[go: up one dir, main page]

CN103361366A - 一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH、制备方法、及其编码产物的氨基酸序列 - Google Patents

一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH、制备方法、及其编码产物的氨基酸序列 Download PDF

Info

Publication number
CN103361366A
CN103361366A CN 201210082191 CN201210082191A CN103361366A CN 103361366 A CN103361366 A CN 103361366A CN 201210082191 CN201210082191 CN 201210082191 CN 201210082191 A CN201210082191 A CN 201210082191A CN 103361366 A CN103361366 A CN 103361366A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cbadh
alcohol dehydrogenase
dehydrogenase gene
mustard
alpine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 201210082191
Other languages
English (en)
Inventor
安黎哲
刘丽君
宋渊
向云
岳修乐
张华�
盛红梅
何文亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou University
Original Assignee
Lanzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou University filed Critical Lanzhou University
Priority to CN 201210082191 priority Critical patent/CN103361366A/zh
Publication of CN103361366A publication Critical patent/CN103361366A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种高山离子芥抗冻相关的类醇脱氢酶基因CbADH、它具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种高山离子芥抗冻相关的类醇脱氢酶基因CbADH的编码产物CbADH,它具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

Description

一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH、制备方法、及其编码产物的氨基酸序列
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域,尤其涉及特别涉及一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH、其编码产物CbADH的氨基酸序列,以及基因CbADH制备方法。
背景技术
低温是影响植物地理分布和生长季节的最主要的环境因素之一,低温冻害严重地影响着农作物的生长状况和产量(Thomashow 1999)。大量的研究表明,各类冷响应基因的表达对植物的抗冻有着至关重要的作用(Gong et al. 2002; Hsieh et al. 2002;Knight et al. 1999; Thomashow 1999; Tahtiharju and Palva 2001)。众多冷响应基因编码种类繁多的蛋白,如植物呼吸、碳循环、脂类、苯丙素和抗氧化代谢过程相关的酶,还有调控基因表达的转录因子,抗冻蛋白等(Guy 1990;Thomashow 1999; Mohapatra et al. 1989)。
醇脱氢酶是植物中普遍存在的酶,在植物的生长、发育和抗逆性中都发挥着重要的作用。经国内外研究发现,能被脱水寒冷诱导表达、缺氧诱导表达、干旱、低温、病原菌入侵诱导表达以及与Ca2+信号转导相关。拟南芥中的乙醇脱氢酶,是该植物中的一种代表性酶,它是催化乙醛和乙醇间的氧化还原反应的重要还原酶,在植物无氧呼吸过程中起着重要作用,也与冷胁迫,脱水,ABA以及乙烯等逆境胁迫应答相关。
高山离子芥(Chorispora bungeana)是十字花科离子芥属多年生植物,分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、高盐碱、空气稀薄、辐射强、劲风。高山离子芥在我国主要分布于乌鲁木齐河源区流石碓,该地区海拔3600~3900 m。年平均气温在-5~-7 ℃之间,6~8月平均气温为3.6 ℃,气温日差较大,是一种伴随反复冻融的冰冻环境。并且处于迎风坡,流石碓中砾石保水性差,时常造成干旱胁迫。高山离子芥在外部形态结构和生态策略上没有显著的抗性特征,为了耐受长期低温、高盐碱、强紫外、大风和生理干旱,适应这些不利的环境条件,势必通过表达抗性基因来维持自身的生理代谢和生长发育,以避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。由于高山离子芥处于极端环境(高盐碱、低温、高辐射等),积累了适应极端胁迫的有益突变,所以克隆和研究高山离子芥的抗冻的类醇脱氢酶基因CbADH将会为构建具有抗冻能力的转基因植株提供物质基础。
发明内容
鉴于醇脱氢酶的研究对提高植物的生长、发育和抗逆性有重要的意义,本发明旨在从高山离子芥基因组中分离一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH,一方面可以扩大醇脱氢酶基因资源,另一方面可以为利用高山离子芥醇脱氢酶基因构建转基因植株提供物质基础。
本发明的另一目的在于提供一种有高山离子芥类醇脱氢酶CbADH基因编码的蛋白CbADH。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
本发明通过RACE扩增克隆得到的高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH,具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。CbADH全长1383bp,包含一个1071 bp的开放阅读框(ORF),开放阅读框从206 bp开始,至1276 bp处结束,5’非翻译区长度为84 bp,3’非翻译区长度为205 bp,polyA尾长度为23 bp。该基因编码一个含有356个氨基酸的蛋白CbADH,具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,对应的分子量为38.7 kDa,等电点为5.73,消光系数为20565,脂肪指数为82.92。整个多肽链表现为亲水性的稳定性蛋白。经分析,该蛋白可能具有跨膜结构,没有信号肽结构,不是分泌蛋白。
通过将高山离子芥中CbADH蛋白与其他物种的ADH蛋白在Tair和NCBI上进行序列同源性比对,得知其与拟南芥的ADH氨基酸序列的相似度最高,达到93%(图1,图2)。
通过SOPMA软件对高山离子芥CbADH的氨基酸序列进行二级结构分析,得知α螺旋(alpha helix)在该基因二级结构中占27.81%,伸展链(extended strand)结构占23.60%,β转角(beta turn)结构占8.99%,无规卷曲(random coil)结构占39.61%。
本发明对克隆的高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH进行了鉴定。本发明通过双向电泳分析发现其在冷胁迫下表达明显提高,在4 oC处理下CbADH表达与未处理植株相比,上调4倍;-4 oC处理下CbADH表达与未处理植株相比,表达上调6-7倍。证明该基因是一种冷诱导基因,与高山离子芥抗冻性有关。
附图说明
图1  高山离子芥CbADH蛋白的氨基酸序列在Tair和NCBI同源性比对,利用MEGA软件分析的进化关系。
图2  高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH核苷酸序列NCBI同源性比对,利用MEGA软件分析的进化关系。
具体实施方式
在本发明的下述实施例中,所用的实验材料为高山离子芥(Chrisporabungeana) (西部植物种质资源库数据平台)。
实施例1
高山离子芥抗冻基因CbADH序列的克隆方法 。     
(1)CbADH cDNA 3′末端的克隆(3′-RACE)
利用RNA提取分离试剂(Trizol,Invitrogen)分离高山离子芥愈伤组织总RNA,其具体方法是:收集高山离子芥愈伤组织100 mg,立即置于液氮中研磨成粉末,之后加入1 ml Trizol试剂,充分混匀,吸入到一个1.5 ml的离心管中;室温放置5 min;加入0.2 ml新鲜氯仿,剧烈振摇15 s,室温静置3 min;4℃,12000 g离心15 min;上清水相转移到一个新的1.5 ml离心管中,加入0.5 ml异丙醇混匀,4℃,12000 g离心10 min沉淀RNA;RNA沉淀用1 ml 75%乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中,-70℃保存备用。
cDNA第一链合成用3′-full RACE core kit(Takara)提供的oligo dT-3 site adaptor primer按照说明合成。根据GeneBank已发表的拟南芥ADH基因设计两个简并套式正义引物:
CbADH  5’引物序列:
   ① outer primer:   5′-TGAATCATCCCGCCTCGCTCCGTGTT-3′
   ② nested Primer:  5′-ATGGCCGAAGATGCTGGAAACAATG-3′
CbADH  3’引物序列:
   ① outer primer:   5′-TGTTGCCCATCTTCACCGGAGAAT-3′
   ② nested Primer:  5′-ATCCGGATGCTCCTCTTGACAAAG-3′
5’RACE特异引物:
   ① outer primer:   5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′
   ② nested Primer:  5′-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′
3’RACE特异引物:
   ① outer primer:   5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3
   ② nested Primer:  5-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3
与3-RACE Kit 提供的3′ -inner primer 和3′ -outer primer配对进行PCR扩增,得到CbCRT的3′-末端,扩增程序为94 ℃ 5 min, 重复扩增步骤30个循环(94 ℃ 50 sec,57 ℃ 50 sec,72 ℃  90 sec),最后在72 ℃扩增5 min。电泳后,扩增产物切胶纯化,与pGEM-T载体连接到,测序。
(2)CbADH cDNA 5′末端的克隆(5′-RACE)
参照上一步的操作步骤提取高山离子芥的总RNA,按照5′-full RACE kit(Takara)使用说明,用随机引物合成cDNA第一链。用CbCRT特异性的引物CbCRTR(5′- GTTTACTTCTGGGAAGCTAAGGGACAAAC -3′)和CbCRTRn(5′- CACCCCAACCATCATGAACACATTC -3′)为反义引物,与试剂盒提供的5′-inner primers和5′-outer primer配对,扩增CbCRT的5′-末端。扩增产物切胶纯化,与pGEM-T载体连接到,测序。
通过RACE扩增克隆得到的高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH,具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。CbADH全长1383bp,包含一个1071 bp的开放阅读框(ORF),开放阅读框从206 bp开始,至1276 bp处结束,5’非翻译区长度为84 bp,3’非翻译区长度为205 bp,polyA尾长度为23 bp。该基因编码一个含有356个氨基酸的蛋白CbADH,具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,对应的分子量为38.7 kDa,等电点为5.73,消光系数为20565,脂肪指数为82.92。整个多肽链表现为亲水性的稳定性蛋白。经分析,该蛋白可能具有跨膜结构,没有信号肽结构,不是分泌蛋白。
通过将高山离子芥中CbADH蛋白与其他物种的ADH蛋白在Tair和NCBI上进行序列同源性比对,得知其与拟南芥的ADH氨基酸序列的相似度最高,达到93%(图1,图2)。
通过SOPMA软件对高山离子芥CbADH的氨基酸序列进行二级结构分析,得知α螺旋(alpha helix)在该基因二级结构中占27.81%,伸展链(extended strand)结构占23.60%,β转角(beta turn)结构占8.99%,无规卷曲(random coil)结构占39.61%。
实施例2 
冷胁迫诱导CbADH基因的鉴定。
本发明对克隆的高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH进行了鉴定。本发明分别在4 oC和-4 oC下处理高山离子芥,提取处理后的高山离子芥的总蛋白,进行双向电泳。对胶用blue silver法染色及扫描分析后,通过比较选择最佳的pH值范围的胶条来获得分辨率最高的蛋白电泳图谱来分离高山离子芥叶片的蛋白质并找出差异蛋白点,手工切取后进行胶内酶切。对酶切产物进行质谱分析。据质谱所得肽段信息进行蛋白质数据库搜索来确定蛋白点信息。通过PDQuest8.0软件对blue silver法染色的胶进行分析找到胶上的蛋白点,并通过软件定量分析找到有显著变化的蛋白点。用维恩图(Venn diagram)表示差异点在不同温度处理下的变化情况,找出上调和下调的点。通过NCBI 网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)提供的 Position-specific iterated and pattern-hit initiated BLAST(PSI- and PHI-BLAST)引擎进行蛋白质的氨基酸序列BLAST,获得蛋白质功能结构域特征和相关功能注释。根据每个蛋白的基因本体(gene ontology,GO)将蛋白进行功能分类。结果显示,在4 ℃处理下CbADH表达与未处理植株相比,上调4倍;-4 ℃处理下CbADH表达与未处理植株相比,表达上调6-7倍。证明该基因是一种冷诱导基因,与高山离子芥抗冻性有关。
Figure IDA0000147123400000011
Figure IDA0000147123400000021
Figure IDA0000147123400000031

Claims (2)

1.一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH,其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述基因CbADH的编码产物高山离子芥类醇脱氢酶,其特征在于:所述高山离子芥类醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
CN 201210082191 2012-03-26 2012-03-26 一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH、制备方法、及其编码产物的氨基酸序列 Pending CN103361366A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201210082191 CN103361366A (zh) 2012-03-26 2012-03-26 一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH、制备方法、及其编码产物的氨基酸序列

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201210082191 CN103361366A (zh) 2012-03-26 2012-03-26 一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH、制备方法、及其编码产物的氨基酸序列

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103361366A true CN103361366A (zh) 2013-10-23

Family

ID=49363623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201210082191 Pending CN103361366A (zh) 2012-03-26 2012-03-26 一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH、制备方法、及其编码产物的氨基酸序列

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103361366A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104328126A (zh) * 2014-10-22 2015-02-04 李鸣 一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因及其编码蛋白质及其基因克隆方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104328126A (zh) * 2014-10-22 2015-02-04 李鸣 一种高山离子芥根特异表达水通道蛋白基因及其编码蛋白质及其基因克隆方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Walia et al. Large‐scale expression profiling and physiological characterization of jasmonic acid‐mediated adaptation of barley to salinity stress
Sreedharan et al. MusaSAP1, a A20/AN1 zinc finger gene from banana functions as a positive regulator in different stress responses
Jiang et al. The AabHLH35 transcription factor identified from Anthurium andraeanum is involved in cold and drought tolerance
Gu et al. Identification and characterization of a LEA family gene CarLEA4 from chickpea (Cicer arietinum L.)
Georgieva et al. Identification of desiccation-regulated genes by cDNA-AFLP in Haberlea rhodopensis: a resurrection plant
Yang et al. The vacuolar membrane sucrose transporter MdSWEET16 plays essential roles in the cold tolerance of apple
Wang et al. PagERF16 of Populus promotes lateral root proliferation and sensitizes to salt stress
CN105838723A (zh) 一种紫花苜蓿抗寒基因MsZFP及其编码蛋白与应用
Minh et al. A LEA gene from a Vietnamese maize landrace can enhance the drought tolerance of transgenic maize and tobacco
CN102766610B (zh) 一种植物抗旱相关蛋白PvSnRK2.3及其编码基因和应用
Cho et al. Type II ice-binding proteins isolated from an arctic microalga are similar to adhesin-like proteins and increase freezing tolerance in transgenic plants
George et al. Identification of stress-induced genes from the drought-tolerant plant Prosopis juliflora (Swartz) DC. through analysis of expressed sequence tags
CN103103169B (zh) 一种植物抗旱相关蛋白EeSnRK2.4及其编码基因和应用
CN103320410B (zh) 一种植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7及其编码基因和应用
CN108048469A (zh) 蔗茅野生种中受低温胁迫表达的蔗茅类钙调素基因ErCML30
CN102643828B (zh) 一种冰缘植物蛋白及其编码序列与应用
CN104975032B (zh) 一个桑树白藜芦醇合成酶基因
CN103361366A (zh) 一种高山离子芥类醇脱氢酶基因CbADH、制备方法、及其编码产物的氨基酸序列
CN103361358B (zh) 一种抗盐胁迫基因CbCRT1、制备方法以及其编码产物的氨基酸序列
CN113603747B (zh) 由Pri-miRNA编码的多肽在提高葡萄抗寒性能中的应用
CN105924512B (zh) 一种与油脂含量相关的GhLPAAT5-like蛋白及其编码基因与应用
CN116425846A (zh) 蛋白质OsNLP4在植物分蘖调控中的应用
Zhang et al. ChaWRKY40 enhances drought tolerance of ‘dawei’hazelnuts by positively regulating proline synthesis
CN102021188A (zh) 白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途
CN103992397B (zh) 玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1及其编码基因

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20131023