CN116004663A - 一种耐受氯离子毒害的玉米抗盐qtl基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种耐受氯离子毒害的玉米抗盐QTL基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的蛋白定位于液泡膜；在根部皮层细胞中表达；在维管组织以及周围的木质部薄壁细胞中不表达；介导Cl^‑往皮层液泡的区隔化来调控Cl^‑根往地上部的转运。本申请的玉米抗盐QTL基因可用于调控玉米耐盐性能，育种耐盐玉米品种。

Description

一种耐受氯离子毒害的玉米抗盐QTL基因及其应用

技术领域

本发明属于农业基因工程技术领域，具体涉及一种耐受氯离子毒害的玉米抗盐QTL基因及其应用。

背景技术

土壤盐渍化是分布十分广泛的环境胁迫,是导致世界范围农作物产量和品质大幅下降的主要环境胁迫之一。全球大约有20％的耕地受到盐渍化影响,此外自然环境恶化、灌溉依赖的耕作方式等也加剧了土壤盐渍化问题(Sahab et al.,2021；Yang and Guo,2018；Zhao etal.,2020)。研究显示,当盐胁迫来临,土壤中盐分增加,导致根系周围水势降低,进而抑制根系对水分和营养物质的吸收,引发生理干旱,产生渗透胁迫；由于Na⁺和Cl^-的逐渐积累产生离子毒害。渗透胁迫和离子毒害都会干扰植物的正常代谢过程,影响植物的生长和发育,进而降低作物产量(Deinlein et al.,2014)。研究作物耐盐的分子机制、挖掘耐盐优异基因资源、培育耐盐农作物,对全球粮食安全和农业可持续发展有重要意义。

Na⁺和Cl^-是盐渍化耕地中最主要的、过多后对农作物有害的离子。其中，Na⁺被广泛认为是盐胁迫条件下与作物产量下降最相关的离子,目前研究人员的研究主要集中在Na⁺稳态维持方面,并且鉴定到一系列与Na⁺相关的耐盐QTL。对于Cl^-稳态维持的研究却相对较少,既不清楚农作物中Cl^-稳态维持的机制,也不清楚Cl^-稳态对主要农作物耐盐的重要性。玉米是我国的主要农作物之一,它对盐胁迫中度敏感。已有的研究表明,盐胁迫对不同自玉米交系的生长抑制作用差异显著。差异的原因主要是由于不同玉米自交系对渗透胁迫、Na⁺和Cl^-毒害耐受性上的差异导致的。在过去的几年里,关于玉米地上部Na⁺排斥和SOIS(salt-induced osmotic stress)抗性相关的主效QTL被陆续鉴定并验证。例如,ZmHKT1和ZmHAK4的优良等位基因通过降低木质部汁液中的Na+浓度,增强玉米耐盐性。Ca²⁺结合蛋白ZmNSA1(Na⁺Content under Saline-Alkaline Condition)通过调节质膜H⁺-ATPase基因的转录,调节玉米盐碱胁迫下地上部Na⁺外排。基本能量释放途径(TCA循环)和类黄酮代谢途径的变异与玉米SIOS耐受性的自然变异有关。但到目前为止,还没有与玉米盐胁迫下Cl^-稳态维持相关的QTL基因被鉴定和应用。

发明内容

一方面，本申请提供了一种耐受氯离子毒害的玉米抗盐QTL基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述玉米抗盐QTL基因位于玉米4号染色体上217,627,480kb-217,633,128kb的位置。

另一方面，本申请提供了根据权利要求1的基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

进一步地，所述蛋白定位于液泡膜。

进一步地，所述蛋白在根部皮层细胞中表达,；在维管组织以及周围的木质部薄壁细胞中不表达。

上述“表达”或“不表达”是基于分子生物学领域对于基因表达相对水平的一般认识判断。

进一步地，所述蛋白介导Cl^-往皮层液泡的区隔化来调控Cl^-根往地上部的转运。

另一方面，本申请提供了上述玉米抗盐QTL基因在调控玉米耐盐性能中的应用。

进一步地，所述应用中敲除起始玉米植株或品种中的上述玉米抗盐QTL基因来获得耐盐性能较起始玉米植株或品种更低的玉米植株或品种。

进一步地，所述敲除使用CRSPR-Cas9方法进行。

进一步地，所述应用中过表达起始玉米植株或品种中的上述玉米抗盐QTL基因来获得耐盐性能较起始玉米植株或品种更高的玉米植株或品种。

另一方面，本申请提供了上述玉米抗盐QTL基因在耐盐玉米育种中的应用。

进一步地，所述应用中检测上述玉米抗盐QTL基因的表达量并选择上述玉米抗盐QTL基因表达量高的玉米植株或品种用于育种。

进一步地，所述应用中在玉米中过表达上述玉米抗盐QTL基因。

过表达基因的方式以及可用的载体等工具本领域技术人员可以依据本领域公知知识或者现有材料来获得。

附图说明

图1为抗盐基因ZmMATE29中(A)pBUE411-ZmMATE29载体结构示意图；(B)ZmMATE29基因结构示意图；(C)为利用CRSPR-Cas9敲除后的核酸与原基因序列的比较；(D)为氨基酸序列与原基因序列的比较。

图2为野生型和ZmMATE29突变体在对照和盐胁迫条件下生长2周后的表型：(A)SPAD值；(B)生物量；(C)根部；(D)木质部汁液及(E)地上部Cl^-浓度；A中标尺：15cm。

图3为ZmMATE29组织表达特异性(A、B),及蛋白亚细胞定位分析(C)。

图4为ZmMATE29编码的蛋白具有Cl^-转运活性；其中(A)为对照及ZmMATE29的电流图；(B)为在烟草叶肉细胞液泡中分析ZmMATE29编码蛋白的Cl^-转运活性。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于此，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1玉米抗盐QTL基因的克隆及功能分析

盐胁迫对玉米幼苗的典型影响是抑制生长,盐胁迫下不同玉米自交系生长受抑制的程度存在显著差异。对311个玉米自交系在对照和100mM NaCl下的苗期(2周)地上部生物量进行全基因组关联分析，鉴定到一个与盐胁迫导致的生物量降低百分率相关的位点ZmRR1。ZmRR1通过与ZmHPs互作并抑制其功能来负调节细胞分裂素信号途径,进而抑制由根往地上部的Cl^-转运来促进玉米耐盐。后续研究发现,ZmMATE29是细胞分裂素信号途径的下游调控靶标。

为了获得ZmMATE29的突变体，发明人(1)设计了CRSPR-Cas9敲除靶点，如图1A所示；(2)用BsaI对含有靶点序列的PCR片段和pBUE411载体进行酶切、连接，连接产物转入大肠杆菌，用通用引物FD3/RD进行菌落PCR扩增，电泳检测有目的大小条带的菌落为阳性克隆，将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得正确的pBUE411-ZmMATE29载体(图1A),将pBUE411-ZmMATE29转入农杆菌EHA105；(3)通过幼胚侵染的方法获得转基因植株；(4)通过对包括靶点在内的基因片段进行PCR扩增、测序确定转基因阳性植株。最终获得了两个ZmMATE29候选基因的敲除材料(命名为ZmMATE29^crispr-1和ZmMATE29^crispr-2)(图1B)(其中使用的靶序列为：CGCTTATCATCCTCAACGCCATGGCCGTGCTGATGCTCCCGCTCTACCTCTTCGCCACCCCTATCCTG CGCTTCTTCCACCAGGACGCCGAGATTGCCGCGCTCACCGGCCGCCTAGCGCTCTACATGATCCCG(gRNA)CAGCTCTT CGCCTACGCCTTCAACTTCCCCATCCAGAAGTTCCTGCAGGCGCAGAGCAAGGTGATGGCCATGGCGGTCGTGTCGGTGG CGGCGCTGCTGCTCCACGTCGCCATCAGCTGGCTCCTCGTCGGGCCCATGGGGATGGGGATCGTCGGCCTGGCCGTTGCG CTCAACGCGTCCTGGTGGCTCGTCGTGCTGGGCCAGCTCGCCTACATTCTCATGG，SEQ ID NO.3,其中的gRNA序列为SEQ ID NO.4)。如图2A所示，表明ZmMATE29基因敲除植株对盐胁迫更敏感，说明该基因是盐胁迫下细胞分裂素信号途径调控玉米Cl^-转运的下游靶标。

通过ZmMATE29基因敲除植株不同组织Cl^-含量的测定实验表明ZmMATE29调控Cl^-转运。具体实验流程为：(1)取材料：表型实验的玉米材料收取地上、地下部后,80℃干燥箱烘干48h至材料不含水分,分析天平称量干重并记录。(2)样品制备：将材料剪碎于坩埚内,用马弗炉进行灰化(300℃,3h；575℃,5h)。马弗炉中的灰化材料冷却后取出。用移液器在每个坩埚中加入10mL 5％[V/V]的硝酸,以上溶液用塑料滴管转移至新的10mL离心管中,获得待测液。(3)测定：准确吸取2mL待测液于15mL离心管中,加硝酸银标准溶液10mL,用力振荡使沉淀凝结,4000g离心8min。将上清全部转移至250mL三角瓶中,用水稀释至40mL,摇匀。加5mL硫酸铁指示剂,用硫氰酸铵溶液滴定,出现淡桔红色,且30s不褪色即为滴定终点。(4)结合材料干重,对每份玉米材料的Cl^-含量进行计算。如图2A所示，ZmMATE29基因敲除植株盐胁迫下较野生型叶片更黄,植株更小,表现出盐胁迫超敏感表型，且地下部Cl^-含量显著降低(D),木质部汁液及地上部Cl^-含量相较野生型显著升高(E,F),说明突变体中Cl^-的长距离运输增加,ZmMATE29很可能为ZmRR1-ZmHP2细胞分裂素信号级联的下游组分。

生物信息预测ZmMATE29编码一个Cl^-转运蛋白，发明人对ZmMATE29的蛋白亚细胞定位及组织表达特异性进行了分析。

(1)基于MaizeGDB网站对ZmMATE29基因结构的预测，基因全长(从起始密码子到终止密码子)2108bp，包含五个外显子，四个内含子，其中编码区序列全长1521bp，如SEQ IDNO.1所示，所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

ATGGCGGGGACGAGCGGCCACAGCGAACGAGCAGACGAGCCTCTGAAGGAGGCGCTGTTGGCTGCCCGCAACGGTAGCGG

CAGCGACGGCGACGGCGAGAAGGACCTGGAGGAGATCCGGAGCGTGGGGTCGTTCCTGCGGCACGCGGCGGAGGAGAACC

GGAAGCTCTGGTACCTTGCGGGCCCCGCCATCATCACGTCCATCACGCAGTACTCGCTCGGCGGCATCACCCAGGTCTTC

GCCGGCCATCTCACCACGCTCGAGCTCGACGCCATCTCCACCGAGAACAACGTCATCGCCGGCCTCGCCTTCGGCATCAT

GCTGGGGATGGGCAGCGCGCTGGAGACGCTGTGCGGACAGGCGTACGGCGCGAAGCAGCTGCACATGCTGGGCGTGTACA

TGCAGCGGTCGCTTATCATCCTCAACGCCATGGCCGTGCTGATGCTCCCGCTCTACCTCTTCGCCACCCCTATCCTGCGC

TTCTTCCACCAGGACGCCGAGATTGCCGCGCTCACCGGCCGCCTAGCGCTCTACATGATCCCGCAGCTCTTCGCCTACGC

CTTCAACTTCCCCATCCAGAAGTTCCTGCAGGCGCAGAGCAAGGTGATGGCCATGGCGGTCGTGTCGGTGGCGGCGCTGC

TGCTCCACGTCGCCATCAGCTGGCTCCTCGTCGGGCCCATGGGGATGGGGATCGTCGGCCTGGCCGTTGCGCTCAACGCG

TCCTGGTGGCTCGTCGTGCTGGGCCAGCTCGCCTACATTCTCATGGGCTACTGCCCCGGCGCCTGGAACGGATTCGACTG

GCTCGCCTTCTCCGACCTCTCCGGCTTCGCGCGCCTGTCGCTTGGCTCCGCCGTCATGCTCTGCCTGGAGTTCTGGTTCT

ACATGTTCCTGATCGTCATCGTCGGCAACCTGGAGAACGCTCAGGTCGCCGTTGCTGCAGTCTCCATTTGCACGAACCTG

TTCGGGTGGCAGATCATGGTGTTCTTCGGATTCAACGCGGCCATCAGCGTGCGGGTGTCGAACGAGCTGGGCGCCGGGCG

GCCCCGCGCGGCCAAGTTCGCGATCCTGGTGGTGCTCATGTCTTCGGTGGCCATCGGGTTGGCCTTCTTCGTCCTCGTCC

TGGCCTTCCGCGACGTGTACGGCGCGCCCTTCACGGAAAGCCCCGAGGTGGTGCGCGCCGTGGCCAGCCTCGGCGTCGTC

TTCGCCTTCTCGCTGCTCCTCAACAGCGTGCAGCCGGTGCTGTCGGGCGTTGCCGTCGGGGCCGGCTGGCAGTGGCTGGT

GGCGTACATCAACCTCGGCTGCTACTACCTCGTTGGCATCCCCGTCGGGTACATCATCGCCTTCCCGCTGCGCGGCGGGG

TGCAGGGGATGTGGGGCGGCATGCTCACGGGCGTCGGCCTGCAGACCCTCATCCTGGTCGCCATCACGCTGCGCACCAAC

TGGGACAAGGAGGCCAGCGAGGCCCATTCCAGGATACAGAAATGGGGTGGATCGGCGGCGGCCAAAGTTTCACATGCATGA(SEQ ID NO.1)

MAGTSGHSERADEPLKEALLAARNGSGSDGDGEKDLEEIRSVGSFLRHAAEENRKLWYLAGPAIITSITQYSLGGITQVF

AGHLTTLELDAISTENNVIAGLAFGIMLGMGSALETLCGQAYGAKQLHMLGVYMQRSLIILNAMAVLMLPLYLFATPILR

FFHQDAEIAALTGRLALYMIPQLFAYAFNFPIQKFLQAQSKVMAMAVVSVAALLLHVAISWLLVGPMGMGIVGLAVALNA

SWWLVVLGQLAYILMGYCPGAWNGFDWLAFSDLSGFARLSLGSAVMLCLEFWFYMFLIVIVGNLENAQVAVAAVSICTNL

FGWQIMVFFGFNAAISVRVSNELGAGRPRAAKFAILVVLMSSVAIGLAFFVLVLAFRDVYGAPFTESPEVVRAVASLGVV

FAFSLLLNSVQPVLSGVAVGAGWQWLVAYINLGCYYLVGIPVGYIIAFPLRGGVQGMWGGMLTGVGLQTLILVAITLRTNWDKEASEAHSRIQKWGGSAAAKVSHA SEQ ID NO.2

(2)为了克隆ZmMATE29全长编码序列，以生长10天的抗盐玉米自交系B73幼苗为材料，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物总RNA提取试剂盒(Cat.#DP432)提取总RNA，并通过使用普洛麦格(北京)生物技术有限公司的M-MLV反转录酶进行反转录获得cDNA，用ZmMATE29特异的引物(正向引物ZmMATE29-gene-F:CCCAAGCTTATGGCGGGGACGAGCGGCCA(SEQIDNo.5)；反向引物ZmMATE29-gene-R:GGACTAGTTCATGCATGTGAAACTTTGG(SEQ ID No.6)进行PCR扩增，获得了与预期大小(1538bp)相符的产物。使用天根生化科技(北京)有限公司的凝胶回收试剂盒(Cat.#DP105-3)对PCR产物进行回收和纯化；(3)回收的PCR片段和HindⅢ与SpeⅠ酶切的GFP载体进行连接，连接产物转入大肠杆菌，用载体上引物sp1300-F(TTGATCCGCAGCCATTAACG SEQ ID No.7)和基因合成引物ZmMATE29-gene-R进行菌落PCR扩增，电泳检测有目的大小条带的菌落为阳性克隆，将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得正确的ZmMATE29-GFP载体。转化玉米原生质体，显微镜观察定位发现其定位在液泡膜(图3C)。以生长10天的玉米自交系B73幼苗为材料，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物总RNA提取试剂盒(Cat.#DP432)提取根中柱和皮层RNA，并通过使用普洛麦格(北京)生物技术有限公司的M-MLV反转录酶进行反转录获得cDNA，用ZmMATE29特异的引物(正向引物ZmMATE29-RT-F CTGGTGGTGCTCATGTCTTC SEQ ID No.8；反向引物ZmMATE29-RT-R GGGATGCCAACGAGGTAGTA，SEQ ID No.9)进行qRT-PCR扩增，检测转录水平，如图4B所示显示ZmMATE29主要在根部皮层细胞中表达,维管组织以及周围的木质部薄壁细胞中几乎不表达。

通过烟草叶肉细胞液泡膜的膜片钳实验系统确定ZmMATE29具有外向转运Cl^-的活性。将ZmMATE29-GFP在烟草细胞中表达,提取原生质体后破碎细胞膜,利用膜片钳技术进行全细胞内向Cl^-电流记录(图4)。如图所示,虽然在对照条件下能记录到超极化激活的微弱离子电流,但是在表达ZmMATE29-GFP烟草细胞的液泡膜中,记录到的电流显著增加(图4A)。将记录结果进行分析比较,表达ZmMATE29-GFP的液泡膜内向电流显著高于对照(图4B),推测ZmMATE29通过介导Cl^-往皮层液泡的区隔化来调控Cl^-根往地上部的转运。

Claims (10)

1.一种耐受氯离子毒害的玉米抗盐QTL基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1。

2.根据权利要求1所述的玉米抗盐QTL基因，所述玉米抗盐QTL基因位于玉米4号染色体上217,627,480kb-217,633,128kb的位置。

3.根据权利要求1的基因所编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的蛋白，其中所述蛋白定位于液泡膜；所述蛋白在根部皮层细胞中表达；在维管组织以及周围的木质部薄壁细胞中不表达；所述蛋白介导Cl-往皮层液泡的区隔化来调控Cl^-根往地上部的转运。

5.根据权利要求1所述的玉米抗盐QTL基因在调控玉米耐盐性能中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述应用中敲除起始玉米植株或品种中的所述玉米抗盐QTL基因来获得耐盐性能较起始玉米植株或品种更低的玉米植株或品种。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述敲除使用CRSPR-Cas9方法进行。

8.根据权利要求5所述的应用，其中所述应用中过表达起始玉米植株或品种中的上述玉米抗盐QTL基因来获得耐盐性能较起始玉米植株或品种更高的玉米植株或品种。

9.根据权利要求1所述的玉米抗盐QTL基因在耐盐玉米育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述应用中检测上述玉米抗盐QTL基因的表达量并选择上述玉米抗盐QTL基因表达量高的玉米植株或品种用于育种，或者所述应用中在玉米中过表达上述玉米抗盐QTL基因。

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