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CN104254609A - 正丁醛的微生物生产 - Google Patents

正丁醛的微生物生产 Download PDF

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Abstract

本发明提供了收率提高的生产正丁醛的微生物和方法，其中微生物经工程改造以提高碳源向正丁醛的转化率。正丁醛通过发生在转化过程期间的气提过程回收，提供了显著高于发酵后单独回收正丁醛的产物收率。

Description

正丁醛的微生物生产
本申请要求于2011年11月3日提交的我们共同审理中(copending)的序列号61/555267的美国临时申请的优先权。
发明领域
本发明领域为精细化学品的生产，特别是正丁醛的微生物生产。
发明背景
每年消耗超过一千万公吨含氧化学品用于合成广泛的一系列工业和消费产品，包括增塑剂、防冻剂产品、飞机和跑道除冰产品、溶剂、液压液、涂料、润滑剂、化妆品、精细化学品和药物。当前，用于C3-C15含氧化学品生产的主导技术为加氢甲酰化，也称为氧化合成或氧化过程。该催化化学过程涉及在高温和高压条件下向烯烃(具有碳-碳双键的碳氢化合物)添加甲酰基和氢原子。丙烯衍生的C4含氧化学品占全世界含氧化学品消费的将近73%。C4含氧化学品的生产需要丙烯作为原料，使得该过程不可持续。用于维持当前制造过程所需高温和高压条件的大量能源成本限制了整体能源效率，因此认为其是环境不友好的。
因此，已经开发并且最近也采用了用于使用可再生资源例如糖和纤维素的生物转化生产C4含氧化学品的新方法。尤其应指出的优点是生物质衍生的底物天然地固定CO2，导致碳中性的含氧化学品生产过程。
生产含氧化学品的另一途径涉及微生物的代谢工程以生产目的化学品。例如，可培养各种梭菌属(Clostridium)物种(无遗传改变)以生产1-丁醇。然而，所有或几乎所有这些已知的过程需要分离1-丁醇，因此具有高回收成本。所选梭菌属菌株已经经代谢工程改造以提高1-丁醇相对其它产物的表达，然而能够用于调节梭菌属代谢途径的遗传工具的缺乏妨碍了该途径的进展。为了避免梭菌属代谢工程相关的困难，考虑了更好地了解和更易修饰的各种替代微生物物种，尤其包括大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
尽管用梭菌属存在困难，Kouba等在美国专利申请号2012/0209021 (通过引用以其整体结合到本文中)中教导了一种使用重组产溶剂(solventogenic)细菌和重组微生物生产正丁醛的方法。此处，Kouba等描述涉及重组梭菌属的两步法，其中(1)培养重组细菌和(2)发酵终止时从培养基中分离所得的正丁醛。尽管该方法至少概念上合乎需要，然而仍存在一些缺点。尤其是在Kouba系统中正丁醛的收率相对低。
因此，尽管在本领域中已经知道多种生产正丁醛的系统和方法，其全部或几乎全部存在一个或多个缺点。因此，仍存在提供用于微生物生产正丁醛的改善的系统和方法的需要。
发明简述
本发明主题为其中微生物经遗传工程改造以产生正丁醛的微生物、方法和系统。最优选地，这样的生产基于改善的乙酰-CoA从多种糖类特别是葡萄糖代谢转化的摩尔收率。然后使用一系列的酶(优选重组的)缩合如此生产的乙酰-CoA，并随后在多个步骤中将缩合产物还原为正丁醛。还进一步优选减少或消除一种或多种微生物醇脱氢酶以防止正丁醛进一步降解。
在进一步特别优选的方面，当培养微生物时通过鼓泡(sparging)过程回收所产生的正丁醛以达到(a) 前所未有的正丁醛累积收率，(b) 24小时或更短的MCY50，(c) 1.0 g/L或更低的溶解正丁醛浓度，和/或(d)细胞密度净增加超过至少24小时。
在一个特别优选的方面，生产正丁醛的方法包括在含有碳源的培养基中培养微生物(例如，优选埃希氏菌属(特别是大肠杆菌)、棒杆菌属(Corynebacterium)、梭菌属、发酵单胞菌属(Zymonomas)、沙门菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klesiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、鱼腥藻属(Anabaena)、青枯菌属(Ralstonia)、乳球菌属(Lactococcus)或酵母菌属(Saccharomyces))的步骤，其中所述微生物经工程改造表达至少一种异源基因并且通过缺失至少一种天然基因以因此允许碳源转化为正丁醛。在另一个步骤中，通过气提过程从培养基中回收所产生的正丁醛至至少1.5g/L的正丁醛累积收率，其中回收步骤在培养步骤期间进行。
最优选地，异源基因为乙酰-CoA乙酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、巴豆酰-CoA水合酶、丁酰-CoA脱氢酶、反式烯酰-CoA还原酶和/或丁醛脱氢酶，或微生物经遗传修饰表达人工操纵子以允许atoB、crt、hbd和bldh的表达。进一步普遍优选微生物经遗传修饰具有减少或消除的ldhA、adhE、frdBC、pta和/或yqhD表达。
不限于本发明主题，气提过程使用气提气体以至少1容器体积/分钟的鼓泡速率鼓泡，其中培养时间为24小时或更短。还进一步优选进行回收步骤至在培养时间40小时或之前2.0 g/L的累积收率。此外，考虑正丁醛可在蒸气相中被还原为正丁醇，或正丁醛从气提气体中冷凝并在液相中还原为正丁醇。
从一个角度看，本发明人还考虑了生产正丁醛的方法，其中在含有碳源的培养基中培养微生物，其中所述微生物经工程改造表达至少一种异源基因并且通过缺失至少一种天然基因以因此允许碳源转化为正丁醛。在另一步骤中，通过气提过程从培养基中回收产生的正丁醛，该过程包括在培养时间24小时或之前有效提供50%最大累积收率(MCY50)的条件下鼓泡的步骤，其中回收步骤在培养步骤期间进行。最优选地，培养步骤超过至少18小时的分批培养，并且MCY50在20小时或更短的时间内收回(例如，其中MCY50为至少1 g/L)。
从另一个角度看，本发明人还考虑了生产正丁醛的方法，其中在含有碳源的培养基中培养微生物，其中所述微生物经工程改造表达至少一种异源基因并且通过缺失至少一种天然基因以因此允许碳源转化为正丁醛。在进一步的步骤中，通过气提过程(例如使用连续鼓泡)以有效维持溶解正丁醛浓度低于成活力阈值浓度的鼓泡速率从培养基中回收产生的正丁醛，其中回收步骤在培养步骤期间进行。如前文，普遍优选(连续)鼓泡的鼓泡速率为至少1容器体积/分钟，和/或溶解正丁醛浓度维持在1.0 g/L或以下。
因此，本发明人还考虑了包括用碳源培养微生物这一步骤的生产正丁醛的方法，其中所述微生物经工程改造表达至少一种异源基因并且通过缺失至少一种天然基因以因此允许碳源转化为正丁醛。在进一步的步骤中，通过气提过程以有效防止细胞密度净下降多达至少40小时的鼓泡速率从发酵液中回收正丁醛，其中回收步骤在培养步骤期间进行。最优选地，鼓泡速率有效产生细胞密度净增加超过至少24小时。
本发明主题的各个目标、特征、方面和优点将从下列优选实施方案的详细描述连同其中相同数字代表相同组分的附图变得更为显而易见。
附图简述
图1为示例性的经工程改造的用于将葡萄糖转化为正丁醛的代谢途径的示意图。
图2A为描述通过经代谢工程改造的大肠杆菌菌株EB10与宿主细胞EB11从葡萄糖生产正丁醛(g/L)的结果的示例性条形图。
图2B为描述通过经代谢工程改造的大肠杆菌菌株EB11与EB13从葡萄糖生产正丁醛(g/L)的结果的示例性条形图。
图3A-3C为显示鼓泡速率为0、1和2容器体积/分钟(VVM)时发酵罐(培养基)中正丁醛浓度对时间以及(鼓泡气体中)正丁醛累积收率(g/L)对时间(小时)的性能图。
图4为根据本发明主题的一个实施方案说明正丁醛毒性的图，表达为不同正丁醛浓度下菌落形成单元/微升对时间(小时)。
图5为OD600细胞密度的示意图，表达为鼓泡速率为0、1和2 VVM时600纳米处的吸光度对时间(小时)。
发明详述
本发明人目前已经发现增加的正丁醛收率可通过当在发酵反应期间用(优选惰性气体)鼓泡发酵罐时产生或培养经工程改造的微生物从各种碳源生产正丁醛来获得。
应理解的是，这种方式不允许产物积累和随后在该过程结束时收集。作为替代，在发酵期间使用鼓泡驱除正丁醛，这意外地似乎增加生产率、延长经工程改造的微生物的成活力和/或生产寿命。因此，实现显著高于在发酵培养基中积累产物的累积收率。发酵期间鼓泡可为连续或不连续的，以可变或恒定速率，以其任何合理的组合。
一旦从发酵培养基中驱除，可使用多种方法回收正丁醛，包括捕集在溶液中、通过溶解或吸附在溶剂中、或经由吸附在固体吸附剂上。如此回收的产物可然后作为商品出售或经由氧化、还原或缩合转化为期需产物。
应进一步理解的是经工程改造的微生物可从多种经修饰生产正丁醛的微生物包括多种细菌、蓝细菌和真菌制成。优选的经工程改造的微生物还已经被修饰以抑制使用正丁醛作为试剂的下游反应，从而进一步增加正丁醛产物的收率。适当的碳源包括多种蛋白、碳水化合物和脂质(所有的纯品或混合物)及其任何合成或人造混合物(例如，细胞提取物、生物质、生物固体等)。
鉴于以上，并且在本发明主题的一个优选方面，通常考虑重组微生物(特别是大肠杆菌)表达一组基因以因此使其能够生产正丁醛。更典型地，重组表达包括至少一种编码具有乙酰-CoA乙酰基转移酶活性的多肽的基因的表达、至少一种编码具有羟丁酰-CoA脱氢酶活性的多肽的基因的表达、至少一种编码具有巴豆酰-CoA水合酶活性的多肽的基因的表达、至少一种编码具有反式烯酰-CoA脱氢酶活性的多肽的基因的表达和/或至少一种编码具有丁醛脱氢酶活性的多肽的基因的表达。图1阐述示例性的经工程改造的代谢途径。 
因此，应理解的是经工程改造的微生物细胞将包含生产正丁醛所需的天然和异源酶的任何组合。例如，细胞可包含天然或异源乙酰-CoA乙酰基转移酶、天然或异源羟丁酰-CoA脱氢酶、天然或异源巴豆酰-CoA水合酶、天然或异源反式烯酰-CoA还原酶和/或天然或异源丁醛脱氢酶。更特别地，乙酰-CoA乙酰基转移酶可为能够催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的任何酶。在一些实施方案中，乙酰-CoA乙酰基转移酶具有E.C.编号2.3.1.9。一个编码示例性乙酰-CoA乙酰基转移酶的基因为大肠杆菌atoB (GenBank编号：NP_416728.1. NC_000913.2)。同样，3-羟丁酰-CoA脱氢酶可为能够催化乙酰乙酰-CoA转化为3-羟丁酰-CoA的任何酶。在一些实施方案中，3-羟丁酰-CoA脱氢酶具有E.C.编号1.1.1.157。一个3-羟丁酰-CoA脱氢酶为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) hbd (GenBank编号：NP_349314.1. NC_003030.1)。巴豆酰-CoA水合酶可为能够催化3-羟丁酰-CoA转化为巴豆酰-CoA的任何酶。在一些实施方案中，巴豆酰-CoA水合酶具有E.C.编号4.2.1.55。一个示例性巴豆酰基-CoA水合酶为丙酮丁醇梭菌crt (GenBank编号：NP_349318.1. NC_003030.1)。反式烯酰-CoA还原酶可为能够催化巴豆酰-CoA转化为丁酰-CoA的任何酶。在一些实施方案中，反式烯酰-CoA还原酶具有E.C.编号1.3.1.38。一个示例性反式烯酰-CoA还原酶为齿垢密螺旋体(Treponema denticola) ter (GenBank编号：NP_971211 NC_002967.9)。丁醛脱氢酶可为能够催化丁酰-CoA转化为丁醛的任何酶。在一些实施方案中，丁醛脱氢酶具有E.C.编号1.2.1.57。一个示例性丁醛脱氢酶为糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum) NI-4 bldh。
在其它优选实施方案中，应理解的是可表达不直接参与正丁醛生产的基因来增加正丁醛产量/滴度以因此在平衡反应中达到顺差。例如，细胞可包含天然或异源甲酸脱氢酶以提供正丁醛生产途径的代谢驱动力。CO2的产生和随后的损耗妨碍该可逆反应。甲酸脱氢酶可为能够催化甲酸盐转化为CO2的任何酶。在一些实施方案中，甲酸脱氢酶具有E.C.编号1.2.1.2。编码示例性甲酸脱氢酶的一个基因为博伊丁假丝酵母(Candida boidinii) fdh (GenBank编号：AF004096、AJ245934、AJ011046、DQ458777)。进一步的合适的修饰和细胞系在WO 2012/125688A2、EP2084287B1、US8188250B2、US20110281314A1、US20120064590A1、WO2012004460A2、WO2012045022A2、WO2012061653A2、WO2012061653A9、WO2012099934A2、WO2012109176A2和WO2012125688A2中描述，其所有通过引用结合到本文中。 
因此，应指出的是与未修饰的相应细胞相比，所考虑细胞中的醇产量将显著减少。优选地，与未修饰的对照细胞所产生的醇相比，按质量或体积计醇产量减少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或大于约95%。更优选地，醇产量减少约99%，并且最优选，所考虑重组宿主细胞产生不可检测的醇。在一些实施方案中，敲除一种或多种醇脱氢酶基因或以其它方式使其无效。更优选地，敲除所有的醇脱氢酶基因或以其它方式使其无效。
关于微生物细胞应理解的是具体的生物对本发明主题不是关键性的，只要该微生物能够重组修饰和生产正丁醛。因此，合适的生物包括各种细菌、蓝细菌或真菌。例如，在一些实施方案中微生物可属于选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属、产碱菌属、发酵单胞菌属、梭菌属、乳杆菌属、聚球藻属、集胞藻属、酵母菌属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属和曲霉菌属的属。在特别优选的实施方案中，所述微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、细长聚球藻(Synechococcus elongatus)、富养产碱菌(Ralstonia eutropha)或酿酒酵母。
重组微生物可使用本领域技术人员已知的任何方法制备，并且将理解的是修饰可包括认为是增加或降低特别的酶途径活性所需的一个或多个基因的插入或缺失。在一些实施方案中，突变体微生物也可用于本发明方法，并且按需要可以是进一步修饰的重组体。 因此，合适的修饰将包括随机诱变以产生缺陷表达模式、含有合适控制元件的染色体外(典型地是质粒或噬菌粒)核酸以产生一种或多种酶的受控过表达、用合适的控制元件插入基因组以产生一种或多种酶的受控过表达等。
关于正丁醛的实际生产，因此考虑合适的方法包括将如本文所述经工程改造的微生物在允许所述微生物使用碳源的条件下发酵从而生产正丁醛。如此生产的正丁醛使用众所周知的气提方法(例如，向培养基中鼓入惰性气体)同时回收和纯化，并随后使用众所周知的方法(例如冷凝)纯化。最典型地，微生物中生产的正丁醛浓度(克/升)大大高于该微生物中所产生的醇浓度(克/升)。例如，正丁醛浓度与醇浓度相比的比率为至少80:20。更优选地，该比率为90:10、95:5或99:1。
所述碳源可为适于所选微生物的任何合适碳源，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素、甘油、二氧化碳、蛋白质和/或氨基酸。也可使用前述的任何组合和/或其它合适碳源。本领域技术人员将容易地能够基于所选的微生物类型选择合适的碳源。然而，特别优选的碳源包括碳中性的那些。因此，尤其合适的选择是，碳源将包括各种不同的水解产物(半纤维素的、蛋白质的等)和粗糖。
实施例
下列实施例说明通过经工程改造的敲除ldhA、adhE、frdBC和yqhD基因但包含atoB-hbd-crt-ter-bldh-fdh基因的大肠杆菌菌株从葡萄糖生产正丁醛。这样的经工程改造的用于正丁醛生产的宿主菌(大肠杆菌菌株EB10)为大肠杆菌BW25113 (rrnBT14 ΔlacZWJ16 hsdR514 ΔaraBADAH33 ΔrhaBADLD78)衍生物，其具有从XL-1 Blue转导的F′以提供lacIq并敲除ldhA、adhE、frdBC和yqhD基因。该菌株利用在EB10中另外删除pta进一步优化，得到EB12。
因此，这些菌株可如下表征：EB10：敲除ldhA、adhE、frdBC和yqhD的BW25113。EB11：敲除ldhA、adhE、frdBC和yqhD (pEB73、pIM8、pCS138)的BW25113。EB12：敲除ldhA、adhE、frdBC、yqhD和pta的BW25113。EB13：敲除ldhA、adhE、frdBC、yqhD和pta (pEB73、pIM8、pCS138)的BW25113。
对于这一特别的实施例，构建了三个质粒并用于正丁醛生产。第一个质粒具有一个为了过表达atoB-crt-hbd-bldh基因构建的含有λPL启动子和lac操纵基因序列的人工操纵子。第二个质粒具有含有λPL启动子和lac操纵基因序列的ter基因。第三个质粒具有含有λPL启动子和lac操纵基因序列的fdh基因。转化EB10和EB12细胞以包含所有三种质粒从而分别形成EB11和EB13。所得的经工程改造的正丁醛生产菌株分别命名为大肠杆菌EB11和EB13。大肠杆菌菌株EB10和EB11在包含3 ml LB培养基(若需要，含有氨苄青霉素(100 μg/ml)、卡那霉素(50 μg/ml)和氯霉素(25 μg/ml))中的试管中于旋转振荡器(250 r.p.m.)上37℃预培养过夜。将过夜培养物1:100稀释至5 ml含有相同抗生素的新鲜培养基中。该新鲜培养基为添加2%葡萄糖的优质肉汤(TB) (12 g胰蛋白胨、24 g酵母提取物、2.31 g KH2PO4、12.54 g K2HPO4、4 ml甘油/L水)。将细胞在旋转振荡器(250 r.p.m.)上37℃需氧生长过夜至OD600 0.4-0.6，然后用0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导另外的1-2 h。将培养物从试管转移至10 ml BD Vacutainer密封管中。将氧气排出并用N2气体代替。允许发酵在旋转振荡器(250 r.p.m.)上37℃进行24小时。
正丁醛的生物反应器生产：在发酵中使用EB12菌株用于正丁醛的生物反应器生产。将过夜预培养物接种在包含适当抗生素的LB中，并使其在旋转振荡器上250 rpm 37℃生长。正丁醛发酵在5升的搅拌罐生物反应器(Eppendorf, Hauppauge, NY, USA)中用2.0升工作体积进行。用23 ml过夜预培养物接种该生物反应器，并在接种时添加0.1 mM IPTG以诱导正丁醛生产途径所牵涉的酶的表达。通过提高搅拌棒的速度(自200 rpm至500 rpm)将好氧阶段期间的溶解氧(DO)维持在相对于空气饱和度的20%。将细胞在好氧条件下于30℃以分批模式生长，直至光密度达到约OD600= 0.8。然后，将搅拌设置为350 rpm并向生物反应器中鼓入特定vvm (每分钟每升液体的气体体积)的氮气，这有两个目的：(i) 转变为厌氧条件和(ii)实现正丁醛的原位气提。厌氧转换时，开始间歇的线性补料葡萄糖溶液(500 g/L)以维持葡萄糖浓度在10和20g/L之间。使用Graham冷凝器将蒸发的正丁醛冷凝并接着穿过一组三个装满水(4℃)的汽水阀。通过自动加入5M NaOH溶液将pH始终控制在6.8。在特定的时间点，收集发酵样品测定细胞生长、正丁醛生产和葡萄糖浓度并更换汽水阀中的水。所分析菌株产生的醇化合物通过GC-MS鉴定。该系统包括模式6890N网络GC系统(Agilent Technologies)、模式7883B注射器和自动进样器(Agilent Technologies)以及模式5973网络质量选择检测器(Agilent Technologies)。使用DB-5ms毛细管柱(30 m，0.25-mm内径，0.25-μm膜厚度；Agilent Technologies)，用氦(1 ml/min-1)作为载气。将箱温以30℃/min从75℃至200℃程序化。注射器和检测器维持在250℃。醇化合物通过溶剂萃取分离。离心后用150 μl GC标准级甲苯(Fluka)萃取300微升发酵液上清。以分流注入模式用30:1的分流比率注入1 μl样品。
所产生的醇化合物通过装备有火焰离子化检测器的气相色谱仪定量。该系统为模式7890A气相色谱仪(Agilent Technologies)和模式7693自动进样器(Agilent Technologies)。醇化合物的分离通过DB-FFAP毛细管柱(30m，0.32-mm内径，0.25-μm膜厚度；Agilent Technologies)实施。GC箱温开始保持在85℃ 2分钟，然后以45℃/分钟的梯度上升直至235℃并保持3分钟。使用氦以14 p.s.i入口压力作为载气。注射器和检测器维持在225℃。按25:1的分流比率注入1μl样品。使用1-戊醇作为内标。比较EB10与生产菌株EB11的示例性结果在图2A中示出，生产菌株EB13中进一步敲除突变pta的效果(相对于生产菌株EB11)在图2B中示出。如容易显而易见的，自包含经工程改造的菌株EB11菌株的肉汤中可生产正丁醛(227 mg/L)，而仅包含EB10的肉汤不能。此外，容易显而易见，通过缺失pta (磷酸转乙酰酶或磷酸乙酰基转移酶)出乎意料且显著地增加生产水平。
图3A-3C显示发酵罐中产生的正丁醛浓度对使用EB13的培养时间和正丁醛累积收率对0、1和2 VVM鼓泡速率下的培养时间。对于图3A，无鼓泡发生(0 VVM)。约20小时后发酵罐中的正丁醛浓度达到最大值约0.20-0.25 g/L，然后降低直至约40小时达到零。在图3B-3C中，鼓泡速率分别为1和2 VVM，发酵罐中存在的最大正丁醛浓度大致与无鼓泡时相同，即，20小时时或之前约0.20-0.25 g/L。实施例中所描述的和图2中所示出的结果与该发现一致；培养时间24小时后回收0.227 g/L正丁醛。
然而，再次关于图3B-3C，通过发酵期间鼓泡显著增加正丁醛的累积收率。例如鼓泡速率1 VVM时，总累积收率大于无鼓泡时的表观最大浓度。在该实施例中，在约90小时期间鼓泡收集产物，总收率为约1.9 g/L。鼓泡速率2 VVM时，在相同量的时间内收集产物，但最大累积收率(MCY)约2.25 g/L。
发酵培养基中0.20-0.25 g/L的这一表观最大浓度有点令人惊讶。正丁醛在水中的溶解度为约70 g/L，所以可合理地期待发酵罐中的最大正丁醛将线性增加至基本上更高的最大值。同样令人惊讶的是，当将惰性气体鼓入培养基时，显著量的正丁醛被驱除，尽管其具有高溶解度。因此，通过适当鼓泡可达到期需的高质量收率。特别地关于图3C，应理解的是在约20小时时获得最大累积收率的一半(MCY50)，这与发酵罐中达到最大正丁醛浓度的时间大致相同。因此，以2 VVM同时鼓泡(concurrent sparging)在相同量的时间内得到约5倍的产物，并且大约在接下来的70个小时期间收集到另外的5倍产物。
转向图4，每μL经工程改造的大肠杆菌的菌落形成单位数目显示为添加不同浓度的正丁醛(NBAL)后的时间的函数，密封管中添加正丁醛(NBAL)(孵育试验)防止正丁醛蒸发。在所有的情况下，包括无添加的情况，菌落形成单位的数目约24小时后走向最小值(例如，细胞不再有活力)。对于1.0 g/L的浓度，该图显示5小时之后菌落形成单位少许净增加，但1.2 g/L及以上的浓度甚至在4.5小时时显示净下降。这些数据提示存在正丁醛的成活力阈值浓度，其中存在正丁醛最大产量和细胞最大成活力时间。使用本发明同时鼓泡方法获得增加的正丁醛收率，这看起来与成活力分析一致。
图5为0、1和2 VVM的鼓泡速率下OD600细胞密度(描述为600 nm处的吸光值)对时间(小时)的示意图。在每种情况下，数据显示15小时时细胞密度增加。然而，24小时时，0 VVM鼓泡的样品显示细胞密度显著降低，而1和2 VVM的样品继续显示细胞密度增加。约40小时时，1和2VVM的样品继续显示净增加，89小时后，1 VVM的样品显示净减少，但2 VVM的样品继续显示净增加。
细胞密度数据似乎与成活力分析和收率数据一致。特别地，24小时时的MCY50看起来与最大速率活跃生产正丁醛的活细胞一致。24小时后，正丁醛生产以减少的速率继续，直至达到最大收率。
清楚地，正丁醛生产期间鼓泡提供显著增加的正丁醛收率。不希望受限于任何特定的方法或机制，本发明人推测正丁醛产物抑制其继续产生超过最小收率。该最小收率约等于非-鼓泡系统的最大正丁醛浓度，显著低于考虑正丁醛溶解度时将预期的收率。
关于避免正丁醛生产的抑制，因此考虑了各种不同的途径。由于数据似乎显示MCY随鼓泡速率增加而增加，推断鼓泡速率大于2 VVM将产生MCY更大的增加将是合理的。因此，认为至少2.0 VVM、更典型地至少2.5 VVM并且最典型地至少3.0 VVM的鼓泡速率是合适的。
另一个途径为认识到如果在产生时正丁醛产物溶解在液相中，那么当鼓泡发生时，产物是在气-液界面被驱除。如果该界面的气-液表面比率增加，可预期被驱除的产物量增加。鼓泡速率的增加(和/或不同的鼓泡器配置)将提供较小的气泡，这将增加气-液表面比率。相似地，增加叶轮速率将打破气泡，也产生增加的气-液表面比率。这些方法的任意组合应产生产物量、其产生速率或二者的增加。
除了鼓泡过程的简单改变，数据提示增加正丁醛MCY的其它的可能解决方案。关于微生物例如修饰的大肠杆菌，温度的变更可影响生产速率。降低发酵罐温度将最可能导致更多的重组基因产物，虽然是以较低的速率。可推测，存在与给定发酵罐温度相关的达到最大收率的最佳鼓泡速率。相反，温度可增加至处于或邻近正丁醛沸点的水平并且可选择将在这些条件下生长的经代谢工程改造的微生物。这将更类似于蒸馏反应，其中正丁醛将以蒸气相或接近蒸气相产生并将其自身驱除出溶液。这还可帮助维持发酵罐中低浓度的产物，降低上述潜在的毒性效应。取决于系统温度，以适当速率鼓泡还可帮助驱除产物。
可改变系统压力，并伴随适当的鼓泡方案。例如，可降低容器内的压力，增加正丁醛的释放。鼓泡气体的压力也可降低，或使用间歇鼓泡过程，或这些方法的组合以提供最佳MCY。
这些实施例利用分批发酵方法。也可设想使用连续发酵方法代替，其中当对反应器鼓泡时，以相同的速率向反应器中引入新鲜液体(培养基)和从发酵罐取出用过的培养基。在该实施例中，用过的培养基包含产物和微生物细胞两者。然后从发酵罐本身收集产物，用过的培养基可再次鼓泡以获得任何残留量的产物。因此，可将培养基中的产物浓度维持在存活力阈值浓度以下。
发酵罐本身设计为可被修改以提供用不同的方式收集产物。例如，可采用在培养基中生产产物的薄膜发酵罐或中空纤维发酵罐，然后可将其鼓泡以移出产物。或者，可将经工程改造的微生物固定在凝胶或藻酸盐-型介质中(见例如，WO2012/004460)，培养基可连续穿过或通过包含微生物的介质并其后立即暴露于鼓泡气体。这将使经工程改造的微生物在浓度增加的产物中的暴露最小化，因为产物将随培养基持续流过微生物并几乎立刻被驱除。或者，包含产物的液相可进料至随着发酵进展经受鼓泡过程的另一个容器。
此外，考虑可用吸收正丁醛的组分例如分子筛或优先溶解正丁醛的与水不混溶性分配液添加培养基本身。这些将具有从微生物移出正丁醛的作用，与从培养基移出正丁醛将增加其MCY的观念一致。
本领域技术人员将显而易见的是除了已经描述的那些外许多更多的修饰而不脱离本文的发明观念是可能的。因此，本发明主题不受限于所附权利要求书的精神内。此外，在解释说明书和权利要求书二者中，所有术语应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含”和“包括”应解释为以非排他方式指要素、组分或步骤，指示所提要素、组分或步骤可与未明确引用的其它要素、组分和步骤一起存在或被利用，或组合。当本说明书权利要求书提及选自A、B、C……和N的某物的至少一种时，原文应解释为仅需要该组中的一个要素，而不是A加N或B加N等。

Claims (20)

1. 一种生产正丁醛的方法，包括：
(a) 在含有碳源的培养基中培养微生物，其中所述微生物经工程改造表达至少一种异源基因并且通过缺失至少一种天然基因以因此允许碳源转化为正丁醛；和
(b) 通过气提过程从培养基中回收产生的正丁醛至至少1.5 g/L的正丁醛累积收率；
其中回收步骤在培养步骤期间进行。
2. 权利要求1的方法，其中所述至少一种异源基因选自乙酰-CoA乙酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、巴豆酰-CoA水合酶、丁酰-CoA脱氢酶、反式烯酰-CoA还原酶和丁醛脱氢酶。
3. 权利要求1的方法，其中所述微生物经遗传修饰表达人工操纵子以允许atoB、crt、hbd和bldh的表达。
4. 权利要求1的方法，其中所述微生物经遗传修饰具有减少或废除的选自ldhA、adhE、frdBC、pta和yqhD的至少一种基因的表达。
5. 权利要求1的方法，其中所述气提过程包括用气提气体以至少1容器体积/每分钟的鼓泡速率鼓泡，并且其中培养时间为24小时或更短。
6. 权利要求1的方法，其中进行回收步骤至在培养时间为40小时或之前的累积收率为2.0 g/L。
7. 权利要求1的方法，其中所述微生物属于选自埃希氏菌属、棒杆菌属、梭菌属、发酵单胞菌属、沙门菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、短杆菌属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、聚球藻属、集胞藻属、鱼腥藻属、青枯菌属、乳球菌属或酵母菌属的属。
8. 权利要求1的方法，其中所述微生物为大肠杆菌。
9. 权利要求8的方法，进一步包括在蒸气相中将正丁醛还原为正丁醇的步骤。
10. 权利要求1的方法，进一步包括冷凝正丁醛并在液相中将正丁醛还原为正丁醇的步骤。
11. 一种生产正丁醛的方法，包括：
(a) 在含有碳源的培养基中培养微生物，其中所述微生物经工程改造表达至少一种异源基因并且通过缺失至少一种天然基因以因此允许将碳源转化为正丁醛；和
(b) 通过气提过程从培养基中回收产生的正丁醛，气提过程包括在有效在培养时间24小时或之前提供50%最大累积收率(MCY50)的条件下鼓泡的步骤；
其中回收步骤在培养步骤期间进行。
12. 权利要求11的方法，其中培养步骤包括在分批培养物中培养超过至少18小时。
13. 权利要求11的方法，其中MCY50在20小时或更短时间内回收。
14. 权利要求13的方法，其中MCY50为至少1 g/L。
15. 一种生产正丁醛的方法，包括：
(a) 在含有碳源的培养基中培养微生物，其中所述微生物经工程改造表达至少一种异源基因并且通过缺失至少一种天然基因以因此允许将碳源转化为正丁醛；和
(b) 通过气提过程以有效将溶解的正丁醛维持在成活力阈值浓度以下的浓度的鼓泡速率从培养基中回收产生的正丁醛；
其中回收步骤在培养步骤期间进行。
16. 权利要求15的方法，其中所述气提过程使用连续鼓泡。
17. 权利要求16的方法，其中连续鼓泡的鼓泡速率为至少1容器体积/分钟。
18. 权利要求15的方法，其中溶解的正丁醛浓度维持在1.0 g/L或以下。
19. 一种生产正丁醛的方法，包括：
(a) 用碳源培养微生物，其中所述微生物经工程改造表达至少一种异源基因并且通过缺失至少一种天然基因以因此允许将碳源转化为正丁醛；和
(b) 通过气提过程以有效防止细胞密度净下降多达至少40小时的鼓泡速率从发酵液中回收产生的正丁醛；
其中回收步骤在培养步骤期间进行。
20. 权利要求19的方法，其中鼓泡速率有效产生细胞密度净增加超过至少24小时。
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