KR101612272B1

KR101612272B1 - 신경교종 줄기세포 검출용 펩타이드

Info

Publication number: KR101612272B1
Application number: KR1020150087689A
Authority: KR
Inventors: 윤문영; 조준행; 이상춘; 문지영
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-20
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2016-04-15
Anticipated expiration: 2035-06-19
Also published as: KR20150146444A

Abstract

본 발명은 신경교종(glioma) 줄기세포를 특이적으로 검출할 수 있는 탐침으로서의 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드를 사용함으로써, 신경교종 줄기세포를 특이적으로 검출할 수 있고, 신경교종을 진단할 수 있다.

Description

신경교종 줄기세포 검출용 펩타이드{Peptide for Detection of Glioma Stem Cell}

본 발명은 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 펩타이드에 관한 것이다.

최근 10년간 암의 진단과 치료에 있어 큰 기술적 진보가 있었지만, 암으로 인한 치사율을 아직도 높은 편이다. 현재 항암 치료에 있어 가장 큰 문제점은 항암치료에 저항성을 가진 암세포가 지속적으로 남아있어, 암의 재발이 나타나는 것이다.

뇌종양은 가장 높은 치사율을 보이는 암 중 하나이며, 조직학적 특성과 특정 표시 인자 등을 통해 4단계로 나뉜다. 가장 악성인 다형교모세포종(glioblastoma multiforme)의 경우 가장 빈번하게 나타나는 악성 뇌종양으로 방사선 및 항암치료에 저항성을 보여, 치료를 병행하여도 평균 생존 기간이 14.6달에 불과하다.

최근 신경 교종(glioma) 내에 줄기세포와 유사한 특성을 지니는 세포들이 소수 존재하고 있다고 보고되었다. 뇌종양 줄기세포(brain cancer stem cell)라 불리는 이 세포들이 암의 생성, 진행 및 재발의 원인 세포로 인식됨에 따라, 뇌종양 줄기세포 특이적 치료제 개발의 필요성이 대두되고 있다.

종양 줄기세포는 정상 줄기세포처럼 자가 재생(self-renewal), 증식 능력(proliferative capacity) 및 다분화능(multi-differentiation)을 지닌다. 또한 CD133과 같이 기존에 줄기 세포의 표시 인자로 알려진 다수의 표시 인자가 종양 줄기세포에서도 발현되는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신경교종(glioma) 줄기세포를 특이적으로 검출할 수 있는 탐침으로서의 펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 신경교종 줄기세포에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 존재를 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 펩타이드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CD133 표적용 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신경교종 줄기세포 검출용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신경교종 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1 서열의 아미노산 서열로 이루어지는 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 신경교종(glioma) 줄기세포를 특이적으로 검출할 수 있는 탐침으로서의 펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 신경교종 줄기세포에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 존재를 규명하였다.

본 발명의 서열목적 제1 서열의 아미노산 서열은 M13 페이지 펩타이드 라이브러리(12개의 아미노산 서열을 가지도록 제작된 펩타이드 라이브러리-Ph.D^TM phage display peptide lirary kit, New England Biolabs(NEB), 약 2.7 × 10⁹개의 아미노산 서열을 지님)를 이용하여 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133에 결합하는 서열을 찾아낸 것이다. 본 발명의 펩타이드는 저분자 펩타이드로서 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif,1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990. 본 발명의 펩타이드는 N-말단의 아미노 말단의 반응성 제거를 위한 공지된 변성이 가능하고, 예를 들어 아세틸화(Acetylation)가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 펩타이드가 암 세포 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 링크는 본 발명의 펩타이드와 검출가능한 표지 사이에 직접 형성되는 것도 가능하지만, 링크를 통해서도 형성 가능하다. 상기 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용 가능하며, 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션에 적용될 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재.

상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예:124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots))등 일 수 있다.

유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.

만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 신경교종을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 투여하게되면 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 신경교종으로 진단된다.

본 발명인 펩타이드의 타겟인 "CD133"은 세포 외막에 존재하며, 세포가 성장해 나갈 때 발현이 유도되는 단백질로 알려져 있는 CD(Cluster of Differentiation) 계열 단백질이다. 악성 뇌종양인 신경교종의 암 줄기세포의 표지마커로 알려져 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1 서열의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 본 발명인 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 펩타이드의 변화를 가져올 수도 있다. 본 발명인 펩타이드의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 펩타이드와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

펩타이드의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 펩타이드 또는 상기 펩타이드 코딩용 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1 서열의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19 및 pET 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 퍼옥시레독신를 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질 전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정하게 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110와 같은 E.coli 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 알파-튜불린 합성 억제용 펩타이드를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1 서열로 이루어지는 펩타이드를 포함하는 신경교종 줄기세포 검출용 키트를 제공한다. 본 발명인 키트에 포함되는 펩타이드는 서열번호 제1 서열의 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산분자를 포함할 수 있으며, 앞서 기재한 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 본 발명의 키트에는 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃ 유지된 상태로 제공될 수 있다. 본 발명인 신경교종 줄기세포 검출용 키트는 본 발명의 다른 양태인 서열목록 제1 서열로 이루어지는 펩타이드를 포함하는 검출용 키트에 관한 것인바, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지된다. 본 구현예에 대하여도 이미 본 발명의 다른 양태인 서열목록 제1 서열로 이루어지는 펩타이드에 대한 내용에서 상술한 바 있으므로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1 서열로 이루어지는 펩타이드를 포함하는 신경교종 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

신경교종 세포 조직에 결합한 본 발명의 펩타이드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 키트에 포함되는 펩타이드는 상기에서 기재한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 신경교종 진단용 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 암 유발 부위, 특히 신경교종 세포와 결합여부 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 진단은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 본 발명의 진단을 실시할 수 있다. 예를 들어, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay)는 ELONA(enzyme-linked oligonucleotide assay)로 조금 변형하여 실시된다.

본 발명의 진단용 키트에는 상술한 신경교종 줄기세포 검출용 키트와 마찬가지로 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃ 유지된 상태로 제공될 수 있다.

또한 본 발명인 진단용 키트의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 대상 세포를 접종하여 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 신경교종 세포와 펩타이드의 결합을 관찰하여 암을 진단할 수 있다.

본 발명인 신경교종 진단용 키트는 본 발명의 다른 양태인 서열목록 제1 서열로 이루어지는 펩타이드를 포함하는 진단용 키트에 관한 것인바, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 펩타이드를 제공한다.

(b) 본 발명은 CD133 표적용 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

(c) 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

(d) 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

(e) 본 발명은 신경교종 줄기세포 검출용 키트를 제공한다.

(f) 본 발명은 신경교종 진단용 키트를 제공한다.

(g) 본 발명을 이용하면 신경교종 줄기세포 특이적 검출이 가능하다.

(h) 본 발명을 이용하면 신경교종의 효과적이고 안전한 진단이 가능하다.

(i) 본 발명의 펩타이드는 대량 생산, 보관 및 취급이 용이하다.

도 1은 뇌 신경교종 줄기세포 표지마커 CD133 ECD 의 유전자 클로닝 결과를 나타낸다. 도 1의 (a)에서 P는 CD133 ECD gene을 나타내고, 도 1의 (b)에서 P1과 P2는 발현벡터 pET-28a 에 CD133 유전자 삽입 하여 이를 확인하기 위해 제한효소를 처리하기 전(P1)과 처리 후(P2)를 나타낸다. CD133 ECD를 코딩하는 유전자 873bp 가 발현벡터에 올바르게 삽입되어 있음을 확인하였다. 도 1의 M은 분자량 마커를 나타낸다.
도 2는 뇌 신경교종 줄기세포 표지마커 CD133 ECD의 단백질 발현 능력 및 단백질 정제를 나타낸다. 도 2의 (a)에서 B.I(before induction)는 IPTG를 넣기 전, O/N(overnight incubation)은 18℃에서 과발현 시킨 상태의 단백질을 나타낸다. 도 2의 (a)를 통해 발현된 단백질의 수용성(Sol, soluble form protein)과 불용성(InS, insoluble form of protein)의 비율을 알 수 있다. CD133 단백질이 불용성 형태로 발현되는 것을 확인 하였다. 도 2의 (b)는 불용성 단백질 형태로 발현된 CD133를 정제 해내기 위해 변성 조건(denature condition) 정제법을 수행하여, 친화성 크로마토그래피를 통해 CD133 단백질을 선별한 것을 나타낸다. F3-F11은 친화성 크로마토그래피를 통해 모아진 단백질을 나타낸다.
도 3은 CD133 단백질과 결합하는 페이지 펩타이드를 스크리닝하기 위한 M13 페이지 스크리닝의 계획도를 나타낸다. 플레이트의 각 웰에 CD133 을 고정시키고(도 3의 (1)), M13 페이지 표면에 12개의 아미노산으로 구성된 펩타이드들이 발현된 페이지 라이브러리를 첨가한 후(도 3의 (2)), 이에 다양한 세척 조건과 결합 시간을 적용시키면 CD133 단백질에 극한 조건에서도 결합하는 페이지 펩타이드가 웰 에 남는다(도 3의 (3)). 마지막으로 이를 추출해 내면 CD133 단백질에 특이적으로 결합하는 페이지 펩타이드만이 최종적으로 확보 된다(도 3의 (4)). 도 3에서 (1)-(4)까지를 한 라운드(round)라고 보고, 상기와 같은 과정을 반복하는 것을 바이오 패닝(biopanning)이라 칭한다. 본 발명자들은 3 라운드의 바이오 패닝을 실시하였다.
도 4는 CD133 촉매도메인 단백질에 대하여 높은 특이성 및 결합력을 페이지 펩타이드를 검출하기 위한 각 라운드(round)의 바이오 패닝 조건을 나타낸다. 각 라운드 당 NaCl과 Tween-20의 비율을 높여주는 반면 페이지 펩타이드 결합시간은 짧게 하여 극한 조건에서도 CD133 단백질에 결합하는 페이지 펩타이드를 검출해 내었다.
도 5는 CD133 단백질에 결합하는 총 35개의 페이지 플라그를 확보한 결과를 나타낸다. 35개의 페이지 플라그는 4종류의 서로 다른 서열의 펩타이드로 분류되었다.
도 6은 CD133 단백질에 결합하는 총 35개의 페이지 플라그 확보: 35개의 페이지 플라그는 4종류의 서로 다른 서열의 펩타이드로 분류되었다. 네 개의 펩타이드 모두 picomolarity 수준으로 CD133 단백질에 효과적으로 결합하는 것을 확인하였다.
도 7은 CD133 단백질에 결합하는 페이지 중, 이차적으로 선별된 펩타이드 서열을 형광 프로브와 합성하였으며, CD133 단백질과 결합력 측정을 수행한 결과를 나타낸다. CD133-GCGK-FITC는 대상물질과 나노몰(nM) 수준의 강한 결합을 이루는 것을 확인하였다.
도 8은 CD133을 발현하는 U87 세포에 대한 선별 펩타이드 서열의 결합력을 분석한 결과를 나타낸다. CD133 항체(antibody)-PE, sc-펩타이드 및 선별된 펩타이드를 이용하여 결합력을 측정한 결과 선별된 펩타이드가 특이적으로 CD133에 강한 결합력으로 결합하는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: CD133 세포 외부 도메인(ECD) 유전자 클로닝

우선 CD133 단백질을 E.coli 상에서 발현시키고 대량생산 및 분리를 위하여 CD133 유전자를 다음과 같이 PCR을 통하여 증폭하였다: CD133 센스 프라이머는 5'- ATAT GGATCC(BamH1) ATGGCTCTTGTCTTCAGTGCCCTGCTGTTACT-3' 를, CD133 안티센스 프라이머는 5'-ATAT GCGGCC(Not1) GCTCAGTATCGAGACGGGTCGTCGTATACATCCTCTGA-3' 를 사용하였다. 상기 합성 프라이머 및 주형(template) DNA를 포함하는 5 % DMSO가 함유된 반응 용액에서, 전변성(pre-denaturation) 95℃ 1분, 변성(denaturation) 94℃ 30초, 어닐링(annealing) 70℃ 45초, 신장(extension) 72℃ 2분 45초를 1 사이클로 하여, 20 사이클의 PCR 반응 후 얻은 주형 DNA를 유전자 염기서열을 통해 확인하였다(참조: 도1). 이 증폭된 유전자를 각각의 제한효소로 (BamH1, Not1) 잘라 박테리아 발현벡터인 pET-28a(+)에 삽입하여 제조사의 매뉴얼에 따라 클로닝한 뒤 이 발현 벡터를 발현숙주인 단백질 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환시킨 뒤, 0.5 mM IPTG, 18℃ 조건하에서 12시간 동안 CD133 단백질의 생산을 유도하였다. 상기 형질전환 방법을 간략하게 기재하면 다음과 같다: 우선 DNA 5 ㎕를 경쟁세포(competent cell) 100 ㎕에 넣고 잘 섞어 준 뒤 얼음에 30분간 놓아 두었다. 그 다음엔 42℃에서 90초간 열 충격을 가하였다. 오염을 방지하기 위해서, 우선 알콜 램프를 켜놓은 뒤에, LB 배지 800 ㎕을 넣고 37℃에서 45분간 인큐베이션 시켰다. 마지막으로 LBA 플레이트에 도포시켜주고, 37℃ 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션 하였다.

실시예 2: CD133 세포 외부 도메인(ECD) 대량 생산 및 분리법

CD133 유전자를 PCR을 통하여 증폭하여 이를 박테리아 발현벡터인 pET-28a에 삽입한 뒤 이렇게 클로닝한 CD133 발현 플라스미드를 발현숙주인 BL21(DE3)에 형질전환 시켜 0.5 mM IPTG, 18℃ 조건하에서 CD133 생산을 유도하였다. 그리고 박테리아 세포를 원심분리를 통하여 수획하여 단백질의 용해도를 조사하여 본 결과 대부분의 단백질이 불용성(insoluble)임을 확인할 수 있었다(참조: 도 2). 따라서 이렇게 불용성인 단백질을 획득하기 위해 변성(Denature) 조건에서 단백질을 분리 및 정제 하였다.

박테리아 세포를 원심분리를 통하여 획득하여 단백질의 용해도를 조사하여 본 결과 대부분의 단백질이 불용성(insoluble)임을 확인 할 수 있었다. 따라서 CD133 분리정제를 위하여 세포 내 불용성 단백질만을 얻어낸 뒤 이를 변성 조건 (6M 구아니듐-HCl)에서 용해시킨 뒤 Ni-세파로오스 컬럼을 통과시켜 CD133 단백질을 결합시킨 뒤에 변성(denature) 된 CD133 을 리폴딩(refolding) 시키기 위하여 컬럼에 결합된 상태로 선형 구배(linear gradient)(요소(Urea)의 농도를 감소시키는)를 통하여 서서히 변성(denature)을 제거 시켜가며 CD133 을 리폴딩(refolding) 시키고 500 mM 이미다졸 선형 구배 하에서 일루션한다. 얻어낸 단백질은 다이알리시스 버퍼(50 mM Tris, 2 mM β-머캅토에탄올, pH 7.4) 용액에서 투석하여 과량의 이미다졸을 제거 하였고, 이를 통해 얻은 단백질을 정제도를 SDS/PAGE를 통하여 확인하였으며(참조: 도 2) 브래드포드 시약을 이용하여 양을 확인한 결과 0.6 mg/L 배양물을 얻을 수 있었다.

실시예 3: M13 파지 펩타이드 라이브러리 스크리닝 - 파지 디스플레이

파지 디스플레이는 상기 실시예 1에서 얻은 단백질을 96-웰 플레이트에 고정시키는 단계에서부터 시작된다. 여기서 사용된 96-웰 플레이트는 표면에 폴리스티렌(polystyrene) 재질로 되어 있는 폴리스티렌 플레이트(SPR)를 사용하였는데 이것은 단백질과 플레이트 표면사이의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 이용하여 단백질을 안정적으로 고정시킴으로써 파지디스플레이의 효율을 높이는 역할을 한다. 이렇게 고정된 단백질에 랜덤 펩타이드 라이브러리(12개의 아미노산으로 구성된 무작위 배열을 통하여 27 억개의 다양한 아미노산 서열을 가지도록 제작된 펩타이드 라이브러리-Ph.D^TM(phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB)를 구입하여 사용함)를 넣어줌으로써 단백질과 펩타이드의 상호작용을 유도하여 단백질과 좋은 결합력을 가지는 특정 펩타이드 만을 선별 해 낼 수 있도록 파지 디스플레이 방법을 디자인 하였다. 상기 방법을 도 3에 나타내었다.

구체적으로, 도 3에서는 CD133 단백질과 결합하는 펩타이드를 스크리닝 하기 위하여, CD133 단백질을 플레이트(SPL) 표면에 고정 시킨 후, M13 파지 펩타이드 라이브러리(약 27억 개의 서로 다른 아미노산 서열을 지닌 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드가 M13 파지 gp3 minor coat 단백질에 융합된 라이브러리)를 넣어 결합을 유도하였다. 이후, 다양한 결합 시간 및 세척조건을 통하여 높은 친화력으로 결합하는 펩타이드 발현 파지를 선별하였다. 이와 관련한 스크리닝 계획 및 반응조건들을 각각 도 3 및 도 4(스크리닝 컨디션) 에 나타내었다. 구체적으로, 도 3은 CD133 단백질과 결합하는 펩타이드 스크리닝을 위한 M13 파지스크리닝의 계획도로서, (1) 96-웰 플레이트의(SPL) 표면에 CD133 단백질을 고정시키고, (2) M13 파지 표면에 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드 라이브러리가 발현된 파지 라이브러리를 CD133 단백질과 결합시킨 뒤에, (3) 이를 다양한 조건으로 세척한 후, (4) 최종적으로 결합된 파지를 화학적 용출 혹은 경쟁적 용출을 통하여 얻었다. 상기와 같이 얻어진 파지를 대장균(ER2738)에 감염시켜 증폭시키고, 증폭된 파지를 다시 CD133 단백질과 결합시킨 후, 세척조건의 강도조절 및 짧은 반응 시간 등의 조건으로 반복시킴으로써 보다 강한 결합력을 갖는 파지를 찾는 과정을 반복하였다. 이러한 일련의 과정을 바이오패닝이라 명명한다(바이오패닝, Biopanning). 도 4는 CD133 단백질에 대하여 높은 특이성 및 결합력을 가진 펩타이드가 발현된 파지를 검출하기 위한 총 3 단계의 바이오 패닝 조건을 도표로 나타낸 것이다. 각각의 단계마다 강한 세척조건, 짧은 반응 시간으로 반응 조건을 다양하게 변화시켰으며, 총3 회의 바이오 패닝을 실시하여 CD133 단백질에 결합하는 펩타이드를 가진 파지를 확보하였다. 상기에 의하여 얻어진 파지를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시켜서 LB 배지에서 증폭시킨 후, 45여 개의 파지 플라그를 선별 및 M13 파지 게놈성 DNA(단일 스트랜드화 원형 DNA)를 분리 정제하여 각각의 유전자 염기서열을 확인하게 되고, 3 염기조 암호(triplet code)에 의해 파지 표면 단백질(gp3 minor coat 단백질)에 발현되어 CD133 단백질과 결합하도록 제작된 펩타이드 부분의 아미노산 염기서열을 규명하였다. 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.

실시예 4: CD133와 결합하는 펩타이드의 결합력 분석

스크리닝한 펩타이드의 결합력 분석을 위하여 각각의 펩타이드가 발현된 파지를 증폭한 뒤 타이터링(titering)을 통하여 파지 용액의 농도를 결정하였다. 이후 CD133 단백질이 결합된 플레이트에 파지를 농도별로 넣어주어 결합한 파지의 양을 측정함으로써 해당 펩타이드의 결합력을 추론하였다.

구체적으로, CD133 단백질이 결합된 플레이트에 파지를 농도별로 넣어준 뒤 일정시간이 지난 후 세척하였다. 이후 파지 표면 단백질을 인식하는 항체(마우스 항-M13 단일 클론 항체, TBST에 1:5000으로 희석, Amersham Bioscience)를 넣어준 후 1시간동안 반응 시켜주었다. 세척용액으로 다시 5번 씻어낸 후 마우스 항-M13 단일클론항체에 결합하는 2차 항체(마우스 IgG-HRP, TBST에 1:4000으로 희석, Santacruz)를 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 5번의 세척 작업을 거친 다음 TMB 기질 용액(3,3' 5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)/H₂O₂, Chemicon)을 넣고 15분 뒤 1 M 황산을 넣어 반응을 종결시켰다. 이 전체 과정을 항체를 이용한 ELISA(Enzyme-linked immunosorbant assay)라 칭하고 이 실험의 결과로 얻는 Kd값은 각 웰의 고정된 단백질에 반응시킨 페이지 펩타이드의 해당 농도에 따른 ELISA 신호 강도를 450 nm에서 측정하여 나타낸 포화곡선으로 정해진다.

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, 4개의 펩타이드가 피코몰(picomolarity) 수준의 우수한 결합력을 보여줌으로써 기존의 항체-항원 반응의 결합력에 상응하는 결합력을 확인할 수 있었다. 이 중 가장 우수한 결합력을 보여준 CD133-1 펩타이드의 대상물질과의 특이성 분석을 위해 펩타이드 서열 말단에 형광프로브를 합성하여 주었다.

실시예 5: CD133와 결합하는 형광 프로브 합성 펩타이드 서열의 결합력 분석

페이지 펩타이드 상에서 CD133 단백질을 높은 결합력으로 대상물질을 특이적으로 인지하는 하나의 서열에 각각 신호를 나타낼 형광 물질(FITC; fluorescein isothiocyanate 사용)을 붙여 합성하였으며, 그 서열은 다음과 같다.

CD133-GCGK-FITC : Ac - KMPKENPSSWLS GCGK - FITC

표기된 아미노산 서열은 아미노 말단부터 나타낸다. N-말단에는 아미노말단의 반응성 제거를 위해 아세틸화(Acetylation)를 시켰고, C-말단에는 카르복시말단에 FITC를 부착하기 위해 아미노산 K(Lysine, 라이신)를 첨가하였다. 각각의 아미노산 서열의 카르복시 말단 부근에는 GCG가 첨가되었는데, 이는 형광 펩타이드 탐침자 Ac-KMPKENPSSWLS GCGK-FITC 의 민감도를 극대화시키기 위한 과정을 위해서다. CD133-GCGK-FITC의 CD133 단백질에 대한 결합력 분석을 위하여 각각의 펩타이드를 CD133 단백질이 고정된 플레이트에 농도별로 희석하여 넣어주었다. 각 웰의 CD133 단백질에 결합한 펩타이드 양을 측정함으로써 각 펩타이드의 결합력을 추론하는 방법은 실시예4 에서 설명한 바와 비슷하다. 그러나 FITC가 합성된 펩타이드의 경우, 1차 항체, 2차 항체, TMB 기질 용액의 첨가 등 페이지 펩타이드 실험에서와 같이 신호를 나타낼 표지자가 별개로 필요하지 않아서 CD133 단백질과 펩타이드를 결합시킨 후 세척하여 형광 강도계로 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation @495nm, Emission @520nm)에서 각 펩타이드 농도의 형광세기를 측정하였다.

펩타이드 해당 농도의 FITC 신호강도는 그래프화 시켜서 펩타이드의 Kd 값을 정하였다(참조: 도 6).

실시 예 6 : CD133 에 결합하는 합성된 펩타이드를 이용한 세포내 cd133 의 결합력 분석

면역화학분석(Immunocytochemistry) 방법을 이용하여 실제 CD133 발현 세포주에 대한 펩타이드의 결합을 형광현미경을 통해 분석하였다. 대조군으로 피코에리트린(phycoerythrin)이 붙어있는 CD133 항체(CD133 antibody-PE)를 이용하였으며, 펩타이드 특이도 분석을 위해 임의의 서열을 가진 펩타이드(Scramble peptide, sc-peptide) 또한 동시에 처리하였다. 상기 실험을 위하여 U87 세포를 60 mm 세포배양 플레이트에 10% 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린 (penicillin), 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 DMEM 배지와 함께 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건하에 성장시켰다. 성장시킨 세포는 펩타이드와의 결합을 위해 우선적으로 블록킹 버퍼(Blocking buffer)(2% FBS) 로 1시간 반응시킨 후 워싱 버퍼(Washing buffer)(PBS) 를 통해 세척을 진행하였다. 이후 CD133 항체(antibody)-PE, sc-펩타이드, 펩타이드를 이용하여 4시간 4℃에서 반응시켰다. 이후 세척과정을 거친 후, 세포 핵 염색을 위해 DAPI를 통해 5분간 추가 반응을 진행시켰다. 최종적으로 형광현미경을 통하여 세포막 단백질 CD133 에 결합하는 각각의 프로브(antibody, sc-peptide, peptide)의 결합력 및 특이도를 분석하였다. 그 결과 CD133 결합 펩타이드가 높은 결합력으로 세포막에 발현된 CD133에 결합하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Peptide for Detection of Glioma Stem Cell <130> PN140158P <150> 10-2014-0076035 <151> 2014-06-20 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence from phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 1 Lys Met Pro Lys Glu Asn Pro Ser Ser Trp Leu Ser 1 5 10

Claims

서열목록 제1 서열의 아미노산 서열로 이루어지는 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 펩타이드.
제 1 항의 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 2 항의 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 3 항의 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 1 항의 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경교종 줄기세포 검출용 키트.
제 5 항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 검출용 키트.
제 1 항의 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경교종 진단용 키트.