CN104328126A - 一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因及其编码蛋白质及其基因克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因及其编码蛋白质及其基因克隆方法，属于植物抗逆性基因研究领域。本发明提供的高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因来自高山离子芥，在低温胁迫条件下，在高山离子芥中的表达量均明显上升，该基因的超量表达，从而增强高山离子芥的抗逆性。

Description

一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因及其编码蛋白质及其基因克隆方法

技术领域

本发明涉及一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因及其编码蛋白质及其基因克隆方法，属于植物抗逆性基因研究领域。

背景技术

低温胁迫常使某些起源于热带、亚热带地区的植物因冷敏感性而无法在温带以北地区露地安全越冬，也给热带、亚热带植物偶然的低温胁迫带来严重的灾害。因此，改造农作物的遗传特性来增加抗寒性已经成为植物育种学家的一个长期追求目标。遗憾的是，传统的育种方法在提高作物抗寒性上取得的进展甚微。从现代生物技术和分子生物学发展趋势可见，转基因技术是解决这一难题最有效的方法之一。低温冷害是农作物生长的季节性和区域性的限制因素，但低温适应过程的实质是细胞内基因表达发生变化的结果，低温条件特异性地诱导了细胞内一系列与细胞抗冻有关的基因表达(Weiser CJ.Sciene.1970,169:1269-1278)，(Artus N N,Uemura M,Steponkus P L,et al.PNAS,1996,93:13404-13409)。

目前对高山离子芥水通道蛋白基因的研究还没有报导。在植物抗寒转基因研究中，Davies等(Wada H,Gombos Z,Murata N.Nature,1990,347(6289):200-203)，(Murata N I,Nashita O,Higashi S.Hayasha,et al.Nature,1992,356:710-713)在上世纪80年代末首先将美洲拟鲽鱼的抗冻蛋白基因导入烟草、郁金香和油菜，发现转基因植株获得了一定的抗冻能力。之后，利用脱饱和酶基因、拟南芥的甘油－3－磷酸酰酶基因和Cor15a基因等冷诱导基因也在不同程度上提高了受试植物的抗寒能力(Steponkus PL,Uemura M,Joseph R A,Gilmour S J and Thomashow M F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998,95:14570-14575)。有研究表明水通道蛋白的表达受高盐条件、旱胁迫、寒胁迫的调控，可能与植物的抗逆性相关，但调控机制还需要进一步研究(Jang J Y,Kim Y,el al.Ⅰlanl MolBiol.2004.54(5):713-725)。水通道蛋白大量存在于动物、植物等多种生物中(张正斌。作物抗旱节水的生理遗传育种基础[M].北京:科学出版社,2003.84-96)。第一个植物水通道蛋白-TIP是从拟南芥中分离出来的(Hofte G M,Hubbard L,Reizer J,et al.PlantPhysiol,1992,17(256):385-387),它位于液泡膜上。随后，第一个植物质膜AQP-拟南芥RD28也被发现(Daniels M J,Mirkov T E,Chrispeels M J.PlantPhysiology,1994,106(4):1325-1333)。迄今为止，已在拟南芥、玉米、烟草、水稻、豌豆、甘蓝、马铃薯、菠菜、番茄、草莓等多种植物中发现并克隆得到了水通道蛋白。另外，从蛋白数据库中也发现了大量的AQP同源物，它广泛存在于胆单子叶和双子叶植物、C3和C4代谢植物中(Scheaffner A R.P lanta,1998,204:131-139)。水通道蛋白的发现对于研究植物的水分关系具有重要意义，但到目前为止，对于每一个AQP以及整个植株AQP在不太生理条件下功能的研究仍然较少。

水通道蛋白的鉴定和研究为进一步探讨植物水分关系提供了新思路。水分在植物体内运输受特定的水通道蛋白基因的表达、调控及亚细胞定位的修饰。水通道蛋白是调节水分在调节水分在细胞间运输和在植株内传导的分子基础，并且与植物的抗逆性如抗盐性、抗寒性、抗冻性之间存在着相互调控的关系，因此可以通过研究表达不同膜蛋白的转基因植株，将分子生物学与植物生理学相结合来确定AQP在植株水分运输中的作用以及与植物抗逆性之间的关系。目前对于高山离子芥还没有相关报道，因此，对高山离子芥水通道蛋白基因的克隆以及对其表达的研究，将有助于明确水通道蛋白基因作用的分子机理，同时获得可应用于其他热带、亚热带地区的对于寒冷敏感的植物的抗冻性改良的基因资源。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因及其编码蛋白质及其基因克隆方法，其中，所述的高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因命名为ChlRB7基因，来自高山离子芥。

本发明提供的高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因来自高山离子芥。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因的克隆方法，包括：

1)选用高山离子芥种子作为实验材料，经低温诱导后取植物组织置于研钵中，室温下采用Trizol reagent抽提总RNA，并采用DnaseⅠ处理，以去除样品中的基因组DNA污染，RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；

2)利用Promega的RT-PCR体系反转录获得cDNA；

3)根据EST信息设计高山离子芥水根特异表达通道蛋白基因编码区引物；

正向引物：5’-TTG CTG GDG TTG GGT CHG C-3’SEQ ID NO：3

反向引物：5’-TCC GCG GCY GTK GCR TAA ACI-3’SEQ ID NO：4

反应体系为：10×buffer 8.0μl，rTaq 1.0μl，dNTPs 1.0μl，primers 2.0μl，dH₂O 8μl，共20μl反应体系；

PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃复性40s，72℃延伸60s，30个扩增循环；72℃延伸10min，4℃保存；

4)PCR反应产物在1.0％的Agarose胶上检测，用GelExtractionKit回收目的片段，连入pGEM一T载体(Promega)。连接后的质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，蓝白斑筛选后挑取白斑提取质粒，经PCR验证为阳性克隆后测序，得高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因。

本发明的有益效果是：

本发明提供的高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因来自高山离子芥，在低温胁迫条件下，在高山离子芥中的表达量均明显上升，该基因的超量表达，从而增强高山离子芥的抗逆性。其基因工程受体植物既适合于水稻、玉米、小麦、甘蔗等单子叶植物，同时也适合于大豆、棉花、烟草等双子叶植物。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

1)高山离子芥根总RNA提取与检测

参照Invitrogen公司Trizol试剂的使用方法，从高山离子芥根提取总RNA并依据M-MLV Reverse Transcriptase(TakaRa)反转录酶的使用方法将其反转录为cDNA于-20℃保存，备用。

2)高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因ChlRB7第一段序列获得

从Genbank下载已经克隆得到相关基因如烟草、胡萝卜和向日葵基因序列，进行序列比对。根据比对结果在CDS保守区设计简并引物，利用间并引物经PCR扩增后得到两条分别约750bp和391bp大小的条带。其中391bp的片段与预期结果相符，T-克隆测序结果在NCBI上进行序列比对发现，与拟南芥δ-TIPs的同源性达到了100％。第一段序列经T-克隆测序结果如下：TTGCTGGTGTTGGGTCTGCCATTGCCTACGCGAAGCTGACGTCAGACGCTGCTCTTGACACGCCCGGACTAGTGGCCATCGCGGTGTGCCATGGATTCGCCCCCTTCGTCGCCGTCGCAATCGGAGCCAACATCTCCGGTGGCCACGTGAACCCAGCCGTCACTTTTGGCCTAGCCGTCGGTGGTCATATCACAGTCATCACCGGAGTTTTCTACTGGATCGCTCAGCTTCTCGGCTCCACCGCCGCTTGCTTCCTCCTCAAATACGTCACCGGTGGTTTGGCTGTTCCAATCCACAGCGTTGGGGCTGGACTAGGTTCACTAGAAGGAGTAGTGATGGAGATCATCATCACTTTCGCTTTGGTCTACACCGTTTATGCAACGGCCGCGGA，SEQ ID NO：5。

3)高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因ChlRB7第二段序列获得

根据已获得第一个片段序列在NCBI比对的结果分析，该序列与拟南芥TIPs基因同源性较高，由此在保守序列区进一步设计简并引物，经PCR扩增后得到了大小约270bp的单一条带。第二段序列经T-克隆测序结果如下：TCGCTTTGGTCTACACCGTTTACGCCACAGCAGCTGATCCCAAGAAGGGATCTCTCGGAACCATCGCTCCTCTAGCCATTGGTCTCATTGTTGGTGCCAACATCCTAGCCGCCGGTCCATTCTCAGGTGGATCCATGAACCCGGCTCGTTCCTTTGGACCAGCTGTTGCAGCCGGTGACTTCTCTGGTCACTGGGTTTACTGGGTGGGACCACTCATCGGTGGTGGACTTGCCGGAGCTGTTTACGGAAATGTCTTCATGGGTTCTTCCGAA，SEQ IDNO：6。

4)高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因ChlRB7的RACE反应

根据Invitrogen GeneRacerTM RACE Ready cDNA kit试剂盒操作手册，在已知序列中分别设计了5’，3’RACE的特异引物。以高山离子芥根总RNA为模板参照试剂盒的方法和试剂合成cDNA，分别用5’，3’的特异引物依照该试剂盒说明书进行PCR扩增，分别获得了两条都约270bp的单一片段。经T-克隆测序，分析结果表明5’RACE序列中含有起始密码子ATG和已知重复区的序列。3’RACE序列中含有重复区序列、终止密码子TAA和poly(A)结构，由此得到了ChlRB7基因的全长序列。5’RACE序列如下所示：GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAAAATCTTCTTCATTAAACAAAAACTTTCAAAACACATTTTCTCCTTCTTCCTCATTCTTCTTCTTCATTTACAACAATGGCAGGAGTAGCCTTCGGTTCCTTTGACGATTCCTTCAGCTTGTCTTCTCTAAGAGCTTACCTCGCTGAGTTCATCTCCACTTTGCTCTTTGTTTTCGCTGGTGTTGGCTCTGCCATTGCCTACGCAAAGCTGACGTCAGACGCTGCTCTTGACACGCCCGGACTAG，SEQ ID NO：7。

3’RACE序列如下所示：TGCCGGAGCTGTTTACGGAAATGTCTTCATGAGTTCTTCCGAACATGCTCCTCTTGCTTCTTCTGATTTCTAAGCTAAAAAAACATGTCATGATGATGATGATTATTGATTCATGTTTTTTTATGTGTTCGTTTGGTTTCTTCTTGCTGCGTTTTGGACTTTTGGTCCGGTTTCGTTGTAATTCTTGTATGAATATCATTTAATGGAATTGGCTGTTTGGCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACTGTCATGCCGTTACGTAGCG，SEQ ID NO：8。

5)高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因ChlRB7长获得

根据RACE测序结果比对分析和第一、二段序列拼接得到了1004bp的基因全长序列(GeneBank Accession No.EU636988)，其中开放阅读框(ORF)有753bp，编码251个氨基酸的蛋白质。在起始密码子ATG前有一段104bp的5’非翻译区(5’UTR)，在终止密码子TAA后有一段173bp的3’非翻区(3’UTR)，其中包括24bp的poly(A)。由此，我们得到了不包括内含子的基因全长序列。将该基因CDS区全序列在NCBI上比对结果分析表明，所克隆得到的基因与拟南芥TIPs基因的同源性高达92％，与胡萝卜(Daucus carota)DcRB7基因同源性为65％，与烟草(N.tabacum)的TobRB7基因同源性为64.1％，与向日葵(common sunflower)SunRB7同源性为62.2％，与番茄(Lycopersicon esculentum)RB7同源性为63.6％，与马铃薯(Solanum tuberosum)potRB7同源性为64％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求1所述的高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因的克隆方法，其特征在于，包括：

1)选用高山离子芥种子作为实验材料，经低温诱导后取植物组织置于研钵中，室温下采用Trizol reagent抽提总RNA，并采用Dnase Ⅰ处理，以去除样品中的基因组DNA污染，RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；

2)利用Promega的RT-PCR体系反转录获得cDNA；

3)根据EST信息设计高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因编码区引物；

正向引物：5’-TTG CTG GDG TTG GGT CHG C-3’SEQ ID NO：3

反向引物：5’-TCC GCG GCY GTK GCR TAA ACI-3’SEQ ID NO：4

反应体系为：10×buffer 8.0μl，rTaq 1.0μl，dNTPs 1.0μl，primers2.0μl，dH₂O 8μl，共20μl反应体系；

PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃复性40s，72℃延伸60s，30个扩增循环；72℃延伸10min，4℃保存；

4)PCR反应产物在1.0％的Agarose胶上检测，用GelExtractionKit回收目的片段，连入pGEM-T载体Promega，连接后的质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，蓝白斑筛选后挑取白斑提取质粒，经PCR验证为阳性克隆后测序，得高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因。