，ARO8、ARO10和ADH1分别以1:1:1，1:0.5:1，1:0.25:2，1:0.25:1，1:0.25:0.5，1:0.15:0.5和1:0.15:0.25的比例配制多酶混合液，各取100μL混合酶液，向其中缓慢加入900μL饱和硫酸铵溶液，25℃沉淀30min，测定各酶活，计算酶活回收率。

交联剂浓度的确定：按照前述最佳条件制备多酶聚集体悬浮液，向其中加入终浓度分别为0.05％、0.10％、0.15％、0.25％、0.50％和0.75％的戊二醛溶液并稍加搅拌，25℃交联120min后，4000rpm离心10min，用10mLpH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤沉淀3次，最后以1mL此缓冲液重悬沉淀，测定各酶活，计算酶活回收率。

交联剂温度的确定：制备多酶聚集体悬浮液，并加入合适浓度的戊二醛溶液，分别在0℃、10℃、25℃、35℃和45℃下交联120min，离心，洗涤，以1mL缓冲液重悬沉淀，测定各酶活，计算酶活回收率。

交联时间的确定：制备多酶聚集体悬浮液，加入戊二醛溶液，在最适温度下，分别交联30、60、90、120和150min，离心，洗涤，以1mL缓冲液重悬沉淀，测定各酶活，计算酶活回收率。

3.采用响应面分析方法验证本发明多酶共固定化条件

根据单因素实验结果，采用Box-Behnken试验设计，对影响Combi-CLEAs活性的显著因素进行3因素3水平设计。各因素编码及水平见表1所示。

根据相应的试验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、平方项和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值。

表1Box-Behnken响应面设计试验因素水平和编码

4.从共固定化多酶(Combi-CLEAs)酶学性质研究确定本发明工艺参数

(1)Combi-CLEAs的最适温度：分别测定Combi-CLEAs在30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、45℃和50℃温度下的酶活，结果用相对酶活表示，以测定的最大酶活为100％。以游离多酶ARO8:ARO10:ADH1的最佳配比1:0.25:1(U:U:U)为对照。

(2)Combi-CLEAs的温度稳定性：将Combi-CLEAs分别置于10℃、30℃、50℃、70℃和90℃下保温5h，测定剩余酶活。测定结果用相对酶活表示，以未保温的酶活为100％。以游离多酶ARO8:ARO10:ADH1的最佳配比1:0.25:1(U:U:U)为对照。

(3)Combi-CLEAs的最适pH：将Combi-CLEAs加入不同pH的缓冲溶液中，混合均匀，4℃放置30min，在最适温度条件下反应，测定酶活。pH体系分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，其中pH3.0～5.0为0.1M醋酸钠缓冲液，pH6.0～7.0为0.1M磷酸钠缓冲液，pH8.0为0.1M Tris-HCl缓冲液；pH9.0为0.05M Gly-NaOH缓冲液。结果用相对酶活表示，以测定的最大酶活为100％。以游离多酶ARO8:ARO10:ADH1的最佳配比1:0.25:1(U:U:U)为对照。

(4)底物浓度对Combi-CLEAs活性的影响：测定Combi-CLEAs在L-苯丙氨酸与草酰乙酸的摩尔比分别为0.2:1、0.5:1、0.75:1、1:1、1.5:1和2:1条件下的酶活，结果用相对酶活表示，以测定的最大酶活为100％。以游离多酶ARO8:ARO10:ADH1的最佳配比1:0.25:1(U:U:U)为对照。

(5)Combi-CLEAs的贮存稳定性：取Combi-CLEAs分别置于4℃冰箱保存40d，每隔一定时间取出等量酶液测定酶活，以测定的最大酶活为100％，结果用相对酶活表示。以游离多酶ARO8:ARO10:ADH1的最佳配比1:0.25:1(U:U:U)为对照。

(6)Combi-CLEAs的操作稳定性：取等量游离多酶和Combi-CLEAs分别作用L-苯丙氨酸，终止反应后滤出酶液继续下一批次反应，测定每批反应的酶活，以测定的最大酶活为100％，结果用相对酶活表示。

二、试验结果

1.多酶共固定化条件研究结果

(1)沉淀剂种类的选择

利用中性盐、水溶性有机溶剂和非离子型高聚物沉淀游离酶是制备CLEAs的第一步，沉淀剂种类不同，诱导出的酶构象也不同，随后的交联反应定格方式也不同，最终的交联酶聚集体的活性差异极大。因此沉淀剂的种类对酶活有很大影响。经过针对性研究筛选和对比试验，本实施例向等量的多酶液中分别加入不同8种沉淀剂((NH4)₂SO₄、叔丁醇、PEG6000、异丙醇、正丁醇、乙醇、丙酮、乙腈)，测得各种聚集体的酶活如图13所示，图13中，CK:游离酶；A:90％(NH4)₂SO₄；B:90％叔丁醇；C:60％PEG6000；D:90％异丙醇；E:90％正丁醇；F:90％乙醇；G:90％丙酮；H:90％乙腈)。从图13中可以看出，各种沉淀剂对混合多酶的沉淀效果各有差异，以硫酸铵和叔丁醇作为沉淀剂最终所得到的酶聚体的活性较高，酶活回收率达到68％。硫酸铵是一种中性盐，在溶液中能破坏蛋白质的水化层而使蛋白质凝集沉淀。叔丁醇是一种水溶性有机溶剂类蛋白沉淀剂，沉淀的原理主要是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加带电质点间的相互作用，增加蛋白质分子之间的相互吸引，致使蛋白质颗粒间容易凝集；其次，这种极性有机溶剂能与水互溶，脱去蛋白质分子周围的水化层，破坏蛋白质分子的水膜而是蛋白发生沉淀。PEG 6000是一种不带电荷的直链聚合物，主要通过空间位置排斥作用以及很强的亲水性，来破坏蛋白质分子表面的水化层，使酶聚集或脱水而沉淀。本文以60％PEG 6000制备的聚集体相对酶活只有43％，可能是PEG浓度不高、对酶的空间排斥作用不强所致，此外，PEG溶液的粘度大，影响操作，试验重复性不好。其它有机溶剂如丙酮、乙腈的沉淀效果都比较好，但是酶活不高，这是因为这些有机溶剂在沉淀过程中对酶活的影响很大，造成酶部分失活。因此，经过分析和试验验证，本发明选取硫酸铵作为制备Combi-CLEAs的沉淀剂。

(2)沉淀剂饱和度的确定

本实施例研究了沉淀剂浓度对多酶聚集体活性的影响。以不同饱和度的硫酸铵对多酶混合液沉淀30min，离心后测定各聚集体活性，以等量的游离多酶酶活回收率为100％，结果如图14所示。随着沉淀剂浓度的升高，被沉淀的蛋白量也增多，因而多酶聚集体的活性呈上升趋势；沉淀剂浓度越大，酶蛋白的沉淀越完全，聚集体中的酶活越高。当硫酸铵饱和度从20％增加到40％，多酶的沉淀速度最快，聚集体相对活性从18％显著增加到58％；随着硫酸铵饱和度的继续增大，相对酶活逐渐升高；当其饱和度为90％时，绝大部分多酶被沉淀下来，相对酶活达到最大，但70％、80％和90％三种饱和度的相对酶活差异不显著，从制备成本考虑，沉淀剂的最终饱和度为70％。

(3)沉淀pH的确定

用不同pH的硫酸铵沉淀剂制备多酶聚集体，测定酶活，以等量的游离多酶酶活回收率为100％，结果如图15所示。由图15可知，随着pH值的升高，酶活呈先上升再下降的变化趋势；pH4.0～6.0范围内的相对酶活较高，处于67％～77％之间；当pH5.0时，聚集体活力最大，这是因为重组酶ARO8、ARO10和ADH1的等电点分别为5.81、4.91和5.06，因而在pH5.0附近沉淀最完全。这些在水溶液中被硫酸铵沉淀下来的酶聚集体，酶分子之间通过非共价键结合在一起，当酶聚集体置于水相反应体系中时，聚集体因不稳定而发生分解，酶分子重新溶解在水中，酶分子的空间构象受到破坏，从而影响酶活力，从前述试验结果看出，即使在完全沉淀的条件下，聚集体的最大相对酶活也不足80％，因此，为了避免聚集体的再次溶解，在多酶发生沉淀后需采用一定浓度的交联剂进行交联。

(4)多酶配比的确定

在确定多酶配比时，固定第一个酶ARO8的酶量，按照酶活力对三种酶以不同比例搭配，并在25℃用pH5.0、70％饱和度的硫酸铵沉淀30min，离心后在各聚集体中加入适量戊二醛进行交联，制备Combi-CLEAs，测定其酶活，以等量的游离多酶酶活回收率为100％，结果如图16所示。多酶配比不同，酶的活力不同；ARO8:ARO10:ADH1为1:0.5:1(U/U/U)时，相对酶活最大，这与前述游离三酶联用时的最佳配比有一定偏差，可能是三酶以1:0.5:1配比时，分子直径、空间构象不同的三种重组酶形成的交联聚集体颗粒大小合适，底物分子容易扩散进入聚集体内部，且酶分子间距离比游离酶更近，ARO8产生的苯丙酮酸易被ARO10原位脱羧、苯乙醛易被ADH1原位脱氢，因此，以1:0.5:1配比的酶液制备的Combi-CLEAs获得了最高的活力。

(5)交联剂浓度的确定

戊二醛是适合于本发明固定化体系，其对酶的交联主要是通过醛基和酶分子表面的胺基发生反应，得到不溶性的酶交联聚集体。但戊二醛的用量对制备的酶交联聚集体有不同的影响。ARO8、ARO10和ADH1按照酶活力以1:0.5:1配比后，经70％饱和度硫酸铵沉淀后，加入不同体积的戊二醛对多酶聚集体进行交联，使溶液中戊二醛的终浓度分别为：0.05％、0.10％、0.15％、0.25％、0.50％和0.75％(V/V)，制得各种Combi-CLEAs，测定其酶活，结果如图17所示。由图17可知，随着戊二醛浓度的增加，酶活力呈先小幅上升再持续下降的变化趋势，在戊二醛浓度为0.10％时，相对酶活达到最高；戊二醛浓度由0.50％增加到0.75％时，相对酶活急剧下降了30％。表明在一定范围内，戊二醛用量增大，得到的Combi-CLEAs的量也增多，酶活力增大，但是戊二醛用量过大，会引起对酶的过度交联，导致酶活性的严重损失。这是因为戊二醛主要通过交联作用来降低酶的流失量，在低浓度时，仅有少量的酶分子能够发生交联，得到的不溶性的交联酶聚集体量很少，有大量的酶没有被交联，在洗涤过程中泄漏、流失，因而酶活力低；但是当浓度过高时，戊二醛与酶分子自身的氨基酸发生多位点结合，使蛋白质的高级结构发生一定程度的破坏，不仅造成了酶活力的损失，而且形成结构紧密的聚集体使得底物分子很难接近酶的活性中心，从而影响酶分子活性中心的有效性，因此体现出较低的酶活力。

(6)交联温度的确定

温度也是影响多酶交联聚集体活力的一个重要因素。在多酶聚集体中加入终浓度为0.10％的戊二醛进行交联，分别置于0、10、20、25、30、35、45℃下交联反应120min，测定各Combi-CLEAs的活力，计算相对酶活。从图18中可以看出，温度从0℃升高到30℃时，酶活力不断增大；在20～30℃范围内的酶活增大显著；30℃时，相对酶活最大，达到74％。随着温度的继续升高，酶活力损失增大，45℃时，Combi-CLEAs的相对活力降为43％。因此制备多酶交联聚集体的最适温度选为30℃。

(7)交联时间的确定

交联时间影响多酶聚集体的活性。终浓度为0.10％的戊二醛在30℃下交联多酶聚集体的时间分别为30、60、90、120和150min，测定各Combi-CLEAs的活力，计算相对酶活。结果如图19所示，随着交联时间的增加，Combi-CLEAs的相对酶活也平稳增大，这是因为交联时间越长，交联越彻底，多酶交联聚集体的量越多，酶的活力越大；当超过120min时酶活开始下降，交联150min时，相对酶活下降到41％，这是因为交联时间过长，过多的戊二醛覆盖酶的部分活性部位，影响酶活力；此外，交联时间过久，戊二醛易发生聚合和氧化等反应，从而影响酶活和交联效果。因此，交联时间对Combi-CLEAs的稳定性和活性非常重要，故确定120min为合适的交联时间。

三、多酶共固定化条件的响应面研究验证试验

1.Box-Benhnken试验结果与分析

本发明采用Box-Behnken试验设计，以(NH4)2SO4为沉淀剂，选取多酶配比为1:0.5:1、沉淀pH为5.0、交联时间为120min，对影响多酶CLEAs活性的显著因素进行3因素3水平的设计，以3次试验所得酶活力回收率的平均值为响应值(Y)，具体试验设计和结果如表2所示。

表2Box-Behnken试验设计及其结果

(2)二次回归拟合及方差分析

应用统计软件SAS 8.0(Statistics Analysis System)对表2的数据进行二次多项回归拟合，统计学上的显著性由T检验确定，决定系数和变异系数由F测验决定。由Box-Behnken试验数据拟合得到响应值(Y)与各因子(A,B,C)之间的二次回归方程为：

Y＝-1024.29+17.18A+519.85B+31.61C+8.63AB-0.079AC+11.78BC-0.11A²-7488.50B²-0.47C²

对上述二元回归方程进行显著性分析及方差分析，结果见表3。

表3Box-Behnken试验设计回归方程的方差分析

各因素与响应值之间线性关系的显著性由F值检验来判定，概率P(F＞F_α)的值越小，则说明变量的显著性越高。失拟项(Lack of fit)是用来评估方程可靠性的一个重要数据，如果显著，表明方程模拟不好；如果不显著，表明方程模拟比较好，可以很好地分析以后的数据，即可以用该回归方程代替真实试验点对实验结果进行分析和预测。由表3可知，模型的显著水平为0.0001(<0.01)，表明模型对响应值(酶活力回收率)的影响极显著，该模型在统计学上有意义。交联温度影响极显著，3因素对酶活力回收率的影响显著性为交联温度>硫酸铵饱和度>戊二醛浓度；交互项A(硫酸铵浓度)与B(戊二醛浓度)、A(硫酸铵浓度)与C(交联温度)交互作用显著，说明这3个因素都是Combi-CLEAs制备过程中的关键控制因素；二次项A²、B²、C²影响极显著。失拟项P＝0.6311(>0.05)，没有显著性意义，说明数据中没有异常点，不需要引入更高次数的项，模型适当。

表4模型的可信度分析

Std.Dev.	2.58	R-Squared	0.9864
				Mean	46.63	Adj R-Squared	0.9688
C.V.％	5.54	Pred R-Squared	0.9153
				PRESS	290.63	Adeq Precision	19.485

由表4可以看出，相关系数R²＝0.9864，说明响应值的变化有98.64％来源于所选三个变量。校正决定系数R²(Adj)＝0.9688(>0.80)，说明96.88％的实验数据的变异性可用此模型解释；而较低的变异系数C.V.％(5.54％)表明，模型中仅有5.54％变异不能由该模型解释，即有94.45％的变异可以由由该模型来解释，表明该模型是高度显著的。信噪比Adeq Precision大于4比较合理，该模型信噪比为19.485，表明模型能很好反映真实的实验值。综上分析，该回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用其确定Combi-CLEAs的最佳制备条件。

3.验证试验

根据Box-Behnken设计模型分析得知，多酶共固定化条件优化工艺参数为：(NH₄)₂SO₄饱和度为71.57％，戊二醛浓度为0.10％，交联温度为28.55℃。在此条件下，酶活回收率预测值为67.29％。为了确定建立的模型与试验结果是否相符，根据实际操作，将固定化工艺参数修正为(NH₄)₂SO₄饱和度为72％，交联温度为29℃，戊二醛浓度仍为0.10％；在此参数下，进行了3组实验，得到的酶活回收率为65.76±3.27％，与模型预测值接近。所拟合数据模型很好地与本发明实际方案具有较好的吻合度。

4.共固定化多酶酶学性质研究试验

(1)温度对共固定化多酶活性的影响

高温下酶的活性构象发生解离，是酶活性降低或丧失的根本原因，而固定化技术通过酶分子之间或酶与载体之间的各种共价键的连接，可有效减少这种构象的解离。因此大多数酶经固定化后，最适温度较游离酶会有所提高。本实验分别测定了不同温度下Combi-CLEAs和游离酶的活性，结果如图20所示。由图20可知，游离酶的最适温度为37℃，Combi-CLEAs的最适温度有小幅升高，为40℃；且Combi-CLEAs的适宜作用温度范围较游离酶宽，在37～50℃范围内，其相对酶活力都保持在最高酶活的86％以上。表明交联固定化技术提高了酶的催化温度。其原因是交联剂戊二醛形成的交联酶聚集体结构比较致密，对酶的活性基团有一定的保护作用。从图中也可看出，随度着温度的进一步升高，固定化酶和游离酶的活性都逐渐降低，因此，除了确定其最适温度，还应考虑固定化酶的热稳定性。

(2)共固定化多酶的温度稳定性

热稳定性是考察固定化酶性能的一个重要指标。对固定化酶和游离酶在不同温度下处理5h，测定其剩余酶活性，结果如图21所示。图中可以看出，随着温度提高，Combi-CLEAs和游离多酶的活性均呈下降趋势，但游离酶的活性下降幅度更大；在50℃保温5h后，Combi-CLEAs的相对酶活仍保持在80％，而游离酶仅50％；90℃处理5h后，前者剩余活力为25％，后者不足10％。由此可见，共交联酶聚体这种固定化方法能有效提高酶的热稳定性，明显降低热失活程度。其原因是游离酶形成CLEAs后，空间结构发生变化，部分活性基团被包埋在聚集体内部，从而受到了保护，因此耐热性有所增强；此外，较高的温度有利于底物分子扩散至聚集体内部与酶发生反应。

(3)pH对共固定化多酶活性的影响

酶的活力易受环境pH的影响，只有在一定pH下，酶才能表现最大活力。由于载体对微环境中离子强度的影响，固定化酶的最适pH值往往会发生漂移。本实施例测定了pH 3.0～9.0的缓冲液中Combi-CLEAs和游离多酶的活性，结果见图22。由图可知，Combi-CLEAs的最适pH为5.0，游离多酶的最适pH为6.0，Combi-CLEAs向酸性偏移了一个单位，其适宜作用pH范围也向酸偏移。可能是因为交联过程中，戊二醛分子中的醛基与酶分子中的氨基发生了亲核反应，使得蛋白质分子侧链基团的负电荷增多，外部溶液中的pH必须向酸性偏移才能中和这些负电荷。

(4)底物浓度对共固定化多酶活性的影响

研究底物的浓度配比影响共固定化多酶(Combi-CLEAs)活性时，保持底物草酰乙酸浓度为10mM不变的情况下，对底物L-苯丙氨酸和草酰乙酸采用不同的摩尔比，在Combi-CLEAs的最适条件下保持5min后，测定酶活，结果如图23所示。由图可见，底物配比对共固定化多酶和游离多酶的影响一致，当L-苯丙氨酸与草酰乙酸摩尔比低于0.75:l时，二者的相对酶活都随L-苯丙氨酸浓度的增加而增大，但固定化多酶的相对酶活稍高；当底物摩尔比超过1.5:1时，因L-苯丙氨酸的抑制，二者活力稍有下降，固定化多酶下降速度稍快。由此可见，L-苯丙氨酸与草酰乙酸的摩尔比为0.75:l时，固定化多酶和游离多酶的相对酶活最大。

(5)共固定化多酶的贮存稳定性

酶的贮存稳定性对其商业化应用非常重要。将游离多酶和共固定化多酶CLEAs置于4℃冰箱保存40d，每隔一定时间测定酶活，结果如图24所示。在贮存的前10d内，两者的活力都没有明显变化；20d后，固定化酶维持98％的活性，游离酶活性为95％；40d后，酶活力都有所下降，但Combi-CLEAs的下降趋势比游离酶缓慢，两者活性分别维持初始酶活的87％和70％。表明固定化酶的贮存稳定性较好，这主要是因为Combi-CLEAs制备过程中的沉淀和交联步骤对酶有提纯作用，避免了杂蛋白造成酶的水解。此外，酶分子以多点共价交联形式牢牢锁定在一个区域内，避免了酶以游离态形式泄漏到溶液中。

(6)共固定化多酶的操作稳定性

可重复利用性也是衡量固定化酶性能的一个重要指标。在每一批次反应结束后，将Combi-CLEAs滤出继续下一批次反应，结果见图25。固定化多酶在重复使用4次后，底物的转化率为23％，维持了66％的初始酶活，而游离酶因为难以回收，使用1次后酶活只保留了4％，说明Combi-CLEAs具有较好的重复操作性；连续使用8次后，固定化多酶活力下降幅度极大，仅剩19％的活力，主要原因是多次重复影响其稳定性，其次是Combi-CLEAs颗粒细小、影响回收。

实施例4多酶共固定体系应用于共反应制备2-苯乙醇

依响应面分析得出的最优工艺参数，进行多酶共固定，按照最佳条件合成2-苯乙醇。Combi-CLEAs加入量为100μL，在pH5.0、40℃水浴5min后，以等体积的乙腈终止反应，用HPLC测得2-苯乙醇的含量为28.61μM。共固定化多酶的酶活力为0.057μmol/(min·mL)。

实施例5优化的三种重组酶的构建方法

以下构建方法中没有特别说明的均为参照本领域常规技术，没有说明的生物材料均为市购或本领域常规使用的生物材料。

一、从酿酒酵母的不同菌株中克隆得到了以Ehrlich途径合成2-苯乙醇的3个关键酶的11个基因。

(1)3个芳香族氨基转氨酶Ⅰ基因。其DNA序列长度为1503bp，相对分子质量大小为56.2kD，理论等电点为5.81。3个基因的Genbank登录号分别为KC422721.1、KC422722.1和KC422723.1。

(2)3个苯丙酮酸脱羧酶基因。其DNA序列长度为1908bp，相对分子质量大小为71.4kD，理论等电点为6.10。其中2个基因在Genbank中注册，登录号分别为KC422719.1和KC422720.1。

(3)5个醇脱氢酶基因。分别为：2个醇脱氢酶Adh1基因、1个醇脱氢酶Adh2基因、1个醇脱氢酶Adh3基因和1个醇脱氢酶Sfa1基因。其中，Adh1和Adh2基因的DNA序列长度都为1047bp，相对分子质量大小约为36.8kD，DV10-Adh1基因的理论等电点为6.07，EC1118-Adh1和DV10-Adh2理论等电点都为6.21。EC1118-Adh1基因和DV10-Adh2的Genbank登录号分别为KC491732.1和KC491733.1。YT0801-Adh3基因的DNA序列长度为1128bp，相对分子质量大小为40.4kD，理论等电点为8.65，其Genbank登录号为KC422718.1。YT0801-Sfa1基因的DNA序列长度为1161bp，相对分子质量大小为41kD，理论等电点为6.51，其Genbank登录号为KC491734.1。

材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株和大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5ɑ，常规菌株，可以使用其他实验室常规实验使用的菌株，本实施例使用的菌株为本实验室常规保存的实验用菌株。克隆载体pGEM-T Easy Vector，Promega公司产品。

TakaRaEx Taq酶购自大连宝生物工程有限公司；普通琼脂凝胶DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；常规试剂均为国产分析纯。

根据已报道的目的基因序列信息，利用primer 5和oligo 6.0设计特异性引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列信息见表5。

表5引物序列信息表

酿酒酵母的培养及总DNA的提取：

分别从不同酿酒酵母菌株中提取基因组DNA，参照蜗牛酶过夜处理法(王萍等，2008；赵宏宇等，2011)。以酿酒酵母总DNA为模板，利用上述特异性引物进行PCR反应扩增目的基因的DNA全长片段，PCR扩增反应体系为：

PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性45s，46℃退火45s，72℃延伸90s；共33个循环；72℃延伸10min，PCR产物4℃下保存。

目的片段PCR扩增产物的回收：扩增PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，用TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。

PCR产物的连接：回收的PCR产物与载体T-easy Vector连接，重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH5α。连接反应体系如下：

连接混合物在4℃下连接过夜，转化大肠杆菌感受态DH5α(CaCl₂法)。

连接产物的转化和大肠杆菌感受态细胞的制备参照现有常规技术。

连接产物的转化包括以下步骤：

步骤一：大肠杆菌感受态细胞的制备

(1)从37℃培养16h的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到装有100mL LB培养基的250mL三角瓶中，于37℃剧烈摇动3h(220rpm)。

(2)在无菌条件下将大肠杆菌转移到一个无菌、一次性使用的预冷的50mL离心管中，冰上放置10min。

(3)于4℃用GS3转头以4000rpm，离心10min收集细胞。

(4)倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽。

(5)以10mL用冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份沉淀，冰浴30min后，再以4000rpm离心10min收集细胞。

(6)弃尽上清，并以2mL冰预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，4℃放置，72h以内使用；或在0.1M CaCl₂基础上添加甘油至终浓度20％，分装后于-70℃保存，长期备用。

步骤二：大肠杆菌感受态细胞的鉴定

(1)吸取100μL感受态细胞的悬浮液，加入2μL不带目的基因的质粒(抗Amp)，混匀，冰浴30min。同时作空白对照一个，即另外吸取100μL感受态细胞的悬浮液，不加质粒。

(2)42℃水浴放置90s，快速转移到冰上，使细胞迅速冷却1～2min。

(3)加入400μL的LB液体，37℃水浴恢复5min，转入37℃摇床200rpm振荡培养45min。

(4)在100mL冷却至46℃的LB固体培养基中，加入200μL的Amp(50μg/μL)，混合均匀，注入平皿。

(5)加入100μL(3)，均匀涂布。

(6)待晾干后，倒置平板，37℃培养过夜，观察结果。

(7)不加质粒的对照无菌落产生；加质粒的有均匀密布的菌落产生。说明感受态细胞有较好的转化能力，且无抗Amp的杂菌。

步骤三：连接产物的转化

(1)从-70℃冰箱中取200μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置于冰上；

(2)加入连接混和液10μL，轻轻摇匀，冰上放置30min；

(3)42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3～5min；

(4)加入1mL不含Amp的LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp⁺)；

(5)将上述菌液摇匀后取100μL均匀涂布于含Amp⁺的筛选平板上，正面向上放置0.5h以便液体被吸收；

(6)待菌液完全被培养基吸收后，倒置平板，于37℃培养16～24h；

(7)待菌落充分显色后，挑取带重组质粒的克隆(白斑)作培养，用无菌牙签在LB固体培养基中挑转化后的白色单菌落，接种到2mL含有抗生素氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h。

重组质粒的提取：参照说明书用TIANGEN质粒小提试剂盒对转化菌株进行重组质粒提取。

重组质粒的酶切鉴定：酶切反应体系为：

37℃保温3h，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

PCR鉴定和酶切鉴定无误的克隆携带菌株，由北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。

核酸序列比对在NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上进行，氨基酸序列比对在EBI-BLAST(http://www.ebi.ac.uk)上进行，核酸序列分析用DNassist 2.0和NCBI Spidey完成，核酸与氨基酸序列绘制用DNAMAN完成，蛋白质结构与功能的预测在Swissprot(http://www.expasy.ch/sprot/)网站上提供链接的平台上进行。

本实施例分别提取17个不同酿酒酵母菌株的总DNA，以ARO8F和ARO8R为引物进行PCR扩增，结果从3个酵母菌株中得到的PCR产物大小都约为1500bp，与预期相符。转化E.coli DH5α，提取阳性重组质粒，经EcoRⅠ酶切鉴定，插入片段大小约1500bp，与预期目标基因接近，见图26所示。其中图26中，左(a)为Aro8基因PCR产物的电泳分析结果；右图(b)为重组质粒的酶切鉴定结果。M:MakerⅢ；1～3:YT0801-Aro8、EC1118-Aro8和DV10-Aro8的PCR产物；1₀～3₀:重组质粒；1₁～3₃:1₀～3₀号质粒的酶切产物。

本实施例提取17株不同酿酒酵母菌株的总DNA，以ARO10F和ARO10R为引物进行PCR扩增。结果从3株酵母菌株中得到的PCR产物大小都约为1900bp，与预期相符。回收PCR产物，转化DH5α感受态细胞，在含Amp⁺的LB平板上进行蓝白斑筛选。提取阳性重组质粒，EcoRⅠ酶切鉴定。酶切结果显示电泳条带清晰，插入片段大小约1900bp，与预期目标基因接近，见图27所示，图中，左图(a)为Aro10基因PCR产物的电泳分析；右图(b):重组质粒的酶切鉴定。M:MakerⅢ；1～3:YT0801-Aro10、EC1118-Aro10和DV10-Aro10的PCR产物；1₀～3₀:重组质粒；1₁～3₃:1₀～3₀号质粒的酶切产物。

本实施例提取17个不同酿酒酵母菌株的总DNA，进行PCR扩增。从2株酵母中得到与Adh1基因大小相符的PCR产物(约1050bp)，由1株酵母得到与Adh2基因大小相符的PCR产物(约1050bp)，由1株酵母得到与Adh3基因大小相符的PCR产物(约1150bp)，由1株酵母得到与Sfa1基因大小相符的PCR产物(约1150bp)。回收PCR产物，转化E.coli DH5α，进行蓝白斑筛选，提取阳性重组质粒，经EcoRⅠ酶切鉴定，插入片段大小都与预期目标基因接近，见图28所示。图28中，左图(a)为PCR产物的电泳分析；右图(b)为重组质粒的酶切鉴定，M:MakerⅢ；1～5:DV10-Adh1、EC1118-Adh1、DV10-Adh2、YT0801-Adh3和YT0801-Sfa1的PCR产物；1₀～5₀:重组质粒；1₁～5₅:1₀～5₀号重组质粒的酶切产物。

二、利用大肠杆菌BL21(DE3)分别对3个关键酶基因所编码的蛋白进行原核表达，经SDS-PAGE检测，3种蛋白的分子量大小与采用生物信息学方法预测的大小基本一致。

(1)将YT0801-Aro8基因克隆到表达载体pET-32a(+)上，构建了芳香族氨基转氨酶Ⅰ基因工程菌株。30℃下，经IPTG诱导8h，工程菌株能表达重组酶ARO8。经纯化，融合蛋白ARO8的浓度为462.3mg/L。经SDS-PAGE检测，其分子大小约为70kDa。

(2)将YT0801-Aro10基因克隆到表达载体pET-32a(+)上，构建了苯丙酮酸脱羧酶基因工程菌株。28℃下，经IPTG诱导3h，工程菌株能表达重组酶ARO10。经纯化，融合蛋白ARO10的浓度为202.2mg/L。经SDS-PAGE检测，其分子大小约为90kDa。

(3)将DV10-Adh1基因克隆到表达载体pET-32a(+)上，构建了醇脱氢酶基因工程菌株。28℃下，经IPTG诱导3h，工程菌株能表达重组酶ADH1。经纯化，融合蛋白ADH1浓度为252.6mg/L。经SDS-PAGE检测，其分子大小为61kDa。

材料：质体转化受体菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)由中山大学生命科学院刘玉焕教授馈赠，也可以采用本领域常规使用的该种受体菌。pMD18-T载体购自Promega公司，pET-32a(+)载体由中山大学生命科学院刘玉焕教授馈赠，也可以采用本领域常规使用的该载体。

氨苄青霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉双丙烯酰胺(BIS)、β-巯基乙醇、溴酚蓝(BPB)、琼脂糖、琼脂粉均为进口分装，购自北京普博欣生物科技有限公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司；蛋白纯化树脂His·bind resin及纯化柱购于Merck公司(德国)；各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、低分子量蛋白标准，购自宝生物(大连)工程有限公司。DNAMarkerⅢ、1kb plus DNA Ladder(MD113)

、蛋白质Marker，购自天根生化科技(北京)有限公司。L-苯丙氨酸、草酰乙酸、天冬氨酸、苯丙酮酸、苯乙醛、2-苯乙醇等化学标准品购自美国Sigma-Aldrich公司。其他化学试剂均为国产分析纯或色谱纯。

培养基：LB(Luria-Bertani)培养基(1000ml)：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，pH自然(固体培养基需另加入20g琼脂粉)，121℃下灭菌15min。冷却至室温加入氨苄青霉素到培养基中，终浓度为1g/L。LB培养基-X-gal-IPTG(1000ml)：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，pH自然，20g琼脂粉，121℃下灭菌15min。冷却至室温加入100μL的氨苄青霉素(100mg/mL)，在培养基中加入10μL的IPTG(24mg/mL)，200μL的X-gal(20mg/mL)。

(1)引物设计

根据目的序列两端的已知序列信息，设计PCR扩增引物，如表6所示。

表6引物序列信息表

引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。DNA测序由华大基因有限公司完成。

(2)克隆基因的PCR扩增

以提取的克隆质粒为模板，进行PCR扩增反应，反应体系如下：

YT0801-Aro8基因PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸90s；共33个循环；72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。

YT0801-Aro10基因PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸120s；共35个循环；72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。

DV10-Adh1基因PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸60s；共33个循环；72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。

(3)PCR扩增产物的回收、连接与转化

PCR扩增产物回收后，在4℃下连接pMD18-T载体过夜，转化E.coli DH5α。连接反应体系如下：

(4)重组质粒的双酶切鉴定与序列测定

提取重组质粒，进行双酶切鉴定，酶切体系如下：

本实施例所涉及的含Aro8基因的重组质粒用EcoR I和Xho I酶切鉴定，含Aro10和Adh1基因的重组质粒用BamH I和Xho I酶切鉴定，产物应为大小两个片段，将酶切鉴定无误的重组质粒测序。

(5)载体pET-32a(+)和重组质粒的连接与转化

双酶切载体pET-32a(+)和重组质粒，37℃水浴3h，电泳。酶切体系如下：

用琼脂糖凝胶分别回收小、大DNA片段，建立连接体系，插入片段的量与载体的量视片段的大小及其DNA浓度而定，一般采取比例3:1。加入T4连接酶(350U/μL，1.0μL)及连接酶缓冲液(1.0μL)，以去离子水补充体系至10μL，轻弹混匀，16℃连接过夜，转化E.coli DH5α，提取重组质粒，经双酶切鉴定和序列测定。根据基因的来源，表达载体质粒分别命名为p32-YT0801-Aro8、p32-YT0801-Aro10和p32-DV10-Adh1。电泳分析如图29、图30和图31所示。并将此重组质粒进行测序鉴定，测序结果与目的基因序列完全一致。表明表达载体p32-YT0801-Aro8、p32-YT0801-Aro10和p32-DV10-Adh1已构建成功。图29中，M:MakerⅢ；1:质粒；2:酶切产物。图30中，M:MD113；1～6:质粒；1₀,5₀:1号和5号质粒的酶切产物。图31中，1～5:质粒；1₀₂,2₀,4₀:1、2和4号质粒的酶切产物。

(6)表达载体的转化：表达载体质粒转化表达菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。提取重组质粒，经双酶切鉴定。

重组蛋白的诱导表达及纯化：

(1)重组蛋白的诱导表达，主要包括以下步骤：(1)取保存的重组阳性克隆子于含有100μg/mLAmp的LB平板划线，37℃培养过夜。(2)挑取单菌落，接种到含有100μg/mLAmp的15mL液体LB培养基中，37℃，200r/m培养过夜。(3)取500μL菌液转接到含有Amp的50mLLB培养基中(1:100)，37℃，200rpm扩大培养至OD为0.8(约2.5h)，添加100mM的IPTG至其终浓度为1mM。在一定温度下诱导表达一定时间。(4)8000rpm离心15min，分别收集菌体和上清液，-20℃保存备用。(5)超声破碎并进行蛋白电泳，观察蛋白表达情况。

(2)重组蛋白的提取：用PBS洗涤菌体2～3次，按原菌液体积1/5～1/10的比例加入裂解液，进行菌体重悬。采用冰浴超声破碎菌体，超声条件是功率400W，超声3s，间隔2s，破碎60次。12000rpm离心5min，将上清用离心管收集，进行SDS-PAGE分析。

(3)重组蛋白的纯化，主要包括以下步骤：(1)将1mL50％Ni-NTAHis·bind树脂悬液加入到4mL1×Ni-NTA结合缓冲液中，轻柔混匀。(2)待树脂自然沉降后，用枪头吸取4mL上清，加入4mL制备好的上清液，轻柔混匀，4℃结合60min。

(3)将裂解液Ni-NTAHis·Bind树脂混合物加入下端封闭的空色谱柱中，除去下端封闭盖子，收集流出液(穿过峰)，保存，用于SDS-PAGE电泳分析。(4)以4mL1×Ni-NTA漂洗缓冲液漂洗两次，收集漂洗组分，用于SDS-PAGE电泳分析。(5)以0.5mL1×Ni-NTA洗涤缓冲液洗脱目的蛋白4次，将洗脱组分分为4部分收集，并进行SDS-PAGE电泳分析各保存组分，最后确定目的蛋白。(4)重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析：本发明中重组蛋白的电泳分析，根据其分子量选用8％的SDS-PAGE(>10kDa)的电泳方案。电泳凝胶的配方，电泳参数及凝胶的染色、脱色方法均参照标准实验方法进行。

(5)参考奥斯伯的方法(1998)测定重组蛋白的浓度：

重组蛋白ARO8浓度的测定：制作牛血清标准曲线，方程为Y＝0.0009X-0.0086，方程校正系数为0.9967，线性拟合较好。测定上清总蛋白和纯化后目的蛋白的浓度，分别为1149.2mg/L和462.3mg/L，目的蛋白占总蛋白的40.2％。

重组蛋白ARO10浓度的测定：测定上清液总蛋白和纯化后ARO10蛋白的吸光度值，根据BSA标准曲线，计算得知总蛋白和纯化后ARO10的浓度，分别为789.9mg/L和202.2mg/L，目的蛋白占总蛋白的25.6％。

重组蛋白ADH1浓度的测定：测定上清液总蛋白和纯化后ADH1蛋白的吸光度值，根据BSA标准曲线，计算得知总蛋白和纯化后ADH1的浓度，分别为880.1mg/L和252.6mg/L，目的蛋白占总蛋白的28.7％。

三、鉴定了3种重组酶的生物活性，并分别研究重组酶的酶学性质。

(1)经HPLC和LC-MS检测，重组酶ARO8具有芳香族转氨酶I的正常生物活性，能够催化L-苯丙氨酸生成苯丙酮酸。ARO8的最适温度和最适pH分别为30℃和7.0，热稳定性较好。其催化活性需要Mg²⁺的参与，Fe³⁺、Fe²⁺和Cu²⁺抑制其活性。低浓度甲醇和DMSO等有机溶剂对其酶活具促进作用。在30℃、pH7.0条件下，重组酶ARO8作用于L-phe的米氏常数K_m为6.577mM，最大反应速率V_max为10.352μM/min；作用于草酰乙酸的米氏常数K_m为15.779mM，最大反应速率V_max为16.863μM/min。最适条件下的酶活力为0.87μmol/(min·mL)。

(2)经GC-FID和GC-MS检测，重组酶ARO10具有苯丙酮酸脱羧酶的正常生物活性，能够催化苯丙酮酸生成苯乙醛。ARO10的最适温度和最适pH分别为37℃以及6.0，热稳定性良好。ARO10需以ThPP和Mg²⁺作为辅助因子，Cu²⁺和Mn²⁺对酶活有促进作用，Fe³⁺等金属离子抑制酶活。甲醇等有机溶剂都抑制其酶活。在37℃、pH6.0条件下，重组ARO10作用于苯丙酮酸的K_m为8.239mM，最大反应速率V_max为2.994μM/min。最适条件下的酶活力为0.22μmol/(min·mL)。

(3)经HPLC和LC-MS检测，重组醇脱氢酶ADH1具有该酶的正常生物活性，能够将苯乙醛还原为2-苯乙醇。ADH1的最适温度和最适pH分别为35℃和6.0，对热敏感。Zn²⁺和Mg²⁺促进其活性，而Fe³⁺等金属离子抑制其活性。有机溶剂甲醇和低浓度的乙醇也能促进酶活。在pH6.0和35℃条件下，ADH1作用于苯乙醛的米氏常数K_m为3.612mM，最大反应速率V_max为18.587μM/min。最适条件下的酶活力为1.75μmol/(min·mL)。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物ARO8F

<400> 1

atgactttac ctgaatcaaa agact 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物ARO8R

<400> 2

ctatttggaa ataccaaatt cttcg 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物ARO10F

<400> 3

ttaagcatgg cacctgttac aat 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物ARO10R

<400> 4

gcgcccacaa gtttctattt tttat 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物ADH1F

<400> 5

gcttatttag aagtgtcaac aacgt 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物ADH1R

<400> 6

atgtctatcc cagaaactca aaaag 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物ADH2F

<400> 7

atgtctattc cagaaactca aaaag 25

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物ADH2R

<400> 8

ttatttagaa gtgtcaacaa cgtatc 26

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物ADH3F

<400> 9

atgttgagaa cgtcaacatt g 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物ADH3R

<400> 10

ttatttacta gtatcgacga cgta 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物SFA1F

<400> 11

atgtccgccg ctactgttgg taaac 25

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物SFA1R

<400> 12

ctattttatt tcatcagact tcaagacggt tc 32

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物p32-ARO8F

<400> 13

cggcggaatt catgacttta cctgaatcaa 30

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物p32-ARO8R

<400> 14

ggcctcgagc tatttggaaa taccaaat 28

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物p32-ARO10F

<400> 15

tggatccatg gcacctgtta caattgaaaa g 31

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物p32-ARO10R

<400> 16

gcgctcgagc tattttttat ttcttttaag tgcc 34

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物p32-ADH1F

<400> 17

cggatccatg tctatcccag aaactcaaaa ag 32

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物p32-ADH1R

<400> 18

cgctcgagtt atttagaagt gtcaacaacg t 31

Claims (10)

1.一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，是在同一反应体系内通过重组转氨酶Ⅰ ARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10和醇脱氢酶ADH1组成的共催化体系催化转化L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸经由苯丙酮酸、苯乙醛转化为2-苯乙醇；其中，所述反应体系内，是以L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，重组酶ARO8、ARO10和ADH1按酶活力以1:0.25:1、1:1:1、1:0.5:1或1:0.25:2(U/U/U)配比确定，在pH值为5.5～7.5、Mg²⁺浓度为1.0～5mM的反应体系中，水浴温度为30～40℃条件下，反应转化4～7min后，以等体积的乙腈终止反应，即制得2-苯乙醇。

2.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述L-苯丙氨酸和草酰乙酸的摩尔比为0.75:l。

3.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述ARO8、ARO10和ADH1的配比为1:0.25:1。

4.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述Mg²⁺浓度为1.0～2.5mM；优选为1.5mM。

5.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述水浴温度为33～40℃；反应时间为5min。

6.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述pH值为5.5～6.5；优选所述pH值为6。

7.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，是先将所述重组转氨酶Ⅰ ARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10和醇脱氢酶ADH1通过共固定方法制得共催化体系Combi-CLEAs，然后利用Combi-CLEAs对L-苯丙氨酸进行催化转化，经由苯丙酮酸、苯乙醛转化为2-苯乙醇。

8.根据权利要求7所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述反应体系内，pH值为5.0、Mg²⁺浓度为1.0～5mM，水浴温度为40℃，反应转化时间为5min。

9.根据权利要求7所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述共催化体系Combi-CLEAs的制备方法为：将ARO8、ARO10和ADH1按照1:1:1、1:0.5:1或1:0.25:1配比后，经沉淀剂硫酸铵沉淀后形成多酶聚集体，加入戊二醛对多酶聚集体进行交联，制得多酶共固定体系；其中，硫酸铵的饱和度为60～90％，pH值为4～6，戊二醛的加入量按照其终浓度为0.05～0.25％确定。

10.根据权利要求9所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述沉淀剂硫酸铵的饱和度70％；沉淀剂硫酸铵的pH值为5；ARO8、ARO10和ADH1的酶配比为1:0.5:1；所述戊二醛的加入量按照其终浓度为0.1％确定；所述交联的温度为20～35℃；所述交联的时间为30～150min。