CN104781417B

CN104781417B - 用于检测癌症干细胞的cd133适配子

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Publication number: CN104781417B
Application number: CN201380048080.1A
Authority: CN
Inventors: 段维
Original assignee: Deakin University
Current assignee: Deakin University
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2017-12-12
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: BR112015002289A2; WO2014019024A1; ES2741949T3; EP2880185A1; ZA201501318B; EP2880185A4; JP6279573B2; CA2880589A1; AU2013299331B2; EP2880185B1; MX2015001433A; IL237034A0; IN2015DN00634A; AU2013299331A1; NZ704719A; US20150299708A1; KR20150085806A; JP2015526075A; SG11201500666TA; US9840712B2

Abstract

本公开涉及RNA适配子及其应用，具体而言，涉及能特异性结合CD133并显示优良肿瘤穿透力的适配子。

Description

用于检测癌症干细胞的CD133适配子

相关申请和通过引用并入

本文所引用或参考的所有文件，以及本文所引文件中引用或参考的所有文件，连同本文或通过引用并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的指导、说明、产品说明书和产品手册，均通过引用整体并入本文中。

技术领域

发明背景

CD133，也称为Prominin-1，是高度糖基化的五次跨膜(pentaspan)膜糖蛋白，其与质膜中的胆固醇结合。尽管已知该蛋白能够确定大量的细胞群体，包括成体干细胞和祖细胞，并且在多种发育的上皮细胞和分化细胞中表达，但其具体功能仍有待阐述。然而，其与Notch-信号通路有关联，该通路对二元细胞命运、肠上皮细胞的分化和淋巴组织生成至关重要(Ulasov et al.2011.Mol Med 17:103-12)。由于认为该分子是许多癌症中的癌症干细胞(CSC)的标志物，最近对其表现出了更多的兴趣。确实，越来越多的证据表明CD133在许多癌症中的CSC上表达，并且在免疫缺陷小鼠中，相对于阴性对照物，CD133⁺细胞存在增加的肿瘤发生可能性(Dittfeld et al.2009.Radiother Oncol 92:353-61)。

近些年，免疫疗法对癌症治疗具有很大的影响。然而，抗体，甚至是人源化抗体的使用，可引起不良的可能致命的副作用(Hansel et al.2010.Nat Rev Drug Discov 9:325-38)。这引起了对“更大和更好的”选择的探索。已进行了数次尝试来使用核酸作为治疗剂，但这些尝试取得了令人失望的结果，这尤其是因为这些核酸不能进入细胞(Shigdar etal.2011.Br J Haematol 155:3-13)。

化学抗体，称为适配子，在过去20年中被越来越多地用于临床应用。确实，一种适配子——哌加他尼(pegaptanib)(抗VEGF适配子)已得到FDA批准，并且几种其他的适配子在进行临床试验。将适配子用于治疗的增加的兴趣是由于几个原因，包括如下事实：它们没有表现出免疫原性、由于是化学合成的而产生的很小的批次间差异，以及相比常规抗体更为稳定。由于其尺寸较小，它们还显示优良的肿瘤穿透力。然而，它们最重要的特征是能够将这些适配子与纳米粒子、药物、显像剂或其他核酸治疗剂结合，而无功能丧失(Meng etal.2012.PLoS One 7:e33434)。该功能化引起新的和更多的靶向治疗，其相比当前的治疗方式具有更少的副作用(Meng et al.2012同上)。当相比主要为被动过程的常规治疗时，靶向递送系统要有效得多。对于成为有效的药物递送剂的适配子，该适配子必须能结合其细胞表面上的靶标，并在短时间内被内化。

发明概述

最近已了解到癌症干细胞是引起肿瘤组织形成和生长的原因，并且其天然耐受化学治疗，这解释了为何传统化疗起初能够减少肿瘤但不能完全根除肿瘤，导致最后的复发。根据癌症干细胞假说，CD133阳性细胞决定长期的肿瘤生长，并因此被怀疑能影响临床结果。最近发现CD133阳性细胞的比例以及它们的成簇拓扑组织均为不良的无进展生存和总体生存的重要预后因素，而与肿瘤阶段、切除程度或患者年龄无关。

当前的用于检测和靶向CD133阳性癌症干细胞的组织病理学技术利用常规的基于抗体的系统，但由于可用的抗CD133抗体的尺寸以及它们相对不能穿透组织而缺少灵敏性。

因此，针对CD133⁺细胞的适配子的产生将有利于根除癌症。本发明人制备了CD133特异性的适配子，其能被快速内化并显示优良的肿瘤穿透力，从而解决了这一问题。

本公开提供了分离的RNA适配子，其能特异性结合CD133。在一个实例中，CD133为人CD133。

在一个实例中，本公开的适配子对表达于HT-29细胞上的CD133具有的解离常数范围为82-145nM。在另一个实例中，本公开的适配子对表达于Hep3B细胞上的CD133具有的解离常数范围为32-52nM。

在一个实例中，分离的RNA适配子包含共有序列5’-CCCUCCUACAUAGGG-3’(SEQ IDNO:1)。

在另一个实例中，分离的RNA适配子包含选自以下的序列：

(i)5’-GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGAGUU ACU AUA GAG CUU CGA CAG GAG GCU CAC AAC-3’(SEQ ID NO:2)；

(ii)5’-GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAACGA GUU ACU AUA G-3’(SEQ ID NO:3)；

(iii)5’-GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGA GU-3’(SEQ ID NO:4)；

(iv)5’-CC ACC CUC CUA CAU AGG GUG G-3’(SEQ ID NO:5)；和

(v)5’-CC CUC CUA CAU AGG G-3’(SEQ ID NO:1)。

在另一个实例中，分离的RNA适配子包含共有序列5’–CAGAACGUAUACUAUUCUG-3’(SEQ ID NO:6)。

在另一个实例中，分离的RNA适配子包含共有序列5’-AGAACGUAUACUAUU-3’(SEQID NO:7).

在另一个实例中，分离的RNA适配子包含序列5’-GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAAGGA AAG CGC UUA UUG UUU GCU AUG UUA GAA CGU AUA CUA UUU CGA CAG GAG GCU CACAAC AGG C-3’(SEQ ID NO:8)。

在具体的实例中，本公开提供了分离的RNA适配子，其经2’-氟-嘧啶修饰，并能够特异性结合CD133。

在另一个实例中，分离的RNA适配子基本上由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6所示的序列组成。

在另一个实例中，分离的RNA适配子由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6所示的序列组成。

在另一个实例中，分离的RNA适配子包含共有序列CCCUCCUACAUAGGG(SEQ ID NO:1)，或共有序列CAGAACGUAUACUAUUCUG(SEQ ID NO:6)，或共有序列AGAACGUAUACUAUU(SEQID NO:7)，其中序列长度为15个碱基至100个碱基。在另一个实例中，长度为15-40个碱基。在另一个实例中，序列长度为19个碱基至100个碱基。在其他实例中，长度为19-40个碱基。

所述序列在共有序列中可包含一个或多个氨基酸取代，其保留了适配子的结合环。在一个实例中，所述序列在共有序列中包含一个或多个取代。在一个实例中，所述序列在共有序列中包含至少1个、2个、3个、4个、5个或6个取代。在另一个实例中，所述序列在SEQID NO:1或SEQ ID NO:6所示的适配子的茎区内包含至少1个、2个、3个、4个、5个或6个取代。在一个实例中，所述茎区为预测的适配子的二维结构的茎区。

在一个实例中，所述适配子包含一个或多个修饰(经修饰的适配子)，其能改善适配子的稳定性(体外或体内)。合适的修饰在本文其他地方有论述。在一个实例中，嘧啶碱基经2’-氟代(2’-F)修饰。在另一个实例中，RNA适配子的3’端经修饰以防止其被核酸酶消化。在另一个实例中，适配子通过将5’端与荧光团或反向的dT结合而被修饰。

本公开还提供了分离的RNA适配子，其与包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或SEQID NO:7所示的序列的适配子具有基本上相同的结合CD133的能力。

在一个实例中，所述适配子能特异性结合CD133⁺细胞。在另一个实例中，所述CD133⁺细胞为干细胞。在另一个实例中，所述干细胞为分离的癌症干细胞。在另一个实例中，所述癌症干细胞特征在于：(i)表达CD133，(ii)为致瘤性的，(iii)能够自我更新，(iv)能够分化，并且(v)耐受常规治疗引起的细胞凋亡。

癌症干细胞可替代性地描述为从诸如生物样品的来源分离的、富集的或纯化的。在另一个实例中，癌症干细胞表示基于CD133⁺表达富集的细胞群。在另一个实例中，所述细胞群包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的癌症干细胞。

在一个实例中，表达CD133的细胞和/或癌症干细胞存在于体内。在另一个实例中，表达CD133的细胞和/或癌症干细胞存在于体外。在其他的实例中，表达C133的细胞和/或癌症干细胞存在于获自个体的生物样品中。

在另一个实例中，本公开的表达CD133的细胞和/或癌症干细胞可表达一种或多种其他的抗原，包括CD44、ABCG2、β-连环蛋白、CD117、ALDH、VLA-2、CD166、CD201、IGFR、EpCAM和EGF1R。

在另一个实例中，根据本公开的癌症干细胞为脑癌干细胞、乳腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、胰腺癌干细胞、结肠癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞、卵巢癌干细胞、皮肤癌干细胞或黑素瘤干细胞。

本公开还提供了包含本文所述的RNA适配子的诊断剂。

在一个实例中，所述诊断剂包含与可检测标记结合的本公开的RNA适配子。

本领域技术人员应理解，本发明的适配子避免可能与非特异性抗体结合有关的并发症，并因此提供优良的信噪比。

在一个实例中，本文所述的诊断剂被用于在体内或体外检测表达CD133的癌症干细胞。

在一个实例中，本公开的RNA适配子在诊断上可用于检测个体或获自患有肿瘤或疑似患有肿瘤的个体的生物样品中的表达CD133的细胞和/或癌症干细胞的存在。可通过将所述适配子与可检测标记结合来促进检测。可检测标记的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、电子致密标记、MRI标记和放射性物质。

本公开还提供了用于生物样品的组织学检查的如本文所述的RNA适配子或如本文所述的诊断剂。制备组织学制品的方法将为本领域技术人员所熟悉。

本公开还提供了包含如本文所述的RNA适配子的抗癌剂。

在一个实例中，所述抗癌剂包含与部分结合的本公开的RNA适配子。

在一个实例中，如本文所述的抗癌剂被用于治疗个体的癌症。在一个实例中，所述个体为将从以本公开的RNA适配子进行治疗获益的个体。在另一个实例中，所述个体为被诊断为患有癌症的个体。在其他的实例中，所述个体为患有选自以下的癌症的个体：脑癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑素瘤或其中存在CD133⁺细胞的任何其他癌症。

可将本公开的适配子与部分结合，并且所述适配子被用于将所述部分引导至肿瘤位点，所述肿瘤位点包含或疑似包含表达CD133的癌症干细胞。部分的实例包括可被用于杀伤癌症干细胞的毒素、放射性核素或化疗剂，或者可被用于定位以及确定包含表达CD133的细胞的肿瘤的大小的显像剂。

包含本公开的RNA适配子的抗癌剂可另外包含一种或多种有效成分。

本公开还提供了从获自个体的生物样品分离、纯化或富集表达CD133的细胞和/或癌症干细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与本公开的RNA适配子或本公开的诊断剂接触。在一个实例中，所述方法在体外进行。

分离、纯化或富集表达CD133的细胞的方法为本领域技术人员已知，并且也在本文其他地方有描述。

本公开还提供了确定个体或获自患有或疑似患有癌症的个体的生物样品中的表达CD133的细胞和/或癌症干细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与本公开的分离的RNA适配子或本公开的诊断剂接触。

本公开还提供了治疗或预防个体中的癌症的方法，包括向个体提供本文所述的RNA适配子或本文所述的抗癌剂。

在一个实例中，所述癌症为其中存在或疑似存在表达CD133的细胞和/或癌症干细胞的任何癌症。在另一个实例中，所述个体为已被诊断为患有癌症的个体。在其他的实例中，所述个体为患有选自以下的癌症的个体：脑癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑素瘤或其中存在CD133⁺细胞的任何其他癌症。

本公开还涉及如本文所述的RNA适配子或抗癌剂在药物中的应用。

本公开还涉及如本文所述的RNA适配子或抗癌剂用于治疗或预防个体中的癌症的用途。

本公开还涉及如本文所述的RNA适配子或抗癌剂在制备用于治疗或预防个体中的癌症的药物中的用途。

本发明还涉及包含与siRNA或核酶结合的如本文所述的RNA适配子的递送剂。

本公开还提供了包含治疗有效量的如本文所述的RNA适配子、抗癌剂或递送剂，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物。

本公开还提供了用于肿瘤的分子成像的如本文所述的RNA适配子或如本文所述的诊断剂。

本发明的RNA适配子的肿瘤穿透能力提供了相比用于肿瘤的分子成像的抗体的独特优势。例如，可将所述RNA适配子与能够促进携带表达CD133的细胞的肿瘤的检测和成像的试剂结合。合适的试剂的实例包括如本文所述的检测标记。

如本文所述的RNA适配子、诊断剂、抗癌剂、递送剂或药物组合物可单独使用，或与其他治疗形式组合使用。例如，RNA适配子、诊断剂、抗癌剂、递送剂或药物组合物可与化疗和/或放疗组合使用。虽然不希望受到理论的束缚，假定化疗剂或放疗剂可通过主要靶向通常为癌症干细胞的后代细胞的快速分裂细胞用于减小肿瘤。所述诊断剂可通过检测肿瘤中的癌症干细胞的存在或缺乏，用于确定任何先前的治疗形式清除癌症干细胞的效果。然后，可将包含本公开的RNA适配子的抗癌剂、递送剂或药物组合物给予肿瘤位点，以特异性减少癌症干细胞。因此，包含RNA适配子的抗癌剂、递送剂或药物组合物可与化疗或放疗一起使用，或者在化疗或放疗后使用。还涉及可将本公开的RNA适配子与靶向癌症干细胞上存在的抗原的一种或多种其他的适配子组合。

应理解，本公开的每个实例加上必要的变更适用于治疗、预防或改善个体中的癌症的方法。

应理解，本公开的每个实例加上必要的变更适用于肿瘤的分子成像。

附图说明

图1.RNA适配子的序列；15mer CD133 RNA适配子，指定为CD133-1-2-2(SEQ IDNO:1)；以及19mer CD133 RNA适配子，指定为CD133-2-1(SEQ ID NO:6)。

碱基修饰：2'-F-嘧啶RNA，胞苷(C)和尿苷(U)为2’-F修饰的(参见图中有下划线的)。IDT-3’用于保护其不被核酸酶消化。RNA HPLC级纯化，合成后：2'-去保护/脱盐。

图2.使用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)分离CD133适配子。

(A)来自重复循环的SELEX的FITC标记的适配子与CD133转染的HEK293T细胞的结合的流式细胞术分析。将来自每轮的荧光素标记的RNA与靶标细胞在37℃下孵育30分钟，然后进行流式细胞术分析。(B)在减去未经挑选的文库RNA与靶细胞的结合的平均荧光强度以及与阴性对照细胞结合的平均荧光强度后，计算每轮的结合。R，SELEX循环的轮；R，未经挑选的随机文库。

图3.截短的CD133适配子克隆的相互作用的平衡解离常数(K_D)的测定。

5×10⁵个细胞/mL的细胞密度、不同浓度的CD133适配子(1-200nM)下的代表性结合曲线。(A)HT-29细胞；(B)Hep3B细胞；(C)T98G细胞；(D)HEK293T细胞。

图4 CD133适配子的截短。

(A)CD133-1被连续总共截短4次，(i):CD133-1；(ii):CD133-1-1，(iii):CD133-1-2，(iv):CD133-1-2-1，(v):CD133-1-2-2；(B)(i)CD133-2被截短一次，(ii)CD133-2-1。

图5.CD133适配子在与CD133阳性细胞而非CD133阴性细胞结合后被内吞。

37℃下将DY647标记的CD133适配子与所示的癌细胞孵育30min，然后使用激光扫描共聚焦显微镜成像。对于每对图，光学(相位)图像在上方，荧光图像在下方。HT-29和Hep3B分别为表达CD133的人结肠癌细胞和肝癌细胞。T98G为不表达CD133的人胶质瘤细胞。HEK293T为不表达CD133的人非肿瘤细胞系。标度线–20μm。

图6.CD133适配子在与CD133阳性细胞而非CD133阴性细胞结合后被内吞。

在阻止内吞的处理(去钾)后，适配子不再进入细胞，相反，它们停留在细胞表面(形成环形结构而非颗粒模式)。转铁蛋白被用作阳性对照以显示阻止转铁蛋白内吞的处理的效力。HT-29：结肠癌细胞系，Hep3B：人肝癌细胞系。37℃下将DY647标记的CD133适配子与所示的癌细胞孵育30min，然后使用激光扫描共聚焦显微镜进行成像。对于每对图，光学(相位)图像在上方，而荧光图像在下方。标度线–20μm。

图7 CD133 RNA适配子相比CD133抗体(AC133)更好地穿透肿瘤块。

在补充有成纤维细胞生长因子(10ng/ml)和表皮生长因子(10ng/ml)、胰岛素(50μg/ml)和B27(100单位/ml)的无血清的DMEM/F12培养基中培养CD133⁺人结肠癌细胞(HT-29)和CD133^-人肾上皮细胞(HEK293T)，以允许形成肿瘤球体。当球体达到300μm的大小时，分别以100nM Dy647标记的CD133RNA适配子或对照适配子以及等浓度的PE-CD133抗体(AC133)孵育球体4hr。在使用PBS洗涤3次后，使用共聚焦荧光显微镜对球体成像。显示了两个核心(中间)部分。

序列表要点

SEQ ID NO:1:是CD133-2-2适配子的序列(15mer)

SEQ ID NO:2:是CD133-1适配子的序列(81mer)

SEQ ID NO:3:是CD133-1-1适配子的序列(58mer)

SEQ ID NO:4:是CD133-1-2适配子的序列(35mer)

SEQ ID NO:5:是CD133-1-2-1适配子的序列(21mer)

SEQ ID NO:6:是CD133-2-1适配子的序列(19mer)

SEQ ID NO:7:是CD133适配子的共有序列(15mer)

SEQ ID NO:8:是CD133-2适配子的序列(85mer)

发明详述

通用技术和所选定义

术语“和/或”，例如“X和/或Y”，应理解为是指“X和Y”或者“X或Y”，并且应当理解为提供了对两种含义或其中的一种含义的明确支持。

本公开中包括的任何文献、行为、材料、装置、物品等的论述不应理解为承认这些事物中的任一种或所有这些事物形成了现有技术的一部分，或者由于其出现于本申请的每项权利要求的优先权日期之前而为与本公开相关的领域中的公共常识。

在整个本说明书中，除非明确地另有所述，或者上下文另有要求，提及单个步骤、组合物、步骤组合或者组合物组合应当理解为包括这些步骤、组合物、步骤组合或者组合物组合中的一项和多项(即，一项或多项)。

除非明确另有所述，本文中描述的每个实例加以必要的修改适用于本公开的其他实例中的每一个。

本领域技术人员理解本公开易于进行除明确描述的那些外的改变和修改。应理解，本公开包括所有这样的改变和修改。本公开还包括本说明书中单独或共同提及或指出的步骤、特征、组合物和化合物的全部，以及所述步骤或特征的任何和全部组合或者任何两项或更多项。

本公开的范围并不限于本文中描述的具体实例，这些具体实例仅旨在示例的目的。功能等同的产品、组合物和方法显然位于本公开的范围中。

不需要过多的实验，除非另有所示，使用分子生物学、重组DNA技术、细胞生物学和免疫学的常规技术即可实施本公开内容。此类方案描述于，例如，Sambrook,Fritsch &Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratories,New York,第二版(1989)，第I、II和III卷全卷；DNA Cloning:A PracticalApproach,第I和II卷(D.N.Glover,ed.,1985),IRL Press,Oxford,整篇文档；Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(M.J.Gait,ed,1984)IRL Press,Oxford,整篇文档，且尤其是其中的Gait的文章,ppl-22；Atkinson et al,pp35-81；Sproatet al,pp 83-115；以及Wu et al,pp 135-151；4.Nucleic Acid Hybridization:APractical Approach(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.,1985)IRL Press,Oxford,整篇文档；Immobilized Cells and enzymes:A Practical Approach(1986)IRL Press,Oxford,整篇文档；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Methods InEnzymology(S.Colowick and N.Kaplan,eds.,Academic Press,Inc.),整篇文档,Sakakibara,D.,Teichman,J.,Lien,E.L and Fenichel,R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342；Merrifield,R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154；Barany,G.and Merrifield,R.B.(1979)in The Peptides(Gross,E.andMeienhofer,J.eds.),vol.2,pp.1-284,Academic Press,New York.12.Wünsch,E.,ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie(Müler,E.,ed.),vol.15,第4版.,第1和2部分,Thieme,Stuttgart；Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.&Bodanszky,A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25,449-474；Handbook ofExperimental Immunology,Vols.I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986,Blackwell Scientific Publications)；以及Animal Cell Culture:PracticalApproach,第3版(John R.W.Masters,ed.,2000),ISBN 0199637970,整篇文档。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”或者变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为意指包括所述的步骤或元件或整数，或者步骤或元件或整数的组合，但不排除任何其他的步骤或元件或整数，或者元件或整数的组合。

术语“由…组成(consists of/consisting of)”应理解为意指方法、过程或组合物具有所述的步骤和/或组分，并且没有其他的步骤或组分。

如本文所用，术语“约”在涉及可测量的值如重量、时间、剂量等的量时，是指包括与所示量的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，并且甚至更优选±0.1％的差异，因为这样的差异适合实施所公开的方法。

如本文所用的术语“适配子”一般是指单个定义的序列的寡核苷酸，或者所述寡核苷酸的混合物，其中所述混合物保留了对CD133的结合特异性。如本文所用，“适配子”是指单链核酸。在结构上，本公开的适配子为特异性结合性寡核苷酸。

如本文所用的术语“寡核苷酸”通用于多脱氧核糖核苷酸(含有2’-脱氧-D-核糖或其经修饰的形式)，即DNA；多核糖核苷酸(含有D核糖或其经修饰的形式)，即RNA；以及任何其他类型的多核苷酸，其为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷，或者经修饰的嘌呤或嘧啶碱基或无碱基核苷酸。根据本公开的内容，术语“寡核苷酸”不仅包括具有常规碱基、糖残基和核苷酸间连接的那些，还包括包含这3个部分中的任何一个或所有这3个部分的修饰的那些。

如本文所用的术语“RNA适配子”是包含核糖核苷单元的适配子。RNA适配子还意在包括如本文所定义的RNA类似物。

如本文所用，术语“结合亲和力”和“结合活性”意在指配体分子/适配子结合或不结合靶标的倾向，并且描述了配体分子/适配子结合靶标的结合强度或亲和力的度量。所述相互作用的能量学在“结合活性”和“结合亲和力”上是有意义的，因为其确定了相互作用伴侣的必要浓度、这些伴侣能够结合的速率，以及溶液中结合和游离分子的相对浓度。所述能量学在本文中是通过测定解离常数K_d(以及其他方式)来表征的。如本领域所已知的，低的解离常数指示分子彼此间的较强的结合和亲和力。在一个实例中，解离常数为至少10^-6M。在另一个实例中，解离常数为至少10^-8和10^-9M。

如本文中所用，术语“生物样品”是指来自个体的细胞或细胞群或一定量的组织或流体。最经常情况下，所述样品已被从个体移除，但术语“生物样品”也可指体内分析的细胞或组织，即未从个体移除的细胞或组织。通常，“生物样品”包含来自个体的细胞，但该术语也可指可用于测量基因表达水平的非细胞的生物物质，如血液、唾液或尿液的非细胞部分。生物样品包括但不限于组织活检、穿刺活检、刮擦物(例如，口腔刮擦物)、全血、血浆、血清、淋巴、骨髓、尿液、唾液、痰、细胞培养物、胸膜液、心包液、腹水或脑脊液。生物样品还包括组织活检和细胞培养物。生物样品或组织样品可指分离自个体的组织或流体样品，包括但不限于，例如，血液、血浆、血清、肿瘤活检、尿液、粪便、痰、脊髓液、胸膜液、乳头吸液、淋巴液、皮肤的外部部分、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、奶、细胞(包括但不限于血细胞)、肿瘤、器官，以及体外细胞培养物组分样品。在一些实施方案中，样品来自原发性或转移性肿瘤的切除术、支气管镜活检或芯针活检，或者来自胸膜液的单元块。另外，可使用细针吸入样品。样品可为石蜡包埋的或冷冻的样品。可通过从个体去除细胞样品获得样品，但也可通过使用先前分离的细胞(例如，另一个人分离的)完成，或者通过体内实施本发明的方法。

如本文所用的术语“与…结合”意在包括RNA适配子借以与本文描述的检测剂、部分、siRNA或核酶连接、贴附或接合的任何结构。产生结合的方法为本领域技术人员已知，并且包括但不限于通过肽接头或通过将RNA和试剂(例如，siRNA或核酶)直接化学合成为一整条链的缀合、连接。

如本文所用的术语“分离的”意在指可从其他组分分离的或从其他组分纯化的RNA适配子或干细胞(例如，癌症干细胞)。分离的细胞是指来自其可能天然存在的环境中的细胞。分离的细胞可被纯化至相对于其可天然获取的状态的任何程度。

如本文所用的术语“配体”是指具有结合靶标能力的分子或其他化学实体。配体可包括肽、寡聚物、核酸(例如，适配子)、小分子(例如，化合物)、抗体或其片段、核酸-蛋白融合物和/或任何其他的亲和试剂。因此，配体可来自任何来源，包括文库，特别是组合文库，如下文公开的适配子文库、噬菌体展示文库或在本领域技术人员研究本公开内容后显而易见的任何其他的文库。

如本文所用的术语“修饰的RNA适配子”意指多聚分子，其除了包含核糖核苷作为其单元外，还包含以下中的至少一种：2’-脱氧、2’-卤代(包括2’-氟代)、2’-氨基(优选为未取代的或单取代的或双取代的)、2’-单卤代甲基、二卤代甲基或三卤代甲基、2′-O-烷基、2′-O-卤代-取代的烷基、2′-烷基、叠氮基、硫代磷酸、巯基、甲基膦酸酯、荧光素、若丹明、芘、生物素、黄嘌呤、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-羟基-6-巯嘌呤和在第6位被硫取代或者在第5位被卤素或C_1-5烷基取代的嘧啶碱基、非碱基接头、3′-脱氧-腺苷以及其他可用的“链终止子”或“不可延展的”类似物(在RNA的3′端)，或标记物如³²P、³³P等。可使用本文公开的标准合成技术将所有上述基团掺入至RNA中。

如本文所用，术语“治疗有效量”应理解为指足够量的用于减少或抑制表达CD133的癌症干细胞的数目和/或癌症的一种或多种症状的根据本公开的RNA适配子、抗癌剂、递送剂或药物组合物。本领域技术人员理解这样的量将根据例如具体个体和/或疾病的类型或严重性或水平而改变。该术语不应理解为将本公开限定于特定量的RNA适配子。

如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”应理解为指给予治疗有效量的如本文所公开的RNA适配子、抗癌剂、递送剂或药物组合物，并减轻或抑制与癌症相关的或由癌症引起的临床病况的至少一种症状。

如本文所用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”应理解为指给予治疗有效量的根据本公开的RNA适配子、抗癌剂、递送剂或药物组合物，并阻止或妨碍或延迟癌症的至少一种症状的发展或进展。

如本文所用，术语“特异性结合”应理解为指相比其与替选细胞或物质的反应或结合，RNA适配子与特定细胞或物质反应或结合得更为频繁、更为快速、持续时间更长和/或亲和力更大。例如，相比其结合不相关的蛋白和/或表位或它们的免疫原性片段，特异性结合靶标蛋白的RNA适配以更大的亲和力、亲合力、更快速地和/或以更长的持续时间结合该蛋白或表位或它们的免疫原性片段。通过阅读本定义，还应理解，例如，特异性结合第一靶标的RNA适配子可以或不可以特异性结合第二靶标。由此，“特异性结合”未必需要排斥结合或不可检测地结合另一分子，这包括在术语“选择性结合”中。通常，但非必然地，提及结合是指特异性结合。根据相比适配子和环境中的其他物质或总体上的非相关分子的解离常数，适配子对靶标的比较解离常数(Kd)来定义结合的特异性。通常适配子对于靶标的Kd为靶标和不相关物质或环境中的伴随物质的Kd的1/2、1/5或1/10。甚至更优选地，Kd为1/50、1/100或1/200。

如本文所用的术语“CD133⁺”或“表达CD133的细胞”可互换使用。该术语包括可通过任何合适的方式检测的CD133抗原的细胞表面表达。在一个实例中，提及细胞对于给定标志物为阳性是指其可为该标志物的低(lo或暗)或高(亮，bri)表达者，这取决于该标志物在细胞表面上存在的程度，其中所述术语涉及荧光强度。

如本文所用，术语“个体”应理解为指任何个体，包括人或非人个体。非人个体可包括非人的灵长类、有蹄类(牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和美洲野牛)、犬、猫科动物、兔类(家兔、野兔和鼠兔)、啮齿类(小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠)、鸟和鱼。在一个实例中，个体为人。

适配子

适配子的几种独特的特性使得它们成为用于大量的分子生物学应用和用作潜在的药剂的有吸引力的工具。首先，大多数适配子以高亲和力结合靶标，显示皮摩尔至纳摩尔范围内的典型的解离常数。适配子的结合位点包括靶标分子的裂缝和凹槽，引起与许多当前可用的药剂非常类似的拮抗活性。第二，适配子的结构在较广的温度和储存条件范围内是稳定的，保留了形成其独特的三级结构的能力。第三，适配子可被化学合成，这与制备单克隆抗体所需的昂贵的和劳动密集的生物系统形成对比。

不希望受到理论的束缚，由于RNA适配子对其靶标蛋白的理论上较高的亲和力以及修饰的RNA比未修饰的RNA更大的血浆稳定性，RNA适配子通常是许多研究小组优选的。

本文公开了能特异性结合CD133抗原的RNA适配子分子，其可用于在细胞内有效递送siRNA或核酶、化疗药物、放射性同位素、毒素和/或其他携带有抗原的试剂。

适配子为单链的寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其结合特定的靶标分子如蛋白或小分子。因此，适配子是抗体的寡核苷酸类似物。通常，适配子包含约15至约100个核苷酸，优选约15至约40个核苷酸，并且更优选约20至约40个核苷酸，其中长度落入这些范围中的寡核苷酸可通过常规技术进行制备。任选地，适配子还可包含最少约6个核苷酸，优选10个，且更优选14或15个核苷酸，它们为产生特异性结合所必需。如果可以在放置靶标的环境中获得适当的相互作用，包含短于10个，例如，6-mer的序列的结合区的适配子是可行的。因此，如果其他物质的干扰很小，可以要求较小的特异性和较小的结合强度。

适配子结合高度依赖于适配子寡核苷酸形成的二级结构。RNA和单链DNA(或类似物)适配子是已知的。参见，例如Burke et al(1996).J.Mol.Biol.264:650-666；Ellingtonand Szostak(1990).Nature 346:818-22；Hirao et al(1998).Mol Divers.4:75-89；Jaeger et al(1998).EMBO Journal17:4535；Kensch et al(2000).J.Biol.Chem 275:18271-8；Schneider et al(1995).Biochemistry 34:9599-9610；以及US 5773598；US6028186；US6110900；US6127119；和US 6171795。

适配子对给定靶标的选择

可通过使用称为SELEX^TM(指数富集的配基系统进化技术)的迭代方法挑选结合几乎任何特定靶标的适配子。该方法描述于，例如US 5270163和US 5475096中。SELEX^TM方法是基于以下独特的观察：核酸具有足够的形成多种二维和三维结构的能力，以及在其单体中适用的充当几乎任何化合物(不管是单体还是聚合物)的配体(即，形成特异性结合对)的足够的化学多功能性。任何大小或组成的分子均可用作靶标。

SELEX^TM方法在开始时依赖于包含随机化序列的单链寡核苷酸的大文库或库。所述寡核苷酸可为修饰的或未修饰的DNA、RNA或DNA/RNA杂合子。在一些实例中，所述库包含100％随机或部分随机的寡核苷酸。在其他实例中，所述库包含随机的或部分随机的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含掺入在随机化序列中的至少一段固定的序列和/或保守序列。在其他实例中，所述库包含随机的或部分随机的寡核苷酸，所述寡核苷酸在其5′端和/或3′端包含至少一段固定的序列和/或保守序列，所述序列可包含所述寡核苷酸库的所有分子所共有的序列。固定的序列为库中寡核苷酸所共有的序列，其掺入是为了预选目的，如CpG基序、PCR引物的杂交位点、RNA聚合酶的启动子序列(例如，T3、T4、T7和SP6)、限制位点或均聚序列，如多聚A或多聚T束、催化核心、用于选择性结合至亲和柱的位点，以及其他的有助于目标寡核苷酸的克隆和/或测序的序列。保守序列为先前描述的固定的序列以外的能结合相同靶标的多种适配子所共有的序列。

所述库的寡核苷酸优选包括随机化的序列部分以及有效扩增所必需的固定的序列。通常，起始库的寡核苷酸包含固定的5’端和3’端序列，其位于30-50个随机核苷酸的内部区域的侧翼。可以多种方式制备所述随机化的核苷酸，包括化学合成和从随机切割的细胞核酸进行尺寸选择。也可在选择/扩增迭代之前或期间通过诱变引入或增加测试核酸中的序列变异。

寡核苷酸的随机序列部分可为任何长度，并且可包含核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，并且可包含修饰的或非天然的核苷酸或核苷酸类似物(参见，例如US 5958691、US5660985和WO 92/07065)。可使用本领域熟知的固相寡核苷酸合成技术从磷酸二酯连接的核苷酸合成随机寡核苷酸。参见，例如Froehler et al.,(1986).Nucl.Acid Res.14:5399-5467和Froehler et al(1986)Tet.Lett.27:5575-5578。也可使用溶液相方法如三酯合成方法合成随机寡核苷酸。参见，例如Sood et al(1977).Nucl.Acid Res.4:2557和Hiroseet al(1978).Tet.Lett.,28:2449。在自动化DNA合成仪上进行的典型合成产生10¹⁴-10¹⁶个个体分子，这一数字对于大多数SELEX^TM实验已足够。

可通过在DNA合成仪上自动化化学合成来生成寡核苷酸的起始文库。可通过在每个另外的步骤中以不同的摩尔比添加4个核苷酸来生成部分随机序列。

寡核苷酸的起始文库可为RNA或DNA。在将RNA文库用作起始文库的情况下，通常通过在体外使用T7 RNA聚合酶或修饰T7 RNA聚合酶转录DNA文库来生成RNA文库，并进行纯化。然后，在有助于结合的条件下将RNA或DNA文库与靶标混合，并使用相同的通用选择方案对其进行逐步的结合、分离和扩增重复，以达到几乎任何所需的结合亲和力和选择性标准。更具体而言，以包含核酸的起始库的混合物起始，SELEX^TM方法包括如下步骤：(a)在有利于结合的条件下将混合物与靶标接触；(b)将未结合的核酸从与靶标分子特异性结合的那些核酸中分离开来；(c)解离核酸-靶标复合物；(d)扩增从核酸-靶标复合物解离的核酸以产生富集了配体的核酸混合物；以及(e)根据需要尽可能多地重复结合、分离、解离和扩增步骤的循环，以产生针对靶标分子的高特异性、高亲和力的核酸配体。在选择了RNA适配子的那些情况下，SELEX^TM法还包括如下步骤：(i)逆转录从核酸-靶标复合物解离的核酸，然后进行步骤(d)中的扩增；以及(ii)转录来自步骤(d)的所扩增的核酸，然后重新开始所述过程。

重复选择和扩增循环直到达到预期目标。通常，重复至直到在重复循环上得不到结合力的显著改善。通常，以5-20个循环程序选择核酸适配子分子。

已知存在多种核酸一级、二级和三级结构。显示最常参与非沃森-克里克类型的相互作用的结构或基序被称为发夹环、对称和非对称凸起、假节及其众多的组合。几乎所有已知的这类基序的案例表明它们可在不多于30个核苷酸的核酸序列中形成。出于这一原因，通常优选的是，使用连续的随机化片段的SELEX^TM程序以包含约20至约50个核苷酸的随机化片段的核酸序列起始。

对核心的SELEX^TM方法进行了修改，以实现许多特定目标。例如，US 5707796描述了使用SELEX^TM结合凝胶电泳来选择具有特定结构特征的核酸分子，如弯曲的DNA。US 5763177描述了基于SELEX^TM的方法，其被用于挑选包含能够与靶标分子结合和/或光交联和/或光失活靶标分子的光反应性基团的核酸配体。US 5567588和US 5861254描述了基于SELEX^TM的方法，其实现了对靶标分子具有高和低亲和力的寡核苷酸之间的高效分离。US 5496938描述了在实施SELEX^TM过程后获得改良的核酸配体的方法。US 5705337描述了将配体与其靶标共价连接的方法。

反向SELEX^TM是通过消除与一种或多种非靶标分子交叉反应的核酸配体序列来改善核酸配体对靶标分子的特异性的方法。反向SELEX^TM包括以下步骤：(a)制备候选的核酸混合物；(b)将候选混合物与靶标接触，其中可从剩余的候选混合物中分离相对于候选混合物对靶标具有增加的亲和力的核酸；(c)从剩余的候选混合物中分离亲和力增加的核酸；(d)从靶标中解离亲和力增加的核酸；(e)将所述亲和力增加的核酸与一种或多种非靶标分子接触，以便将对非靶标分子具有特定亲和力的核酸配体去除；以及(f)扩增仅对靶标分子具有特定亲和力的核酸，以产生用于结合靶标分子的针对具有相对较高亲和力和特异性的核酸序列富集的核酸混合物。如上文针对SELEX^TM所描述的，如有必要重复选择和扩增循环直至达到预期目标。

在典型的实例中，使用诸如Beaucage et al.(1981)Tetrahedr.Letters22:1859-1862和Sinha et al.,(1984)Nucleosides and Nucleotides 3:157-171所描述的那些的常规技术在固相支持柱上合成RNA适配子。从产生的RNA适配子去除最终的DMT基团。可选地，如果使用大规模合成，可通过扩大固相载体法规模来制备RNA适配子，或者可通过使用溶液相技术(特别是在所需要的终产物为相对较短的寡核苷酸时)制备RNA适配子。用于合成方法的起始物质可为具有所需要的一级结构的5′-非三苯甲基化的RNA寡核糖-核苷酸或类似物，其优选可具有经保护的碱基，并且其优选结合固相载体。可使用任何常规使用的保护基团。通常，N₆-苯甲酰基被用于腺嘌呤、N₄-苯甲酰基被用于胞嘧啶、N₂-异丁酰基被用于鸟嘌呤和N₂-苯甲酰基被用于2-氨基嘌呤。其他有用的保护基团包括苯氧乙酰基(PAC)和t-丁氧乙酰基(TAC)。便利地，应当将更多的碱基不稳定性保护基团用于合成RNA适配子；本领域技术人员知道这些基团。这样的基团可帮助防止生成的三磷酸或二磷酸水解，它们通常在碱性条件下非常稳定，但能够接受一些水解作用。其他预期的修饰在美国专利第6,011,020号中有公布，并且包括但不限于通过共价连接掺入生物利用度增强分子如PEG或胆固醇。

另外，在RNA合成期间可掺入核苷类似物如2′-脱氧、2′-卤代、2′-氨基(未取代的或单取代的或双取代的)、2′-单卤代甲基、二卤代甲基或三卤代甲基、2′-O-烷基、2′-O-卤素取代的烷基、2′-烷基、叠氮基、硫代磷酸酯、巯基、甲基膦酸酯、荧光素、若丹明、芘、生物素、黄嘌呤、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-羟基-6-巯嘌呤和在第6位被硫取代或者在第5位被卤素或C_1-5烷基取代的嘧啶碱基、非碱基接头、3′-脱氧-腺苷以及其他可用的“链终止子”或“不可延展的”类似物(在RNA的3′端)等。此外，不同的标记物如³²P或³³P等同样可在合成期间掺入，产生新的通过该方法制备的RNA类似物。其他预期的修饰公布于美国专利第6,011,020号中，并且包括但不限于掺入3′帽，如反向DT帽，或反向的非碱基帽或它们的组合。

适配子的结合亲和力

结合亲和力描述了分子彼此的结合强度或亲和力的度量。本文中的适配子对于靶标和其他分子的结合亲和力根据K_d进行定义。可通过本领域已知的方法测定解离常数，并且对于复杂混合物，可通过诸如Caceci,M.,et al.,Byte(1984)9:340-362中描述的那些的方法计算解离常数。测量解离常数的实例描述于例如US 7602495(其描述了表面等离子体共振分析)、US 6562627、US 6562627和US 2012/00445849中。在另一个实例中，使用诸如Wong and Lohman,(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5428-5432公开的双过滤硝酸纤维素过滤器结合实验确定K_d。

然而，观察到对于一些小寡核苷酸，难以直接测定K_d，并且可能造成高误导性的结果。在这些情况下，用已知能结合靶标或候选物的物质进行针对靶标分子或其他候选物质的竞争性结合检测。在理想情况下，发生50％抑制时的浓度值(K_i)等于K_d。然而，在任何情况K_i都不会小于K_d。因此，替代性地，K_i的测定为K_d的值设定了最大值。在技术困难阻碍K_d的精确测量的那些情况下，可方便地替换K_i测量来提供K_d的上限。K_i值也可用于确认本公开的适配子是否结合靶标。

改善适配子稳定性

在使用核酸作为治疗剂中遇到的一个潜在的问题在于在显示所需的效果前，以其磷酸二酯形式存在的寡核苷酸在体液中可被诸如内切酶和外切酶的细胞内酶和细胞外酶快速降解。本公开还包括如本文所述的RNA类似物和/或经设计用于改善RNA适配子的一种或多种特性(如保护免被核酶降解)的另外的修饰。

本公开中预期的寡核苷酸修饰包括但不限于，提供了掺入另外的电荷、极性、疏水性、氢键、静电相互作用和流变性至核酸配体碱基或核酸配体整体的那些其他的化学基团。

用于产生耐受核酶的寡核苷酸的修饰还可包括一个或多个取代的核苷酸间连接、改变的糖类、改变的碱基或以上的组合。此类修饰包括2′位置的糖修饰、5位置的嘧啶修饰、8位置的嘌呤修饰、环外胺的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修饰、甲基化和不常见的碱基配对组合如异碱基异胞苷和异尿苷；3′和5′修饰如加帽；缀合至高分子量非免疫原性化合物；缀合至亲脂性化合物；以及磷酸酯骨架修饰。

在一个实例中，与本公开的适配子缀合的非免疫原性的高分子量化合物为聚烷二醇，优选聚乙二醇。在一个实例中，骨架修饰包括掺入一个或多个硫代磷酸酯至磷酸酯骨架中。在另一个实例中，本公开的适配子包含掺入少于10个、少于6个或少于3个硫代磷酸酯至磷酸酯骨架中。

适配子的利用

本公开的RNA适配子分子可用作分离和纯化靶标分子(例如，携带CD133的癌症干细胞)的亲和配体；追踪、监测、检测和定量靶标分子(例如，携带CD133的癌症干细胞)，或者封闭、允许、激活或催化在生理上与实现治疗效果有关的反应的探针。它们可用作药剂，结合特定靶标以及将特定分子导向期望位点。

本公开的RNA适配子分子可用于体外处理，例如用于纯化靶标分子(例如，携带CD133的癌症干细胞)的亲和纯化混合物。适配子对于从污染物层析分离靶标分子(例如，携带CD133的癌症干细胞)和从细胞培养物或细胞提取物纯化靶标分子是理想的。

在一个实例中，本公开的RNA适配子分子可用作将靶标(例如，携带CD133的癌症干细胞)结合或固定至固相载体的捕获试剂。固相载体可由具有通常与过滤器、晶圆、晶圆芯片、膜和薄膜有关的结构和组成的基底组成。然而，预期固相载体可由这样的基底组成，其包括但不限于树脂、亲和树脂、磁珠或聚合物珠子或任何用于捕获或固定用于诊断、检测或定量研究的试剂的诊断性检测剂。

固相载体可基于所需的用途包含任何材料，包括但不限于：玻璃、金属表面，以及诸如钢材、陶瓷材料或聚合物材料如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺和聚偏二氟乙烯等的材料，或以上的组合。

CD133抗原

CD133最初称为AC133，是一种糖蛋白(也称为Prominin 1)。其为特异性定位至细胞突起的5次跨膜跨膜糖蛋白的一个成员。CD133表达于造血干细胞、内皮祖细胞、恶性胶质瘤、神经元和神经胶质干细胞、龋源性儿科脑瘤，以及成人肾脏、乳腺、气管、唾液腺、胎盘、消化道、睾丸和其他细胞类型中。

表达CD133的癌症干细胞的分离和纯化

通过干细胞分化更新成体细胞的最熟知的实例是造血系统。发育上未成熟的前体细胞如造血干细胞和祖细胞响应分子信号，以逐渐形成不同的血液和淋巴细胞类型。干细胞也存在于其他组织中，包括上皮组织和间质组织。癌症干细胞可起源于这些细胞类型中的任何一种，例如，由于正常干细胞中的遗传损伤或通过干细胞和/或分化细胞的异常调节的增殖而产生。

癌症干细胞可来源于包含致瘤干细胞的任何癌症，所述致瘤干细胞即具有广泛或无限增殖能力的细胞，并且产生了大多数的癌细胞。在确立的肿瘤中，大多数细胞已丢失了广泛增殖和形成新的肿瘤的能力，并且小部分的癌症干细胞增殖从而再生癌症干细胞，以及产生缺少致瘤潜力的肿瘤细胞。癌症干细胞可不对称地和对称地分裂，并且可显示变化的增殖速率。癌症干细胞可包括已重新获得了干细胞性能的瞬时性增殖性细胞或祖细胞。

可从中分离干细胞的代表性癌症包括特征为实体瘤的癌症，包括例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm’s tumor)、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

可根据本公开从中分离或富集干细胞的其他代表性癌症包括造血性恶性肿瘤，如B细胞淋巴瘤和白血病，包括低级/滤泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡NHL、中级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级小非切割的细胞NHL、巨大肿块性疾病(bulky disease)NHL和华氏巨球蛋白血症、慢性白细胞性白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、淋巴细胞性白血病、单核细胞性白血病、髓系白血病和前髓系白血病。

可使用本文所述的适配子分子选择携带CD133的癌症干细胞。例如，与荧光染料结合的适配子可用于主动选择癌症干细胞。还已知CD133在一些正常细胞中表达。然而，认为在癌症干细胞中，CD133表达上调。癌症干细胞标志物通常以相同来源的分化细胞或非致瘤细胞的至少约5倍，例如，为至少约10倍，或为至少约15倍，或为至少约20倍，或为至少约50倍，或为至少约100倍的水平表达。选择方法还可包括可用于清除非癌症干细胞群中的那些癌细胞的阴性选择标志物。

应理解在实施本公开中，可通过多种不同的方法分离携带CD133的细胞。例如，可将本公开的RNA适配子附着于固相载体以允许粗分离。可根据分离效率、相关的细胞毒性、实施的容易程度和速率以及所需的高级设备和/或专业技能，采用具有不同效率的不同技术。用于分离或纯化的方法可包括但不限于，使用包被适配子的磁珠的磁力分离、亲和层析和以与固体基质结合的适配子“淘选”。提供了精确分离或纯化的技术包括但不限于FACS。制备FACS的方法对本领域技术人员是显而易见的。

表达CD133的癌症干细胞的富集

在一个实例中，从获自个体的生物样品富集了本公开的RNA适配子分子。通常，所述个体为患有肿瘤或疑似患有包含癌症干细胞的肿瘤的个体。本文中所用的术语“富集的”或“富集”或其变型描述这样的细胞群，其中当相比未处理的细胞群(例如，样品中的细胞)时，一种特定细胞类型(即，癌症干细胞)的比例增加。

在一个实例中，针对癌症干细胞富集的群体包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的携带CD133的癌症干细胞。就此而言，术语“包含癌症干细胞的富集的细胞群”应理解为为术语“包含X％的癌症干细胞的细胞群”提供了明确的支持，其中X％为本文所述的百分比。

在一个实例中，从可选择形式的包含CD133+细胞的细胞制剂富集细胞群。就此而言，术语“可选择形式”应理解为是指细胞表达允许挑选携带CD133的细胞的标志物(例如，细胞表面标志物)。

使用适配子分子对癌症的诊断

本公开的RNA适配子分子可用于体外诊断目的，以确定恶性组织中的癌症干细胞的存在。所述方法包括检测生物样品中CD133⁺癌症干细胞的存在。例如，可将生物样品与本公开的标记的RNA适配子接触，并测定RNA适配子特异性结合样品中的细胞的能力。结合指示携带CD133的癌症干细胞的存在。本公开的RNA适配子也可用于通过向个体给予本公开的分离的RNA适配子(其标记有能产生可检测信号的报告基团)来体内定位肿瘤。然后，可使用流式细胞术、显微镜、外部闪烁扫描术、发射断层扫描、光学成像或放射核扫描(radionuclear scanning)检测结合的适配子。所述方法可用于在个体中就疾病程度来展现癌症和监测响应治疗的变化。

可通过将RNA适配子与可检测标记结合来促进癌症干细胞的检测。可检测标记的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、电子致密标记、MRI标记和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖甘酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。合适的荧光物质的实例包括伞形酮(umbellifone)、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯代三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光物质的实例包括鲁米诺。生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素和水母素，并且合适的放射性物质的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、¹⁸F、⁶⁴Cu、^94mTc、¹²⁴I、¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸²Rb或³H。

可通过例如使用Klenow聚合酶的模板延伸，通过T4RNA连接酶介导的连接和末端脱氧核苷酰转移酶来实现适配子的3’端标记。可通过以过量的GTP-β-S补充体外转录混合物来实现5’端标记，然后可将其硫醇用于结合生物素。另外，将合适的基团直接化学缀合至5’端或3’端可用于标记适配子。

本公开的抗癌剂

可将本公开的RNA适配子分子缀合至部分，并用于将所述部分导向CD133+细胞，优选癌症干细胞。部分的实例包括可用于杀伤癌症干细胞的毒素、放射性核素或化疗剂。

可通过化学合成的部分和适配子，或通过缀合方式，例如，用于连接分别制备的RNA适配子和所述部分的非肽共价键，例如，非酰胺键，将RNA适配子融合至部分，例如毒素。可选地，可通过合适的连接肽连接所述RNA适配子和部分。

可用的毒素分子包括肽毒素，其在存在于细胞中时具有明显的细胞毒性。毒素的实例包括细胞毒素、破坏酶活性并从而杀伤癌症干细胞的代谢干扰物(抑制剂和活化剂)，以及能杀伤确定半径的效应子部分中的所有细胞的放射性分子。代谢干扰物是能改变细胞代谢而使得正常功能被改变的分子，例如，酶或细胞因子。在广义上，术语毒素包括任何造成肿瘤细胞死亡的效应子。

许多肽毒素具有广泛性的真核受体结合结构域；在这些情况下，必须对毒素进行修饰以防止杀伤不携带CD133的细胞(例如，防止杀伤不携带CD133但具有未修饰的毒素的受体的细胞)。必须以保存所述分子的细胞毒性功能的方式进行这样的修饰。可能有用的毒素包括但不限于：白喉毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素、0-志贺样毒素(SLT-I、SLT-II、SLT-II_V)、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、假单胞菌外毒素、Alorin、皂素、莫迪素(modeccin)和白树毒素。其他毒素包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和淋巴毒素(LT)。具有抗肿瘤活性的另一种毒素为卡里奇霉素γ1，其为包含具有针对肿瘤的相当大的效力的抗肿瘤抗生素的二炔-烯(Zein N et al(1988).Science 240:1198-201)。

例如，可将白喉毒素(其序列是已知的)缀合至本公开的RNA适配子分子。由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diptheriae)分泌的天然的白喉毒素分子由几个功能域组成，以分子的氨基末端起始，所述功能域可表征为具有酶促活性的片段A(AA 1-193)和片段B(AA194-535)，所述片段B包含异位结构域和广义的细胞结合域(AA 475-535)。

可以本领域技术人员已知的几种方式中的任一种连接RNA适配子和毒素部分。例如，将RNA适配子缀合至毒素(白树毒素)的方法描述于Chu TC et al.(2006)Cancer Res 6(12)5989-5992中。

所述部分也可为以局部水平激活或抑制身体的免疫系统的免疫系统调节物。例如，递送至肿瘤的细胞因子，例如淋巴因子如IL-2，可引起细胞毒性T-淋巴细胞或自然杀伤细胞在肿瘤附近增殖。

部分或报告基团也可为放射性分子，例如，放射性核素或所谓的敏化剂，例如，在特定条件下变得具有放射性的前体分子，例如，在所谓的“硼中子俘获治疗”(BNCT)中，暴露于低能中子束的硼，所述治疗在Barth et al.(1990).Scientific American Oct 1990:100-107中有描述。可使用具有此类放射性效应子部分的化合物来抑制肿瘤中的癌症干细胞增殖和标记癌症干细胞用于成像目的。

放射性核素为可发射α、β或γ粒子的单原子放射性分子。α粒子发射体优于β或γ粒子发射体，因为它们在较短的距离释放高得多的能量辐射，并因此是有效的，而不会穿透和损伤正常组织。发射放射性核素的合适的α粒子包括²¹¹At、²¹²Pb和²¹²Bi。

放射性分子必须直接或通过双官能团螯合剂与适配子紧密连接。该螯合剂不允许洗脱，并因此过早在体内释放放射性分子。Waldmann,Science,252:1657-62(1991)。例如，为了采用本发明的BNCT，可将稳定同位素或硼，例如硼10，选为化合物的抗肿瘤部分或效应子部分。硼将会被递送至肿瘤细胞中或肿瘤细胞上，并通过适配子与癌症干细胞的特异性结合浓缩。在允许积累足够量的硼的时间后，可以具有约0.025eV的能量的低能中子束对肿瘤进行成像和辐照。虽然该中子辐照自身对肿瘤周围的健康组织或肿瘤自身造成很少的损伤，硼10(例如，在肿瘤细胞的表面上)会捕获中子，从而形成不稳定同位素硼11。硼11立即裂变产生锂7核子和高能α粒子，约279万Ev。这些重粒子是高度致命的，但在很小范围内形成辐射，因为粒子具有仅约一个细胞直径(10微米)的光程长。

本公开的递送剂

本公开的RNA适配子分子可用于将siRNA或核酶递送至细胞中。合适的siRNA或核酶的实例依赖于环境。适合本公开的应用的siRNA或核酶的实例包括靶向ATP结合盒式膜转运蛋白、多能性基因(Bmi-1、Notch 1、Sox 2、Oct-4、Nanog、β-连环束、Smo、巣蛋白、ABCG2、Wnt2和SCF等)、GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)和生存素的那些。

例如，这已在本领域中使用抗PSMA适配子进行了证明。基于对PSMA通过网格蛋白有被小窝内化至核内体的了解，假定抗PSMA适配子将运载所连接的siRNA至表达PSMA的细胞，并且与PSMA蛋白结合的适配子-siRNA将通过内化进入细胞。接着，siRNA部分将接受Dicer复合物的处理，并送入至RNA诱导沉默复合物(RISC)介导的基因沉默通路。3个研究小组已使用不同的策略来完成这一过程。Chu et al(2006)Nucleic Acids Res 34,e73描述了用于组装抗PSMA适配子和siRNA的生物素-链霉亲和素桥联介导的缀合方法。McNamaraet al.(2006)Nat Biotechnol 24,1005-1015使用“仅RNA”的适配子-siRNA嵌合方法来连接适配子和siRNA。在随后的Wullner et al(2008).Curr.Cancer Drug Targets8:554-565的研究中，作者使用抗PSMA适配子来递送真核延长因子2(EEF2)siRNA至PSMA阳性的前列腺癌细胞，二价的PSMA适配子被用于该目的。作者证明，相比单价的抗PSMA-siRNA嵌合体，二价适配子构建物的基因敲低效力较优。

本公开的RNA适配子分子也可用于递送货运物至多种实体瘤中的CD133⁺癌症干细胞。白树毒素是能抑制蛋白合成过程并且具有细胞毒性的核糖体毒素。然而，其不能透膜，并且需要引导物用于其细胞进入。因此，可使用本公开的RNA适配子分子来递送不能透膜的毒素荷载至癌症干细胞。

耐细胞毒性化疗剂的肿瘤部分是由于至癌细胞的递送不足和癌细胞摄取不足，并且更重要的是癌细胞的流出。来源于聚(D,L-乳酸-乙醇酸共聚物)PLGA的可生物降解的纳米粒子(NP)被用于解决这一问题，如Dhar et al(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:17356-17361中所述。简而言之，通过引入两个烷基链将顺铂转化为其前药Pt(IV)化合物。这增加了化合物的疏水性，且简化了将其包装在NP的疏水内核中的过程。聚乙二醇(PEG)被用作合成PLGA-PEG纳米粒子的纳米沉淀步骤中的共聚物。以PSMA(前列腺特异性膜抗原)适配子修饰PLGA-PEG-NP表面。当以LNCaP细胞孵育时，NP经历内吞作用，且烷基化的前药通过细胞质还原过程被转化为顺铂。

本公开还延伸至使用RNA适配子分子作为同时的药物递送剂和成像剂。这可通过将适配子缀合至荧光量子点(QD)的表面来实现。接着，用Dox孵育QD-适配子缀合物以形成QD-适配子-Dox纳米粒子。Dox和QD均为荧光分子。然而，由于它们在QD-适配子-Dox纳米粒子中相互靠近，它们通过双荧光共振能量转移(FRET)机制淬灭彼此的荧光。因此，QD-适配子-Dox纳米粒子是非荧光的。然而，通过前列腺癌细胞中PSMA介导的内吞作用而进行的QD-适配子-Dox纳米粒子的内化造成Dox从QD-适配子-Dox纳米粒子释放，其引起Dox和QD的荧光的恢复。

药物组合物

在本公开的一个实例中，根据本公开的RNA适配子、抗癌剂或药物递送剂被以包含药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物形式给药。可根据用于给药的途径和装置采用组合物的赋形剂或其他成分的选择。

术语“载体”和“赋形剂”是指本领域中常规使用的用于促进活性化合物的储存、给药和/或生物活性的组合物(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,16thEd.,Mac Publishing Company(1980)。载体也可降低活性化合物的任何不需要的副作用。合适的载体为，例如稳定的，例如，不能与载体中的其他成分反应。在一个实例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下不在受体中产生明显的局部或系统不利影响。

用于本公开的合适载体包括常规使用的那些，例如，水、盐水、水性葡萄糖、乳糖、林格氏溶液(一种缓冲溶液)、透明质酸和乙二醇，其为示例性的液体载体，特别是(在等渗时)用于溶液的。合适的药物载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

可添加其他的一般添加剂如抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等。为了制备可注射的溶液、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，可额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂。

可经肠胃外(例如，静脉内、皮下、局部或腹膜注射)给予包含本发明的RNA适配子的抗癌剂或药物递送剂。可根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法、排泄物和疾病的严重性来确定有效剂量的抗癌剂。在一个实例中，抗癌剂或药物递送剂包含10-95％体重比的RNA适配子。在另一个实例中，抗癌剂或药物递送剂包含25-75％体重比的RNA适配子。

给药频率可为一天一次至几次。

在一个实例中，RNA适配子的有效细胞内含量为约1nM至1000nM。在另一个实例中，RNA适配子的有效细胞内含量优选为100nM至500nM。然而，适配子的剂量可低于或高于上述范围。

适配子的组合

可根据本文公开的任何方法，单独或结合一种或多种另外的RNA适配子使用本公开的分离的RNA适配子分子。在一个实例中，可将本公开的RNA适配子分子与可促进癌症干细胞的检测、纯化或富集的RNA适配子组合。在一个实例中，所述另外的RNA适配子包含Shigdar S et al(2011).Cancer Sci 102(5):991-998中描述的适配子EpDT35’–GCGACUGGUUACCCGGUCG-3’的序列。在另一个实例中，所述另外的RNA适配子包含序列5’–ACGUAUCCCUUUUCGCGUA-3’。

试剂盒

本公开还提供了用于实施本文公开的方法的诊断剂盒。在一个实例中，所述诊断剂盒包含用于检测表达CD133的细胞(例如，癌症干细胞)的如本文所述的RNA适配子或诊断剂。

所述试剂盒也可包含助剂如缓冲剂和稳定剂。所述诊断剂盒还可包含用于降低背景干扰的试剂、对照试剂和用于进行测试的装置。通常还包含关于如何使用所述诊断剂盒的指导。

本领域技术人员应理解可对上述实施方案进行多种变型和/或修改，而不脱离本公开的广义总体范围。因此，本实施方案在所有方面应理解为示例性和非限制性的。

实施例

方法

细胞系和细胞培养物

用于本研究的来源于人的细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American typeCulture Collection)。它们为人结肠直肠癌HT-29；人肝细胞癌Hep3B；人多形性成胶质细胞癌T98G；和人胚肾细胞HEK293T。将细胞培养和维持在具有补充了10％胎牛血清(HEK293T,HT-29)的杜氏改良的伊戈尔培养基(DMEM)(Invitrogen,Victoria,Australia)，或补充了10％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)(Invitrogen)(Hep3B,T98G)的培养物中。将细胞于37℃下保持在5％CO₂气氛中。

蛋白表达和细胞SELEX

人CD133 cDNA购自Invitrogen，并将其克隆至哺乳动物表达载体、pcDNA 3.1/V5-His-TOPO中。将重组6x组氨酸标记的CD133在HEK293T细胞中瞬时表达。简而言之，将HEK293T细胞接种在100mm或60mm盘中，以在24小时孵育后达到70％的汇合度，并根据厂商的说明书，使用于无抗生素的培养基中的Lipofectamine 2000(Invitrogen LifeTechnologies)，用总共分别24μg或8μg的CD133转染。孵育72小时后，将转染的细胞用作细胞SELEX的靶标。

SELEX选择

合成了包含中心40-nt随机化序列(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC AAGAAT AAA CGC TCA A-N40-TTC GAC AGG AGG CTC ACA ACA GGC，T7 RNA聚合酶启动子序列标有下划线)的DNA文库(GeneWorks,Australia)。使用位于随机化序列侧翼的引物5’-TAATAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC AAG AAT AAA CGC TCA A-3’和5’-GCC TGT TGT GAG CCTCCT GTC GAA-3’，通过大规模PCR，从原始合成的文库生成了双链DNA库。使用T7转录试剂盒(Biotechnologies,USA)，将一部分的大规模PCR产物(～10¹⁴个序列)用作体外转录的模板，以制备起始2’-氟嘧啶修饰的RNA库。对于SELEX，将用于起始选择的5μM浓度的RNA或用于每个重复循环的1μM浓度的RNA稀释于100μL的结合缓冲液(含有2.5mM MgCl₂、0.1mg/mL tRNA和0.1mg/mL鲑鱼精的杜氏磷酸盐缓冲盐水)中，并在85℃变性5分钟，使其冷却至室温10min，并在37℃退火15min，然后在4℃下用表达于HEK293T细胞中的靶标蛋白孵育1h。孵育和大量洗涤后，使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)对结合的RNA进行逆转录，然后进行PCR扩增和体外转录，并将其用于下一轮的SELEX。使用表达于HEK293T细胞中的His标记的不相干蛋白，从第4轮起纳入逆选择步骤，以降低特异性识别His标签、HEK293T细胞或组织培养平板的物质的富集。还对PCR扩增循环数进行了优化以防止非特异性“寄生”PCR产物的过度扩增。另外，通过调整适配子浓度、孵育时间和洗涤数增加了选择方法的严紧度，以促进高亲和力适配子的选择。为了获得具有高特异性的适配子，在SELEX进展过程中，渐续降低使用的细胞数，同时增加洗涤的严紧度，并从第4轮起纳入阴性选择。使用限制性片段长度多态性(RFLP)和流式细胞术，用活细胞监测富集。

RFLP分析

通过限制性片段长度多态性(RFLP)确定选择期间适配子候选物的富集。简而言之，按先前所述进行RFLP(Das et al.2009；Missailidis & Hardy2009)，进行了少量的修改。通过PCR，将来自重复循环的约5ng的cDNA扩增8个循环。37℃下，使用在厂商(Takara)提供的补充了0.1％(w/v)牛血清白蛋白的缓冲液T中识别4核苷酸的4种限制酶(常切点酶(frequent cutter))Afa I、Alu I、Hha I和Xsp I过夜消化扩增的DNA。过夜消化后，将DNA加热至65℃，在冰上冷却，并通过在TBE缓冲液中的非变性20％聚丙烯酰胺凝胶上电泳来进行分离。然后将凝胶在GelStar中染色并使用标准凝胶成像系统成像。

流式细胞术检测

在80％汇合度时以胰蛋白酶消化来收获细胞，并重悬在洗涤缓冲液(具有2.5mMMgCl₂的DPBS)中，并计数。离心(1000xg，5min)后，将细胞团重悬在结合缓冲液(补充有5mMMgCl₂、0.1mg/ml tRNA、0.1mg/ml鲑鱼精DNA的DPBS)中，并稀释至1×10⁶/mL。

为了确认适配子与靶标蛋白的结合，根据先前描述的方法(Willkomm & Hartmann(2005).Weinheim,Wiley-VCH GmbH & Co.KGaA 1:86-94)，在3'端用异硫氰酸荧光素(FITC)标记来自重复循环的RNA。在整个过程中都使用了Amber管，以将光致漂白减至最小。简而言之，用过碘酸钠将样品氧化。通过添加10mM乙二醇终止氧化，然后通过乙醇进行沉淀。添加FITC 30摩尔至过量，并在4℃下过夜来完成反应。在冰上将1μM的FITC标记的RNA与胰蛋白酶消化的于100μL结合缓冲液中的CD133蛋白转染的5×10⁵HEK293T或非转染的HEK293T细胞孵育1h，然后洗涤3次，并重悬在300μL的结合缓冲液中。通过每个样品计数50,000个事件，用FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson)测定荧光强度。将来自未选择的文库的FITC标记的RNA用于测定非特异性结合。

在减去第0轮RNA与靶标细胞的结合以及根据Ellington和同事描述的方法(Li etal.(2009).J.Proteome Res 8:2438-48)的与阴性对照细胞的结合的平均荧光强度后，计算每轮的结合。

所选适配子的克隆、测序和结构分析

在重复循环的RFLP和流式细胞术分析后，第6轮显示了选择性识别靶标蛋白的RNA序列的充分富集。通过PCR将该富集的库扩增10个循环，并将PCR产物克隆至质粒(Invitrogen)中。制备了来自单个克隆的质粒DNA，并使用自动化DNA测序方案测定了它们的序列。使用ClustalX2(Larkin et al.(2007)Bioinformatics 23:2947-8)分析了适配子序列。使用程序RNAfold(Hofacker(2003)Nucleic Acid Res31:3429-31)预测二级结构。

适配子亲和力的测定

使用流式细胞术测定了成功的2’-氟嘧啶RNA适配子物质与表达于细胞表面上的天然CD133的解离常数(K_d)。首先用封闭缓冲液(包含0.2％(w/v)叠氮化钠的结合缓冲液)孵育转染了CD133蛋白的HEK293T细胞或未转染的HEK293T细胞(5×10⁵)，然后用结合缓冲液洗涤两次，随后在冰上用于100μL体积的结合缓冲液中的连续浓度(高于和低于表观K_d约10倍)的FITC标记的适配子孵育1h。用结合缓冲液将细胞洗涤3次,重悬在150μL结合缓冲液中，并进行流式细胞术分析。将FITC标记的未选择的文库用作阴性对照。从适配子-靶标细胞的平均荧光强度(MFI)减去未选择的文库的平均荧光强度，以生成特异性结合的MFI。通过斯卡查德分析，根据以下方程式确定每个适配子的K_d：

[结合的适配子]/[适配子]＝-(1/K_d)×[结合的适配子]+([T]_tot/K_d)其中[T]_tot表示总靶标浓度。

适配子截短和特异性测定

为了生成截短的适配子，合成了所需序列的正义和反义DNA寡核苷酸。CD133-1-1(第1个截短物)衍生自正义寡核苷酸5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG AGA CAA GAA TAA ACGCTC AAC CCA CCC TCC TAC ATA GGG AGG AAC GAG TTA CTA TAG-3’，和反义寡核苷酸5’-CTA TAG TAA CTC GTT CCT CCC TAT GTA GGA GGG TGG GTT GAG CGT TTA TTC TTG TCTC-3’；CD133-1-2(第2个截短物)衍生自正义寡核苷酸：5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG CTCAAC CCA CCC TCC TAC ATA GGG AGG AAC GAG T-3’，和反义寡核苷酸5’-ACT CGT TCC TCCCTA TGT AGG AGG GTG GGT TGA GC-3’；CD133-1-2-1(第3个截短物)衍生自正义寡核苷酸5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAC CAC CCT CCT ACA TAG GGT GG-3’，和反义寡核苷酸5’-CCACCC TAT GTA GGA GGG TGG-3’；以及CD133-1-2-2(第4个截短物)衍生自正义寡核苷酸TAA TAC GAC TCA CTA TAC CCT CCT ACA TAG GG-3’和反义寡核苷酸5’-CCC TAT GTA GGAGGG-3’。CD133-2-1(第1个截短物)衍生自正义寡核苷酸5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAC AGAACG TAT ACT ATT CTG-3’和反义寡核苷酸5’-CAG AAT AGT ATA CGT TCT G-3’(T7 RNA启动子序列标有下划线)。以等摩尔比将相关的寡核苷酸对混合在1×PEI缓冲液(0.1M Tris-HCl pH 8、0.1M MgCl₂、0.5M NaCl和0.1M二硫苏糖醇)中，90℃下加热5min，并缓慢冷却至室温，然后进行乙醇沉淀。按上述进行体外转录和FITC标记。还用5’-DY647荧光标签和3'-反向脱氧胸苷(Dharmacon)化学合成了这些克隆(CD133-1-4和CD133-2-1)的最终截短物，5’-DY647-CCC TCC TAC ATA GGGdT-3'和5’-DY647-CAG AAC GTA TAC TAT TCT GdT-3’。使用CD133阳性(HT-29和Hep3B)和CD133阴性细胞系(T98G和HEK293T)测定了这2个适配子和阴性对照适配子的结合亲和力。在4℃下使用包含5％(v/v)胎牛血清的封闭缓冲液进行封闭步骤，同时在37℃下进行适配子的结合30min。

共聚焦显微镜

标记之前24小时，以75,000个细胞/cm²的密度将细胞接种在玻璃底的具有8个小室的载玻片(Lab-Tek II,Nunc)中。以与流式细胞术相同的方式制备DY647-CD133-1-2-2、DY647-CD133-2-1和对照适配子。在去除培养基后，在37℃下将细胞在包含5％(v/v)血清的封闭缓冲液中孵育15min，在结合缓冲液中洗涤两次，然后在37℃下用200nM适配子孵育30min。在最后15min的孵育期间将双苯酰亚胺Hoechst 33342(3μg/mL)(Sigma)添加至细胞中。去除适配子溶液，并将细胞在结合缓冲液中洗涤3次，每次5min，然后使用FluoViewFV10i激光扫描共聚焦显微镜(Olympus)成像。

内吞作用的抑制

这基本上按针对共聚焦显微镜描述的进行，进行了少量的修改。简而言之，37℃下将细胞用去钾(50mM Hepes、140mM NaCl、2.5mM MgCl₂和1mM CaCl₂)或高渗缓冲液(含有3mMKCl和450mM蔗糖的去钾缓冲液)预处理1hr。这些缓冲液也被用于使用适配子的孵育步骤和所有冲洗步骤。通过定性表征与Alexa Fluor 488(Invitrogen)缀合的人转铁蛋白的内化，验证这些处理在抑制内吞作用中的效力。在预处理之后将转铁蛋白(5μg/mL)添加至细胞中，然后在37℃下孵育30min。将细胞在其各自的缓冲液中洗涤3次，并使用FluoView FV10i共聚焦显微镜成像。

适配子与转铁蛋白的共定位

按先前针对共聚焦显微镜所描述的制备HT-29、Hep3B、T98G和293T细胞。在去除培养基后，37℃下将细胞在包含5％(v/v)血清的封闭缓冲液中孵育15min，在结合缓冲液中洗涤两次，然后于37℃用200nM适配子孵育30min。去除适配子溶液，并将细胞在结合缓冲液中洗涤3次，每次5min。然后将转铁蛋白添加至细胞中并孵育2小时，然后在最后15min的孵育期间向细胞中添加双苯酰亚胺Hoechst 33342(3μg/mL)(Sigma)。将细胞在结合缓冲液中洗涤3次，每次5min，然后使用FluoView FV10i激光扫描共聚焦显微镜成像。

肿瘤球体准备和以适配子和抗体孵育

取出1000-2000个HT29和HEK293T细胞，并使其在包含表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、胰岛素和B27的DMEM/F12培养基(Invitrogen Life Technologies)中形成球体7天。在第7天时，在包含2.5mM MgCl₂的PBS中将球体(大小为300～400μm的)洗涤3次，并使用结合缓冲液封闭20分钟。然后用100nM的适配子或AC133抗体将球体孵育30min、60min、120min、240min或24小时。在每个时间点后，用PBS将球体洗涤3次，然后使用FluoViewFV10i共聚焦显微镜成像。

实施例1：细胞SELEX促进针对复杂蛋白靶标的适配子的选择

CD133为包含2个胞外环的复杂5次跨膜蛋白。为了有效选择仅针对蛋白的细胞外部分的适配子，必须设计允许发明人以其天然构象形式表达CD133的方法。为了这一目的，发明人试图在HEK293T细胞表面上瞬时表达蛋白。使用Lipofectamine 2000，将CD133转染至HEK293T细胞，并允许表达72小时，然后进行SELEX实验，通过AC133抗体染色确认表达。类似于先前的SELEX实验，将在所有嘧啶上均包含2’氟修饰的核糖的约1×10¹⁴种物质的的随机RNA文库与在HEK293T细胞表面上表达的CD133一起孵育。通过几个洗涤步骤去除未结合的RNA，然后进行RT-PCR，并将该过程重复总共12个循环。使用转染至HEK293T细胞中的不相关的His标记的蛋白，通过阴性选择消除非特异性结合。进行非放射性RFLP，以确认重复循环期间物质的演化，并使用流式细胞术，用转染的和未转染的HEK293T细胞确定富集的确认。如图1中所示，相比未转染的HEK293T细胞和未选择的文库，第6轮显示与CD133转染的HEK293T细胞的结合增加2.5倍以上。

实施例2：SELEX后改造产生了最小的肿瘤特异性适配子。

将第6轮克隆并测序，并使用内部方法用FITC对克隆进行荧光标记。使用转染的和未转染的HEK293T细胞测定每个克隆的结合特异性，并以称为CD133-1和CD133-2的两个适配子显示最鼓舞人心的结果。将这两个克隆顺序截短，以测定维持适配子的结合区域的结构以及降低K_d并因此增加结合亲和力所需的最少碱基数(表1)。

表1 CD133适配子及其截短物的序列。

克隆CD133-1总共被截短4次，以确定适配子的结合区域。该克隆被成功截短至15个核苷酸，使得其成为发表的针对肿瘤特异性抗原的最小适配子，并且大小等于发表的针对凝血酶的最小DNA适配子(Paborsky et al.(1993)J.Biol Chem 268:20808-11)。还研究了第二个克隆CD133-2以高亲和力和特异性结合CD133的潜能。截短适配子导致K_d减小，并因此使得对靶标的亲和力变高(表2)。

表2 CD133对CD133阳性(HT-29 & Hep3B)和CD133阴性(T98G & HEK293T)细胞的解离结合常数

细胞系	CD133-1-2-2(Kd,nM)	CD133-2-1(Kd,nM)
			HT-29	82	145
Hep3B	32	52
			HEK293T	1.20E+05	1.74E+06
T98G	2.75E+05	4763

使用CD133阳性(HT-29和Hep3B)和CD133阴性(T98G和HEK293T)细胞系确定了这两个适配子的灵敏度和特异性的确认(表2)。当物质为商业合成且标记有DyLight荧光团时，K_d轻微增加。

实施例3：通过受体介导的内吞作用内化CD133特异性适配子。

如我们先前所报导的，对于可分类为有效癌症治疗诊断剂的适配子，其必须在与其靶标结合后有效内化。在于37℃以CD133阳性和CD133阴性细胞孵育30分钟后，使用共聚焦显微镜对内化进行定量。由于缺少使用CD133阴性细胞系可见的荧光信号，内化被认为是特异性的。经内吞阻塞如去钾和高渗处理确认通过受体介导的内吞作用的内化。先前已使用转铁蛋白确认了这些处理的有效性(Shigdar et al.(2011a)Cancer Sci102:991-8)。

实施例4：相比CD133抗体，CD133特异性适配子显示优良的肿瘤球体穿透力。

为了尝试证明我们的适配子作为癌症治疗诊断剂的有效性，本发明人使用体外肿瘤球体作为用于体内靶向的模型，研究了其适配子穿透肿瘤块的潜能。发明人制备了HT-29(CD133⁺)和HEK293T(CD133^-)细胞系的肿瘤球体模型，并用CD133-1、CD133-2和AC133抗体将这些球体孵育4h，然后进行共聚焦显微镜检测(图7)。

实施例5：CD133适配子-阿霉素缀合物能够在体外消除结肠癌症干细胞。

除了一些例外，化疗药物如阿霉素不杀伤癌症干细胞。本发明人假设如果化疗药物通过CD133适配子被递送至癌症干细胞，并通过内吞作用(而非作为游离药物随机扩散至细胞中)进入细胞，它们能够将常规的化疗药物转化成有效的癌症干细胞杀伤剂。为了测试CD133适配子-阿霉素体外消除结肠癌症干细胞的能力，本发明人进行了体外肿瘤球体检测。

将CD133-2-1适配子缀合至阿霉素。将3种不同细胞剂量的结肠癌细胞(HT29)接种于具有促进肿瘤球体形成的癌症干细胞培养基(补充了胰岛素、FGF、EGF和B27的无血清的DMEM培养基)的96孔超低附着盘。用盐水(PBS)对照、1μM的DOX-适配子缀合物或1μM的游离阿霉素处理细胞。处理后3天评估每个孔中的肿瘤球体形成(表3)。

在100个细胞/孔的细胞剂量下，CD133-2-1适配子-Dox缀合物和游离阿霉素显示对抑制肿瘤球体形成无影响。然而，在每孔50个细胞的细胞剂量下，使用适配子-Dox观察到频率的轻微减小。重要的是，在10个细胞/孔的条件下，以1μM的DOX-适配子缀合物处理引起能够形成肿瘤球体的结肠癌干细胞样细胞的完全消除。因此，阿霉素通过CD133适配子的癌症干细胞靶向的递送能够避开已知的化学抗性机制，其为癌症干细胞耐受常规抗癌治疗的能力的基础。

表3 处理后肿瘤球体的形成

对照(PBS)

阿霉素(Dox)

适配子-阿霉素缀

			合物
				100个细胞/孔	5/5	5/5	5/5
50个细胞/孔	5/5	5/5	3/5
				10个细胞/孔	4/5	5/5	0/5

癌症干细胞(CSC)被认为是癌症的根基和癌症复发的诱因。该模型得到了接受，因为其解释了辐射和化疗耐受性(Visvader & Lindeman(2012)Cell Stem Cell 10:717-28)，并引起了特异性靶向肿瘤中的该细胞群的多次尝试。虽然不存在一种限定所有CSC的特异性标志物，但多种标志物包括CD133、CD44、ALDH、EpCAM和ABCG2(Hu & Fu(2012)CancerRes2:340-56；Visvader & Lindeman 2012，同上)，已证明可用于限定实体瘤中的CSC群。CD133被涉及作为脑癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤癌、结肠癌、肝癌、肺癌和卵巢癌中的CSC群的标志物。虽然CD133的功能仍然有待阐明，该标志物在缺氧条件下被上调，并且与三阴性乳腺癌和前列腺癌中的血管生成拟态相关(Liu et al.(2012a)Cancer Biol Ther May113(7)；Liu et al.(2012b)Oncogene Apr 2)，表明CD133在肿瘤生长和转移中的重要性。考虑到这些CD133⁺细胞能够以何种严格度产生、维持和持续肿瘤扩散，我们已分离了针对CD133的RNA适配子。

本发明人先前已成功进行了SELEX方法来分离靶向另一CSC标志物的适配子(Shigdar et al.2011a，同上)。由于该蛋白的5次跨膜特性和使用其构象形状的蛋白来选择适配子的必要性，靶向CD133的适配子的分离需要对先前的方案进行修改。使用流式细胞术结合检测以及RFLP分析显示了选择方案的成功。在第6个SELEX循环后显示了成功演化，并克隆了几种适配子。选择了两种适配子用于使用CD133阳性和阴性细胞系进一步表征。也对这些适配子进行了截短以确定维持结合亲和力所需的最小尺寸。这些适配子中的一种CD133-1，能够被截短至15个碱基的大小。该截短使得其成为描述的最小的RNA适配子，且等于靶向凝血酶的DNA适配子的大小(Paborsky et al.1993，同上)。这两种适配子均显示具有灵敏性和特异性，并且更重要的是，在与其靶标结合后，这两种适配子均被受体介导的内吞作用快速内化。适配子的该后一特性为将这些适配子改良为治疗诊断剂所必需的。

适配子具有许多益处，使得它们成为用于肿瘤块的处理和成像的理想伴随形态。它们的较小的尺寸意味着相比常规的免疫治疗选择，它们能够更有效地穿透肿瘤，并且这些核酸还缺少免疫原性，引起少得多的副作用。通过将药物直接缀合至或包封于纳米粒子中来添加功能，适配子能够作为非常有效的药物护送物起作用。已存在几例将化疗药物如阿霉素、siRNA或核酶直接缀合至靶向适配子，并通过将适配子结合至其表面来成功功能化纳米粒子的报导。虽然一些适配子通过与其靶标结合能够单独起作用，大部分的适配子作为细胞毒性物质的牵引手要更为成功。

Claims

1.RNA适配子，其能特异性结合CD133，其中所述适配子由选自5’-GAG ACA AGA AUAAAC GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGA GUU ACU AUA GAG CUU CGA CAGGAG GCU CAC AAC-3’(SEQ ID NO:2)或其截短物序列的序列组成，其中SEQ ID NO:2的截短物序列包含共有序列5’-CCCUCCUACAUAGGG-3’(SEQ ID NO:1)；或者所述适配子由选自5’-GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA GGA AAG CGC UUA UUG UUU GCU AUG UUA GAA CGU AUA CUA UUU CGA CAG GAG GCU CAC AAC AGG C-3’(SEQ ID NO:8)或其截短物序列的序列组成，其中SEQ ID NO:8的截短物序列包含共有序列5’-AGAACGUAUACUAUU-3’(SEQ ID NO:7)。

2.如权利要求1所述的适配子，其由选自以下的序列组成：

(i)5’-GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGA GUUACU AUA GAG CUU CGA CAG GAG GCU CAC AAC-3’(SEQ ID NO:2)；

(ii)5’-GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGAGUU ACU AUA G-3’(SEQ ID NO:3)；

(iii)5’-GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGA GU-3’(SEQ ID NO:4)；

(iv)5’-CC ACC CUC CUA CAU AGG GUG G-3’(SEQ ID NO:5)；和

(v)5’-CAGAACGUAUACUAUUCUG-3’(SEQ ID NO:6)。

3.如权利要求1或2所述的适配子，其由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6所示的序列组成。

4.如权利要求1或2所述的适配子，其中所述适配子被修饰以增加适配子稳定性。

5.如权利要求4所述的适配子，其中所述适配子经2’-氟代修饰。

6.如权利要求1或2所述的适配子，其具有约150nM或更小的解离常数。

7.如权利要求1或2所述的适配子，其中所述适配子能特异性结合CD133⁺癌症干细胞。

8.如权利要求7所述的适配子，其中所述细胞存在于获自个体的生物样品中。

9.如权利要求8所述的适配子，其中所述细胞选自：脑癌干细胞、乳腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、胰腺癌干细胞、结肠癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞、卵巢癌干细胞、皮肤癌干细胞和黑素瘤干细胞。

10.诊断剂，其包含与可检测标记结合的权利要求1至9中任一项所述的RNA适配子。

11.如权利要求10所述的诊断剂，其中所述可检测标记选自：酶、辅基、发光物质、电子致密标记、MRI标记和放射性物质。

12.如权利要求11所述的诊断剂，其中所述发光物质为荧光物质或生物发光物质。

13.用于生物样品的组织学检查中的权利要求1至9中任一项所述的适配子、或者权利要求10或11所述的诊断剂。

14.抗癌剂，其包含与部分结合的权利要求1至9中任一项所述的适配子。

15.如权利要求14所述的抗癌剂，其中所述部分选自毒素、放射性核素和化疗剂。

16.如权利要求15所述的抗癌剂，其中所述化疗剂为阿霉素。

17.从获自个体的生物样品分离、纯化或富集表达CD133的细胞和/或癌症干细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与权利要求1至9中任一项所述的RNA适配子或者权利要求10或11所述的诊断剂接触，并且所述方法是用于非诊断目的的。

18.如权利要求1至9中任一项所述的RNA适配子或者权利要求10或11所述的诊断剂在制备用于诊断患有或疑似患有癌症的个体的试剂盒中的用途。

19.如权利要求18所述的用途，其中所述个体为患有选自以下的癌症的个体：脑癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑素瘤或其中存在CD133⁺细胞的任何其他癌症。

20.权利要求1至9中任一项所述的适配子或者权利要求14至16中任一项所述的抗癌剂在制备用于治疗或预防个体的癌症的药物中的用途。

21.递送剂，其包含与siRNA或核酶结合的权利要求1至9中任一项所述的适配子。

22.组合物，其包含治疗有效量的权利要求1至9中任一项所述的适配子、权利要求14至16中任一项所述的抗癌剂、或权利要求21所述的递送剂，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

23.用于肿瘤的分子成像的权利要求1至9中任一项所述的适配子、或者权利要求10或11所述的诊断剂。