CN107338258A - 生产β‑丙氨酸的工程菌构建及其生产β‑丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生产β‑丙氨酸的工程菌构建及其生产β‑丙氨酸的方法，属于生物技术领域，本发明提供一株特基拉芽孢杆菌的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶基因，见SEQ.NO.1，以及包含所述PanD基因的工程菌；本发明还提供产L‑天冬氨酸α‑脱羧酶工程菌的构建方法，并通过表达和分泌获得的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶转化L‑天冬氨酸生产β‑丙氨酸。本发明是国内外第一次使用来源于特基拉芽孢杆菌内的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶转化L‑天冬氨酸生产β‑丙氨酸，该酶在大肠杆菌内表达后，产生的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶酶活力高，菌体无需破碎，即可直接用于转化，最高可以转化180g/L的L‑天冬氨酸，β‑丙氨酸产量达到119.8g/L，工业应用具有优势。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种构建遗传工程菌的方法及其在转化L-天冬氨酸产β-丙氨酸上的应用。
背景技术
一、β-丙氨酸的医疗价值及其生理功能
β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，作为一种重要的精细化工品和药物中间体,其用途广泛：工业上,是合成泛酸钙和肌肽的重要原料,也是合成聚β-氨基丙酸的前体物质；医药上,作为原料用于合成抑制恶性肿瘤骨转移的帕米膦酸钠和抗结肠炎药物巴柳氮,还是复方氨基酸的一种重要成分；同时还可作为铅中毒的解毒剂以及用于合成甜味剂等。由于β-丙氨酸及其衍生物在医药、美容、食品、饲料及化工等领域的广泛应用,市场需求量呈日渐上升趋势。
目前工业上主要通过化学方法生产β-丙氨酸，如丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亚胺(丁二酰亚胺)降解法、β-氨基丙腈法等，存在成本高、工艺条件苛刻、副产物较多及生产环境不友好等缺点，新的生物转化法生产工艺被认为是最有前景的替代方法。
生物转化法是以L-天冬氨酸为生产原料，利用微生物细胞胞内的L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase)催化L-天冬氨酸脱α位羧基生产β-丙氨酸(见图1)。采用基因工程手段构建工程菌是实现酶高效表达的重要途径，目前工程菌株外源表达L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因多来源于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌，酶活不高，专利CN104531796A中通过L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌全细胞催化生产β-丙氨酸，最高催化48g/L的L-天冬氨酸，β-丙氨酸浓度约为32g/L，距离工业化应用尚有距离，且酶需要多次反复投放，操作较为复杂。文献“枯草芽胞杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的酶学性质”(生物工程学报,2015,31(8):1184–1193.)比较了枯草芽孢杆菌和其他菌属来源的PanD基因表达的L-天冬氨酸α-脱羧酶，揭示了芽孢杆菌属酶学性质，具有更好的热稳定性和比酶活，应是实现L-天冬氨酸α-脱羧酶高效表达、高效率转化生产β-丙氨酸的重要选择。
发明内容
本发明是为了克服目前现有工程菌异源表达酶活不高的缺点，提供一种筛选分离到的一株特基拉芽孢杆菌PanD37(CGMCC No.10506)的)L-天冬氨酸α-脱羧酶基因(PanD基因)，并以此为模板构建基因工程菌，以及这种高产工程菌的构建、表达和纯化，及其全细胞转化和发酵液直接转化合成β-丙氨酸的方法；所述的特基拉芽孢杆菌PanD37(Bacillustequilensis PanD37)，已于2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10506，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所采用的技术方案是：
一株特基拉芽孢杆菌PanD37(CGMCC No.10506)的PanD基因，见SEQ.NO.1。
一种产L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌，所述的工程菌包含SEQ.NO.1。产L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法，通过分子生物学手段从微生物中克隆获得L-天冬氨酸α-脱羧酶基因，构建含L-天冬氨酸α-脱羧酶基因的表达载体，将构建好的表达质粒导入E.coliBL21(DE3)，通过氨苄青霉素抗性平板筛选获得表达载体高拷贝重组的含L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌，并通过表达和分泌获得的L-天冬氨酸α-脱羧酶转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸。
一种产L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法，具体实施步骤为：
1、根据特基拉芽孢杆菌全基因组中L-天冬氨酸α-脱羧酶基因的序列信息设计含有限制性内切酶BamHI酶切位点的上游引物F-PanD：5′-AAGGATCCGAAGGAGATATACCATGTATCG-3′；和含有XhoI酶切位点(黑体表示)的下游引物R-PanD：5′-TTCTCGAGCTACAAAATTGTACGGGCGGGTTC-3′；
通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到特基拉芽孢杆菌PanD37(CGMCCNo.10506)基因组DNA，并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系包括10×ExTaqbuffer(Mg2+Plus)4μL，dNTPs mixture4.5μL，TaKaRaExTaq 0.3μL，模板1.0μL，上下游引物各1.0μL，用dd H2O补足至50μL；PCR反应参数为：94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环后，72℃延伸10min；PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶检测，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化目标DNA片段；用BamH I和Xho I分别酶切载体pET32a及PanD片段，然后用DNA连接酶将panD片段与载体连接并转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选阳性克隆，获得产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌；
2、将构建的产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌接入LB斜面培养基培养14-24h；
3、接1环斜面产L-天冬氨酸α-脱羧酶基因的工程菌种于LB液体种子培养基培养6-12h；
4、发酵罐中装入培养基，种子液以5％(体积比)种量接入发酵培养基，初始转速200r/min，初始通气流量为2L/min，随着菌体OD600值增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20％以上，用氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养6-10h，然后降温至24-30℃表达；发酵过程中采用DO-stat、pH-stat方式流加补料培养基；发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集含有L-天冬氨酸α-脱羧酶基因的工程菌菌体。
利用构建的产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸，具体方法如下：
1、将产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌菌体投入转化液中进行转化，其转化液为：pH为7.0、100-200g/L L-天冬氨酸溶液，加入湿的L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌菌体20-80g，转化过程中控制pH在7.0，温度30-40℃，转化10-20h。
进一步，转化液pH值用NaOH调节。
进一步，转化过程中pH值用2mol/L HCl控制。
本发明所述的基因工程菌及其构建应用生产β-丙氨酸的有益效果：
1、本发明是国内外第一次使用来源于特基拉芽孢杆菌内的L-天冬氨酸α-脱羧酶转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸，该酶在大肠杆菌内表达后，表现出很高的活力，可以满足工业化规模生产的需求。
2、建立起的新型生物法生产β-丙氨酸的工艺，可以避免目前主要采用的化学合成法成本高、条件及生产环境不友好等缺点，具有明显的经济社会效益。
3、本发明所提供的L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌遗传稳定性好，培养基成分简单原料成本低，产生的L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活力高，发酵得到的菌体无需破碎，即可直接用于转化，可直接利用该菌株细胞直接转化β-丙氨酸，最高可以转化180g/L的L-天冬氨酸，β-丙氨酸产量达到119.8g/L，工业应用具有优势。
附图说明
图1：L-天冬氨酸α-脱羧酶催化反应机制；
图2：重组质粒pET32a-panD的构建；
图3：β-丙氨酸标准品液相谱图(6.8min)；
图4：基因工程菌转化产物液相谱图(6.8min)。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
含L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌的构建
以特基拉芽孢杆菌PanD37(CGMCC No.10506)全基因组为模板，设计一对引物PCR扩增L-天冬氨酸α-脱羧酶基因PanD，构建重组质粒pET-32a-PanD(如图2所示)，转化E.coliBL21(DE3)得到产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌。
根据特基拉芽孢杆菌全基因组(LGRW01000001)中L-天冬氨酸α-脱羧酶基因的序列信息设计含有限制性内切酶BamHI酶切位点的上游引物F-PanD：5′-AAGGATCCGAAGGAGATATACCATGTATCG-3′；和含有XhoI酶切位点(黑体表示)的下游引物R-PanD：5′-TTCTCGAGCTACAAAATTGTACGGGCGGGTTC-3′。通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到Bacillus tequilensis PanD37(CGMCC No.10506)基因组DNA，并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系包括10×ExTaq buffer(Mg2+Plus)4μL，dNTPs mixture4.5μL，TaKaRaExTaq 0.3μL，模板1.0μL，上下游引物各1.0μL，用dd H2O补足至50μL。PCR反应参数为：94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环后，72℃延伸10min。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶检测，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化目标DNA片段。用BamH I和Xho I分别酶切载体pET32a及PanD片段，然后用DNA连接酶将panD片段与载体连接并转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选阳性克隆，获得L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌。
实施例2
通过表达和分泌获得L-天冬氨酸α-脱羧酶转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸
(1)将构建的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌接入LB斜面培养基培养24h；
(2)接1环斜面L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌种于LB液体种子培养基培养12h；
(3)5L发酵罐中装入3.0L培养基，种子液以5％(体积比)种量接入发酵培养基，初始转速200r/min，初始通气流量为2L/min，随着菌体OD600值增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20％(溶氧电极测定)以上，用25％(g/100ml)氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养6h，然后降温至30℃表达。发酵过程中采用DO-stat方式流加补培养基。发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌体两次。
(4)将步骤(3)收集的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌体投入转化液中进行转化，转化液的配制方法为：100g/L L-天冬氨酸溶液2L，NaOH调节pH为7.0；加入湿L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌体20g，转化过程中自动流加2mol/L HCl控制pH在7.0，温度32℃，在5L自控发酵罐上转化10h,β-丙氨酸浓度为66.3g/L，摩尔转化率99.1％。
转化液中β-丙氨酸含量按以下方法来测定取转化液10000rpm离心10min，收集上清液，并以β-丙氨酸作为标准品，配制标准溶液；将适度稀释后的上清液和标准溶液分别与2，4-二硝基氟苯衍生，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定β-丙氨酸的含量。β-丙氨酸作为标准品的液相谱图(6.8min)如图3所示；基因工程菌转化产物液相谱图(6.8min)如图4所示。
高效液相色谱条件：
液相色谱条件为氨基酸专用ODS-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温：33℃；检测波长：360nm；流动相A：50％乙腈，流动相B：0.45％乙酸钠缓冲液(pH6.4)，按表1梯度洗脱，流动相总流量：1mL/min，2,4-二硝基氟苯柱前衍生测定。
表1流动相洗脱方式
实施例3
通过表达和分泌获得L-天冬氨酸α-脱羧酶转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸
(1)将构建的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌接入LB斜面培养基培养18h；
(2)接1环斜面L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌种于LB液体种子培养基培养8h；
(3)5L发酵罐中装入3.0L培养基，种子液以7％(体积比)种量接入发酵培养基，初始转速200r/min，初始通气流量为2L/min，随着菌体OD600值增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在25％以上，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养9h降温至26℃表达。发酵过程中采用pH-stat方式流加补培养基。发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌体两次。
(4)将步骤(3)收集的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌体投入转化液中进行转化，转化液的配制方法为：150g/L L-天冬氨酸溶液2L，NaOH调节pH为7.0；加入湿L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌体30g，转化过程中自动流加2mol/L HCl控制pH在7.0，温度37℃，在5L自控发酵罐上转化13h,β-丙氨酸浓度为99.9g/L，摩尔转化率99.5％。
实施例4
通过表达和分泌获得L-天冬氨酸α-脱羧酶转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸
(1)将构建的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌接入LB斜面培养基培养14h；
(2)接1环斜面L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌种于LB液体种子培养基培养6h；
(3)5L发酵罐中装入3.0L培养基，种子液以5％(体积比)种量接入发酵培养基，初始转速200r/min，初始通气流量为2L/min，随着菌体OD600值增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20％以上，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养7h降温至25℃表达。发酵过程中采用DO-stat方式流加补培养基。发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌体两次。
(4)将步骤(3)收集的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌体投入转化液中进行转化，转化液的配制方法为：180g/L L-天冬氨酸溶液2L，NaOH调节pH为7.0；加入湿L-天冬氨酸α-脱羧酶基因工程菌菌体20g，转化过程中自动流加2mol/L HCl控制pH在7.0，温度40℃，在5L自控发酵罐上转化18h,β-丙氨酸浓度为119.8g/L，摩尔转化率99.4％。
SEQUENCE LISTING
<110> 鲁东大学
<120> 生产β-丙氨酸的工程菌构建及其生产β-丙氨酸的方法
<130> 无
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 383
<212> DNA
<213> Bacillus sp.
<400> 1
atgtatcgaa caatgatgag cggcaagctt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60
aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120
aatgaaaaag tacaaattgt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180
cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240
gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300
cacgagccga aagtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360
gaacccgccc gtacaatttt gta 383
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 上游引物F-PanD
<400> 2
aaggatccga aggagatata ccatgtatcg 30
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 下游引物R- PanD
<400> 3
ttctcgagct acaaaattgt acgggcgggt tc 32
Claims (7)
1.一株特基拉芽孢杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因，所述特基拉芽孢杆菌的生物保藏号CGMCC No.10506，所述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因序列为SEQ.NO.1。
2.一种产L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌，所述的工程菌包含权利要求1所述的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因。
3.一种产L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌的构建方法，具体实施步骤为：
1)根据特基拉芽孢杆菌全基因组中L-天冬氨酸α-脱羧酶基因的序列信息设计含有限制性内切酶BamHI酶切位点的上游引物F-PanD：5′-AAGGATCCGAAGGAGATATACCATGTATCG-3′；和含有XhoI酶切位点的下游引物R-PanD：5′-TTCTCGAGCTACAAAATTGTACGGGCGGGTTC-3′；
通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到特基拉芽孢杆菌PanD37基因组DNA，所述特基拉芽孢杆菌PanD37的生物保藏号为CGMCC No.10506，并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系包括10×ExTaq buffer 4μL，dNTPs mixture4.5μL，TaKaRaExTaq 0.3μL，模板1.0μL，上下游引物各1.0μL，用dd H2O补足至50μL；PCR反应参数为：94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环后，72℃延伸10min；PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶检测，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化目标DNA片段；用BamH I和Xho I分别酶切载体pET32a及PanD片段，然后用DNA连接酶将panD片段与载体连接并转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选阳性克隆，获得产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌；
2)将构建的产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌接入LB斜面培养基培养14-24h；
3)接1环斜面产L-天冬氨酸α-脱羧酶基因的工程菌种于LB液体种子培养基培养6-12h；
4)发酵罐中装入培养基，种子液以体积比5％的接种量接入发酵培养基，初始转速200r/min，初始通气流量为2L/min，随着菌体OD600值增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20％以上，用氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养6-10h，然后降温至24-30℃表达；发酵过程中采用DO-stat、pH-stat方式流加补料培养基；发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集含有L-天冬氨酸α-脱羧酶基因的工程菌菌体。
4.利用权利要求2或3构建的产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸。
5.权利要求4所述转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸的具体方法，其特征在于将产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌菌体投入转化液中进行转化，其转化液为：pH为7.0、100-200g/L L-天冬氨酸溶液，加入湿的L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌菌体20-80g，转化过程中控制pH在7.0，温度30-40℃，转化10-20h。
6.权利要求5所述转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸的具体方法，其特征在于所述转化液pH值用NaOH调节。
7.权利要求5所述转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸的具体方法，其特征在于转化过程中pH值用2mol/L HCl控制。
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