CN104769103B - 多链嵌合抗原受体和其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及被称为多链CAR的嵌合抗原受体(CAR)的产生。此类CAR，其利用配体结合结构域特性，针对所选择的靶重定向免疫细胞特异性和反应性，包括在不同的跨膜多肽中分离的胞外配体结合和信号域。设计信号域以组装在近膜位置，其形成更接近于天然受体的灵活结构，其赋予最佳的信号转导。本发明包括编码所述多链CAR的多核苷酸、载体，和在其表面表达它们的分离的细胞，特别是用于它们在免疫疗法中的用途。本发明开辟了对用于治疗癌症和病毒感染的有效的继承性免疫治疗策略的道路。

Description

多链嵌合抗原受体和其用途

技术领域

本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)。利用配体结合结构域特性，CAR能够针对所选择的靶重定向免疫细胞特异性和反应性。特别是，本发明涉及多链嵌合抗原受体，其中用不同的跨膜多肽分离胞外配体结合和信号域以改善它们的功能。构成本发明的多链CAR的不同跨膜多肽，一旦组装在一起可特异性地结合至靶标中的一个或几个配体并诱导免疫细胞的活化，其中它们被表达且是免疫应答。本发明还涉及编码此类跨膜多肽的多核苷酸、载体，以及用于免疫治疗的在其表面表达所述多链CAR的分离的细胞。本发明还涉及用于工程化在其表面表达多链CAR的免疫细胞的方法。本发明开辟了对用于治疗癌症和病毒感染的有效的继承性(adoptive)免疫治疗策略的道路。

背景技术

继承性免疫治疗，其涉及离体(ex vivo)产生的自体抗原特异性T细胞的转移，是治疗病毒感染和癌症的有前途的策略。可以通过基因工程由抗原特异性T细胞的扩增或T细胞的重定向产生用于继承性免疫治疗的T细胞(Park,Rosenberg et al.2011)。病毒抗原特异性T细胞的转移是用于治疗移植相关病毒感染和罕见病毒相关恶性肿瘤的成熟过程。同样地，已经示出肿瘤特异性T细胞的分离和转移成功治疗黑素瘤。

已经通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移成功产生T细胞中的新的特异性(Jena,Dotti et al.2010)。CAR是由靶向部分组成的合成受体，靶向部分与单个融合分子中的一个或多个信号域相关。在一般情况下，CAR的结合部分由单链抗体的抗原结合结构域(scFv)组成，其包括通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻且可变的片段。也已成功地使用基于受体或配体结构域的结合部分。对于第一代CAR的信号域源自CD3ζ(zeta)或Fc受体γ(gamma)链的胞质区域。第一代CAR已经示出成功地重定向T细胞细胞毒作用，然而，它们未能提供体内(in vivo)长期扩增和抗肿瘤活性。已经单独(第二代)或组合(第三代)加入来自包括CD28、OX-40(CD134)和4-1BB(CD137)的共刺激分子的信号域以提高存活并增加CAR修饰的T细胞的增殖。CAR已成功允许T细胞针对抗原被重定向，该抗原在来自包括淋巴瘤和实体瘤的各种恶性肿瘤的肿瘤细胞表面表达(Jena,Dotti et al.2010)。

目前CAR结构建立在其中所有相关结构域包括在单个多肽内的设计上(US 7,741,465)。这种设计使连续附加的信号域成为必须，因此使得从它们的自然近膜位置、远离质膜移动一些结构域成为必须。然而，其中配体和信号域在它们的正常近膜位置(即相邻于它的内侧的细胞膜)分离的结构，将是更为期望的并认为允许共刺激结构域的改善功能。对于IgE(FcεRI)的高亲和力受体可以负担此类结构。的确，FcεRI，其存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上，是由配体结合性α(alpha)亚基、β(beta)亚基和两个信号转导γ亚基的同型二聚体组成的四聚体复合物(Metzger,Alcaraz et al.1986)。FcεRIα结构域由含有两个结合IgE的Ig样结构域的胞外结构域、跨膜结构域和短胞质尾区(tail)组成。β亚基包括四个跨膜区段(segment)分离氨基和羧基末端胞质尾区。γ链基本上由跨膜区域和含有一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的胞质尾区组成(Cambier 1995)。

使用继承性免疫治疗用于治疗患者的当前方案基于自体细胞转移。在这种方法中，从患者回收T淋巴细胞、离体遗传修饰或选择、体外培养以如果必要扩增细胞的数量并最后注入到患者。除了淋巴细胞注入，可以其他方式被操纵宿主，其他方式支持T细胞的植入或它们参与免疫应答，例如淋巴细胞生长因子(如IL-2)的预调节(用放疗或化疗)和给予。使用患者自身淋巴细胞(即自体疗法)，每个患者接受单独制造的治疗。

面临对实际应用的大量技术和逻辑障碍的自体疗法，它们的产生需要昂贵的设备和专家人员，在患者的诊断后必须在短时间内产生它们，并在许多情况下，患者的预治疗导致退化的免疫功能，使得患者的淋巴细胞功能不佳且以非常低的数量存在。因为这些障碍，每个患者的自体细胞制剂有效地为新产品，从而导致在有效性和安全性上显著变化。理想地，人们希望使用标准化治疗，其中可以预先制造、详细表征同种异体治疗细胞，并且可以用于立即给予至患者。同种异体是指，细胞是从属于相同物种但在遗传上不一样的个体获得的。然而，同种异体细胞的使用目前具有许多缺点。在免疫活性的(competent)宿主中同种异体细胞被迅速排斥，这是被称为宿主抗移植物反应(HvG)的过程，并且这显著限制了转移的细胞的有效性。在免疫非活性的宿主中，同种异体细胞能够移入，但它们的内源TCR特异性地将宿主组织识别为异体的(foreign)，导致移植物抗宿主病(GvHD)，其可以导致严重的组织损伤和死亡。为了有效地使用同种异体细胞，必须克服这两个问题。

在免疫活性的宿主中，同种异体细胞被宿主免疫系统迅速排斥。已经证实，存在于非照射的血液产品中的同种异体白细胞将持续不超过5至6天(Boni,Muranski etal.2008)。因此，为了防止同种异体细胞的排斥，必须有效地抑制宿主的免疫系统。糖皮质类固醇在治疗上广泛用于免疫抑制(Coutinho and Chapman 2011)。这类类固醇激素结合至存在于T细胞的胞液中的糖皮质激素受体(GR)，导致进入细胞核的易位和特异性DNA基序的结合，其调节一些参与免疫过程的基因的表达。用糖皮质类固醇治疗性T细胞的导致细胞因子产生的降低水平，导致T细胞无反应性且干扰T细胞活化。阿仑单抗，也称为CAMPATH1-H，是靶向CD52的人源化单克隆抗体，是12种氨基酸糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl-inositol，GPI)连接的糖蛋白(Waldmann and Hale 2005)。CD52在T和B淋巴细胞上以高水平表达并且在单核细胞上以较低水平表达，同时不存在于粒细胞和骨髓前体上。用阿仑单抗(针对CD52的人源化单克隆抗体)治疗已经示出诱导循环淋巴细胞和单核细胞的快速耗尽。它经常在T细胞淋巴瘤的治疗中并且在某些情况下作为用于移植的预处理方案的部分使用。然而，在继承性免疫治疗的情况下，使用免疫抑制性药物也会对引入的治疗性T细胞有不利影响。因此，在这些条件下为了有效地使用继承性免疫治疗方法，将需要引入的细胞耐免疫抑制性治疗。

另一方面，T细胞受体(TCR)是细胞表面受体，其参与T细胞活化以响应于抗原呈递。TCR通常由两条链，α和β制成，其组装以形成异源二聚体且与CD3转导亚基关联以形成存在于细胞表面上的T细胞受体复合物。TCR的每条α和β链由免疫球蛋白样N-末端可变(V)区和恒定(C)区、疏水跨膜结构域和短胞质区域组成。至于免疫球蛋白分子，通过V(D)J重组，在T细胞群体内产生抗原特异性的大的多样性产生α和β链的可变区。然而，与识别完整抗原的免疫球蛋白形成对比，由与MHC分子相关的加工的肽片段活化T细胞，由T细胞引入额外维度以抗原识别，被称为MHC限制。通过T细胞受体识别供体和受体之间的MHC差异导致T细胞增殖和GVHD的潜在发展。已经示出，TCR的正常表面表达取决于复合物的所有七种组分的协调合成和组装(Ashwell and Klusner 1990)。TCRα或TCRβ的失活可导致从防止识别同种异体抗原以及因此GVHD的T细胞表面的TCR消除。然而，TCR中断(disruption)导致CD3信号转导组分的消除且改变进一步T细胞扩增的方式。

T细胞介导的免疫包括由共刺激和微调免疫应答的抑制信号之间的平衡调节的多个顺序步骤。被称为免疫检查点的抑制信号对于维持自身耐受性至关重要，且还限制免疫介导的附带(collateral)组织损伤。可由肿瘤下调免疫检查点蛋白的表达。肿瘤吸纳(co-opt)这些抑制通路的能力代表免疫抗性中的重要机制，且限制免疫治疗的成功。活化治疗性T细胞免疫应答的有前途方法之一是阻滞这些免疫检查点(Pardoll 2012)。免疫检查点代表活化癌症中功能性细胞免疫的显著障碍，且对于包括CTLA 4和程序性死亡-1(PD-1)的T细胞上的抑制配体特异的拮抗抗体是在临床中进行评估的靶向剂的实例。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4；也称为CD152)下调T细胞活化的幅度，且用拮抗剂CTLA4抗体(伊匹单抗(ipilimumab))的治疗已经示出患有黑素瘤的患者中的生存益处(Robert and Mateus 2011)。程序性细胞死亡蛋白1(PD1或PDCD1，也称为CD279)代表对于免疫疗法的另一个非常有前途的靶(Pardoll and Drake 2012；Pardoll 2012)。与CTLA-4形成对照，PD1在对感染的炎性反应时限制周组织中的T细胞效应子功能，且限制自身免疫。用PD1抗体的第一个临床试验示出肿瘤消退的一些案例(Brahmer,Drake etal.2010)。多个另外的免疫检查点蛋白代表基于最近研究用于治疗阻滞的有前途的靶。

在正常T细胞中，T细胞受体源自前T细胞受体(pTCR)，其由不成熟的胸腺细胞表达并且对于从双阴性(CD4-CD8-)到双阳性(CD4+CD8+)阶段的T细胞发育至关重要。在TCRβ基因座的生产性重排方面成功的前T细胞表达功能性TCRβ链，其与不变的前Tα链(preTalpha)和CD3信号转导组分配对以形成前TCR复合物。前TCR在细胞表面的表达对于引发β-选择有必要，β-选择是诱导发育中的T细胞扩增、执行TCRβ基因座的等位排斥并且导致在TCRα基因座处重排的感应的过程(von Boehmer 2005)。在生产性TCRα重排和由TCRα取代pTα以形成成熟TCR后，一经结合在胸腺上皮细胞上表达的自身肽MHC复合物，胸腺细胞进行选择的第二步骤，被称为阳性或TCRα/β选择。因此，成熟T细胞通过它们的TCR识别并应答抗原/MHC复合物。TCR活化的最直接后果是经由关联CD3亚基起始信号转导通路，其引起包括克隆性扩增T细胞、上调细胞表面上活化标志物和诱导细胞毒性或细胞因子分泌在内的多个事件。

由于在胸腺发育期间通过与前Tα配对来选择TCRβ链的性质，因此，在其中TCRα已被失活的T细胞中，异源引入pTα转基因可引起前TCR的形成。该pTCR可以充当以非MHC依赖性的方式的T细胞活化或刺激的工具，从而例如允许TCRα失活之后的α/βT细胞的持续扩增。重要地，在关联的CD3亚基方面，pTCR复合物显示与TCR相似的生化组分(Carrasco,Ramiroet al.2001)。另外，与TCR形成对照，前TCR信号转导可由配体独立事件部分地发生。pTCR胞外结构域的晶体结构已经为pTCR信号转导的可能的配体独立提供结构基础。已经示出pTCR形成头尾二聚体，其中两个pTα-TCRβ异源二聚体相关联(Pang,Berry et al.2010)。

在开发可以靶向恶性或感染细胞的治疗级工程化免疫细胞的背景中，本发明人寻求改善的CAR结构，其会更接近于天然的那些，并且很可能因此的使用任何胞外单或多特异性配体结合结构域的行为。

作为结果，他们已设计了新一代CAR，根据本发明其涉及分离的多肽亚基，称为“多链CAR”。

发明内容

在现有技术中的嵌合抗原受体(CAR)以单个融合分子存在，其需要信号域的连续附加。然而，从它们的天然近膜位置去除信号域干扰它们的功能。因此，为了克服这个缺点，本发明人已成功设计所谓的多链CAR，其允许所有有关信号域的近膜位置。在多链CAR中，信号域被放置在不同的多肽链上，以使得它们位于近膜位置。例如，通过由胞外配体结合结构域如scFv替代FcεRIα链的高亲和性IgE结合结构域，多链CAR可以衍生自FcεRI，然而FcεRIβ和/或γ链的N和/或C-末端尾用于将信号转导结构域放置在正常近膜位置。胞外配体结合结构域具有向细胞靶重定向T细胞特异性的作用，同时置于近膜位置的信号转导结构域活化免疫细胞应答。

在近膜位置的信号域存在于与携带胞外配体结合结构域不同的多肽上的事实，为CAR提供更灵活的结构。因此，取决于在CAR的配体结合结构域和其受体之间寻求的相互作用强度，可以添加另外的信号域或共刺激结构域或从CAR去除它们。这种在CAR结构中的灵活性也允许引入另外的一个或多个胞外配体结合结构域。这可以通过将第二配体结合结构域融合至携带第一配体结合结构域的多肽，或通过引入另外的胞外配体结合结构域完成。如果该第二配体结合结构域具有不同的特异性，那么形成双特异性多链CAR，并且如果有另外的特异性，那么形成多特异性多链CAR。鉴于靶向给定细胞或携带在它们的表面存在的两个或多个不同受体的病毒，这些是特别有利的。这增加此类多链CAR对所述细胞或病毒的特异性。在另一方面，信号域的数量可以允许对于不同结合结构域分别地调节信号。此外，可以以不同的表达水平独立地表达形成CAR的每个重组多肽以进一步调节CAR的活性。

本发明被吸引到这种新的CAR结构、编码其的重组多核苷酸、以及工程化对于特异性细胞识别的免疫细胞的方法，不论免疫细胞的目的和性质。

本发明另外地提供用于制造此类更适用于免疫治疗目的免疫细胞的方法。

例如，特别是，通过在原代细胞中失活TCRα或β基因和/或通过结合使编码对于不同免疫抑制剂的靶、特别是CD52和GR(糖皮质激素受体)的基因的失活并进一步选择耐所述免疫抑制剂的细胞，免疫细胞可以被进一步工程化以成为非同种反应性的和/或耐免疫抑制剂。

除了遗传修饰的免疫细胞的以上描述的概念，本发明还涉及这样的实施方式，其中当TCRα被失活时，例如通过在细胞中瞬时表达前Tα从而在不存在功能性α/βTCR的情况下修复功能性CD3复合体，免疫细胞被工程化以允许增殖。

为了工程化遗传地高活性修饰的免疫细胞，本发明还提供了这样的方法，其中由缺乏基因如PD1和CTLA-4的表达阻断免疫检查点。

本申请进一步公开了工程化的免疫细胞特别是将用作药物的T细胞，更特别是，用于通过将此类免疫细胞给予至生物体治疗或预防癌症。

附图和附表的简要说明

除了前述特征，本发明进一步包括其他特征，其会从以及跟随附图的描述显露。将容易地获得本发明的更完整评价和其许多附带的优点，由于本发明的更完整评价和其许多附带的优点通过参考结合下面详细描述的下列附图变得更好理解。

图1：T细胞和抗原呈递细胞之间的正常关系的示意图。

图2：根据本发明的遗传修饰的治疗性T细胞和患者的肿瘤细胞的示意图。

图3：多链CAR示意图。

图4：不同版本的多链CAR的示意图。A.FcεRI受体的示意图。B-C不同版本的多链CAR(csm1至csm10)，包括融合至FcεRIα链的跨膜结构域的scFv和CD8茎区(stalk region)。至少一个41BB、CD28和/或CD3ζ结构域可以融合至FcεRIα、β和/或γ链。

图5：工程化用于免疫治疗的人类同种异体细胞的方法的一个实例的示意图。

图6：在用抗CD52抗体(CAMPATH1-H)连同补体或对照处理后，活CD52阳性或CD52阴性细胞的以细胞/毫升计的浓度。

图7：在TCR阳性和TCR阴性细胞之间，或在CD52阳性和CD52阴性细胞之间，并且以非活化细胞作为对照的前侧向散射(FSC)分布(这是细胞尺寸的指标)的比较。

图8：在靶向的CD52和TCRα失活的T细胞上的CD107a表达(脱粒(degranulation)的标志物)的流式细胞仪分析。在用Daudi细胞孵育之前(A)和之后(B)，在CD52+TCRαβ+细胞(第一列)、CD52-TCRαβ-细胞(第二列)、CD52-TCRαβ+细胞(第三列)和CD52+TCRαβ-细胞(第四列)上分析CD107表达；C)代表用CAR进一步转染并且用Daudi细胞孵育的T细胞的流式细胞仪分析；D)代表用CAR转染但不用Daudi细胞孵育的T细胞的流式细胞仪分析，和E)代表用CAR转染且以PMA/离子霉素(阳性对照)处理的T细胞的流式细胞仪分析。

图9：CD52和TRAC TALE核酸酶潜在脱位点(off-site)靶的深度测序分析。图9公开了“左半靶”序列为SEQ ID NO:149-165和“右半靶”序列为SEQ ID NO 166-182，所有分别按出现的顺序。

图10：通过T7核酸内切酶分析的PDCD1和CTLA-4基因组基因座的分析。箭头指向消化的PCR产物。

图11：前Tα构建体的一些实例的示意图。

图12：在TCRα失活的Jurkat细胞中，FL、Δ18、Δ48pTα构建体(％CD3表面表达)的转导效率(％BFP+细胞)和活性的流式细胞仪分析。

图13：编码pTα蛋白(前TCRα)的慢病毒构建体的示意图。

图14：A.实验方案的表示。B.在TCRα失活的T细胞(KO)上TCRα/β、CD3表达和BFP表达的流式细胞仪分析，该T细胞在纯化前和纯化后用BFP-2A-pTαΔ48(KO/Δ48)或对照BFP慢病毒载体(KO/BFP)转导。C.在纯化的TCRα失活细胞上的TCRα/β和CD3表达的流式细胞仪分析，该细胞用BFP-2A-pTαΔ48慢病毒载体转导(BFP_阳性)或不转导(BFP_阴性)。NEP代表具有TRAC TALE核酸酶的非电穿孔细胞。

图15：A-B.分别在非电穿孔细胞(NEP)和TCRα失活细胞(KO)上，用抗CD3/CD28珠重新活化后24小时和48小时，早期活化标志物CD69(A)、晚期活化标志物CD25(B)表达的流式细胞仪分析，上述的细胞用BFP-2A-pTα-Δ48慢病毒载体(pTα-Δ48)，BFP-2A-pTα-Δ48.41BB慢病毒载体(pTα-Δ48.BB)或对照BFP载体(BFP)转导。pTα-Δ48直方图对应于在表达pTα-Δ48的TCR失活细胞(BFP+细胞)中检测到的信号，而KO直方图对应于不表达pTα-Δ48的TCRα失活细胞(BFP-细胞)，pTα-Δ48.BB直方图对应于在表达pTα-Δ48.41BB的TCR失活细胞(BFP+细胞)中检测到的信号，而KO直方图对应于不表达pTα-Δ48.41BB的TCRα失活细胞(BFP-细胞)。NEP(非电穿孔)直方图对应于在非工程化细胞中检测到的信号。C.在非电穿孔细胞(NEP)和TCRα失活细胞(KO)上，用抗CD3/CD28珠重新活化后72小时，细胞尺寸的流式细胞仪分析，上述的细胞用BFP-2A-pTα-Δ48慢病毒载体(pTα-Δ48)、BFP-2A-pTα-Δ48.41BB慢病毒载体(pTα-Δ48.BB)或对照BFP载体(BFP)转导。每幅图的上半部分中表示的值对应于每个群体的荧光的几何平均值。

图16：用pTα-Δ48(pTαΔ48)或对照BFP载体(BFP)转导的TCRα失活细胞(KO)的细胞生长分析，其在不同时间点(x轴)保持在IL2或具有抗CD3/CD28珠的IL2中。在不同时间点对于每个条件评估BFP+细胞数并且相对于重新活化后第2天获得的值评估这些细胞的倍数诱导(y-轴)。从两个独立供体获得结果。对于第二供体，还对于用pTα-Δ48.41BB(pTα-Δ48.BB)和全长pTα-(pTα-FL)转导的细胞确定细胞生长。

图17：对用五种不同Cytopulse程序电穿孔的PBMC的GFP阳性细胞的流式细胞仪分析。A.NEP、EP#1(GFP)和EP#2(GFP)；B.EP#3(pUC)，EP#4(GFP)和EP#5(GFP)。上部线对应于6×10⁶细胞/小杯(cuvette)的转染，而下部线对应于3×10⁶细胞/小杯的转染。

图18：在用GFP mRNA、GFP DNA和对照pUC DNA电穿孔后，使用存活性(viability)染料(eFluor-450)的纯化的T细胞死亡率和存活群体中的GFP阳性细胞的流式细胞仪分析。A.NT和NEP；B.EP(无DNA)和GFP DNA；C.pUC DNA和GFP mRNA。NEP对应于保持在电穿孔缓冲液中但没有电穿孔的细胞并且NT对应于保持在培养基中的非电穿孔细胞。

图19：跟随着TRAC TALE核酸酶mRNA电穿孔，在人类原代T细胞上TCRα/β和CD3表达的流式细胞仪分析(顶部)。跟随TRAC TALE核酸酶mRNA电穿孔，从人类原代T细胞提取的基因组DNA的深度测序分析(底部)(SEQ ID NO 183-192，分别按出现的顺序)。

图20：A.在用或不用编码单链CAR的mRNA电穿孔T细胞后，CAR表达(抗F(ab')2)的流式细胞仪分析。B.在用Daudi细胞共培养的电穿孔T细胞上，CD107a表达(脱粒的标志物)的流式细胞仪分析。

图21：A.编码多链CAR的mRNA的表示。B.在用或不用编码多链CAR的多顺反子mRNA电穿孔的存活T细胞上，CAR表达(抗F(ab’)2)的流式细胞仪分析。C.在用Daudi细胞共培养的电穿孔T细胞上，CD107a表达(脱粒的标志物)的流式细胞仪分析。

图22：在多顺反子mRNA的电穿孔后，人类T细胞中的多链CAR表达。

图23：由三个链：α、β和γ的表达调节多亚基CAR的表达。

图24：跟随用靶细胞的共培养，瞬时表达多链CAR的人类T细胞脱粒。

图25：跟随用靶细胞的共培养，瞬时表达多链CAR的人类T细胞分泌细胞因子。

图26：瞬时表达多链CAR的人类T细胞裂解靶细胞。

表1：GR TALE核酸酶和在人类GR基因中TALE核酸酶靶位点的序列的描述。

表2：在酵母中GR TALE核酸酶的切割活性。值包括在0和1之间，最大值是1。

表3：在293细胞中内源TALE核酸酶靶位点处的靶向突变的百分比。

表4：在原代T淋巴细胞中内源TALE核酸酶靶位点处的靶向突变的百分比。

表5：CD52、TRAC和TRBC TALE核酸酶和在人类相应基因中TALE核酸酶靶位点的序列的描述。

表6：用于TRAC和CD52TALE核酸酶的另外的靶序列。

表7：对于TALE核酸酶靶向的CD52_T02、TRAC_T01、TRBC_T01和TRBC_T02靶的插入缺失(indels)百分比。

表8：在转染相应的表达TALE核酸酶的多核苷酸后，CD52阴性、TCR阴性和CD52/TCR双阴性T淋巴细胞的百分比。

表9：在转染表达TRBC TALE核酸酶的多核苷酸后，TCR阴性T淋巴细胞的百分比。

表10：CTLA4和PDCD1TALE核酸酶和在人类相应基因中TALE核酸酶靶位点的序列的描述。

表11：pTα构建体的子集的描述。

表12：不同pTα构建体在Jurkat TCRα失活细胞中的活性。通过在用不同的前Tα构建体转染的Jurkat TCRα失活细胞上CD3表达的流式细胞仪分析测定活性。

表13：用于确定在PBMC衍生的T细胞中电穿孔所需的最低电压的不同cytopulse程序。

表14：用于电穿孔纯化T细胞的Cytopulse程序。

表15：多链CAR版本的FcR链组合物的描述。

具体实施方式

除非在本文中明确定义，所使用的所有技术和科学术语具有由基因治疗、生物化学、遗传学和分子生物学领域中的技术人员通常理解的相同含义。

可以在本发明的实践或测试中使用与在本文中所描述的那些相似或等同的所有方法和材料，连同本文所描述的合适方法和材料。所有出版物、专利申请、专利和本文提及的其他参考文献都通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。此外，除非另有规定，材料，方法和实例仅是说明性的，并不意在进行限制。

除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在本领域的技术范围内。此类技术在文献中充分解释。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(FrederickM.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al.,2001,Cold Spring Harbor,NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.,1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York),特别是，Vols.154和155(Wuet al.eds.)和Vol.185,"Gene Expression Technology"(D.Goeddel,ed.)；GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos eds.,1987,ColdSpring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer和Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook OfExperimental Immunology,Volumes l-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1986).

多链嵌合抗原受体(CAR)

本发明涉及特别适于在免疫治疗中使用的免疫细胞的多链嵌合抗原受体(CAR)。

根据本发明的多链CAR通常至少包括：

-包含至少一种胞外配体结合结构域的一种跨膜多肽和；

-包含至少一种信号转导结构域的一种跨膜多肽；

使得所述多肽被组装在一起以形成多链嵌合抗原受体。

如本文所使用的，术语“胞外配体结合结构域”被定义为能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，该结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择胞外配体结合结构域以识别配体，其作为在与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物。因此可以作为配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌症细胞相关的那些。特别是，胞外配体结合结构域可以包括源自针对靶抗原的抗体的抗原结合结构域。作为非限制性实例，靶的抗原可以是肿瘤相关的表面抗原，如ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside)GD2、导管上皮粘蛋白(mucine)、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人类绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、P53、前列腺特异性蛋白(prostein)、PSMA、生存和端粒酶(surviving and telomerase)、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素样生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)和腱生蛋白-C的A1结构域(TnC Al)和成纤维细胞相关蛋白(fap)；谱系特异性或组织特异性抗原如CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、内皮糖蛋白、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF 17)，或病毒特异性表面抗原如HIV特异性抗原(如HIV gp120)；EBV特异性抗原、CMV特异性抗原、HPV特异性抗原、拉沙(Lasse)病毒特异性抗原、流感病毒特异性抗原以及这些表面标志物的任何衍生物或变体。

胞外配体结合结构域还可以包括结合靶抗原的肽，结合抗体的肽或蛋白(该抗体结合靶抗原)，肽或蛋白配体如生长因子、细胞因子或激素作为结合靶上受体的非限制性实例，或源自受体如生长因子受体、细胞因子受体或激素受体的结构域作为结合靶上肽或蛋白配体的非限制性实例。优选的靶是细胞或病毒。

在优选的实施方式中，所述胞外配体结合结构域是单链抗体片段(scFv)，其包括由柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链(V_L)和重链(V_H)可变片段。在优选的实施方式中，所述scFv是抗CD19 scFv，优选scFv-4G7(Peipp et al.,J ImmunolMethods.2004Feb 15；285(2):265-80)(VH:SEQ ID NO:193和VL:SEQ ID NO:194,scFV:SEQIDNO:195)。

除scFv外的其他结合结构域也可以用于淋巴细胞的预定靶向；如骆驼科单结构域抗体片段或受体配体，如血管内皮生长因子多肽、整联蛋白结合肽、调蛋白或IL-13突变蛋白(mutein)、抗体结合结构域、抗体高变环或CDR，作为非限制性实例。

在优选的实施方式中，所述跨膜多肽还包括在所述胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的茎区。本文所使用的术语“茎区”一般是指行使功能以将跨膜结构域连接至胞外配体结合结构域的任何寡肽或多肽。特别是，茎区用于提供对于胞外配体结合结构域的更多灵活性和可及性。茎区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。茎区可以源自所有或部分的天然存在的分子，如来自CD8、CD4或CD28的所有或部分胞外区，或来自所有或部分的抗体恒定区。可替代地，茎区可以是对应于天然存在的茎序列的合成序列，或可以是完全合成的茎序列。在优选的实施方式中，所述茎区是人类CD8α链(例如NP_001139345.1)的部分(SEQ ID NO:196)。

因此，免疫细胞中的多链CAR表达引起选择性修饰的细胞并且消除限定的靶，包括但不限于携带各自肿瘤相关表面抗原的恶性细胞或携带病毒特异性表面抗原的病毒感染的细胞，或携带谱系特异性或组织特异性表面抗原的靶细胞。

通常在癌细胞中观察到靶抗原的下调或突变，产生抗原损失逃逸变体。因此，为了抵消肿瘤逃逸并且使免疫细胞对靶更特异，多链CAR可以包括几个胞外配体结合结构域，以同时结合靶中的不同元件从而增加免疫细胞活化和功能。在一个实施方式中，胞外配体结合结构域可以串联地放置在相同跨膜多肽上并且可选地可由接头分离。在另一个实施方式中，可以将所述不同的胞外配体结合结构域放置在组成多链CAR的不同跨膜多肽上。在另一个实施方式中，本发明涉及包括每一个不同的胞外配体结合结构域的多链CAR的群体。特别是，本发明涉及工程化免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞并在所述细胞表面表达每一种包含不同的胞外配体结合结构域的多链CAR的群体。在另一个具体实施方式中，本发明涉及工程化免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞并将多核苷酸引入到所述细胞，以上描述的多核苷酸编码组成每一种包含不同的胞外配体结合结构域的多链CAR的群体的多肽。在具体实施方式中，工程化免疫细胞的方法包括在细胞表面表达融合于信号转导结构域的FcεRIβ和/或γ链的至少一部分和融合于不同胞外配体结合结构域的FcεRIα链的几部分。在更具体的实施方式中，所述方法包括将至少一种多核苷酸引入到所述细胞，所述多核苷酸编码融合于信号转导结构域的FcεRIβ和/或γ链的一部分和融合于不同胞外配体结合结构域的几个FcεRIα链。多链CAR的群体是指每一个包括不同胞外配体结合结构域的至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个多链CAR。根据本发明的不同的胞外配体结合结构域可以优选地同时结合靶中的不同元件从而增加免疫细胞活化和功能。

本发明还涉及分离的免疫细胞，其包括每一个包括不同胞外配体结合结构域的多链CAR的群体。

本发明的多链CAR的信号转导结构域或胞内信号域负责引起免疫细胞活化和免疫应答的、跟随将胞外配体结合结构域结合至靶的胞内信号转导。换言之，信号转导结构域负责其中多链CAR被表达的免疫细胞的至少一个正常效应子功能的活化。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助子(helper)活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“信号转导结构域”是指转导效应子信号功能信号并引导细胞进行专门功能的蛋白的部分。

对于在多链CAR中使用的信号转导结构域的优选实例可以是Fc受体或T细胞受体和共受体的胞质序列，其一致行动以引发跟随抗原受体接合的信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体和作为相同功能能力的任何合成序列。信号转导结构域包括两个不同类的胞质信号转导序列、引发抗原依赖性初级活化的那些、和以抗原不依赖的方式作用以提供次级或共刺激信号的那些。初级胞质信号转导序列可以包括信号转导基序，其是被称作ITAM的基于免疫受体酪氨酸的活化基序。ITAM是在各种受体的胞质内尾中发现的明确限定的信号转导基序，其用作对于syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。在本发明中使用的ITAM的实例可以包括，作为非限制性实例的源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε(epsilon)、CD3γ、CD3δ(delta)、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在优选的实施方式中，多链CAR的信号转导结构域可以包括CD3ζ信号域或FcεRIβ或γ链的胞质内结构域。

在具体实施方式中，本发明的多链CAR的信号转导结构域包括共刺激信号分子。共刺激分子是细胞表面分子，其不同于需要有效免疫应答的抗原受体或它们的配体。“共刺激配体”是指在抗原呈递细胞上的分子，其特异性结合在T细胞上的同源共刺激分子，从而提供信号，除了由例如TCR/CD3复合体与载有肽的MHC分子的结合提供的主要信号外，其介导T细胞应答，包括但不限于增殖活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。除其他外，共刺激配体还包括与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。

“共刺激分子”是指在T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导由细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC类I分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的实例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体，等。

在另一个具体实施方式中，所述信号转导结构域是TNFR相关因子2(TRAF2)结合基序、共刺激TNFR家族成员的胞质内尾。共刺激TNFR家族成员的胞质尾包含TRAF2结合基序，其由主要保守基序(P/S/A)X(Q/E)E)或次要基序(PXQXXD)组成，其中X是任何氨基酸。TRAF蛋白被招募到许多TNFR的胞内尾以响应于受体三聚化。

在优选的实施方式中，本发明的多链CAR的信号转导结构域包括选自由4-1BB(GenBank：AAA53133)和CD28(NP_006130.1)组成的组的共刺激信号分子的部分。特别是，本发明的多链CAR的信号转导结构域包括选自SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201的氨基酸序列。

适当跨膜多肽的区别特征包括在免疫细胞、特别是淋巴细胞细胞或自然杀伤(NK)细胞的表面表达、并且一起相互作用用于引导针对预定靶细胞的免疫细胞的细胞应答的能力。包括胞外配体结合结构域和/或信号转导结构域的本发明的多链CAR的不同的跨膜多肽一起相互作用以参与跟随与靶配体结合的信号转导并诱导免疫应答。跨膜结构域可以源自天然或合成来源。跨膜结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基如α、β、γ或δ，构成CD3复合体的多肽，IL2受体p55(α链)、p75(β链)或γ链，Fc受体特别是Fcγ受体III或CD蛋白的亚基链。可替代地，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要包括疏水残基如亮氨酸和缬氨酸。在优选的实施方式中，源自Fcε受体链或其变体的跨膜多肽具体包括FcεRIα链(SEQ ID NO:202)、β链(SEQ ID NO:203)和/或γ链(SEQ ID NO:204)或其变体的部分。

术语“源自”是指具有等同于Fcε受体的氨基酸序列的多肽，其包括Fcε受体序列的一个或多个氨基酸修饰。此类氨基酸修饰可以包括氨基酸替换、缺失、添加或这些修饰的任何的组合，并且相对于Fc受体的生物活性可以改变Fc结合区的生物活性。另一方面，源自具体Fc受体的Fc结合区可以包括一个或多个氨基酸修饰，相对于Fc受体的生物活性，所述修饰基本上不改变Fc结合区的生物活性。这种类别的氨基酸修饰通常将包括保守氨基酸替换。

在具体实施方式中，多链CAR包括源自FcεRI链的跨膜多肽。在更具体的实施方式中，FcεRI链是FcεRIα链，其中由胞外配体结合结构域、优选地由scFV、更优选的scFv-4G7(SEQ ID NO:195)代替胞外结构域。

在更具体的实施方式中，所述多链CAR可以包括FcεRIα链的部分和FcεRIβ链的部分或它们的变体，使得所述FcεRI链自发地二聚在一起以形成二聚的嵌合抗原受体。在另一个实施方式中，多链嵌合抗原可以包括FcεRIα链的部分和FcεRIγ链的部分或它们的变体，使得所述FcεRI链自发地三聚在一起以形成三聚的嵌合抗原受体，并且在另一个实施方式中，多链嵌合抗原受体可以包括FcεRIα链的部分、FcεRIβ链的部分和FcεRIγ链的部分或它们的变体使得所述FcεRI链自发地四聚在一起以形成四聚的嵌合抗原受体。

换言之，多链CAR包括以下组分中的至少两个：

a)包括FcεRIα链的部分和胞外配体结合结构域的一种多肽，

b)包括FcεRIβ链的部分的一种多肽，和/或

c)包括FcεRIγ链的部分的一种多肽，借此，不同的多肽自发地多聚在一起以形成二聚的、三聚的或四聚的CAR。

在优选的实施方式中，本发明的多链CAR包括具有选自由SEQ ID NO:202至SEQ IDNO:204组成的组的氨基酸序列的多肽的部分。

本文所使用的术语“…的部分”是指分子的任何子集，其是更短的肽。可替代地，可以通过在编码该多肽的DNA中的突变制备多肽的氨基酸序列功能性变体。此类变体或功能性变体包括例如从氨基酸序列内的残基的缺失，或者氨基酸序列内的残基的插入或取代。也可以制作缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所期望的活性，尤其是表现出特异性抗靶细胞免疫活性。宿主细胞内的本发明多链CAR的功能在适合于证明结合特定的靶之后所述多链CAR的信号转导潜能的分析中是可检测的。此类分析对本领域技术人员是可用的。例如，该分析允许检测结合靶之后引发的信号转导通路，如涉及以下项产量的增加的测定的分析：钙离子释放、胞内酪氨酸磷酸化、磷酸肌醇转换(turnover)、或白介素(IL)2、干扰素γ、GM-CSF、IL-3、IL-4产量，因而实现。

作为非限制性实例，在图4中示出不同版本的多链CAR。在更优选的实施方式中，本发明的多链CAR包括具有选自由SEQ ID NO:206至SEQ ID NO:213组成的组的氨基酸序列的多肽。在优选的实施方式中，多链CAR包括具有这样的氨基酸序列的多肽：该氨基酸序列具有与选自由SEQ ID NO:206至SEQ ID NO:213组成的组的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％的序列同一性。

多核苷酸，载体：

本发明还涉及编码根据本发明的以上描述的多链CAR的多核苷酸、载体。本发明提供包括编码可以包括在多链CAR中的本文所公开的跨膜多肽的DNA和RNA分子的多核苷酸。特别是，本发明涉及包括编码构成如上所描述的多链CAR的至少一种跨膜多肽的核酸序列的多核苷酸。更特别是，本发明涉及包括两个或多个编码构成如上所描述的多链CAR的跨膜多肽的核酸序列的多核苷酸。在优选的实施方式中，本发明涉及选自由：SEQ ID NO:214至SEQ ID NO:223组成的组的多核苷酸。在优选的实施方式中，多核苷酸具有与选自由SEQ IDNO:214至SEQ ID NO:223组成的组的核酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％的序列同一性。

多核苷酸可存在于表达盒或表达载体中(例如用于引入到细菌宿主细胞的质粒，或病毒载体，如用于转染昆虫宿主细胞的杆状病毒载体，或质粒或病毒载体，如用于转染哺乳动物宿主细胞的慢病毒)。

在具体实施方式中，不同的核酸序列可以包括在一种多核苷酸或载体中，其包括编码核糖体跳读(skip)序列的核酸序列，如编码2A肽的序列。2A肽，其在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒亚组中被识别，引起从一个密码子到下一个密码子的核糖体“跳读”而不形成由该密码子所编码的两个氨基酸之间的肽键(参见Donnelly et al.,J.of GeneralVirology 82:1013-1025(2001)；Donnelly et al.,J.of Gen.Virology 78:13-21(1997)；Doronina et al.,Mol.And.Cell.Biology 28(13):4227-4239(2008)；Atkins et al.,RNA13:803-810(2007))。“密码子”是指在mRNA上(或在DNA分子的有义链上)的3个核苷酸，其由核糖体翻译成一个氨基酸残基。因此，当多肽由在框中(in frame)的2A寡肽序列分离时，可以从在mRNA内的单个、连续的开放阅读框合成两个多肽。此类核糖体跳读机制是本领域中公知的并且已知被用于表达由单个信使RNA所编码的几种蛋白的几种载体使用。作为非限制性实例，在本发明中，2A肽已用于表达多链CAR的不同多肽到细胞。在更优选的实施方式中，本发明涉及选自由：SEQ ID NO:224至SEQ ID NO:232组成的组的多核苷酸。

为了将跨膜多肽如FcεR引导进入宿主细胞的分泌通路，在多核苷酸序列或载体序列中提供分泌信号序列(也称为前导序列，前原(prepro)序列或前序列)。分泌信号序列可以是FcεR的序列，或可以源自另一种分泌蛋白(例如，t-PA)或从头合成的。分泌信号序列可操作地连接至跨膜核酸序列，即，两个序列在正确阅读框中连接(join)并且定位以将新合成的多肽引导到宿主细胞的分泌通路。分泌信号序列通常位于编码感兴趣多肽的核酸序列的5'，尽管某些分泌信号序列可位于感兴趣核酸序列中的别处(参见，例如，Welch et al.,U.S.专利号5,037,743；Holland et al.,U.S.专利号5,143,830)。在优选的实施方式中，信号肽包括FcεRIα链(NP_001992.1)的残基1至25并且具有氨基酸序列SEQ ID NO:205。

本领域技术人员将认识到，考虑到遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中大量的序列变异是可能的。优选地，本发明的核酸序列被密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达，优选用于在人类细胞中表达。密码子优化是指在给定物种的高度表达的基因中通常是罕见的感兴趣的密码子被在该物种的高度表达的基因中通常是常见的密码子的序列中的交换，这样的密码子与被交换的密码子编码相同的氨基酸。

在优选的实施方式中，根据本发明的多核苷酸包括选自由：SEQ ID NO:214至SEQID NO:223的组的核酸序列。本发明涉及包括这样的核酸序列的多核苷酸，其具有与选自由SEQ ID NO:214至SEQ ID NO:222组成的组的核酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％的序列同一性。

工程化免疫细胞的方法：

在所包括的具体实施方式中，本发明涉及制备用于免疫治疗的免疫细胞的方法，包括将构成所述多链CAR的多肽引入到所述免疫细胞并扩增所述细胞。在具体实施方式中，本发明涉及工程化免疫细胞的方法，包括提供细胞和在如上所描述的细胞表面表达至少一种多链CAR。在具体实施方式中，该方法包括用至少一种多核苷酸转化细胞，该多核苷酸编码构成如上所描述的至少一个多链CAR的多肽，并且将所述多核苷酸表达进入所述细胞。

在另一个实施方式中，本发明涉及制备用于免疫治疗的细胞的方法，包括将构成所述多链CAR的不同多肽引入进入所述细胞并扩增所述细胞。在优选的实施方式中，所述多核苷酸包括在考虑到在细胞中稳定表达的慢病毒载体中。

在另一个实施方式中，所述方法进一步包括通过以下遗传修饰所述细胞的步骤：失活表达TCR的一种成分的至少一个基因，对于免疫抑制剂的靶，HLA基因和/或免疫检查点基因如PDCD1或CTLA-4。在优选的实施方式中，所述基因选自由TCRα、TCRβ、CD52、GR、PD1和CTLA-4组成的组。在优选的实施方式中，所述方法进一步包括将罕见切割核酸内切酶引入到所述T细胞，该酶能够通过DNA切割选择性失活所述基因。在更优选的实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶是TALE核酸酶。根据本发明的优选的TALE核酸酶是识别并且切割靶序列的那些酶，选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1至6(GR)、SEQ ID NO:37、57至60(TCRα)、SEQID NO:38或39(TCRβ)、和SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:65(CD52)、SEQ ID NO:74至SEQ ID NO:78(PD1和CTLA-4)。

失活基因是指不以功能蛋白形式表达感兴趣的基因。在具体实施方式中，在提供的待工程化的细胞中，该方法的遗传修饰依赖一种罕见切割核酸内切酶的表达使得所述罕见切割核酸内切酶在一种靶基因中特异性催化切割从而失活所述靶基因。由罕见切割核酸内切酶引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的不同机制修复。然而，NHEJ是不完美的修复过程，其往往导致在切割位点处DNA序列的改变。机制涉及剩下两个DNA末端通过直接再连接(Critchlow and Jackson 1998)或经由所谓微同源介导的末端连接(Ma,Kim et al.2003)的重连接。经由非同源末端连接(NHEJ)的修复通常引起小插入或缺失并且可以用于创建特异性基因敲除。所述修饰可以是至少一个核苷酸的取代、缺失或添加。可以由本领域中公知的方法识别和/或选择其中切割诱导的突变事件(即连续到NHEJ事件的突变事件)已发生的细胞。

在另一个实施方式中，可以将另外的催化结构域进一步引入到具有所述罕见切割核酸内切酶的细胞以增加突变，以增强失活本公开中描述的靶基因的能力。特别是，所述另外的催化结构域是DNA末端加工酶。DNA末端加工酶的非限制性实例包括5-3'核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶(flap endonucleases)、解旋酶、磷酸酶(hosphatase)、水解酶和模板-不依赖的DNA聚合酶。此类催化结构域的非限制性实例包括(comprise of)蛋白结构域或蛋白结构域的催化活性衍生物，其选自由以下组成的组：hExol(EXO1_HUMAN)、酵母Exol(EXO1_YEAST)、大肠杆菌(E.coli)Exol、人类TREX2、小鼠TREX1、人类TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、TdT(末端脱氧核苷酸基转移酶)人类DNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)。在优选的实施方式中，所述另外的催化结构域具有3'-5'-核酸外切酶活性，并且在更优选的实施方式中，所述另外的催化结构域是TREX，更优选TREX2催化结构域(WO2012/058458)。在另一个优选的实施方式中，所述催化结构域由单链TREX多肽编码。所述另外的催化结构域可以可选地由肽接头融合至根据本发明的核酸酶融合蛋白或嵌合蛋白。

已知核酸内切断裂刺激同源重组的速率。因此，在另一个实施方式中，该方法的遗传修饰步骤还包括将胞外源核酸引入细胞的步骤，至少包括与靶核酸序列的部分同源的序列，使得在靶核酸序列和外源核酸之间发生同源重组。在具体实施方式中，所述外源核酸包括其分别与靶核酸序列的5'和3'区域同源的第一和第二部分。在这些实施方式中的所述外源核酸还包括位于第一和第二部分之间的第三部分，其包括与靶核酸序列的5'和3'区域的不同源性。切割靶核酸序列之后，在靶核酸序列和外源核酸之间刺激同源重组事件。优选地，在所述供体基质内使用至少50bp、优选超过100bp并且更优选超过200bp的同源序列。因此，外源核酸优选为从200bp至6000bp、更优选从1000bp至2000bp。实际上，共享的核酸同源性位于侧接上游和下游的区域中，断裂位点和待引入的核酸序列应位于两臂之间。

特别是，所述外源核酸依次包括与所述切割的上游序列同源的第一区域、失活选自由以下组成的组的一个靶基因的序列：TCRα、TCRβ、CD52、GR、免疫检查点基因，和与切割的下游序列同源的第二区域。可以在引入或表达所述罕见切割核酸内切酶的同时、之前或之后进行所述多核苷酸引入步骤。取决于其中已发生断裂事件的靶核酸序列的位置，此类外源核酸可以用于敲除基因，例如当外源核酸位于所述基因的开放阅读框内时，或用于引入新的序列或感兴趣的基因。通过使用此类外源核酸的序列插入，通过校正或取代所述基因(等位基因交换作为非限制性实例)可以用于修饰靶向的现有基因，或用于上调或下调靶基因的表达(启动子交换作为非限制性实例)，所述靶基因校正或取代。在优选的实施方式中，可以在由特异性TALE核酸酶靶向的精确的基因组位置处进行失活来自由TCRα、TCRβ、CD52、GR、免疫检查点基因组成的组的基因，其中所述特异性TALE核酸酶催化切割并且其中所述外源核酸依次包括至少同源性的区域和序列以失活一个靶基因，靶基因选自由TCRα、TCRβ、CD52、GR、免疫检查点基因组成的组，其通过同源重组整合。在另一个实施方式中，可以依次地或同时地通过分别使用几种TALE核酸酶并且特异性靶向一种限定的基因和用于特异性基因失活的几种特异性多核苷酸失活几种基因。

另外的基因组修饰步骤也可指选自由TCRα、TCRβ、CD52、GR、免疫检查点基因组成的组的另一种基因的失活。如上所描述的，所述另外的基因组修饰步骤可以是包括以下的失活步骤：

(a)将至少一种罕见切割核酸内切酶引入到所述细胞使得所述罕见切割核酸内切酶特异性地催化在所述细胞的基因组的一个靶序列中的切割。

(b)将外源核酸可选地引入到所述细胞，外源核酸依次包括与所述切割的上游序列同源的第一区域，待插入所述细胞的基因组中的序列，和与所述切割的下游序列同源的第二区域，

其中所述引入的外源核酸失活基因并整合编码至少一种感兴趣的重组蛋白的至少一个外源多核苷酸序列。在另一个实施方式中，所述外源多核苷酸序列被整合在选自由TCRα、TCRβ、CD52、GR、免疫检查点基因组成的组的基因内。

-免疫抑制抗性T细胞：

在具体的方面，遗传修饰细胞的步骤之一可以是包括以下的方法：

(a)通过失活表达用于免疫抑制剂的靶的至少一个基因修饰T细胞，和

(b)可选地在所述免疫抑制剂的存在下扩增所述细胞。

免疫抑制剂是由作用的几种机制之一抑制免疫功能的药剂。换言之，免疫抑制剂通过化合物起作用，其通过减弱免疫应答的程度和/或幅度(voracity)的能力表现。作为非限制性实例，免疫抑制剂可以是钙调磷酸酶抑制剂、雷帕霉素的靶、白介素-2α-链阻断剂、肌苷单磷酸脱氢酶的抑制剂、二氢叶酸还原酶的抑制剂、皮质类固醇或免疫抑制抗代谢物。传统的细胞毒性免疫抑制剂通过抑制DNA合成起作用。其他可以通过活化T细胞或通过抑制辅助细胞的活化起作用。通过失活T细胞中的免疫抑制剂的靶，根据本发明的方法允许赋予对用于免疫治疗的T细胞的免疫抑制抗性。作为非限制性实例，用于免疫抑制剂的靶可以是用于免疫抑制剂的受体，如：CD52、糖皮质激素受体(GR)、FKBP家族基因成员和亲环素家族基因成员。

失活基因是指不以功能蛋白形式表达感兴趣的基因。在具体实施方式中，在提供的待工程化的细胞中，该方法的遗传修饰依赖一种罕见切割核酸内切酶的表达，使得所述罕见切割核酸内切酶特异性催化在一种靶基因中的切割，从而失活所述靶基因。在具体实施方式中，所述要工程化细胞的方法包括以下步骤中的至少一个：

(a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；

(b)在表达用于免疫抑制剂的靶的所述T细胞中选择基因；

(c)将罕见切割核酸内切酶引入到所述T细胞，该罕见切割核酸内切酶能够通过DNA切割、优选通过双链断裂选择性失活编码所述免疫抑制剂的靶的所述基因，和

(d)可选地在所述免疫抑制剂的存在下扩增所述细胞。

在更优选的实施方式中，所述方法包括：

(a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；

(b)在所述表达用于免疫抑制剂的靶的T细胞中选择基因；

(c)用编码罕见切割核酸内切酶的核酸的转化所述T细胞，该罕见切割核酸内切酶能够通过DNA切割、优选通过双链断裂选择性失活编码所述免疫抑制剂的靶的所述基因，和

(d)将所述罕见切割核酸内切酶表达进入所述T细胞；

(e)可选地在所述免疫抑制剂的存在下扩增所述细胞。

在具体实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶特异性靶向选自由CD52、GR组成的组的一种基因。在另一个实施方式中，对于免疫抑制性治疗特异的步骤(b)的所述基因是CD52并且步骤(d)或(e)的免疫抑制性治疗包括人源化抗体靶向CD52抗原。

在另一个实施方式中，对于免疫抑制性治疗特异的步骤(b)的所述基因是糖皮质激素受体(GR)并且步骤(d)或(e)的免疫抑制性治疗包括皮质类固醇如地塞米松。

在另一个实施方式中，对于免疫抑制性治疗特异的步骤(b)的所述靶基因是FKBP家族基因成员或其变体并且步骤(d)或(e)的免疫抑制性治疗包括FK506，也称为他克莫司或藤霉素。在另一个实施方式中，所述FKBP家族基因成员是FKBP12或其变体。

在另一个实施方式中，对于免疫抑制性治疗特异的步骤(b)的所述基因是亲环素家族基因成员或其变体并且步骤(d)或(e)的免疫抑制性治疗包括环孢素。

在另一个实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶可以是大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶或TALE核酸酶。在优选的实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶是TALE核酸酶。根据本发明的优选的TALE核酸酶是识别和切割选自由以下组成的组的靶序列的那些：

-SEQ ID NO:1至6(GR)，和

-SEQ ID NO:40、61至65(CD52)。

所述TALE核酸酶优选包括选自SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:48的多肽序列，以切割各自的靶序列SEQ ID NO:1至6和SEQ ID NO:40。

-用于免疫治疗的高活性T细胞

在具体的方面，遗传修饰细胞的一个具体步骤可以是包括以下的方法：

(a)通过失活至少一种免疫检查点基因修饰T细胞；和

(b)扩增所述细胞。

T细胞介导的免疫包括多个顺序步骤，涉及抗原特异性细胞的克隆选择、它们在次级淋巴组织中的活化和增殖、它们转运(traffick)至抗原和炎症位点、直接效应子功能的执行和对于大量效应子免疫细胞提供帮助(通过细胞因子和膜配体)。通过使微调应答的刺激和抑制信号平衡来调节这些步骤中的每个。本领域普通技术人员将理解，术语“免疫检查点”是指由T细胞表达的一组分子。这些分子有效地作为“制动器”以下调或抑制免疫应答。免疫检查点分子包括，但不限于程序性死亡1(Programmed Death 1)(PD-1，也称为PDCD1或CD279，登录号：NM_005018)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，GenBank登录号AF414120.1)、LAG3(也称为CD223，登录号：NM_002286.5)、Tim3(也称为HAVCR2，GenBank登录号：JX049979.1)、BTLA(也称为CD272，登录号：NM_181780.3)、BY55(也称为CD160，GenBank登录号：CR541888.1)、TIGIT(也称为VSTM3，登录号：NM_173799)、B7H5(也称为C10或f54，小鼠远景基因(vista gene)的同源物，登录号：NM_022153.1)、LAIR1(也称为CD305，GenBank登录号：CR542051.1)、SIGLEC10(GenBank登录号：AY358337.1)、2B4(也称为CD244，登录号：NM_001166664.1)，其直接抑制免疫细胞。例如，CTLA-4是在某些CD4和CD8T细胞上表达的细胞表面蛋白；当通过它在抗原呈递细胞上的配体(B7-1和B7-2)连接时，T细胞活化和效应子功能受到抑制。因此，本发明涉及工程化特别是用于免疫治疗的T细胞的方法，包括通过失活参与免疫检查点至少一种蛋白、具体是PD1和/或CTLA-4来遗传修饰T细胞。

在具体实施方式中，所述工程化细胞的方法包括以下步骤中的至少一个：

(a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；

(b)将罕见切割核酸内切酶引入到所述T细胞，该核酸内切酶能够通过DNA切割、优选通过双链断裂选择性失活编码免疫检查点蛋白的一种基因；

(c)扩增所述细胞。

在更优选的实施方式中，所述方法包括：

(a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；

(b)用编码罕见切割核酸内切酶的核酸转化所述T细胞，该核酸内切酶能够通过DNA切割、优选通过双链断裂选择性失活编码免疫检查点蛋白的基因；

(c)将所述罕见切割核酸内切酶表达进入所述T细胞；

(d)扩增所述细胞。

在具体实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶特异性靶向选自由以下组成的组的一种基因：PD1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、TCRα和TCRβ。在另一个实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶可以是大范围核酸酶、锌指核酸酶或TALE核酸酶。在优选的实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶是TALE核酸酶。TALE核酸酶是指由源自转录活化子样效应子(Transcription Activator Like Effector)(TALE)的DNA结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成以切割核酸靶序列的融合蛋白。(Boch,Scholzeet al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Cermak,Doyleet al.2011；Geissler,Scholze et al.2011；Huang,Xiao et al.2011；Li,Huang etal.2011；Mahfouz,Li et al.,2011；Miller,Tan et al.2011；Morbitzer,Romer etal.2011；Mussolino,Morbitzer et al.2011；Sander,Cade et al.2011；Tesson,Usal etal.2011；Weber,Gruetzner et al.2011；Zhang,Cong et al.2011；Deng,Yan et al.2012；Li,Piatek et al.2012；Mahfouz,Li et al.2012；Mak,Bradley et al.2012)。

在本发明中，已设计新的TALE核酸酶用于精确靶向用于继承性免疫治疗策略的有关基因。根据本发明的优选的TALE核酸酶是识别和切割选自由以下组成的组的靶序列的那些：SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78(PD1)、SEQ ID NO:74至SEQ ID NO:76(CTLA-4)。本发明还涉及这样的TALE核酸酶多肽，其包括选自由SEQ ID NO:79至SEQ ID NO:88组成的组的氨基酸序列。

本发明还涉及包括这样的氨基酸序列的多肽，其具有与选自由SEQ ID NO:79至SEQ ID NO:88组成的组的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％的序列同一性。编码根据本发明的以上描述的罕见切割核酸内切酶多核苷酸、载体也包括在本发明的范围内。该方法可与本公开中描述的任何一个不同方法相关。

-非同种反应性T细胞：

在另一个实施方式中，本发明可特别适用于同种异体免疫治疗。在这种情况下，遗传修饰细胞的步骤之一可以是包括以下的方法：

(a)通过失活编码T细胞受体(TCR)的组分的至少一种基因修饰T细胞；

(b)扩增所述细胞。

在具体实施方式中，在提供的待工程化的细胞中，该方法的遗传修饰依赖于一种罕见切割核酸内切酶的表达，使得所述罕见切割核酸内切酶特异性催化在一种靶基因中的切割从而失活所述靶基因。在具体实施方式中，所述工程化细胞的方法包括以下步骤中的至少一个：

(a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；

(b)将罕见切割核酸内切酶引入到所述T细胞，该核酸内切酶能够通过DNA切割、优选通过双链断裂选择性失活编码T细胞受体(TCR)的组分的至少一种基因；

(c)扩增所述细胞。

在更优选的实施方式中，所述方法包括：

(a)优选从细胞培养物或从血液样品提供T细胞；

(b)用编码罕见切割核酸内切酶的核酸转化所述T细胞，该核酸内切酶能够通过DNA切割、优选通过双链断裂选择性失活编码T细胞受体(TCR)的组分的至少一种基因；

(c)将所述罕见切割核酸内切酶表达进入所述T细胞；

(d)分选转化的T细胞，其不在它们的细胞表面上表达TCR；

(e)扩增所述细胞。

在另一个实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶可以是大范围核酸酶、锌指核酸酶或TALE核酸酶。在优选的实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶是TALE核酸酶。根据本发明的优选的TALE核酸酶是识别和切割选自由以下组成的组的靶序列的那些：

-SEQ ID NO:37、57至60(TCRα)，

-SEQ ID NO:38或39(TCRβ)，

所述TALE核酸酶优选包括选自SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:48的多肽序列，以切割各自的靶序列SEQ ID NO:37至39。

-前Tα

在另一方面，遗传修饰细胞的另一个步骤可以是扩增TCRα缺陷的T细胞的方法，包括将pTα(也称为前TCRα)或其功能性变体引入到所述T细胞和扩增所述细胞，可选地通过刺激CD3复合体。在优选的实施方式中，该方法包括：

(a)用编码至少pTα的片段的核酸转化所述细胞以支持CD3表面表达；

(b)将所述pTα表达进入所述细胞；

(c)可选地通过刺激CD3复合体扩增所述细胞。

本发明还涉及制备用于免疫治疗的T细胞的方法，包括用于扩增T细胞的方法的步骤。

在具体实施方式中，可以随机地或否则通过同源重组引入pTα多核苷酸序列，特别是，插入可以与TCRα基因的失活相关。

根据本发明，使用pTα的不同功能性变体。肽的“功能性变体”是指与整个肽或其片段基本上相似的分子。本发明的pTα或其功能性变体的“片段”是指该分子的任何子集，即，更短的肽。优选pTα或功能性变体可以是全长pTα或C-末端截短的pTα版本。C-末端截短的pTα缺乏C-末端的一个或多个残基。作为非限制性实例，C末端截短的pTα版本缺乏来自蛋白(SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:114)的C-末端的18、48、62、78、92、110或114个残基。此外，可以通过在编码肽的DNA中的突变制备肽的氨基酸序列变体。此类功能性变体包括例如从氨基酸序列内的残基的缺失，或氨基酸序列内的残基的插入或取代。也可制作缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所期望的活性，特别是功能性CD3复合体的修复。在优选的实施方式中，在如上所描述的不同的pTα版本引入至少一个突变以实现二聚。作为非限制性实例，突变的残基可以是人类pTα蛋白的至少W46R、D22A、K24A、R102A或R117A，或在pTα家族或同源成员上使用CLUSTALW方法的对齐位置。优选地，如上所描述的pTα或其变体包括突变的残基W46R(SEQ ID NO:123)或突变的残基D22A、K24A、R102A和R117A(SEQ ID NO:124)。在具体实施方式中，所述pTα或变体也融合至信号转导结构域如CD28、OX40、ICOS、CD27、CD137(4-1BB)和CD8，作为非限制性实例(SEQ ID NO:115至SEQ IDNO:120)。如上所描述的pTα或变体的胞外结构域可以融合至TCRα蛋白的片段，特别是TCRα的跨膜和胞内结构域(SEQ ID NO:122)。pTα变体也可以融合至TCRα的胞内结构域(SEQIDNO：121)。

在另一个实施方式中，所述pTα版本融合至胞外配体结合结构域并且更优选地，pTα或其功能性变体融合至单链抗体片段(scFV)，其包括由柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链(V_L)和重链(V_H)可变片段。作为非限制性实例，pTα或其功能性变体的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:124组成的组。

因为一些变异性可以起因于从其衍生这些多肽的基因组数据，并且还考虑到取代存在于不显著损失活性(功能性变体)的这些多肽中的一些氨基酸的可能性，本发明包括以上多肽的多肽变体，其与在本专利申请中所提供的序列共享至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％的同一性。

因此，本发明被吸引到包括这样的多肽序列的多肽，其具有与选自由SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:124组成的组的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、95％、97％或99％的序列同一性。

TCRα缺陷型T细胞是指缺乏功能性TCRα链的表达的分离的T细胞。这可以通过不同的方式实现，作为非限制性实例，通过工程化T细胞使得它在其细胞表面上不表达任何功能性TCRα，或通过工程化T细胞使得它在其表面上产生非常少的功能性TCRα链，或通过工程化T细胞以表达TCRα链的突变或截断形式。

TCRα缺陷型细胞无法再通过CD3复合体进行扩增。因此，为了克服这个问题并允许TCRα缺陷型细胞的增殖，将pTα或其功能性变体引入到所述细胞，从而修复功能性CD3复合体。在优选的实施方式中，该方法还包括将罕见切割核酸内切酶引入所述T细胞，该核酸内切酶能够通过DNA切割选择性失活编码一种T细胞受体(TCR)组分的一种基因。在具体实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶是TALE核酸酶。作为非限制性实例，TALE核酸酶针对选自由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:57至60组成的组的TCRα的基因靶序列之一。优选地，TALE核酸酶选自由SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的组。

以上描述的编码pTα的多肽、特别是功能性变体也包括在本发明中。在优选的实施方式中，本发明涉及pTα或其功能性变体，其融合至信号转导结构域如CD28、OX40、ICOS、CD137和CD8。更特别是，本发明涉及包括选自由SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:124组成的组的氨基酸序列的pTα功能性变体。以上描述的编码pTα的多核苷酸，载体或其功能性变体也包括在本发明中。

在本发明的范围内还包括通过所述方法易于获得的分离的细胞或细胞系。特别是，通过将pTα或其功能性变体引入所述细胞以支持CD3表面表达获得所述分离的细胞或细胞系。在优选的实施方式中，进一步通过失活TCRα基因来遗传修饰所述分离的细胞或细胞系。该基因优选地通过至少一种罕见切割核酸内切酶失活。在优选的实施方式中，所述罕见切割核酸内切酶是TALE核酸酶。

在本发明的范围内还包括通过工程化细胞、特别是T细胞的所述方法易于获得的分离的细胞或细胞系，其中选自由TCRα、TCRβ、CD52、GR，免疫检查点基因组成的组的至少一种基因已被失活。

-双特异性抗体

根据进一步实施方式，可以用双特异性抗体进一步暴露通过如前所描述的不同方法获得的工程化T细胞。所述T细胞可以在给予至患者之前离体地或在给予至患者之后体内地暴露于双特异性抗体。所述双特异性抗体包括具有不同抗原特性的两个可变区，其允许促使工程化细胞接近靶抗原。作为非限制性实例，所述双特异性抗体针对肿瘤标志物和淋巴细胞抗原如CD3并且具有重定向和活化任何循环T细胞对抗肿瘤的潜力。

递送方法

以上描述的不同方法涉及将多链CAR、pTα或其功能性变体、罕见切割核酸内切酶、TALE核酸酶、可选地具有DNA末端加工酶的CAR或外源核酸引入到细胞。

作为非限制性实例，可以引入所述多链CAR、pTα或其功能性变体、罕见切割核酸内切酶、TALE核酸酶或可选地具有DNA末端加工酶的CAR或外源核酸作为由一种或不同质粒载体编码的转基因。不同的转基因可以包括在一种载体中，其包括编码核糖体跳读序列的核酸序列如编码2A肽的序列。2A肽，其在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒亚组中被识别，引起从一个密码子到下一个密码子的核糖体“跳读”而不形成由密码子所编码的两个氨基酸之间的肽键(参见Donnelly et al.,J.of General Virology 82:1013-1025(2001)；Donnellyet al.,J.of Gen.Virology 78:13-21(1997)；Doronina et al.,Mol.And.Cell.Biology28(13):4227-4239(2008)；Atkins et al.,RNA 13:803-810(2007))。“密码子”是指在mRNA上(或在DNA分子的有义链上)的3个核苷酸，其由核糖体翻译成一个氨基酸残基。因此，当多肽由在框中的2A寡肽序列分离时，可从在mRNA内的单个、连续的开放阅读框合成两个多肽。此类核糖体跳读机制是本领域中公知的并且已知被用于表达由单个信使RNA所编码的几种蛋白的几个载体使用。作为非限制性实例，在本发明中，2A肽已用于将罕见切割核酸内切酶和DNA末端加工酶或多链CAR的不同多肽表达进入细胞。

所述质粒载体还可以包括选择标志物，其提供对接受所述载体的细胞的识别和/或选择。

作为将编码所述多肽的多核苷酸引入到细胞内结果，可以在细胞中原位合成多肽。可替代地，多肽可以在胞外产生所述，然后将其引入其中。用于将多核苷酸构建体引入到动物细胞的方法是本领域中已知的并且作为非限制性实例包括其中将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中的稳定转化方法、其中多核苷酸构建体不整合到细胞的基因组中的瞬时转化方法和病毒介导的方法。通过例如重组病毒载体(例如逆转录病毒，腺病毒)、脂质体等，可以将所述多核苷酸引入到细胞。例如，瞬时转化方法包括例如显微注射、电穿孔或粒子轰击。考虑到在细胞中表达，所述多核苷酸可以包括在载体、更具体是质粒或病毒中。

-电穿孔

在本发明的具体实施方式中，根据本发明的编码多肽的多核苷酸可以是例如通过电穿孔将其直接引入到细胞中的mRNA。本发明人确定在T细胞中用于mRNA电穿孔的最佳条件。

本发明人使用cytoPulse技术，其通过使用脉冲电场允许瞬时透化活细胞用于递送材料进入细胞。基于使用PulseAgile(Cellectis产权)电穿孔波形，该技术授予对脉冲持续时间、强度以及脉冲之间间隔的精确控制(美国专利6010613和国际PCT申请WO2004083379)。可以修饰所有这些参数以达到对于具有最小死亡率的高转染效率的最佳条件。基本上，第一高电场脉冲允许孔形成，同时后续的较低电场脉冲允许将多核苷酸移动进入细胞。在本发明的一个方面中，发明人描述引起实现mRNA在T细胞中的>95％转染效率，并且使用电穿孔方案以在T细胞中瞬时表达不同种类的蛋白的步骤。特别是，本发明涉及转化T细胞的方法，包括使所述T细胞与RNA接触和向T细胞施加敏捷脉冲序列，由以下组成：

(a)一个具有电压范围从2250至3000V/厘米的电脉冲，在步骤(a)和(b)的电脉冲之间，脉冲宽度为0.1ms并且脉冲间隔为0.2至10ms；

(b)一个具有电压范围从2250至3000V的电脉冲，在步骤(b)的电脉冲和步骤(c)的第一电脉冲之间，具有脉冲宽度为100ms并且脉冲间隔为100ms；和

(c)4个具有电压为325V的电脉冲，在4个电脉冲的每个之间，具有脉冲宽度为0.2ms并且脉冲间隔为2ms。

在具体实施方式中，转化T细胞的方法包括接触具有RNA的所述T细胞和向T细胞施加敏捷脉冲序列，其包括：

(a)一个具有电压为2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V/厘米的电脉冲，在步骤(a)和(b)的电脉冲之间，脉冲宽度为0.1ms并且脉冲间隔为0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ms；

(b)一个具有电压范围从2250、为2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的电脉冲，在步骤(b)的电脉冲和步骤(c)的第一电脉冲之间，具有脉冲宽度为100ms并且脉冲间隔为100ms；和

(c)4个具有电压为325V的电脉冲，在4种电脉冲的每个之间具有脉冲宽度为0.2ms并且脉冲间隔为2ms。

在本申请中公开包括在以上描述的数值范围内的任何值。电穿孔培养基可以是本领域中已知的任何合适培养基。优选地，电穿孔培养基具有范围跨越0.01至1.0毫西门子的导电性。

在具体实施方式中，作为非限制性实例，所述RNA编码罕见切割核酸内切酶，罕见切割核酸内切酶的一个单体，如半TALE核酸酶(Half-TALE-nuclease)、嵌合抗原受体、多链嵌合抗原受体的至少一种组分、pTα或其功能性变体、外源核酸、一个另外的催化结构域。

修饰的T细胞

本发明还涉及要通过工程化细胞的所述方法易于获得的分离的细胞或细胞系。特别是，所述分离的细胞包括如上所描述的至少一种多链CAR。在另一个实施方式中，所述分离的细胞包括每一个包括不同胞外配体结合结构域的多链CAR的群体。特别是，所述分离的细胞包括编码组成至少一种多链CAR的多肽的外源多核苷酸序列。所述细胞还可以进一步包括至少一种失活基因，其选自由CD52、GR、TCRα、TCRβ、HLA基因、免疫检查点基因如PD1和CTLA-4组成的组，或可以表达pTα转基因。

在本发明的范围内也包括分离的免疫细胞，优选根据任何一个前述方法获得的T细胞。所述免疫细胞是指造血起源的细胞，其功能上参与先天和/或适应性免疫应答的启动和/或执行。根据本发明的所述免疫细胞可以源自干细胞。干细胞可以是成熟干细胞、胚胎干细胞，更具体是非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能性干细胞或造血干细胞。代表性的人类细胞是CD34+细胞。所述分离的细胞还可以是树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或T细胞，其选自由炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞组成的组。在另一个实施方式中，所述细胞可以源自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在扩增和遗传修饰本发明细胞的之前，可以通过各种非限制性方法从受试者获得细胞的来源。细胞可以获自一些非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可以使用可获得的并且是本领域技术人员已知的任何数量的T细胞系。在另一个实施方式中，所述细胞可以源自健康供体、诊断患有癌症的患者或诊断为感染的患者。在另一个实施方式中，所述细胞是呈现不同表型特征的细胞的混合群体的部分。在本发明的范围内也包括根据前述方法从转化的T细胞获得的细胞系。耐免疫抑制性治疗并且通过前述方法易于获得的修饰的细胞包括在本发明的范围内。

在另一个实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞包括一种失活基因，选自由CD52、GR、PD1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCRα和TCRβ组成的组，和/或表达CAR、多链CAR和/或pTα转基因。在另一个具体实施方式中，所述分离的细胞包括编码组成多链CAR的所述多肽的多核苷酸。

在另一个实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞包括两种失活基因，其选自由以下组成的组：CD52和GR、CD52和TCRα、CDR52和TCRβ、GR和TCRα、GR和TCRβ、TCRα和TCRβ、PD1和TCRα、PD1和TCRβ、CTLA-4和TCRα、CTLA-4和TCRβ、LAG3和TCRα、LAG3和TCRβ、Tim3和TCRα、Tim3和TCRβ、BTLA和TCRα、BTLA和TCRβ、BY55和TCRα、BY55和TCRβ、TIGIT和TCRα、TIGIT和TCRβ、B7H5和TCRα、B7H5和TCRβ、LAIR1和TCRα、LAIR1和TCRβ、SIGLEC10和TCRα、SIGLEC10和TCRβ、2B4和TCRα、2B4和TCRβ，和/或表达CAR、多链CAR和/或pTα转基因。

在另一个实施方式中，根据本发明，通过失活TCRα基因和/或TCRβ基因，使TCR在细胞中不呈现功能。以上策略更具体地用于避免GvHD。在本发明的具体的方面，是获得源自个体的修饰细胞的方法，其中所述细胞可以不依赖于主要组织相容性复合体信号转导通路增殖。所述方法包括以下步骤：

(a)从所述个体回收细胞；

(b)通过失活TCRα或TCRβ基因离体遗传修饰所述细胞；

(c)在扩增所述细胞的适当条件下体外培养遗传修饰的T细胞。

通过该方法易于获得的修饰的细胞，其可以不依赖于主要组织相容性复合体信号转导通路增殖，包括在本发明的范围内。可以在本发明的具体的方面中使用所述修饰细胞用于治疗需要其对抗宿主抗移植物(HvG)排斥反应和移植物抗宿主病(GvHD)的患者；因此，在本发明的范围内，是治疗需要其对抗宿主抗移植物(HvG)排斥反应和移植物抗宿主病(GvHD)的患者的方法，包括通过将有效量的修饰的细胞给予所述患者治疗所述患者，该修饰的细胞包括失活的TCRα和/或TCRβ基因。

T细胞的活化和扩增

不论在T细胞的遗传修饰之前还是之后，通常使用如下列文献中所描述的方法可以活化并扩增T细胞，例如，美国专利6352694；6534055；6905680；6692964；5858358；6887466；6905681；7144575；7067318；7172869；7232566；7175843；5883223；6905874；6797514；6867041；和美国专利申请公开号20060121005。可以在体外或体内扩增T细胞。

通常，通过与刺激T细胞表面上的CD3TCR复合体和共刺激分子以创建用于T细胞的活化信号的试剂接触扩增本发明的T细胞。

例如，化学物质如钙离子载体A23187，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或促有丝分裂外源凝集素样植物凝集素(PHA)可以用于创建用于T细胞的活化信号。

作为非限制性实例，如通过接触抗CD3抗体、或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD2抗体，或通过接触结合钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)，可以在体外刺激T细胞群体。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，T细胞的群体可以接触抗CD3抗体和抗CD28抗体。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或结合至表面。如本领域普通技术人员可容易地理解的，颗粒对细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒径。在本发明的进一步实施方式中，细胞如T细胞与试剂涂覆的珠结合，该珠和细胞被随后分离，然后将细胞进行培养。在可替代实施方式中，在培养之前，试剂涂覆的珠和细胞不分离而是一起培养。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 5，(Lonza))，其可以包括用于增殖和生存力必需的因素，包括血清(例如，胎牛血清或人类血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、和TNF-或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括，但不限于，表面活性剂、血浆蛋白和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20，优化剂(Optimizer)，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或定义设置的激素，和/或足够用于生长和扩增T细胞的量的细胞因子。抗生素例如青霉素和链霉素仅包括在实验培养物中，不在要注入到受试者的细胞培养物中。在支持生长必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和大气(例如，空气加5％CO2)，靶细胞得到维持。已暴露于不同刺激时间的T细胞可显示出不同的特性。

在另一个具体实施方式中，可以通过用组织或细胞共培养扩增所述细胞。在所述细胞给予至受试者之后，所述细胞还可以在体内、例如在受试者的血液中扩增。

治疗应用

在另一个实施方式中，由不同方法获得的分离的细胞或源自如前所描述的所述的分离的细胞的细胞系可以用作药物。在另一个实施方式中，所述药物可以用于治疗需要其的患者中的癌症或感染。在另一个实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞或源自所述分离的细胞的细胞系可以在制备用于治疗需要其的患者中的癌症、病毒感染或自身免疫疾病的药物中使用。

在另一方面，本发明依赖于用于治疗需要其的患者的方法，所述方法包括以下步骤中的至少一个：

(a)提供通过前述方法中的任何一种可获得的免疫细胞；

(b)向所述患者给予所述转化的免疫细胞，

在一个实施方式中，本发明的所述T细胞可以经历体内健壮(robust)的T细胞扩增并可持续用于时间的延长量。

所述治疗可以是改善、治愈或预防的。它可以是自体免疫治疗的部分或同种异体免疫治疗的部分。自体是指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群源自所述患者或人类白细胞抗原(HLA)相容供体。同种异体是指用于治疗患者的细胞或细胞群不源自所述患者但源自供体。

本发明特别适用于同种异体免疫治疗，在它能够转化T细胞的范围内，通常从供体获得，到非同种反应性细胞中。这可根据标准方案完成，并根据需要再生多次。所产生的修饰的T细胞可以汇集并给予至一个或几个患者，使可以用作“现成的”治疗产品。

在上一节中描述了可以与公开的方法一起使用的细胞。所述治疗可以用于治疗诊断患有癌症、病毒感染、自身免疫疾病或移植物抗宿主病(GvHD)的患者。可以被治疗的癌症包括未血管化的、或尚未基本上血管化的、以及是血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或可以包括实体瘤。待用本发明的多链CAR治疗的癌症类型包括，但不限于，癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤，和恶性肿瘤例如肉瘤、癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。

它可以是结合对抗癌症的一种或多种疗法的治疗，其选自抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突状细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放射疗法的组。

根据本发明的优选的实施方式，所述治疗可给予至接受免疫抑制性治疗的患者。实际上，本发明优选依赖于细胞或细胞的群体，由于编码此类免疫抑制剂的受体的基因失活，其已经耐受至少一种免疫抑制剂。在这方面，免疫抑制性治疗应有助于患者内的根据本发明的T细胞的选择和扩增。

根据本发明，可以任何方便的方式进行细胞或细胞的群体的给予，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。可以皮下地、皮内地、瘤内地、结内地、髓内地、肌内地、通过静脉内或淋巴内注射、或腹腔内地将本文描述的组合物给予至患者。在一个实施方式中，优选通过静脉内注射给予本发明的细胞组合物。

细胞或细胞的群体的给予可以由10⁴-10⁹细胞/kg体重，优选10⁵至10⁶细胞/kg体重的给予组成，其包括那些范围内的细胞数的所有整数值。可以一个或多个剂量给予细胞或细胞的群体。在另一个实施方式中，以单剂量给予所述有效量的细胞。在另一个实施方式中，跨越一段时间以多于一个剂量给予所述有效量的细胞。给予的时间在管理医师的判断范围内并且取决于患者的临床情况。细胞或细胞的群体可以获自任何来源，如血库或供体。当个体需要变化时，确定用于具体疾病或病症的给定细胞类型的有效量的最佳范围在本领域的技术范围内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。给予的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重、并行治疗的种类(如果有的话)、治疗的频率和所需效果的性质。

在另一个实施方式中，肠胃外给予所述有效量的细胞或包含这些细胞的组合物。所述给予可以是静脉内给予。所述给予可以通过肿瘤内注射直接完成。

在本发明的某些实施方式中，结合(例如，之前、同时或之后)任何数量的相关治疗方式将细胞给予至患者，包括但不限于用试剂治疗，如抗病毒疗法，用于MS患者的西多福韦和白介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)或那他珠单抗(nataliziimab)治疗，或用于牛皮癣患者的efaliztimab治疗或用于PML患者的其他治疗。在进一步实施方式中，本发明的T细胞可结合下列项使用：化学疗法，放射，免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫清除剂如CAM PATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法，细胞毒素(cytoxin)，氟达拉滨(fludaribine)，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸(mycoplienolicacid)，类固醇，FR901228，细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖磷酸酶钙调磷酸酶(环孢霉素和FK506)或抑制p70S6激酶，其对于生长因子诱导的信号转导(雷帕霉素)重要(Liu etal.,Cell 66:807-815,11；Henderson et al.,Immun.73:316-321,1991；Bierer et al.,Citrr.Opin.mm n.5:763-773,93)。在进一步实施方式中，本发明的细胞组合物被给予至患者，结合(例如，之前，同时或之后)骨髓移植，T细胞消融疗法，使用化学疗法药剂如氟达拉滨，外部束辐射治疗(XRT)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，或抗体如OKT3或CAMPATH，在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法后给予，如与CD20反应的试剂例如利妥昔单抗。例如，在一个实施方式中，受试者可以经历用高剂量化学疗法的标准治疗然后是外周血干细胞移植。在某些实施方式中，跟随移植，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方式中，在外科手术之前或之后给予扩增的细胞。可以在本发明的具体的方面使用通过任何一种本文所描述的方法获得的所述修饰的细胞，用于治疗需要其对抗宿主抗移植物(HvG)排斥反应和移植物抗宿主病(GvHD)的患者；因此，在本发明的范围内的是治疗需要其对抗宿主抗移植物(HvG)排斥反应和移植物抗宿主病(GvHD)的患者的方法，包括通过将有效量的修饰的细胞给予所述患者治疗所述患者，修饰的细胞包含失活的TCRα和/或TCRβ基因。

工程化用于免疫治疗的人类同种异体细胞的方法的实例

为了更好地理解本发明，工程化用于免疫治疗的人类同种异体细胞的方法的一个实例示于图5，该方法包括以下步骤中的一个或几个的组合：

1.从细胞培养物或从来自一个个体患者的血液样品或从血库提供T细胞并且使用抗CD3/C28活化剂珠活化所述T细胞。该珠提供用于T细胞活化和扩增所需的初级和共刺激信号。

2.a)用pTα或其功能性变体的转基因转导所述细胞以支持CD3表面表达，并通过刺激CD3复合体允许细胞扩增。预期TCR破坏消除TCR复合体，并移除同种异体反应(GvHD)，但由于CD3信号转导组分的损失可能改变同种异体细胞扩增。预期转导的细胞表达pTα链或其功能性变体。该pTα链与TCRβ链和CD3信号转导组分配对以形成前TCR复合体并因此修复功能性CD3复合体并支持失活的TCRα细胞的活化或刺激。可以在TCRα失活之前或之后实现用pTα慢病毒载体转导T细胞。

b)用多链CAR转导所述细胞允许将T细胞重定向针对在来自包括淋巴瘤和实体瘤在内的各种恶性肿瘤的靶细胞表面表达的抗原。为了改善共刺激结构域的功能，本发明人已设计了源自如前所述FcεRI的多链CAR。可以在TCRα和其他基因如CD52基因的失活之前或之后完成转导。

3.工程化非同种反应性和免疫抑制抗性T细胞：

a)可能的是失活所述细胞中的TCRα以从细胞表面消除TCR，并且防止由同种异体的TCR将宿主组织识别为外源的组织，从而避免GvHD。

b)还可能的是失活编码免疫抑制剂的靶的一种基因以使所述细胞抗免疫抑制性治疗以防止移植排斥反应而不影响移植的T细胞。在这个实例中，免疫抑制剂的靶是CD52并且免疫抑制剂是人源化单克隆抗CD52抗体。

已由本发明人示出，通过允许T细胞内较高比率的DSB事件，TALE核酸酶的使用特别有利于实现T细胞中的上述双失活。优选地，通过用编码靶向所述基因的TALE核酸酶的mRNA电穿孔T细胞失活TCRα和CD52基因。已由本发明人发现，使用导致高转化率的mRNA对T细胞危害较小，因此在工程化T细胞的方法中是至关重要的。然后，使用磁性珠分选失活的T细胞。例如，由固体表面上的固定移除表达CD52的T细胞并且失活的细胞不暴露通过柱的应力。这种温和的方法增加适当工程化T细胞的浓度。

4.在给予至患者之前体外扩增工程化的T细胞，或在给予至患者之后通过刺激CD3复合体体内扩增工程化的T细胞。在给予步骤之前，患者可经受免疫抑制性治疗如CAMPATH1-H，其是人源化单克隆抗体抗CD52。

5.在给予至患者之前，可选地用双特异性抗体离体暴露所述细胞，或在给予至患者之后体内地促使工程化的细胞接近靶抗原。

其他定义

-除非另有规定，“一个(a)”，“一种(an)”，“该(the)”和“至少一个”可互换使用并且是指一个或一个以上。-在本文中根据单字母代码指定多肽序列中的氨基酸残基，其中例如Q是指Gln或谷氨酰胺残基，R是指Arg或精氨酸残基，D是指Asp或天冬氨酸残基。

-氨基酸替换是指用另一个氨基酸残基替换一个氨基酸残基，例如，在肽序列中用谷氨酰胺残基替换精氨酸残基是氨基酸替换。

-如下指定核苷酸：单字母代码用于指定核苷的碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鸟嘌呤。对于简并核苷酸，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k代表g或t，s代表g或c，w代表a或t，m代表a或c，y表示t或c(嘧啶核苷酸)，d代表g、a或t，v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c并且n代表g、a、t或c。

-如本文所用，“核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸和/或多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，和通过任何连接、切断、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可由单体构成，其是天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合。修饰的核苷酸可以在糖部分和/或在嘧啶或嘌呤碱基部分具有改变。糖修饰包括例如用以下取代一个或多个羟基基团：卤素、烷基基团、胺和叠氮基团，或糖可以被官能化为醚或酯。此外，可以用空间地和电子地相似的结构取代整个糖部分，如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶，酰化的嘌呤或嘧啶，或其他公知的杂环取代。可以通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接核酸单体。核酸可以是单链或双链的。

-“连续包括与所述双链断裂的上游序列同源的第一区域、待插入所述细胞基因组中的序列，和与所述双链断裂的下游序列同源的第二区域的多核苷酸”是指这样的DNA构建体或基质，其包括与原位DNA靶的区域5'和3'同源的第一和第二部分。DNA构建体还包括位于第一和第二部分之间的第三部分，其包括与相应的原位DNA序列的部分同源性，或可替代地包括与原位DNA靶的区域5'和3'无同源性。切割DNA靶以后，在包含包括在感兴趣基因座的基因组和该基质之间刺激同源重组事件，其中由基质的第三部分和所述基质的第一和第二部分的可变部分取代包含DNA靶的基因组序列。

-“DNA靶”，“DNA靶序列”，“靶DNA序列”，“核酸靶序列”，“靶序列”或“处理位点”是指可以由根据本发明的罕见切割核酸内切酶靶向和加工的多核苷酸序列。这些术语是指具体的DNA位置，优选细胞中的基因组位置，同样还有可独立地于遗传物质的主体存在的遗传物质部分，作为非限制性实例，如质粒、附加体、病毒、转座子，或在细胞器如线粒体中。作为TALE核酸酶的靶的非限制性实例，靶基因组序列一般由以下组成：由15-bp间隔子分隔的两个17-bp长的序列(称为半靶)。作为非限制性实例，每个半靶由列于表l、5、6和10中的TALE核酸酶的重复识别，其在EF1-α启动子或T7启动子的控制下编码在质粒中。由所述靶的一条链的5'至3'序列限定核酸靶序列，如表l，5，6和10所示。

-嵌合抗原受体(CAR)是指这样的分子，其组合针对存在于靶细胞上的组分的结合结构域，例如，对于具有T细胞受体活化胞内结构域的所期望抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体特异性以产生嵌合蛋白，其表现出特异性抗靶细胞免疫活性。通常，CAR由融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(scFvFc:ζ)的胞内信号域的胞外单链抗体(scFvFc)组成，并且当在T细胞中表达时，具有基于单克隆抗体的特异性重定向抗原识别的能力。本发明中使用的CAR的一个实例是针对CD19抗原的CAR并且可以包括作为非限制性实例的氨基酸序列：SEQ IDNO:73。

-“递送载体(delivery vector)”或“多个递送载体(delivery vectors)”是指任何递送载体，其可以在本发明中用于投入细胞接触(即“接触”)或递送到本发明中需要的细胞或亚细胞区室(即“引入”)试剂/化学物质和分子(蛋白或核酸)内。它包括但不限于脂质体递送载体，病毒递送载体，药物递送载体；化学媒介物(carrier)，聚合物媒介物，脂质复合物，多聚复合物(polyplexes)，树枝状聚合物，微泡(超声造影剂)，纳米颗粒，乳剂或其他适当的转移载体。这些递送载体允许递送分子、化学物质、大分子(基因，蛋白)或其他载体如质粒、由Diatos开发的肽。在这些情况下，递送载体是分子媒介物。“递送载体”或“多个递送载体”也是指进行转染的递送方法。

-术语“载体(vector)”或“多个载体(vectors)”是指能够将另一个核酸转运到其已连接它的核酸分子。本发明中的“载体”包括但不限于病毒载体，质粒，RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可以由染色体的、非染色体的、半合成或合成的核酸组成。优选的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达它们与其连接的核酸(表达载体)的那些。大量的合适载体是本领域技术人员已知的并且是可商购获得的。

-病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒如小核糖核酸病毒和甲病毒，以及双链DNA病毒，其包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1型和2型、爱泼斯坦-巴尔二氏(Epstein-Barr)病毒、巨细胞病毒)，和痘病毒(例如，牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括例如诺沃克病毒(Norwalk virus)、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,InFundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia,1996)。

-“慢病毒载体”是指基于HIV的慢病毒载体，由于它们相对大的包装能力、降低的免疫原性和它们以高效率稳定地转导大范围的不同细胞类型的能力，其对于基因递送非常有前途。慢病毒载体通常在将三种(包装、包膜和转移)或多种质粒瞬时转染到生产细胞之后产生。像HIV那样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体相互作用进入靶细胞。进入时，病毒RNA经历逆转录，其由病毒逆转录酶复合物介导。逆转录产物是双链线性病毒DNA，其是用于感染的细胞的DNA中的病毒整合的底物。“整合型慢病毒载体(或LV)”是指作为非限制性实例的此类载体，其能够整合靶细胞的基因组。相对地，“非整合型慢病毒载体(或NILV)”是指有效的基因递送载体，其不通过病毒整合酶的作用整合靶细胞的基因组。

-递送载体和载体可以与任何细胞透化技术如声孔效应或电穿孔或这些技术的衍生物相关联或组合。

-细胞(cell)或多个细胞(cells)是指源自用于体外培养的这些生物体的任何真核活细胞、原代细胞和细胞系。

-“原代细胞(primary cell)”或“多个原代细胞(primary cells)”是指直接从活组织(即活检材料)获取并对于体外生长建立的细胞，其已经经历很少的群体倍增，因此，与连续致瘤的(continuous tumorigenic)或人工永生化的细胞系相比，它们是更具有代表性的主要功能性组分并且表征它们从其衍生的组织。

作为非限制性实例，细胞系可选自由以下组成的组：CHO-K1细胞；HEK293细胞；Caco2细胞；U2-OS细胞；NIH 3T3细胞；NSO细胞；SP2细胞；CHO-S细胞；DG44细胞；K-562细胞；U-937细胞；MRC5细胞；IMR90细胞；Jurkat细胞；HepG2细胞；HeLa细胞；HT-1080细胞；HCT-116细胞；Hu-h7细胞；Huvec细胞；Molt 4细胞。

可以通过本发明的方法修饰所有这些细胞系以提供细胞系模型来产生、表达、量化、检测、研究感兴趣的基因或蛋白；这些模型也可以用于在研究和生产以及各个领域，如作为非限制性实例的化学、生物燃料、治疗学和农艺学中筛选感兴趣的生物活性分子。

-“突变”是指多核苷酸(cDNA，基因)或多肽序列中最多达一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、二十、二十五、三十、四十、五十或更多个的核苷酸/氨基酸的替换、缺失、插入。突变可影响基因或其调节序列的编码序列。它也可影响基因组序列的结构或所编码的mRNA的结构/稳定性。

-“变体”是指通过突变或替换母体分子的氨基酸序列中的至少一个残基获得的重复变体、变体、DNA结合变体、TALE核酸酶变体、多肽变体。

-“功能性变体”是指蛋白或蛋白结构域的催化活性突变体；此类突变体可以具有与其母体蛋白或蛋白结构域相同的活性或另外的特性，或更高或更低的活性。

-“基因”是指遗传的基本单元，由沿染色体以线性方式排列的DNA区段组成，其为特异性蛋白或蛋白的区段编码。基因通常包括启动子、5'非翻译区、一个或多个编码序列(外显子)、可选地内含子、3'非翻译区。基因还可以包括终止子、增强子和/或沉默子。

-如本文所用，术语“基因座(locus)”是染色体上的DNA序列(例如基因)的具体物理位置。术语“基因座”可以指染色体上的罕见切割核酸内切酶靶序列的具体物理位置。此类基因座可以包括由根据本发明的罕见切割核酸内切酶识别和/或切割的靶序列。理解的是本发明的感兴趣的基因座可不仅限制(qualify)存在于细胞的遗传物质的主体(即在染色体中)中的核酸序列，而且液限制可以独立存在于遗传物质的所述主体如质粒、附加体、病毒、转座子，或在细胞器如作为非限制性实例的线粒体中的遗传物质的部分。

-术语“核酸内切酶”是指任何野生型或变体酶，其能够催化在DNA或RNA分子、优选DNA分子内的核酸之间键的水解(切割)。核酸内切酶不切割不论其序列的DNA或RNA分子，但识别和切割在特定的多核苷酸序列处的DNA或RNA分子，其进一步称为“靶序列”或“靶位点”。当典型地具有大于12个碱基对(bp)长度、更优选的14-55bp的多核苷酸识别位点时，核酸内切酶可以被归类为罕见切割核酸内切酶。罕见切割核酸内切酶通过诱导限定基因座处的DNA双链断裂(DSB)显著增加HR(Rouet,Smih et al.1994；Choulika,Perrin etal.1995；Pingoud and Silva 2007)。罕见切割核酸内切酶可以例如是归巢核酸内切酶(Paques and Duchateau2007)、由工程化的锌指结构域与限制酶如FokI的催化结构域的融合产生的嵌合锌指核酸酶(ZFN)(Porteus and Carroll 2005)或化学核酸内切酶((Eisenschmidt,Lanio et al.2005；Arimondo,Thomas et al.2006)。在化学核酸内切酶中，化学或肽切割物(cleaver)被结合至核酸的聚合物或识别特异性靶序列的另一种DNA，从而靶向切割活性到特异性顺序。化学核酸内切酶也包括合成的核酸酶，像邻二氮杂菲、DNA切割分子、和形成三链的寡核苷酸(TFO)的结合物，其已知结合特异性DNA序列(Kalishand Glazer 2005)。此类化学核酸内切酶包括在根据本发明的术语“核酸内切酶”中。

罕见切割核酸内切酶也可以是例如TALE核酸酶，一种新类别的嵌合核酸酶，其使用FokI催化结构域和源自转录激活子样效应子(TALE)的DNA结合结构域，转录激活子样效应子是在感染过程中由黄单胞菌属(Xanthomonas genus)的植物病原体使用的蛋白家族(Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak etal.2010；Li,Huang et al.)。基于FokI的TALE核酸酶(TALE核酸酶)的功能布局基本上是ZFN的功能布局，具有由TALE结构域取代的锌指DNA结合结构域。这样，通过TALE核酸酶的DNA切割需要侧接非特异性中央区的两个DNA识别区。包括在本发明中的罕见切割核酸内切酶也可以源自TALE核酸酶。

罕见切割核酸内切酶可以是归巢核酸内切酶，也称为大范围核酸酶。此类归巢核酸内切酶是本领域公知的(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶识别DNA靶序列并产生单链或双链断裂。归巢核酸内切酶是高度特异性的，识别长度范围从12至45碱基对(bp)、通常长度范围从14至40bp的DNA靶位点。根据本发明的归巢核酸内切酶可例如对应于LAGLIDADG核酸内切酶(如SEQ ID NO:127公开的“LAGUDADF”)，HNH核酸内切酶，或GIY-YIG核酸内切酶。根据本发明的优选归巢核酸内切酶可以是I-Crel变体。

-“TALE核酸酶”(TALEN)是指由通常源自转录激活子样效应子(TALE)的核酸结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成以切割核酸靶序列的融合蛋白。催化结构域优选为核酸酶结构域并且更优选为具有核酸内切酶活性的结构域，如，例如I-Tevl、ColE7、NucA和Fok-I。在具体实施方式中，TALE结构域可以融合至大范围核酸酶，如，例如I-Crel和I-Onul或其功能性变体。在更优选的实施方式中，所述核酸酶是单体TALE核酸酶。单体TALE核酸酶是这样的TALE核酸酶，其不需要用于特异性识别和切割的二聚，如WO2012138927中描述的工程化TAL重复与I-Tevl催化结构域的融合。转录激活子样效应子(TALE)是来自细菌物种黄单胞杆菌属(Xanthomonas)的蛋白，其包括多个重复序列，每个重复包括在位置12和13(RVD)中的双残基(di-residue)，其特异于核酸靶序列的每个核苷酸碱基。具有相似模块化碱基每碱基(base-per-base)核酸结合特性(MBBBD)的结合结构域也可以源自最近由申请人在不同细菌物种中发现的新的模块化蛋白。新的模块化蛋白具有显示比TAL重复更具序列可变性的优势。优选地，与识别不同核苷酸相关的RVD是用于识别C的HD；用于识别T的NG；用于识别A的NI；用于识别G或A的NN；用于识别A、C、G或T的NS；用于识别T的HG；用于识别T的IG；用于识别G的NK；用于识别C的HA；用于识别C的ND；用于识别C的HI；用于识别G的HN；用于识别G的NA；用于识别G或A的SN和用于识别T的YG；用于识别A的TL；用于识别A或G的VT和用于识别A的SW。在另一个实施方式中，关键氨基酸12和13可向其他氨基酸残基突变以调节它们向核苷酸A、T、C和G的特异性并且具体地增强这种特异性。TALE核酸酶已被描述并且用于刺激基因靶向和遗传修饰(Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Li,Huang et al.)。工程化的TALE核酸酶以商品名TALEN^TM商购获得(Cellectis,8rue de la Croix Jarry,75013Paris,France)。

-术语“切割”是指多核苷酸的共价主链的断裂。可以通过多种方法起始切割，包括但不限于磷酸二酯键的酶学或化学水解。单链切割和双链切割二者均是可能的并且双链切割可以作为两个不同单链切割事件的结果发生。双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交体切割可以引起平末端或交错末端的产生。

-“融合蛋白”是指本领域中公知过程的结果，其在于将最初编码分离的蛋白或蛋白的部分的两种或更多种基因的连接，所述“融合基因”的翻译获得具有源自每个原始蛋白的功能特性的单个多肽。

-“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。可以通过比较出于比较的目的可以对齐的每个序列中的位置确定同一性。当比较的序列中的位置被相同的碱基占据时，则分子在该位置上是同一的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性的程度是在由核酸序列共享的位置上的相同或匹配核苷酸的数量的函数。各种对齐算法和/或程序可以用于计算两个序列之间的同一性，其包括可以作为GCG序列分析包的部分可获得的FASTA或BLAST(威斯康星州，麦迪逊，威斯康星州大学(University of Wisconsin,Madison,Wis.))并且可以以例如默认设置使用。例如，预期与本文所描述的特异性多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优选表现出基本上相同功能的多肽，以及编码此类多肽的多核苷酸。

-“相似性”描述两个或多个多肽的氨基酸序列之间的关系。使用相似性矩阵如BLOSUM45、BLOSUM62或BLOSUM80，BLASTP也可以用于识别具有与参考氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％序列相似性的氨基酸序列。除非另有所指，相似性评分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，百分比相似性基于BLASTP阳性分数并且百分比序列同一性基于BLASTP同一性分数。BLASTP“同一性”示出在相同的高得分序列对中的总残基的数量和分数；BLASTP“阳性”示出对于其对齐分数具有正值且其彼此相似的残基的数量和分数。由本公开预期且涵盖与本文公开的氨基酸序列具有这些程度的同一性或相似性或任何中间程度的同一性或相似性的氨基酸序列。使用遗传密码推导相似多肽的多核苷酸序列并且可以通过常规方式获得。例如，pTα的功能性变体可以具有与SEQ ID NO:107的氨基酸序列70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％序列相似性。编码此类功能性变体的多核苷酸将通过使用遗传密码反向翻译其氨基酸序列制备。

-“信号转导结构域”或“共刺激配体“是指在抗原呈递细胞上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供信号，除了通过例如将TCR/CD3复合体与载有肽的MHC分子结合提供的主信号外，其介导T细胞应答，包括但不限于增殖活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、和与B7-H3特异性结合的配体。除其他外，共刺激配体还包括与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，如但不限于，CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。

-“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而由细胞介导共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。

-如本文所使用的，“共刺激信号”是指这样的信号，其与主信号组合，如TCR/CD3连接，引起T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。

-“双特异性抗体”是指在单个抗体分子内具有用于两种不同抗原的结合位点的抗体。本领域技术人员应当理解，除了标准抗体结构的其他分子可以构建有两个结合特异性。应当进一步理解，由双特异性抗体结合的抗原可以是同时或顺序的。可以通过化学技术(参见例如，Kranz et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,5807)，通过“polydoma”技术(参见美国专利号4474893)或通过重组DNA技术生产双特异性抗体，其所有是本身已知的。作为非限制性实例，每个结合结构域包括来自抗体重链的至少一个可变区(“VH或H区”)，其中第一结合结构域的VH区特异性结合至淋巴细胞标志物如CD3并且第二结合结构域的VH区特异性结合至肿瘤抗原。

-如本文所使用的，术语“胞外配体结合结构域”被定义为能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，该结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择胞外配体结合结构域以识别配体，其作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物。因此，可以作为配体的细胞表面标志物的实例包括那些与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌症细胞相关的那些。

如本文所使用的，术语“受试者”或“患者”包括动物界的所有成员，其包括非人类灵长类动物和人类。

本发明的以上书面描述提供了制造和使用它的方式及过程，使得任何本领域技术人员能制造和使用它，这种实现具体提供用于所附权利要求的主题，其构成原始描述的部分。

当数值限制或范围在本文中陈述时，端点被包括在内。此外，数值限制或范围内的所有值和子范围被明确包括，如明确写出的那样。

呈现上面的描述以使本领域技术人员能够制造和使用本发明并且在具体应用及其需求的情况下提供。对优选的实施方式的各种修饰将是本领域技术人员显而易见的并且本文所定义的一般原理可应用于其他实施方式和应用而不脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不意在限于示出的实施方式，但是要符合与本文所公开的原理和特征一致的最广范围。

已经一般地描述了本发明，可以通过参考某些具体实例获得进一步理解，除非另有说明，在本文中提供它们仅用于说明的目的并且不意在限制。

实施例

实施例1：TALE核酸酶切割人类GR基因

设计和生产靶向人类GR基因外显子的6种异源二聚的TALE核酸酶。以下表1表示由每种TALE核酸酶切割的靶序列。GR TALE核酸酶由两个独立实体(称为半TALE核酸酶)组成，各自包含工程化以结合并切割由通过15-bp间隔子隔开的两个17-bp长的序列(称为半靶)组成的GR靶序列的重复序列。

表1：GR TALE核酸酶和在人类GR基因中的TALE核酸酶靶位点序列的描述

N-末端、C-末端结构域的氨基酸序列和重复基于AvrBs3TALE(参考：GenBank：X16130.1)。C-末端和N-末端结构域由两个BsmBI限制位点隔开。使用由连续限制/连接/洗涤步骤(国际PCT申请WO2013/017950)组成的固相载体法合成靶向所期望的序列(SEQ IDNO:1至6)的重复阵列(SEQ ID NO:7至18)。简言之，通过生物素/链霉亲和素相互作用将第一嵌段(编码二重复)固定在固相载体上，然后将第二嵌段(三重复)连接至第一嵌段并且在SfaNI消化后连接第三嵌段(三重复)。在获得所期望的重复阵列之后，使用三重复或二重复嵌段重复该过程。然后，产物被克隆到用于在大肠杆菌(E.coli)扩增的经典的pAPG10克隆质粒中并测序。使用用于接收质粒的IIS型限制性内切酶BsmBI以及用于插入重复序列的Bbvl和SfaNI将由此获得的重复阵列序列亚克隆至酵母表达TALE载体中。在大肠杆菌中扩增编码半TALE核酸酶的DNA(包含融合至FokI限制性内切酶催化结构域的TALE衍生的DNA结合结构域)，通过标准小量制备技术回收并测序以评估插入的完整性。

在酵母中的GR TALE核酸酶的活性：

在如前所述(国际PCT申请WO 2004/067736和于(Epinat,Arnould et al.2003；Chames,Epinat et al.2005；Arnould,Chames et al.2006；Smith,Grizot et al.2006)中的我们的酵母SSA分析中，在37℃和30℃下于靶上测试六种GR-TALE核酸酶的核酸酶活性，该靶包含产生SEQ ID NO:1至6的、在由15bp间隔子隔开的DNA链上、彼此相对的两个TALE靶序列。如前所述(国际PCT申请WO 2004/067736和于(Epinat,Arnould et al.2003；Chames,Epinat et al.2005；Arnould,Chames et al.2006；Smith,Grizot et al.2006)，构建所有包括TALE核酸酶DNA靶序列的酵母靶报告质粒。在靶上个体克隆的酵母中的TALE核酸酶切割活性水平列于表2。

表2：在酵母中的GR TALE核酸酶的切割活性

值包括在0和1之间。极大值是1。

GR TALE核酸酶在HEK293细胞中的活性：

使用哺乳动物表达载体中限制性内切酶消化，将每个TALE核酸酶构建体亚克隆在pEFlα长启动子的控制下。

在转染前1天接种一百万个HEK293细胞。用2.5μg的两个质粒的每个共转染细胞，其编码GRex2、GRex3T2、GRex3T4、GRex5Tl、GRex5T2或GRex5T3TALE核酸酶的左和右半边，根据制造商的说明书使用25μL脂质体(Invitrogen)，其在EF1α启动子的控制下识别在GR基因中感兴趣的两个半靶基因组序列。作为对照，用2.5μg的在EF1α启动子的控制下编码TALE核酸酶的左和右半边的两个质粒的每个共转染细胞，靶向T细胞受体α恒定链区(TRAC_T01)靶位点((TRAC_T01-L和-R TALE核酸酶(SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42，TRAC_T01靶位点(SEQID NO:37))。由GR编码序列中的TALE核酸酶产生的双链断裂诱导非同源末端连接(NHEJ)，其是容易出错的机制。通过在所靶向的基因组基因座处的插入或缺失的频率测定TALE核酸酶的活性。

在转染后的第2或7天收获细胞并且使用如下合成(composite)引物在提取的基因组DNA上进行基因座特异性PCR：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3'(正向衔接子序列，SEQ ID NO:126)-10N(TAG)-对于GR外显子2的基因座特异性正向序列：5'-GGTTCATTTAACAAGCTGCC-3'(SEQ ID NO:127；如SEQ ID NO:31所公开的合成引物)，对于GR外显子3：5'-GCATTCTGACTATGAAGTGA-3'(SEQ ID NO:128；如SEQ ID NO:32所公开的合成引物)和对于GR外显子5：5'-TCAGCAGGCCACTACAGGAGTCTCACAAG-3'(SEQ ID NO:129；如SEQ IDNO:33所公开的合成引物)，以及反向合成引物5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-3'(反向衔接子序列，SEQ ID NO:130))-对于GR外显子2的基因座特异性反向序列：5'-AGCCAGTGAGGGTGAAGACG-3'(SEQ ID NO:131；如SEQ ID NO:34所公开的合成引物)，对于GR外显子3：5'-GGGCTTTGCATATAATGGAA-3'(SEQ ID NO:132；如SEQ ID NO:35所公开的合成引物)和对于GR外显子5：5'-CTGACTCTCCCCTTCATAGTCCCCAGAAC-3'(SEQ ID NO:133；如SEQ IDNO:36所公开的合成引物)。

通过454测序系统(454生命科学(454Life Sciences))测序PCR产物。每PCR产物获得约10,000序列，然后对于位点特异性插入或缺失事件的存在进行分析。表3表示序列的百分比，其示出在样品中的序列总数中的TALE核酸酶靶位点处的插入或缺失。在表3中，为GRex2、GRex3T2和GRex3T4列出代表性实验的结果。

在测试的所有情况下，相对于转染后第2天的试样之一，突变的％在第7天是相似的。还分析了突变事件的性质，显现出在相比于插入的所有情况下的大多数缺失。

表3：在HEK293细胞中的内源TALE核酸酶靶位点处的靶突变的百分比

在原代T淋巴细胞中的GR TALE核酸酶的活性：

使用表达载体中的限制性内切酶消化将每个TALE核酸酶构建体亚克隆在T7启动子的控制下。

编码切割GR基因组序列的TALE核酸酶的mRNA合成自携带来自T7启动子的下游编码序列的各质粒。使用抗CD3/CD28活化剂珠(Life technologies)活化从外周血分离的T淋巴细胞5天并且使用CytoLVT-P仪器(BTX-Harvard apparatus)，用10μg的编码两个半TALE核酸酶的2个mRNA的每个通过电穿孔转染5百万个细胞。用10μg的编码靶向CD52基因(CD52_T02-L和-R TALEN(SEQ ID NO:55和56)，靶序列CD52_T02SEQ ID NO:40)的两个半TALE核酸酶的2个mRNA的每个转染的T细胞用作对照。

转染后的第3和7天，从转染的细胞分离基因组DNA并且使用前述引物进行基因座特异性PCR。通过454测序系统(454Life Sciences)测序PCR产物。每个PCR产物获得约10,000序列，然后对于位点特异性插入或缺失事件的存在进行分析；结果列于表4。

表4：在原代T淋巴细胞中的内源TALE核酸酶靶位点处的靶向突变的百分比

实施例2：切割人类CD52基因、人类T细胞受体α恒定链(TRAC)和人类T细胞受体β恒定链1和2(TRBC)的TALE核酸酶

如实施例1中所述，设计且生产分别靶向CD52、TRAC和TRBC基因的异二聚体TALE核酸酶。靶基因组序列由通过11或15-bp间隔子隔开的两个17-bp长的序列(称为半靶)组成。每个半靶由表5中所列的半TALE核酸酶的重复识别。人类基因组包括两个功能性T细胞受体β链(TRBC1和TRBC2)。在α/βT淋巴细胞的发育期间，在每个细胞中选择这两个恒定链之一以剪接至TCR-β的可变区并且形成功能性全长β链。在TRBC1和TRBC2之间保守的序列中选择2个TRBC靶使得相应的TALE核酸酶会同时切割TRBC1和TRBC2。

表5：CD52、TRAC和TRBC TALE核酸酶和在人类相应基因中TALE核酸酶靶位点序列的描述

已设计TRAC和CD52基因中的其他靶序列，其示于表6。

表6：用于TRAC和CD52TALE核酸酶的另外的靶序列

CD52-TALE核酸酶、TRAC-TALE核酸酶和TRBC-TALE核酸酶在HEK293细胞中的活性

使用哺乳动物表达载体中限制性内切酶消化将每个TALE核酸酶构建体亚克隆在pEFlα长启动子的控制下。在转染前1天接种一百万个HEK293细胞。根据制造商的说明书，使用25μl的脂质体(lipofectamine)(Invitrogen)，用2.5μg的在EF1-α启动子的控制下编码识别在CD52基因、T细胞受体α恒定链区(TRAC)或T细胞受体β恒定链区(TRBC)中的感兴趣的基因组序列中的两个半靶的TALE核酸酶的两个质粒中的每个共转染细胞，或用5μg对照pUC载体(pCLS0003)。由非同源末端连接(NHEJ)在活细胞中修复由CD52或TRAC编码序列中的TALE核酸酶产生的双链切割，其是容易出错的机制。通过在所靶向的基因组基因座处的插入或缺失频率测定TALE核酸酶在活细胞中的活性。在转染后48小时，从转染的细胞分离基因组DNA并且使用如下合成引物进行基因座特异性PCR：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(正向衔接子序列，SEQ ID NO:126)-10N(TAG)-对于CD52的基因座特异性正向序列：5'-CAGATCTGCAGAAAGGAAGC-3'(SEQ ID NO:134；如SEQ IDNO:66所公开的合成引物)，对于TRAC：5'-ATCACTGGCATCTGGACTCCA-3'(SEQ ID NO:135；如SEQ ID NO:67所公开的合成引物)，对于TRBC1：5'-AGAGCCCCTACCAGAACCAGAC-3'(SEQ IDNO:136；如SEQ ID NO:68所公开的合成引物)，或对于TRBC2：5'-GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3'(SEQ ID NO:137；如SEQ ID NO:69所公开的合成引物)，以及反向合成引物5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG(反向衔接子序列，SEQ ID NO:130)-对于CD52的内源基因座特异性反向序列：5'-CCTGTTGGAGTCCATCTGCTG-3'(SEQ ID NO:138；如SEQ ID NO:70所公开的合成引物)，对于TRAC：5'-CCTCATGTCTAGCACAGTTT-3'(SEQ ID NO:139；如SEQ IDNO:71所公开的合成引物)，对于TRBC1和TRBC2：5'-ACCAGCTCAGCTCCACGTGGT-3'(SEQ IDNO:140；如SEQ ID NO:72所公开的合成引物)。通过454测序系统(454Life Sciences)测序PCR产物。每个PCR产物获得约10,000序列，然后对于位点特异性插入或缺失事件的存在进行分析；结果列于表7。

表7：对于TALE核酸酶靶向的CD52_T02、TRAC_T01、TRBC_T01和TRBC_T02靶的插入缺失百分比

CD52-TALE核酸酶、TRBC-TALE核酸酶和TRAC-TALE核酸酶在原代T淋巴细胞中的活 性

使用哺乳动物表达载体中的限制性内切酶消化将每个TALE核酸酶构建体亚克隆在T7启动子的控制下。

从携带来自T7启动子的下游编码序列的质粒合成编码切割CD52TRAC和TRBC基因组序列的TALE核酸酶的mRNA。使用抗CD3/CD28活化剂珠(Life technologies)活化从外周血分离的T淋巴细胞5天，并且随后使用CytoLVT-P装置，然后用10μg的编码两个半TALE核酸酶(或非编码RNA作为对照)的2个mRNA的每个通过电穿孔转染5百万个细胞。作为由NHEJ诱导的插入和缺失的结果，在部分细胞中，对于CD52和/或TRAC的编码序列会在框外(out offrame)，获得非功能性基因。在电穿孔后的第5天，通过用于在其细胞表面的CD52或TCR存在的流式细胞术，用荧光染料结合的抗CD52或抗TCR抗体标记细胞。由于从外周血扩增的所有T淋巴细胞正常表达CD52和TCR，CD52阴性或TCR阴性细胞的比例是TALE核酸酶活性的直接测定结果。表8中列出代表性实验的结果。表9示出测试TRBC TALE核酸酶效率的代表性实验的结果。

表8：在转染相应的表达TALE核酸酶的多核苷酸后，CD52-阴性、TCR-阴性和CD52/TCR-双阴性T淋巴细胞的百分比

ARN转染	％TCR-阴性细胞
		无RNA	1,22
TALEN TRBC_T01	6,52
		TALEN TRBC_T02	23,5

表9：在转染表达TRBC TALE的核酸酶多核苷酸后，TCR-阴性T淋巴细胞的百分比

具有靶CD52基因的T细胞的功能分析

CD52基因失活的目的是使得T淋巴细胞耐抗CD52抗体介导的免疫抑制。如前段中所述，用编码切割CD52的TALE核酸酶的mRNA转染T淋巴细胞。在转染后的第7天，用具有或不具有30％兔补体(Cedarlane)的50μg/ml抗CD52单克隆抗体(或大鼠IgG作为对照)处理细胞。在37℃下培养2小时后，用荧光染料结合的抗CD52抗体连同荧光细胞活力染料(eBioscience)标记并且通过流式细胞术分析细胞以测定活细胞中的CD52阳性和CD52阴性细胞的频率。图6示出代表性实验的结果，证明CD52阴性细胞完全耐补体介导的抗CD52抗体毒性。

具有靶TRAC基因的T细胞的功能分析

TRAC基因失活的目的是使得T淋巴细胞不应答T细胞受体刺激。如前段中所述，以编码切割TRAC或CD52的TALE核酸酶的mRNA转染T淋巴细胞。在转染后的第16天，用最高达5μg/ml的植物凝集素(PHA，Sigma-Aldrich)处理细胞，T细胞有丝分裂原(mitogen)通过T细胞受体作用。在PHA处理后具有功能T细胞受体的细胞应增加尺寸。在培养三天后，用荧光染料结合的抗CD52或抗TCR抗体标记并且通过流式细胞仪分析细胞以比较在TCR阳性和TCR阴性细胞之间、或在CD52阳性和CD52阴性细胞之间的细胞尺寸分布。图7示出TCR阳性细胞在PHA处理后显著增加尺寸，然而TCR阴性细胞具有如未处理的细胞一样的尺寸，表明TRAC失活使得它们不响应于TCR信号转导。与此相反，CD52阳性和CD52阴性增加尺寸至相同的程度。

具有靶CD52和TRAC基因的T细胞的功能分析

为了验证当提供有嵌合抗原受体(CAR)时，基因组工程化不影响T细胞呈现抗肿瘤活性的能力，我们用10μg的编码抗CD19 CAR(SEQ ID NO:73)的RNA转染已经用CD52-TALE核酸酶和TRAC-TALE核酸酶靶向的T细胞。24小时后，用表达CD19的Daudi细胞培养T细胞4小时。通过流式细胞仪分析(Betts,Brenchley et al.2003)测定CD107a(由T淋巴细胞释放的细胞毒性颗粒(称为脱粒)的标志物)的细胞表面上调。结果包括在图8中，并示出在响应于PMA/离子霉素(阳性对照)或CD19+Daudi细胞方面，CD52阴性/TCRαβ阴性细胞和CD52阳性/TCRαβ阳性细胞具有相同的脱粒能力。CD107上调依赖于CD19+的存在。这些数据表明，基因组工程化对T细胞发动受控抗肿瘤应答的能力没有不利影响。

CD52-TALE核酸酶和TRAC-TALE核酸酶在原代T淋巴细胞中的基因组安全

由于我们的构建体包括核酸酶亚基，重要的问题是多重TALE核酸酶转染是否会引起基因毒性和在‘紧密匹配’靶序列处或通过错配半TALE核酸酶的脱靶切割。为了评价TRAC-TALE核酸酶和CD52-TALE核酸酶对细胞基因组的完整性的影响，我们列出了在呈现脱位点切割潜力的人类基因组中的序列。为了生成该列表，我们识别基因组中的与原始半靶相比具有最多达4种取代的所有序列，然后识别在具有离彼此9至30bp间隔子的头对头方向上的潜在半靶的对。这种分析包括由一个半TALE核酸酶分子的同源二聚体或由一个CD52半TALE核酸酶和一个TRAC半TALE核酸酶形成的异源二聚体潜在靶向的位点。基于考虑到个别取代的成本和取代的位置的特异性数据(其中，对于在半靶的3'末端处的碱基错配是更容忍的)，我们为潜在脱位点靶评分。我们获得了173个具有反映切割可能性估计的分数的独特的序列。我们选择了15个最高得分并且通过深度测序在用CD52和TRAC TALE核酸酶同时转染并且通过磁分离纯化为CD52阴性、TCRαβ阴性的T细胞中的这些基因座处发现的突变的频率来分析。结果在图9中。插入/缺失的最高频率是7×l0^-4。这些结果使得假定脱位点靶与预期靶相比至少600倍不太可能突变。因此，在该研究中使用的TALE核酸酶试剂呈现极其特异性。

实施例3：切割人类CTLA4基因和人类PDCD1基因的TALE核酸酶。

如实施例1中所述，设计且生产分别靶向PDCD1和CTLA4基因的异二聚体TALE核酸酶。靶基因组序列由通过11或15-bp间隔子隔开的两个17-bp长的序列(称为半靶)组成。每个半靶由表10中所列的半TALE核酸酶的重复识别。

表10：CTLA4和PDCD1TALE核酸酶和在人类相应基因中TALE核酸酶靶位点序列的描述

CTLA4-TALE核酸酶和PDCDl-TALE核酸酶在HEK293细胞中的活性

使用哺乳动物表达载体中限制性内切酶消化将每个TALE核酸酶构建体亚克隆在pEFlα长启动子的控制下。在转染前1天接种一百万个HEK293细胞。根据制造商的说明书，使用25μl的脂质体(Invitrogen)，以2.5μg的在EFL-α启动子控制下的编码识别在PDCD1和CTLA-4基因中感兴趣的基因组序列中的两个半靶的TALE核酸酶的两个质粒的每个共转染细胞，或用5μg对照pUC载体(pCLS0003)。由非同源末端连接(NHEJ)在活细胞中修复由PDCD1和CTLA-4编码序列中的TALE核酸酶产生的双链切割，其是容易出错的机制。通过在所靶向的基因组基因座处的插入或缺失的频率测定TALE核酸酶在活细胞中的活性。在转染后48小时，从转染的细胞分离基因组DNA并且使用如下合成引物进行基因座特异性PCR：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(正向衔接子序列，SEQ ID NO:126)-10N(TAG)-对于CTLA4_T01的基因座特异性正向序列：5'-CTCTACTTCCTGAAGACCTG-3'(SEQ ID NO:141；如SEQ ID NO:99所公开的合成引物)，对于CTLA4_T03/T04：5'-ACAGTTGAGAGATGGAGGGG-3'(SEQ ID NO:142；如SEQ ID NO:100所公开的合成引物)，对于PDCD1_T01：5'-CCACAGAGGTAGGTGCCGC-3'(SEQ ID NO:143；如SEQ ID NO:101所公开的合成引物)，或对于PDCD1_T03：5'-GACAGAGATGCCGGTCACCA-3'(SEQ ID NO:144；如SEQ ID NO:102所公开的合成引物)，以及反向合成引物5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG(反向衔接子序列，SEQID NO:130)-对于CTLA4_T01的内源基因座特异性反向序列：5'-TGGAATACAGAGCCAGCCAA-3'(SEQ ID NO:145；如SEQ ID NO:103所公开的合成引物)，对于CTLA4_T03/T04：5'-GGTGCCCGTGCAGATGGAAT-3'(SEQ ID NO:146；如SEQ ID NO:104所公开的合成引物)，对于PDCD1_T01：5'-GGCTCTGCAGTGGAGGCCAG-3'(SEQ ID NO:147；如SEQ ID NO:105所公开的合成引物)，或对于PDCD1_T03：5'-GGACAACGCCACCTTCACCT-3'(SEQ ID NO:148；如SEQ ID NO:106所公开的合成引物)。

通过T7-核酸内切酶分析来分析PCR产物：简要地，在PCR产物的变性和再退火后，T7核酸内切酶将特异性消化由野生型和突变链构成的错配DNA。然后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳解析消化产物。消化产物的存在指示由TALE核酸酶活性诱导的突变序列。结果示于图10，其中箭头指向消化的PCR产物。它们证明了PDCD1_T1、PDCD1_T3、CTLA4_T1、CTLA4_T3和CTLA4_T4TALE核酸酶都在它们的靶位点处显示出致突变核酸酶活性。

实施例4：pTα允许在失活TCRαT淋巴细胞中的CD3表面表达：

不同的前Tα版本的描述：

人类pTα基因编码跨膜糖蛋白，其包括胞外Ig样结构域、疏水跨膜结构域和大的C-末端胞质内尾。已设计并且在表11中描述源自人类pTα糖蛋白的不同版本，并在图11中表示。

表11：pTα构建体的子集的描述

所测试的不同前Tα构建体包括：

1)pTα缺失突变体：在人类pTα蛋白(其包括114个氨基酸)(SEQ ID NO:107)的胞内胞质尾中产生不同的缺失。所测试的构建体包括蛋白的全长版本(FL)和突变，其中从蛋白的C-末端缺失18、48、62、78、92、110和114个氨基酸(SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:114)。

2)包括胞内活化结构域的pTα突变体：将FL和Δ48变体在它们的C末端融合至CD8、CD28或41BB胞内活化结构域(SEQ ID NO:115至SEQ ID NO:120)。

3)pTα/TCRα嵌合突变体：在构建体之一中，TCRα胞内结构域(IC)融合至pTα的较小尾(tail-less)版本(Δ114)(SEQ ID NO:121)。还产生第二构建体，其中pTα胞外结构域融合至来自TCRα的跨膜(TM)和IC结构域(SEQ ID NO:122)。

4)pTα二聚突变体：某些突变已在文献中描述为能够改变前TCR复合体的寡聚/二聚能力。提出这些突变体以允许在细胞表面的前TCR表达，而不诱导组成型信号转导(假定在前TCR寡聚后诱导)。已在pTαΔ48变体中引入该突变并且是：

-1xMUT：W46R(SEQ ID NO:123)

-4x MUT：D22A、K24A、R102A，R117A(SEQ ID NO:124)

不同前Tα构建体在TRAC失活Jurkat细胞中的活性：

为了对于它们修复在TCRα失活细胞中的CD3表面表达的能力筛选不同的pTα变体，产生这样的细胞系，其中使用靶向TRAC的TALEN中断TCRα基因。使用CytoPulse电穿孔用编码切割TALEN的TRAC的质粒转染Jurkat细胞(T细胞白血病细胞系)并且其中然后使用CD3磁珠通过阴性选择纯化KO细胞(TCR_α/β ^NEG；CD3^NEG)。扩增KO群体(JKT_KOx3细胞)并且用于筛选不同的pTα变体。通过用15μg的在EF1α启动子的控制下的编码不同pTα变体的质粒转染一百万个JKT_KOx3细胞进行筛选，接着在转染48h后通过CD3细胞表面表达的流式细胞仪分析。图12是转染效率(BFP+细胞的％)和JKT_KOx3细胞中的FL、Δ18和Δ48pTα构建体活性的代表性实施例，其基于由流式细胞仪测定的CD3+细胞的％。来自不同构建体的结果归纳在表12中。

表12：不同pTα构建体在Jurkat TCRα失活细胞中的活性。通过在用不同的前Tα构建体转染的Jurkat TCRα失活细胞上CD3表达的流式细胞仪分析测定活性

pTα-FL和pTα-Δ48在TCRα失活的原代T淋巴细胞中的活性：

为了测试pTα-FL和pTα-Δ48版本在TCRα失活T淋巴细胞中诱导CD3表面表达的能力，pTα-FL和pTα-Δ48编码序列被克隆到自失活pLV-SFFV-BFP-2A-PCTRA慢病毒载体，其在SFFV启动子下编码蓝色荧光蛋白(BFP)，接着是自切割T2A肽(图13)。

使用抗CD3/CD28活化剂珠(Life technologies)活化从外周血分离的T淋巴细胞72小时并且使用CytoLVT-S仪器(BTX-Harvard Harbour)，通过用10μg编码靶向TCRα恒定链区(TRAC)的TALE核酸酶的mRNA的电穿孔转染4.5百万个细胞。在电穿孔两天后，用LV-SFFV-BFP-2A-pTα-Δ48或LV-SFFV-BFP-2A-对照慢病毒载体转导T细胞。然后，使用抗CD3磁珠(Miltenyi Biotech)纯化CD3阴性和CD3low T细胞。该实验方案示于图14A。

图14B表示在用CD3珠纯化之前和之后，在用BFP-2A-pTαΔ48(KO/Δ48)或对照BFP慢病毒载体(KO/BFP)转导的TCRα失活T细胞(KO)上的TCRα/β、CD3细胞表面表达和BFP表达的流式细胞仪分析。与非转导细胞(BFP-细胞)相比，用BFP-T2A-pTα-Δ48载体转导的TCRα失活细胞(BFP+细胞)示出更高水平的CD3。在用对照BFP载体转导的细胞中没有观察到差异。这些结果表明，pTα介导在TCRα失活细胞的细胞表面的CD3表达的修复。与此相反，如预期，在用或不用pTα-Δ48表达载体转导的细胞中，TCRα/β染色保持不变。

pTα介导的CD3表达支持TCR缺陷型T细胞的活化：

为了确定pTα转导细胞活化信号的能力，在用pTα-Δ48和pTα-Δ48.41BB转导的TCRα失活T细胞上分析早期和晚期活化标志物的表达。如先前部分和图14A中所述，从原代人类T细胞产生用pTα-Δ48和pTα-Δ48.41BB转导的TCRα失活T细胞。

为了检测经由CD3的信号转导，在用CD3珠纯化TCRα失活T细胞后的第3天，使用抗CD3/CD28涂覆的珠重新活化细胞(图14A)。分别在重新活化后的24和48小时，用荧光染料结合的抗CD69(早期活化标志物)和抗CD25(晚期活化标志物)染色细胞，并通过流式细胞仪分析(图15A-图15B)。如图15A-图15B中所示，表达pTα-Δ48(KO/pTα-Δ48)或pTα-Δ48.41BB(KO/pTα-Δ48.BB)的TCRα失活细胞示出活化标志物的上调，达到与在TCRα/β表达细胞(NEP：非电穿孔细胞)中观察到的那些相似的水平。

T细胞活化的另一个指标是细胞尺寸的增加，其有时被称为“爆破(blasting)”。在使用抗CD3/CD28珠重新活化72小时后由细胞尺寸的流式细胞仪分析测定前TCR复合体诱导“爆破”的能力(图15C)。用抗CD3/CD28珠刺激诱导在表达TCRα/β复合体的细胞对(vs.)表达pTα-Δ48或pTα-Δ48.41BB的细胞中的细胞尺寸的可比增加。总之，这些结果表明，前TCR复合体有能力转导信号，其有效地结合至介导活化标志物上调的机制。

pTα介导的CD3表达使用刺激的抗CD3/CD28抗体支持TCR缺陷型原代T细胞的扩增

为了评估前TCR复合体支持长期细胞增殖的能力，测定如前所描述产生的细胞增殖。在初始活化后十天，细胞保持在IL2(非重新作用(non-Re-act))或具有抗CD3/CD28珠的IL2(重新作用(Re-act))中。对于每个条件，在不同时间点计数并通过流式细胞仪分析细胞以估计BFP+细胞的数量。比较用BFP或BFP-T2A-前TCRα-Δ48载体转导的TCRα失活细胞(KO)的生长并且相对于在重新活化后第2天获得的值评估这些细胞的倍数诱导。图16示出用两个独立供体获得的结果。在这两种案例中，表达pTα-Δ48的TCRα失活细胞比仅表达BFP对照载体的TCRα失活细胞显示更大的扩增。对于第二供体，表达pTα-Δ48.41BB或全长pTα的TCRα失活细胞也包括在内，其也显示比仅表达BFP对照载体的TCRα失活细胞更大的扩增。

实施例5：使用Cytopulse技术优化T细胞中的mRNA转染。

确定优化的cytopulse程序

在非活化的PBMC上进行第一组实验以确定其中细胞可以被转染的电压范围。如表13中所述测试五种不同的程序。

表13：用于确定在PBMC衍生的T细胞中电穿孔需的最低电压的不同cytopulse程序

使用不同的Cytopulse程序，在0.4cm间隙小杯(30或15×l0⁶细胞/ml)中用20μg的编码GFP的质粒和对照质粒pUC电穿孔3或6百万个细胞。在电穿孔后24小时，通过流式细胞仪在电穿孔细胞中分析GFP表达以确定转染效率。示于图17中的数据表明，在PBMC衍生的T细胞中用于质粒电穿孔所需要的最低电压。这些结果表明，cytopulse程序3和4允许高效转化T细胞(EP#3和#4)。

活化的纯化T细胞的mRNA的电穿孔

在确定允许T细胞的有效DNA电穿孔的最佳cytopulse程序后，我们测试该方法是否适用于mRNA电穿孔。

用PHA/IL2预活化6天的5×l0⁶纯化T细胞被重悬在cytoporation缓冲液T(BTX-Harvard apparatus)中并且使用如先前部分中所确定的优选cytopulse程序，在0.4cm小杯中，用10μg的编码GFP的mRNA或20μg的编码GFP的质粒或pUC电穿孔(表14)。

表14：用于电穿孔纯化T细胞的Cytopulse程序

在转染后48小时，用细胞活力染料(eFluor-450)染色细胞并且通过流式细胞仪分析确定细胞活力和存活GFP+细胞的％(图18)。

示于图18的数据表明，具有本文所确定的最佳条件的RNA电穿孔是无毒性的，并允许转染95％以上的活细胞。

在合成中，整个数据集显示，可以有效地用DNA或RNA转染T细胞。特别是，RNA转染对细胞活力没有影响并且允许在细胞的群体中感兴趣的转染基因的均匀表达水平。

可以在所使用的活化方法(PHA/IL-2或CD3/CD28涂覆的珠)的独立细胞活化后的早期实现有效的转染。本发明人已从活化后的72h以>95％的效率成功地转染细胞。此外，也可以使用相同的电穿孔方案获得在解冻和活化后的T细胞的有效转染。

在用于TALE核酸酶功能表达的原代人类T细胞中的mRNA电穿孔

在表明mRNA电穿孔允许在原代人类T细胞中的GFP的有效表达后，我们测试该方法是否适用于感兴趣的其他蛋白的表达。转录活化子样效应子核酸酶(TALE核酸酶)是用过将TAL DNA结合结构域融合至DNA切割结构域产生的位点特异性核酸酶。它们是强有力的基因组编辑工具，因为它们诱导在几乎任何期望的DNA序列处的双链断裂。这些双链断裂活化非同源末端连接(NHEJ)，一种容易出错的DNA修复机制，潜在地导致感兴趣的任何期望基因的失活。可替代地，如果适当的修复模板被同时引入到细胞，可以通过同源重组修复TALE核酸酶诱导的DNA断裂，因此提供将在基因序列处修饰的可能性。

我们已使用mRNA电穿孔以表达设计以特异性切割人类基因中的序列的TALE核酸酶，其编码T细胞抗原受体(TRAC)的α链。在该序列中引起的突变预期会导致基因失活和来自细胞表面的TCRαβ复合体的损失。使用Cytopulse技术将TRAC TALE核酸酶RNA或作为对照的非编码RNA转染到活化的原代人类T淋巴细胞。电穿孔顺序在于如表14中所述的2个1200V的脉冲，接着是四个130V的脉冲。

通过在电穿孔7天后的TCR表面表达的流式细胞仪分析(图19，上图)，我们观察到44％的T细胞丧失TCRαβ表达。通过TRAC基因座的PCR扩增接着是454高通量测序，我们分析了转染细胞的基因组DNA。所测序的33％的等位基因(2153中的727)包括在TALE核酸酶切割位点处的插入或缺失。图19(下图)示出突变等位基因的实施例。

这些数据表明，使用cytopulse技术的mRNA的电穿孔引起TRACTALE核酸酶的功能表达。

用编码抗CD19单链嵌合抗原受体(CAR)的单顺反子mRNA电穿孔T细胞：

将用抗CD3/CD28涂覆的珠和IL2预活化几天(3-5)的5×10⁶T细胞重悬在cytoporation缓冲液T中并且使用表14中所述的方案，不用mRNA或用10μg的编码单链CAR(SEQ ID NO:73)的mRNA在0.4cm小杯中电穿孔。

在电穿孔后24小时，细胞用可固定细胞活力染料eFluor-780和PE结合的山羊抗小鼠IgG F(ab’)2片段特异性染色以评估CAR在活细胞上的细胞表面表达。数据示于图20。这表明，用前述单顺反子mRNA电穿孔的绝大部分活T细胞在其表面表达CAR。

在电穿孔后24小时，将T细胞与Daudi(CD19+)细胞共培养6小时，并通过流式细胞仪分析以检测脱粒标志物CD107a在其表面的表达(Betts,Brenchley et al.2003)。

示于图20的数据表明，用前述单顺反子mRNA电穿孔的大部分细胞在表达CD19的靶细胞的存在下脱粒。这些结果清楚地表明，在电穿孔T细胞的表面表达的CAR是活化的。

用编码抗CD19多亚基嵌合抗原受体(CAR)的多顺反子mRNA电穿孔T细胞：

将用抗CD3/CD28涂覆的珠和IL2预活化几天(3-5)的5×10⁶T细胞重悬在cytoporation缓冲液T中并且使用表14中所述的方案，不用mRNA或用45μg的编码多链CAR(SEQ ID NO:226)的mRNA在0.4cm小杯中电穿孔，图21A和图4B(csm4)。

在电穿孔后24小时，用可固定细胞活力染料eFluor-780和PE结合的山羊抗小鼠IgG F(ab’)2片段特异性染色细胞以评估CAR在活细胞上的细胞表面表达。示于图21的数据表明用前述多顺反子mRNA电穿孔的绝大部分活T细胞在其表面表达CAR。

在电穿孔后24小时，将T细胞与Daudi(CD19+)细胞共培养6小时并通过流式细胞仪分析以检测脱粒标志物CD107a在其表面的表达。示于图21的数据表明，用前述多顺反子mRNA电穿孔的大部分细胞在表达CD19的靶细胞的存在下脱粒。这些结果清楚地表明，在电穿孔T细胞的表面表达的CAR是活化的。

实施例6：多链CAR

A.多链CAR的设计

基于对于IgE的高亲和力受体(FcεRI)设计靶向CD19抗原的9种多链CAR。在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上表达的FcεRI引发过敏反应。它是由单个α亚基(SEQ ID NO:202)、单个β亚基(SEQ ID NO:203)和两个二硫键连接的γ亚基(SEQ ID NO:204)构成的四聚体复合物。α亚基包括IgE结合结构域。β和γ亚基包括ITAM(SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199)，其介导信号转导，图4A。如图4B、图4C和表15中所述设计多链CAR。在每条多链CAR中，FcRα链的胞外结构域被删除并且由4G7scFv和CD8α铰链(SEQ ID NO:206)替换。在多链CAR csm2、csm4、csm5、csm8和csm10中，FcRβ链和/或FcRγ链的ITAM被删除。在多链CAR csm2、csm4、csm5、csm6、csm8、csm9和csm10中，CD3ζ(SEQ ID NO:197)的3ITAM被添加到FcRβ链或FcRγ链。在多链CAR csm2、csm4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9和csm10中，4-1BB胞内结构域(SEQID NO:200)被添加到FcRα链、FcRβ链或FcRγ链。在多链CAR csm10中，CD28胞内结构域被添加到FcRα链(SEQ ID NO:201)。

表15：多链CAR版本的链组合物的描述

B.瞬时表达的多链CAR可以引发T细胞活化

多链CAR可以在多顺反子mRNA的电穿孔后在人类T细胞中表达。

用封端和聚腺苷酸化的多顺反子mRNA电穿孔T细胞(图21A)，该mRNA是使用mMESSAGE mMACHINE试剂盒和作为模板的线性化质粒制备的。用作模板的质粒包括T7RNA聚合酶启动子，接着是编码csml、csm2、csm4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9或csm10的多顺反子DNA序列(SEQ ID NO:224至232)。

根据以下方案，使用CytoLVT-S设备(Cellectis)完成将多顺反子mRNA电穿孔到人类T细胞中：将用抗CD3/CD28涂覆的珠和IL2预活化几天(3-5)的5×10⁶个T细胞重悬在cytoporation缓冲液T中；和使用PBMC3方案表14，用45μg的mRNA在0.4cm小杯中电穿孔。

在电穿孔后24小时，用可固定细胞活力染料eFluor-780和PE结合的山羊抗小鼠IgG F(ab’)2片段特异性标记使用编码多链CAR的多顺反子mRNA工程化的人类T细胞，并通过流式细胞仪分析。示于图22的数据表明，使用多顺反子mRNA工程化的活T细胞表达多链CAR csml、csm2、csm4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9和csm10。

如对于FcεRI的文献中所述，由3条链的表达调节多亚基CAR的表达。单独的α链比α+γ链复合体较少表达并且α+γ链复合体比α+β+γ链复合体较少表达，图23。

在与靶细胞共培养后瞬时表达多链CAR的人类T细胞脱粒

在电穿孔后24小时，将使用编码多链CAR的多顺反子mRNA工程化的人类T细胞与靶(Daudi)或对照(K562)细胞共培养6小时。然后，通过流式细胞仪分析CD8+T细胞以检测脱粒标志物CD107a在其表面的表达。示于图24的数据表明，表达多链CAR csml、csm2、csm4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9和csm10的人类CD8+T细胞在与表达靶细胞的CD19的共培养中脱粒，但不在与对照细胞的共培养中脱粒。

瞬时表达多链CAR的人类T细胞在与靶细胞共培养后分泌细胞因子

在电穿孔后24小时，使用编码多链CAR的多顺反子mRNA工程化的人类T细胞与靶(Daudi)或对照(K562)细胞共培养24小时。然后，收获上清液并使用TH1/TH2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒分析以量化由T细胞产生的细胞因子。示于图25A-图25C的数据表明，表达多链CARcsml、csm2、csm4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9和csm10的人类T细胞在与表达CD19的靶细胞的共培养中产生IFNγ、IL8和IL5，但在与对照细胞的共培养不产生它们。

瞬时表达多链CAR的人类T细胞裂解靶细胞

在电穿孔后24小时，使用编码多链CAR的多顺反子mRNA工程化的人类T细胞与靶(Daudi)或对照(K562)细胞共培养4小时。然后，通过流式细胞仪分析靶细胞以分析它们的活力。示于图26的数据表明，表达多链CAR csml、csm2、csm4、csm5、csm6、csm7、csm8、csm9和csm10的细胞裂解表达CD19的靶细胞，而不是对照细胞。

本说明书中所引用的参考文献列表

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Claims (26)

1.一种多链多链嵌合抗原受体(CAR)，至少包括：

-包含至少一种胞外配体结合结构域的一种跨膜多肽，其中，所述至少一种胞外配体结合结构域与细胞表面分子相互作用；和

-包含至少一种信号转导结构域的一种跨膜多肽；

其中，所述多链嵌合抗原受体的一个或多个所述信号转导结构域存在于与携带一个或多个所述胞外配体结合结构域的多肽不同的多肽上。

2.根据权利要求1所述的多链嵌合抗原受体，其中，至少一种跨膜多肽包括Fc受体的部分。

3.根据权利要求2所述的多链嵌合抗原受体，其中，所述Fc受体的部分选自由以下组成的组：(a)FcεRIα链、(b)FcεRIβ链和(c)FcεRIγ链。

4.根据权利要求3所述的多链嵌合抗原受体，其中，所述Fc受体的部分是FcεRIα链的部分。

5.根据权利要求3或4所述的多链嵌合抗原受体，包括FcεRIα链的部分和FcεRIβ链的部分，使得所述FcεRI链二聚在一起以形成二聚的嵌合抗原受体。

6.根据权利要求3或4所述的多链嵌合抗原受体，包括FcεRIα链的部分和FcεRIγ链的部分，使得所述FcεRI链三聚在一起以形成三聚的嵌合抗原受体。

7.根据权利要求3或4所述的多链嵌合抗原受体，包括FcεRIα链的部分、FcεRIβ链的部分和FcεRIγ链的部分，使得所述FcεRI链四聚在一起以形成四聚的嵌合抗原受体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的多链嵌合抗原受体，其中，所述胞外配体结合结构域识别作为在与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的多链嵌合抗原受体，其中，所述胞外配体结合结构域是单链抗体片段(scFv)。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的多链嵌合抗原受体，其中，所述跨膜多肽进一步包括茎区。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的多链嵌合抗原受体，其中，所述信号转导结构域选自由以下组成的组：TCRζ链、FCεRβ链、FcεRIγ链、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的多链嵌合抗原受体，其中，所述CAR包括共刺激结构域。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的多链嵌合抗原受体，进一步包括选自由以下组成的组的共刺激分子：CD28、OX40、ICOS、CD137和CD8。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的多链嵌合抗原受体，包括选自由以下组成的组的多肽：SEQ ID NO:202至SEQ ID NO:204和SEQ ID NO:206至SEQ ID NO:213。

15.一种包括编码至少一种跨膜多肽的核酸序列的多核苷酸，所述跨膜多肽构成根据权利要求1至14中任一项所述的多链CAR。

16.一种包括编码两种或更多种跨膜多肽的核酸序列的多核苷酸，所述跨膜多肽构成根据权利要求1至14中任一项所述的多链CAR。

17.一种包含权利要求15或16所述的多核苷酸的载体。

18.一种工程化免疫细胞的体外方法，包括：

(a)提供免疫细胞；

(b)在所述细胞的表面表达至少一种根据权利要求1至14中任一项所述的多链嵌合抗原受体。

19.根据权利要求18所述的工程化免疫细胞的体外方法，包括：

(a)提供免疫细胞；

(b)将至少一种编码多肽的多核苷酸引入到所述细胞，所述多肽构成至少一种根据权利要求1至14中任一项所述的多链嵌合抗原受体；

(c)将所述多核苷酸表达进入所述细胞。

20.根据权利要求18所述的工程化免疫细胞的体外方法，包括：

(a)提供免疫细胞；

(b)在所述细胞的表面表达根据权利要求1至14中任一项所述的多链嵌合抗原受体的群体，每一种所述多链嵌合抗原受体包含不同的胞外配体结合结构域。

21.根据权利要求19所述的工程化免疫细胞的体外方法，包括：

(a)提供免疫细胞；

(b)将至少一种编码多肽的多核苷酸引入到所述细胞，所述多肽构成根据权利要求1至14中任一项所述的多链嵌合抗原受体的群体，每一种所述多链嵌合抗原受体包含不同的胞外配体结合结构域；

(c)将所述多核苷酸表达进入所述细胞。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的工程化免疫细胞的体外方法，进一步包括步骤(d)在所述免疫细胞中失活至少一个选自由以下组成的组的基因：TCRα、TCRβ、CD52、GR和免疫检查点。

23.一种从根据权利要求18至22中任一项所述的方法可获得的分离的免疫细胞。

24.一种包括至少一种根据权利要求1至14中任一项所述的多链嵌合抗原受体的分离的免疫细胞。

25.根据权利要求23或24所述的分离的免疫细胞，所述分离的免疫细胞源自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的分离的免疫细胞在制备用于治疗疾病的药物中的用途。