CN114507668B

CN114507668B - 一种同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体及其应用

Info

Publication number: CN114507668B
Application number: CN202210207946.XA
Authority: CN
Inventors: 蒲颖; 印明柱; 陈翔
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2022-03-04
Filing date: 2022-03-04
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2042-03-04
Also published as: CN114507668A

Abstract

本发明公开了一种同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体及其应用，所述核酸适体PT‑2筛选自人甲状腺未分化癌CAL‑62和甲状腺乳头状腺癌TPC‑1，PT‑2核酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。本发明是通过活细胞筛选得到的，不仅能与人甲状腺未分化癌及甲状腺乳头状腺癌细胞系高亲和力结合，还能够与多种恶性程度较高的其他肿瘤细胞系具有高亲和力结合的核酸适体；核酸适体PT‑2无免疫原性、分子量小、易于修饰、取代和标记、能够体外化学合成；同时，核酸适体的序列稳定性良好，易于保存，方便标记；核酸适体合成成本较抗体低，周期短、重现性好；本发明可应用于人甲状腺未分化癌、甲状腺乳头状腺癌以及相关恶性肿瘤细胞的检测、并用于制备相关治疗药物。

Description

一种同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体及其应用

技术领域

本发明涉及一种同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体及其应用，属于分子诊疗领域。

背景技术

恶性肿瘤是现代社会威胁人类健康的最重大疾病之一。它对人类的健康和生命造成了极大的威胁，给患病家庭乃至整个社会带来了沉重的经济负担。世界卫生组织把恶性肿瘤的治疗列为人类健康事业的首要任务。以甲状腺癌为例，甲状腺癌(thyroidcarcinoma)是来源于甲状腺恶性肿瘤，大约占全身恶性肿瘤的1％。甲状腺乳头状癌是来源于甲状腺滤泡上皮细胞的分化型甲状腺癌，其是甲状腺恶性肿瘤中最常见的病理类型，虽然恶性程度较低，生长较为缓慢，但其发病率较高，占甲状腺总发病例数80％以上；而甲状腺癌发病率占比10％-15％的未分化癌是全身最致命的肿瘤之一，死亡率超过90％，占所有甲状腺癌死亡病例数一半以上，中位生存期仅6个月左右，早期可发生全身转移。甲状腺未分化癌(undifferentiated carcinoma，UTC)又称间变性癌(anaplastic carcinoma，ATC)或肉瘤样癌(sarcomatoid carcinoma)，多发生于老年人，女性患者占比60-70％。国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control,UICC)与美国癌症联合会(AmericanJoint Committee on Cancer,AJCC)将所有的ATC都分为IV。目前甲状腺癌的诊断主要依靠B超及细针穿刺活检，甲状腺乳头状癌的治疗主要为手术切除，而甲状腺未分化癌尚无有效治疗方法。

恶性肿瘤的灵敏诊断和精准靶向治疗是提高治疗效果的重要途径。实现灵敏诊断和靶向治疗的关键是需要有良好的分子探针作为工具。这些分子探针通过与肿瘤的分子标志物特异性结合，随后通过各种修饰方法将这些分子探针与信号分子、治疗药物进行恰当的连接，将信号分子/治疗药物靶向运载至肿瘤细胞，从而实现灵敏诊断和靶向治疗的目的。

指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX)是一种可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的单链寡核苷酸——核酸适体的技术。核酸适体又称为“化学抗体”，与目前常用的蛋白质分子探针相比，具有高亲和力、高特异性、稳定结合靶标、易合成、易修饰、易储存等优点。2006年时任美国佛罗里达大学教授的谭蔚泓院士率研究团队在SELEX基础上，创建了基于活细胞的SELEX技术(Cell-SELEX)。该技术以活细胞为靶标，从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到高亲和力、高特异性结合靶细胞的核酸适体。Cell-SELEX技术无须事先了解靶标的分子特征，在保持目标分子天然构象的同时，最大程度的保留了其生物功能。它在识别疾病细胞/组织与正常细胞/组织之间的分子差异、确定疾病相关生物标志物方面有着极大的优势。因此，Cell-SELEX技术是一种发现疾病特异性标志物的良好方法，而该技术所获得的核酸适体可作为疾病研究的分子探针和靶向治疗的载体。而且，目前国内外尚无特异性针对甲状腺未分化癌细胞的核酸适体报道，本申请填补了这一空白。

发明内容

本发明同时以人甲状腺未分化癌细胞系CAL-62和乳头状癌细胞系TPC-1为正细胞，以原代分离的甲状腺滤泡上皮细胞为负细胞，获得了一种高亲和力，并且能同时靶向包括甲状腺未分化癌、乳头状癌、三阴性乳腺癌、口腔鳞癌、口底鳞癌、结肠癌、卵巢癌、外阴鳞癌、肺癌在内的多种不同组织来源恶性肿瘤的核酸适体，即一种同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体及其应用。

本发明公开了的同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体，所述核酸适体同时识别包括甲状腺未分化癌与甲状腺乳头状癌在内的多种恶性肿瘤细胞系，命名为PT-2，PT-2核酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，具体为：

5'-ATCCAGAGTGACGCAGCACTGTGGCGTTACTTGAGTCCCTTCTTACAAGCCCTGGATTAGAGTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3'，其中第43位碱基“C”更换为“T”不影响序列的二级结构和结合特性。

优选的，所述核酸适体第43位碱基“C”可更换为“T”，更换后的核酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示。

优选的，所述序列任意一个位置连接或者多个位置同时连接有包括荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、酶标记和/或纳米材料等在内的修饰或改造。

优选的，所述核酸适体扩增用上游引物如序列表SEQ ID NO:2所示，下游引物如序列表SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述PT-2核酸序列包括以下二级结构中的任意一种或几种：

值得一提的是，本发明的二级结构仅为预测结构，本发明的核酸适体在4℃的环境下具有12个预测二级结构，37℃条件下也有不同的结构。在不同的预测软件中，预测结果也会存在少许偏差，因此，只要是与本发明的核酸适体序列相同的，不论二级结构如何，都应认为落入本发明的保护范围中。

同理，只要是与本发明的核酸适体序列相似度在90％以上的，可以与本发明的核酸适体有相同或极其相似的应用的，尽管可能有个别碱基的修改，对整体功能没影响的其他序列，也应该被认为落入本发明的保护范围中。

优选的，上述核酸适体在筛选时，所用核酸文库和引物的设计如下：

随机核酸文库(SEQ ID NO:1)：

5‘-ATCCAGAGTGACGCAGCA(N₄₄)TGGACACGGTGGCTTAGT-3’

上游引物(SEQ ID NO:2)：5‘-异硫氰酸荧光素-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’

下游引物(SEQ ID NO:3)：5‘-生物素-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’。其中N表示A、T、C、G随机任一碱基。

本发明还公开了一种采用上述核酸适体的应用，所述核酸适体在制备诊断和治疗人甲状腺未分化癌和甲状腺乳头状腺癌及相关肿瘤细胞及组织的各种制剂中的应用。可应用于人甲状腺未分化癌、甲状腺乳头状腺癌以及相关恶性肿瘤的检测、并用于制备相关治疗药物。检测方面包括但不限于特定细胞株的识别、肿瘤标志物的制备、检测试剂盒的制备、影像学检查等。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明不仅填补了目前无甲状腺未分化癌核酸适体报道的空白，又能同时针对多种不同的恶性肿瘤性疾病开展诊断及治疗的应用。未来，通过对该条核酸适体PT-2的性质表征和靶分子的鉴定，有助于探索和发现肿瘤性疾病中共同的肿瘤标志物。该核酸适体可作为分子探针用于多种肿瘤的诊断和靶向治疗。PT-2是通过活细胞筛选得到的，既能与人甲状腺未分化癌及甲状腺乳头状腺癌细胞高亲和力结合，又能够与多种不同组织来源的其他肿瘤细胞系具有高亲和力结合的核酸适体；无免疫原性、分子量小、在不同的部位易于修饰、取代和标记、能够体外化学合成。同时，核酸适体的序列稳定性良好，易于保存，方便标记。核酸适体合成成本较抗体低，周期短、重现性好。采用本发明进行相关肿瘤性疾病的细胞检测及制备治疗药物、检测试剂盒，操作简单、迅速。

附图说明

图1A和1B为核酸适体PT-2的预测二级结构的两种结构示意图；

图2为取筛选所得的核酸文库进行常规PCR扩增的扩增条件示意图；

图3为筛选的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4A为Cell-SELEX的实验流程图，图4B、C、D为筛选进程图；

图5A、B、C为通过分析高通量测序结果后，挑选出的序列PT-2与正负细胞结合的情况；

图6为使用乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶K或者胰酶处理后，PT-2与人甲状腺未分化癌细胞CAL-62的结合情况；

图7A为计算得到的PT-2与CAL-62的结合解离常数(K_d)；7B为PT-2与TPC-1的结合解离常数(K_d)；

图8A为PT-2在4℃情况下与人甲状腺未分化癌细胞CAL-62的结合共聚焦图片；8B为PT-2在37℃下与人甲状腺未分化癌细胞CAL-62的结合共聚焦图片；8C为PT-2在4℃下与人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1的结合共聚焦图片；8D为PT-2在37℃下与人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1的结合共聚焦图片；

图9为PT-2在4℃和37℃情况与人甲状腺未分化癌细胞CAL-62的结合流式位移对比图；

图10为PT-2与不同的细胞系结合情况的流式图；

图11为PT-2的活体小鼠成像图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体及其应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

本发明首次通过同时以人甲状腺未分化癌细胞系CAL-62和乳头状癌细胞系TPC-1为正细胞，以原代分离的甲状腺滤泡上皮细胞为负细胞，获得了一种高亲和力，并且不仅能结合人甲状腺未分化癌细胞、甲状腺乳头状癌细胞，而且能结合不同组织来源的多种恶性肿瘤细胞系的核酸适体PT-2。PT-2具有图1所示的预测二级结构，本发明的核酸适体在4℃的环境下具有12个预测二级结构，37℃条件下也有不同的结构。在不同的预测软件中，预测结果也会存在少许偏差，因此，只要是与本发明的核酸适体序列相同的，不论二级结构如何，都应认为落入本发明的保护范围中

本实验所用的细胞包括购于广州赛库生物技术有限公司的人甲状腺未分化癌细胞CAL-62，购于中乔新舟生物科技有限公司的人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1，以及购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司的人甲状腺滤泡上皮细胞TC。其他细胞均来源于中南大学湘雅医院中心实验室及皮肤科实验室。

实施例1：能同时识别人甲状腺未分化癌细胞和人甲状腺乳头状癌细胞的核酸适体筛选

1、所用核酸文库和引物的设计：

随机核酸文库(SEQ ID NO:1)：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA(N₄₄)TGGACACGGTGGCTTAGT-3’

上游引物(SEQ ID NO:2)：5’-异硫氰酸荧光素-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’

下游引物(SEQ ID NO:3)：5’-生物素-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’。其中N表示A、T、C、G随机任一碱基。

核酸适体PT-2的序列如下所示(SEQ ID NO:4)：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCACTGTGGCGTTACTTGAGTCCCTTCCTACAAGCCCTGGATTAGAGTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’，其中第43位碱基“C”更换为“T”不影响序列的二级结构和结合特性，更换后的序列表如SEQ ID NO:5所示。

2、所用试剂具体成分见表1。

表1、试剂配制

注意：缓冲液均至于4℃冰箱冷藏，其中洗涤缓冲液保存时间不超过1个月，结合缓冲液保存时间不超过1周。

3、所用细胞系及培养条件见表2。

表2、所用细胞系及培养条件

4、筛选

4.1正筛选

4.1.1孵育

用50μl双蒸水溶解10OD上述随机文库，95℃金属浴变性10min，迅速至于冰上10min，然后加入950μl结合缓冲液混匀。将CAL-62细胞预先接种在10cm直径的细胞培养皿中，常规培养至丰度95％左右，去除常规培养基后4℃洗涤缓冲液润洗3次，然后与上述预处理好的随机文库在4℃孵育1小时。

4.1.2解离

孵育完成后移除孵育培养皿中的溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次1min。弃去洗涤缓冲液后用1ml双蒸水刮取培养皿中所有细胞，并置于1.5ml离心管中，95℃金属浴变性10min，5500转每分转速离心后取上清，此即与CAL-62细胞结合的核酸序列，也是第一轮筛选所得的文库。

4.2PCR扩增文库

取筛选所得的核酸文库进行常规PCR扩增，引物序列如前所述，扩增条件如表3所示，扩增条件如图2所示。每轮筛选后，PCR扩增总共需要三轮，第一轮PCR固定扩增8个循环(X＝7)，然后以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR。第二轮PCR主要为了获得最优的扩增轮数，200μlPCR2混合物分成20μl每管，装入8个200μlPCR管中，延伸步骤分别扩增0，2，4，6，8，10，12，14个周期，然后进行最后一次延伸72℃5min。将第二轮扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(120V电泳45min)，然后在紫外成像仪下观察分析电泳条带。图3为某轮筛选的PCR2产物琼脂糖凝胶电泳图，图中标号为PCR循环相应轮数。从图3中可知：6轮的PCR效果最佳，因为其产物最多并且基本无杂带。第三轮PCR则使用第二轮PCR的成分和所得的最佳循环轮数进行扩增，扩增后所得的产物即为本轮筛选所得序列及其互补序列(双链DNA)PCR3。

表3、PCR成分列表

成分	PCR1(1000μl)	PCR2(200μl)	PCR3(1000μl)
				10XPCR Buffer	100	20	100
2.5mM dNTP	60	16	80
				引物Mix(5uM)	20	10	50
模板	200	20	100
				Taq热启动酶	5	1	5
双蒸水	615	133	665

4.3制备单链DNA序列

用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记PCR3扩增后产物，然后使用0.2M氢氧化钠使双链DNA序列变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的DNA单链文库，并用于下一轮筛选。

由于本发明使用两种细胞作为正细胞，因此下一轮筛选也为正筛选，但正细胞更换为TPC-1，其余步骤不变。

4.4负筛选

将上一轮筛选所得到的单链DNA文库用50μl双蒸水溶解，95℃金属浴变性10min，迅速至于冰上10min，然后加入950μl结合缓冲液混匀。首次加负筛选一般选择6cm直径的细胞培养皿来接种正负细胞，待细胞丰度长至95％左右用于筛选，以后随着筛选轮数的推进，逐渐增加负筛选的细胞量(使用更大的细胞培养皿接种负细胞用于筛选)以及负筛选的孵育时间，同时缩短正筛选的孵育时间。将准备好的单链DNA文库加入负细胞培养皿中4℃孵育，然后收集细胞孵育后的上清液，此即不与负细胞结合的核酸序列。然后将上清加入正细胞所在培养皿中重复步骤4.1～4.3。

以上所述筛选流程，如图4A所示。

4.5流式细胞技术检测文库富集情况

流式细胞技术是一种在功能水平上对单细胞或者粒子进行定量分析和分选的实验手段。它可以高速分析上万个细胞。流式细胞仪以激光作为发光源，被荧光染色标记的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的核酸适体与靶细胞结合后，携带荧光信号的靶细胞经过激光束后经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，从而检测到靶细胞所携带荧光信号的强度。

样本准备：正负细胞提前接种在培养皿种，待生长丰度达到95％左右用0.2％的EDTA室温消化3-4min，使用完全培养基吹打细胞制备程单个细胞悬液，再用洗涤缓冲液洗涤并计数细胞，每50万个细胞加入250nM 200μl(总量约50pmole)待测的各轮筛选富集的单链DNA文库，4℃孵育1小时后使用洗涤缓冲液洗涤2-3次，最后用使用200μl结合缓冲液重悬，上机检测。

另外准备相应的正负细胞与250nM未经筛选的随机文库作为对照。图4B、C、D为流式细胞技术检测各轮筛选产物与正负细胞结合的情况。可以看出随着筛选轮数的推进，各轮文库相较于未经过筛选的文库与正细胞结合程度越来越强，而在负细胞无明显变化。第7轮筛选产物与正细胞结合最强，而在负细胞无明显结合。

5、测序并鉴定与正细胞特异性结合能力最强且与负细胞不结合的序列

将筛选获得的最佳结合文库进行16S高通量测序，挑选富集程度较高的链，再利用流式细胞技术检测所挑选出的序列与靶细胞结合选择性和亲和性，从而确定核酸适体。检测结果显示图5A、5B中PT-2与CAL-62及TPC-1细胞结合能力最强，而与TC细胞基本不结合(如图5C所示)。

实施例2：鉴定核酸适体PT-2的靶标类型，并测定其与靶细胞结合的亲和力

1、PT-2靶标类型的初步鉴定

在与PT-2孵育前，CAL-62先分别用胰酶、蛋白酶K消化处理细胞，目的是破坏细胞膜蛋白质，倘若PT-2结合的靶标是膜蛋白，则蛋白酶K处理后的细胞不再与PT-2结合。如图6所示，胰酶的消化可以明显减弱PT-2与CAL-62的结合，而经蛋白酶K处理之后的CAL-62细胞不再与PT-2结合。因此初步推测PT-2的靶标为膜蛋白。

2、PT-2结合解离常数的测定

Cy5标记的核酸适体PT-2分别配制成终浓度500nM、400nM、300nM、250nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.563nM、0.781nM、0.391nM、0.195nM的结合溶液，分别与50万个靶细胞在4℃条件下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤两次，用流式细胞技术检测细胞表面的荧光强度，扣除相应浓度的随机文库荧光强度后，用公式Y＝BmaxX/(K_d+X)计算核酸适体的结合解离常数(结果如图7，7A为PT-2与CAL-62的K_d值曲线，7B为PT-2与TPC-1的K_d值曲线)，结果表明，PT-2与CAL-62及TPC-1的结合解离常数均在5nM左右。

实施例3：观察不同孵育温度对PT-2与靶细胞结合的影响

Cy5标记的核酸适体PT-2配制成终浓度250nM的结合溶液，提前24小时将靶细胞接种到直径35mm的玻璃底共聚焦培养皿中。分别在4℃及37℃与靶细胞孵育1小时，然后用4℃洗涤缓冲液洗涤三次，共聚焦显微镜下观察荧光信号的亚细胞定位。如图8A、B、C和D所示，结果发现在4℃情况下PT-2定位在CAL-62细胞及TPC-1细胞膜表面；在37℃情况下，PT-2进入到CAL-62细胞膜内，定位于胞质中。而对于TPC-1细胞，PT-2在4℃条件下定位于细胞表面，而37℃条件下则定位于细胞核膜周围并进入核内。

同样，Cy5标记的核酸适体PT-2配制成终浓度250nM的结合溶液，与50万个靶细胞分别在4℃与37℃条件下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤两次，用流式细胞技术检测细胞表面的荧光强度。发现与4℃相比，37℃时PT-2与靶细胞结合强度进一步增加(如图9所示)。PT-2与各个细胞的结合强度表如表4所示。

表4、PT-2与各个细胞的结合强度表

核酸适体与细胞间的结合程度根据核酸适体与细胞结合所得荧光信号平均值超出空白对照(DNA文库)所得荧光信号平均值的程度来计算：-,<10％；+,10-35％；++,35-60％；+++,60-85％；；++++,>85％

实施例4：观察PT-2与不同种属不同来源细胞的结合情况

Cy5标记的核酸适体PT-2配制成终浓度250nM的结合溶液，与验证细胞分别在4℃与37℃条件下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤两次，用流式细胞技术检测细胞表面的荧光强度。发现：1、PT-2完全不与所有鼠源性细胞结合；2、与原代分离的人正常KC、正常甲状腺上皮细胞、永生化的甲状腺上皮细胞、恶性程度较低的皮肤黑色素瘤原位癌WM35细胞均不结合；3、基本与所有甲状腺来源的恶性肿瘤都有一定程度的结合，除外甲状腺未分化癌KHM-5M(如图10所示)。这表明PT-2未来除外可以用于甲状腺肿瘤性疾病的诊断和治疗外，还可用于开发多种恶性肿瘤性疾病的诊疗产品。

实施例5：PT-2的活体成像

通过皮下注射的方式给裸鼠种植CAL-62细胞。4周大的雄性裸鼠购于中南大学湘雅三医院实验动物部，给每只裸鼠皮下种植1×10⁶个CAL-62细胞，30天后肿瘤长至直径1cm左右，建模完成。尾静脉注射Cy5标记的PT-2或随机对照文库4.5nmol，然后用小动物成像仪PerkinElmer Spectrum傅里叶红外光谱仪在注射后15min、30min、45min、60min拍摄荧光信号，拍摄时裸鼠使用异氟烷气麻镇静。小鼠置于活体成像仪中采集Cy5荧光，用640nm激发，采集695-770nm荧光信号。结果如图11所示，表明核酸适体PT-2在复杂环境中具有良好的识别能力。

本发明利用基于活细胞的核酸适体筛选技术(Cell-SELEX)，同时以人甲状腺未分化癌细胞系CAL-62以及人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1为正细胞进行筛选。所用的筛选初始文库总长度80个碱基，包括两端固定序列的18个碱基的引物序列和中间44个随机碱基。筛选过程中交替使用CAL-62和TPC-1作为正细胞，原代分离的正常人甲状腺上皮细胞作为负细胞，经过8轮筛选，富集到能同时结合包括甲状腺未分化癌细胞及乳头状癌细胞在内的多种恶性肿瘤细胞系。对所富集的序列进行16s测序，并对结果进行分析和比对，通过流式细胞术的验证，最终挑选出核酸适体PT-2。PT-2在体外与包括甲状腺未分化癌细胞及乳头状癌细胞在内的多种恶性肿瘤细胞系均表现出极高的亲和性，而不与原代分离的多种人源细胞和鼠源细胞结合。在激光共聚焦显微镜成像下，在37℃时PT-2能自动进入细胞内部，在TPC-1细胞中甚至能进入细胞核内。而且在成瘤的裸鼠活体成像实验中，尾静脉注射Cy-5标记的PT-2后，荧光信号能在肿瘤部位富集，表明PT-2在复杂的在体环境中仍能保持良好的识别能力。以上结果均说明核酸适体PT-2可以应用于多种肿瘤细胞系的检测，有望应用于后续寻找癌症靶标分子从而展开对疾病的机理研究及相关肿瘤性疾病的靶向诊疗中。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中南大学湘雅医院

<120> 一种同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(36)

<400> 1

atccagagtg acgcagcatg gacacggtgg cttagt 36

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(18)

<400> 2

atccagagtg acgcagca 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(18)

<400> 3

actaagccac cgtgtcca 18

<210> 4

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(82)

<400> 4

atccagagtg acgcagcact gtggcgttac ttgagtccct tcctacaagc cctggattag 60

agtgtggaca cggtggctta gt 82

<210> 5

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (1)..(82)

<400> 5

atccagagtg acgcagcact gtggcgttac ttgagtccct tcttacaagc cctggattag 60

agtgtggaca cggtggctta gt 82

Claims

1.一种同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体同时识别包括甲状腺未分化癌与甲状腺乳头状癌在内的多种恶性肿瘤细胞系，命名为PT-2，PT-2核酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体第43位碱基“C”可更换为“T”，更换后的核酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示。

3.根据权利要求1所述的同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体，其特征在于，所述序列任意一个位置连接或者多个位置同时连接有包括荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、酶标记和/或纳米材料在内的修饰或改造。

4.根据权利要求1所述的同时识别多种恶性肿瘤细胞的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体扩增用上游引物如序列表SEQ ID NO:2所示，下游引物如序列表SEQ ID NO:3所示。