CN102766634B - 一种靶向人高转移肝癌细胞的单链dna适配子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向人高转移肝癌细胞的ssDNA适配子及其应用，涉及肝癌转移复发的诊治领域，为肝癌转移复发的诊治提供了一种高效特异的靶向性新型分子。本发明应用消减cell-SELEX技术，以遗传背景相同但转移潜能有明显差异的两个肝癌细胞系MHCC97-L(低转移)和HCCLM9(高转移)分别为消减靶子和筛选靶子，筛选出能特异识别高转移潜能肝癌细胞HCCLM9的ssDNA适配子。该适配子是能特异结合人高转移肝癌细胞膜表面的单链DNA分子探针，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该适配子在制备诊断或治疗肝癌的试剂中可望发挥重要作用。

Description

一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子及其应用

技术领域

本发明涉及肝癌转移复发的诊断与治疗技术领域，具体涉及一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子及其应用，可用于肝癌转移复发的靶向诊疗。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，占全部恶性肿瘤的6%，中国是世界上肝癌死亡率最高的国家，占世界上肝癌总死亡人数的53%，在中国已成为恶性肿瘤第2位的死因。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究方面均取得了长足的进步，但总体而言，肝癌的预后并没有得到显著的改善，5年生存率仅为5%左右。目前，临床主要依靠定期复查甲胎蛋白AFP等血清学标志物和B超等影像学检查来发现术后的转移复发，但AFP阳性的肝癌只有70%-80%，B超无法发现小于1cm的肝癌，诊断均存在盲区，不能准确及时预测。因此进行筛选HCC转移相关的靶分子用来预测并干预转移复发的研究尤为重要。

近年来发展起来的SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）技术是九十年代发展起来的一种新的体外筛选技术，它运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲合力、特异性强的寡核苷酸适配子（aptamers），已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子和朊病毒等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲合性和特异性，具有良好的应用前景。

特异结合于肿瘤细胞的核酸适配子有利于肿瘤的诊断和治疗。抗体可以特异识别肿瘤细胞的标志物，但缺点是分子大且具有免疫原性。人源化抗体等抗体工程技术更具前景，但因易被肽酶降解和有免疫反应而导致应用受限。适配子出现十多年来，已可应用于酶链寡核苷酸实验、流式细胞仪、适配子芯片(aptamer chip)、蛋白定量及蛋白纯化等体外实验，同时具有可在体内抑制生长因子和受体的相互作用或抑制酶活性等功能，还可进行体内成像等。适配子可作为诊断和治疗试剂，用于诊断时可识别与结合特定靶分子，用于治疗时可作为功能阻断物质或者直接阻断疾病进程。适配子可以作为肿瘤发生和发展过程中具有重要功能的蛋白质的直接抑制剂。

然而到目前为止，还没有出现成功将SELEX筛选技术用于开发诊断及治疗肝癌转移复发的试剂的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种能特异性地、高亲和力地结合高转移潜能肝癌细胞HCCLM9（Wu et al.Journal of Experimental&Clinical CancerResearch 2010,29:17,http://www.jeccr.com/content/29/1/17）膜表面的单链DNA适配子；

本发明的第二个目的在于提供一种上述单链DNA适配子耦联荧光量子点形成的功能化生物分子探针，能识别组织切片中的肝癌细胞；

本发明的第三个目的在于提供一种上述单链DNA适配子耦联磁性颗粒的复合物，能捕获外周血模拟环境中的循环肝癌细胞；

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述单链DNA适配子或其衍生物在制备肝癌靶向诊断试剂中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述单链DNA适配子或其衍生物在制备靶向性抗肝癌转移复发药物或抗肝癌转移复发药物靶向输送载体中的应用。

为了实现上述诸目的，本发明采用了以下技术方案：

一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其筛选及初步的应用研究过程如下：

①随机ssDNA文库的构建和引物的合成

构建长度为76nt的随机文库，两端为固定序列，中间为40个核苷酸随机序列，库容量大约为10¹⁵-10¹⁶，根据随机ssDNA文库两端固定序列设计上下游引物。ssDNA文库的序列：5’-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-（N40）-TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3’，其中N代表A，T，C，G四个随机碱基；上游引物P1:5’-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3’；下游引物P2：5’-ACT AAG CCA CCG TGT CCA-3’；

②SELEX筛选过程

a：高转移潜能肝癌细胞HCCLM9（靶细胞）和低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L（消减细胞）的培养；b：消减细胞、靶细胞与ssDNA文库孵育；c：与靶细胞结合ssDNA的扩增；d：链酶亲和素磁珠法制备ssDNA文库；e：重复上述过程，共进行8-12轮筛选。

③流式细胞仪监测DNA适配子的各轮筛选富集情况:

a：制备FITC标记ssDNA；b：靶细胞的处理；c：靶细胞与FITC标记ssDNA孵育；d：流式细胞术检测，通过荧光强度值的大小比较富集的情况。

④克隆与测序

经多轮筛选得到的ssDNA用PCR扩增dsDNA，回收纯化连接T载体，经蓝白斑筛选，随机挑选多个克隆进行序列测定。

⑤DNA适配子一、二级结构分析和预测及同源序列分析

⑥流式细胞术检测DNA适配子与高转移潜能肝癌细胞HCCLM9（靶细胞）结合的亲和力解离常数Kd。

⑦DNA适配子特异性的鉴定

通过流式细胞术检测筛选得到的DNA适配子与高转移潜能肝癌细胞（HCCLM9）、低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L、HepG2细胞、Hu7细胞、乳腺癌细胞MDA-MB-231、肺癌细胞H1299、结肠癌细胞SW48、胃癌细胞MGC803、宫颈癌细胞HeLa、外周血白细胞WBC的亲合力以鉴定其特异性。

⑧通过荧光显微镜成像和流式荧光强度变化，初步分析ssDNA适配子与靶细胞的结合位点

用蛋白酶K处理靶细胞后，用FITC标记的ssDNA适配子与靶细胞作用后，上流式检测。初步分析用蛋白酶处理靶细胞后，适配子与靶细胞结合的能力是降低或是升高，从而判断ssDNA适配子是否与靶细胞表面的膜蛋白分子结合。

⑨应用量子点荧光成像初步分析ssDNA适配子作为分子探针识别组织切片中的肝癌细胞的能力

分别以培养的肝癌细胞、肝癌肺转移动物模型肝脏和肺脏组织切片、临床确诊的若干例肝癌组织切片为研究对象，以筛选出的核酸适配子为识别分子，用量子点作为标记物，采用间接荧光法，研究其对肝癌细胞的特异性识别。

⑩磁性颗粒与高亲和力特异结合靶细胞表面单链DNA适配子耦联，研究该复合物捕获外周血模拟环境中循环肿瘤细胞的效能

把不同数量（10⁵个、10⁴个、10³个、10²个）的肝癌细胞HCCLM9分别混匀到1mL健康人的外周血中，NH₄Cl法除去红细胞，然后与BIO标记的核酸适配子孵育；充分洗涤后，室温下与链酶亲和素磁珠孵育；在磁力架上充分洗涤后，铺在多聚赖氨酸处理的玻片上，固定后，以AFP抗体/CK19抗体/DAPI鉴定捕获的细胞。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

本发明以遗传背景相同但转移潜能有明显差异的两个肝癌细胞系MHCC97-L（低转移）和HCCLM9（高转移）分别为消减靶子和筛选靶子，采用消减cell-SELEX技术，筛选出了能特异识别高转移潜能肝癌细胞HCCLM9而不识别低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L的单链DNA适配子LY-1。

量子点耦联适配子LY-1的功能化生物分子探针，可识别体外培养的高转移肝癌细胞以及肝癌肺转移动物模型裸鼠肝脏和肺脏组织切片中高转移肝癌细胞。经临床验证发现，量子点耦联适配子LY-1的功能化生物分子探针可识别肝癌病人肝脏组织切片中的肝癌细胞，这为临床肝癌早期转移诊断提供了依据。

FITC标记的适配子LY-1在流式细胞仪上可识别出外周血模拟环境中高转移肝癌细胞，基于适配子LY-1耦联磁颗粒的复合物可捕获外周血模拟环境中的循环肝癌细胞。循环肝癌细胞可能是肝癌血行转移的基础，是导致术后复发转移的关键。本发明筛选出特异结合高转移潜能的肝癌细胞膜表面靶向核酸适配子分子，用来捕获、识别循环肝癌细胞，可解决因缺乏肝癌细胞表面特异性单克隆抗体而无法捕获、识别循环肝癌细胞的困扰。

附图说明

图1.1为第二轮筛选电泳图变化示意图。

A:第二轮单链扩双链电泳图，Lane1：18个循环的PCR产物；Lane2：18个循环阴性对照。

B:第二轮双链链扩双链电泳图，Lane1：12个循环的PCR产物；Lane2：14个循环的PCR产物；Lane3：16个循环的PCR产物；Lane4：18个循环的PCR产物；Lane5：20个循环的PCR产物；Lane6：12个循环仅细胞无文库的PCR产物；Lane7：14个循环仅细胞无文库的PCR产物；Lane8：16个循环仅细胞无文库的PCR产物；Lane9：18个循环仅细胞无文库的PCR产物；Lane10：20个循环仅细胞无文库的PCR产物。

图1.2为第八轮和第九轮筛选电泳图变化示意图。

A:第八轮单链扩双链和双链扩双链，Lane1：12个循环单链扩双链PCR产物；Lane2：阴性对照；Lane3：4个循环双链扩双链PCR产物；Lane4：6个循环双链扩双链PCR产物；Lane5：8个循环双链扩双链PCR产物；Lane6：10个循环双链扩双链PCR产物。

B:第九轮单链扩双链和双链扩双链，Lane1：8个循环单链扩双链PCR产物；Lane2：10个循环单链扩双链PCR产物；Lane3：阴性对照；Lane4：4个循环双链扩双链PCR产物；Lane5：6个循环双链扩双链PCR产物；Lane6：8个循环双链扩双链PCR产物；Lane7：10个循环双链扩双链PCR产物。

图1.3为第10轮单链扩双链电泳图变化示意图。

Lane1：10个循环单链扩双链PCR产物；Lane2：12个循环单链扩双链PCR产物；Lane3：14个循环单链扩双链PCR产物；Lane4：16个循环单链扩双链PCR产物；Lane5：阴性对照。

图2为流式细胞分析监测与细胞结合的文库富集情况示意图。

选取第3轮、5轮、7轮、9轮筛选的文库，采用FITC、BIO标记的引物扩增文库，链酶亲和素磁珠分离法制备ssDNA亚文库，600pmol亚文库分别与1x10⁶靶细胞HCCLM9、消减细胞MHCC97L冰上孵育30min，流式监测结合细胞荧光强度变化。

图3A-F为富集文库的测序结果示意图。

图3A:适配子LY-1序列及测序图；图3B:适配子LY-13序列及测序图；图3C:适配子LY-7/43序列及测序图；图3D:适配子LY-27/45序列及测序图；图3E:适配子LY-32序列及测序图；图3F:适配子LY-46序列及测序图。

图4为荧光显微镜和流式细胞仪鉴定ssDNA适配子与细胞的结合示意图。

图4.1：6条适配子与靶细胞结合的流式检测。

图4.2：6条适配子与靶细胞结合的荧光图。

图5为适配子LY-1结合细胞的特异性分析示意图。

包括：FITC标记的适配子LY-1与高转移肝癌细胞HCCLM9、低转移肝癌细胞MHCC97-L、肝癌Hu7细胞、肝癌HepG2细胞、肺癌H1299细胞、结肠癌SW48细胞、胃癌MGC803细胞、宫颈癌HeLa细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、外周血白细胞WBC结合流式检测图。

图6为适配子LY-1与靶细胞结合力常数分析示意图。

通过FITC-LY-1适配子在不同浓度下与HCCLM9结合后的平均荧光强度测定，利用prism软件拟合结合曲线，计算两者结合的平衡解离常数Kd值，约为Kd=167.3±30.2nM。

图7为适配子LY-1与细胞结合位点分析示意图。

A:高转移肝癌细胞HCCLM9经蛋白酶K作用后，细胞膜受到一定程度破坏，适配子LY-1结合的荧光强度减弱。

B:LY-1适配子与高转移肝癌细胞荧光成像图（40×）。

图8为量子点耦联适配子LY-1功能化生物分子探针可识别高转移肝癌细胞示意图。

A:量子点耦联适配子LY-1功能化生物分子探针可识别高转移肝癌细胞（20×）；

B:量子点耦联适配子LY-1功能化生物分子探针可识别高转移肝癌细胞（40×）。

图9为量子点耦联适配子LY-1的功能化生物分子探针识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肝脏组织切片中肝癌细胞示意图。

A:量子点耦联适配子LY-1的功能化生物分子探针识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肝脏组织切片中肝癌细胞，肝癌细胞膜表面被红色的量子点标记显色；

B:量子点耦联无关对照适配子的功能化生物分子探针不识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肝脏组织切片中肝癌细胞。

图10为量子点耦联适配子LY-1的功能化生物分子探针识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肺脏组织切片中肝癌细胞示意图。

A:量子点耦联适配子LY-1的功能化生物分子探针识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肺脏组织切片中肝癌细胞，高转移肝癌细胞膜表面被红色的量子点标记显色；

B:量子点耦联无关对照适配子的功能化生物分子探针不识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肺脏组织切片中肝癌细胞。

图11为量子点耦联适配子LY-1功能化生物分子探针识别肝癌病人组织切片中的高转移肝癌细胞示意图。

A:量子点耦联适配子LY-1的功能化生物分子探针识别肝癌病人肝脏组织切片中的肝癌细胞，肝癌细胞膜表面被红色的量子点标记显色；

B:量子点耦联无关对照适配子功能化生物分子探针不识别肝癌病人肝脏组织切片中的肝癌细胞。

图12为FITC标记的适配子LY-1在流式细胞仪上可识别出外周血模拟环境中高转移肝癌细胞示意图。

A:仅白细胞无高转移肝癌细胞，FITC标记的适配子LY-1在流式仪上不识别白细胞；

B:仅高转移肝癌细胞无白细胞，PE-CD45不识别高转移肝癌细胞；

C:10⁵个肝癌细胞混匀到1mL健康人的外周血中，FITC标记的适配子LY-1可识别出一定数量的外周血模拟环境中的肝癌细胞；

D:10⁴个肝癌细胞混匀到1mL健康人的外周血中，FITC标记的适配子LY-1可识别出一定数量的外周血模拟环境中的肝癌细胞；

E:10³个肝癌细胞混匀到1mL健康人的外周血中，FITC标记的适配子LY-1可识别出一定数量的外周血模拟环境中的肝癌细胞；

F:10²个肝癌细胞混匀到1mL健康人的外周血中，FITC标记的适配子LY-1能够识别较少量的外周血模拟环境中的肝癌细胞。

图13为适配子LY-1捕获外周血模拟环境中的肝癌细胞后经AFP抗体鉴定情况示意图。

A:基于适配子LY-1耦联磁颗粒的复合物捕获的外周血模拟环境中的循环肝癌细胞经AFP抗体鉴定成像图(20×)；

B:基于适配子LY-1耦联磁颗粒的复合物捕获的外周血模拟环境中的循环肝癌细胞经DAPI染料鉴定成像图(20×)；

C:基于适配子LY-1耦联磁颗粒的复合物捕获的外周血模拟环境中的循环肝癌细胞经AFP抗体鉴定成像图(40×)；

D:基于适配子LY-1耦联磁颗粒的复合物捕获的外周血模拟环境中的循环肝癌细胞经DAPI染料鉴定成像图(40×)。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明做进一步的阐述，便于本领域技术人员深入了解本发明；但以下内容不应以任何方式被理解为对本发明权利要求书请求保护范围的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。相应的结果见说明书附图，分析说明见附图说明。

实施例1.消减cell-SELEX筛选特异结合高转移肝癌细胞的核酸适配子

1.1高转移潜能肝癌细胞HCCLM9（靶细胞）和低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L（消减细胞）筛选前处理

采用无酶的细胞消化液处理生长状况良好的细胞，按5×10⁶个细胞接种于培养皿中，过夜培养，当细胞的融合率达到95%即可用于文库的筛选。

1.2第一轮细胞筛选

1.2.1选择细胞融合率95%的单层贴壁过夜生长的细胞HCCLM9作为筛选靶标，用台盼蓝鉴定其活性，用1×PBS-1mmol/LMgCl₂-0.1%BSA漂洗细胞2次；

1.2.2将随机ssDNA文库与靶细胞在冰上共孵育60min，使ssDNA文库与细胞充分作用；

1.2.3 1×PBS-1mmol/LMgCl₂-0.1%BSA洗涤缓冲液漂洗细胞；

1.2.4向单层细胞加入ddH₂O₂，室温下作用10min，用细胞刮匙反复刮，收集细胞裂解液，转入1.5mlEP管中，100℃水浴10min，12000rpm，10min，收集上清，上清中含有第一轮筛选结合的单链DNA，上清液作为模板可用于PCR扩增，制备下一轮筛选的亚文库。-80℃冻存备用。

1.3第一轮筛选后的单链DNA文库PCR扩增

1.3.1通过上、下游引物将单链DNA文库扩增为双链DNA文库，扩增条件为：

1.3.2在Taq DNA聚合酶的作用下，95℃预变性5分钟,再进行95℃，45s、56℃，45s，72℃，45s，共12个循环（扩增2+x个循环，选择最佳扩增循环数），72℃延伸8分钟；

1.3.3将扩增产物行3%的凝胶电泳鉴定；

1.3.4将鉴定正确的双链DNAPCR产物作为模板，行双链扩增双链，扩增条件为：

1.3.5在Taq DNA聚合酶的作用下，95℃预变性5分钟,再进行95℃，45s、60℃，45s，72℃，45s，共10个循环（扩增2+x个循环，选择最佳扩增循环数），72℃延伸8分钟；

1.3.6将PCR扩增产物行3%凝胶电泳鉴定。

1.4链霉亲和素磁珠法分离单链DNA制备第二轮筛选亚文库

1.4.1按下列条件大量扩增双链DNA以备制备单链

1.4.2采用链酶亲和素磁珠方法分离制备ssDNA

用1×PBS将链酶亲和素磁珠洗涤3次，PCR产物溶于ddH₂O₂中，与磁珠在室温下孵育20min，通过带生物素标记的一条链与链霉亲和素磁珠结合；1×PBS洗涤3次，加入0.15mol/L NaOH于室温下变性5min，与靶细胞结合的另一条链被游离出来；上磁力架，室温3min，吸取上清转入EP管中，加入一定体积的浓HCl中和，核酸定量仪测ssDNA浓度，用于下一轮筛选。

1.5筛选的第4轮引入消减细胞进行消减cell-SELEX筛选

1.5.1消减细胞对文库的消减

①将一定浓度的ssDNA文库溶解于合适体积的筛选结合缓冲液即1×PBS-1mmol/LMgCl₂-ytRNA-鲑鱼精DNA-0.1%BSA中，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却（第1轮筛选ssDNA文库的用量为10nmol，以后每轮筛选的投入量为3000pmol、1000pmol、800pmol、600pmol递减，为了适配子的更好获得，前3轮没有进行消减筛选）；

②约1×10⁷贴壁生长的消减细胞MHCC97-L，用1×PBS-1mmol/L MgCl₂-0.1%BSA洗涤缓冲液漂洗细胞2次，加入筛选文库，冰上孵育1h，小心收集结合后上清，获得与消减细胞结合的ssDNA文库即消减文库。

1.5.2靶细胞特异结合ssDNA适配子的筛选

①合适细胞密度(95%的融合率)的单层贴壁过夜生长的靶细胞HCCLM9，用1×PBS-1mmol/LMgCl₂-0.1%BSA漂洗细胞2次；

②将上述消减文库与靶细胞HCCLM9在冰上孵育30min~60min，使ssDNA文库与细胞充分作用；洗涤缓冲液漂洗细胞，为了获得较高亲和力和特异性的适配子，随着筛选轮数增加逐渐加强洗涤力度，洗涤次数从3次增加至5次，洗涤时间从3min增加至10min；

③向单层细胞加入ddH₂O₂，室温下作用10min，用细胞刮匙反复刮，收集细胞裂解液，转入1.5mlEP管中，100℃水浴10min，12000rpm，10min，收集上清，上清中含有与靶细胞结合的单链DNA，上清液作为模板可用于PCR扩增，制备下一轮筛选的亚文库。-80℃冻存备用。

1.6荧光显微镜鉴定及流式监测

1.6.1制备FITC标记的单链DNA用于流式或荧光显微镜监测各轮富集情况

双链扩双链PCR条件。

注意各轮的PCR循环数不一样，应遵循筛选时的循环数进行扩增制备FITC标记的单链DNA文库。

1.6.2采用生物素-链酶亲和素磁珠方法分离制备FITC标记ssDNA

链酶亲和素磁珠用1×PBS洗涤3次，PCR产物溶于ddH₂O₂中，与磁珠在室温下孵育20min，通过带生物素标记的一条链与链霉亲和素磁珠结合；PBS洗涤3次，加入0.15mol/L NaOH于室温下变性5min，与靶细胞结合的另一条链被游离出来；上磁力架，室温3min，吸取上清转入EP管中，加入一定体积的浓HCl中和，核酸定量仪测ssDNA浓度，用于流式或荧光显微镜监测各轮富集情况。

1.6.3流式监测富集情况的靶细胞处理

将过夜生长的靶细胞用不含胰酶的EDTA液消化，以免损伤细胞膜表面组分，影响核酸适配子与靶细胞的结合。计数板计数后，调整为1×10⁶，用适配子筛选结合液重悬细胞。

1.6.4靶细胞与FITC标记ssDNA孵育

文库与靶细胞HCCLM9在冰上孵育30min，使ssDNA文库与细胞充分作用；洗涤缓冲液漂洗细胞，加入450ul 1×PBS重悬细胞沉淀，上流式检测。

1.6.5荧光显微镜监测适配子与靶细胞结合情况

接种合适密度的消减细胞和靶细胞于共聚焦小皿中，贴壁过夜生长；用1×PBS轻轻漂洗2次；将各FITC标记的单链DNA文库，在适宜体积的结合缓冲液1×PBS-1mmol/LMgCl₂-0.1ytRNA-鲑鱼精DNA-0.1%BSA中，与细胞在冰上共孵育30min；1×PBS-1mmol/L MgCl₂-0.1%BSA轻漂洗细胞3次后；荧光显微镜下观察结合情况。

1.7感受态细胞的制备

挑取E.coli.DH5α单菌落于LB液体培养基中过夜培养，按1:100（v/v）接种于50ml LB培养基中，37℃振荡培养至OD值600约为0.4，将菌液冰浴15min，于4℃，4,000rpm离心10min，弃净上清；用20ml预冷0.1mol/L CaCl₂重悬菌体，冰浴15min，4℃，4,000rpm离心10min，弃上清；用2ml 0.1mol/L CaCl₂重悬菌体，分装贮存于-70℃备用。

1.8T载体克隆及测序

1.8.1反应体系如下：

1.8.2将10μl连接产物加入100μl冰浴的宿主菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克60sec，立即冰浴1min~2min；加入700μl不含抗生素的LB培养基，37℃缓慢振摇45min；取适量体积菌液涂布于LB/Amp/IPTG/X-gal平板上，37℃培养箱中倒置培养过夜。

1.8.3隔天挑取白色单克隆，进行菌落PCR鉴定。

1.8.4鉴定阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.9寡核苷酸适配子一级序列及二级结构分析

利用RNAstructure 4.5软件、DNAMAN软件和MEME在线软件。

http://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi进行。

1.10DNA适配子特异性的鉴定

通过流式细胞术检测筛选得到的DNA适配子与高转移潜能肝癌细胞HCCLM9、低转移潜能肝癌细胞MHCC97-L、HepG2细胞、Hu7细胞、乳腺癌细胞MDA-MB-231、肺癌细胞H1299、结肠癌细胞SW48、胃癌细胞MGC803、宫颈癌细胞HeLa、外周血白细胞WBC结合力以鉴定其特异性。

1.10.1分别制备合成FITC标记的待检测单链寡核苷酸适配子；

1.10.2用1×PBS洗涤单层培养靶细胞或消减细胞，尽可能完全去除瓶中液体，加入适量细胞无酶消化液使其覆盖细胞表面，37℃放置10min或适宜的时间，直到细胞完全脱壁，加入2~3倍体积1×PBS缓冲液终止反应。1,000rpm离心5min，弃上清，用1×PBS重悬细胞。

1.10.3约400pmol FITC-ssDNA分别与1×10⁶细胞在1×PBS-1mmol/L MgCl₂-lytRNA-鲑鱼精DNA-0.1%BSA缓冲液体系中于冰上孵育约30min；

1.10.4离心小心去上清，450μl 1×PBS轻柔重悬细胞；

1.10.5流式细胞仪检测，通过荧光强度值比较适配子的结合情况。

1.11初步分析筛选得到的ssDNA适配子与靶细胞的结合位点

分别用胰酶和蛋白酶K处理靶细胞后，用FITC标记的ssDNA适配子与靶细胞作用后，上流式检测。初步分析用蛋白酶处理靶细胞后，适配子与靶细胞结合的能力是降低或是升高，从而判断ssDNA适配子是否与靶细胞表面的膜蛋白分子结合。约1×10⁶的靶细胞HCCLM9经1×PBS洗涤后，与0.1mg/ml蛋白酶K于37℃作用8min，加入FBS终止蛋白酶作用，用结合缓冲液洗涤细胞后，经蛋白酶K处理后的细胞按上述骤进行流式和荧光的检测。

实验结果表明：经过10轮筛选，克隆、测序获取6条适配子。经流式、荧光法鉴定，有2条适配子与高转移肝癌细胞高亲和力结合，分别命名为LY-1、LY-13。体外合成LY-1适配子，经流式、荧光法鉴定发现该适配子特异结合高转移肝癌细胞HCCLM9，与低转移肝癌细胞MHCC97-L、HepG2、Hu7、乳腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞SW48、胃癌细胞、宫颈癌细胞HeLa、外周血白细胞WBC等均不结合。蛋白酶K消化细胞后经流式检测以及荧光法分析，LY-1适配子与高转移肝癌细胞结合位点在膜表面。

将实施例1筛选出的靶向人高转移肝癌细胞的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的ssDNA适配子LY-1做如下进一步的应用研究。

实施例2.基于量子点-适配子的功能化生物分子探针的肝癌细胞识别

2.1动物模型制作：

按本组方法制作人肝癌肺转移动物模型，简述如下：

2.1.1观察MHCC97-L和HCCLM9细胞生长良好，细胞融汇率达到80%，将其分别胰酶消化，置于15ml离心管内，4℃1000rpm×10min离心，弃上清，按5×10⁶/0.2mL剂量接种于裸鼠背部皮下，2w后皮下成瘤，直径约0.5cm左右。

2.1.2原位种植：同时切除MHCC97-L和HCCLM9裸鼠背部皮下瘤，分别置于加入1×PBS的培养皿中。肝内原位肿瘤接种，MHCC97-L和HCCLM9方法一致：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉成功后，裸鼠仰卧位，腹部75%酒精消毒2次。取左上腹横切口，长约1.5cm，逐层进入腹腔，暴露肝脏。用刀柄按下切口下缘，上缘轻轻施压，肝左叶即暴露出腹腔。用眼科镊在肝脏包膜下轻轻戳出一个小孔，生理盐水纱布按压片刻止血，将备好的肿瘤组织块塞入，瘤组织直径大小约2mm。将肝脏回纳入腹腔，6-0缝线间断缝合后关腹。术后观察切口无明显出血，回笼饲养。

2.1.3每组8只。6周后，裸鼠明显衰竭，解剖裸鼠，取肝脏肿瘤标本和肺脏于-80℃保存。

2.2石蜡组织标本切片制作

2.2.1洗片：使用前载破片应用清洁剂（重络酸钾：浓硫酸：蒸馏水＝1:1:10）浸泡超过24h，随后放入干净盆中，流水冲洗4h。在双蒸水中漂洗3次，浸泡于无水酒精中2h。烤箱烘干后备用。

2.2.2载玻片防脱片处理：将已经清洗的载玻片在含有2%APES的丙酮液中浸泡30s，晾干后放入纯丙酮溶液以洗去未结合APES，共2次，于通风处晾干备用。

2.2.3将石蜡标本连续切片，厚度4μm，在56℃恒温箱中将所用组织标本贴在载玻片上，随后60℃烤片1h。恒温37℃过夜。

2.3适配子识别组织切片肝癌细胞

2.3.1准备组织切片，37℃过夜烤片。

2.3.2于不同的器皿中二甲苯脱蜡3次，每次5min。

2.3.3水化，酒精浓度依次从高到低：无水酒精5min，95%酒精2min，95%2min，80%酒精2min。

2.3.4水洗4min后，浸泡纯水2min。

2.3.5 1×PBS冲洗3次，每次5min。

2.3.6配制抗原修复液，即：蒸馏水225ml+A液4.75ml（0.1M柠檬酸溶液：柠檬酸(C₆H₈O7.H₂O)21.01g，加蒸馏水至1000ml）+B液20.25ml（0.1M柠檬酸三钠溶液：柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇.H₂0)29.41g，加蒸馏水至1000ml）。配制完成后，把病理玻片放入配置好的抗原修复液中后一起放入微波炉，低火5min，中火10min，自然冷却，冲水3min，纯水浸泡2min。

2.3.7适配子封闭液（鲑精DNA/BSA/酵母tRNA)室温封闭60min。

2.3.8甩掉封闭液，直接加终浓度为600pM适配子结合液，4℃冰箱60min。

2.3.9PBS冲洗3次，每次3min。

2.3.10加入一定浓度链酶亲和素量子点(1:200)，室温下孵育30min。

2.3.11 1×PBS冲洗3次，每次3min。

2.3.12滴50%甘油，封片。

2.3.13在荧光显微镜下观察适配子结合情况。

2.4适配子识别外周血模拟环境中的肝癌细胞

2.4.1红细胞裂解

分别将10⁵个、10⁴个、10³个、10²个高转移肝癌细胞HCCLM9投入到1mL健康人的外周全血中，加入2倍体积的1×PBS，混匀，1500r/min，5min，去上清，加入红细胞裂解液NH₄Cl，室温下翻转孵育10min，1500r/min，5min，去上清；重复裂解残余红细胞一次，1500r/min，5min，去上清，加入10倍体积的1×PBS洗涤一次，去上清，加入适配子结合液1mL，混匀细胞沉淀。

2.4.2适配子与混合细胞孵育

加入一定浓度FAM标记的适配子，使其终浓度为500pM，冰上振荡孵育30min，使用冰冷PBS洗涤3次/5min，1500r/min，5min，最后一次去上清，细胞沉淀用450ul PBS重悬，上流式检测适配子识别外周血模拟环境中肝癌细胞。

2.5细胞爬片

2.5.1细胞培养  高转移肝癌细胞株HCCLM9培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃、5%CO₂/95%空气培养箱，隔天更换培养液。

2.5.2细胞培养玻片和培养皿的处理  将20mm×20mm盖玻片和直径9cm的玻璃培养皿用清水洗净，2%（w/v）盐酸溶液浸泡过夜，清水浸泡，用软毛刷轻轻刷洗，烘箱烘干，温度控制在50～70℃，放酸缸内经硫酸-重铬酸钾清洁液（浓硫酸100ml，重铬酸钾100g，蒸馏水1000ml）浸泡1～3天，自来水冲洗20次，蒸馏水洗涤10次，浸泡过夜，烘干后，干烤灭菌，温度控制在150～170℃，2h，备用。

2.5.3制备细胞爬片  将盖玻片平铺于培养皿上，每个培养皿铺4张盖玻片。用0.125%胰蛋白酶消化细胞，按2×10⁶个/每个培养皿接种，37℃，5%CO₂/95%空气，饱和湿度培养3d，细胞长满盖玻片。

2.6细胞量子点荧光法成像

2.6.1洗涤细胞爬片：PBS，洗涤2次，每次3min。

2.6.2加入终浓度500pM适配子结合液，冰上孵育30min。

2.6.3PBS冲洗3次，每次3min。

2.6.4加入一定浓度链酶亲和素量子点(1:200)，室温下孵育30min。

2.6.5PBS冲洗3次，每次3min。

2.6.6滴50%甘油，封片。

2.6.7在荧光显微镜下观察适配子结合情况。

2.7临床肝癌组织切片验证适配子识别肝癌细胞能力

2.7.1准备组织切片，37℃过夜烤片。

2.7.2于不同的器皿中二甲苯脱蜡3次，每次5min。

2.7.3水化，酒精浓度依次从高到低：无水酒精5min，95%酒精2min，95%2min，80%酒精2min。水洗4min后，浸泡纯水2min。

2.7.4PBS冲洗3次，每次5min。

2.7.5配制抗原修复液，即：蒸馏水225ml+A液4.75ml+B液20.25ml。配制完成后，把病理玻片放入配置好的抗原修复液中后一起放入微波炉，低火5min，中火10min，自然冷却，冲水3min，纯水浸泡2min。

2.7.6适配子封闭液（鲑精DNA/BSA/酵母tRNA)室温封闭60min。

2.7.7甩掉封闭液，直接加终浓度为500pM适配子结合液，4℃冰箱60min,

2.7.8PBS冲洗3次，每次3min。

2.7.9加入一定浓度链酶亲和素量子点，室温下孵育30min

2.7.10PBS冲洗3次，每次3min。

2.7.11滴50%甘油，封片

2.7.12在荧光显微镜下观察适配子结合情况。

实验结果表明：基于量子点-适配子的功能化生物分子探针不仅可识别体外培养的高转移肝癌细胞，而且还能够识别肝癌肺转移动物模型裸鼠肝脏和肺脏石蜡组织切片中的肝癌细胞。更为重要的是，基于量子点-适配子的功能化生物分子探针能够识别临床病理已确诊的肝癌组织切片的肝癌细胞。FITC标记的核酸适配子可识别外周血模拟环境中的肝癌细胞。

实施例3.外周血模拟环境循环肝癌细胞富集试验

3.1红细胞裂解

分别将10⁴个、10²个高转移肝癌细胞HCCLM9投入到1mL健康人的外周全血中,加入2倍体积的PBS，混匀，1500r/min，5min，去上清，加入红细胞裂解液NH₄Cl，室温下翻转孵育10min，1500r/min，5min，去上清；重复裂解残余红细胞一次，1500r/min，5min，去上清，加入10倍体积的PBS洗涤一次，去上清，加入适配子结合液1mL，混匀细胞沉淀。

3.2适配子与混合细胞孵育

加入一定浓度适配子，使其终浓度为500pM，冰上振荡孵育30min，使用冰冷PBS洗涤3次/5min，1500r/min，5min，最后一次去上清，细胞沉淀备用。

3.3磁颗粒准备

3.3.1轻轻摇晃装磁珠小瓶，悬浮磁珠，获得均匀一致的悬浮液。

3.3.2根据需要，转移适当量磁珠悬浮液到备用管中。

3.3.3将管子放在磁力架1-2分钟，在分离过程，不要将管子从磁力架上拿下来。

3.3.4用移液器将管中上清移去（此时管置于磁力架上），避免移液器枪头触及管内壁（因磁珠附着于管内壁）。

3.3.5从磁力架上取下管子，加入洗涤缓冲液（5mM Tris-HCl(pH75),05mMEDTA,1M NaCl），让缓冲液沿管内壁（磁珠积聚处）留下并轻轻悬浮，缓冲液用量与磁珠悬浮液等体积。

3.3.6重复洗一次（步骤3.3.3-3.3.5），然后放入适当体积缓冲液配制磁珠工作液。

3.4磁颗粒-适配子复合物富集循环肝癌细胞

3.4.1用缓冲液悬浮磁珠，使终浓度为5ug/ul，或实验应用的适宜浓度。

3.4.2加等体积的PBS重悬细胞沉淀,缓冲液中NaCl浓度是2M，在混合物中NaCl浓度应为1M。

3.4.3室温下放置，轻轻旋转或时而轻敲离心管混合，室温下孵育20min

3.4.4磁珠此时被覆了生物素化的适配子-细胞，用磁力架分离磁珠。将离心管放在磁力架上1-2分钟。

3.4.5用1×PBS洗2-3次，用磁力架吸附磁珠以利于洗涤。

3.4.6悬浮磁珠，稀释至所需浓度。

3.5富集的循环肝癌细胞鉴定

3.5.1取一定量的磁颗粒细胞混合液滴在预先用多聚甲醛处理的玻片上，铺平液体，室温下静止30min，用PBS洗去未粘附在玻片上的细胞。

3.5.2固定细胞：固定液为-20℃甲醇，每张玻片3～5ml，去除多余PBS后，固定15min。

3.5.3洗涤玻片：同步骤1，洗涤3次，每次3min。

3.5.4封闭：封闭液为含有1%（wt/vol）牛血清白蛋白和0.1%（vol/vol）TritonX-100的PBS。封闭条件为：去除多余PBS后，湿盒孵育，37℃，20～30min。

3.5.5加一抗：去除多余封闭液后，滴加小鼠抗人AFP单克隆抗体、兔抗人CK19抗体，4℃冰箱过夜。

3.5.6洗涤玻片：清洗液为含0.5%（vol/vol）Tween#20的PBS，洗涤3次，每次3min。

3.5.7加荧光标记的二抗：去除多余PBS后，滴加荧光标记的二抗，稀释液为含5%（wt/vol）牛血清白蛋白的PBS，稀释后IgG浓度为10μg/ml。湿盒，室温20-25℃避光孵育1h。

3.5.8洗涤玻片：清洗液为含0.5%（vol/vol）Tween#20的PBS，避光洗涤3次，每次3min。

3.5.9细胞核复染：去除多余PBS后，滴加4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），稀释液为含5%（wt/vol）牛血清白蛋白的PBS，稀释后浓度为2μg/ml。湿盒，室温20-25℃避光染色15～20min。

3.5.10洗涤玻片：清洗液为含0.5%（vol/vol）Tween#20的PBS，避光洗涤3次，每次3min，缓冲甘油封片，4℃避光保存。

实验结果表明：基于适配子LY-1耦联磁颗粒的复合物可捕获外周血模拟环境中的循环肝癌细胞。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉大学

 

<120>  一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子及其应用

 

<130>  一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子及其应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  74

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atccagagtg acgcagcatt gggtgttagg ctggtcttaa tcgggtcggg ttgctgtgga     60

 

cacggtggct tagt                                                       74

 

 

<210>  2

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ttgggtgtta ggctggtctt aatcgggtcg ggttgctg                             38

 

Claims (6)

1.一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述单链DNA适配子在制备高转移潜能肝癌细胞HCCLM9诊断试剂中的应用。

3.含有权利要求1所述单链DNA适配子的高转移潜能肝癌细胞HCCLM9诊断试剂。

4.权利要求1所述单链DNA适配子在制备靶向抗高转移潜能肝癌细胞HCCLM9转移复发药物中的应用。

5.权利要求1所述单链DNA适配子在制备抗高转移潜能肝癌细胞HCCLM9转移复发药物的靶向输送载体中的应用。

6.一种靶向抗高转移潜能肝癌细胞HCCLM9转移复发药物，其中含有权利要求1所述的单链DNA适配子。

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