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CN108866062A - 一种特异性识别肝癌干细胞的dna适配体及其筛选方法与应用 - Google Patents

一种特异性识别肝癌干细胞的dna适配体及其筛选方法与应用 Download PDF

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CN108866062A
CN108866062A CN201810640738.2A CN201810640738A CN108866062A CN 108866062 A CN108866062 A CN 108866062A CN 201810640738 A CN201810640738 A CN 201810640738A CN 108866062 A CN108866062 A CN 108866062A
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单鸿
李丹
王皓帆
吕秀芳
罗慧
于海玲
刘天泽
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Abstract

本发明公开了一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法与应用，所述DNA适配体的核苷酸序列包括如Seq ID No.1所示的特征序列部分。所述筛选方法包括以下步骤：利用核酸适配体体外筛选技术，以CD133阳性表达肝癌细胞株为正筛靶标，以CD133阴性表达肝癌干细胞为负筛靶标，从体外合成的随机寡聚文库中筛选出与所述肝癌细胞株特异结合的核酸适配体。本发明的DNA适配体可应用于设计、制备抗肝癌的药物或检测试剂中。与现有技术相比，本发明的DNA适配体具有特异性好、性能稳定且制备成本低等优点。

Description

一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法与 应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法与应用。
背景技术
原发性肝癌是全世界范围内最常见的恶性程度最高的肿瘤之一，为全球第五大癌症之一，死亡率位居第3位。中国是肝癌新发病例人数最多的国家，其5年生存率低于5％，并且发病率仍在逐年升高，为社会带来了沉重的经济负担。目前，肝癌的主要治疗手段包括手术治疗、肝移植、射频消融治疗和肝动脉化疗栓塞术，其中，手术治疗和肝移植是相对最为成熟的治疗方法。由于手术治疗可以根治，因此，手术治疗是肝癌治疗的首选方法，然而术后复发却是至今无法解决的难题，且复发率极高。而对于合并有肝硬化的肝癌患者，肝移植是最有前景的治疗手段，但由于供体肝短缺，使得肝移植的开展受到极大的限制。综上所述，由于各治疗手段的局限性，导致肝癌患者的生存率低下，迫切需要结合肝癌的发病机制研究进一步开发新的治疗方法。
肿瘤干细胞假说认为在肿瘤组织中存在一种数量较少的肿瘤干细胞，被认为是肿瘤增殖、侵袭、转移及复发的根源。目前，在白血病、乳腺癌、肺癌、脑肿瘤、结直肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中均已成功分离出肿瘤干细胞。肝癌中存在肿瘤干细胞与其难治、复发及耐药等特点密切相关，而这些特点也表明了肝癌很可能也是一种肿瘤干细胞疾病，已有报道称，利用细胞表面分子分离出的肝癌干细胞在复发、耐药等方面发挥着重要作用。
CD133/prominin-1是一种造血干细胞和神经干细胞的表面标志物，近期研究发现，CD133也在多种实体肿瘤的肿瘤干细胞中表达，在体内发挥着多种生物学作用，且有研究已经表明CD133是肝癌干细胞的重要标志物。核酸适配体是由DNA/RNA单链构成的核酸分子，可特异性地识别单个蛋白或小分子，其具有与抗体相媲美的亲和力和特异性，同时又具备抗体所无法媲美的优点，如不易受pH、温度等环境因素影响而变性且价格便宜；可在体外筛选；无免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、改造与标记；化学稳定性好，能可逆变性与复性、可通过酶扩增、剪切等，这些优点使得其在生物医学领域具有广阔的应用前景。
因此，找出一种特异性针对肝癌的核酸适配体将其应用于肝癌的早期检测、分子成像、药物的靶向输送具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种具有高度特异性且性能稳定的特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法与应用，该适配体能够特异性识别CD133阳性表达的肝癌PLC8024细胞株及其衍生物。
一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体，所述DNA适配体的核苷酸序列包括如Seq ID No.1所示的特征序列部分。
进一步地，所述肝癌干细胞选自CD133表达的肝癌干细胞。
进一步地，所述肝癌干细胞选自PLC8024肝癌细胞株。
本发明的有益效果在于：本发明的可识别肝癌细胞株的核酸适配体能特异性识别肝癌组织，且对有CD133阳性表达的肝癌诊断，转移的预测和治疗提供新的思路，尤其对肝癌的早期检测具有重要意义。
本发明还包括上述DNA适配体的筛选方法，包括以下步骤：利用核酸适配体体外筛选技术，以CD133阳性表达肝癌细胞株为正筛靶标，以CD133阴性表达肝癌干细胞株为负筛靶标，从体外合成的随机寡聚文库中筛选出与所述肝癌细胞株特异结合的核酸适配体。
进一步地，所述筛选方法，具体包括以下步骤：
S1、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：
ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin-ACGCTCTGACCACTGACCT；
S2、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；
S3、正筛：将所述步骤S2得到的核酸适配体一级文库的上清与正筛靶标孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正筛适配体组文库；
S4、负筛：将所述步骤S3得到的正筛适配体组文库与负筛靶标孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的负筛适配体组文库；
S5、分析鉴定所述步骤S4所得到的负筛适配体组文库各序列的选择性、亲和力，最终得到带有如Seq ID No.1所示的特征序列的DNA适配体。
优选地，所述筛选方法，具体包括以下步骤：
S11、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：
ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin-ACGCTCTGACCACTGACCT；
S21、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；
S31、PCR扩增文库：将所述核酸适配体一级文库进行PCR扩增，得到扩增产物；
S41、正筛：将所述步骤S31得到的扩增产物的上清与CD133阳性的PLC8024细胞株孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正筛适配体组文库；
S51、负筛：将所述步骤S41得到的正筛适配体组文库与CD133阴性的PLC8024细胞株孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的适配体组文库；
S61、核酸适配体循环筛选：重复步骤S11～S51至少一次，以扩增产物代替随机文库，直到得到的适配体组文库与靶细胞的亲和力选择性不再上升；
S71、测序鉴定：克隆测序所述步骤S61得到的适配体组文库，分别鉴定各条序列的选择性和亲和力，最终得到带有如Seq ID No.1所示的特征序列的DNA适配体。进一步地，所述筛选方法还包括筛选操作开始之前进行肝癌干细胞分选的步骤，具体为：用CD133抗体标记PLC8024肝癌细胞株后，用流式细胞仪分选得到CD133阳性的PLC8024肝癌干细胞作靶标。
本发明的有益效果在于：采用本发明方案筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力及特异性无免疫原性，能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存便于标记且二抗不需要标记。
本发明还包括将上述DNA适配体应用于设计、制备抗肝癌的药物或检测试剂中。
本发明的有益效果在于：采用本发明的核酸适配体进行肝癌细胞的检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，周期短且重现性好；本发明的核酸适配体的特征序列可作为抗肝癌的分子探针或药物靶点，将为肝癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支持，具有重要的临床价值。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
本发明实施例为：一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法，所述DNA适配体的核苷酸序列包括AGGAGGTTAGGGGTGGGTGGGTGGT，其筛选方法包括以下步骤：
1.初始DNA文库(即一级文库)准备：
设计合成两端含19个核苷酸(引物)，中间包括25个核苷酸随机序列的核酸序列随机核酸文库及扩增引物，具体如下：
ACC TTG GCT GTC GTG TTG T(如Seq ID No.2所示)-25nt-A GGT CAG TGG TCAGAG CGT(如Seq ID No.3所示)
5'引物：ACC TTG GCT GTC GTG TTG T(如Seq ID No.4所示)
3'引物：ACG CTC TGA CCA CTG ACC T'(如Seq ID No.5所示)
2.靶细胞准备
2.1用台盼蓝染色实验确定肝癌细胞的活力，同时确定孵育用的细胞数目。
2.2文库与肝癌细胞孵育，筛选候选适配体。使用结合缓冲液溶解上述随机核酸文库，结合缓冲溶液用DPBS缓冲液配制，含5mM氯化镁，4.5g/L葡萄糖，0.1mg/mL酵母tRNA和1mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。95℃恒温振荡5分钟，迅速放入冰中然后与已经培养和预处理好的PLC8024细胞株在冰上孵育1小时。
2.3解离并洗脱结合的序列，孵育完成后倒出孵育培养瓶内的液体，用洗涤缓冲液(所述洗涤缓冲液用DPBS缓冲液配制，含5mM氯化镁和4.5g/L葡萄糖)洗涤孵育培养瓶中的细胞。用无DNase水刮取细胞沉淀，95℃加热细胞和DNA混合物10min，加热变性分离结合在细胞表面的适配体，13000rpm离心5min，收集上清即为筛选所得针对肝癌细胞的特异核酸适配体文库。
3.文库扩增：对文库进行PCR扩增，取100μL上述操作筛选所得的PLC8024细胞特异结合的DNA适配体，第一轮筛选后需将全部所得的与细胞特异结合的核酸适体文库预扩增16个循环，再进行本步骤的扩增，得到扩增产物。
4.将经PCR扩增得到的双链DNA酶解成单链DNA文库。
5.经过多轮正筛和负筛过程得到候选的适配体，其中，所述正筛过程的操作步骤如下：将所述步骤扩增产物的上清与CD133阳性的PLC8024细胞株孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正筛适配体组文库；
所述负筛过程的操作步骤如下：将上述正筛适配体组文库与CD133阴性的PLC8024细胞株孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的适配体组文库。
6.完成筛选流程后，对终产物进行TOPO-TA扩增后测序，对测序结果进行分析，得到一条高度富集的适配体：
5’-AGGAGGTTAGGGGTGGGTGGGTGGT-3’
7.适配体的特异性和临床意义的鉴定
7.1用原始DNA文库序列做阴性序列对照，合成带5’FAM荧光分子的适配体和对照适配体。
7.2在200μL结合缓冲液中用250nM的带荧光适配体和对照文库与3×105个PLC8024细胞孵育4℃，1h。
7.3孵育完成后用500μL洗脱缓冲液洗3次，每次5min，洗完后用500μL洗脱缓冲液重悬后，流式细胞仪测定细胞荧光强度。
7.4荧光显微镜观察适配体结合特异性，1.5×105个细胞种于直径为35mm的培养皿，生长24h，用洗脱缓冲液洗脱残余培养基后，用250nM荧光标记的适配体和对照文库溶解1mL结合缓冲液，4℃，孵育1h后，用荧光显微镜观察适配体结合情况，观察结果表明本发明序列的适配体对PLC8024细胞株具有极强的结合力。
7.5免疫组化
取肝癌病人的肿瘤及癌旁组织的石蜡块，切片经二甲苯脱蜡后，用梯度酒精(100％、95％、90％、80％和70％)水合处理，每个浓度处理5min，然后用DPBS溶液洗涤5min后，用95℃的0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸盐溶液处理样本20min以修复抗原，室温放置直至自然冷却。封闭液用结合缓冲液配制(添加20％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，0.1mg/mL的硅鱼精DNA)常温封闭1h，然后在200μL结合缓冲液中用250nM的FAM标记的适配体或对照文库避光冰上孵育30分钟，荧光显微镜观察荧光发光情况，通过观察发现本发明序列的适配体对肝癌组织具有良好的识别检测能力。
本发明中实验方法如无特殊说明均为常规方法，实验中所使用的材料如无特殊说明，则为常规生化试剂商店购买所得；本发明所用PLC8024肝癌细胞来源本实验所用所有细胞均来自华南肿瘤学国家重点实验室，其它细胞来源于American Tissue CultureCollection。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110>中山大学附属第五医院
<120>一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法与应用
<160> 5
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列（Artifical Sequence）
<400> 1
aggaggttaggggtgggtgggtggt 25
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列（Artifical Sequence）
<400> 2
accttggctgtcgtgttgt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列（Artifical Sequence）
<400> 3
aggtcagtggtcagagcgt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列（Artifical Sequence）
<400> 4
accttggctgtcgtgttgt 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列（Artifical Sequence）
<400> 5
acgctctgaccactgacct 19

Claims (8)

1.一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体，其特征在于：所述DNA适配体的核苷酸序列包括如Seq ID No.1所示的特征序列部分。
2.根据权利要求1所述的特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体，其特征在于：所述肝癌干细胞选自CD133表达的肝癌干细胞。
3.根据权利要求2所述的特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体，其特征在于：所述肝癌干细胞选自PLC8024肝癌细胞株。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的DNA适配体的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：利用核酸适配体体外筛选技术，以CD133阳性表达肝癌细胞株为正筛靶标，以CD133阴性表达肝癌干细胞株为负筛靶标，从体外合成的随机寡聚文库中筛选出与所述肝癌细胞株特异结合的核酸适配体。
5.根据权利要求4所述的DNA适配体的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法，具体包括以下步骤：
S1、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：
ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin-ACGCTCTGACCACTGACCT；
S2、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；
S3、正筛：将所述步骤S2得到的核酸适配体一级文库的上清与正筛靶标孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正筛适配体组文库；
S4、负筛：将所述步骤S3得到的正筛适配体组文库与负筛靶标孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的负筛适配体组文库；
S5、分析鉴定所述步骤S4所得到的负筛适配体组文库各序列的选择性、亲和力，最终得到带有如Seq ID No.1所示的特征序列的DNA适配体。
6.根据权利要求5所述的DNA适配体的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法，具体包括以下步骤：
S11、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：
ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin-ACGCTCTGACCACTGACCT；
S21、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；
S31、PCR扩增文库：将所述核酸适配体一级文库进行PCR扩增，得到扩增产物；
S41、正筛：将所述步骤S31得到的扩增产物的上清与CD133阳性的PLC8024细胞株孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正筛适配体组文库；
S51、负筛：将所述步骤S41得到的正筛适配体组文库与CD133阴性的PLC8024细胞株孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的适配体组文库；
S61、核酸适配体循环筛选：重复步骤S11～S51至少一次，以扩增产物代替随机文库，直到得到的适配体组文库的亲和力选择性不再上升；
S71、测序鉴定：克隆测序所述步骤S61得到的适配体组文库，分别鉴定各条序列的选择性和亲和力，最终得到带有如Seq ID No.1所示的特征序列的DNA适配体。
7.根据权利要求4-6任一项所述的DNA适配体的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法还包括筛选操作开始之前进行肝癌干细胞分选的步骤，具体为：用CD133抗体标记PLC8024肝癌细胞株后，用流式细胞仪分选得到CD133阳性的PLC8024肝癌干细胞作靶标。
8.一种将如权利求1-3任一项所述的DNA适配体应用于设计、制备抗肝癌的药物或检测试剂中。
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