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CN105254728B - 改良植物根系和产量的相关蛋白TaMOR-D及其编码基因与应用 - Google Patents

改良植物根系和产量的相关蛋白TaMOR-D及其编码基因与应用 Download PDF

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CN105254728B
CN105254728B CN201510762495.6A CN201510762495A CN105254728B CN 105254728 B CN105254728 B CN 105254728B CN 201510762495 A CN201510762495 A CN 201510762495A CN 105254728 B CN105254728 B CN 105254728B
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Abstract

本发明公开了改良植物根系和产量的相关蛋白TaMOR‑D及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。本发明所提供的TaMOR蛋白及其编码基因在改良植物根系、增加产量和抗倒伏方面具有重要意义，将在培育根系发达、高产和抗倒伏植物品种中发挥重要作用。

Description

改良植物根系和产量的相关蛋白TaMOR-D及其编码基因与 应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，尤其涉及改良植物根系和产量的相关蛋白TaMOR-D及其编码基因与应用。
背景技术
粮食问题是关乎国家安全的头等大事，但是全球气候变暖及其他环境因素变化导致全球范围内粮食大量减产，使粮食供给减少，局部地区因粮食短缺引发动荡。同时全球人口不断增加，消费需求加上生物能源需求增加，使得粮食需求大增。所以粮食增产问题是全球农业面临的巨大挑战。
根系在水分和养分摄取，支撑植株生长和根系微环境建立等方面起重要作用。根系改良越来越被认同是作物改良的一种有效手段。根系的生长发育受到一系列基因的调节。明确根系生长发育的调控机制，将为根系基因工程研究和应用提供科学依据。研究表明，把分子遗传学和遗传工程研究相结合，将有助于基因发掘和作物改良，从而达到增产的目的。
因此，利用现代分子生物技术，发掘根系形态建成相关基因，通过基因工程改良根系，对粮食增产具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种改良植物根系和产量的相关蛋白TaMOR-D及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白质，命名为TaMOR蛋白，来源于小麦(Triticum aestivum L.)品种旱选10号，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。
为了便于上述(a)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表1：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列4、序列5和序列6所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
编码所述蛋白质的DNA分子也属于本发明的保护范围。
上述DNA分子为如下1)-5)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)编码区为序列表中序列1第14-739位所示的DNA分子；
3)编码区为序列表中序列1第14-742位所示的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
5)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白质的DNA分子。
其中，序列1由926个核苷酸组成，第14-742位为ORF，编码序列表中序列2所示的蛋白质。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCUbi 1390、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。
在本发明中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为35S启动子。
更为具体的，所述重组表达载体为在pCAMBIA1300-GFP和pCUBi 1390载体的多克隆位点处插入所述基因后得到的重组质粒。所述多克隆位点具体分别为HindIII和SmaI、BamHI和SpeI。
所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。
上述蛋白质或所述DNA分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物根系和/或产量中的应用也属于本发明的保护范围：
上述调控植物根系为提高植物侧根、冠状根数量和/或根干重；
上述调控植物产量体现在提高植物单株粒数和/或单株产量。
上述蛋白质或所述DNA分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在培育高改良根系和/或高产量转基因植物中的应用也是本发明保护的范围。
上述蛋白质在作为转录因子中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻；
或所述植物为双子叶植物，所述单子叶植物具体为拟南芥。
本发明另一个目的是提供一种培育改良根系和/或高产量转基因植物的方法，包括如下步骤：将上述DNA分子导入目的植物，得到转基因植物；
所述转基因植物具有如下1)-8)中至少一种表型：
1)所述转基因植物的根系改良；
2)所述转基因植物产量高于所述目的植物；
3)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；
4)所述转基因植物的地上干重大于所述目的植物；
5)所述转基因植物的分蘖数大于所述目的植物；
6)所述转基因植物的主穗长大于所述目的植物；
7)所述转基因植物的主茎直径大于所述目的植物；
8)所述转基因植物的主穗一次枝梗数大于所述目的植物。
上述方法中，所述转基因植物的根系改良体现在如下A-C中至少一种：
A)所述转基因植物的侧根数大于所述目的植物；
B)所述转基因植物的冠状根数大于所述目的植物；
C)所述转基因植物的根干重大于所述目的植物；
所述转基因植物产量高于所述目的植物体现在如下D和/或E：
D)所述转基因植物的单株粒数大于所述目的植物；
E)所述转基因植物的单株产量大于所述目的植物；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻；实施例用的是野生型水稻Kitaake。
或所述植物为双子叶植物，所述单子叶植物具体为拟南芥，实施例中用的是拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)。
所述蛋白质在作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的实验证明了，本发明发现了新蛋白TaMOR-D，过表达TaMOR-D能有效改良拟南芥根系，并且有效改良水稻根系、茎秆及其产量等性状，证明TaMOR-D与植物的根系生长和单株产量有关，为培育高产量的转基因植物提供基础。。
附图说明
图1为TaMOR-D亚细胞定位示意图；A、B分别为Confocal下观察小麦原生质体和烟草叶片中TaMOR-D-GFP表达的情况。
图2为TaMOR-D蛋白全长及其截断的转录激活活性检测结果；A为TaMOR截断示意图；B为TaMOR截断连接到BD载体上转化的酵母在缺陷培养基上的生长状况。
图3为TaMOR在小麦不同发育时期不同组织中的相对表达量；A和B分别为实时定量PCR和半定量PCR分析TaMOR在不同时期不同组织中的相对表达情况。
图4为从小麦种子萌发到幼苗期TaMOR的表达情况；A为小麦从种子萌发到幼苗期(1-13天)的生长状况；B为TaMOR在种子开始萌发后13天的表达变化趋势。
图5TaMOR表达受生长素诱导；A为在生长素(IAA)处理下TaMOR表达情况；B为在生长素和蛋白表达抑制剂放线菌酮(CHX)处理下TaMOR的表达情况。
图6为过表达TaMOR拟南芥表型；A为野生型(WT)和转基因拟南芥株系(Line1-3)的植株形态；B为野生型和转基因株系侧根数的分析结果。
图7为过表达TaMOR水稻表型；A为T0代转基因水稻株系中畸形植株表型。B-E为正常生长转基因水稻株系和对照比对图；B为转基因水稻幼苗和对照比对图；C为转基因水稻成熟期植株和对照比对图；D为转基因水稻幼苗根系和对照比对图；E为转基因水稻成熟期根系和对照比对图；F转基因水稻主穗和对照比对图。
图8为过表达TaMOR水稻表型性状统计结果；A为苗期转基因株系(Line1-3)和野生型(WT)的冠状根数比对结果；B-K依次为成熟期转基因水稻株系(Line1-3)和野生型(WT)的性状比对结果：根干重(B)、地上干重(C)、分蘖数(D)、株高(E)、主穗长(F)、主茎直径(G)、主穗一次枝梗数(H)、千粒重(I)、单株粒数(J)和单株产量(K)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
小麦(Triticum aestivum L.)品种旱选10号：耐旱品种，来源于国家种质库(编号：ZM009279)。记载于“王正航,武仙山,昌小平等.小麦旗叶叶绿素含量及荧光动力学参数与产量的灰色关联度分析.作物学报,2010年02期”一文，公众可从申请人处获得，仅限于用于重复本发明。
pCAMBIA1300-GFP载体：由CAMBIA公司的pCAMBIA1300载体按照如下方法改造而来：(1)在pCAMBIA1300载体的酶切位点BamHI和XbaI之间插入序列3所示DNA片段(含有2个CaMV 35S启动子)后得到中间载体；(2)在所述中间载体的KpnI和SacI位点间插入序列表中序列4所示DNA片段(GFP的开放阅读框)，最终得到所述pCAMBIA1300-GFP载体。
pCUBi 1390载体：记载于“水稻基因OsASIE1抗逆功能分析。作物学报，2011年37(10)1771-1778.”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于复制本发明。
根癌农杆菌GV3101(Agrobacterium tumefaciens StrainGV3101)：BiovectorScience Lab,Inc产品。
根癌农杆菌EHA105(Agrobacterium tumefaciens strain EHA105)：北京华越生物公司产品。
拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)：记载于“马元媛.外源NO对拟南芥愈伤组织呼吸强度及线粒体复合体Ⅰ蛋白的影响.兰州大学,2007年硕士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅限于用于重复本发明。
野生型水稻Kitaake：记载于“水稻高光效育种研究进展。生物技术进展，2014年4(3)153-157.”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于复制本发明。
实施例1、TaMOR蛋白及其编码基因及其表达研究
一、TaMOR蛋白及其编码基因的获得
将大小均匀一致的小麦(Triticum aestivum L.)品种旱选10号的种子，置于直径9cm培养皿中，在22℃，光强150μmol·m-2·s-1，光周期为12h光照、12h黑暗，相对湿度70％条件下，加去离子水培养。取长至一叶一心的幼苗叶片，用液氮速冻，-80℃保存备用。用TRIZOL提取总RNA，以M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA(Invitrogen)，以此cDNA为模板，引物F1和R1进行PCR扩增，得到926bp的PCR扩增产物。经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，将该PCR产物所示的基因命名为TaMOR-D，该基因的编码区为序列1第14-742位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为TaMOR-D，其氨基酸序列为序列表中序列2。
二、TaMOR-D蛋白表达研究
A、TaMOR-D蛋白的亚细胞定位
重组载体pCAMBIA1300-TaMOR-D-GFP为将序列1所示TaMOR-D插入pCAMBIA1300-GFP载体的HindⅢ和SmaI酶切位点间得到的载体。
将重组载体pCAMBIA1300-TaMOR-D-GFP分别转入小麦原生质体和烟草叶片中。
小麦原生质体瞬间表达步骤：
1、制备高浓度融合目标基因的表达载体质粒DNA，浓度应达到2μg/μl。
2、取小麦品种旱选10号一叶一心期小麦绿色幼苗叶片，用刀片去掉叶片尖端和基部组织，将剩余的叶片部分切成0.5-1mm的长条。
3、将切好的叶片置于30ml酶解液中，在黑暗条件下，置于摇床中，轻微摇动酶解3-4h。
4、用等体积的W5溶液稀释酶解液。
5、用W5溶液润洗不锈钢网筛(200目)2-3次。
6、用不锈钢网筛(200目)过滤稀释后的酶解物，获原生质体溶液，100×g离心4min。
7、用冰浴的30ml W5溶液轻柔重悬原生质体，100×g离心4min。
8、轻轻吸出上清后用30ml W5溶液再次重悬原生质体，并将其置于冰上30min；同时用显微镜检查原生质体数目和状态。
9、100×g离心4min，用适量的(20ml)MMg溶液重悬原生质体。
10、将20μg质粒加入到5ml离心管中。
11、缓慢吸取1ml原生质体，加入到含有质粒的离心管中。
12、加入1ml的PEG4000溶液，室温下，静置20min。
13、加入3ml W5溶液，轻轻混匀，终止反应。
14、100×g离心4min，轻轻吸出上清，并用3ml W5溶液重悬原生质体。
15、重复上一步，用1ml W5溶液重悬原生质体，24℃光照培养16h。
16、在Leika TCS-NT激光扫描共聚焦显微镜下观察记录GFP表达情况。
小麦原生质体瞬间表达主要缓冲液配置：
(1)酶解液
55℃水浴10min，冷却至室温后加入以下试剂：
10mM CaCl2 1ml 0.15M CaCl2
0.1％BSA 1ml 1.5％BSA
(2)PEG 4000溶液
(3)W5溶液
(4)MMg溶液
甘露醇(mannitol) 400mM
氯化镁(MgCl2) 15mM
2-吗啉乙磺酸(MES) 4mM，pH5.7
烟草转化步骤：
1、将构建好的目的质粒热击转化到农杆菌GV3101中，倒置，28℃培养2-3d。
2、挑取经过菌落PCR鉴定的阳性克隆，接种于5ml YEB(Kan+Rif抗性)液体培养基，28℃200rpm培养过夜。
3、当菌液呈橙红色时检测OD值，并依据OD值按照如下公式，吸取菌液。
Vconstruct＝Vfinal×0.5/OD，Vp19＝Vfinal×0.3/OD
4、将载体与p19的菌液按照计算好的比例混合在一个试管中，12000rpm离心1min。
5、利用侵染Buffer重悬菌体，继续培养4h。
Buffer配置方法如下：
6、注射于烟草(Nicotiana benthamiana)叶片的背面，注射过的烟草正常生长3-4d。
7、用Confocal观察GFP发光情况。
亚细胞定位结果如图1所示。结果表明TaMOR在小麦原生质体和烟草细胞中的定位相同，都定位在细胞核和细胞膜上。
B、TaMOR-D蛋白的转录激活活性
TaMOR-D蛋白P1截短体为序列2第1-242位氨基酸；
TaMOR-D蛋白P2截短体为序列2第7-242位氨基酸；
TaMOR-D蛋白P3截短体为序列2第29-242位氨基酸；
TaMOR-D蛋白P4截短体为序列2第109-242位氨基酸；
TaMOR-D蛋白P5截短体为序列2第7-108位氨基酸；
TaMOR-D蛋白P6截短体为序列2第1-108位氨基酸；
TaMOR-D蛋白P7截短体为序列2第1-28位氨基酸；
将上述各截短体编码基因插入pGBKT7载体(BD载体)(Clontech公司产品，其产品目录号为VT1638)的EcoRI和BamHI酶切位点间得到重组载体(图2A)。
利用酵母系统，通过两个报告基因HIS和LACZ确定TaMOR的转录激活活性及其活性区域。即在二缺(SD/-Trp-His)和三缺培养基(SD/-Trp-His-Ade)(采用泛基诺公司的基础培养基Minimal SD Base、二缺Trp-His-dropout和三缺Trp-His-Ade-dropout配置)上，检测酵母在营养缺陷培养基上能否生长。
结果发现，在二缺(SD/-Trp-His)和三缺培养基(SD/-Trp-His-Ade)上，只有含P4片段的酵母生长良好，如图2B所示。表明TaMOR-D具有转录激活活性，C端是TaMOR-D的转录激活区域。
C、TaMOR-D基因在不同组织中的表达情况
在小麦(Triticum aestivum L.)品种旱选10号生长不同时期取不同组织部位为样品，经液氮冷冻，-80℃保存备用。包括萌发期(胚芽、根基和根)、幼苗期(叶、根基和根)和抽穗期(根、叶、叶鞘、节、节间和穗)。用TRIZOL分别提取上述液氮保存样品的总RNA，以M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA，采用实时定量和半定量方法检测TaMOR在不同时期不同组织中的表达差异。用组成型表达的Tubulin基因作为内参，设计的引物序列如下：
检测基因TaMOR-D表达的引物序列如下：
TaMOR-RT-F：5’-GTCTTTGCGCCCTACTTCTG-3’(序列1的第80-99位)；
TaMOR-RT-R：5’-TCATGACCTGCTGCTGGAG-3’(序列1的第281-299位的反向互补序列)；
检测基因Tubulin表达的引物序列如下：
Tubulin-RF：5’-GAGGCCTCGTGTGGTCGCTTTGT-3’；
Tubulin-RR：5’-GCCCAGTTGTTACCCGCACCAGA-3’。
实时定量和半定量实验结果如图3所示，TaMOR-D在不定根和侧根发生的部位即根基和根上表达量明显高于其它组织。
D、TaMOR基因从小麦种子萌发到幼苗的表达情况
从小麦种子萌发开始直到第13天，分别截取小麦根基为样品，经液氮冷冻，-80℃保存备用。用TRIZOL分别提取上述液氮保存样品的总RNA，以M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA，采用实时定量方法检测TaMOR从萌发到第13天幼苗期的表达情况。检测引物同检测TaMOR组织表达实验。
实时定量实验结果如图4所示，从萌发到幼苗期TaMOR表达变化呈现U型趋势，即第1天的表达量较高，第2天下降，第4-5天最低，第6天开始上升，第13天达到最高。
E、TaMOR基因对生长素处理的表达情况
小麦种子水培5天，将幼苗移到1μM吲哚乙酸(IAA)溶液中处理，分别在0h、1h、3h、6h、12h、24h截取幼苗的根基组织为样品，经液氮冷冻，-80℃保存备用。取萌发后第8天的小麦幼苗首先浸入到50μM放线菌酮(CHX)中进行24小时前期处理，再分别浸入水、50μM CHX、1μM IAA、50μM CHX和1μM IAA的混合溶液中处理3h。截取幼苗的根基组织为样品，经液氮冷冻，-80℃保存备用。用TRIZOL分别提取上述液氮保存样品的总RNA，以M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA，采用半定量PCR的方法检测基因TaMOR对处理的响应情况。检测引物同检测TaMOR组织表达实验。
半定量PCR检测结果如图5所示，TaMOR受生长素处理上调表达，在处理3h达到高峰。并且生长素诱导TaMOR表达不受蛋白抑制剂CHX的影响。
实施例2、TaMOR-D基因的功能验证
一、TaMOR-D基因在提高拟南芥侧根数中的应用
1、TaMOR-D基因的扩增
根据TaMOR-D基因序列1的序列设计引物对(F1和R1)，引物5’末端分别引入HindIII和SmaI酶切识别位点。以小麦品种旱选10号的cDNA为模板，PCR扩增TaMOR-D基因；将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化900bp左右的条带。
F1：5’-CCCAAGCTTATGACGGGACTTGGGTCG-3’(下划线部分为HindIII的酶切位点，其后的序列为序列表中序列1的第14-31位)；
R1：5’-TCCCCCGGGCGAGCGATTTAGGTACGCAT-3’(下划线部分为SmaI的酶切位点，其后的序列为序列表中序列1的第720-739位的反向互补序列)。
2、重组载体的构建
①用限制性内切酶HindIII和SmaI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；
②用限制性内切酶HindIII和SmaI酶切载体pCAMBIA1300-GFP，回收载体骨架；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
④将步骤③的连接产物电击转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃培养过夜，挑取阳性克隆进行测序。测序结果表明，得到了重组载体pCAMBIA1300-TaMOR-D-GFP，其为将序列1第14-739位核苷酸插入pCAMBIA1300-GFP的HindIII和SmaI酶切位点得到的载体。
2、转基因拟南芥的获得
1)将2μl构建正确的重组质粒pCAMBIA1300-TaMOR-D-GFP加入至20μl根癌农杆菌GV3101感受态细胞中，28℃热击转化。
2)将转化的农杆菌进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的单菌落，接入5ml YEB液体培养基(含50mg/l卡那霉素，50mg/l利福平)中，28℃、250rpm振荡培养过夜。
3)将步骤2的5ml菌液转至250ml YEB液体培养基(含50mg/l卡那霉素，50mg/l利福平)中，28℃、250rpm振荡培养约14h(菌液OD600达到0.8-1.0)。
4)配置农杆菌转染缓冲液。农杆菌转染缓冲液：1/2MS 100ml，加5g蔗糖、80μlSilwet-77。
5)离心收集菌体，用农杆菌转染缓冲液重悬菌体。
6)选取刚开花的拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)植株，将花序浸泡在农杆菌转染缓冲液中大约30sec，套上保鲜袋保湿，黑暗培养24h，然后去掉保鲜袋，正常培养，收获种子为T0代。T0代自交获得T1代种子。
7)将T1代种子消毒后，平铺于MS培养基上(含50mg/L潮霉素)，4℃春化2d，22℃、16h光照/8h黑暗培养14d，挑选抗潮霉素的转基因拟南芥植株，将转基因株系繁种、加代，得到多个T3代纯合转TaMOR-D拟南芥株系(所有后代均具有潮霉素抗性的亲代为纯合系)。
3、转基因拟南芥的分子鉴定
提取T3代纯合转TaMOR-D拟南芥株系的基因组DNA，用上述F1和R1进行PCR扩增，得到926bp为阳性T3代纯合转TaMOR-D拟南芥株系，经过检测，T3代纯合转TaMOR-D拟南芥株系全部为阳性。
采用同样的方法将空载体pCAMBIA1300-GFP导入拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)中，得到T3代纯合转空载体拟南芥。
4、转基因拟南芥的表型鉴定
1)、实验材料的培养
取拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)(野生型对照，WT)、T3代纯合转TaMOR-D拟南芥株系(Line1、Line2和Line3)和T3代纯合转空载体拟南芥(Vector)的种子，先用加有0.01％(v/v)Triton X-100的10％(v/v)NaClO溶液消毒处理15min，然后在超净工作台中用灭菌水清洗8次。再将其播种到添加3.0％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)琼脂粉的MS培养基进行萌发培养。萌发培养先经4℃处理2d，再移到22℃、12h光照的培养箱中垂直培养8d。
每个株系3株，实验重复3次，结果取平均值。
2)、拟南芥侧根数的统计分析
利用EXPSON EXTRESSION 10000XL扫描仪(EXPSON，JAPAN)扫描拟南芥幼苗根系，利用winRHIZO软件分析根系扫描图像。
幼苗根系及其统计结果如图6所示，T3代纯合转TaMOR-D拟南芥株系(Line1、Line2和Line3)的侧根数显著高于野生型拟南芥。
拟南芥哥伦比亚0型(Clo-0)和T3代纯合转空载体拟南芥无显著差异。
上述结果说明过表达TaMOR-D能有效增加拟南芥的侧根数。
二、TaMOR-D基因显著改良水稻根系并提高产量
1、TaMOR-D基因的扩增
根据TaMOR-D基因的序列设计引物对(F2和R2)，引物5’末端分别引入BamHI和SpeI酶切识别位点。以小麦品种旱选10号的cDNA为模板，PCR扩增TaMOR-D基因；将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化900bp左右的条带。
F2：5’-CGGGATCCATGACGGGACTTGGGTCG-3’(下划线部分为BamHI的酶切位点，其后的序列为序列表中序列1的第14-31位)；
R2：5’-GGACTAGTTTACGAGCGATTTAGGTACGC-3’(下划线部分为SpeI的酶切位点，其后的序列为序列表中序列1的第722-742位的反向互补序列)。
2、重组载体的构建
①用限制性内切酶BamHI和SpeI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；
②用限制性内切酶BamHI和SpeI酶切载体pCUbi1390，回收载体骨架；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；
④将步骤③的连接产物电击转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃培养过夜，挑取阳性克隆进行测序。测序结果表明，得到了重组载体pCUbi1390-TaMOR-D，其为将序列1第14-742位核苷酸插入pCUbi1390的BamHI和SpeI酶切位点得到的载体。
2、转基因水稻的获得
以水稻品种Kitaake为受体，通过农杆菌介导转化方法转化水稻Kitaake的成熟胚愈伤组织，经过抗性愈伤组织的筛选及分化，生根、壮苗过程，最终获得21个T0代转TaMOR-D水稻株系。
3、转基因拟南芥的分子鉴定
提取T0代转TaMOR-D水稻株系的基因组DNA，用上述F2和R2进行PCR扩增，得到926bp为阳性T0代转TaMOR-D水稻株系，经过检测，T0代转TaMOR-D水稻株系全部为阳性。
采用同样的方法将空载体pCUbi1390导入水稻品种Kitaake中，得到T3代纯合转空载体水稻。
4、转基因水稻表型鉴定
取水稻品种Kitaake(野生型对照，WT)、T3代转TaMOR-D水稻株系(Line1、Line2和Line3)和T3代纯合转空载体水稻(vector)的种子，播种进行盆栽室外培养。每个株系播种15粒种子，实验重复3次，结果取平均值。
分别在苗期(播种后第20天)和成熟期(播种后第70天)对转基因株系和野生型进行表型鉴定。苗期主要对植株根系冠状根数进行统计分析。成熟期对根干重、地上干重、分蘖数、株高、主穗长、主茎直径、主穗一次枝梗数、千粒重、单株产量和单株粒数进行统计分析。统计结果如表2。
表2苗期和成熟期表型统计结果
性状 WT Vector Line1 Line2 Line3
冠状根数 21.3±3.2B - 31±1.0A 30.0±2.6A 31.0±1.0A
根干重 1.73±0.1B 1.71±0.09B 2.10±0.18A 2.07±0.15A 1.99±0.09A
地上干重 29.57±1.08B 29.62±1.05B 32.46±1.19A 32.30±1.54A 31.68±1.32A
分蘖数 9.4±1.17 9.3±0.90 9.4±1.30 9.2±1.12 9.5±0.87
株高 60.6±1.45B 60.4±1.59B 62.5±1.37A 62.4±1.75A 62.4±1.43A
主穗长 11.5±0.53B 11.6±0.52B 14.1±0.78A 14.0±0.71A 13.9±0.78A
主茎直径 4.66±0.27B 4.77±0.24B 5.88±0.34A 5.24±0.46A 5.62±0.29A
主穗一次枝梗数 6.4±0.53B 6.4±0.75B 11.7±0.86A 11.1±0.78A 10.0±0.71A
千粒重 21.14±0.21A 21.32±0.25A 19.26±0.97B 19.31±0.24B 19.58±0.32B
单株产量 10.37±0.67B 10.28±0.50B 11.92±0.75A 11.83±0.80A 11.78±1.20A
单株粒数 493.6±21.7B 485.4±26.9B 650.9±11.4A 630.7±26.5A 634.9±51.6A
注释：A、B表示在0.01水平存在显著差异。
T0代有16个转TaMOR-D水稻表现出极其多的冠状根，但是地上部分生长发育畸形，最终不能获得种子(图7A)，其余的5个株系生长正常。
T3代苗期表型鉴定如图7所示，图7B苗期植株整体长势对比图，图7D为苗期根部表型对比图。冠状根数统计结果如表2所示，表明在转基因植株苗期冠状根数显著多于对照株系。
T3代成熟期表型鉴定如图7和图8所示，图7C表示对照和转基因株系在成熟期的整体对比，图7E表示对照和转基因株系成熟期的根系，图7F表示对照和转基因成熟期株系的主穗。图8中，A-K分别为对照和转基因水稻的冠状根数、根干重、地上干重、分蘖数、株高、主穗长、主茎直径、主穗一次枝梗数、千粒重、单株粒数、单株产量对比结果。T3代转TaMOR-D水稻的株高、主穗长度及一次枝梗数显著高于野生型。株高的增加是由主穗长度增加引起的。成熟期的转基因株系地下和地上干重显著高于野生型。转基因株系的千粒重显著低于野生型，但是单株粒数和籽粒产量显著高于野生型。此外，转基因株系的茎秆直径显著大于野生型。实验结果表明过表达TaMOR-D能显著改良水稻根系和增加产量，同时大根系和粗壮的茎秆也能增强植株的抗伏性。

Claims (12)

1.一种蛋白质，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为编码区为序列表中序列1第14-739位所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、重组菌或重组病毒。
5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、重组菌或重组病毒在调控植物根系和/或产量中的应用。
6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、重组菌或重组病毒在培育根系改良和/或高产量转基因植物中的应用；
所述根系改良的转基因植物为如下A-C中至少一种：
A）所述转基因植物的侧根数大于目的植物；
B）所述转基因植物的冠状根数大于目的植物；
C）所述转基因植物的根干重大于目的植物。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻；所述双子叶植物为拟南芥。
9.权利要求1所述蛋白质在作为转录因子中的应用。
10.一种培育改良根系和/或高产量转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述DNA分子导入目的植物，得到转基因植物；
所述转基因植物具有如下1）-8）中至少一种表型：
1）所述转基因植物的根系改良；
所述转基因植物的根系改良体现在如下A-C中至少一种：
A）所述转基因植物的侧根数大于所述目的植物；
B）所述转基因植物的冠状根数大于所述目的植物；
C）所述转基因植物的根干重大于所述目的植物；
2）所述转基因植物产量高于所述目的植物；
3）所述转基因植物的株高大于所述目的植物；
4）所述转基因植物的地上干重大于所述目的植物；
5）所述转基因植物的分蘖数大于所述目的植物；
6）所述转基因植物的主穗长大于所述目的植物；
7）所述转基因植物的主茎直径大于所述目的植物；
8）所述转基因植物的主穗一次枝梗数大于所述目的植物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：
所述转基因植物产量高于所述目的植物体现在如下D和/或E：
D）所述转基因植物的单株粒数大于所述目的植物；
E）所述转基因植物的单株产量大于所述目的植物；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：
所述单子叶植物为水稻；
所述双子叶植物为拟南芥。
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