CN104371966A - 一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104371966A CN104371966A CN201410636627.6A CN201410636627A CN104371966A CN 104371966 A CN104371966 A CN 104371966A CN 201410636627 A CN201410636627 A CN 201410636627A CN 104371966 A CN104371966 A CN 104371966A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- acs
- maeb
- escherichia coli
- acetyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 84
- JPYHHZQJCSQRJY-UHFFFAOYSA-N Phloroglucinol Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCCC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O JPYHHZQJCSQRJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 46
- QCDYQQDYXPDABM-UHFFFAOYSA-N phloroglucinol Chemical compound OC1=CC(O)=CC(O)=C1 QCDYQQDYXPDABM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 46
- 229960001553 phloroglucinol Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 108010049926 Acetate-CoA ligase Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 101150108859 maeB gene Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 101150001698 phlD gene Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 35
- 101710104378 Putative malate oxidoreductase [NAD] Proteins 0.000 claims description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 8
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 8
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 7
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 claims description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 claims description 3
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 abstract description 2
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 abstract 1
- 101150008274 marA gene Proteins 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008146 Acetate-CoA ligase Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000010812 external standard method Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- VUMCUSHVMYIRMB-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-tri(propan-2-yl)benzene Chemical compound CC(C)C1=CC(C(C)C)=CC(C(C)C)=C1 VUMCUSHVMYIRMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SPSSULHKWOKEEL-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrotoluene Chemical compound CC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O SPSSULHKWOKEEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKFYKCYQEWQPTM-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-2-(4-fluorophenyl)acetate Chemical compound OC(=O)C(N)C1=CC=C(F)C=C1 JKFYKCYQEWQPTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100463764 Campylobacter jejuni subsp. jejuni serotype O:2 (strain ATCC 700819 / NCTC 11168) pglD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 229910021612 Silver iodide Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- -1 and OD Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229940045105 silver iodide Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01134—Difructose-anhydride synthase (3.2.1.134)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
- C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
- C12Y602/01003—Long-chain-fatty-acid-CoA ligase (6.2.1.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的基因工程菌是共表达乙酰辅酶A合成酶基因acs、苹果酸酶基因maeB、聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的基因工程菌。同时本发明还提供了基因工程菌的构建方法。本发明所提供的基因工程菌能够以乙酸为原料合成间苯三酚，具有生产成本低，产量高的特点，产量可达1.2g/L以上，最高产率可达30％，为理论产率的52％，适用于产业化推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
间苯三酚又名1,3,5-三羟基苯、均苯三酚，是重要的精细化工产品，可以用作药物合成的中间体、燃料耦合剂、轮胎增粘剂以及偶氮复合油墨等原料，在纺织品及皮革染色工艺、生产塑料胶囊、替代碘化银用于人工降雨等方面有广泛应用。除此之外，间苯三酚本身还是一种优良的医药产品，性能优越的抗养护剂，早已广泛用于抗菌、防腐等。
早在20世纪50年代，间苯三酚的化学合成工艺就已经建立起来并应用到工业生产中，包括2,4,6-三硝基甲苯(TNT)途径、1,3,5-三异丙基苯途径等。但传统的化学合成工艺后处理较难、污染环境且原料存在安全隐患，同时副产物的存在使得间苯三酚的分离精制比较困难。
生物催化是以酶为催化剂来完成的化学反应，反应条件温和，对环境友好；以可再生资源为底物的生物催化合成，是解决全球能源危机的有效途径，近年来研究非常活跃。间苯三酚及其衍生物的生物催化合成途径主要是在对荧光假单胞菌phlACBDE基因簇的功能分析的基础形成的。通过反向遗传学的手段，研究者发现了间苯三酚合成的关键基因phlD，PhlD蛋白可催化小分子底物丙二酸单酰辅酶A聚酮缩合及环化等一系列反应，最终生成间苯三酚，这一研究使生物法合成间苯三酚成为可能。研究者已在大肠杆菌中过表达pglD及marA基因，以葡萄糖为碳源进行发酵，最终间苯三酚产量能够达到3.8g·L-1(Yujin Cao,et al.Improvedphloroglucinol production by metabolically engineered Escherichia coli.Appl Microbiol Biotechnol(2011)91:1545–1552)。由于葡萄糖成本较高，限制了生物法的广泛应用，寻找更廉价的碳源，降低生物法制备间苯三酚的成本是现有技术亟待解决的问题。
乙酸作为一种价廉易得的可替代碳源，从工业废液中回收乙酸，作为工程大肠杆菌的碳源，发酵生产间苯三酚，既可回收利用资源,又可减轻环境污染，同时还能降低生产成本，具有广阔的应用前景。乙酸在大肠杆菌体内的代谢途径，有2种代谢方式，一是以由乙酰辅酶A合成酶(ACS)催化生成乙酰辅酶A，一是由乙酸激酶(ACK)和磷酸转乙酰酶(PTA)催化生成乙酰辅酶A(Alan J.Wolfe,Microbiol.Mol.Biol.Rev.2005,69(1):12-50)。但目前尚没有利用乙酸发酵生成间苯三酚的菌株报道，以乙酸为原料生物合成间苯三酚是否可行尚无法确定。
发明内容
为解决以葡萄糖为原料生产间苯三酚成本过高的问题，本发明提供了一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌，所采取的技术方案如下：
本发明的目的之一在于提供一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌，其特征在于，是是共表达乙酰辅酶A合成酶基因acs、苹果酸酶基因maeB、聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的基因工程菌。。
上述基因可来源于化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒。
优选地，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。
优选地，乙酰辅酶A合成酶基因acs来自大肠杆菌的，来自大肠杆菌的，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌的，Gene ID：12931931。
本发明的另一目的在于提供了一种所述基因工程菌的构建方法，该方法的步骤如下：
1)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB；
2)构建含有聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的重组质粒；
3)构建含有乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB的重组质粒；
4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主菌中，获得基因工程菌。
所述方法中乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。
所述方法中所述乙酰辅酶A合成酶基因acs优选来源于大肠杆菌的，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB优选来源于来自大肠杆菌的，Gene ID：12931931。
所述方法的具体步骤如下：
1)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB；
所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID：12931931；
2)将步骤1)所得的聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA克隆到质粒载体pET30上，构建重组质粒pET-pdlD-marA；
3)将步骤1)中所得的乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB克隆到质粒载体pACYC-Duet上，构建重组质粒pACYC-maeB-acs；
4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述基因工程菌生产间苯三酚的方法，该方法的步骤如下：
1)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs
和苹果酸酶基因maeB；
所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID：12931931；
2)将步骤1)所得的聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA克隆到质粒载体pET30上，构建重组质粒pET-pdlD-marA；
3)将步骤1)中所得的乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB克隆到质粒载体pACYC-Duet上，构建重组质粒pACYC-maeB-acs；
4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌；
5)将步骤4)所得的重组大肠杆菌按体积比1％-5％的接种量接种到乙酸培养基中发酵生产间苯三酚，发酵条件为：发酵温度为30-37℃、pH 6-8和培养至OD600为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-1.0mmol·L-1，培养48小时。
所述方法中步骤5)所述乙酸培养基，每升含有6g乙酸、2g牛肉粉、1g甜菜碱、KH2PO42.5g、(NH4)2SO43g、柠檬酸-H2O 1g、KCl 1.86g、FeSO4-7H2O 80mg、MgSO4-7H2O 0.24g，用NaOH将pH回调至7.0。
本发明所提供的基因工程菌，用于发酵生产以间苯三酚为中间产物的代谢产品。
本发明有益效果：
1.本发明构建的大肠杆菌能够转化乙酸生成间苯三酚。
2.利用本发明方法以乙酸为碳源，间苯三酚的产量可达到1g/L以上，最高产率可达到30％，为理论产率的52％。
附图说明
图1 pACYC-acs质粒图谱。
图2 pACYC-maeB-acs质粒图谱。
图3 不同菌株间苯三酚产量、产率。
图4 间苯三酚发酵过程曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所采用的分子生物学方法均为常规技术手段，而发酵生产间苯三酚或以间苯三酚为中间产物的目标产物的方法也均为普通发酵过程优化。
以下实施例所用试剂、材料和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规试剂、材料和仪器，可从商业渠道获取。
实施例1
乙酰辅酶A合成酶基因acs，苹果酸酶基因maeB共表达载体的构建，具体过程如下：以寡核苷酸5’-CCG GGA TCC ATG AGC CAA ATT CAC AAA CAC-3’和5’-TTG GAATTC TTA CGA TGG CAT CGC GA-3’为引物，以大肠杆菌基因组DNA为模版，采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出乙酰辅酶A合成酶基因acs，并在5’端和3’端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到pACYCDuet-1载体上，得到重组质粒pACYC-acs(图1)；以寡核苷酸5’-CCG AGA TCT ATG GAT GAC CAG TTA AAACAA A-3’和5’-TTG GGT ACC TTA CAG CGG TTG GGT TTG-3’为引物，以大肠杆菌基因组DNA为模版，采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出苹果酸酶maeB，并在5’端和3’端分别引入BglⅡ和KpnⅠ酶切位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到pACYC-acs载体上，得到重组质粒pACYC-acs-maeB(图2)。
实施例2
合成间苯三酚的工程大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pACYC-acs-maeB/PET-pglD-marA的制备，并用该菌株发酵转化乙酸为间苯三酚，其具体过程如下：
采用碱裂解法提取实施例1中构建得到的重组质粒pACYC-acs-maeB与发明人所在实验室已构建的重组质粒PET-pglD-marA(Yujin Cao,et al.Appl Microbiol Biotechnol(2011)91:1545–1552)，采用热击转化法将5μl重组质粒至转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，然后取50μl转化后的菌液涂布于含有34μg·mL-1氯霉素与50μg·mL-1卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，长出的菌落即为共表达乙酰辅酶A合成酶基因及苹果酸酶基因的重组大肠杆菌菌株。挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，37℃、180rpm振荡培养过夜，然后将菌液按体积比1％的接种量接种到添加34μg·mL-1氯霉素与50μg·mL-1卡那霉素的以乙酸为唯一碳源的培养基中，乙酸浓度为0.1mol/L，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol·L-1，发酵24小时；将培养液进行离心，分离细胞和上清，采用液相色谱法检测发酵液上清中的乙酸与间苯三酚含量，并以购买的乙酸与间苯三酚标准品作为对照。通过外标法计算得到，间苯三酚的产量可达到122mg/L，产率可达9.1％，产率为理论产率的15.6％。未过表达两酶的菌株发酵液中检测不到间苯三酚，结果如附图3所示。
实施例3
用构建好的菌株BL21(DE3)/pACYC-acs-maeB/PET-pglD-marA发酵生成间苯三酚，其步骤如下：将培养好的发酵种子按5％的体积比接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中。培养温度37℃，诱导前调整为32℃，溶氧控制在50％。当OD600为1.0左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol·L-1。发酵过程通过自动流加氨水，硫酸将pH控制在7.0，补料为3M的乙酸以1％速率流加，每3h取样测定OD，乙酸，间苯三酚。发酵48小时结束后，将样品进行离心，分离细胞和上清，采用液相色谱法检测发酵液上清中的乙酸与间苯三酚含量，并以购买的乙酸与间苯三酚标准品作为对照。通过外标法计算得到，结束发酵时，间苯三酚的产量可达到1.2g/L，最高产率可达30％，为理论产率的52％。结果如附图4所示。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌，其特征在于，是共表达乙酰辅酶A合成酶基因acs、苹果酸酶基因maeB、聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的基因工程菌。
2.权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。
3.权利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID：12931931。
4.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
1)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB；
2)构建含有聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA的重组质粒；
3)构建含有乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB的重组质粒；
4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主菌中，获得基因工程菌。
5.权利要求4所述方法，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。
6.权利要求4所述方法，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID：12931931。
7.权利要求4所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB；
所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID：12931931；
2)将步骤1)所得的聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、克隆到质粒载体pET30上，构建重组质粒pET-pdlD-marA；
3)将步骤1)中所得的乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB克隆到质粒载体pACYC-Duet上，构建重组质粒pACYC-maeB-acs；
4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。
8.一种利用权利要求1所述基因工程菌生产间苯三酚的方法，其特征在于，步骤如下：
1)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB；
所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID：12931931；
2)将步骤1)所得的聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、克隆到质粒载体pET30上，构建重组质粒pET-pdlD-marA；
3)将步骤1)中所得的乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB克隆到质粒载体pACYC-Duet上，构建重组质粒pACYC-maeB-acs；
4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌；
5)将步骤4)所得的重组大肠杆菌按体积比1％-5％的接种量接种到乙酸培养基中发酵生产间苯三酚，发酵条件为：发酵温度为30-37℃、pH 6-8和培养至OD600为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-1.0mmol·L-1，培养48小时。
9.权利要求8所述方法，其特征在于，步骤5)所述乙酸培养基，每升含有6g乙酸、2g牛肉粉、1g甜菜碱、KH2PO42.5g、(NH4)2SO43g、柠檬酸-H2O 1g、KCl 1.86g、FeSO4-7H2O 80mg、MgSO4-7H2O 0.24g，用NaOH将pH回调至7.0。
10.权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，用于发酵生产以间苯三酚为中间产物的代谢产品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410636627.6A CN104371966A (zh) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | 一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410636627.6A CN104371966A (zh) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | 一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104371966A true CN104371966A (zh) | 2015-02-25 |
Family
ID=52551163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410636627.6A Pending CN104371966A (zh) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | 一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104371966A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104988172A (zh) * | 2015-07-30 | 2015-10-21 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法及应用 |
| CN105018511A (zh) * | 2015-07-30 | 2015-11-04 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种体外酶反应合成间苯三酚的方法及应用 |
| CN109439606A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-03-08 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN109456927A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-03-12 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用 |
| CN110551769A (zh) * | 2019-09-27 | 2019-12-10 | 北京理工大学 | 一种间苯三酚的生产方法 |
| CN113249281A (zh) * | 2020-02-07 | 2021-08-13 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用 |
-
2014
- 2014-11-12 CN CN201410636627.6A patent/CN104371966A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HENRY LIN等: "Acetyl-CoA synthetase overexpression in Escherichia coli demonstrates more efficient acetate assimilation and lower acetate accumulation: a potential tool in metabolic engineering", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 * |
| NCBI: "GenBank：BAA16337.2", 《NCBI》 * |
| YUJIN CAO等: "Improved phloroglucinol production by metabolically engineered Escherichia coli", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104988172A (zh) * | 2015-07-30 | 2015-10-21 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法及应用 |
| CN105018511A (zh) * | 2015-07-30 | 2015-11-04 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种体外酶反应合成间苯三酚的方法及应用 |
| CN105018511B (zh) * | 2015-07-30 | 2018-08-17 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种体外酶反应合成间苯三酚的方法及应用 |
| CN109439606A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-03-08 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN109456927A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-03-12 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用 |
| CN109439606B (zh) * | 2018-11-14 | 2022-06-28 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN110551769A (zh) * | 2019-09-27 | 2019-12-10 | 北京理工大学 | 一种间苯三酚的生产方法 |
| CN110551769B (zh) * | 2019-09-27 | 2021-09-21 | 北京理工大学 | 一种间苯三酚的生产方法 |
| CN113249281A (zh) * | 2020-02-07 | 2021-08-13 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用 |
| CN113249281B (zh) * | 2020-02-07 | 2022-11-11 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104059872B (zh) | 高产n-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN104371966A (zh) | 一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN107119002B (zh) | 一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用 | |
| CN102787135A (zh) | 一种提高工程大肠杆菌间苯三酚合成能力的方法 | |
| CN107338258A (zh) | 生产β‑丙氨酸的工程菌构建及其生产β‑丙氨酸的方法 | |
| CN102154339A (zh) | 一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法 | |
| CN107227286B (zh) | 一株高产琥珀酸的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN114807206B (zh) | 合成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的菌株及其构建方法和应用 | |
| CN102643774A (zh) | 一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法 | |
| CN117866866A (zh) | 一种利用富马酸生产依克多因的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN104371967A (zh) | 一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN105969713A (zh) | 一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌及其应用 | |
| CN116083332A (zh) | 一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用 | |
| CN109679978A (zh) | 一种用于制备l-2-氨基丁酸的重组共表达体系及其应用 | |
| US11760988B2 (en) | L-aspartate alpha-decarboxylase mutant and application thereof | |
| CN112280725B (zh) | 一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法 | |
| CN110951794B (zh) | 一种提高酿酒酵母工程菌生产葡萄糖二酸的发酵方法 | |
| CN115895989A (zh) | 一株高产丁二酸的大肠杆菌及其制备方法与应用 | |
| CN104357495B (zh) | 一种提高细胞间苯三酚合成产量的方法及应用 | |
| CN106929527A (zh) | 一种高间苯三酚合成能力的基因工程菌及构建方法和应用 | |
| CN103571785B (zh) | 一种高效利用脂肪酸生产甲羟戊酸的方法及构建得到的基因工程菌 | |
| CN107119003A (zh) | 一种利用葡聚糖合成3‑羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用 | |
| CN102876703B (zh) | 利用调控蛋白ALsR适度加强枯草芽孢杆菌乙偶姻合成 | |
| CN115247144B (zh) | 生产l-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用 | |
| CN114276970B (zh) | 一种产1,3-丙二醇的基因工程菌 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150225 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |