KR100971790B1 - Butyryl-CoA를 중간체로 하여 부탄올을 생합성하는 능력을가지는 박테리아를 이용하여 부탄올을 제조하는 방법 - Google Patents
Butyryl-CoA를 중간체로 하여 부탄올을 생합성하는 능력을가지는 박테리아를 이용하여 부탄올을 제조하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 butyryl-CoA를 중간체(intermediate)로 하여 부탄올을 생합성하는 능력을 가지는 박테리아를 이용하여 부탄올을 제조하는 방법에 관한 것으로, butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소 (AdhE)를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 박테리아에서, 다양한 방법으로 butyryl-CoA를 생성한 다음 부탄올로 전환시켜 부탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 butyryl-CoA를 중간체(intermediate)로 하여 부탄올을 생합성하는 능력을 가지는 박테리아를 이용하여 부탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 고유가와 환경 문제로 인해 미생물을 이용한 바이오연료 생산이 큰 관심을 끌고 있다. 특히, 바이오부탄올은 바이오에탄올에 비해 산소함유량이 낮아 화석연료와 잘 섞인다는 장점이 있다. 최근 바이오 부탄올이 휘발유의 대체 연료로 부상하면서 시장 규모가 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 미국에서의 연간 바이오 부탄올 시장은 370 million gal에 이르고 있고, 3.75＄/gal의 단가를 형성하고 있다. 특히, 바이오부탄올은 에너지 밀도, 휘발성 제어, 충분한 옥탄가, 낮은 불순물 등 연료로서 적합한 특성을 가지고 있다. 에탄올 보다 휘발유에 더욱 적합한 부탄올을 미생물을 이용하여 대량 생산한다면, 원유 수입 대체 효과 및 온실 가스 배출 감소로 인한 환경적 효과 등을 가져올 수 있다.
부탄올은 Clostridial 균주의 혐기적 ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) fermentation에 의해 생물학적 방법으로 생산될 수 있는데 (Jones, D.T. and Woods, D.R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986; Rogers, P., Adv. Appl. Microbiol., 31:1, 1986; Lesnik, E.A. et a1., Necleic Acids Research, 29: 3583, 2001), 이러한 방법이 1950년대 까지만 해도 40년 이상에 걸쳐 부탄올과 아세톤의 주요 공급원이었다. Clostridial 균주는 성장 조건이 까다롭고 분자생물학적 tool 및 omics technology 등이 완전히 갖추어져 있지 않아서 추가 균주 개량에 어려움이 있다.
따라서, 성장이 우수하고 다양한 omics technology가 구비된 대장균 등에서의 부탄올 생산이 요구되고 있다. 특히, 대사공학 또는 omics technology 등을 이용한 균주 개발이 전무한 상태이므로 무한한 개발 잠재력이 있다고 하겠다.
Clostridium acetobutylicum에서의 부탄올 생성 pathway는 FIG. 1에 나타난 바와 같다 (Jones, D.T. and Woods, D.R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986; Desai, R.P. et al., J. Biotechnol., 71:191, 1999). 대장균은 유사 pathway를 통해 에탄올을 합성할 수 있는데, 이는 혐기적 조건에서 induce되는 adhE 유전자 (acetyl-CoA로부터 acetaldehyde를 거쳐 에탄올 생성에 관여하는 AdhE 효소를 encoding)에 의해 이루어진다. 대장균도 butyryl-CoA와 butanol 합성에 필요한 유전자들 중 일부를 포함할 수 있으나, 그 농도가 매우 낮아서 clostridia의 해당 유전자들처럼 효과적으로 해당 반응을 catalyze 하기는 힘들다.
한편, 부탄올 생합성 경로를 도입하여 부탄올 생성능을 가지는 재조합 박테리아를 제작하고, 이를 이용하여 부탄올 생산을 시도한 바 있으나, 그 생성량이 미미하였다 (US 2007/0259410 A1; US 2007/0259411 A1).
이에, 본 발명자들은 박테리아 (특히, 대장균)을 이용하여 부탄올을 생산하는 새로운 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소 (AdhE)를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 박테리아에서 다양한 방법으로 중간체인 butyryl-CoA를 생성시키고, 상기 생성된 butyryl-CoA가 AdhE에 의해 부탄올로 전환되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
결국, 본 발명의 목적은 부탄올 등의 생합성 경로에서 중요한 중간체인 butyryl-CoA를 생성하는 다양한 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 butyryl-CoA를 중간체(intermediate)로 하여 부탄올을 생합성하는 능력을 가지는 박테리아를 이용하여 부탄올을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소 (AdhE)를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 박테리아에 CoAT (acetyl-CoA:butyryl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 박테리아를 부티레이트 또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, CoAT (acetyl-CoA:butyryl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 박테리아를 부티레이트 또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, AtoDA (acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아를 부티레이트 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, AtoDA를 코딩하는 유전자와 AdhE를 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아를 부티레이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, AtoDA를 코딩하는 유전자, FadB (3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, PaaFG (enoyl-CoA hydratase)를 코딩하는 유전자 및 FadE (acyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아를 부티레이트 또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, AtoDA를 코딩하는 유전자, FadB를 코딩하는 유전자, PaaFG를 코딩하는 유전자 및 FadE를 코딩하는 유전자와 AdhE를 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아를 부티레이트 또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, thiolase (THL)를 코딩하는 유전자, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD)를 코딩하는 유전자, crotonase (CRO)를 코딩하는 유전자와 functional BCD (butyryl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 박테리아 및 상기 재조합 박테리아를 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, THL를 코딩하는 유전자, BHBD를 코딩하는 유전자 및 crotonase를 코딩하는 유전자와 functional BCD를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 박테리아를 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, THL를 코딩하는 유전자, BHBD를 코딩하는 유전자, crotonase를 코딩하는 유전자, functional BCD를 코딩하는 유전자, AAD를 코딩하는 유전자, BDH를 코딩하는 유전자 및 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, lacI (lac operon repressor를 코딩하는 유전자) 유전자 및 lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 박테리아 및 상기 재조합 박테리아를 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
FIG. 1은 Clostridium acetobutylicum에서의 부탄올 생성 pathway를 나타낸 것이다.
FIG. 2는 본 발명에 따른 재조합 대장균에서 추정된 부탄올 생성 pathway를 나타낸 것이다.
FIG. 3은 ato system 및/또는 fad system에서 butyryl-CoA를 거쳐 부탄올이 생성되는 pathway를 나타낸 것이다.
FIG. 4는 Clostridium acetobutylicum에서의 acetyl-CoA에서 butyryl-CoA의 생성 pathway를 나타낸 것이다.
FIG. 5는 pKKhbdthiL 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 6은 pTrc184bcdcrt 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 7은 pKKhbdadhEthiL (pKKHAT) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 8은 pKKhbdadhEatoB (pKKHAA) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 9는 pKKhbdadhEphaA (pKKHAP) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 10은 pKKhbdydbMadhEphaA (pKKHYAP) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 11은 pKKhbdbcdPA01adhEphaA (pKKHPAP) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 12는 pKKhbdbcdKT2440adhEphaA (pKKHKAP) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 13은 pTrc184bcdbdhABcrt (pTrc184BBC) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 14는 부탄올 생합성 경로에 관여하는 C. acetobutylicum 유래 유전자 중 일부를 대장균 유래 유전자로 대체한 경우의 부탄올 생합성 경로를 나타낸 것이다.
FIG. 15는 pKKmhpFpaaFGHatoB (pKKMPA) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
본 발명에서는 Clostridium acetobutylicum 유래 thiolase (THL)를 코딩하는 유전자 (thl or thiL); acetyl-CoA:butyryl-CoA transferase (CoAT)를 코딩하는 유전자 (ctfA 및 ctfB); 및 acetoacetate decarboxylase (AADC)를 코딩하는 유전자(adc)가 도입되어 있는 재조합 대장균 [E. coli ATCC 11303(pACT)]이 자체의 효소 (혐기 조건에서 발현되는 AdhE)에 의해 butyryl-CoA로부터 부탄올을 합성할 수 있는지를 확인하고자 하였다. 상기 재조합 대장균 [E. coli ATCC 11303(pACT)]은 acetyl-CoA로부터 acetoacetyl-CoA를 거쳐 acetone을 제조하기 위하여 제작된 것이다 (Bermejo, L.L. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:1079, 1998).
상기 재조합 대장균에 의해 발현되는 Clostridium acetobutylicum의 CoAT enzyme (butyric acid (BA) 또는 acetic acid를 각각 butyryl-CoA 또는 acetyl-CoA로 전환시키는 효소)를 이용하여 acetoacetyl-CoA의 CoA 잔기를 교환할 경우, butyryl-CoA의 생성이 가능할 것으로 예측하였다 (FIG. 2). 또한, 상기 재조합 대 장균 (E. coli ATCC 11303(pACT))은 혐기 조건에서 발현되는 AdhE 효소를 가지고 있으므로, 상기 AdhE 효소가 butyryl-CoA를 butanol로 전환시킨다면 (AdhE enzyme은 원래 acetyl-CoA를 ethanol로 전환시킨다), butanol이 생성될 것으로 예측하였다 (FIG. 2).
이를 확인하기 위하여, 상기 재조합 대장균을 부티레이트 함유 배지에서 배양한 결과, 부티레이트가 butyryl-CoA을 거쳐 부탄올 전환되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 상기 재조합 대장균에 도입되어 있는 ctfA 및 ctfB 유전자에 의해 발현된 CoAT 효소 및 혐기 조건에서 발현된 AdhE 효소에 기인한 것으로 추정된다.
본 발명의 실시예에서는 상기 재조합 대장균을 부티레이트 및/또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양한 결과, 부탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소 (AdhE)를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 박테리아에 CoAT (acetyl-CoA:butyryl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 박테리아를 부티레이트 또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, CoAT (acetyl-CoA:butyryl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 박테리아를 부티레이트 또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 박테리아는 thiolase (THL) 및 acetoacetate decarboxylase (AADC)를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CoAT (acetyl-CoA:butyryl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 ctfA 및 ctfB인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 THL를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 thl 또는 thiL, Ralstonia 속 유래 phaA 또는 대장균 유래 atoB인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 AADC를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 adc인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 다른 미생물 유래의 유전자라 할지라도 숙주 박테리아에 도입발현되어 동일한 효소활성을 나타내는 한 제한이 없다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 박테리아는 대장균인 것이 바람직하나, 상기 AdhE를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 한 이에 국한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 pACT가 도입되어 있지 않은 야생형 대장균을 부티레이트 및/또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양한 결과, 부탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다
야생형 대장균을 부티레이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올이 생성되는 것은 부티레이트가 ato system(Lioliou and Kyriakidis, Microbial Cell Factories, 3:8, 2004)의 AtoDA에 의해 butyryl-CoA로 전환된 다음, 상기 대장균이 가지고 있는 AdhE 효소에 의해 부탄올로 전환된 것으로 추정할 수 있다 (FIG. 3). AtoD는 acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase α subunit이고, AtoA는 acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase β subunit으로, 상기 AtoDA는 다음 반응에 관여 하는 효소이다: aa-CoA＋acetate (or butyrate) ←→ aa ＋ acetyl (butyryl)-CoA
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, AtoDA (acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자와 butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소 (AdhE)를 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아를 부티레이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, AtoDA (acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아를 부티레이트 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 AtoDA를 코딩하는 유전자 및/또는 AdhE를 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아는 대장균인 것이 바람직하나, 상기 유전자를 함유하는 한 이에 국한되는 것은 아니다.
아울러, 야생형 대장균을 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올이 생성되는 것은 acetoacetate가 상기 ato system의 AtoDA에 의해 acetoacetyl-CoA로 전환된 다음, fad system (Park and Lee, Biotechnol. Bioeng., 86:681, 2004)의 FadB(또는PaaH), PaaFG 및 FadE에 의해 butyryl-CoA로 전환된 다음, 상기 대장균이 가지고 있는 AdhE 효소에 의해 부탄올로 전환된 것으로 추정할 수 있다 (FIG. 3).
상기 FadB는 4가지 기능(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase; 3-hydroxybutyryl-CoA epimerase; delta(3)-cis-delta(2)- trans-enoyl-CoA isomerase; 및 enoyl-CoA hydratase)을 가지는 것으로 알려져 있고, FadA와 함께 다음 반응에 관여한다: acyl-CoA ＋ acetyl-CoA ←→ CoA ＋ 3-oxoacyl-CoA. 상기 FadB (또는 PaaH)는 acetoactyl-CoA를 β-hydroxybutyryl-CoA로 전환한다.
상기 PaaFG는 enoyl-CoA hydratase의 기능을 갖는 효소로 β-hydroxybutyryl-CoA를 crotonyl-CoA로 전환한다.
상기 FadE는 acyl-CoA dehydrogenase로 다음 반응에 관여하는 효소로 crotonyl-CoA를 butyryl-CoA로 전환한다: Butanoyl-CoA ＋ FAD ←→ FADH2 ＋ Crotonoyl-CoA
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, AtoDA (acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, FadB 또는 PaaH (3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, PaaFG (enoyl-CoA hydratase)를 코딩하는 유전자 및 FadE (acyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자와 butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소 (AdhE)를 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아를 부티레이트 또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, AtoDA를 코딩하는 유전자, FadB 또는 PaaH를 코딩하는 유전자, PaaFG를 코딩하는 유전자 및 FadE를 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아를 부티레이트 또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 AtoDA를 코딩하는 유전자, FadB 또는 PaaH를 코딩하 는 유전자, PaaFG를 코딩하는 유전자 및 FadE를 코딩하는 유전자 및/또는 AdhE를 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아는 대장균인 것이 바람직하나, 상기 유전자를 함유하는 한 이에 국한되는 것은 아니다.
이상 설명한 바와 같이, butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소 (AdhE)를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 대장균과 같은 박테리아에 acetyl-CoA로부터 butyryl-CoA를 생성하는 pathway를 도입할 경우, 부탄올을 제조할 수 있을 것이다.
이러한 acetyl-CoA로부터 butyryl-CoA를 생성하는 pathway로 이미 잘 알려진 Clostridium 속 유래 pathway를 고려할 수 있다 (FIG. 4). FIG. 4의 pathway에서 Clostridium 속 유래 thl이 대장균에서 효과적이라는 것은 이미 규명된 바 있다 (Bermejo, L.L. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:1079, 1998). 아울러 Clostridium 속 유래 THL을 코딩하는 유전자는 thl 이외에 thiL이 알려져 있다 (Nolling, J. et al., J. Bacteriol., 183:4823, 2001). THL 효소는 acetyl-CoA를 acetoacetyl-CoA로 전환한다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 상기 Clostridium 속 유래 thl 또는 thiL 이외에 Ralstonia 속 유래 phaA 또는 대장균 유래 atoB를 도입한 경우에도 THL 활성을 나타내는 것을 부탄올 생성능으로 확인하였다. 따라서, 상기 Ralstonia 속 유래 phaA 또는 대장균 유래 atoB를 thl 또는 thiL 유전자 대신 사용할 수 있고, 나아가 다른 미생물 유래의 유전자라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 THL 활성을 가지는 한 제한 없이 사용할 수 있을 것이다.
아울러, Bennett 등은 acetoacetyl-CoA로부터 butyryl-CoA를 생성하는데 필요한 효소들 중 butyryl-CoA dehydrogenase (BCD)를 제외한 β-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD) 및 crotonase (CRO)가 대장균에서 발현된다는 것을 제시하였다 (Boynton, Z.L. et al., J. Bacteriol., 178: 3015, 1996). 상기 논문에 의하면, 상기 BCD enzyme 또는 그 co-factors (electron transfer flavoproteins putatively coded by Clostridium acetobutylicum genes (etfB and etfA)) 들이 대장균에서 잘 발현되지 않아서 기능이 없거나, 안정성에 문제가 있어서 in vitro assay에서 활성이 감지되지 않는다고 보고한 바 있다.
본 발명에서는 Clostridium acetobutylicum 유래 bcd를 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL)와 함께 도입시킴으로써 butyryl-CoA dehydrogenase 저발현 문제를 해결하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 Clostridium acetobutylicum 유래 bcd와 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL)를 동시에 도입시킨 경우에 부탄올 생성능이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다.
또 다른 방법으로, Pseudomonas aeruginosa 또는 Pseudomonas putida 유래 bcd 또는 Bacillus subtilis 유래 ydbM를 도입시킴으로써 butyryl-CoA dehydrogenase 저발현 문제를 해결하였다. 결국, BCD를 코딩하는 유전자 역시 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 BCD 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다.
본 발명의 실시예에서는 Clostridium 속 유래 thiL, hbd, bcd, groESL 및 crt 유전자를 대장균에 도입한 결과, 포도당으로부터 butyryl-CoA를 중간체로 거쳐 부탄올이 생성되는 것을 확인하였다. 본 발명의 실시예에서는 또한, 상기 Clostridium 속 유래 bcd와 groESL 대신에 Pseudomonas 속 유래 bcd 또는 Bacillus 속 유래 ydbM를 도입한 대장균에서도 포도당으로부터 butyryl-CoA를 중간체로 거쳐 부탄올이 생성되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, THL, BHBD 및 crotonase를 코딩하는 유전자와 functional BCD를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 박테리아 및 상기 재조합 박테리아를 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, THL를 코딩하는 유전자, BHBD를 코딩하는 유전자 및 crotonase를 코딩하는 유전자와 functional BCD를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 박테리아를 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 생성된 butyryl-CoA는 자체적으로 가지고 있는 AdhE를 코딩하는 유전자에 의해 발현되는 AdhE에 의해 부탄올로 전환된다. 대장균의 경우에는 butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소 (AdhE)를 코딩하는 유전자를 가지고 있다. 또 다른 방안으로는 자체적으로 AdhE를 코딩하는 유전자를 가지고 있지 않은 숙주세포를 사용할 경우에는 AAD(butyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자와 BDH(butanol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 추가로 도입시킴으로써 butyryl-CoA로부터 부탄올을 생성할 수 있다. 아울러 자체적으로 AdhE를 코딩하는 유전자를 가지고 있더라도, AAD(butyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 BDH(butanol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입시킬 경우, 발현되는 AdhE, AAD 및 BDH에 의해 butyryl-CoA로부터 부탄올로의 전환을 촉진할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 재조합 박테리아는 AAD(butyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및/또는 BDH(butanol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 AAD를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 adhE 또는 대장균 유래 mhpF인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 AAD 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다. 또한, 상기 BDH를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 bdhAB인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 BDH 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 THL를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 thl 또는 thiL, Ralstonia 속 유래 phaA 또는 대장균 유래 atoB인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 BHBD 및 crotonase를 코딩하는 유전자는 각각 Clostridium 속 유래 hbd 및 crt인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 각각 BHBD (대장균에서는 FadB 또는 PaaH) 및 crotonase (대장균에서는 PaaFG) 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다. 본 발명의 실시예에서는 Clostridium 속 유래 hbd 및 crt를 각각 대장균 유래 paaH (3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 paaFG (enoyl-CoA hydratase를 코딩하는 유전자)로 대체한 경우에도 부탄올이 생성되는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, "functional BCD" 대장균 등의 숙주세포에 도입된 bcd 유전자가 발현되어 BCD 활성을 나타내는 것을 의미하고, functional BCD를 코딩하는 유전자의 예로는 Pseudomonas 속 유래 bcd 또는 Bacillus 속 유래 ydbM인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한 Clostridium 속 유래 bcd의 경우에도 대장균 등에서 미약한 활성을 나타내고, chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL)와 함께 도입될 경우에는 BCD 활성이 증폭되므로 여기에 속한다 할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 박테리아는 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자는 groESL인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 상기 재조합 박테리아는 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lacI (lac operon repressor를 코딩하는 유전자) 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 아울러, lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 추가로 결실되어 있는 특징으로 할 수 있으며, 상기 lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ldhA (lactate dehydrogenase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.
최종적으로, 본 발명에서는 THL를 코딩하는 유전자, BHBD를 코딩하는 유전자, crotonase를 코딩하는 유전자, functional BCD를 코딩하는 유전자, AAD를 코딩하는 유전자, BDH를 코딩하는 유전자 및 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하고, lacI (lac operon repressor를 코딩하는 유전자) 유전자 및 lactate 생합 성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시켜 재조합 변이 대장균을 제작하고, 상기 재조합 변이 대장균에서 부탄올 생성능이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명에서 '결실'이란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.
실시예
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 대장균 W3110을 숙주 미생물로 이용하였으나, 다른 대장균이나, 박테리아, 효모 및 곰팡이를 사용하여 동일한 결실 대상 유전자를 결실시키고, 부탄올 생합성에 관여하는 효소의 유전자를 도입시킨 다음, 이를 이용하여 부탄올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 도입 대상 유전자로 특정 균주 유래인 것만을 예시하였으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
아울러, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이, 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것 (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001)도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 부티레이트 첨가에 의한 부탄올 제조
재조합 대장균 [E. coli ATCC 11303(pACT)]을 배양하여 부탄올의 제조를 시도하였다. 상기 배양에 사용된 배지 조성은 다음과 같다: NaCl 10g/L, Bacto Tryptone 10g/L 및 Yeast extract 5g/L를 함유하는 LB배지 ＋ Glucose 20g/L 및 NaHCO3 1g/L.
15 ml 배양 tube에 배지 12 ml를 첨가하고 50 g/ml ampicillin을 첨가한 다음, 재조합 대장균 [E. coli ATCC 1103(pACT)]를 접종하고, aerobic chamber에서 1시간 배양한 다음, anaerobic chamber로 transfer하여 2시간 배양하였다.
상기 배양액에 0.8 mM butyric acid를 각각 50㎕, 100㎕, 200㎕ 및 300㎕ 첨가하여 배양하되, 2시간 마다 다시 0.8 mM butyric acid를 각각 50㎕, 100㎕, 200㎕ 및 300㎕ 첨가하면서 배양하였다. 이때, butyric acid 첨가 전에 acid의 pH를 배양액의 그것과 맞추었다.
24, 48, 72, 96, 140 및 164 시간 배양후 배양액의 다양한 성분을 HPLC로 분석하였다 (표 1). 표 1에서 'L-200-48'의미는 200㎕ 0.8 mM butyric acid가 첨가된 배지에서 48시간 배양한 경우를 나타내고, C는 대조군으로 부티레이트가 첨가되지 않은 배지에서 배양한 경우를 나타낸다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 LB 배지에서는 에탄올, 부탄올, acetic acid 및 butyric acid가 검출되지 않았고, butyric acid를 첨가하지 않은 양성대조군에서는 acetate와 ethanol만이 생성되었다. 단, 예외적으로 배양 164시간 후에 매우 낮은 수준의 부탄올이 감지되는데, 이는 butyryl-CoA로부터 유래할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 반면, 재조합 대장균 [E. coli ATCC 11303(pACT)]의 배양시 부티레이트를 첨가한 경우, 에탄올이 생성되는 것으로 보아 AdhE enzyme이 혐기 조건에서 발현되는 것을 알 수 있었고, acetone 생성으로 CoAT enzyme이 발현된다는 것을 알 수 있었으며, 최종적으로 부탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
표 1
실시예 2: 아세토아세테이트 첨가에 의한 부탄올 제조
배양배지로 LB 및 M9 배지를 사용하고, 아세토아세테이트와 부티레이트를 첨가하는 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 배양하였다. 즉, 재조합 대장균 [E. coli ATCC 11303(pACT)]을 아세토아세테이트 (10mM) 및/또는 부티레이트 (20mM 또는 40mM)을 함유하는 LB (glucose 30g/L 함유) 및 M9 배지(5x M9 salts 200ml/L, 2mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, glucose 60g/L 함유)에서 배양한 다음, 배양액을 HPLC로 분석 하였다 (표 2). 표 2에서 '10-M9-200-2-72h'의미는 아세토아세테이트 10mM과 부티레이트 20mM을 함유하는 M9 배지에서 72시간 배양한 경우를 나타내고, 400은 부티레이트 40mM을 함유하는 배지에서 배양한 경우를 나타내며, C는 대조군으로 부티레이트를 함유하지 않는 배지에서 배양한 경우를 나타낸다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 배지에 관계 없이 아세토아세테이트와 부티레이트를 모두 함유하는 배지에서 뿐만 아니라 아세토아세테이트 만을 함유하는 배지에서도 부탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
표 2
실시예 3: 야생형 대장균에서 아세토아세테이트 또는 부티레이트 첨가에 의한 부탄올 제조
15ml 배양배지(LB, glucose 30g/L 함유)를 함유하는 배양 tube에 야생형 대장균(E. coli ATCC 11303)를 접종하여 24시간 배양 후, OD가 2.02에 도달되었을 때, 500ml 배양배지를 포함하는 플라스크로 접종하였다. 상기 배양액을 OD 0.4까지 배양한 후 250ml bottle 2개로 분주하였다. 상기 배양액의 OD가 0.42에 도달되었을 때 배양 bottle을 5000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고 bottle을 혐기챔버에 넣고 혐기챔버에 있던 새 배지 30 ml씩을 각 bottle에 첨가하였다. 0.108g/ml lithium acetoacetate(Sigma, A-8509) 용액을 300μl씩 각 tube에 첨가하여 최종농도가 10mM이 되도록 하고, 부티레이트를 최종농도 0.8mM 되도록 첨가하였다. 배양액의 pH를 부티레이트 첨가전의 pH인 6.25로 맞춘 후, 세포를 현탁하고 배양한 다음, 최종 배양액을 HPLC로 분석하였다 (표 3).
표 3에서 'L8-200-72h'의미는 아세토아세테이트 10mM과 부티레이트 0.8mM을 함유하는 LB 배지에서 72시간 배양한 경우를 나타내고, LC8은 대조군으로 부티레이트를 첨가하지 않고 아세토아세테이트만 함유하는 배지에서 배양한 경우를 나타낸다.
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균(E. coli ATCC 11303)에서도 아세토아세테이트와 부티레이트를 모두 함유하는 배지에서, 실시예 1에서와 마찬가지로, 부탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 아세토아세테이트만 함유하는 배지에서도 부탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
표3
실시예 4: acetyl-CoA로부터 butyryl-CoA를 생성하는 pathway가 도입된 대장균에서 부탄올 제조
4-1: pKKhbdthiL 벡터의 제작
부탄올 생합성 경로에 필수적인 유전자들, 즉, hbd(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 thiL (thiolase를 코딩하는 유전자)를 증폭하고, 순차적으로 pKK223-3 발현벡터 (Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKhbdthiL 벡터를 수득하였다 (FIG. 5).
Clostridium acetobutylicum (KCTC 1724)의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서 열번호 1 및 2의 프라이머를 이용한 PCR (95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복)을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (hbd 유전자)을 EcoRI 및 PstI로 절단하고, pKK223-3 발현벡터(Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKhbd를 제작하였다 (FIG. 5).
pKKhbdthiL 벡터를 제작하기 위하여, 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (thiL 유전자)을 SacI으로 절단하고, 동일 효소(SacI)로 절단한 pKKhbd 벡터에 삽입하여 hbd 유전자와 thiL 유전자를 동시에 함유하는 재조합 벡터 pKKhbdthiL를 제작하였다 (FIG. 5).
[서열번호 1] hbdf: 5'-acgcgaattcatgaaaaaggtatgtgttat-3'
[서열번호 2] hbdr: 5'-gcgtctgcaggagctcctgtctctagaatttgataatggggattctt-3'
[서열번호 3] thiLf: 5'-acgcgagctctatagaattggtaaggatat-3'
[서열번호 4] thiLr: 5'-gcgtgagctcattgaacctccttaataact-3'
pKKhbdgroESLthiL 벡터를 제작하기 위하여, 상기 Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (groESL 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 효소(XbaI)로 절단한 pKKhbdthiL 벡터에 삽입하여 pKKhbdgroESLthiL 벡터를 수득하였다 (FIG. 5).
[서열번호 5] groESLf: 5'-agcttctagactcaagattaacgagtgcta-3'
[서열번호 6] groESLr: 5'-tagctctagattagtacattccgcccattc-3'
4-2: pTrc184bcdcrt 벡터의 제작
Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 프라이머를 사용한 CR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (bcd 유전자)을 NcoI 및 KpnI로 절단하고, pTrc99A 발현벡터(Amersham Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pTrc99Abcd를 제작하였다.상기 pTrc99Abcd 벡터를 BspHI 및 EcoRV로 절단한 다음, 동일 효소(BspHI 및 EcoRV)로 절단한 pACYC184(New England Biolabs)에 삽입하여 bcd 유전자를 발현시키기 위한 발현벡터인 pTrc184bcd를 제작하였다 (FIG. 6).
[서열번호 7] bcdf: 5'-agcgccatggattttaatttaacaag-3'
[서열번호 8] bcdr: 5'-agtcggtacccctccttaaattatctaaaa-3'
pTrc184bcdcrt 벡터를 제작하기 위하여, 상기 Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9 및 10의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, crt 유전자의 PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(crt 유전자)을 BamHI 및 PstI로 절단한 다음, 동일 효소(BamHI 및 PstI)로 절단한 pTrc184bcd에 삽입하여 bcd 유전자와 crt 유전자를 동시에 함유하는 재조합 벡터 pTrc184bcdcrt를 제작하였다 (FIG. 6).
[서열번호 9] crt1: 5'-atacggatccgagattagtacggtaatgtt-3'
[서열번호 10] crt2: 5'-gtacctgcagcttacctcctatctattttt-3'
4-3: lacI 유전자의 결실
상기 4-1 및 4-2에서 제작된 재조합 벡터들에 함유되어 있는 tac promoter 와 trc promoter가 상시 작동되어, 해당 벡터에 클로닝한 유전자들(hbd, thiL, groESL, bcd 및 crt)이 constitutive하게 발현될 수 있도록 염색체 상의 lacI 유전자를 결실시켰다. 즉, 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6:97(12):6640, 2000)에 의해, butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소 (AdhE)를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 대장균 W3110 (ATTC 39936)에서 lac operon의 repressor를 코딩하는 유전자로 lactose 분해를 담당하는 lac operon의 전사억제 기능을 갖는 lacI 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하여 WL 균주를 제작하였다.
[서열번호 11] lacI_1stup: 5'-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttagattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 12] lacI_1stdo: 5'-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgcacttaacggctgacatggg-3'
4-4:부탄올 생성 미생물의 제작
상기 4-1 및 4-2에서 제작된 pKKhbdgroESLthiL 벡터와 pTrc184bcdcrt 벡터를 상기 4-3에서 제작된 WL 균주에 도입하여 부탄올 생성 재조합 변이 미생물 (WL＋pKKhbdgroESLthiL＋pTrc184bcdcrt)을 제작하였다.
4-5: 부탄올 생성능 측정
상기 4-4에서 제작된 부탄올 생성 미생물을 엠피실린(ampicillin) 및 클로람 페니콜(chloramphenicol)이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100ml LB를 함유한 250mL 플라스크에 glucose (10g/L)를 첨가하고 질소가스를 채운 후 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후 상기 전배양액 2㎖을 접종하여, 37℃에서 배양하였다. 상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer (STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 부탄올 농도를 packed column (Supelco CarbopackTM B AW/6.6％ PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography (Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하였다.
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 W3110에서는 부탄올이 생성되지 않은 반면, 본 발명에 따른 재조합 변이 미생물에서는 부탄올이 생성되었다. 이 결과로부터, 본 발명에서의 hbd, thiL, bcd, groESL 및 crt 유전자들의 과발현으로 인해 acetyl-CoA로부터 butyryl-CoA가 성공적으로 생성되었으며, 또한 상기 생성된 butyryl-CoA가 대장균에 존재하는 AdhE에 의해 부탄올로 전환된 것을 확인할 수 있었다.
표 4
실시예 5: 다른 균주 유래의 유전자 도입에 의한 부탄올 제조
5-1: 1dhA 유전자 결실
실시예 4-3에서 수득된 lacI 유전자가 결실된 대장균 W3110(WL)에서 ldhA 유전자를 추가로 결실시키기 위하여, 서열번호 13 및 14의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법에 의해 ldhA (lactate dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 유전자를 결실시켜 WLL 균주를 제작하였다.
[서열번호 13] ldhA1stup: 5'-atgaaactcgccgtttatagcacaaaacagtacgacaagaagtacctgcagattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 14] ldhA1stdo: 5'-ttaaaccagttcgttcgggcaggtttcgcctttttccagattgcttaagtcacttaacggctgacatggga-3'
5-2: pKKhbdadhEthiL (pKKHAT) 벡터의 제작
Clostridium acetobutylicum (KCTC 1724)의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 15 내지 20의 프라이머들을 이용하여 부탄올 생합성 경로에 필수적인 유전자들, 즉 hbd (3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase를 코딩하는 유전자), adhE (butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 thiL (thiolase를 코딩하는 유전자)를 증폭하고, 순차적으로 pKK223-3 발현벡터 (Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKhbdadhEthiL (pKKHAT) 벡터를 수득하였다 (FIG. 7).
[서열번호 15] hbdf: 5'-acgcgaattcatgaaaaaggtatgtgttat-3'
[서열번호 16] hbdr: 5'-gcgtctgcaggagctcctgtctctagaatttgataatggggattctt-3'
[서열번호 17] adhEf: 5'-acgctctagatataaggcatcaaagtgtgt-3'
[서열번호 18] adhEr: 5'-gcgtgagctccatgaagctaatataatgaa-3'
[서열번호 19] thiLf: 5'-acgcgagctctatagaattggtaaggatat-3'
[서열번호 20] thiLr: 5'-gcgtgagctcattgaacctccttaataact-3'
5-3: pKKhbdadhEatoB (pKKHAA) 벡터의 제작
Escherichia coli W3110의 atoB (acetyl-CoA acetyltransferase를 코딩하는 유전자)를 pKKhbdadhE 벡터 (FIG. 7)에 클로닝하기 위하여, Escherichia coli W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 21 및 22의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(atoB 유전자)을 SacI으로 절단하고, 동일 효소(SacI)로 절단한 pKKhbdadhE 벡터에 삽입하여 pKKhbdadhEatoB (pKKHAA) 벡터를 수득하였다 (FIG. 8).
[서열번호 21] atof: 5'-atacgagctctacggcgagcaatggatgaa-3
[서열번호 22] ator: 5'-gtacgagctcgattaattcaaccgttcaat-3
5-4: pKKhbdadhEphaA (pKKHAP) 벡터의 제작
Ralstonia eutropha (KCTC 1006)의 phaA (thiolase를 코딩하는 유전자)를 pKKhbdadhE 벡터에 클로닝하기 위하여, Ralstonia eutropha의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 23 및 24의 프라이머를 사용한 PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(phaA 유전자)을 SacI으로 절단하고, 동일 효소(SacI)로 절단한 pKKhbdadhE 벡터에 삽입하여 pKKhbdadhEphaA (pKKHAP) 벡터를 수득하였다 (FIG. 9).
[서열번호 23] phaAf: 5'-agtcgagctcaggaaacagatgactgacgttgtcatcgt-3'
[서열번호 24] phaAr: 5'-atgcgagctcttatttgcgctcgactgcca-3'
5-5: pKKhbdydbMadhEphaA (pKKHYAP) 벡터의 제작
Bacillus subtilis (KCTC 1022)의 ydbM (hypothetical protein을 코딩하는 유전자)를 pKKhbdadhE 벡터에 클로닝하기 위하여, Bacillus subtilis의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 25 및 26의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (ydbM 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 효소(XbaI)로 절단한 pKKhbdadhEphaA (pKKHAP) 벡터에 삽입하여 pKKhbdydbMadhEphaA (pKKHYAP) 벡터를 수득하였다 (FIG. 10).
[서열번호 25] ydbMf: 5'-agcttctagagatgggttacctgacatata-3'
[서열번호 26] ydbMr: 5'-agtctctagattatgactcaaacgcttcag-3'
5-6: pKKhbdbcdPA01adhEphaA (pKKHPAP) 벡터의 제작
Pseudomonas aeruginosa PA01 (KCTC 1637)의 bcd (butyryl-CoA dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 cloning 하기 위하여, Pseudomonas aeruginosa PA01의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 27 및 28의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(bcd 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 효소(XbaI)로 절단한 pKKhbdadhEphaA (pKKHAP)에 삽입하여 pKKhbdbcdPA01adhEphaA (pKKHPAP) 벡터를 수득하였다 (FIG. 11).
[서열번호 27] bcdPA01f: 5'-agcttctagaactgctccttggacagcgcc-3'
[서열번호 28] bcdPA01r: 5'-agtctctagaggcaggcaggatcagaacca-3'
5-7: pKKhbdbcdKT2440adhEphaA (pKKHKAP) 벡터의 제작
Pseudomonas putida KT2440 (KCTC 1134)의 bcd(butyryl-CoA dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 cloning 하기 위하여, Pseudomonas putida KT2440의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 29 및 30의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (bcd 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 효소(XbaI)로 절단한 pKKhbdadhEphaA 벡터에 삽입하여 pKKhbdbcdKT2440adhEphaA (pKKHKAP) 벡터를 수득하였다 (FIG. 12).
[서열번호 29] bcdKT2440f: 5'-agcttctagaactgttccttggacagcgcc-3'
[서열번호 30] bcdKT2440r: 5'-agtctctagaggcaggcaggatcagaacca-3'
5-8: pTrc184bcdbdhABcrt 벡터의 제작
Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 31 및 32의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (bcd 유전자)을 NcoI 및 KpnI로 절단하고, pTrc99A 발현벡터(Amersham Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pTrc99Abcd를 제작하였다. 상기 pTrc99Abcd 벡터를 BspHI 및 EcoRV로 절단한 다음, 동일 효소(BspHI 및 EcoRV)로 절단한 pACYC184(New England Biolabs)에 삽입하여 bcd 유전자를 발현시키기 위한 발현벡터인 pTrc184bcd를 제작하였다 (FIG. 13).
[서열번호 31] bcdf: 5'-agcgccatggattttaatttaacaag-3'
[서열번호 32] bcdr: 5'-agtcggtacccctccttaaattatctaaaa-3'
pTrc184bcdbdhAB 벡터를 제작하기 위하여, Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 33 및 34의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, bdhAB 유전자의 PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(bdhAB 유전자)을 BamHI 및 PstI로 절단한 다음, 동일 효소(BamHI 및 PstI)로 절단한 pTrc184bcd 절편에 삽입하여 bcd 유전자와 bdhAB 유전자를 동시에 함유하는 재조합 벡터 pTrc184bcdbdhAB (pTrc184BB)를 제작하였다.
[서열번호 33] bdhABf: 5'-acgcggatccgtagtttgcatgaaatttcg-3'
[서열번호 34] bdhABr: 5'-agtcctgcagctatcgagctctataatggctacgcccaaac-3'
pTrc184bcdbdhABcrt 벡터를 제작하기 위하여, Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 35 및 36의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, crt 유전자의 PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(crt 유전자)을 SacI 및 PstI로 절단한 다음, 동일 효소(SacI 및 PstI)로 절단한 pTrc184bcdbdhAB 절편에 삽입하여 bcd 유전자와 bdhAB 유전자 및 crt 유전자를 동시에 함유하는 재조합 벡터 pTrc184bcdbdhABcrt (pTrc184BBC)를 제작하였다 (FIG. 13).
[서열번호 35] crtf: 5'-actcgagctcaaaagccgagattagtacgg-3'
[서열번호 36] crtr: 5'-gcgtctgcagcctatctatttttgaagcct-3'
5-9: 부탄올 생성 미생물의 제작
상기 5-1에서 제작된 lacI 및 ldhA 유전자가 결실된 대장균 W3110 (WLL)에 상기 5-2 내지 5-7에서 제작된 pKKhbdadhEthiL (pKKHAT), pKKhbdadhEatoB (pKKHAA), pKKhbdydbMadhEphaA (pKKHYAP), pKKhbdadhEphaA (pKKHAP), pKKhbdbcdPA01adhEphaA (pKKHPAP) 및 pKKhbdbcdKT2440adhEphaA (pKKHKAP)로 구성된 군에서 선택된 벡터와 상기 5-8에서 제작된 pTrc184bcdbdhABcrt (pTrc184BBC) 벡터를 도입하여 부탄올 생성 재조합 변이 미생물 (WLL＋pKKHAT＋pTrc184BBC, WLL＋pKKHAA＋pTrc184BBC, WLL＋pKKHAP＋pTrc184BBC, WLL＋pKKHYAP＋pTrc184BBC, WLL＋pKKHPAP＋pTrc184BBC, 및 WLL＋pKKHKAP＋pTrc184BBC)을 제작하였다.
5-10: 부탄올 생성능 측정
상기 5-9에서 제작된 부탄올 생성 미생물들을 엠피실린(ampicillin) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100ml LB를 함유한 250mL 플라스크에 glucose (5g/L)를 첨가하고 질소가스를 채운 후 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후 상기 전배양액 2㎖을 접종하여, 37℃에서 10시간 배양하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g glucose, 2g KH2PO4, 15g (NH4)2SO4·7H2O, 20mg MnSO4·5H2O, 2g MgSO4·7H2O, 3g yeast extract, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO4·7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4·7H2O, 0.5g MnSO4·4H2O, 1g CuSO4·5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0.23g Na2B4O7·10H2O, 35％ HCl 10㎖ 함유)의 성분으로 구성된 배지 2.0 리터를 함유한 5.0 리터 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Korea)를 멸균 후 80℃ 이상에서부터 질소를 0.5vvm으로 10시간 공급하면서 실온까지 온도를 낮추었다. 상기 발효기에 상기 전배양액을 접종하여, 37℃, 200rpm에서 배양하였다. pH는 25％(v/v) NH4OH의 automatic feeding에 의해 6.8로 유지하였고, 배양 중에는 질소를 0.2vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하였다.
상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 부탄올 농도를 packed column (Supelco CarbopackTM B AW/6.6％ PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography (Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하였다.
그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, THL 효소를 코딩하는 유전자로 thiL를 도입한 경우 (WLL＋pKKHAT＋pTrc184BBC) 이외에 phaA를 도입한 경우 (WLL＋pKKHAP＋pTrc184BBC) 및 atoB를 도입한 경우 (WLL＋pKKHAA＋pTrc184BBC)에도 부탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 다른 미생물 유래의 THL을 코딩하는 유전자도 대장균 등의 숙주세포에서 발현되어 THL 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, Clostridium acetobutylicum 유래 bcd만을 도입한 경우 (WLL＋pKKHAP ＋pTrc184BBC)에 비해, Clostridium acetobutylicum 유래 bcd 유전자와 Bacillus subtilis의 ydhM 유전자를 추가로 도입한 경우 (WLL＋pKKHYAP＋pTrc184BBC)와 Pseudomonas aeruginosa 또는 Pseudomonas putida 유래의 bcd를 추가로 도입한 경우 (WLL＋pKKHPAP＋pTrc184BBC; WLL＋pKKHKAP＋pTrc184BBC)에 butyryl-CoA dehydrogenase 활성이 증가한다는 것을 증가된 부탄올 생성능으로 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 다른 미생물 유래의 BCD를 코딩하는 유전자도 대장균 등의 숙주세포에서 발현되어 butyryl-CoA dehydrogenase 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
표 5
실시예 6: 대장균 유래 유전자와 C. acetobutylicum 유래 유전자의 혼합 도입에 의한 부탄올 제조
본 실시예에서는 부탄올 생합성 경로에 관여하는 C. acetobutylicum 유래 유전자 중 일부를 대장균 유래 유전자로 대체한 경우의 부탄올 생성능을 확인하였다 (FIG. 14). 대장균 유래 mhpF 유전자가 acetaldehyde dehydrogenase를 코딩한다는 것은 이미 알려져 있다 (Ferrandez, A. et al., J. Bacteriol., 179:2573, 1997). 본 실시예에서는 Clostridium 속 유래 adhE를 대장균 유래 mhpF (acetaldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자)로 대체하고, Clostridium 속 유래 crt, hbd 및 thiL을 각각 대장균 유래 paaFG, paaH 및 atoB로 대체하여 부탄올 생성능을 확인하였다.
6-1: pKKmhpFpaaFGHatoB 벡터의 제작
E. coli W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 37 내지 42의 프라이머들을 이용한 PCR을 수행하여 부탄올 생합성 경로에 필수적인 유전자들, 즉 mhpF (acetaldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자), paaFG (enoyl-CoA hydratase를 코딩하는 유전자), paaH (3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 atoB (acetyl-CoA acetyltransferase를 코딩하는 유전자) 등을 순차적으로 pKK223-3 발현벡터(Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKmhpFpaaFGHatoB (pKKMPA) 벡터를 제작하였다 (FIG. 15).
[서열번호 37] mhpFf: 5'-atgcgaattcatgagtaagcgtaaagtcgc-3'
[서열번호 38] mhpFr: 5'-tatcctgcaggagctctctagagctagcttaccgttcatgccgcttct-3'
[서열번호 39] paaFGHf: 5'-atacgctagcatgaactggccgcaggttat-3'
[서열번호 40] paaFGHr: 5'-tatcgagctcgccaggccttatgactcata-3'
[서열번호 41] atoBf: 5'-atacgagctctgcatcactgccctgctctt-3'
[서열번호 42] atoBr: 5'-tgtcgagctccgctatcgggtgtttttatt-3'
6-2: 부탄올 생성 미생물의 제작
실시예 5-1에서 제작된 lacI 및 ldhA 유전자가 결실된 대장균 W3110 (WLL)에 상기 6-1에서 제작된 pKKMPA와 상기 5-8에서 제작된 pTrc184bcdbdhAB(pTrc184BB) 벡터를 도입하여 부탄올 생성 재조합 변이 미생물 (WLL＋pKKMPA＋pTrc184BB)를 제작하였다.
6-3 부탄올의 생성능 측정
상기 6-2에서 제작된 부탄올 생성 미생물들을 실시예 5-10과 동일한 방법으로 배양하고 동일한 조건에서 부탄올을 측정하였다.
그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, C. acetobutylicum의 부탄올 생합성 pathway만을 이용했을 때 보다, 해당 효소를 코딩한다고 예상되는 대장균 유래의 유전자들 (adhE mhpF, crt paaFG, hbd paaH, thiL atoB)과 C. acetobutylicum 유래의 bcd 및 bdhAB 유전자를 혼합하여 사용한 경우에 부탄올 생성능이 향상된 것을 알 수 있었다. 즉, 대장균에서 부탄올 생산을 위해 필수적인 효소들 중 4개(butyraldehyde dehydrogenase, crotonase, BHBD 및 THL)는 각각 대장균 유래의 mhpF, paaFG, paaH 및 atoB 유전자에 의해 코딩되는 효소들로 대체 가능하며, 오히려 Clostridium acetobutylicum의 그것보다 활성이 더 우수하다는 것을 부탄올 생성능으로 확인할 수 있었다.
표 6
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 다양한 방법으로 butyryl-CoA를 제조한 다음, 이를 중간체(intermediate)로 하여 부탄올을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록
전자파일 첨부하였음.
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<151> 2007-02-02
<160> 42
<170> KopatentIn 1.71
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Claims (37)
- butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소인 AdhE를 코딩하는 유전자를 가지고 있고, CoAT (acetyl-CoA:butyryl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균을 부티레이트 또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 혐기성 조건으로 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 재조합 대장균은 thiolase (THL)를 코딩하는 유전자 및 acetoacetate decarboxylase (AADC)를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 CoAT를 코딩하는 유전자는 ctfA 및 ctfB인 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
- 제4항에 있어서, 상기 ctfA 및 ctfB는 Clostridium 속 유래인 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 THL를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 thl 또는 thiL, Ralstonia 속 유래 phaA 또는 대장균 유래 atoB인 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법
- 제2항에 있어서, 상기 AADC를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 adc인 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- AtoDA를 코딩하는 유전자와 AdhE를 코딩하는 유전자를 함유하는 대장균을 부티레이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- AtoDA를 코딩하는 유전자, FadB 또는 PaaH를 코딩하는 유전자, PaaFG를 코딩하는 유전자 및 FadE를 코딩하는 유전자와 AdhE를 코딩하는 유전자를 함유하는 대장균을 부티레이트 또는 아세토아세테이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
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