CN108048500A - β-丙氨酸的生物合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了β‑丙氨酸的生物合成方法，包括重组酿酒酵母全细胞催化L‑天门冬氨酸转化合成β‑丙氨酸的反应；其中所述的重组酿酒酵母含有外源性L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶编码基因。本发明所述方法和应用，具有原材料廉价易得、操作简便易控、合成途径绿色高效、生物安全性好、反应速率快、转化率高等优势，为β‑丙氨酸的工业化生产奠定了基础。

Description

β-丙氨酸的生物合成方法

技术领域

本发明涉及一种简洁、高效的β-丙氨酸微生物合成方法，尤其涉及应用重组基因工程酵母菌生物转化合成β-丙氨酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

β-丙氨酸，又称3-氨基丙酸，是自然界中唯一存在的β型氨基酸。β-丙氨酸在医药、食品、美容、饲料及化工等领域的应用广泛，如合成泛酸钙、肌肽、帕米膦酸二钠、巴柳氮等医药或饲料及食品添加剂。目前β-丙氨酸的生产主要有化学合成以及生物法，化学法应用更早且使用更为普遍，但往往存在污染严重、副反应(产物)多、晶体纯度不高等缺点；而生物酶法则具有底物选择性高、转化率高、且反应过程简单、产物晶体易提纯等优点，近年来受到广泛关注。

专利CN105543119A中从葡萄园筛选到一株L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌株，其分类命名为特基拉芽孢杆菌PanD37(Bacillus tequilensis PanD37)，β-丙氨酸产量为16.25g/L，远低于目前工业化水平。直接从天然菌株中筛选高产L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌株比较困难，因此通过基因工程的方法来提高该酶的活性成了使其应用的唯一方法。

专利CN 101210230A中将大肠杆菌中的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因克隆并进行异源表达，并利用全细胞直接进行催化合成β-丙氨酸，但其反应是在细胞内进行，产量仅2.94g/L，离实际应用还有很大距离。专利CN 106755155A和CN 104531796 A则采用细胞破碎后的酶液进行催化反应，催化效率相比采用全细胞时有所加快，说明采用全细胞进行合成时存在较大的底物进入细胞及产物扩散到胞外的阻力。从目前的报道来看大部分基因工程菌的宿主菌株都是以大肠杆菌为主，但大肠杆菌并非公认的生物安全菌种，在使用过程中存在内毒素污染等生物安全风险，且细胞破碎又会增加分离纯化成本。2015年邓思颖等研究了L-天冬氨酸-α-脱羧酶的酶学性质，不同来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶的稳定性并不理想，反应温度越高，反应速率越快，酶活损失也越大，这对于该酶的工业化生产是不利的。

发明内容

本发明的目的在于提供一套完整的生物转化生产β-丙氨酸的技术方案，期望通过基因工程及细胞表面展示的方法构建重组工程菌，并据其设计合理的生物发酵工程方案，以实现β-丙氨酸绿色、高效、低成本的工业化生产。

为实现上述目的，本发明首先将外源性基因克隆后连接至表达载体，然后将所构建的重组载体转入作为表达宿主的酿酒酵母细胞，通过酵母细胞的培养使酶表达于酵母细胞的表面。基于此，本发明提供β-丙氨酸的生物合成方法，包括重组酿酒酵母全细胞催化L-天门冬氨酸转化合成β-丙氨酸的反应；其中所述的重组酿酒酵母含有外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因。

本发明的方法不但可以克服底物和产物的跨膜阻力，且不需要酶的分离步骤，同时发现，将该酶表达于细胞表面后，该酶的稳定性得到了提升，催化过程中酶活更加稳定，不易失活。基于此，本发明再一方面的目的还在于提供一种β-丙氨酸的生物合成方法，该方法中包括使用上述本发明的重组酿酒酵母对底物的转化反应的步骤。

本发明成功构建重组酿酒酵母细胞，使其作为全细胞催化剂将底物转化为β-丙氨酸，省去了酶的分离纯化，避免了内毒素的隐患及抗生素的使用，具有摩尔转化率高、生产速率快、酶的稳定性强等特点，是实现高效、环保、经济化生产β-丙氨酸的良好选择。

附图说明

本发明附图7幅，其中：

图1是重组载体结构示意图。

图2是重组酿酒酵母表面展示酶的荧光标记及激光共聚焦图像；其中

A-1是白光照射下荧光倒置显微镜验证结果；

A-2是493nm激发波长下荧光倒置显微镜验证结果；

B-1是白光照射下激光共聚焦显微镜验证结果；

B-2是493nm激发波长下激光共聚焦显微镜验证结果。

图3是pH对重组酿酒酵母表面酶活性的影响试验结果。

图4是不同方式的酶催化对比试验结果。

图5是不同温度条件下酶活检测试验结果。

图6是不同温度条件下重组酿酒酵母催化合成β-丙氨酸的试验结果。

图7是重组酿酒酵母重复利用过程中表面酶活性检测试验结果。

具体实施方式

在现有技术的基础上，本发明首先将目的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1)和表达载体pYD1酶切后，经重组构建重组载体。然后，将重组载体转化至大肠杆菌DH5α中，具体方法可举例但不限于热击法。继而利用氨苄青霉素抗性基因筛选、PCR及酶切验证上述步骤所获得的转化子，保存于斜面培养基。为了获得所需的重组酵母细胞，需提取重组表达载体，并转化至酿酒酵母感受态细胞中，利用缺陷型筛选获得阳性转化子。将阳性转化子活化后接种到种子培养基，待菌体生长至OD₆₂₀＝1.0～5.0时，转接至诱导培养基中，获得重组酿酒酵母。

原则来讲，上述酿酒酵母感受态细胞包括所有根据现有技术可作为转化宿主的酿酒酵母感受态细胞。本发明具体实施方式中，所述的表达宿主是酿酒酵母Saccharomycescerevisiae EBY100。

选择该宿主的突出原因之一，是可以利用酵母细胞表面展示技术，使酶蛋白与酵母细胞壁蛋白融合，以天然构象的形式锚定在细胞表面，相当于酶的固定化。同其余的宿主表达相比，展示酶制备简单，省去了酶的分离纯化以及固定化等步骤，有助于降低酶制剂生产成本。与胞内酶相比，展示酶无底物及产物的跨膜阻力，并且增强了酶的稳定性。

如无特殊说明，本发明中所述及的斜面培养基配方如下：酵母浸粉5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂粉20.0g/L，121℃灭菌15min，冷却后加入终浓度为10～100μg/mL的氨苄青霉素。

所述的种子培养基配方如下：在82mL超纯水中，加入无氨基酵母氮源0.67g，如为制备固体培养基加入3.0g/L的琼脂粉，121℃灭菌15min；灭菌后补加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，组氨酸(2.0g/L)1mL，苏氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％葡萄糖5mL；

所述的诱导培养基配方如下：在82mL超纯水中，加入无氨基酵母氮源0.67g，121℃灭菌15min；灭菌后补加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，组氨酸(2.0g/L)1mL，苏氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％半乳糖5mL；

上述种子及诱导培养基的制备中所述及的氨基酸混合液中含有如下组分：精氨酸0.2g/L、天冬氨酸1.0g/L、谷氨酸1.0g/L、异亮氨酸0.3g/L、赖氨酸0.3g/L、缬氨酸1.5g/L、蛋氨酸0.2g/L、苯丙氨酸0.5g/L、丝氨酸3.75g/L、酪氨酸0.3g/L和腺嘌呤0.4g/L。

在此基础上，本发明进一步提供一种β-丙氨酸的生物合成方法，该方法在于使用上述本发明的重组酿酒酵母全细胞催化L-天门冬氨酸转化合成β-丙氨酸的反应；其中所述的重组酿酒酵母含有外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因。其中所述及的外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因具有SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，作为外源基因载体的酿酒酵母优选酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae EBY100。

β-丙氨酸的生物合成是一项相对成熟的技术，反应体系中的底物浓度按照反应效率设置最有利于生产，反应底物浓度无上下限设置，但最高反应物浓度在一定程度上决定于反应底物在体系中的溶解度，并且随着反应底物浓度的增加，对转化效果存在一定程度的抑制。本发明的具体实施方式中，L-天冬氨酸的溶解度最高约37mM，但我们在生产中可以按照高于此的标准设定反应物投料量，比如用到的100mM，此时原始的反应体系中已经有部分是不溶的固体状态，但随反应进行可逐步溶解，并不影响转化反应的进行。因此，该投料方法既可保证反应的顺利进行，又能降低操作成本。作为可实施的操作方式，本发明中，所述的底物浓度在初始反应体系中的浓度可设置为100～1000mM。

另一方面，本发明所述的合成β-丙氨酸的方法中，转化反应体系pH是6.0～8.0，优选6.5～7.5，该反应体系可以是磷酸盐缓冲液或水，优选磷酸盐缓冲液。所述的转化反应的温度是30～60℃，优选50～60℃，最优选55±2℃。允许的测量或控制误差所导致的一定范围内的温度波动也是可以接受的。

再一方面，本发明所述的合成β-丙氨酸的方法中，所述的转化反应体系中重组酿酒酵母用量是OD₆₂₀＝1.0～5.0。

根据优化的结果，上述本发明的β-丙氨酸的生物合成方法的较为具体的实施方式之一，可以描述为包括下述操作步骤的方法：将重组酿酒酵母加入底物L-天冬氨酸(L-Asp)溶液中进行反应，反应温度50～60℃，反应体系pH值为6.5～7.5，每小时取样测定β-丙氨酸，直到L-天冬氨酸全部转化，分离菌体并收集反应液。

上述的β-丙氨酸的生物合成方法，由于在催化反应合成的体系中使用的全细胞进行生产，反应进行到适当程度可以通过物理分离重组酿酒酵母终止反应，并且分离出来的重组酿酒酵母可以作为细胞催化剂继续添加到生物转化的反应体系中使用，实现循环利用。

综上，自构建有效的工程菌始，本发明所述的β-丙氨酸的生物合成方法可以描述为如下完整的技术方案：

(1)构建重组菌体；

克隆外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因，使用表达载体pYD1构建包括该外源性基因的重组载体，并采用热击法将重组载体转化至大肠杆菌DH5α中；

(2)利用氨苄青霉素抗性基因筛选、PCR及酶切验证步骤(1)所获得的转化子，保存(于斜面培养基)；

(3)从步骤(2)所得转化子中提取重组载体，并转化至酿酒酵母EBY100感受态细胞中，利用缺陷型筛选获得阳性转化子；将阳性转化子活化后接种到种子培养基，待菌体生长至适当生物量时，转接至诱导培养基中，获得重组酿酒酵母；

(4)β-丙氨酸的生物合成：制备浓度为0.1～1mol/L的L-天门冬氨酸水溶液，加入步骤(3)的培养物至OD₆₂₀＝1.0～5.0，调节pH为6.5～7.5，体系在50～60℃条件下反应，反应结束后收集反应液分离菌体；

(5)将步骤(4)分离所得菌体加入到新的反应体系中，循环生产β-丙氨酸。

下述非限制性实施例用于对本发明的内容作进一步说明，不应当理解为对本发明任何形式的限定。

实施例1

表面展示重组酿酒酵母的构建和培养：

首先，以枯草芽孢杆菌168基因组(GenBank：CP019663.1)为模板扩增panD基因，通过利用限制性内切酶BamH I和Xho I，将PCR产物和表达载体pYD1酶切纯化后过夜连接，然后将其转化至大肠杆菌DH5α中，利用氨苄青霉素抗性基因筛选转化子，并对其进行PCR及酶切验证和DNA测序，验证无误后保存于平板培养基。重组载体结果如图1所示。其次，提取重组表达载体，并转化至酿酒酵母EBY100感受态细胞中，利用缺陷型筛选获得阳性转化子，将阳性转化子活化后接种到种子培养基，待菌体生长至OD₆₂₀＝1.0～5.0时，转接至诱导培养基中，获得重组酿酒酵母。最后，用含有1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和1μg抗体(anti-V5-FITC)的磷酸盐缓冲液重悬重组酵母细胞，置于冰上30min后，离心收集细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗两遍后重悬细胞，置于荧光倒置显微镜和激光共聚焦显微镜下观察。结果如图2所示，可见：当生物酶展示于细胞表面时，暴露的V5抗原表位能与游离的荧光素标记抗体发生特异性结合，在493nm激发波长下检测到的荧光信号，即为特异性结合产生的荧光信号，证明该生物酶已成功展示于细胞表面。

将重组酿酒酵母接种到种子培养基中，30℃，180rpm的条件下活化菌体。之后再转接至种子培养基中进行扩大培养，30℃，180rpm振荡培养。待生长至适宜的生物量，再接种到1.0L诱导培养基中，20℃，150rpm通气培养细胞。16～24h后放罐，4℃离心收集细胞。

实施例2

不同反应pH对表面展示重组酿酒酵母催化合成β-丙氨酸的影响：

表面展示重组酿酒酵母的培养如实施例1相同，离心收集细胞进行催化反应。研究不同反应pH 5(乙酸盐缓冲液)、6/7/8/9(磷酸盐缓冲液)对表面展示重组酿酒酵母催化合成β-丙氨酸的影响。将2.66g L-天冬氨酸溶解于90mL缓冲溶液中，用6M NaOH溶液和10％盐酸维持上述pH，重组酿酒酵母加入到反应体系中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝1.0～5.0，控制温度为37℃，每小时取样测定β-丙氨酸，直到L-天冬氨酸全部转化，离心取上清液，利用高效液相色谱法测定β-丙氨酸的浓度，发现该酶在pH 5-9范围内均具有较高活性，反应的最适pH为7.0，结果如图3所示。

实施例3

L-天冬氨酸浓度为0.2/0.4/0.6/0.8M时表面展示重组酿酒酵母催化合成β-丙氨酸的研究：

表面展示重组酿酒酵母的培养如实施例1相同，离心收集细胞进行催化反应。研究不同摩尔浓度(0.2/0.4/0.6/0.8M)L-天冬氨酸溶液对表面展示重组酿酒酵母催化合成β-丙氨酸的影响。将重组酿酒酵母加入到上述不同底物浓度的反应体系(pH＝7.0)中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝1.0～5.0，用10％盐酸溶液维持pH＝7.0，控制温度为37℃，每小时取样测定β-丙氨酸，直到L-天冬氨酸全部转化，利用高效液相色谱法测定β-丙氨酸的浓度，结果如表1所示。

表1.表面展示重组酿酒酵母催化合成β-丙氨酸的结果

底物浓度(M)	反应时间(h)	β-丙氨酸的浓度(g/L)
			0.2	1	17.8
0.4	2	35.6
			0.6	4	53.5
0.8	5	71.3

实施例4

不同方式的酶催化对比试验

本实施例考察不同形式的L-天冬氨酸-α-脱羧酶在催化合成β-丙氨酸试验中的区别，所用于催化试验的酶体系分别是：

(1)酶A：表面展示重组酿酒酵母

参照实施例1，离心收集重组酿酒酵母，为酶A。

(2)酶B：重组大肠杆菌

重组大肠杆菌的构建与培养如下：将实施例1中重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选获得能催化合成β-丙氨酸的重组大肠杆菌M。将重组大肠杆菌M接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm的条件下过夜振荡培养。以1％的接种量接种到1.5L发酵培养基中，37℃，200rpm通气培养细胞至OD₆₀₀＝0.6～0.8后，加入诱导剂IPTG诱导过夜后，离心收集菌体，为酶B。

(3)酶C：重组大肠杆菌裂解液

取10mL重组大肠杆菌M进行超声波破碎(功率200W，工作4秒停4秒，总时间为8min)，10000rpm离心1min，取上清液，即为酶C。

(4)酶D：非表面展示重组酿酒酵母

非表面展示重组酵母的构建和培养如下：首先，将实施例1中的重组载体转化至酿酒酵母BY4742感受态细胞中，利用缺陷型筛选获得重组酿酒酵母N。将重组酿酒酵母N接种到种子培养基中，30℃，180rpm的条件下活化菌体。之后再转接至种子培养基中进行扩大培养，30℃，180rpm振荡培养。待生长至适宜的生物量，再接种到1.0L诱导培养基中，20℃，150rpm通气培养细胞。16～24h后放罐，4℃离心收集细胞，即为酶D。

(5)酶E：非表面展示重组酵母裂解液

取10mL重组酿酒酵母N进行超声波破碎(功率500W，工作5秒停5秒，总时间为8min)，10000rpm离心1min，取上清液，即为酶E。

将0.2M L-天冬氨酸溶液用6M NaOH溶液调节pH＝7.0，将各种参测酶加入到反应体系中，使反应液中生物量相同(OD₆₀₀＝1.0～5.0)，用10％盐酸溶液维持pH＝7.0，控制温度为37℃，反应60min，每20min取样测定β-丙氨酸，利用高效液相色谱法测定β-丙氨酸的浓度，结果如图4所示。

将0.4M L-天冬氨酸底物溶液用6M NaOH溶液调节pH＝7.0，将各种参测酶加入到反应体系中，使反应液中生物量相同(OD₆₀₀＝1.0～5.0)，用10％盐酸溶液维持pH＝7.0，控制温度为37、45和55℃，每20min取样测定β-丙氨酸，利用高效液相色谱法测定β-丙氨酸的浓度，根据β-丙氨酸产量随时间变化的曲线计算瞬时酶活，结果如图5示。

采用全细胞进行催化反应效率明显不如其裂解液的催化效率，主要是由于L-天冬氨酸-α-脱羧酶是胞内酶，底物进入细胞及产物扩散到胞外时都存在较大的阻力；采用细胞裂解液参与反应，催化效率高，但会增加生产成本，且游离酶的稳定性不理想；将生物酶展示于酵母细胞表面，既能够克服底物和产物跨膜阻力的影响，提高了反应速率，酶的稳定性有较大提高，又避免了破碎细胞和酶的分离等步骤，降低了生产成本，提高了经济效益。

实施例5

表面展示重组酿酒酵母和粗酶液的催化活力稳定性比较：

表面展示重组酿酒酵母(酶A)和粗酶液(酶E)的制备与实施例5相同。将1.0M L-天冬氨酸底物溶液用6M NaOH溶液调节pH＝7.0，将表面展示重组酿酒酵母和粗酶液加入到反应体系中，用10％盐酸溶液维持pH＝7.0，控制温度为37、45和55℃，每1h取样测定β-丙氨酸，利用高效液相色谱法测定β-丙氨酸的浓度，结果如图6所示。

当采用高浓度底物时，随着温度的升高，粗酶液的催化生成β-丙氨酸的转化率降低，这是由于随着温度增高，粗酶液的酶活损失加快，导致在长时间反应过程中催化效率大幅下降。而在相同底物浓度时，随着温度的升高，采用表面展示重组酵母细胞催化生成β-丙氨酸的转化率越高且催化效率有大幅提高，这是由于该酶经过表面展示后，热稳定性提高，高温情况下失活不明显，而随着反应温度提高，传质传热效率加快，从而催化效率提升。该实施例说明表面展示重组酿酒酵母更适合于工业化生产，既避免了破碎细胞和酶的分离等步骤，又提高了生产效率，降低了生产成本，提高了经济效益。

实施例6

表面展示重组酿酒酵母循环使用高效合成β-丙氨酸：

表面展示重组酿酒酵母的培养与实施例1相同，离心收集细胞进行催化反应。将2.66g L-天冬氨酸溶解于90mL 0.02M磷酸盐缓冲液溶液中，用6M NaOH溶液调节pH＝7.0，将重组酿酒酵母加入到反应体系中，使反应液中生物量OD₆₂₀＝5.0，用10％盐酸溶液维持pH＝7.0，控制温度为55℃，每小时取样测定β-丙氨酸，直到L-天冬氨酸全部转化；然后，用蠕动泵泵出或离心弃去反应上清液后，再次按照上述反应条件多次重复反应；最后，利用高效液相色谱法测定β-丙氨酸的浓度，结果如图7所示。回收菌体的过程中，细胞存在部分损失，因此多次循环利用重组酿酒酵母催化合成β-丙氨酸的过程中酶活性是比较稳定的，可重复使用，以降低工业化生产成本，解决酶回收难、利用率低等问题，更符合工业化生产的要求。

序列表

<110> 大连医诺生物股份有限公司

<120> β-丙氨酸的生物合成方法

<130> N/A

<141> 2017-12-25

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 384

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(168基因组)

<400> 1

atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60

aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120

aatgaaaaag tacaaattgt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180

cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240

gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300

catgagccga aagtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360

gaaccagccc gtacaatttt gtag 384

Claims (8)

1.β-丙氨酸的生物合成方法，包括重组酿酒酵母全细胞催化L-天门冬氨酸转化合成β-丙氨酸的反应；其中所述的重组酿酒酵母含有外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组酿酒酵母是含有外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae EBY100。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应中底物L-天门冬氨酸的浓度为0.1～1mol/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应温度30～60℃。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的反应温度50～60℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应体系pH值为6.0～8.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括反应后分离反应液与菌体的步骤，所得菌体用于新的反应体系。

8.权利要求1所述的方法，包括如下步骤：

(1)构建重组菌体；

克隆外源性L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因，使用表达载体pYD1构建包括该外源性基因的重组载体，并采用热击法将重组载体转化至大肠杆菌DH5α中；

(2)利用氨苄青霉素抗性基因筛选、PCR及酶切验证步骤(1)所获得的转化子，保存；

(3)从步骤(2)所得转化子中提取重组载体，并转化至酿酒酵母EBY100感受态细胞中，利用缺陷型筛选获得阳性转化子；将阳性转化子活化后接种到种子培养基，待菌体生长至适当生物量时，转接至诱导培养基中，获得重组酿酒酵母；

(4)β-丙氨酸的生物合成：制备浓度为0.1～1mol/L的L-天门冬氨酸水溶液，加入步骤(3)的培养物至OD₆₂₀＝1.0～5.0，调节pH为6.5～7.5，体系在50～60℃条件下反应，反应结束后收集反应液分离菌体；

(5)将步骤(4)分离所得菌体加入到新的反应体系中，循环生产β-丙氨酸。