CN108424937B

CN108424937B - 一种酶法合成丹参素的方法

Info

Publication number: CN108424937B
Application number: CN201810396471.7A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 冯志彬; 段春利
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Shandong Yangcheng Biotech Co ltd
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2038-04-27
Also published as: CN108424937A

Abstract

本发明公开了一种新型的合成丹参素合成方法，所述方法是利用酪氨酸解氨酶酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶催化左旋多巴生产丹参素。具体是将左旋多巴(3，4‑二羟基苯基丙氨酸)0.5‑1.5mol、酪氨酸解氨酶湿菌体10‑30g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体10‑30g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体10‑30g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0，温度为30℃，催化反应16‑20h，得到丹参素。该方法首次利用酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶，以左旋多巴为底物酶法生产丹参素，节省原料，避免了化学合成的污染。

Description

一种酶法合成丹参素的方法

技术领域

本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种酶法合成丹参素的方法。

背景技术

丹参素，化学名为β-(3，4-二羟基苯基)乳酸，因其为中药材丹参的有效成分，故命名为丹参素，药理学研究发现，丹参素具有缩小心肌梗死范围和减轻病程的作用，同时对心肌缺血，再灌注损伤具有保护作用，能够清除外源性氧自由基，保护线粒体的功能；而且丹参素能明显抑制血小板的聚集，对冠心病有效，有助于机体组织的康复和成人呼吸窘迫综合征等严重并发症的纠正；丹参素在抗菌消炎及增强机体免疫功能方面也有一定的功效，在临床上对感染性休克患者应用丹参素，可提高生存率；大量的临床研究也发现丹参素能够抑制细胞内源性胆固醇的合成，可用于动脉粥样硬化的防治；丹参素可通过对血小板释放物及凝血酶原的影响，抑制其聚集，降低血液的凝固性而起到活血化淤的作用。另外丹参素对增生性疤痕、扩张冠状动脉、肝损伤、抗脑缺血损伤、肺心病、肿瘤、高原病、银屑病都有一定的治疗作用。综上所述，丹参素具有很大的市场潜力。目前丹参素的生产主要有植物提取和化学合成两种方法，植物提取以丹参药材为原料，经过粉碎、加水浸泡、煎煮，提取液浓缩后利用乙醇沉淀，乙醚萃取，水相经过盐析获得。该方法的主要缺点在于提取过程中过高的乙醇浓度降低了丹参素的活性成分，尽管很多的研究促进了方法的改进，但是原材料的限制成了制约其生产规模的最大因素。化学合成法最早起源于Harington等人在1931年的报道，他们通过将乙烯酮化合物乙酰化的方法获得丹参素，该方法可以分别以甘氨酸或者反式肉桂酸为原料，但是其步骤繁琐，中间产物多，环境污染严重。因此开发新的丹参素合成方法至关重要，目前利用重组微生物技术进行丹参素的合成仅见一例报道，该报道以预苯酸为前体，利用对羟基苯乙酸间位羟基化酶和D-乳酸脱氢酶催化合成丹参素，随着研究的深入，重组微生物技术生产丹参素因其效率高、低污染、成本低将备受关注，而选择反应的关键酶，并高效表达是成败的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的酶法合成丹参素的方法，用以解决现有技术中原材料紧缺的问题，该方法效率高、低污染、成本低。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明以左旋多巴为底物，通过酪氨酸解氨酶(TAL)、苯丙酮酸还原酶(PPR)和葡萄糖脱氢酶(GDH)催化生产丹参素，其中葡萄糖脱氢酶用于NADH的再生，避免了NADH的添加。具体如下：

以酪氨酸解氨酶催化3，4-二羟基苯基丙氨酸生成3，4-二羟基苯基丙酮酸，然后在苯丙酮酸还原酶催化下还原生成丹参素(3，4-二羟基苯基乳酸)。其中，3，4-二羟基苯基丙酮酸在苯丙酮酸还原酶催化下还原生成丹参素的过程中，会同时产生NAD，并需要辅酶NADH，但是NADH存在价格昂贵的问题。所以针对这个问题，通过加入葡萄糖脱氢酶用于NADH的再生，原因在于，由于在整个的反应体系中存在葡萄糖，加入葡萄糖脱氢酶可以使其在产生葡萄糖酸的过程中同时以NAD为辅酶产生NADH，形成循环的辅酶再生系统，不需要再额外添加NADH，解决了NADH价格昂贵的问题。具体反应过程如下：

优选地，所述酪氨酸解氨酶来自于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，但不局限于此菌，该菌中所含的酪氨酸解氨酶能够催化苯丙氨酸和酪氨酸的脱氨。并且以该菌的酪氨酸解氨酶为模板，密码子优化后可以合成在大肠杆菌中表达的酪氨酸解氨酶基因TAL-made。

所述苯丙酮酸还原酶来自于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，但不局限于此菌，该菌中所含的苯丙酮酸还原酶能够催化酮酸还原为乳酸。并且以该菌的苯丙酮酸还原酶为模板，密码子优化后能够合成在大肠杆菌中表达的苯丙酮酸还原酶基因PPR-made，该酶为D型-苯丙酮酸还原酶。

本发明中的葡萄糖脱氢酶来自于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，但不局限于巨大芽胞杆菌，该菌中所含的葡萄糖脱氢酶在催化葡萄糖生成葡萄糖酸的过程中完成辅酶NADH的再生。并且以该菌的葡萄糖脱氢酶为模板，密码子优化后能够合成在大肠杆菌中表达的葡萄糖脱氢酶基因GDH-made。

本发明中一种优选的实施方式，将密码子优化后合成的酪氨酸解氨酶基因、苯丙酮酸还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因分别克隆至表达载体，导入到大肠杆菌，实现基因的表达，然后收集表达酪氨酸解氨酶的细胞、表达苯丙酮酸还原酶的细胞和葡萄糖脱氢酶的细胞，菌体放入-80℃保存24h，菌体融化后直接添加于催化体系中催化生产丹参素。具体地，所述方法如下：

(1)酪氨酸解氨酶TAL-made、苯丙酮酸还原酶PPR-made和葡萄糖脱氢酶GDH-made的异源表达：分别构建TAL-made、PPR-made和GDH-made的基因工程菌，经发酵分别制得表达TAL、PPR和GDH的湿菌体；

(2)然后将左旋多巴0.5-1.5mol、酪氨酸解氨酶湿菌体10-30g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体10-30g/L和葡萄糖脱氢酶湿菌体10-30g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0，温度为30℃，催化反应16-20h，得到丹参素。优选地，催化0.5-1.5mol底物左旋多巴需要酪氨酸解氨酶湿菌体15-20g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体15-20g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体15-20g/L。

其中步骤(1)的具体方法如下：

(a)构建TAL-made载体：

利用BamHI和XhoI分别将TAL-made基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达TAL-made的质粒pET28a-TAL-made；

(b)构建PPR-made载体：

利用BamHI和XhoI分别将PPR基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达PPR-made的质粒pET28a-PPR-made；

(c)构建GDH-made载体：

利用BamHI和XhoI分别将GDH-made基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达GDH-made的质粒pET28a-GDH-made；

(d)构建分别表达TAL、PPR和GDH的基因工程菌；

将质粒pET28a-TAL-made、pET28a-PPR-made和质粒pET28a-GDH-made分别转入E.coli BL21(DE3)，得到分别重组表达TAL、PPR和GDH的菌株BL21-TAL、BL21-PPR和BL21-GDH；

(e)将菌株BL21-TAL在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述TAL表达菌体；

将菌株BL21-PPR在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述PPR表达菌体。

将菌株BL21-GDH在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述GDH表达菌体。

其中，所述发酵培养基配方为：葡萄糖2％、硫酸铵0.3％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉2％、KH₂PO₄ 1.25％、MgSO₄ 0.1％、柠檬酸0.15％和乳糖0.1-0.5％，发酵条件：pH7.0，温度37℃，诱导后降温至25-30℃，发酵结束后再以6000rpm转速离心10min，-20℃保存菌体备用。

更进一步地，重组蛋白TAL表达的检测方法：将上述得到的表达菌株BL21-TAL在含有Kana的LB液体培养基中37℃培养，菌体OD600达到0.4-0.6后，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.1mM，25℃诱导表达16h，分别收集加入IPTG诱导前和诱导结束后的菌体，利用聚丙烯胺凝胶电泳检测重组蛋白TAL的表达。

其中重组蛋白PPR表达的检测方法：所得到的表达菌株BL21-PPR在含有Kana的LB液体培养基中37℃培养，菌体OD600达到0.4-0.6后，加入IPTG至终浓度为0.1mM，25℃诱导表达16h，分别收集加入IPTG诱导前和诱导结束后的菌体，利用聚丙烯胺凝胶电泳检测重组蛋白PPR的表达。

其中重组蛋白GDH表达的检测方法：所得到的表达菌株BL21-GDH在含有Kana的LB液体培养基中37℃培养，菌体OD600达到0.4-0.6后，加入IPTG至终浓度为0.1mM，25℃诱导表达16h，分别收集加入IPTG诱导前和诱导结束后的菌体，利用聚丙烯胺凝胶电泳检测重组蛋白GDH的表达。

本发明具有如下优点：

本发明属于首次采用酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶，以左旋多巴为底物生产丹参素，具有原创性，并且试验验证摩尔转化率高，加上采用的是生物酶法生产，无污染，还没有副产物的影响，适合工业生产。

由于本发明选用的苯丙酮酸还原酶的还原活性需要辅酶NADH，本发明没有直接辅酶NADH，而是采用葡萄糖脱氢酶用于NADH的再生，避免了NADH的添加，解决了NADH价格昂贵的问题。

附图说明

图1显示了质粒pET28a-TAL-made、pET28a-PPR-made和质粒pET28a-GDH-made的双酶切验证结果；

其中泳道M是DNA marker，泳道1是BamHI/XhoI双酶切验证质粒pET28a-TAL-made；泳道2是BamHI/XhoI双酶切验证质粒pET28a-PPR-made；泳道3是BamHI/XhoI双酶切验证质粒pET28a-GDH-made。

图2显示了TAL重组蛋白的SDS-PAGE检测结果；

其中泳道M是蛋白质Marker，泳道1是BL21-TAL诱导前产物，泳道2是BL21-TAL诱导后产物；

图3显示了PPR重组蛋白的SDS-PAGE检测结果；

图中泳道M是蛋白质Marker，泳道1是BL21-PPR诱导前产物，泳道2是蛋白质BL21-PPR诱导后产物；

图4显示了GDH重组蛋白的SDS-PAGE检测结果；

图中，泳道M是蛋白质Marker，泳道1是BL21-GDH诱导前产物，泳道2是蛋白质BL21-GDH诱导后产物。

图5显示了高效液相色谱法测定化合物的保留时间。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本发明中使用的色谱仪是美国Agilent公司生产的1200型高效液相色谱仪。

本发明中使用的材料如下：大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、TransTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、标准相对分子量(Mr)DNA(即DNA marker，Mr 250～10，000)、标准Mr蛋白质等试剂均可购置于北京全式金生物技术有限公司；多巴标准品(美国Sigma-Aldrich公司)；卡那霉素(Kana)购自上海生工生物技术有限公司；蛋白胨和酵母提取物(英国Oxoid公司)；其他试剂均购自国药试剂有限公司。

LB培养基/g·L^-1：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH 7.0。

按照正交试验的方法，设计下列实施例，以得到优选步骤。

实施例1一种酶法合成丹参素的方法，具体步骤如下：

一、酪氨酸解氨酶TAL-made、苯丙酮酸还原酶PPR-made和葡萄糖脱氢酶GDH-made的异源表达：

1、酪氨酸解氨酶TAL-made的异源表达与酶活测定：

(1)获得TAL-made基因片段

根据酪氨酸解氨酶(TAL)基因序列(基因库登录号：CP015288，SEQ ID NO.1)，经过适合大肠杆菌表达的密码子优化后由公司合成获得TAL-made基因(SEQ ID NO.2)，该基因与TAL基因氨基酸序列完全相同，并在基因序列的上下游引入BamHI和XhoI的限制性酶切位点，以便于后续的载体构建。

(2)pET28a-TAL-made表达载体的构建

使用BamHI和XhoI分别双酶切合成的TAL-made基因与pET28a载体，连接转化后，构建得到重组表达TAL的质粒pET28a-TAL-made。使用BamHI和XhoI双酶切验证所构建的质粒，电泳检测酶切产物得到2条条带(5.9kb和1.5kb)，与预期相符(见图1，泳道1为DNA分子量Marker，泳道，2为pET28a-TAL-made酶切电泳)。将pET28a-TAL-made转化入E.coli BL21(DE3)，得到TAL表达菌株BL21-TAL。

将表达菌株BL21-TAL接入LB培养基(含Kana 50ng/ml)中，37℃培养。当OD₆₀₀值达到0.4～0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导16h，SDS-PAGE电泳检测可溶性蛋白的表达。结果表明加入IPTG后，TAL(Mr约54.9KD)有明显表达条带，与预期大小相符。IPTG诱导前后TAL表达的SDS-PAGE检测结果见图2(泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1是BL21-TAL诱导前产物，泳道2是BL21TAL诱导后产物)。

2、苯丙酮酸还原酶PPR-made的异源表达与酶活测定：

(1)获得PPR-made基因片段

根据苯丙酮酸还原酶(PPR)基因序列(基因库登录号：KP735960，SEQ ID NO.3)，经过适合大肠杆菌表达的密码子优化后由公司合成获得PPR-made基因(SEQ ID NO.4)，该基因与PPR基因氨基酸序列完全相同，并在基因序列的上下游引入BamHI和XhoI的限制性酶切位点，以便于后续的载体构建。

(2)pET28a-PPR-made表达载体的构建

使用BamHI和XhoI分别双酶切合成的PPR-made基因与pET28a载体，连接转化后，构建得到重组表达PPR的质粒pET28a-PPR-made。使用BamHI和XhoI双酶切验证所构建的质粒，电泳检测酶切产物得到2条条带(5.9kb和0.9kb)，与预期相符(见图1，泳道1为DNA分子量Marker，泳道3为pET28a-PPR-made酶切电泳)。将pET28a-PPR-made转化入E.coli BL21(DE3)，得到PPR表达菌株BL21-PPR。

将表达菌株BL21-PPR接入LB培养基(含Kana 50ng/ml)中，37℃培养。当OD₆₀₀值达到0.4～0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导16h，SDS-PAGE电泳检测可溶性蛋白的表达。结果表明加入IPTG后，PPR(Mr约33.7KD)有明显表达条带，与预期大小相符。IPTG诱导前后PPR表达的SDS-PAGE检测结果见图3(泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1是BL21-PPR诱导前产物，泳道2是蛋白质BL21-PPR诱导后产物)。

3、葡萄糖脱氢酶GDH-made的异源表达与酶活测定：

(1)获得GDH-made基因片段

根据葡萄糖脱氢酶(GDH)基因序列(基因库登录号：J04805，SEQ ID NO.5)，经过适合大肠杆菌表达的密码子优化后由公司合成获得GDH-made基因(SEQ ID NO.6)，该基因与GDH基因氨基酸序列完全相同，并在基因序列的上下游引入BamHI和XhoI的限制性酶切位点，以便于后续的载体构建。

(2)pET28a-GDH-made表达载体的构建

使用BamHI和XhoI分别双酶切合成的GDH-made基因与pET28a载体，连接转化后，构建得到重组表达GDH的质粒pET28a-GDH-made。使用BamHI和XhoI双酶切验证所构建的质粒，电泳检测酶切产物得到2条条带(5.9kb和0.8kb)，与预期相符(见图1，泳道1为DNA分子量Marker，泳道4是BamHI/XhoI双酶切验证质粒pET28a-GDH-made)。将pET28a-GDH-made转化入E.coli BL21(DE3)，得到GDH表达菌株BL21-GDH。

将表达菌株BL21-GDH接入LB培养基(含Kana 50ng/ml)中，37℃培养。当OD₆₀₀值达到0.4～0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导16h，SDS-PAGE电泳检测可溶性蛋白的表达。结果表明加入IPTG后，GDH(Mr约28.0KD)有明显表达条带，与预期大小相符。IPTG诱导前后GDH表达的SDS-PAGE检测结果见图4(泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1是BL21-GDH诱导前产物，泳道2是蛋白质BL21-GDH诱导后产物)。

4、分别发酵所述菌株BL21-TAL、BL21-PPR和BL21-GDH

将菌株BL21-TAL在发酵培养基中培养，加入0.1％的乳糖30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述TAL表达菌体，表达菌体保存于-20℃；将菌株BL21-PPR在发酵培养基中培养，加入0.1％的乳糖30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述PPR表达菌体，表达菌体保存于-20℃；将菌株BL21-GDH在发酵培养基中培养，加入0.1％的乳糖30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述GDH表达菌体，表达菌体保存于-20℃。

二、配制催化反应体系制备化合物1：

按步骤一中的方法得到TAL、PPR和GDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：左旋多巴0.5mol，氨基酸脱氨酶湿菌体10g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体10g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体10g/L，调节反应体系pH8.0，在30℃条件下转化16h，所得丹参素含量为48.9g/L，摩尔转化率大于49.0％。利用高效液相色谱鉴定和定量反应混合物中产生的丹参素。

使用HPLC法测定反应混合物。色谱条件：色谱柱C₁₈柱(4.6mm×250mm，5m)；流动相A为甲醇，流动相B为1％醋酸；流速0.7ml/min；柱温30℃；检测波长280nm。色谱条件如下：0-15min，12％流动相A；接着在15min内，流动相A从12％线性增加到52％；在上述条件下，反应混合物中出现了与丹参素标准品(图5C，箭头所示)保留时间一致的峰(图5A，箭头所示)，图5B为底物左旋多巴的HPLC波谱。采用标准曲线法测定产物生成量，分别配制1、2、4、8和10ng/ml系列浓度标准溶液(丹参素)，进样测定。以溶液浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程A＝206.86c+60.63(r²＝0.9975)。

实施例2

除了以下步骤不同之外，其余步骤同实施例1。

按步骤一中的方法得到TAL、PPR和GDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：左旋多巴1.0mol，氨基酸脱氨酶湿菌体20g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体20g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体20g/L，调节反应体系pH8.0，在30℃条件下转化16h，所得丹参素含量为58.0g/L，摩尔转化率大于58.1％。

实施例3

除了以下步骤不同之外，其余步骤同实施例1。

按步骤一中的方法得到TAL、PPR和GDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：左旋多巴1.5mol，氨基酸脱氨酶湿菌体30g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体30g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体30g/L，调节反应体系pH8.0，在30℃条件下转化16h，所得丹参素含量为60.7g/L，摩尔转化率大于60.8％。

实施例4

除了以下步骤不同之外，其余步骤同实施例1。

按步骤一中的方法得到TAL、PPR和GDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：左旋多巴0.5mol，氨基酸脱氨酶湿菌体20g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体20g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体20g/L，调节反应体系pH8.0，在30℃条件下转化20h，所得丹参素含量为55.2g/L，摩尔转化率大于55.3％。

实施例5

除了以下步骤不同之外，其余步骤同实施例1。

按步骤一中的方法得到TAL、PPR和GDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：左旋多巴1.0mol，氨基酸脱氨酶湿菌体30g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体30g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体30g/L，调节反应体系pH8.0，在30℃条件下转化20h，所得丹参素含量为59.2g/L，摩尔转化率大于59.3％。

实施例6

除了以下步骤不同之外，其余步骤同实施例1。

按步骤一中的方法得到TAL、PPR和GDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：左旋多巴1.5mol，氨基酸脱氨酶湿菌体10g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体10g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体10g/L，调节反应体系pH8.0，在30℃条件下转化20h，所得丹参素含量为52.2g/L，摩尔转化率大于52.3％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 一种酶法合成丹参素的方法

<130> 2018

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1572

<212> DNA

<213> TAL

<400> 1

atgctcgcca tgagcccccc gaagccggcc gtcgagctgg atcgccacat cgatctggac 60

caggcccatg ccgtggcgag cggcggcgcg cggattgtcc ttgcccctcc ggcgcgcgac 120

cggtgccgtg cgtccgaagc gcggctcggc gctgtcatcc gcgaggcgcg ccatgtctac 180

ggactgacaa ccggcttcgg tccccttgcg aaccgcctga tctcaggtga gaatgtccga 240

acgctgcagg ccaatcttgt ccatcatctg gccagcggcg tgggaccggt gcttgactgg 300

acgacggcgc gcgccatggt tctggcgcgt ctggtgtcga tcgctcaggg agcctccggt 360

gccagcgagg ggaccatcgc tcgcctgatc gacctgctca attccgagct cgctccggcc 420

gttcccagcc gcggcacggt gggcgcgtcg ggtgacctga caccgcttgc gcatatggtg 480

ctctgcctcc agggccgggg agacttcctg gaccgggacg ggacgcggct tgacggcgca 540

gaagggctcc ggcgcggacg gctgcaaccg ctcgatctct cccatcgcga tgcactggcg 600

ctggtcaacg ggacctccgc catgaccggg atcgcgctgg tgaatgctca cgcctgccgc 660

catctcggca actgggcggt ggcgttgacg gccctgcttg cggaatgtct gagaggccgg 720

accgaggcat gggccgcggc actgtccgac ctgcggccgc atcccggaca gaaggacgcc 780

gcagcgaggc tgcgcgcccg cgtggacggc agcgcgcggg tggtccggca cgtcattgcc 840

gagcggaggc tcgacgccgg cgatatcggg acggagccgg aggcggggca ggatgcctac 900

agcctgcgct gcgctccgca ggttctcggg gcgggcttcg acacgctcgc atggcatgac 960

cgggtgctga cgatcgagct gaacgcggtg accgacaatc cggtgtttcc gcccgatggc 1020

agcgtgcccg ccctgcacgg gggcaatttc atgggccagc atgtggcgct gacgtccgat 1080

gcgctcgcca cggccgtcac cgttctggcg ggccttgcgg agcgccagat tgcacgtctg 1140

acagatgaaa ggctgaaccg tgggctgccc cccttcctcc accggggccc cgccgggttg 1200

aattccggct tcatgggcgc acaggtgacg gcgaccgcgc tcctggccga gatgcgagcc 1260

acgggacctg cctcgatcca ttcgatctcc acgaacgccg ccaatcagga tgtggtctcg 1320

cttgggacca tcgccgcgcg cctctgccgc gagaagatcg accgttgggc ggagatcctt 1380

gcgatcctcg ctctctgtct tgcacaagct gcggagctgc gctgcggcag cggcctagac 1440

ggggtgtctc ccgcggggaa gaagctggtg caggccctgc gcgagcagtt cccgccgctt 1500

gagacggacc ggcccctggg acaggaaatt gccgcgcttg ctacgcacct cttgcagcaa 1560

tctcccgtct ga 1572

<210> 2

<211> 1584

<212> DNA

<213> TAL-made

<400> 2

ggatccatgc tggccatgag tccgccgaaa ccggccgttg aactggatcg tcatattgat 60

ctggatcagg cacatgccgt ggcaagtggc ggtgcccgca ttgtgctggc accgcctgca 120

cgtgatcgct gtcgtgcaag cgaagcacgt ctgggcgccg ttattcgtga agcacgtcat 180

gtgtatggtc tgaccaccgg ttttggcccg ctggccaatc gcctgattag cggcgaaaat 240

gttcgtaccc tgcaggccaa tctggttcat catctggcaa gtggcgtggg tccggttctg 300

gattggacca ccgcacgtgc aatggttctg gcacgcctgg tgagtattgc ccagggtgca 360

agtggtgcca gtgaaggtac cattgcccgt ctgattgatc tgctgaatag cgaactggca 420

ccggcagtgc cgagtcgcgg cacagtgggt gcaagtggcg atctgacccc gctggcacat 480

atggttctgt gcctgcaggg ccgtggcgat tttctggatc gcgatggtac ccgcctggat 540

ggtgcagaag gcctgcgtcg cggtcgtctg cagccgttag atctgagtca tcgtgatgcc 600

ctggcactgg ttaatggtac cagcgccatg accggtattg ccctggtgaa tgcacatgca 660

tgccgtcatc tgggtaattg ggcagtggca ctgaccgcac tgctggccga atgtctgcgc 720

ggccgcaccg aagcatgggc cgcagcactg agtgatctgc gtccgcatcc gggtcagaaa 780

gatgccgcag cacgcctgcg tgcccgtgtg gatggtagcg cacgcgttgt tcgccatgtt 840

attgcagaac gtcgcctgga tgcaggtgac attggtaccg aaccggaagc cggccaggat 900

gcatatagtc tgcgttgcgc accgcaggtg ctgggcgctg gttttgatac cctggcatgg 960

catgatcgcg ttctgaccat tgaactgaat gcagttaccg ataatccggt ttttccgccg 1020

gatggcagtg tgccggccct gcatggcggt aattttatgg gtcagcatgt tgccctgacc 1080

agtgatgccc tggcgaccgc cgttaccgtt ctggccggtc tggcagaacg ccagattgcc 1140

cgcctgaccg atgaacgcct gaatcgtggt ctgccgccgt ttctgcatcg cggtccggca 1200

ggcctgaata gcggctttat gggtgcacag gtgaccgcca ccgcactgtt agccgaaatg 1260

cgcgccaccg gcccggccag cattcatagt attagcacca atgccgcaaa tcaggatgtg 1320

gttagcctgg gtaccattgc agcccgcctg tgccgtgaaa aaattgatcg ttgggccgaa 1380

attctggcaa ttctggccct gtgcctggcc caggcagccg aactgcgttg cggtagtggc 1440

ctggatggtg ttagtccggc cggtaaaaaa ctggtgcagg ccctgcgcga acagtttccg 1500

ccgctggaaa ccgatcgtcc gctgggccag gaaattgccg cactggccac ccatctgctg 1560

cagcagagcc cggtttaact cgag 1584

<210> 3

<211> 939

<212> DNA

<213> PPR

<400> 3

atgatgaaga ttctaaacag ctttagtctg aagccggagc agcgccaaac acttgaagca 60

gcgggacaca ccgtcatcga tgctgacaag cttgatgatg ccacggctca acaaattgac 120

gtggtttatg gttggaatgc tgcggctacc cgcgtgaact ttgaccgact tcagtttgtg 180

caggcgatgt ccgctggcgt tgattattta ccattggctg agttggctaa acaccatgtc 240

ttgctggcta atacaagcgg cattcacgcc gaacccattg cggagtatgt gcttggcgcc 300

ttgtttacga tcagtcgcgg tattttgcca gccattcgag cagatcgcga catgtggaca 360

ttacgccaag agcgaccgcc aatgacattg cttaagggca aaacagcagt catttttggc 420

accggtcata ttggatcaac gattgcgacc aaactccagg cattgggctt gcacacgatt 480

ggcgtgagtg cacatggccg tccggctgca ggatttgacc aagtgatgac ggatgtggcg 540

acccatgagg cagcagggcg agcagatgtc gtcatcaacg cgttaccatt aacgccagat 600

acaaaacact tttatgatga agcattcttt gcagccgcta gcaaacaacc gcttttcatt 660

aacattggcc gtggtccgtc agttgatatg gctgctttga cgcaggcatt gaaaaacaag 720

caaatcagtg ctgctgcctt ggatgtggtg gatccggaac cactgccgca agactcacca 780

ttatggggca tgacgaacgt tttgctcacg ccgcatattt cgggcacggt gccgcaatta 840

cgcgacaaag tttttaaaat atttaatgat aacctcaaaa ccttgatatc aagcggccaa 900

ttggcaagcc atcaagttga tctcacgcgc ggatactga 939

<210> 4

<211> 951

<212> DNA

<213> PPR-made

<400> 4

ggatccatga tgaagatcct gaatagtttc agtctgaaac cggaacagcg tcagaccctg 60

gaagcagcag gtcataccgt tattgatgcc gataaactgg atgatgccac cgcccagcag 120

attgatgtgg tgtatggttg gaatgcagcc gcaacccgcg tgaattttga tcgcctgcag 180

tttgttcagg caatgagcgc cggtgttgat tatctgccgc tggcagaact ggcaaaacat 240

catgtgctgc tggcaaatac cagtggcatt catgcagaac cgattgcaga atatgtgctg 300

ggtgcactgt ttaccattag ccgcggcatt ctgccggcaa ttcgtgccga tcgtgatatg 360

tggaccctgc gccaggaacg tccgccgatg accctgctga aaggtaaaac cgcagttatt 420

tttggtaccg gtcatattgg tagtaccatt gccaccaaac tgcaggcact gggcctgcat 480

accattggtg tgagtgccca tggtcgtccg gccgcaggtt ttgatcaggt tatgaccgat 540

gttgccaccc atgaagcagc cggccgcgca gatgttgtga ttaatgcact gccgctgacc 600

ccggatacca aacattttta tgatgaagca ttcttcgcag cagccagcaa acagccgctg 660

tttattaata ttggtcgtgg cccgagtgtt gatatggccg cactgaccca ggcactgaaa 720

aataagcaga ttagcgcagc cgccctggat gttgttgatc cggaaccgct gccgcaggat 780

agcccgctgt ggggtatgac caatgttctg ctgaccccgc atattagcgg taccgttccg 840

cagctgcgtg ataaagtttt taaaattttc aacgacaacc tgaagaccct gattagtagt 900

ggtcagctgg ccagccatca ggtggatctg acccgcggct attaactcga g 951

<210> 5

<211> 786

<212> DNA

<213> GDH

<400> 5

atgtataaag atttagaagg aaaagtagtg gtcataacag gttcatctac aggtttggga 60

aaatcaatgg cgattcgttt tgcgacagaa aaagccaaag tagttgtgaa ctatcgttct 120

aaggaggacg aagctaacag cgttttagaa gaaattaaaa aagttggcgg agaagcaatt 180

gctgtcaaag gtgatgtaac agttgagtct gacgttatca atttagttca atctgctatt 240

aaagagtttg gaaagctaga cgttatgatt aacaacgcag ggttagaaaa tccggtttca 300

tctcatgaaa tgtctttaag cgattggaat aaagtcattg atacgaactt aacgggagct 360

tttttaggca gccgtgaagc gattaaatat tttgtggaaa atgatattaa gggaacagtt 420

attaacatgt cgagtgttca cgagaaaatt ccttggccat tatttgttca ttatgcagca 480

agtaaaggcg gtatgaagct tatgactgaa acactggcat tagaatacgc tccaaaaggt 540

attcgtgtaa ataacattgg accaggagcg attaatacac cgattaacgc tgagaaattt 600

gctgatcctg agcagcgtgc agatgtagaa agcatgattc caatgggata catcggagag 660

ccggaagaaa ttgcagcagt tgctgcatgg ctagcttctt cagaggcgag ttatgtaaca 720

ggaattacgc tctttgctga cggcggtatg acacagtacc catcattcca agcaggacgc 780

ggataa 786

<210> 6

<211> 798

<212> DNA

<213> GDH-made

<400> 6

ggatccatgt acaaggatct ggaaggcaaa gttgtggtta ttaccggtag tagtaccggt 60

ctgggcaaaa gcatggcaat tcgctttgcc accgaaaaag caaaagtggt ggtgaattat 120

cgcagtaaag aagatgaagc aaatagcgtt ctggaagaaa ttaagaaagt tggtggtgaa 180

gccattgccg ttaaaggcga tgtgaccgtg gaaagcgatg ttattaatct ggttcagagc 240

gcaattaagg aatttggcaa actggatgtg atgattaata atgcaggtct ggaaaatccg 300

gttagcagcc atgaaatgag cctgagtgat tggaataagg ttattgatac caatctgacc 360

ggtgcctttc tgggcagtcg cgaagccatt aagtattttg tggaaaatga tatcaagggc 420

accgtgatta atatgagcag tgtgcatgaa aaaatcccgt ggccgctgtt tgttcattat 480

gcagccagca aaggtggtat gaaactgatg accgaaaccc tggcactgga atatgccccg 540

aaaggtattc gtgttaataa tattggtccg ggtgcaatta ataccccgat taatgcagaa 600

aaattcgccg atccggaaca gcgcgccgat gttgaaagta tgattccgat gggttatatt 660

ggcgaaccgg aagaaattgc cgcagtggcc gcatggctgg ccagtagtga agcaagctat 720

gttaccggca ttaccctgtt tgcagatggc ggcatgaccc agtatccgag ctttcaggca 780

ggccgcggtt aactcgag 798

Claims

1.一种酶法合成丹参素的方法，其特征在于，所述方法是以左旋多巴为底物，通过酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶催化生产丹参素；具体包括如下步骤：

(1)酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的异源表达：分别构建酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的基因工程菌，经发酵分别制得表达酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的菌体：酪氨酸解氨酶湿菌体、苯丙酮酸还原酶湿菌体和葡萄糖脱氢酶湿菌体；

(2)然后将左旋多巴0.5-1.5mol、酪氨酸解氨酶湿菌体10-30g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体10-30g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体10-30g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0，温度为30℃，催化反应16-20h，得到丹参素。

2.根据权利要求1所述的酶法合成丹参素的方法，其特征在于，催化0.5-1.5mol底物左旋多巴需要酪氨酸解氨酶湿菌体15-20g/L、苯丙酮酸还原酶湿菌体15-20g/L、葡萄糖脱氢酶湿菌体15-20g/L。

3.根据权利要求1所述的酶法合成丹参素的方法，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶选自类球红细菌。

4.根据权利要求1所述的酶法合成丹参素的方法，其特征在于，所述苯丙酮酸还原酶选自干酪乳杆菌。

5.根据权利要求1所述的酶法合成丹参素的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶选自巨大芽孢杆菌。

6.根据权利要求1所述的酶法丹参素的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体如下：

(a)构建酪氨酸解氨酶载体：

利用BamHI和XhoI分别将TAL-made基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达酪氨酸解氨酶的质粒pET28a-TAL-made；

(b)构建苯丙酮酸还原酶载体：

利用BamHI和XhoI分别将PPR-made基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达苯丙酮酸还原酶的质粒pET28a-PPR-made；

(c)构建葡萄糖脱氢酶载体：

利用BamHI和XhoI分别将GDH-made基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达葡萄糖脱氢酶的质粒pET28a-GDH-made；

(d)分别构建酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的基因工程菌；

将质粒pET28a-TAL-made、pET28a-PPR-made和pET28a-GDH-made分别转入E.coliBL21，得到分别重组表达酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的菌株BL21-TAL、BL21-PPR和BL21-GDH；

(e)将菌株BL21-TAL在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述酪氨酸解氨酶表达菌体；

将菌株BL21-PPR在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述苯丙酮酸还原酶表达菌体；

将菌株BL21-GDH在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述葡萄糖脱氢酶表达菌体。

7.根据权利要求6所述的酶法合成丹参素的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为：葡萄糖2％、硫酸铵0.3％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉2％、KH₂PO₄1.25％、MgSO₄0.1％、柠檬酸0.15％和乳糖0.1-0.5％，发酵条件：pH7.0，温度37℃，诱导后降温至25-30℃，发酵结束后再以6000rpm转速离心10min，-20℃保存菌体备用。