FI126855B - Menetelmä ja laitteisto orgaanisten liuottimien ja alkoholien tuottamiseksi mikrobeilla - Google Patents

Description

Menetelmä ja laitteisto orgaanisten liuottimien ja alkoholien tuottamiseksi mikrobeilla Tämä keksintö liittyy liuottimien ja alkoholien valmistamiseen tarkoitettuun biomat-riisiin, matriisin sisältävään biokolonniin ja laitteistoon. Tämä keksintö liittyy myös liuottimien ja alkoholien valmistusmenetelmään mainittua biokolonnia käyttämällä.

Biologisten prosessien ehkä tärkein alue on orgaanisten liuottimien ja alkoholien valmistaminen. Esimerkiksi asetoni-butanoli-etanoli (ABE) -fermentointi Clostridium acetobutylinumilla on saanut nykyään melkoisesti huomiota. Weizmannin tärk-kelysprosessi on eräs ensimmäisistä erittäin tunnetuista Clostridium acetobuty-linumia käyttävistä prosesseista asetonin ja butanolin mikrobiologiseksi valmistamiseksi anaerobista fermentointiprosessia käyttämällä. C.acetobutylinum ja muut C/osfr/cf/y/77-lajit voivat hajottaa esimerkiksi sokeria, tärkkelystä, ligniiniä ja muuta biomassaa suoraan propionihapoksi, butanoliksi, eetteriksi ja glyseriiniksi. Teollisen mittakaavan fermentointeja suoritettiin historiallisesti hapon ja liuottimen tuottamista varten ennen petrokemiallisen teollisuuden nousua. 1960-luvulta lähtien ABE-teollisuus on vähentynyt. Viimeaikaiset edistymiset bioprosessoinnin ja bioteknologian alueilla ovat johtaneet uudelleen kiinnostukseen kemikaalien ja polttoaineiden, erityisesti butanolin, valmistamiseen fermentoimalla. Jatkuvatoimisella fermentointiteknologialla butanolia voidaan valmistaa suuremmin saannoin, pitoisuuksin ja suuremmilla nopeuksilla.

Asetonia/isopropanolia, butanolia, etanolia voidaan käyttää nestemäisinä liikenne-biopolttoaineina polttomoottoreissa. Butanoli on edullinen liikennepolttoaine, koska sen energiasisältö on lähellä bensiinin energiasisältöä (26,9 versus 32 MJ/I), sitä voidaan varastoida kosteissa olosuhteissa sen heikon veteen sekoittuvuuden takia ja se on yhteensopiva olemassa olevan bensiinin varastoinnin infrastruktuurin kanssa. Suuresta tietämyksestä huolimatta on vielä olemassa ratkaisemattomia ongelmia, jotka estävät laajamittaisen Clostridia spp.:n käyttämisen teollisuudessa. Näitä ovat alhaiset saannot, peräkkäiset hapon muodostumis- ja liuottimen akku-muloitumisvaiheet ja Clostridia spp.:n kapea substraattipreferenssi. ABE-fermentointiprosessit optimoidaan pääasiassa käyttämällä syötteenä tärkkelystä ja melasseja (Mitchell, 1998). Clostridia-lajissa on kaikki tärkkelyksen täydelliseksi hajottamiseksi ja sen jälkeen lopputuotteiksi fermentoimiseksi tarvittavat amylosyyttiset entsyymiaktiivisuudet (Nimcevic et ai., 1998). Mitä tahansa ihmisen ravitsemiseen käytettäviä ruoka-aineita ei voida kuitenkaan luetteloida 2. sukupolven biopolttoaineena, eivätkä ne täytä vaatimuksia bioenergian eettisestä tuottamisesta uusiutuvasta biomassasta. Metsä- tai kasvijäte tai teolliset jätevirrat koostuisivat ympäristöllisesti hyväksyttävimmistä ja saatavissa olevista syötteistä. Havupuusta, kovapuusta ja siistatusta paperista valmistetut nestemäiset hydrolysaatit koostuvat pääasiassa ksyloosi-, mannoosi- ja galaktoosisokereista puulajista ja valitusta hydrolyysimenetelmästä riippuen (Rakkolainen et ai., 2010). Aikaisemmin butanolia valmistettiin Venäjän ABE-tehtaissa maatalouden hydrolysoidusta ligno-selluloosajätteestä. Pentoosihydrolysaattia muodostettiin käyttämällä 1-prosenttista H2S04-liuosta 115-125 °C:n lämpötilassa 1,5-3 tunnin ajan, jolloin liuottimen saanto oli keskimäärin 20-32 % (Zverlov et ai., 2006). Edullisella substraatilla, eli tärkkelyksellä, fermentointiaika on noin 20-25 tuntia, mutta käytettäessä syötteenä lignoselluloosahydrolysaatteja se on oleellisesti pitempi (Ezeji ja Blaschek, 2008).

Vaikein haaste teollisessa ABE-fermentoinnissa on liuottimien alhainen saanto. Kaikkein edullisimmallakin substraatilla, eli tärkkelyksellä ja melasseilla, liuottimien kokonaissaanto on noin 30-32 % ja butanolin suurin saavutettu pitoisuus on 10-15 g/l perinteisessä panosfermentoinnissa (Walton ja Martin, 1979). Julkaisussa Lin ja Blaschek, 1983 on raportoitu, kuinka C. acetobutylicumin liuottimen sietoa on parannettu sarjalla rikastusmenetelmiä (Lin ja Blaschek (1983). Tämän kaltaisten tulosten toistettavuus eri kasvusubstraatilla ja eri olosuhteissa on kuitenkin heikko. Joissakin tapauksissa siirtosarja päättyy siihen, että Clostridia spp. menettää täydellisesti liuottimien tuottokykynsä. Tämä degeneraatio on liitetty liuottimia muodostavia geenejä sisältävien megaplasmidien häviöön (Comillot et ai., 1997). C. acetobutylicum on itiöivä, grampositiivinen mikrobi ja SpoOA-geenin sitova alue sijaitsee sellaisten liuottimia muodostavien geenien promoottorialueella (Thormann et ai., 2002), jotka toimivat itiöiden muodostumisen ja liuottimen muodostuksen transkiptionaalisena säätelijänä (Harris et ai., 2002). C. acetobutylicumin monimutkaisesta elinkierrosta ja metaboliasta johtuen viime aikoina on kehitetty uusia bakteeri-isäntiä butanolin tuottamiseen. Rekombinanttinen Lactobacillus brevis -kanta, jossa on butanolireitin klostridigeenejä (crt, bed, etfB, etfA ja hbd), pystyi syntetisoimaan jopa 300 mg I'1 tai 4,1 mM butanolia glukoosia sisältävällä alustalla (Berezina et ai., 2010).

Kaksivaiheista kemostaattiasennusta on tutkittu eräänä vaihtoehtona ABE-fer-mentoinnin suurempia tuottavuuksia varten (Mutschlechner et ai., 2000; Bahl et ai., 1982). Kemostaattiasennus mahdollistaa butanolin vakiollisen poistamisen, joka on edellytys suurelle liuottimen tuotolle ja tuotteen saannolle. On todennäköis tä, että vapaan solususpension kasvatuksilla ei saavuteta teollisesti käyttökelpoista liuottimen tuottavuutta, erityisesti mitä tulee nestemäisten liikennebiopolttoainei-den tuottamiseen lignoselluloosabiomassasta. ABE-fermentointi tarjoaa erään mahdollisuuden tulevaisuuden biopuhdistamoille välttämättömien bioenergiarat-kaisujen toteuttamiseksi lignoselluloosabiomassasta. Tämä vaatii uusia parannuksia bioprosessitekniikkaan ja myös kantojen kehittämistutkimukseen. Metabolisesti rakennettujen kantojen tulee olla elinkykyisiä ja niiden tulee sietää erilaisia todellisissa hydrolysaateissa olevia erilaisia inhibiittoreita. Bioprosessitekniikassa tulee ottaa huomioon hyvin suuret tilavuudet, joita tarvitaan tyydyttämään liikennepoltto-aineiden kulutusta.

On raportoitu useista yrityksistä käyttää niin kutsuttua biomassaa pidättävää menetelmää tai kierrättävää menetelmää. Tashiro et ai. (2005) pääsivät ABE-tuotta-vuuteen 7,55g'Y1h'1 ABE-pitoisuudella 8,58 g/l laimennusnopeuksilla 0,11 h-1, kun käytettiin jatkuvatoimista kasvatusta soluja kierrättämällä. Qureshi ja Blaschek (2004) käyttivät tiilikappaleita solujen immobilisoimiseksi kolonniin; he pääsivät korkeisiin ABE-tuottoihin vapaisiin solususpensioihin verrattuna, mutta kolonni kärsi teknisistä ongelmista. Ennis ja Maddox (1989) tutkivat liottimen tuottamista jatkuvatoimisella bioreaktorilla, joissa soluja kierrätettiin käyttämällä ristikkäisvirta-us-mikrosuodatus (CFM) -kalvoyksikköä. Liuottimen tuoton ilmoitettiin olevan 2,92 kg/m3 ja saannon 0,31 kg kg'1.

Berezina et ai. (2008) raportoivat C. acetobutylicumin eri kantojen alhaisista sellu-laasiaktiivisuuksista karboksimetyyliselluloosalle ja kiteiselle ja amorfiselle selluloosalle . Julkaisun Löpez-Contreras et ai. (2004) mukaan C. acetobutylicum ei hajota selluloosaa, mutta että sellulaasiaktiivisuuden matalatasoista indusoitumista esiintyy, kun sitä kasvatetaan ksyloosilla tai ligniinillä. ABE-fermentointi Clostridium-lajeja käyttämällä on prosessi, jossa tarvitaan kahta vaihetta. Ensimmäisessä vaiheessa muodostuu happoja, etikka-, propioni-, maitoja voihappoa. Toisessa vaiheessa muodostuu liuottimia, asetonia, butanolia, etanolia ja isopropanolia. Happoja ja liuottimia muodostavien vaiheiden solut voidaan ladata kolonniin, substraattivirta pumpataan sitten kolonnin läpi, jolloin muodostuu liuottimia. Prosessi tulee suorittaa täysin anaerobisissa olosuhteissa.

Patenttijulkaisu WO 2009/126795 julkistaa prosessin, jossa ainakin kaksi bioreak-toria asennetaan sarjaan tai peräkkäin butanolin jatkuvatoimiseksi tuottamiseksi kiinteään kantoaineeseen immobilisoituja Clostridium-lajeja käyttämällä. Tarvitaan entsyymien lisäsyöttöä luonnollisten polymeerien hajottamiseksi sellaisiksi yksinkertaisemmiksi ainesosiksi, joita mikro-organismit pystyvät käyttämään.

Patenttijulkaisu WO 81/01012 A julkistaa menetelmän liuottimien mikrobiologiseksi valmistamiseksi. Immobilisoituja, Clostridium-lajien liuotinta muodostavien kantojen ei-kasvavia soluja käytetään kaksivaiheisessa ABE-prosessissa, jossa solu-massaa kasvatetaan ensin optimaalisissa olosuhteissa ja sitten solut immobilisoi-daan eri menetelmillä.

Eurooppapatentti EP 0282474 (A1) julkistaa jatkuvatoimisen ABE-l-valmistusme-netelmän, jossa ensimmäisessä vaiheessa bakteereja kasvatetaan jatkuvatoimi-sesti ja toisessa vaiheessa, jossa bakteerit immobilisoidaan kantaja-aineeseen, muodostuu tuotetta. Toinen vaihe suoritetaan jatkuvatoimisesti tai eräluonteisesti.

Yleinen kuvaus Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota biokolonni ja soluja pidättävä biomatrii-si, jotka mahdollistavat teknisesti yksinkertaisen prosessin liuottimien ja alkoholien valmistamiseksi eri substraateista. Tämän keksinnön toisena tarkoituksena on tarjota laitteisto ja menetelmä orgaanisten liuottimien valmistamiseksi eri substraateista mikrobien avulla. Tämä tavoite toteutuu itsenäisissä patenttivaatimuksissa lueteltujen keksinnön ominaispiirteiden avulla. Jotkut muista patenttivaatimuksista ovat tämän keksinnön edullisia sovellutusmuotoja. Tämä keksintö perustuu biokolonniin, jossa on soluja pidättävää biomatriisia, joka on ainakin osaksi hajotettavissa ja käytettävissä valittujen mikrobien ravinnon lähteenä. Nyt on yllättäen havaittu, että sellaisen biokolonnin käyttäminen biomatriisi-na, jossa on soluja pidättäviä selluloosakuituja, joita valitut mikrobit hajottavat biologisesti, johtaa parempaan saantoon ja nostaa orgaanisten liuottimien ja alkoholien tuottonopeutta. Valitut solut konvertoivat samaan aikaan substraatin (substraatit) ja valinnaisesti myös hajoavan, solua pidättävän biomatriisin orgaanisiksi hapoiksi ja alkoholeiksi. Tällöin käytettyjen ravinteiden määrä vähenee. Tämä yksinkertaistaa prosessia ja parantaa orgaanisten happojen ja alkoholien tuottamisen taloudellisuutta. Koska jäteaineen tuotto on lisäksi minimaalista, prosessissa ei ole kalliita jätteen keräämis-, erottamis- ja poistovaiheita. Kustannustehokkuus on myös parempi, koska ei ole tarvetta tarjota ylimääräistä vaihetta soluja pidättävän biomatriisiin erottamiseksi lopputuotteista.

Soluja pidättävä biomatriisi valitaan ryhmästä, jonka muodostavat kuitumassan selluloosakuidut, hiokemassa ja liukeneva massa. Kolonnin täytteenä käytetyt sel-luloosakuidut valmistetaan esimerkiksi puun biomassasta etanoli-vesi-S02-keitolla. C. acetobutylicum pystyy hydrolysoimaan selluloosaa, koska siinä on sellulosomi-geenien operoni, mutta selluloosa-aktiivisuus indusoituu olosuhteista riippuvaisesti. On edullista, että biokolonnissa käytetään hyvin hajonnutta selluloosakuitumas-saa soluja pidättävänä biomatriisina. Mikrobit hajottavat soluja pidättävää biomat-riisia ja käyttävät sitä ravinnon lähteenä ajan kuluessa ja sen koostumus on tasainen. Tämän tyyppisen biokolonnin käyttäminen on myös hyvin taloudellista, koska kuitumassa on täysin biologista ja hajoavaa, ja jäljelle jäävä matriisi voidaan pestä ”puhtaaksi” soluista, minkä jälkeen sitä on mahdollista kierrättää tai käyttää uudelleen riippuen solujen metabolian altistustasosta tuottovaiheen aikana. Puun biomassan käyttäminen on myös hyvin kannattavaa, koska sitä on tavallisesti helposti saatavissa ja se on tavallisesti hinnaltaan edullista.

Soluja pidättävä biomatriisi on levyn tai maton tai verkon muotoinen ja rullattu tukiverkon kanssa. Soluja pidättävän biomatriisin rakenne voi vaihdella. ABE-fermentointi C/osfr/cf/ym-lajilla vaatii kaksi vaihetta, näin ollen kaksi kerros-ta/vyöhykettä biomatriisissa. Biomatriisin valmistamiseksi on myös olemassa kaksi erilaista puukuitujen käsittelytapaa; se voidaan esimerkiksi valmistaa matoksi tai levyksi käytetystä mikrobista tai prosessin mittakaavasta riippuen. Tässä kuvataan myös soluja pidättävä biomatriisi yksittäisten kuitujen tai flokkien muodossa. Tässä kuvataan myös soluja pidättävässä biomatriisissa oleva tukirakenne ja/tai virtauksenjakain.

Erään sovellutusmuodon mukaan soluja pidättävä biomatriisi sisältää lisäksi poly-propyleenia tai polyetyleeniä.

Soluja pidättävän biomatriisin muodosta (levy tai matto) riippumatta soluja pidättävä biomatriisi rullataan sellaisen tukiverkon kanssa, joka voidaan valmistaa poly-propyleenista, polyetyleenistä tai jostain muusta mikrobiologisille reaktioille inertis-tä aineesta. Kuidut tai muu biomatriisi sijoitetaan tukimatriisin kanssa kerroksina toinen toisensa pintaan ja rullataan halutun pituisiksi ja halkaisijaltaan halutuiksi pyöreiksi laatoiksi. Kunkin kerroksen paksuus ja kunkin aineen suhde voi vaihdella käytetyistä mikrobeista riippuen.

Erään sovellutusmuodon mukaan mainitut mikrobit immobilisoidaan soluja pidättävään biomatriisiin. Mikrobit voidaan immobilisoida soluja pidättävään biomatriisiin alalla tunnetuilla yleisillä menetelmillä. Näitä ovat esimerkiksi solususpension pumppaaminen soluja pidättävän matriisin läpi, kunnes kolonni on kyllästetty soluilla. Matriisi voidaan sekoittaa suspension kanssa, jonka solupitoisuus on korkea, ja pakata kolonniin.

Erään sovellutusmuodon mukaan mainittu mikrobi valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Clostridia-lajit, kuten C. acetobutylicum, C. butyricum, C. beijerinckii, C. saccharobutylacetonicum ja C. saccharobutylicum, tai Lactobacillus-\ä\\\ (maitohappobakteerit), kuten L. plantarum, L. brevis, L. fermentum, L sanfranciscensis, L buchneri, L collinoides, L rhamnosus ja L bulgaricus. Mainittu mikrobi voi olla esimerkiksi villityyppinen mikrobi, tyypiltään mutantti mikrobi ja geneettisesti muokattu mikrobi. Tämän keksinnön toinen suoritusmuoto on laitteisto orgaanisten liuottimien ja alkoholien valmistamiseksi eri substraateista mikrobien avulla. Tämän keksinnön mukaisessa laitteistossa on ainakin biokolonni, jossa on puukuituja soluja pidättävänä biomatriisina, joka on hajotettavissa ja käytettävissä valittujen mikrobien ravinnon lähteenä.

Erään sovellutusmuodon mukaan laitteistossa on lisäksi erillinen tai integroitu solujen kasvatusyksikkö, jossa on syöttölaite ensimmäisen substraatin syöttämiseksi, ja säätölaite valitun mikrobin (valittujen mikrobien) solujen kasvatusolosuhteiden säätelemiseksi solujen mainitun integroidun kasvatusyksikön ensimmäisessä liuoksessa.

Toisen sovellutusmuodon mukaan laitteistossa on lisäksi erillinen tai integroitu fermentointia säätelevä yksikkö, jossa on säätölaite olosuhteiden muokkaamiseksi toisessa liuoksessa siten, että ne suosivat orgaanisten liuottimien ja alkoholien muodostumista valittujen mikrobisolujen avulla. Mainitussa säätöyksikössä on edullisesti syöttölaite solujen ja/tai ensimmäisen liuoksen syöttämiseksi solujen mainitusta integroidusta kasvatusyksiköstä ja säätölaite olosuhteiden muokkaamiseksi toisessa liuoksessa siten, että ne suosivat orgaanisten liuottimien ja alkoholien muodostumista valittujen mikrobisolujen avulla. Mainitussa säätöyksikössä on edullisesti lisäsyöttöyksikkö lisäsubstraatin syöttämiseksi mainittuun fermentointia säätelevään yksikköön.

Toisen sovellutusmuodon mukaan laitteistossa on lisäksi erillinen tai integroitu liuoksen talteenottoyksikkö kolmannen liuoksen talteenottamiseksi orgaanisia liuottimia ja alkoholeja sisältävästä biokolonnista.

Erään sovellutusmuodon mukaan laitteistossa on lisäksi soluja palauttava yksikkö biokolonnista peräisin olevien solujen, liuoksen ja/tai kuitujen talteenottamiseksi substraatista ja/tai liuoksen talteenottoyksiköstä. Valinnaisesti ainakin osa näistä soluista palautetaan solujen integroituun kasvatusyksikköön, fermentointia säätelevään yksikköön ja/tai biokolonniin. Tämän etuna on vähentää solujen kasvatus-kustannuksia. Soluja voidaan palauttaa ensimmäiseen yksikköön myös solujen aktiivisuuden uudistamiseksi optimaalisimmissa olosuhteissa. Tässä kuvataan myös menetelmä orgaanisten liuottimien ja alkoholien valmistamiseksi eri substraateista mikrobi(e)n avulla menetelmän sisältäessä ainakin seu-raavat vaiheet: a) mikrobisolujen kasvattamisen jatkuvatoimisella tavalla, panosmuodossa tai fed batch -tavalla ensimmäisessä liuoksessa syöttämällä ensimmäistä substraattia ja muokkaamalla mainitun ensimmäisen liuoksen olosuhteita optimaalisiksi mikrobisolujen kasvulle; b) valinnaisesti solujen kasvatusolosuhteiden muokkaamisen toisessa liuoksessa jatkuvatoimisessa, panosmuotoisessa tai fed batch -mallissa siten, että ne suosivat orgaanisten liuottimien ja alkoholien muodostumista mikrobisolujen avulla; ja c) kasvavien tai mukautettujen solujen viemisen vaiheesta a) ja/tai b) biokolonniin, jossa on soluja pidättävää biomatriisia, joka on ainakin osaksi hajotettavissa ja käytettävissä fermentoinnin säätöyksiköstä peräisin olevien mukautettujen mikrobien ravinnon lähteenä.

Soluja pidättävä biomatriisi valitaan edullisesti ryhmästä, jonka muodostavat kui-tumassan selluloosakuidut, hiokemassa ja liukeneva massa Tässä kuvattu menetelmä sisältää lisäksi seuraavat vaiheet: d) orgaanisten liuottimien ja alkoholien tuottamisen mukautetuilla mikrobisoluilla syöttämällä toista substraattia soluja pidättävään biomatriisiin; ja e) kolmannen liuoksen talteenottamisen orgaanisia liuottimia ja alkoholeja sisältävästä vaiheesta d). Tämän menetelmän erään sovellutusmuodon mukaan mikrobisolut otetaan talteen vaiheesta d) ja/tai vaiheesta e). Valinnaisesti ainakin osa näistä soluista syötetään takaisin vaiheeseen b). Tämän menetelmän erään sovellutusmuodon mukaan toisen substraatin syöttäminen vaiheessa d) aloitetaan heti kun soluja pidättävä biomatriisi on kyllästetty mik-robisoluilla. Tämä parantaa lisäksi saantoa ja nostaa tuottonopeutta, koska biomatriisi on täydessä käytössä. Tämän menetelmän erään sovellutusmuodon mukaan solujen määrää säädellään mittaamalla liuosten optista tiheysarvoa. Tämä on suotuisa ja luotettava menetelmä solujen määrän mittaamiseksi. Se antaa myös tavan prosessin säätelemiseksi tarkemmin ja täsmällisemmin. Tämän menetelmän erään sovellutusmuodon mukaan ensimmäinen substraatti ja/tai toinen substraatti valitaan ryhmästä, jonka muodostavat monomeeriset ja oli-gomeeriset sokerit, puun ja kuitumassan biomassasta peräisin oleva substraatti, kasvien kuorista peräisin oleva substraatti, kuten lignoselluloosabiomassasta, POME:sta ja/tai EFB:stä peräisin oleva substraatti.

Kuitumassasta voidaan tehdä hajoavampaa solujen aineenvaihduntaa varten so-lukontaktiin altistumisen aikana, ja päinvastoin, muokkaamalla kuitumassan poly-merointiastetta säätämällä esimerkiksi rikkidioksidipitoisuutta lignoselluloosabio-massan keitossa. Kuitumassan koostumus voi vaihdella yksittäisistä kuiduista tasaisiin levyihin kolonnin rakenteen mukaan. Tämän menetelmän erään sovellutusmuodon mukaan vaiheiden a) ja b) kasvuolosuhteita optimoidaan säätelemällä pH-arvoa, kasvunopeutta, syöttönopeutta, lämpötilaa, sokerikoostumusta ja substraattipitoisuutta. Tämän menetelmän erään sovellutusmuodon mukaan ensimmäisen liuoksen pH-arvo vaiheessa a) on 3,5-4,5 ja toisen liuoksen pH-arvo vaiheessa b) on 4,5-6,5. Panosmallissa pH in 3,5-6,5. Tämän menetelmän erään sovellutusmuodon mukaan kolmatta liuosta, joka sisältää orgaanisia liuottimia ja alkoholeja, otetaan talteen vaiheessa e) samanaikaisesti, kun toista substraattia syötetään solua pidättävään biomatriisiin vaiheessa d). Tämä liuoksen samanaikainen talteen ottaminen joko alentaa tai eliminoi täysin mikrobisolujen mahdollisen lopputuoteinhibition. Tämä keksintö perustuu myös biokolonnin käyttämiseen orgaanisten liuottimien ja alkoholien tuottamiseen tällä menetelmällä nestemäisten polttoaineiden, kemikaalien, polymeerien ja biomateriaalien syötteeksi. Tämän keksinnön erään sovellutusmuodon mukaan orgaanisia liuottimia ja alkoholeja, kuten asetonia, butanolia, etanolia ja isopropanolia, valmistetaan tämän keksinnön mukaan biokolonnilla (BC). Substraatti (substraatit) valitaan edullisesti ryhmästä, jonka muodostavat monomeeriset ja oligomeeriset sokerit, puun biomassasta peräisin oleva substraatti ja kasvien kuorista peräisin oleva substraatti. Tämän käytön erään sovellutusmuodon mukaan mainittu mikrobi on Clostridia-\a\\ tai Lactobacillus-laji. Syötettävä substraatti on edullisesti substraatti, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat monomeeriset ja oligomeeriset sokerit, puun biomassasta peräisin oleva substraatti ja kasvien kuorista peräisin oleva substraatti. Tämän käytön erään sovellutusmuodon mukaan valmistetut orgaaniset liuottimet ja alkoholit valitaan ryhmästä, jonka muodostavat asetoni, butanoli, etanoli ja iso-propanoli. Muita tuotteita ovat etikkahappo, voihappo, maitohappo, asetaldehydi butyyrialdehydi, meripihkahappo ja propionihappo.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämän keksinnön joitakin sovellutusmuotoja kuvataan seuraavaksi yksityiskohtaisemmin esimerkein.

Organismi, sen säilyttäminen ia siirrostevalmiste

Clostridia acetobutylicum B 5313 (DSM 792, ATCC 824) saatiin laitoksen Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms (Moskova, Venäjä) kokoelmasta Russian National Collection of Industrial Microorganisms. Jäätyneitä va-rastoviljelmiä, joissa oli 20 % (paino/tilavuus) glyserolia, säilytettiin 2 ml:n ampulleissa -70 °C:ssa. Fermentoinnin siirroste valmistettiin 125 ml:n ilmatiiviissä, anaerobisissa lasipulloissa ja kasvatettiin yli yön MSS-alustalla (Berezina et ai., 2008) 37 °C:ssa. MSS-alusta sisälsi 5 g/l hiivauutejauhoa (Scharlau), 60 g/l glukoosia (VWR), 0,8 g/l K2HP042HPC>4:ää (J. T. Baker), 0,01 g/l p-aminobentsoehappoa (Fluka), 0,5 g/l kysteiini-hydrokloridia (Aldrich), 3 g/l CFhCOONFUiää (Merck), 1 g/l KF^PCUiää (J. T. Baker), 1 g/l MgS04-7Fl20:ta (J. T. Baker) ja 0,05 g/l Fe-SCUTF^Oita (Merck).

Kemostaattikasvatukset

Kaksivaiheiset kemostaattikasvatukset suoritettiin kahdessa 1 litran fermentorissa (Braun Biostat Q), F1, F2, MSS-alustalla (glukoosipitoisuus 20 g/l) tai SOL-alustal-la 37 °C:ssa käyttämällä sekoitusnopeutta 50 rpm. SOL-alusta valmistettiin julkai- sun Liubimova et al. (1993) mukaan ja se sisälsi: 1 g/l tryptonia (Lab M), 1 g/l hii-vauutejauhetta (Scharlau), 60 g/l glukoosia (VWR), 0,7 g/l K2HP04:ää (J. T. Baker), 0,5 g/l kysteiini-hydrokloridia (Aldrich), 0,01 g/l NaChää (J. T. Baker), 3 g/l CH3COONH4:ää (Merck), 0,7 g/l KH2PC>4:ää (J. T. Baker), 0,1 g/l MgS04-7H20:ta (J. T. Baker), 0,02 g/l MnS04-H20:ta (Merck) ja 0,015 g/l FeS04-7H20:ta (Merck). Valinnaisesti käytettiin sokeriseosta, jossa oli glukoosia 6,3 g/l; arabinoosia 2,23 g/l; galaktoosia 6,43 g/l; mannoosia 22,85 g/l; ksyloosia 7,51 g/l. Alustaa au-toklavoitiin 20 minuutin ajan 121 °C:n lämpötilassa. Viljelmän pH säädettiin F1-ja F2-yksiköissä vastaavasti arvoon 4,6 ja 5,1 ja sitä säädeltiin 4 M NaOH:lla. Lai-mennusnopeudet säädettiin peräkkäin arvoihin 0,05 h'1 ja 0,1 h'1. 500 ml:n työs-kentelytilavuus pidettiin vakiollisena poistamalla nestettä peristalttisilla pumpuilla kummastakin fermentointiyksiköstä (Peristaltic Pump P-3, Pharmacia Fine Chemicals). Näytteitä otettiin biomassaa ja HPLC:tä varten kahtena peräkkäisenä päivänä tasapainotilaolosuhteiden varmistamiseksi.

Solun kuivapainomittaukset

Viljelmänäytteitä (40 ml) sentrifugoitiin (Eppendorf, Centrifuge 5804R) 5000 rpm:n nopeudella 10 minuuttia, ne pestiin Milli-Q-vedellä ja niitä kuivattiin seuraavaksi uunissa 80 °C:n lämpötilassa 24 tunnin ajan (Heraeus) lasisilla petrimaljoilla, jotka punnittiin ennen näytteen lisäämistä. Maljat punnittiin sitten kun ne olivat kuivia.

Soluja pidättävä kolonni

Pharmacia-kolonni (XK26) täytettiin muoviverkkoon tuetuilla, vedellä kyllästetyillä selluloosakuiduilla. 50 g (paino/paino) kuusihakekuituja rullattiin yhdessä muovi-verkon kanssa putkimaiseen muotoon ja asetettiin kolonniin. Pylvään korkeus oli 20,7 cm ja vastaava tyhjä tilavuus oli 102 cm3. Kolonnia steriloitiin yli yön etanolilla ja 4,6 cm3:n kolonnitilavuus määritettiin huuhtomalla kolonnia kasvatusalustalla. Aktiivisesti kasvavaa ja tuottavaa Clostridia-solumassaa ladattiin biokolonniin pumppaamalla solususpensiota suurella virtausnopeudella matriisin läpi. Ulos vir-taava solumassa palautettiin F2-bioreaktoriyksikköön. Solumassan retentiota seurattiin alentamalla 600 nm:n optista tiheysarvoa. Kun biomatriisi oli kyllästetty soluilla, lataaminen lopetettiin. Substraattiliuoksen syöttäminen aloitettiin pohjan suunnasta erillisestä substraattipullosta, joka oli sijoitettu 37 °C:n vesihauteeseen. ABE-liuostuotetta kerättiin kolonnin päältä. Kun tuottavuus aleni, solujen lataaminen toistettiin.

Kuusihakkeen SEW-fraktiointi kuitumassan tuottamiseksi

Massan keiton raaka-aineena käytettiin 2-4 mm:n paksuiseksi seulottua ja sitten ilmakuivattua teollista kuusihaketta. Hake fraktioitiin SC>2-etanoli-vesi (SEW) -keit-toprosessilla, jota American Process Inc. (API) kutsuu myös AVAP™-prosessiksi. Selluloosan keitto suoritettiin silikoniöljyhauteessa käyttämällä 6:ta 220 ml:n säiliötä laittamalla 25 grammaa uunissa kuivattua haketta kuhunkin säiliöön. Tuoretta fraktiointinestettä valmistettiin injektoimalla kaasumaista rikkidioksidia 55-tilavuus-prosenttiseen etanoli-vesi-lluokseen. Käytettiin deionisoitua vettä ja etanolia, ETAX A:ta (96,1 % (til./til.). Käytetty neste-puu-suhde oli 6 l/kg. Keitto suoritettiin kaksissa eri olosuhteissa. Fraktiointiolosuhteet, muun muassa S02-pitoisuus nesteen painosta, lämpötila ja fraktiointiaika, muun muassa lämmitysaika, esitetään taulukossa 1. Olosuhteet valittiin siten, että fraktioinnista 2 saadulla massalla on huomattavasti alhaisempi viskositeetti ja selluloosan polymerointiaste. Tästä eteenpäin fermentoimattomia referenssimassanäytteitä kutsutaan REF135:ksi ja REF150 keittolämpötilojen mukaisesti, kun taas fermentoituja massoja kutsutaan FER135:ksi ja FER150:ksi.

Taulukko 1: Fraktiointiolosuhteet kuusihakkeen SEW-keitossa selluloosakuiduiksi.

Keittämisen jälkeen säiliöt poistettiin nopeasti öljyhauteesta ja ne jäähdytettiin kylmällä vedellä. Kunkin säiliön kuitumassasuspensio kaadettiin pesupussiin ja käytetty neste erotettiin kuitumassasta puristamalla. Sitten kuitumassa pestiin 2 kertaa 300 ml:Ha 40-prosenttista etanoli-vesi-liuosta 60 °C:ssa ja lopuksi huoneenlämpötilassa 2 kertaa 3 l:lla deionisoitua vettä. Osa pestystä kuitumassasta laitettiin fermentointikolonniin, kun taas osaa massasta pidettiin referenssinäyttee-nä, jolle ei tehty lisäkäsittelyjä.

Kuitumassoien analyysit ennen fermentointia ia fermentoinnin jälkeen Käsittelemättömien referenssikuitumassojen ja fermentoitujen kuitumassojen ho-mogenisointi suoritettiin hajottamalla 1 % konsistenssiin 30 000 kierrosnopeudella (ISO 5263:n mukainen laitteisto). Hajotettu kuitumassa laitettiin pesusukkaan ja

ylimäärä vettä suodatettiin pois. Suodos suodatettiin uudelleen suodatinmaton läpi nollakuidun hävikin minimoimiseksi. Sitten massa kuivattiin ilmassa ennen lisäkokeita.

Kuitumassojen kemiallinen koostumus määritettiin sen jälkeen, kun ilmassa kuivatut kuitumassat oli jauhettu Wiley-myllyllä käyttämällä 30 meshin seulaa. Uuttuva ainesosa määritettiin SCAN-CM 49:03:n mukaan käyttämällä asetonia uuttavana liuottimena. Tämän jälkeen suoritettiin NREL (NREL/TP-510-42618) -menetelmä ligniinin ja rakenteellisten hiilihydraattien määrittämiseksi. Referoidusta menetelmästä poiketen happoon liukeneva ligniini (ASL) määritettiin UV-Vis-spektrofoto-metrillä 205 nm:n aallonpituudella seuraavan yhtälön mukaan:

jossa ODWkuitumassa = kuitumassanäytteen uunikuivattu paino. Käytetty absor-boivuusarvo oli 128 I g"1 cm'1, joka on yleinen havupuulajeille.

Kuitumassaliuosten rajaviskositeetti CED:ssä analysoitiin SCAN-CM 15:99:n mukaan. Ennen määritystä kuitumassoille REF150 ja FER150, jotka valmistettiin alhaisemmalla S02-kuormituksella (3 %) ja joiden ligniinipitoisuus oli siis suurempi, suoritettiin ligniinin poistaminen kloriitilla T230 om-66:n (5 g kuitumassaa 200 ml:ssa vettä + 5 g NaCIC^ta + 2 ml etikkahappoa 70 °C:ssa 5 minuuttia) mukaan.

Selluloosan polymerointiaste (DP) laskettiin rajaviskositeetistä seuraavan yhtälön (da Silva Perez ja van Fleiningen, 2002) mukaan:

missä η = kuitumassojen rajaviskositeetti CED:ssä, ml/g; [Flemijkuitumassa = kuitu-massan hemiselluloosapitoisuus (yksikkömurtoluku) ja [Selluloosajkuitumassa = kui-tumassan selluloosapitoisuus (yksikkömurtoluku). Kuitumassan selluloosapitoi-suus laskettiin käyttämällä yhtälöä (Janson, 1974): [Selluloosa] = [Glu]k0k - [Man]/4,15, jossa [Glu]kok = kuitumassan kokonaisglukaanipitoisuus ja [Man] = kuitumassan mannaanipitoisuus. Flemiselluloosien glukaani laskettiin kuitumassan kokonaisglu-kaanipitoisuuden ja selluloosapitoisuuden erona.

Substraatti- ia metaboliittianalyysi 2 ml:n näytteitä sentrifugoitiin 14 000 rprrrllä 5 minuutin ajan (Eppendorf, Centrifuge 5424) ja supernatantti otettiin talteen analyysiä varten. Glukoosi-, etikkahappo-, voihappo-, asetoni-, butanoli- ja etanolipitoisuudet analysoitiin HPLC:llä (Alliance, Waters 2690 and 2695 Separations Modules).

Tulokset

Kaksivaiheinen kemostaattiasennus koottiin yhdistämällä kaksi bioreaktoriyksikköä peristalttisilla pumpuilla. Jakautuminen happoa muodostavaan ja liuotinta muodostavaan vaiheeseen F1- ja F2-bioreaktoriyksiköissä perustui pFI-erolle (taulukko 1) julkaisun Mutschlechner et ai. (2000) mukaisesti. Kemostaattia käytettiin kahdella eri laimennusnopeudella glukoosi- ja sokeriseossubstraateilla. Alhaisempi laimen-nusnopeus asetettiin arvoon 0,05 ja korkeampi arvoon 0,1 1/h. Mikäli laimennus-nopeus oli suurempi kuin 0,1 1/h, biomassa alkoi peseytyä hitaasti ulos, mikä osoittaa sen, että laimennusnopeusmaksimi oli ylitetty. Analysoidut glukoosisubst-raattipitoisuudet olivat 18,7 ja 56,2 g/l. Sokeriseossubstraatissa oli glukoosia 6,3, arabinoosia 2,23, galaktoosia 6,43, mannoosia 22,85 ja ksyloosia 7,51 g/l. Tämä sokerikoostumus perustui keskimääräisiin tuloksiin, joita saatiin, kun kuusihaketta hydrolysoitiin julkaisun Rakkolainen et ai. (2010) mukaan vesi-etanoli-S02-keitolla.

Tulokset osoittivat, että eri pH-arvo ei voi täydellisesti erottaa C. acetobutylicumin aineenvaihduntaa happoa muodostavaan ja liuotinta muodostavaan vaiheeseen. Happoja ja liuottimia havaittiin sekä F1- että F2-bioreaktoriyksiköissä. Biomassa lisääntyy suuremmalla laimennusnopeudella glukoosin syöttöpitoisuudella 18,7 g/l. Tämä osoitti, että solut eivät pysty ylläpitämään niiden energiatarvettaan täydellisesti laimennusnopeudella 0,06 1/h. Metaboliittien tuotto osoitti, että asetoni ja butanoli olivat päätuotteet glukoosista ja että niitä voitiin havaita sekä F1- että F2-yksiköissä näissä olosuhteissa.

Taulukko 2: Clostridia acetobutylicum B5313:n kaksivaiheisen kemostaattikasvatuksen tulokset glukoosilla (glukoosi: 18,7 tai 56,2 g/l ja sokeriseosalusta; glukoosi 6,3; arabinoosi 2,23; galaktoosi 6,43; mannoosi 22,85; ksyloosi 7,51 g/l). F1:ssä ja F2:ssa ylläpidettiin eri pH-arvoja (arvot vastaavasti 4,6 ja 5,1) solujen aineenvaihdunnan jakamiseksi happoa muodostavaan ja liuotinta muodostavaan vaiheeseen.

Glukoosipitoisuudella 18,7 g/l kummallakin yksiköllä F1 ja F2 oli likimain samat metaboliittitasot. Tämä johtuu siitä seikasta, että solususpensiota pumpattiin jatkuvasti F1 -yksiköstä F2-yksikköön. Kuitenkin vasta sitten, kun glukoosipitoisuus oli nostettu arvoon 56,2 g/l, butanoli- ja asetonipitoisuudet nousivat vastaavasti F2-yksikössä, mikä osoittaa, että liuotinta muodostava vaihe tarvitsee riittävän ylisuuren substraattipitoisuuden (taulukko 3). Mannoosia ja glukoosia, jotka olivat edullisimpia substraatteja, kulutettiin saantojen ollessa vastaavasti 0,67 ja 0,90 g/g. Arabinoosi ja ksyloosi olivat siis vähimmin edullisia substraatteja saantojen ollessa vastaavasti 0,04 ja 0,11 g/g (taulukko 4a-b). C. acetobutylicum käytti kaikkia seossubstraatteja samanaikaisesti, mutta kemostaattiolosuhteissa ei havaittu mitään liuottimen muodostumista.

Taulukko 3: Clostridia acetobutylicum B 5313:n metaboliittituotanto kasvatettaessa kaksivaiheisessa kemostaatissa glukoosipitoisuuksilla 18,7 ja 56,2 g/l ja soke-riseosalustalla (sokereita 45,3 g/l). Soluja pidettiin F1-ja F2-yksiköissä vastaavasti happoa muodostavassa ja liuotinta muodostavassa, eri pH-arvoon perustuvassa, vaiheessa. Kaikki näytteet tehtiin kaksoiskokein kahtena peräkkäisenä päivänä.

Taulukko 3 *MSS-alusta sisälsi asetaattia 2,54g/l, **nd, ei havaittu

Taulukot 4a-b: Clostridia acetobutylicum B 5313:n kasvattaminen kaksivaiheisessa kemostaatissa a) glukoosilla, 18,6 tai 56,2 g/l, ja b) sokeriseosalustalla (glukoosia 6,3; arabinoosia 2,23; galaktoosia 6,43; mannoosia 22,85; ksyloosia 7,51 g/l).

Numerot tarkoittavat saantoja (Y s/s), eli kulutettu sokeri (g) / alustan sokeripitoisuus (g), ja F1 ja F2 tarkoittavat fermentointiyksikköjä ja F1+F2 on sokereiden kokonaiskulutus.

Taulukko 4a

Taulukko 4b

Taulukko 5: Kuusihakkeesta valmistettuja selluloosakuituja ladattiin muoviverkolla tuettuun kolonniin. Clostridia acetobutylicum B 5313 -solut ladattiin kolonniin bio-reaktorista pumppaamalla solususpensiota kolonnimatriisin läpi. Solujen saavuttaessa kyllästeisyyden syöttö vaihdettiin a) glukoosiin (18,7 g/l) tai b) soke-riseosalustaan (glukoosi 6,3; arabinoosi 2,23; galaktoosi 6,43; mannoosi 22,85; ksyloosi 7,51 g/l). Luvut esitetään volumetrisinä saantoina (Qbuoh = g butano-lia/l h).

ABE-tuotteiden korkeaan volumetriseen tuottoon pääsemiseksi C. acetobutylicum-solut ladattiin kolonniin F2-bioreaktorista. Selluloosakuituja käytettiin muoviverkolla tuettuna soluja pidättävänä matriisina. Tulokset osoittavat, että suurin volumetri-nen butanolin tuotto glukoosista oli 4,38 g/l h loppupitoisuudella 4,14 g/l (tietoja ei esitetä). Suurin laimennusnopeus (1,06 1/h) mahdollisti butanolin nopean poistamisen helpottaen inhibitiovaikutusta solun aineenvaihduntaan. Etikkahappo- ja voihappopitoisuudet olivat vastaavasti 1,19 g/l ja 1,63 g/l, mikä osoittaa solujen tuottaneen aktiivisesti happoja (tietoja ei esitetä). Volumetrinen tuotto ja loppupi-toisuus sokeriseossyötöllä laimennusnopeudella 0,2 1/h olivat 0,82 g/l h ja 4,02 g/l (tietoja ei esitetä).

Taulukko 6: Kuitumassan rajaviskositeetti CED:ssä (ml/g) ja selluloosan polyme-rointiaste (DP) ennen kuin niitä käytettiin ABE-kolonnissa soluja pidättävänä matriisina ja tällaisen käyttämisen jälkeen. REF135/150 viittaa kontrollinäytteisiin ennen kolonnikokeita ja FER135/150 kolonnikokeiden jälkeen.

Viskositeettitulokset ja selluloosan DP-tulokset osoittavat, että C. acetobutylicum pystyy hajottamaan selluloosakuituja muodostamalla ekstrasellulaarisia sellulaase-ja kolonniolosuhteissa. Selluloosan DP laski 9,6 %:Ma viskositeetiltaan suuremman

kuitumassan kyseessä ollessa, kun taas vaikutus viskositeetiltaan matalampaan kuitumassaan oli merkityksetön (1,9 %) (taulukko 6).

Taulukko 7: Selluloosakuitujen kemiallinen koostumus ennen ABE-kolonniajoja ja -ajojen jälkeen.

Kokonaishiilihydraattien paino-osuus laski fermentoidussa kuitumassassa referenssiin verrattuna, kun taas ligniinin suhteellinen osuus nousi (taulukko 7). Pääasiassa mannaani- ja ksylaanisokereita, jotka olivat peräisin hemiselluloosista, käytettiin mieluummin kuin selluloosasta peräisin olevaa glukaania.

Referenssit

Bahl, H., Andersch, W. ja Gottschalk, G. (1982) Continuous production of acetone and butanol by Clostridium acetobutylicum in a two-stage phosphate limited che-mostat. Eur. J. Appi. Microbiol. Biotechnol. 15: 201-205.

Berezina, O. V., Sineoky, S. P., Velikodvorskaya, G. A., Schwarz, W. H. ja Zver-lov, V. V. (2008) Extracellular glycosyl hydrolase activityof the Clostridium strains producing acetone, butanol, and ethanol. Appi. Biochem. Microbiol. 44: 42-47.

Berezina, O. V., Zakharova, N. V., Brandt, A., Yarotsky, S. V., Schwarz, W. H. ja Zverlov, V. V. (2010) Reconstructing the clostridial n-butanol metabolic pathway in Lactobacillus brevis. Appi Microbiol Biotechnol. 87: 635-646.

Cornillot, E., Nair, R. V., Papoutsakis, E. T. ja Soucaille, P. (1997) The genes for butanol and acetone formation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 reside on a large plasmid whose loss leads to degeneration of the strain. Journal of Bacteriology. 179(17), 5442-5447.

Ennis, B. M. ja Maddox, I. S. (1989) Production of solvents (ABE fermentation) from whey permeate by continuous fermentation in a membrane bioreactor. Bioprocess Eng. 4: 27-34.

Ezeji T. ja Blaschek H. P. (2008) Fermentation of dried distillers' grains and solubles (DDGS) hydrolysates to solvents and value-added products by solventogenic Clostridia. Bioresource Technology. 99 (12): 5232.

Harris, L. M., Welker, N. E., Papoutsakis, E. T. (2002) Northern, morphological, and fermentation analysis of spoOA inactivation and overexpression in Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Journal of Bacteriology. 184 (13), 3586-3597.

Janson, J. (1974) Analysis of the polysaccharides in wood and pulp. Faserforschung und Textiltechnik. 25 (9), 375-382.

Lin, Y. L. ja Blaschek, H. P. (1983) Butanol production by a butanol-tolerant strain of Clostridium acetobutylicum in extruded corn broth. Applied and Environmental Microbiology. 45 (3): 966-73.

Liubimova I. K., Velikaia, M. A., Lukina, G. P., Abilev, S. K. ja Livshits, V. A. (1993) Biosynthesis of solvents by the mutants of Clostridium acetobutylicum, resistant to 2-deoxy-D-glucose. Russian Journal of Biotechnology. 8: 10-12.

Lopez-Contreras, A. M., Gabor, K, Martens, A. A., Renekens, B. A. M., Claassen, P. A. M., van der Oost, J. ja de Vos, W. M. (2004) Substrate-induced production and secretion of cellulases by Clostridium acetobutylicum. Applied and Environmental Microbiology. 70 (9): 5238-5243.

Mitchell, W. J., (1998) Physiology of carbohydrate to solvent conversion by Clostridia. Adv. Microb. Physiol. 39, 31-130.

Mutschlechner 0., Swoboda H. ja Gapes J. R. (2000) Continuous two-stage ABE-fermentation using Clostridium beijerinckii NRRL B592 operating with a growth rate in the first stage vessel close to its maximal value. J. Mol. Microbiol. Biotech-nol. 2(1):101-105.

Nimcevic D., Schuster M. ja Gapes J. R. (1998) Solvent production by Clostridium beijerinckii NRRL B592 growing on different potato media. Appi. Microbiol. Bio-technol. 50: 426^128.

Qureshi N., Lai, L. L. ja Blaschek, H. P. (2004) Scale-up of a high productivity continuous biofilm reactor to produce butanol by adsorbed cells of Clostridium beijerinckii. Food and Bioproducts Processing. 82 (C2): 164-173.

Rakkolainen, M., Iakovlev, M., Teräsvuori, A-L, Sklavounos, G. Jurgens, Granström, T. B. ja van Heiningen, A. (2010) SÖ2-ethanol-water fractionation of forest biomass and implications for biofuel production by ABE fermentation. Cellulose Chemistry and technology (painossa). da Silva Perez, D. ja van Heiningen, A. R. P. (2002) Determination of cellulose degree of polymerization in chemical pulps by viscosimetry. Seventh European Workshop on Lignocellulosics and Pulp (EWLP, Proceedings), s. 393-396.

Tashiro, Yukihiro; Takeda, Katsuhisa; Kobayashi, Genta ja Sonomoto, Kenji (2005) High production of acetone-butanol-ethanol with high cell density culture by cell-recycling and bleeding. Journal of Biotechnology. 120 (2), 197-206.

Thormann, K., Feustel, L., Lorenz, K., Nakotte, S. ja Durre, P. (2002) Control of butanol formation in Clostridium acetobutylicum by transcriptional activation. Journal of Bacteriology. 184 (7), 1966-1973.

Walton, M. T. ja Martin, J. L. (1979) Production of butanol-acetone by fermentation. In H.J. Peppier and D. Perlman (toim.) Microbial Technology 2nd ed. Academic Press. New York, NY 1: 187-209.

Zverlov, V. V., Berezina, O., Velikodvorskaya, G. A. ja Schwarz, W. H. (2006) Bacterial acetone and butanol production by industrial fermentation in the Soviet Union: use of hydrolyzed agricultural waste for biorefinery. Appi. Microbiol. Biotech-nol. 71, 587-597.

Claims (10)

1. Soluja pidättävä biomatriisi (CRB) orgaanisten liuottimien ja alkoholien tuottamiseksi mikrobi(e)n avulla eri substraateista, tunnettu siitä, että mainitussa soluja pidättävässä biomatriisissa (CRB) on: - selluloosakuituja, jotka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat kuitumassan selluloosakuidut, hiokemassa ja liukeneva kuitumassa, ja - mikrobeja, jotka on immobilisoitu soluja pidättävään biomatriisiin (CRB), ja jotka mikrobit kykenevät konvertoimaan samaan aikaan substraatin (substraatit) orgaanisiksi liuottimiksi ja alkoholeiksi, ja biomatriisi (CRB) on levyn, maton tai verkon muodossa ja rullattu tukiverkon kanssa.

2. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen soluja pidättävä biomatriisi (CRB), joka sisältää polypropyleeniä tai polyetyleeniä.

3. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen soluja pidättävä biomatriisi (CRB), jossa mainittu mikrobi (mainitut mikrobit) valitaan ryhmästä, jonka muodostavat C/osfr/cf/ä-lajit, kuten C. acetobutylicum, C. butyricum, C. beijerinckii, C. saccharobutylacetonicum, C.saccharobutylicum, ja Lactobacillus-lajit, kuten L plantarum, L brevis, L fermentum, L sanfranciscensis, L. buch-neri, L coliinoides, L rhamnosus ja L bulgaricus.

4. Biokolonni (BC), joka sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen soluja pidättävän biomatriisin (CRB).

5. Laitteisto orgaanisten liuottimien ja alkoholien tuottamiseksi mikrob(e)illa eri substraateista, joka laitteisto sisältää patenttivaatimuksen 4 mukaisen bioko-lonnin (BC).

6. Orgaanisten liuottimien ja alkoholien valmistusmenetelmä eri substraateista mikrobi(e)n avulla menetelmän sisältäessä ainakin seuraavat vaiheet: - mikrobisolujen kasvattamisen ensimmäisessä liuoksessa (S01) syöttämällä ensimmäistä substraattia (SU1) ja muokkaamalla mainitun ensimmäisen liuoksen olosuhteita optimaalisiksi mikrobisolujen kasvulle; ja - kasvavien tai mukautettujen solujen viemisen vaatimuksen 4 mukaiseen bio-kolonniin; ja - mikrobisolujen kasvattamisen syöttämällä substraattia (SU1, SU2) mihin tahansa patenttivaatimusten 1-5 mukaiseen soluja pidättävään biomatriisiin (CRB), - tuotetaan samanaikaisesti orgaanisia liuottimia ja alkoholeja kyseisellä soluja pidättävällä biomatriisilla (CRB), ja - otetaan talteen orgaanisia liuottimia ja alkoholeja sisältävää liuosta, jolloin mikrobisoluja kasvatetaan liuoksessa (S01) syöttämällä substraattia (SU1) ja muokkaamalla mainitun liuoksen (S01) olosuhteista optimaalisiksi mikrobisolujen kasvulle.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, jolloin solujen määrää säädellään mittaamalla liuosten (S01, S02, S03) optisia tiheysarvoja.

8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen menetelmä, jolloin substraatti (SU1, SU2) valitaan ryhmästä, jonka muodostavat monomeeriset ja oligomeeriset sokerit, puun biomassasta peräisin oleva substraatti, kasvien kuorista peräisin oleva substraatti, kuten lignoselluloosabiomassasta, POMEsta ja/tai EFB:stä peräisin oleva substraatti.

9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 6-8 mukainen menetelmä, jolloin kasvatusolosuhteita optimoidaan säätelemällä pH-arvoa, kasvunopeutta, syöttöno-peutta, lämpötilaa, sokerikoostumusta, substraattipitoisuutta.

10. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen soluja pidättävän bio-matriisin (CRB) käyttö orgaanisten liuottimien ja alkoholien tuottamiseen nestemäisten polttoaineiden, kemikaalien, polymeerien ja biomateriaalien syötteeksi. Patentkrav