CN110607309A - 一种可增强植物抗旱作用的蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可增强植物抗旱作用的基因、其编码的蛋白,以及利用转基因技术获得高抗旱性玉米的应用，将所述的基因通过以抗氯霉素和抗除草剂Basta为筛选标记的重组真核表达载体导入玉米中，得到转基因玉米植株。本发明提供了一种可增强植物抗旱作用的基因、该基因编码的蛋白及其用于培养高抗旱性玉米的用途，通过农杆菌介导的方法，将基因导入玉米植株中，获得转基因玉米；相对于未转化的玉米品种，该转基因玉米植株具有较强的抗旱性。

Description

一种可增强植物抗旱作用的蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种可增强植物抗旱作用的蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

玉米(Oryza sativa L.)是重要的粮食作物。玉米生产是一个大需水量的过程，因此玉米生产对缺水十分敏感。我国的主要玉米种植期(东北地区4～9月，黄淮地区3～10月，长江流域3～11月，华南和西南地区1～12月)常常遭遇不同程度的干旱影响。据初步估算作物受旱面积和受旱成灾面积大致以每10年408.8万公顷和209.0万公顷的速率增长。根据中国农科院农业政策研究中心预测，2020年我国玉米需要2.04亿吨，生产能力1.84亿吨，每公顷产量约7.8吨，届时每年还需要进口2100万吨玉米才能满足粮食和畜牧业的增长需求，其中40％以上的增产应通过新品种选育和推广实现，要满足我国对玉米的需求，必需提高玉米的耐旱能力。

传统的玉米抗性育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。而且中国各玉米种族品种的遗传背景比较单一，抗逆性问题依然存在，通过常规杂交选育耐旱玉米品系十分困难，一是没有可靠的耐旱种质资源材料，二是没有可信稳定的选育评判性状指标，三是由于常规选育技术固有的缺陷(随机、盲目性)。因此，难以将耐旱性状与其它农艺性状实现协调性聚合在同一品种中或者至少其选育进度等难以满足生产要求。

转基因育种技术已成为玉米育种中的一个不可替代的育种策略。最大的特点是有可靠的转基因筛选标记、可定向操作并改良重要性状，育成速度相对较快，更重要的是能够实现性状的定向聚合。自1996年来，国际上商业化或者申请商业化的转基因玉米品种仅有抗虫的转Bt基因、抗除草剂玉米以及抗虫玉米。迄今为止，全世界也没有育成一个转基因的“抗旱玉米品种”。

发明内容

本发明的目的是提供一种可增强植物抗旱作用的基因，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其在干旱胁迫早期诱导时表达量明显上升。其编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明的另一个目的是提供上述可增强植物抗旱作用的基因在提高玉米或其他植物抗旱性中的用途。

本发明所提供的可增强植物抗旱作用的基因在提高玉米抗旱性中的用途，是将目的基因导入玉米中，得到转基因玉米植株。

其中，所述目的基因通过以抗氯霉素和抗除草剂Basta为筛选标记的重组真核表达载体导入玉米中。

其中，所述真核表达载体为质粒pGSA1252。

其中，将目的基因的cDNA序列克隆到质粒pGSA1252在3×CaMV35S强启动子下游Nco1/BamH1酶切位点，获得重组质粒pGSA1252::RA33G4。

其中，重组质粒pGSA1252::RA33G4导入玉米的方法包括以下步骤：

(1)将重组质粒pGSA1252::RA33G4导入根癌农杆菌；(2)将导入质粒的根癌农杆菌制备成OD600为0.5、含100μM的乙酰丁香酮的菌液；

(3)用解剖刀的尖端轻微创伤玉米的成熟胚，再用75％酒精消毒，然后将种子转入步骤(2)的菌液中，再加20ml的MS液体培养基和6μl的50mg/ml的乙酰丁香酮，在28℃，100rpm的摇床上培养18-20h；

(4)将玉米成熟种子取出，转移到含MS、30g/L蔗糖、100μM乙酰丁香酮、7g/L琼脂、pH6.0的共培养基上，在28℃黑暗共培养3天；

(5)将玉米成熟种子冲洗干净后，转至含MS、0.1mg/L的IAA、250mg/L的抗生素Cef、20ppm的Basta、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH6.0的抑菌及筛选培养基上培养一周；培养一周后先打开瓶盖，让抗性苗28℃下，16h光照培养3天后转至经灭菌的土，在28℃，16h光照培养获得除草剂Basta抗性玉米苗；

(6)将除草剂Basta抗性玉米苗移栽到盆土中28℃正常生长7天后，再向叶面喷40ppm的Basta，仍可以存活的即为高抗旱性的转基因玉米植株。

本发明的有益效果

本发明提供了一种可增强植物抗旱作用的基因、该基因编码的蛋白及其用于培养高抗旱性玉米的用途，通过农杆菌介导的方法，将基因导入玉米植株中，获得转基因玉米；相对于未转化的玉米品种，该转基因玉米植株具有较强的抗旱性。

附图说明

图1为PCR方法鉴定转基因玉米植株材料的电泳图。

图2为Southern杂交鉴定转基因玉米植株材料的印迹图。

图3为转基因玉米植株的自交纯合T4代抗旱功能鉴定结果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1转基因抗旱玉米的制备

玉米种子材料为：

(1)参考SEQ ID NO.1的序列，使用软件设计克隆该基因的引物，从玉米的cDNA文库中克隆得到cDNA基因全长；

(2)将目的基因的cDNA序列克隆到商业质粒pGSA1252在3×CaMV35S强启动子下游Nco1/BamH1酶切位点，获得重组质粒pGSA1252::RA33G4；该商业质粒pGSA1252带有一个抗氯霉素的基因和抗除草剂Basta的筛选标记基因Bar；

(3)将导入质粒的根癌农杆菌制备成OD600为0.5、含100μM的乙酰丁香酮的菌液；

(4)用解剖刀的尖端轻微创伤玉米的成熟胚，再用75％酒精消毒，然后将种子转入步骤(2)的菌液中，再加20ml的MS液体培养基和6μl的50mg/ml的乙酰丁香酮，在28℃，100rpm的摇床上培养18-20h；

(5)将玉米成熟种子取出，转移到含MS、30g/L蔗糖、100μM乙酰丁香酮、7g/L琼脂、pH6.0的共培养基上，在28℃黑暗共培养3天；

(6)将玉米成熟种子冲洗干净后，转至含MS、0.1mg/L的IAA、250mg/L的抗生素Cef、20ppm的Basta、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH6.0的抑菌及筛选培养基上培养一周；培养一周后先打开瓶盖，让抗性苗28℃下，16h光照培养3天后转至经灭菌的土，在28℃，16h光照培养获得除草剂Basta抗性玉米苗；

(7)将除草剂Basta抗性玉米苗移栽到盆土中28℃正常生长7天后，再向叶面喷40ppm的Basta，仍可以存活的即为高抗旱性的转基因玉米植株。

实施例2高抗旱性的转基因玉米植株材料的分子鉴定

1、PCR方法鉴定

提取植株材料的基因组DNA，使用PCR扩增Basta基因和35S-RA33G4基因的片段，其中，扩增Basta基因的引物序列为：Bar-F 5’-GCACCATCGTCAACCACTACATCG-3’和Bar-R 5’-AAATCTCGGTGACGGGCAGGAC3’，扩增35S-RA33G4基因的引物序列为：35S–F5’-CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG-3’和RA33G4–R 5’-GCGGTACCGTGACAGATGATGCATGGGG-3’。其中35S-RA33G4基因引物对扩增包括了35S和RA33G4两个基因的部分区段。具体的PCR过程和条件按照常规方法进行，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，图1中M为100bpmarker；1：阳性质粒；2：未转基因植株；3：未反转录RNA；4-11：转基因植株；从图中可以看出，4-11泳道的样品均扩增出了两条带，证实为转基因植株。

2、Southern杂交鉴定

将PCR检测呈阳性的玉米植株DNA用限制性内切酶HindIII消化后，按照《分子克隆实验指南》方法进行转膜、杂交。以pGSA1252::RA33G4为模板，分别用两对引物(Bar-F和Bar–R；35S-RA33G4)PCR扩增制备作探针，探针的标记采用地高辛标记试剂盒及其方法，所得的杂交图为图2，图2中M：1kb marker；1：阴性CK(HindⅢ酶切野生株玉米总DNA)；2：阳性CK(HindⅢ单酶切的表达载体pGSA1252::RA33G4)；3-10：阳性转基因植株(HindⅢ酶切转基因植株玉米总DNA)。从图2中可以看出，3-8和10的转基因系已为纯合系。

实施例3转基因玉米植株的自交纯合T4代抗旱功能鉴定

通过实施例1的试验，得到我国玉米自交系黄早四(HZ4),昌7-2(C7-2),掖478(Y478)和郑58(Z58)每个品种6-10株转基因苗，在实验室经过4代的自交繁育选育，得到T4代玉米种子。将T4代玉米种子在75％酒精中表面消毒20min后在50％的carbendazolwettable powder可湿性粉剂中拌种(防止种传和土传病害)，之后将种子按照上述方法播种于盆土。每盆播3-4粒，放置于温室中培养并按上述已指出的方法管理。温室条件：恒温30±0.5℃，光周期设置为12-h自然光照/12-h黑暗的，空气湿度控制在50-60％。苗子长到三叶期时，采用不浇水的自然土壤干旱，当盆土土表以下10cm范围之内的土中的含水量为0，10cm以下的土中的含水量达到50％(用土壤水分测定仪测定)，连续10-15天观察记录植株的表型并分析有关参数。设置以非转基因植株为平行对照，表型以对照为参考，主要是根据叶子的萎焉程度及植株的死亡率。实验结果见图3，转基因植株在充分供水条件下没有显著差异，在中等干旱胁迫条件下，转基因植株显示出较为明显的抗旱性，而严重胁迫下四个转基因品种间的抗旱性显著优于非转基因植株。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一种可增强植物抗旱作用的蛋白及其编码基因和应用

<130> ZYWS

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 430

<212> DNA

<213> 一种可增强植物抗旱作用的蛋白及其编码基因和应用(Oryza sativa L.)

<400> 1

agcgaaagga gagaaggaat ccgatccatc caagccaagc caaggcagag aagaagaaga 60

agtggaggaa gaagaagcat cggcagcatg tcggagggga ctgccaactg cgtggacatc 120

ctgatcgcca tcatcctgcc tccgctgggg gtgttcctca agtacgggtg cggccacgag 180

ttctggatct gcctcctcct caccttcctc ggctatatac ccggcatcat ctacgccatc 240

tacgccatca ccaagaacaa ctagctagtc atccttgccg acgacgatcc atgtctctgt 300

atctgcgtct gttcatatgc ctgatgccga cttgtgctgt atgtagtgct tgaattcagt 360

cgtgttttgc taccgtaccc accccatgca tcatctgtca ccgcgacgca ataatcatag 420

taataacaag 430

<210> 2

<211> 58

<212> PRT

<213> 一种可增强植物抗旱作用的蛋白及其编码基因和应用(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Ser Glu Gly Thr Ala Asn Cys Val Asp Ile Leu Ile Ala Ile Ile

1 5 10 15

Leu Pro Pro Leu Gly Val Phe Leu Lys Tyr Gly Cys Gly His Glu Phe

20 25 30

Trp Ile Cys Leu Leu Leu Thr Phe Leu Gly Tyr Ile Pro Gly Ile Ile

35 40 45

Tyr Ala Ile Tyr Ala Ile Thr Lys Asn Asn

50 55

Claims (8)

1.一种可增强植物抗旱作用的基因，其特征在于：所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的基因编码的蛋白，其特征在于：蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的基因在提高玉米或其他植物抗旱性中的用途。

4.一种利用转基因技术获得高抗旱性玉米的方法，其特征在于：将权利要求1所述的基因导入玉米中，得到转基因玉米植株。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述基因通过以抗氯霉素和抗除草剂Basta为筛选标记的重组真核表达载体导入玉米中。

6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述真核表达载体为质粒pGSA1252。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：将目的基因的cDNA序列克隆到质粒pGSA1252在3×CaMV35S强启动子下游Nco1/BamH1酶切位点，获得重组质粒pGSA1252::RA33G4。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，重组质粒pGSA1252::RA33G4导入玉米的方法包括以下步骤：

(1)将重组质粒pGSA1252::RA33G4导入根癌农杆菌；

(2)将导入质粒的根癌农杆菌制备成OD600为0.5、含100μM的乙酰丁香酮的菌液；

(3)用解剖刀的尖端轻微创伤玉米的成熟胚，再用75％酒精消毒，然后将种子转入步骤(2)的菌液中，再加20ml的MS液体培养基和6μl的50mg/ml的乙酰丁香酮，在28℃，100rpm的摇床上培养18-20h；

(4)将玉米成熟种子取出，转移到含MS、30g/L蔗糖、100μM乙酰丁香酮、7g/L琼脂、pH6.0的共培养基上，在28℃黑暗共培养3天；

(5)将玉米成熟种子冲洗干净后，转至含MS、0.1mg/L的IAA、250mg/L的抗生素Cef、20ppm的Basta、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH6.0的抑菌及筛选培养基上培养一周；培养一周后先打开瓶盖，让抗性苗28℃下，16h光照培养3天后转至经灭菌的土，在28°C，16h光照培养获得除草剂Basta抗性玉米苗；

(6)将除草剂Basta抗性玉米苗移栽到盆土中28℃正常生长7天后，再向叶面喷40ppm的Basta，仍可以存活的即为高抗旱性的转基因玉米植株。