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KR101796983B1 - 미생물에 의한 ｎ-부티르알데하이드의 생성 - Google Patents

미생물에 의한 ｎ-부티르알데하이드의 생성 Download PDF

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KR101796983B1
KR101796983B1 KR1020147015023A KR20147015023A KR101796983B1 KR 101796983 B1 KR101796983 B1 KR 101796983B1 KR 1020147015023 A KR1020147015023 A KR 1020147015023A KR 20147015023 A KR20147015023 A KR 20147015023A KR 101796983 B1 KR101796983 B1 KR 101796983B1
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butanol
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광 명 조
웬디 히가쉬드
크리시 리
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이젤 바이오테크날러지스, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 향상된 수율로 n-부티르알데하이드를 생성하는 미생물 및 방법을 제시하며, 여기서 미생물은 탄소 공급원의 n-부티르알데하이드로의 전환을 향상시키도록 조작된다. n-부티르알데하이드는 전환 공정 동안 발생하는 가스 스트립핑 공정 방식에 의해 회수되며, n-부티르알데하이드 단독의 발효후 회수보다 현저하게 더 높은 생성물 수율을 제공한다.

Description

미생물에 의한 Ｎ-부티르알데하이드의 생성 {MICROBIAL PRODUCTION OF N-BUTYRALDEHYDE}
본 출원은 2011년 11월 3일 출원된 본 출원인의 공동계류중인 미국 가출원 일련번호 61/555267에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명의 분야는 정제 화학물질의 생성 및 특히, 미생물에 의한 n-부티르알데하이드의 생성에 관한 것이다.
매년 1억 메트릭톤이 넘는 옥소-화학물질이 가소화제, 부동액 제품, 항공기 및 활주로 제빙 제품, 용매, 유압유, 페인트, 윤활제, 화장품, 정밀 화학물질 및 약제를 포함하는 광범위한 산업재 및 소비재의 합성에 소모된다. 현재, C3-C15 옥소-화학물질 생성을 위한 우세한 기법은 옥소-합성 또는 옥소-공정으로서 또한 공지된 하이드로포르밀화이다. 이러한 촉매 화학 공정은 고온 및 고압 조건하에서 포르밀 기와 수소 원자를 올레핀 (탄소-탄소 이중 결합을 갖는 하이드로카본)에 첨가하는 것을 포함한다. 프로필렌-유래된 C4 옥소-화학물질은 전세계 옥소-화학물질 소비의 거의 73%를 차지한다. C4 옥소-화학물질의 생성은 출발물질로서 프로필렌이 요구되나, 이는 이러한 공정을 지속가능하게 하지 못한다. 현 제작 공정에서 필요한 고온 및 고압 조건을 유지하기 위한 상당한 에너지 비용은 전체적인 에너지 효율을 제한하며, 따라서 친환경적으로 여겨지지 않는다.
따라서, 재생가능한 자원 예컨대, 당 및 셀룰로오스의 생물학적 전환을 이용하여 C4 옥소-화학물질을 생성하기 위한 신규한 방법이 개발되었으며, 또한, 더욱 최근에 이용되었다. 다른 이점 중에서, 바이오매스-유래된 기질은 자연적으로 CO2를 고정시켜 탄소 중성 옥소-화학물질 생성 공정을 유도한다는 것을 주목해야 한다.
옥소-화합물질을 생성하기 위한 또 다른 접근법은 관심 화학물질을 생성하기 위한 미생물의 대사 공학을 포함한다. 예를 들어, 다양한 클로스트리듐 (clostridium) 종 (유전적 변이 비함유)은 배양되어 1-부탄올을 생성할 수 있다. 그러나, 모든 또는 거의 모든 이러한 공지된 공정은 1-부탄올의 분리가 필요하며, 따라서 높은 회수 비용이 든다. 클로스트리듐의 선택된 균주를 대사 조작하여 다른 생성물에 비해 1-부탄올의 발현을 향상시켰으나, 클로스트리듐의 대사 경로를 조절하는데 이용가능한 유전자 도구의 결여는 이러한 방법의 발달을 방해하였다. 클로스트리듐의 대사 조작과 관련된 어려움을 우회하기 위해, 특히 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae)를 포함하는, 더욱 잘 인지되어 있으며 더욱 용이하게 변형되는 다양한 대안적인 미생물 종이 고려되었다.
클로스트리듐으로 인한 어려움에도 불구하고, 코우바 (Kouba) 등은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 출원 제 2012/0209021호에서 재조합 용매발생 박테리아 및 재조합 미생물을 사용하여 n-부티르알데하이드를 생성하는 방법을 교시하고 있다. 여기서, 코우바 등은 재조합 클로스트리듐을 포함한 2-단계 방법으로서 (1) 재조합 박테리아가 배양되고, (2) 생성된 n-부티르알데하이드가 발효 종료시 배양 배지로부터 분리되는 방법을 기술하고 있다. 이러한 접근법은 적어도 개념적으로 바람직하지만, 그럼에도 불구하고 여러 단점이 여전히 존재한다. 특히, 코우바 시스템에서는 n-부티르알데하이드의 수율이 비교적 낮다.
이와 같이, n-부티르알데하이드를 생성하는 다양한 시스템 및 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있지만, 이들 모두 또는 거의 모두는 하나 이상의 단점을 갖고 있다. 결론적으로, 여전히 미생물에 의해 n-부티르알데하이드를 생성하기 위한 개선된 시스템 및 방법을 제공할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명의 내용은 미생물이 n-부티르알데하이드를 생성하도록 유전적으로 조작된 미생물, 방법 및 시스템에 관한 것이다. 가장 바람직하게는, 이러한 생성은 다양한 사카라이드 및 특히, 글루코오스의 대사 전환으로부터의 아세틸-CoA의 개선된 몰 수율을 기반으로 한다. 그 후, 이렇게 생성된 아세틸-CoA는 일련의 (바람직하게는 재조합) 효소를 사용하여 농축되며, 후속하여 농축 생성물이 다단계에 걸쳐 n-부티르알데하이드로 환원된다. 하나 이상의 미생물의 알코올 데하이드로게나아제가 감소되거나 제거되어 n-부티르알데하이드의 추가의 분해를 방지하는 것이 여전히 추가로 바람직하다.
추가의 특히 바람직한 양태에서, 미생물은 배양되어 (a) 지금까지 공지되지 않았던 누적 수율의 n-부티르알데하이드, (b) 24 시간 또는 그 미만의 MCY50, (c) 1.0 g/L 또는 그 미만의 용해된 n-부티르알데하이드 농도 및/또는 (d) 적어도 24시간에 걸친 세포 밀도의 순수 증가를 달성하면서, 생성된 n-부티르알데하이드는 스파징 (sparging) 공정에 의해 제거된다.
특히 바람직한 일 양태에서, n-부티르알데하이드를 생성하는 방법은 미생물 (예를 들어, 바람직하게는, 에스체리치아 (및 특히, E. coli), 코리네박테리움 ( Corynebacterium ), 클로스트리듐, 자이모노마스 ( Zymonomas ), 살모넬라 (Salmonella), 로도코커스 ( Rhodococcus ), 슈도모나스 ( Pseudomonas ), 바실러스 (Bacillus), 락토바실러스 ( Lactobacillus ), 엔테로코커스 ( Enterococcus ), 알칼리제네스 ( Alcaligenes ), 클레시엘라 ( Klesiella ), 패니바실러스 ( Paenibacillus ), 아트로박터 ( Arthrobacter ), 브레비박테리움 ( Brevibacterium ), 피치아 ( Pichia ), 캔디다 ( Candida ), 한세눌라 ( Hansenula ), 사이네초코커스 ( Synechococcus ), 사이네초사이스티스 ( Synechocystis ), 아나배나 ( Anabaena ), 랄스토니아 ( Ralstonia ), 락토코커스 ( Lactococcus ) 또는 사카로마이 세스 ( Saccharomyces ) 속)을 탄소 공급원을 갖는 배양 배지중에서 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 미생물은, 하나 이상의 이종성 유전자의 발현 및 하나 이상의 천연 유전자의 결실에 의해 탄소 공급원의 n-부티르알데하이드로의 전환을 이렇게 허용하도록 조작된 것이다. 또 다른 단계에서, 생성된 n-부티르알데하이드는 가스 스트립핑 공정에 의해 배양 배지로부터 회수되어 1.5 g/L 이상의 n-부티르알데하이드의 누적 수율로 회수되며, 회수 단계는 배양 단계 동안 수행된다.
가장 바람직하게는, 이종성 유전자는 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나아제, 크로토닐-CoA 하이드라타아제, 부티릴-CoA 데하이드로게나아제, 트랜스-에노일-CoA 환원효소 및/또는 부탄알 데하이드로게나아제이거나, 미생물은 유전적으로 변형되어 인공 오페론을 발현하여 atoB , crt, hbd, 및 bldh의 발현을 허용한다. 또한, 미생물은 ldhA , adhE , frdBC, pta, 및/또는 yqhD의 저하된 또는 폐지된 발현을 갖도록 유전적으로 변형되는 것이 일반적으로 바람직하다.
본 발명의 내용으로 제한하려고 하는 것은 아니나, 가스 스트리핑 공정(gas stripping process)은 분당 1 이상의 베슬 부피 (vessel volume)의 스파징 속도로 스트립핑 가스로 스파징하는 것을 이용하며, 여기서 배양 시간은 24시간 또는 그 미만이다. 회수 단계는 40시간의 배양 시간째에 또는 그 전에 2.0g/L의 누적 수율로 수행되는 것이 여전히 추가로 바람직하다. 추가적으로, n-부티르알데하이드가 증기상의 n-부탄올로 환원될 수 있거나, n-부티르알데하이드가 스트립핑 가스로부터 응축되고 액체 상의 n-부탄올로 환원되는 것으로 여겨진다.
한 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 또한, n-부티르알데하이드를 생성하는 방법으로서, 탄소 공급원을 갖는 배양 배지에서 미생물을 배양하고, 여기서, 미생물은, 하나 이상의 이종성 유전자의 발현 및 하나 이상의 천연 유전자의 결실에 의해 탄소 공급원의 n-부티르알데하이드로의 전환을 이렇게 허용하도록 조작된 것인 방법을 고려한다. 또 다른 단계에서, 생성된 n-부티르알데하이드는 24시간 배양 시간 또는 그 전에 최대 누적 수율의 50% (MCY50)를 제공하기에 효과적인 조건하에서 스파징 단계를 포함하는 가스 스트립핑 공정에 의해 배양 배지로부터 회수되며, 회수 단계는 배양 단계 동안 수행된다. 가장 바람직하게는, 배양 단계는 적어도 18시간에 걸친 배치식 배양이며, MCY50는 20 시간 또는 그 전에 회수된다 (예를 들어, 여기서 MCY50는 1 g/L 이상이다).
또 다른 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 또한, n-부티르알데하이드를 생성하는 방법으로서, 탄소 공급원을 갖는 배양 배지에서 미생물을 배양하고, 여기서, 미생물은, 하나 이상의 이종성 유전자의 발현 및 하나 이상의 천연 유전자의 결실에 의해 탄소 공급원의 n-부티르알데하이드로의 전환을 이렇게 허용하도록 조작된 것인 방법을 고려한다. 추가의 단계에서, 생성된 n-부티르알데하이드는 용해된 n-부티르알데하이드를 생존 임계 농도 미만의 농도로 유지하는데 효과적인 스파징 속도에서 가스 스트립핑 공정 (예를 들어, 연속 스파징 이용)에 의해 배양 배지로부터 회수되며, 여기서 회수 단계는 배양 단계 동안 수행된다. 이전과 같이, (연속) 스파징은 분 당 1 베슬 부피 이상의 스파징 속도로 발생하고/거나 용해된 n-부티르알데하이드 농도는 1.0g/L 또는 그 미만으로 유지되는 것이 일반적으로 바람직하다.
따라서, 본 발명자들은 또한, 탄소 공급원을 사용하여 미생물을 배양하는 단계를 포함하여 n-부티르알데하이드를 생성하는 방법으로서, 여기서 미생물은, 하나 이상의 이종성 유전자의 발현 및 하나 이상의 천연 유전자의 결실에 의해 탄소 공급원의 n-부티르알데하이드로의 전환을 이렇게 허용하도록 조작된 것인 방법을 고려한다. 추가의 단계에서, 생성된 n-부티르알데하이드는 적어도 40 시간 까지 동안 세포 밀도의 순수 감소를 방지하는데 효과적인 스파징 속도에서의 가스 스트립핑 공정에 의해 배양 브로쓰로부터 회수되며, 여기서 회수 단계는 배양 단계 동안 수행된다. 가장 바람직하게는, 스파징 속도는 적어도 24시간에 걸쳐 세포 밀도의 순수 증가를 유도하는데 효과적이다.
본 발명의 내용의 다양한 목적, 특성, 양태 및 이점은 동일한 번호가 동일한 요소를 나타내는 첨부된 도면과 함께 바람직한 구체예의 하기 상세한 설명으로부터 더욱 자명해질 것이다.
도 1은 글루코오스의 n-부티르알데하이드로의 전환을 위한 예시적인 조작된 대사 경로의 개략적 대표도이다.
도 2A는 대사 조작된 E. coli 균주 EB10 대 숙주 세포 EB11에 의한 글루코오스로부터의 n-부티르알데하이드 생성 (g/L) 결과를 도시하는 예시적인 막대 그래프이다.
도 2b는 대사 조작된 E. coli 균주 EB11 대 숙주 세포 EB13에 의한 글루코오스로부터의 n-부티르알데하이드 생성 (g/L) 결과를 도시하는 예시적인 막대 그래프이다.
도 3a-3c는 발효기 (배양 배지에서의 n-부티르알데하이드의 농도) 대 시간 및 분당 0. 1 및 2 베슬 부피 (VVM)의 스파징 속도에서의 (스파징 가스중의) n-부티르알데하이드의 누적 수율 (g/L) 대 시간 (시)을 나타내는 성능 그래프이다.
도 4는 다양한 농도의 n-부티르알데하이드에서 마이크로리터당 콜로니 형성 유닛 대 시간 (시)으로서 나타낸, 본 발명의 내용의 구체예에 따른 n-부티르알데하이드 독성을 도해하는 그래프이다.
도 5는 0, 1 및 2 VVM의 스파징 속도에서 약 600 나노미터에서의 흡광도 대 시간 (시)으로서 나타낸 OD600 세포 밀도의 대표도이다.
본 발명자들은 이제, 조작된 미생물을 생성하거나 배양하여 발효 반응 동안 (바람직하게는, 불활성 가스)를 발효기에 스파징하면서 다양한 탄소 공급원으로부터 n-부티르알데하이드를 생성함으로써 향상된 수율의 n-부티르알데하이드가 수득될 수 있음을 발견하였다.
이러한 방식으로, 생성물은 축적이 허용되지 않으며, 후속하여 공정 말기에 수집되지도 않음이 인지되어야 한다. 대신, 발효 동안의 스파징이 이용되어 n-부티르알데하이드가 제거되고, 이는 뜻밖에도 생산율을 증가시키고, 조작된 미생물의 생존력 및/또는 생성 수명을 연장시키는 것으로 보인다. 결론적으로, 발효 배지에서의 생성물 축적 보다 현저하게 더 높은 누적 수율이 달성된다. 발효 동안의 스파징은 가변 속도 또는 일정 속도에서, 또는 이들의 임의의 적당한 조합에서 연속성 또는 불연속성일 수 있다.
일단 발효 배지로부터 분리되어 나오면, 용액에서의 포획, 용매로의 용해 또는 흡착, 또는 고체 흡착제상으로의 흡착을 포함하는 다양한 방법을 이용하여 n-부티르알데하이드가 회수될 수 있다. 그 후, 이렇게 회수된 생성물은 상품으로서 판매될 수 있거나, 산화, 환원 또는 응축을 통해 바람직한 생성물로 전환될 수 있다.
조작된 미생물은 다양한 박테리아, 시아노박테리아 및 진균류를 포함하는, n-부티르알데하이드를 생성하도록 변형되는 다양한 미생물로부터 제조될 수 있음이 추가로 인지되어야 한다. 바람직한 조작된 미생물은 또한, 시약으로서 n-부티르알데하이드를 사용하여 다운스트림 반응을 억제하도록 변형되어, n-부티르알데하이드 생성물의 수율을 추가로 향상시켰다. 적합한 탄소 공급원은 다양한 단백질, 탄수화물 및 지질 (모든 순수하거나 혼합물임), 및 이들의 임의의 합성 또는 인공 혼합물 (예를 들어, 세포 추출물, 바이오매스, 바이오솔리드 등)을 포함한다.
상기 관점에서 그리고, 본 발명의 내용의 바람직한 한 양태에서, 일반적으로, 재조합 미생물 및 특히, E. coli는 n-부티르알데하이드를 이렇게 생성가능하게 하는 유전자 그룹을 발현하는 것으로 여겨진다. 가장 전형적으로, 재조합 발현은 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현, 하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현, 크로토닐-CoA 하이드라타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현, 트랜스-에노일-CoA 환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 부탄알 데하이드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 포함한다. 도 1은 예시적인 조작된 대사 경로를 도해한다.
결론적으로, 조작된 미생물 세포가 n-부티르알데하이드를 생성하는데 필요한 천연 및 이종성 효소의 임의의 조합을 포함할 것임이 인지되어야 한다. 예를 들어, 세포는 천연 또는 이종성 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제 효소, 천연 또는 이종성 하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나아제, 천연 또는 이종성 크로토닐-CoA 하이드라타아제, 천연 또는 이종성 트랜스-에노일-CoA 환원효소 및/또는 천연 또는 이종성 부티르알데하이드 데하이드로게나아제를 포함할 수 있다. 더욱 특히, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제는 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환을 촉매작용할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 일부 구체예에서, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제는 E.C. 넘버가 2.3.1.9이다 . 예시적인 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제를 엔코딩하는 한 유전자는 에스체리치아 콜라이 atoB (GenBank Nos: NP_416728.1. NC_000913.2)이다. 마찬가지로, 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나아제는 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환을 촉매작용할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 일부 구체예에서, 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나아제는 E.C. 넘버가 1.1.1.157이다 . 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나아제는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 hbd (GenBank No: NP_349314.1. NC_003030.1)이다. 크로토닐-CoA 하이드라타아제는 3-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 전환을 촉매작용할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 일부 구체예에서, 크로토닐-CoA 하이드라타아제는 E.C. 넘버가 4.2.1.55이다. 예시적인 크로토닐-CoA 하이드라타아제는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 crt (GenBank Nos: NP_349318.1. NC_003030.1)이다. 트랜스-에노일-CoA 환원효소는 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 전환을 촉매작용할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 일부 구체예에서, 트랜스-에노일-CoA 환원효소는 E.C. 넘버가 1.3.1.38이다. 예시적인 트랜스-에노일-CoA 환원효소는 트레포네마 덴티콜라 ter (Treponema denticola ter) (GenBank Nos: NP_971211 NC_002967.9)이다. 부탄알 데하이드로게나아제는 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매작용할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 일부 구체예에서, 부탄알 데하이드로게나아제는 E.C. 넘버가 1.2.1.57이다. 예시적인 부탄알 데하이드로게나아제는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 NI -4 bldh ( Clostridum saccharoperbutylacetonicum NI -4 bldh )이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, n-부티르알데하이드의 생성에 직접적으로 관여하지 않는 유전자는 n-부티르알데하이드 생성/역가를 증가하도록 발현되어 평형 반응에서 유리한 균형을 이렇게 달성할 수 있음이 인지되어야 한다. 예를 들어, 세포는 천연 또는 이종성 포르메이트 데하이드로게나아제를 포함하여 n-부티르알데하이드로의 생성 경로에 대한 대사 원동력을 제공할 수 있다. CO2의 생성 및 후속 손실은 가역 반응을 방지한다. 포르메이트 데하이드로게나아제는 포르메이트의 CO2로의 전환을 촉매작용할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 일부 구체예에서, 포르메이트 데하이드로게나아제는 E.C. 넘버가 1.2.1.2이다 . 예시적인 포르메이트 데하이드로게나아제를 엔코딩하는 한 유전자는 캔디다 보이디니 fdh (Candida boidinii fdh) (GenBank Nos: AF004096, AJ245934, AJ011046, DQ458777)이다. 추가로 적합한 변형 및 세포주는 WO 2012/125688A2, EP2084287B1, US8188250B2, US20110281314A1, US20120064590A1, WO2012004460A2, WO2012045022A2, WO2012061653A2, WO2012061653A9, WO2012099934A2, WO2012109176A2, 및 WO2012125688A2에 기술되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로서 포함된다.
결론적으로, 고려된 세포에서 알코올 생성은 비변형된 상응하는 세포와 비교하여 현저하게 감소될 것임이 주지되어야 한다. 바람직하게는, 알코올 생성은 비변형된 대조군 세포에서 생성된 것과 비교하여 약 10 질량 또는 부피%, 20 질량 또는 부피%, 30 질량 또는 부피%, 40 질량 또는 부피%, 50 질량 또는 부피%, 60 질량 또는 부피%, 70 질량 또는 부피%, 80 질량 또는 부피%, 90 질량 또는 부피%, 95 질량 또는 부피% 또는 약 95 질량 또는 부피% 초과까지 감소된다. 더욱 바람직하게는, 알코올 생성은 약 99%까지 감소되며, 가장 바람직하게는, 고려된 재조합 숙주 세포는 알코올을 검출가능할 정도로 생성하지 않는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 알코올 데하이드로게나아제 유전자는 넉아웃되거나, 다르게는 이용불가능하게 된다. 더욱 바람직하게는, 모든 알코올 데하이드로게나아제 유전자는 넉아웃되거나, 다르게는 이용불가능하게 된다.
미생물 세포와 관련하여, 이러한 미생물이 재조합 변형되거나 n-부티르알데하이드를 생성할 수 있기만 하면 특정 유기체가 본 발명의 내용에 결정적인 것은 아님이 인지되어야 한다. 따라서, 적합한 유기체는 다양한 박테리아, 시아노박테리아 또는 진균류를 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서 미생물은 에스체리치 아, 바실러스 , 코리네박테리움 , 알칼리제누스 ( Alcaligenus ), 자이모모나스 (Zymomonas), 클로스트리듐, 락토바실러스 , 사이네초코커스 , 사이네초사이스티스 , 사카로마이세스, 피치아 , 캔디다, 한세눌라 및 아스퍼길루스 ( Aspergillus )로 구성된 군으로부터 선택된 속에 속할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 미생물은 에스체리아 콜라이 , 바실러스 서브틸리스 ( Bacillus subtilis), 사이네초코커스 엘롱가투스 ( Synechococcus elongatus ), 랄스토니아 유 트로파 ( Ralstonia eutropha ) 또는 사카로마이세스 세레비시애 ( Saccharomyces cerevisiae)이다.
재조합 미생물은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 변형은 특정 효소 경로의 활성을 증가시키거나 감소시키는데 필요한 것으로 여겨지는 하나 이상의 유전자의 삽입 또는 결실을 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일부 구체예에서, 돌연변이 미생물이 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있으며, 요망에 따라 추가로 변형된 재조합체일 수 있다. 이와 같이, 적합한 변형은 결핍 발현 패턴을 유도하는 임의 돌연변이유발, 하나 이상의 효소의 조절된 과다발현을 유도하기에 적합한 조절 요소를 지닌 염색체외 (전형적으로 플라스미드 또는 파아지미드) 핵산, 하나 이상의 효소의 조절된 과다발현을 유도하는데 적합한 조절 요소로의 유전체 삽입 등을 포함할 것이다.
따라서, n-부티르알데하이드의 실제 생성과 관련하여, 적합한 방법은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 미생물이 탄소 공급원을 사용하도록 허용하는 조건하에서 상기 미생물을 발효시켜 n-부티르알데하이드를 생성하는 것을 포함하는 것이 고려된다. 이렇게 생성된 n-부티르알데하이드는 동시에 회수되고 잘 공지된 가스 스트립핑 방법을 사용하여 정제되고 (예를 들어, 배양 배지를 통해 불활성 가스를 스파징함), 후속적으로 잘 공지된 방법 (예를 들어, 응축)을 이용하여 정제된다. 가장 전형적으로는, 미생물중에 생성된 n-부티르알데하이드의 농도 [그램/리터]는 미생물중에 생성된 알코올의 농도 [그램/리터] 보다 실질적으로 높다. 예를 들어, 알코올의 농도와 비교한 n-부티르알데하이드의 농도 비는 적어도 80:20이다. 더욱 바람직하게는, 비는 90:10, 95:5, 또는 99:1이다.
탄소 공급원은 선택된 미생물에 적당한 임의의 적합한 탄소 공급원 예컨대, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 전분, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 글리세롤, 이산화탄소, 단백질 및/또는 아미노산일 수 있다. 또한, 상기 및/또는 기타 적합한 탄소 공급원의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 당업자는 선택된 미생물 유기체의 유형을 기반으로 하여 적당한 탄소 공급원을 용이하게 선택할 수 있을 것이다. 그러나, 특히 바람직한 탄소 공급원은 탄소-중립인 공급원을 포함한다. 따라서, 그리고 다른 적합한 선택중에서, 탄소 공급원은 다양한 가수분해물 (헤미셀룰로오스성, 단백질성 등) 및 원당을 포함할 것이다.
실시예
하기 실시예는 ldhA , adhE , frdBC , 및 yqhD 유전자가 넉아웃되나, atoB -hbd-crt-ter-bldh-fdh 유전자는 함유하는 조작된 E. coli 균주에 의해 글루코오스로부터 n-부티르알데하이드의 생성을 입증하였다. n-부티르알데하이드 생성을 위해 이렇게 조작된 숙주 균주 즉, E. coli 균주 EB10은 ldhA , adhE , frdBC , 및 yqhD 유전자가 유전자 넉아웃되고, lacIq을 공급하도록 XL-1 블루로부터 F' 형질도입된 E. coli BW25113 (rrnBT14 Δ lacZWJ16 hsdR514 Δ araBADAH33 Δ rhaBADLD78) 유도체이다. 균주는 EB10에서 추가적인 pta 결실로 추가로 최적화되어 EB12를 유도하였다.
이와 같이, 균주는 하기와 같이 특징화될 수 있다: EB10: ldhA , adhE , frdBC, 및 yqhD에서 넉아웃된 BW25113. EB11: ldhA , adhE , frdBC, 및 yqhD (pEB73, pIM8, pCS138)에서 넉아웃된 BW25113. EB12: ldhA , adhE , frdBC , yqhD 및 pta에서 넉아웃된 BW25113. EB13: ldhA , adhE , frdBC , yqhD 및 pta (pEB73, pIM8, pCS138)에서 넉아웃된 BW25113.
이러한 특정 예에서, 3개의 플라스미드를 작제하고, n-부티르알데하이드 생성에 사용하였다. 첫 번째 플라스미드는 λPL 프로모터 및 lac 오퍼레이터 서열과 atoB-crt-hbd-bldh 유전자의 과다 발현을 위해 작제된 인공 오페론을 갖는다. 두 번째 플라스미드는 λPL 프로모터 및 lac 오퍼레이터 서열과 ter 유전자를 갖는다. 세 번째 플라스미드는 λPL 프로모터 및 lac 오퍼레이터 서열과 fdh 유전자를 갖는다. EB10 및 EB12 세포는 3개의 모든 플라스미드를 함유하도록 형질전환되어 각각 EB11 및 EB13을 형성하였다. 생성된 조작된 n-부티르알데하이드 생성 균주는 각각 E.coli EB11 및 EB13으로서 칭하였다. E. coli 균주 EB10 및 EB11을 필요에 따라, 암피실린 (100 ㎍/ml), 카나마이신 (50 ㎍/ml), 및 클로르암페니콜 (25 ㎍/ml)을 갖는 3ml의 LB 배지를 함유하는 시험 튜브에서 37℃하에 밤새 회전 진탕기 (250r.p.m.)상에서 예비배양하였다. 하룻밤 지난 배양물을 동일한 항생제를 갖는 5ml의 새로운 배지로 1:100 희석하였다. 새로운 배지는 2% 글루코오스가 보충된 테레픽 브로쓰 (TB) (물 1리터 당 4 ml 글리세롤, 12 g 트립톤, 24 g 효소 추출물, 2.31 g KH2PO4, 12.54 g K2HPO4)이다. 세포를 0.4 내지 0.6의 OD600로 성장시키고, 그 후 0.1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드 (IPTG)로 회전 진탕기 (250 r.p.m.)상에서 밤새 37℃에서 호기성하에 추가의 1 내지 2h 동안 유도하였다. 배양물을 시험 튜브로부터 10-ml BD Vacutainer 밀봉된 튜브로 옮겼다. 산소를 제거하고, N2 가스로 대체하였다. 회전 진탕기 (250 r.p.m.)상에서 밤새 37℃하에 24시간 동안 발효가 진행되게 하였다.
n-부티르알데하이드의 생물반응기 생성: n-부티르알데하이드의 생물반응기 생성을 위한 발효에 균주 EB12를 사용하였다. 하룻밤 지난 예비배양물을 적합한 항생제를 함유하는 LB에 접종하고, 250rpm의 회전 진탕기에서 37℃에서 성장하게 하였다. N-부티르알데하이드 발효를 2.0 리터의 작업 용적을 이용하여, 5-리터 교반-탱크 생물반응기 (Eppendorf, Hauppauge, NY, USA)에서 수행하였다. 생물반응기에 하룻밤 지난 예비배양물 23ml를 접종하고, 0.1mM IPTG를 접종시에 첨가하여 n-부티르알데하이드 생성 경로에 관련된 효소의 발현을 유도하였다. 호기성 스테이지 동안 용해된 산소 (DO)는 교반기 속도를 증가시킴으로써 (200 rpm으로부터 500 rpm으로) 공기 포화에 대해 20%로 유지시켰다. 세포를 광밀도가 약 OD600= 0.8에 도달할 때까지 배치식 모드에서 호기성 조건하에 30℃에서 성장시켰다. 그 후, 진탕을 350rpm으로 설정하고, 특정 vvm (분 당 액체 부피 당 가스 부피)의 질소를 하기 2가지의 목적으로 생물반응기를 통해 버블링시켰다: (i) 혐기성 조건으로 전환 및 (ii) n-부티르알데하이드의 제자리 가스 스트립핑 달성. 혐기성 전환시, 글루코오스 용액 (500g/리터)의 간헐적 선형 공급을 개시하여 10 내지 20g/L의 글루코오스 농도를 유지하였다. 증발된 n-부티르알데하이드를 Graham 응축기를 사용하여 응축한 후, 물 (4℃)로 채워진 일련의 3개 트랩을 통해 통과시켰다. 5M NaOH 용액의 자동화된 첨가에 의해 pH를 항상 6.8로 조절하였다. 특정 시점에서, 발효 샘플을 수집하여 세포 성장, n-부티르알데하이드 생성 및 글루코오스 농도를 측정하고, 트랩중의 물을 교체하였다. 분석된 균주에 의해 생성된 알코올 화합물을 GC-MS로 확인하였다. 시스템은 모델 6890N 네트워크 GC 시스템 (Agilent Technologies), 모델 7883B 주입기 및 오토샘플러 (Agilent Technologies) 및 모델 5973 네트워크 질량 선택성 검출기(Agilent Technologies)를 포함하였다. 운반 가스로서 헬륨 (1 ml/min-1)을 사용하면서 DB-5ms 모세관 칼럼 (30 m, 0.25-mm 내부 직경, 0.25-㎛ 막 두께; Agilent Technologies)을 사용하였다. 오븐 온도를 30 ℃/min-1으로 75℃ (2.6 min)로부터 200℃로 프로그램시켰다. 주입기 및 검출기를 250℃로 유지시켰다. 알코올 화합물을 용매 추출에 의해 분리하였다. 배양 브로쓰의 상청액 300 마이크로리터를 150㎕ GC 표준 등급 톨루엔 (Fluka)으로 원심분리한 후 추출하였다. 1 ㎕ 샘플을 30:1 분할 비율의 분할 주입식 모드로 주입하였다.
생성된 알코올 화합물을 불꽃이온화 검출기가 구비된 가스 크로마토그래피에 의해 정량화하였다. 시스템은 모델 7890A 가스 크로마토그래피 (Agilent Technologies) 및 모델 7693 오토샘플러 (Agilent Technologies)였다. 알코올 화합물의 분리는 A DB-FFAP 모세관 칼럼 (30m, 0.32-mm 내부 직경, 0.25-㎛ 막 두께; Agilent Technologies)에 의해 수행하였다. GC 오븐 온도는 처음에는 2분 동안 85℃에서 유지시키고, 235℃까지 45℃/min의 변화도로 증가시키고, 3분 동안 유지하였다. 헬륨을 운반 가스로서 14 p.s.i. 주입구 압력으로 사용하였다. 주입기 및 검출기는 225℃로 유지시켰다. 1㎕ 샘플을 25:1 분할 비로 주입하였다. 1-펜탄올을 내부 표준으로서 사용하였다. EB10과 생성 균주 EB11을 비교한 예시적 결과는 도 2a에 도시되어 있으며, 생성 균주 EB13 (생성 균주 EB11과 비교)에서 pta의 추가적 넉-아웃 변이 효과는 도 2b에 도시되어 있다. 쉽게 알 수 있는 바와 같이, n-부티르알데하이드 (227 mg/L)는 조작된 균주 EB11 균주를 함유하는 브로쓰로부터 생성될 수 있었으나, EB10을 단독으로 함유하는 브로쓰에서는 생성될 수 없었다. 게다가, pta (포스포트랜스아세틸라아제 또는 포스페이트 아세틸트랜스퍼라아제)의 결실에 의해 생성 수준이 예상치못하게 그리고 현저하게 증가됨을 쉽게 알 수 있다.
도 3a-3c는 EB13을 사용한 발효기에서 생성된 n-부티르알데하이드의 농도 대 배양 시간, 및 0, 1, 및 2 VVM의 스파징 속도에서 n-부티르알데하이드의 누적 수율 대 배양 시간을 나타낸다. 도 3a와 관련하여, 스파징이 발생하지 않는다 (0 VVM). n-부티르알데하이드의 농도는 약 20시간 후 발효기에서 약 0.20-0.25 g/L의 최대치에 도달하고, 그 후 약 40시간까지 0에 도달할 때까지 감소한다. 도 3b-3c에서, 스파징 속도는 각각 1 및 2 VVM이며, 발효기에 존재하는 n-부티르알데하이드의 최대 농도는 20시간 또는 그 전에 비스파징된 것과 거의 유사하게 되며 즉, 약 0.20-0.25 g/L이다. 실시예에 기술되고 도 2에 도시된 결과는 이러한 관찰과 일치한다: 0.227 g/L의 n-부티르알데하이드가 24시간 배양 시간 후 회수되었다.
그러나, 다시 도 3b-3c와 관련하여, n-부티르알데하이드의 누적 수율은 발효 동안 스파징에 의해 현저하게 증가된다. 1 VVM의 스파징 속도에서, 예를 들어, 총 누적 수율은 비스파징된 것의 명백한 최대 농도 보다 높았다. 본 실시예에서, 생성물은 약 90시간에 걸쳐 스파징으로 수집되며, 총 수율은 약 1.9 g/L이다. 2 VVM의 스파징 속도에서, 생성물은 동일한 양의 시간에 걸쳐 수집되나, 최대 누적 수율 (MCY)는 약 2.25 g/L이다.
발효 매질에서 0.20-0.25 g/L의 이러한 자명한 최대 농도는 다소 놀랍다. 물중의 n-부티르알데하이드의 용해도는 약 70 g/L이며, 따라서, 발효기내의 최대 n-부티르알데하이드가 실질적으로 더 높은 최대치로 선형으로 증가할 것임이 합리적으로 예측될 수 있다. 또한, 놀랍게도, 불활성 가스가 배양 배지를 통해 스파징되는 경우, 상당량의 n-부티르알데하이드가 이의 높은 용해도에도 불구하고 분리되어 나온다. 따라서, 바람직한 질량 고수율이 적합하게 스파징함으로써 달성될 수 있다. 특히 도 3c와 관련하여, 최대 누적 수율의 반 (MCY50)이 약 20시간에서 달성되며, 이는 발효기에서 n-부티르알데하이드의 최대 농도에 도달하는 시간과 거의 동일한 시간임이 인지되어야 한다. 이와 같이, 2 VVM의 동시 스파징은 동일한 양의 시간내의 생성물의 약 5배, 및 약 다음 70시간에 걸쳐 수집된 생성물의 추가의 5배를 유도한다.
도 4로 돌아와서, 조작된 E. coli 1μL 당 콜로니 형성 유닛의 수는, 다양한 농도의 n-부티르알데하이드 (NBAL)를 n-부티르알데하이드 증발을 방지하기 위해 밀봉된 튜브에 첨가한 후 (인큐베이션 시험) 시간의 함수로서 나타낸다. 첨가가 이루어지지 않은 경우를 포함한 모든 경우에서, 콜로니 형성 유닛의 수는 약 24시간 후 최소 값 (예를 들어, 세포는 더 이상 생존할 수 없음)으로 가는 경향이 있다. 1.0 g/L의 농도에 있어서, 그래프는 5시간 후 콜로니 형성 유닛의 순수 증가를 조금 나타내며, 1.2 g/L 및 그 초과의 농도에서는 심지어 4.5 시간에서도 순수 감소를 나타낸다. 이러한 데이타는 세포에 대한 최대 생존 시간 및 n-부티르알데하이드의 최대 생성이 있는 n-부티르알데하이드의 생존 임계 농도가 존재함을 시사한다. 본 발명에 따른 동시 스파징 방법을 사용하여 달성된 n-부티르알데하이드의 향상된 수율은 생존 분석과 일관된 것으로 보인다.
도 5는 0, 1, 및 2 VVM 스파징 속도에서 600nm에서의 흡광도로서 나타낸 OD600 세포 밀도 대 시간 (시)의 대표도이다. 각각의 경우, 데이타는 15시간에서의 세포 밀도의 증가를 나타낸다. 그러나, 24시간에서, 0 VVM에서의 샘플 스파징은 세포 밀도의 분명한 감소를 나타내는 반면, 1 및 2 VVM에서의 샘플은 세포 밀도의 증가를 계속 나타낸다. 약 40시간에서, 1 및 2 VVM에서의 샘플은 순수 증가를 계속해서 나타내며, 89시간 후, 1 VVM에서의 샘플은 순수 감소를 나타내나, 2 VVM에서의 샘플은 순수 증가를 계속 나타낸다.
세포 밀도 데이타는 생존력 분석 및 수율 데이타와 일관되는 것으로 보인다. 특히, 24시간에서의 MCY50는 n-부티르알데하이드를 최대 속도로 활성적으로 생성하는 생존 세포와 일관되는 것으로 보인다. 24시간 후, n-부티르알데하이드 생성은 최대 수율에 도달할 때까지 감소된 속도로 계속된다.
분명하게는, n-부티르알데하이드의 생성 동안 스파징은 n-부티르알데하이드의 현저하게 증가된 수율을 제공한다. 임의의 특정 방법 또는 메카니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 본 발명자들은 n-부티르알데하이드 생성물이 최소 수율 초과로의 이의 계속되는 생성을 억제하는 것으로 추정하였다. 비-스파징된 시스템에서 n-부티르알데하이드의 최대 농도와 대략적으로 동일한 이러한 최소 수율은 n-부티르알데하이드의 용해도를 고려할 경우 예상되는 것보다 현저하게 더 낮았다.
따라서, n-부티르알데하이드 생성 억제의 회피와 관련하여, 다양한 접근법이 고려된다. 데이타는 MCY가 증가된 스파징 속도에 따라 증가함을 나타내는 것으로 보이기 때문에, 2 VVM 보다 높은 스파징 속도가 MCY의 더 높은 증가를 유도할 것으로 합리적으로 결론지을 것이다. 따라서, 2.0 VVM 이상, 더욱 전형적으로는, 2.5 VVM 이상 및 가장 전형적으로는, 3.0 VVM 이상의 스파징 속도가 적합한 것으로 여겨진다.
또 다른 접근법은, n-부티르알데하이드 생성물이 생성될 때 액체 상에서 용해되는 경우, 스파징이 발생할 때, 생성물이 분리되어 나올 수 있는 가스-액체 계면을 확인하는 것이다. 이러한 계면의 가스-액체 표면적비가 증가하는 경우, 분리되어 나온 생성물의 양이 증가할 것으로 예측될 수 있다. 스파징 속도의 증가 (및/또는 다양한 스파저 (sparger) 형상)은 더 작은 버블을 제공할 것이며, 이는 가스-액체 표면적비를 증가시킬 것이다. 유사하게는, 임펠러 속도를 증가시키면 가스 버블을 쪼개어 또한, 증가된 가스-액체 표면적비를 유도할 것이다. 이러한 방법의 임의의 조합은 생성물의 양, 이의 생성 속도 또는 이 둘 모두의 증가를 유도할 것이다.
스파징 공정의 단순한 변형 이외에, 데이타는 n-부티르알데하이드의 MCY를 증가시키기 위한 다른 잠재적인 해결책을 제시한다. 미생물 예컨대, 변형된 E.coli에 있어서, 온도의 변화는 생성 속도에 영향을 끼칠 수 있다. 발효기 온도를 저하시키면, 비록 더 낮은 속도지만 아마도 더 많은 재조합 유전자 생성물을 유도할 것이다. 아마도, 최대 수율을 달성하기 위해 주어진 발효기 온도와 관련된 최적의 스파징 속도가 존재한다. 반대로, 온도는 n-부티르알데하이드의 비등점 또는 이에 근접한 수준으로 증가될 수 있으며, 이러한 조건하에서 성장할 대사적으로 조작된 미생물이 선택될 수 있다. 이는 증류 반응에 더욱 가까울 것이며, 여기서 n-부티르알데하이드는 증기상에서 또는 증기상에 근접하게 생성될 것이며, 용액으로부터 분리될 것이다. 이는 또한, 발효기에서 생성물의 저농도를 유지하게 도울 수 있으며, 상기 언급된 잠재적인 독성 효과를 감소시킨다. 시스템의 온도에 따라, 적합한 속도의 스파징 또한 생성물의 제거를 도울 수 있다.
시스템 압력은 적합한 스파징 프로토콜에 따라 변화될 수 있다. 예를 들어, 용기내의 압력이 감소할 수 있으며, 이는 n-부티르알데하이드의 방출을 향상시킨다. 스파징 가스의 압력은 마찬가지로 저하될 수 있거나, 간헐적 스파징 공정이 이용되거나, 최적의 MCY를 제공하기 위해 이들 방법의 조합이 이용될 수 있다.
이러한 예들은 배치식 발효 방법을 이용하였다. 또한, 연속 발효 방법을 대신 이용하는 것을 생각할 수 있으며, 여기서 반응기에 스파징하면서, 소비된 배지가 발효기로부터 추출되는 속도와 동일한 속도로 신선한 액체 (배양 배지)가 반응기내로 유입된다. 이러한 예에서, 소비된 배지는 생성물 및 미생물 세포 둘 모두를 함유한다. 그 후, 생성물은 발효기 자체로부터 수집되며, 소비된 배지는 다시 스파징되어 임의의 잔여량의 생성물을 수득할 수 있다. 결론적으로, 생성물 농도는 생존 임계 농도 미만으로 배지중에 유지될 수 있다.
발효기 디자인 자체는 상이한 방식으로 생성물을 수집하는데 제공되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 박막 발효기 또는 중공 섬유 발효기가 사용될 수 있으며, 이는 배지중에 생성물을 제공하며, 그 후 스파징되어 생성물을 제거할 수 있다. 대안적으로, 조작된 미생물은 겔 또는 알기네이트-형 배지중에 고정화될 수 있으며 (예를 들어, WO2012/004460 참조), 배양 배지는 미생물을 함유하는 배지를 가로질러 또는 관통하여 연속적으로 통과하고, 그 직후 스파징 가스에 노출될 수 있다. 이는, 생성물이 미생물과 배양 배지를 지나 계속하여 흘러 사실상 즉시 분리되어 나올 것이기 때문에, 조작된 미생물의 증가된 농도의 생성물로의 노출을 최소화시킬 것이다. 대안적으로, 생성물을 함유하는 액체상이 발효 진행으로서 스파징 공정으로 처리되는 또 다른 컨테이너로 공급될 수 있다.
게다가, 배양 배지 자체는 n-부티르알데하이드를 흡착하는 요소 예컨대, 분자체 또는 n-부티르알데하이드를 우선적으로 용해시키는 수혼화성 분할 유체로 증가될 수 있음이 고려된다. 이는 배양 배지로부터 n-부티르알데하이드의 제거가 이의 MCY를 증가시킬 것이라는 개념에 따라, 미생물로부터의 n-부티르알데하이드 제거에 효과적일 것이다.
본원에서 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 이미 기술된 것들 이외에, 더 많은 변형이 가능하다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 내용은 첨부된 청구범위의 사상을 제외하고는 제한되지 않는다. 게다가, 명세서 및 청구범위 둘 모두를 이해하는데 있어서, 모든 용어는 문맥에 상통한 가장 넓은 가능한 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 비제한적 방식으로 요소, 성분 또는 단계를 나타내는 것으로 해석되어야 하며, 이는 언급된 요소, 성분 또는 단계가 존재할 수 있거나, 이용될 수 있거나, 명백히 언급되지 않은 다른 요소, 성분 또는 단계와 조합될 수 있음을 나타낸다. 명세서 청구범위가 A, B, C ... 및 N으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 무언가를 나타내는 경우, 이러한 글은 A 플러스 N, 또는 B 플러스 N 등이 아니라, 군으로부터의 단지 하나의 요소를 요구하는 것으로서 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. n-부티르알데하이드를 생성하는 방법으로서,
    (a) 탄소 공급원을 갖는 배양 배지중에서 미생물을 배양하는 단계로서, 상기 미생물은, 조작된 세포에서 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환, 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환, 3-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 전환, 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 전환 및 부티릴-CoA의 n-부티르알데하이드로의 전환이 가능하도록 하나 이상의 이종성 유전자가 발현되도록 조작되고, 부탄올 데하이드로게나아제 유전자 및 하나 이상의 다른 천연 알코올 데하이드로게나아제 유전자의 결실에 의해 더 조작되어 상기 탄소 공급원의 n-부티르알데하이드로의 증가된 전환을 허용하도록 조작된 것인 단계;
    (b) 상기 배양 배지로부터 생성된 n-부티르알데하이드를 1.0g/L 또는 그 미만으로 용해된 n-부티르알데하이드 농도를 유지하는 가스 스트립핑 공정에 의해 적어도 1.5 g/L의 n-부티르알데하이드의 누적 수율을 달성하도록 회수하는 단계; 및
    (c) 증기상에서 n-부티르알데하이드를 n-부탄올로 환원시키는 단계; 또는
    (d) n-부티르알데하이드를 응축시키고 액체상에서 n-부티르알데하이드를 n-부탄올로 환원시키는 단계를 포함하며,
    상기 회수 단계는 미생물이 n-부티르알데하이드를 생성하는 동안 세포 밀도가 증가하는 상기 배양 단계 동안 수행되는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나아제, 크로토닐-CoA 하이드라타아제, 부티릴-CoA 데하이드로게나아제, 트랜스-에노일-CoA 환원효소, 및 부탄알 데하이드로게나아제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 미생물이 E. coli 이고, atoB, crt, hbd, 및 bldh의 발현을 허용하는 인공 오페론을 발현하도록 유전적으로 변형되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 미생물이 E. coli 이고, ldhA, adhE, frdBC, pta, 및 yqhD로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 폐지시키도록 유전적으로 변형되는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 가스 스트리핑 공정이 분당 1 이상의 베슬 부피(vessel volume)의 스파징 속도 (sparging rate)로 스트립핑 가스 (stripping gas)를 스파징하는 것을 포함하며, 배양 시간은 24시간 또는 그 미만인 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 회수 단계가 40시간의 배양 시간째에 또는 그 전에 2.0g/L의 누적 수율로 수행되는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 미생물이 에스체리치아 ( Escherichia ), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 클로스트리듐 ( Clostridium ), 자이모노마스 ( Zymonomas ), 살모 넬라 ( Salmonella ), 로도코커스 ( Rhodococcus ), 슈도모나스 ( Pseudomonas ), 바실러스 (Bacillus), 락토바실러스 ( Lactobacillus ), 엔테로코커스 ( Enterococcus ), 알칼리제네스 ( Alcaligenes ), 클레시엘라 ( Klesiella ), 패니바실러스 ( Paenibacillus ), 아트로박터 ( Arthrobacter ), 브레비박테리움 ( Brevibacterium ), 피치아 ( Pichia ), 캔디다 ( Candida ), 한세눌라 ( Hansenula ), 사이네초코커스 (Synechococcus), 사이네초사이스티스 ( Synechocystis ), 아나배나 ( Anabaena ), 랄스토니아 ( Ralstonia ), 락토코커스 ( Lactococcus ) 및 사카로마이세스 ( Saccharomyces )으로 구성된 군으로부터 선택된 속에 속하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 미생물이 E. coli인 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 증기상에서 n-부티르알데하이드가 n-부탄올로 환원되는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, n-부티르알데하이드가 응축되고, 액체상에서 n-부탄올로 환원되는 방법.
  11. n-부티르알데하이드를 생성하는 방법으로서,
    (a) 탄소 공급원을 갖는 배양 배지중에 미생물을 배양하는 단계로서, 상기 미생물은, 조작된 세포에서 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환, 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환, 3-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 전환, 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 전환 및 부티릴-CoA의 n-부티르알데하이드로의 전환이 가능하도록 하나 이상의 이종성 유전자를 발현하도록 조작되고 부탄올 데하이드로게나아제 유전자 및 하나 이상의 다른 천연 알코올 데하이드로게나아제 유전자의 결실에 의해 더 조작되어 상기 탄소 공급원의 n-부티르알데하이드로의 증가된 전환을 허용하도록 조작된 것인 단계; 및
    (b) 용해된 n-부티르알데하이드 농도가 1.0 g/L 또는 그 미만으로 유지되고, 24시간째 또는 그 전의 배양 시간에서 최대 누적 수율의 50% (MCY50)를 제공하기에 효과적인 조건하에서 스파징 단계를 포함하는 가스 스트립핑 공정에 의해 상기 배양 배지로부터 생성된 n-부티르알데하이드를 회수하는 단계; 및
    (c) 증기상에서 n-부티르알데하이드를 n-부탄올로 환원시키는 단계; 또는
    (d) n-부티르알데하이드를 응축시키고 액체상에서 n-부티르알데하이드를 n-부탄올로 환원시키는 단계를 포함하며,
    상기 회수 단계가 미생물이 n-부티르알데하이드를 생성하는 동안 세포 밀도가 증가하는 상기 배양 단계 동안 수행되는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 배양 단계가 적어도 18시간에 걸친 배치 배양으로 배양하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, MCY50이 20시간 또는 그 전에 회수되는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, MCY50이 1g/L 이상인 방법.
  15. n-부티르알데하이드를 생성하는 방법으로서,
    (a) 탄소 공급원을 갖는 배양 배지중에 미생물을 배양하는 단계로서, 상기 미생물은, 조작된 세포에서 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환, 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환, 3-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 전환, 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 전환 및 부티릴-CoA의 n-부티르알데하이드로의 전환이 가능하도록 하나 이상의 이종성 유전자를 발현하도록 조작되고, 부탄올 데하이드로게나아제 유전자 및 하나 이상의 다른 천연 알코올 데하이드로게나아제 유전자의 결실에 의해 더 조작되어 탄소 공급원의 n-부티르알데하이드로의 증가된 전환을 허용하도록 조작된 것인 단계;
    (b) 1.0 g/L 또는 미만의 농도로 용해된 n-부티르알데하이드를 유지하기에 효과적인 스파징 속도에서 가스 스트립핑 공정에 의해 배양 배지로부터 생성된 n-부티르알데하이드를 회수하는 단계; 및
    (c) 증기상에서 n-부티르알데하이드를 n-부탄올로 환원시키는 단계; 또는
    (d) n-부티르알데하이드를 응축시키고 액체상에서 n-부티르알데하이드를 n-부탄올로 환원시키는 단계를 포함하며,
    상기 회수 단계는 미생물이 n-부티르알데하이드를 생성하는 동안 세포 밀도가 증가하는 상기 배양 단계 동안 수행되는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 가스 스트립핑 공정이 연속 스파징을 이용하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 연속 스파징이 분당 1 이상의 베슬 부피의 스파징 속도에서 이루어지는 방법.
  18. 삭제
  19. n-부티르알데하이드를 생성하는 방법으로서,
    (a) 탄소 공급원으로 미생물을 배양하는 단계로서, 상기 미생물은 조작된 세포에서 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환, 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환, 3-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 전환, 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 전환 및 부티릴-CoA의 n-부티르알데하이드로의 전환이 가능하도록 하나 이상의 이종성 유전자를 발현하도록 조작되고 부탄올 데하이드로게나아제 유전자 및 하나 이상의 다른 천연 알코올 데하이드로게나아제 유전자의 결실에 의해 탄소 공급원의 n-부티르알데하이드로의 증가된 전환을 허용하도록 조작되는 단계, 및
    (b) 용해된 n-부티르알데하이드 농도가 1.0 g/L 또는 그 미만으로 유지되어 적어도 40시간 이하의 시간 동안 세포 밀도의 순수 감소를 방지하는 가스 스트립핑 공정에 의해 배양 브로쓰로부터 생성된 n-부티르알데하이드를 회수하는 단계; 및
    (c) 증기상에서 n-부티르알데하이드를 n-부탄올로 환원시키는 단계; 또는
    (d) n-부티르알데하이드를 응축시키고 액체상에서 n-부티르알데하이드를 n-부탄올로 환원시키는 단계를 포함하며,
    상기 회수 단계는 미생물이 n-부티르알데하이드를 생성하는 동안 세포 밀도가 증가하는 상기 배양 단계 동안 수행되는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 가스 스트립핑 공정은 적어도 24시간에 걸쳐 세포 밀도의 순수 증가를 유도하는데 효과적인 방법.
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