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CN103917245A - 用于制备糖-蛋白质糖缀合物的方法 - Google Patents

用于制备糖-蛋白质糖缀合物的方法 Download PDF

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CN103917245A CN201280054487.0A CN201280054487A CN103917245A CN 103917245 A CN103917245 A CN 103917245A CN 201280054487 A CN201280054487 A CN 201280054487A CN 103917245 A CN103917245 A CN 103917245A
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Abstract

本发明提供了用于还原胺化多糖的还原端处的羰基的方法，其中所述还原胺化在pH4至5之间进行。本发明还提供了用于制备多糖和载体分子的缀合物的方法，其包括步骤：(a)使多糖与连接体偶联，以形成多糖-连接体化合物，其中连接体的游离端是酯基；和(b)使酯基与载体分子中的伯氨基反应，以形成多糖-连接体-载体分子缀合物，其中所述连接体通过酰胺键与载体分子偶联。本发明还提供了减少未反应的连接体污染多糖-连接体化合物的方法，其包括在小于pH5的含水条件下沉淀未反应的连接体的步骤。本发明还提供了通过这些方法获得的或者可获得的多糖-连接体-载体分子缀合物和中间化合物。

Description

用于制备糖-蛋白质糖缀合物的方法
技术领域
本发明涉及缀合的糖领域，特别是来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域，以及用于形成复合糖的载体。可将复合糖用于免疫接种。
发明背景
已经将来自细菌的糖用于疫苗多年。然后，由于糖是非T细胞依赖性抗原，所以它们免疫原性差。与载体缀合可以将非T细胞依赖性抗原转变成T细胞依赖性抗原，从而增强记忆应答，并允许产生保护性免疫。因此，最有效的糖疫苗是基于复合糖的，并且原型结合疫苗(prototype conjugatevaccine)是针对流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)b型(‘Hib’)的[例如参见参考文献64的第14章]。
革兰氏阴性菌由含脂多糖的外膜围绕。脂多糖是作为内毒素并在哺乳动物中诱发强免疫应答的一组分子。每一脂多糖包含三个部分：O-抗原(也称为O-特异多糖或O-多糖)、核心结构域和脂质A结构域。针对来自特定革兰氏阴性菌的O-抗原的抗体可以赋予针对该细菌感染的保护。因此，已经设想了含有与载体蛋白缀合的O-抗原的疫苗。例如，基于O-抗原的结合疫苗已经建议用于多种沙门氏菌(Salmonellae)(例如，参考文献1和2中的肠沙门氏菌(Salmonella enterica)中的血清型鼠伤寒杆菌(Salmonella Typhimurium)和甲型副伤寒沙门氏菌(SalmonellaParatyphi A))；志贺氏杆菌属(Shigella)[参考文献3、4、5、6、7、8和9]；以及大肠杆菌(Escherichia coli)[参考文献10和11]。在这些疫苗中，O-抗原与来自全长脂多糖的核心结构域连接(即缀合的多糖是没有其脂质A结构域的脂多糖)。多糖通过其核心结构域与载体缀合。该核心结构域自身可以诱导保护性抗体，因此设想结合疫苗含有不与O-抗原连接的核心结构域[参考文献12]。
已知将含核心结构域的多糖与载体蛋白缀合的多种方法。一些方法涉及通过连接体缀合之前，多糖链的随机活化(例如使用溴化氰(CNBr)或1-氰-4-二甲基氨吡啶四氟硼酸酯(CDAP))(参见例如，参考文献1和2)。其他方法是更有选择性的，涉及该链的特异性残基(例如核心结构域的2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)端)。例如，参考文献13的方法涉及KDO端中的羰基与己二酸二酰肼(ADH)连接体之间的还原胺化。涉及还原胺化的反应通常非常慢，例如参考文献13中需要7天的步骤。另一选择性方法描述于参考文献9中，这次涉及通过KDO中的羧基，使用1-乙基-3–(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDAC)和ADH的偶联。在这些非选择性和选择性方法中，通常使用EDAC进行与载体的后续反应，EDAC活化蛋白质中的用于与连接体反应的羧基。该EDAC活化可以引起KDO亚基中羧基的活化，导致不想要的副反应。EDAC活化还可以引起载体蛋白的交联，因为蛋白质中活化的羧基可以与蛋白质中的而非连接体中的伯胺基反应。
因此，仍存在制备缀合物，特别是来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域的其他以及更好的方法的需求。
发明公开
本发明基于缀合方法，其可以用于取代现有技术的缀合方法。这些方法可以比现有技术方法，特别是涉及还原胺化的那些方法更快地施行。该方法还不需要使用EDAC，这避免了不想要的副反应。在研发这些方法期间，发明人发现了不需要使用毒性化合物来纯化中间化合物的方法。因此，本方法可以更安全地实施。与现有技术的缀合物相比，得到的缀合物具有不同的，优选地改进的免疫学特性。
因此，本发明提供了用于将多糖与载体蛋白缀合的备选或改进方法，以及通过这些方法获得或者可获得的缀合物。本发明还提供了用于本发明方法的中间化合物，以及用于制备这些中间化合物的方法。
本发明的第一方面
在第一个方面，本发明提供了用于制备多糖和载体分子的缀合物的方法，其包括以下步骤：(a)使多糖与连接体偶联，以形成多糖-连接体中间产物，其中连接体的游离端是酯基；和(b)使酯基与载体分子中的伯胺基反应，以形成多糖-连接体-载体分子缀合物，其中连接体通过酰胺键与载体分子偶联。不同于参考文献1、2和13中所使用的缀合方法，本发明不需要使用EDAC活化载体分子，从而避免了不想要的副反应。本发明还提供了该方法的各个步骤(a)和(b)；通过该方法获得的或者可获得的缀合物；以及通过该方法的步骤(a)获得的或者可获得的多糖-连接体中间产物。
本发明第一方面的步骤(a)
在本发明第一方面的步骤(a)中，将多糖与连接体偶联，以形成多糖-连接体中间产物，其中连接体的游离端是酯基。因此，连接体是这样的连接体，其中至少一个末端是酯基。如下所述，连接体的其他末端是选择性的，以使其可以与多糖反应以形成多糖-连接体中间产物。
在本发明的一些实施方案中，直接发生步骤(a)中的偶联。在这些实施方案中，通常使用多糖中的伯胺基将多糖与连接体偶联。在这些实施方案中，连接体通常在两个末端均具有酯基。这允许酯基中的一个通过亲核酰基取代与多糖中的伯胺基反应来发生偶联。该反应产生了多糖-连接体中间产物，其中多糖通过酰胺键与连接体偶联。因此在这些实施方案中，连接体是双功能连接体，其提供用于与多糖中伯胺基反应的第一酯基以及用于与载体分子中伯胺基反应的第二酯基。例如，可以使用通式X1-L-X2的双功能连接体，其中X1是可以与多糖中的伯胺基反应的酯基；X2是可以与载体分子中的伯胺基反应的酯基；并且L是连接体中的连接部分。一般的L基团是具有1-10个碳原子的直链烷基(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)，特别地-(CH2)4-。通式X-L-X的同型双功能连接体是特别合适的，其中两个X基团是一模一样的，并且能与两个伯胺基反应；并且其中L是连接体中的连接部分。一般的X基团是N-氧丁二酰亚胺。L通常具有通式-L'-L2-L'-，其中L'是羰基。一般的L2基团是具有1-10个碳原子的直链烷基(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)，特别地-(CH2)4-。因此，一般的连接体是己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯(adipic acid N hydroxysuccinimide diester)(SIDEA)，并且发明人发现该化合物特别适合作为本发明的连接体：
在本发明的备选实施方案中，在与连接体偶联之前，间接地进行步骤(a)中的偶联，即使用用于衍生多糖的其他连接体进行步骤(a)中的偶联。
在涉及间接偶联的第一组实施方案中，使用多糖的还原端处的羰基，将多糖与其他连接体偶联。这种偶联包括两步：(a1)使羰基与其他连接体反应；和(a2)使其他连接体的游离端与连接体反应。在这些实施方案中，其他连接体通常在两个末端均具有伯氨基，从而允许通过还原胺化，使伯氨基中的一个与多糖中的羰基反应来进行步骤(a1)。使用伯氨基与多糖中的羰基反应。发明人发现，酰肼(特别地-C(＝O)NHNH2)或者羟氨基(-ONH2)是合适的。相同的伯氨基通常存在于其他连接体的两个末端。优选地，根据下文详述的本发明第二方面的方法进行还原胺化。反应产生了多糖-其他连接体中间产物，其中多糖通过C-N键与其他连接体偶联。
在涉及间接偶联的第二组实施方案中，使用多糖中的不同基团，特别地羧基，将多糖与其他连接体偶联。这种偶联包括两步：(a1)使基团与其他连接体反应；和(a2)使其他连接体的游离端与连接体反应。在这些实施方案中，其他连接体通常在两个末端均具有伯氨基，从而允许通过EDAC活化，使伯氨基中的一个与多糖中的羧基反应来进行步骤(a1)。使用的伯氨基与多糖中经EDAC活化的羧基反应。酰肼(特别地-C(＝O)NHNH2)是合适的。相同的伯氨基通常存在于其他连接体的两个末端。该反应产生了多糖-其他连接体中间产物，其中多糖通过酰胺键与其他连接体偶联。
涉及间接偶联的这两组实施方案在步骤(a1)后产生了多糖-其他连接体中间产物。本发明提供了通过这些实施方案获得的或者可获得的多糖-其他连接体中间产物。本发明还提供了这些实施方案的各个步骤(a1)和(a2)。
其他连接体的游离端通常是伯氨基。以与在涉及上述直接偶联的实施方案中所使用的伯胺基相同的方式以及相同的连接体等，使用该伯氨基进行步骤(a2)。第二步产生了多糖-连接体中间产物，其中多糖通过其他连接体与连接体偶联，所述其他连接体通过酰胺键与连接体偶联。因此，在这些间接实施方案中的其他连接体通常是双功能连接体，其提供了用于与多糖中羰基(或羧基)反应的第一伯胺基，以及用于与连接体中的一个酯基反应的第二伯胺基。例如，可以将通式Y1-L-Y2的双功能连接体用作为其他连接体，其中Y1包含可以与多糖中的羰基(或羧基)反应的第一伯胺基；Y2包含可以与连接体中的一个酯基反应的伯胺基；并且L是其他连接体中的连接部分。一般的L基团是具有1-10个碳原子的直链烷基(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)，特别地-(CH2)4-。通式Y-L-Y的同型双功能连接体是特别合适作为其他连接体的，其中两个Y基团是相同的，并且均能与羰基(或羧基)以及酯基反应；并且其中L是其他连接体中的连接部分。一般Y基团是-NHNH2基团。L通常具有通式-L'-L2-L'-，其中L'是羰基。一般L2基团是具有1-10个碳原子的直链烷基(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)，特别地-(CH2)4-。因此，通常其他连接体是己二酸二酰肼(ADH)，并且本发明人发现该化合物特别适合作为本发明的其他连接体。然而，可以使用更短的其他连接体，并且本发明人发现羧二肼(carbodihydrazine)(CDH，即Y-L-Y，其中Y是-NHNH2,L是羰基)也特别适合作为用于本发明的其他连接体。
本发明第一方面的步骤(b)
在步骤(b)中，多糖-连接体中间产物中连接体的游离端处的酯基与载体分子中的伯胺基反应。通过亲核酰基取代进行反应，以形成多糖-连接体-载体分子缀合物，其中连接体通过酰胺键与载体分子偶联。
在步骤(a)和步骤(b)之间，可以从多糖-连接体中间产物中去除未反应的连接体。优选地，通过下文详述的本发明第三方面的方法实施该去除。
取决于多糖和载体分子的分子量，可以通过本发明方法产生具有1:10(即过量蛋白质)至10:1(即过量多糖)之间的多糖:蛋白质比例(w/w)的缀合物。例如，缀合物可以具有过量的糖，例如10:1至1:1的比例，来自副伤寒沙门氏菌的与CRM197偶联的O-抗原-核心通常具有大于1.5:1的比例。8:1至1.5:1之间的比例是特别有用的，更特别的比例是6:1至2:1之间的比例。相反，通过现有技术的方法制备的缀合物倾向于具有过量的蛋白质，例如参考文献13中多糖:蛋白质比例在1:17至1:1.4之间。本发明发现，可将6:1至2:1之间的比例，特别地3:1至4:1之间的比例用于含来自副伤寒沙门氏菌的O-抗原-核心和CRM197的缀合物。这些缀合物可以高效率地生产，并且显示出与含更大量多糖(例如5:1至6:1之间的比例)的缀合物相似的免疫原性。就多糖:蛋白质比例(摩尔/摩尔)而言，本发明方法允许一个以上的多糖链与每一载体分子缀合，因此比例一般大于1:1。
组合物可以包含少量的游离载体[14]。当给定的载体蛋白在本发明组合物中以游离形式和缀合形式存在时，未缀合的形式在总体上优选地不多于组合物中载体蛋白的总量的5％，优选地以重量计少于2％存在，以及更优选地以重量计少于1％存在。
缀合后，可以分离游离的和缀合的多糖。存在许多合适的方法，包括疏水作用层析(HIC)、切向流过滤、大小排阻层析等[还参见参考文献15&16等]。
缀合物优选地可溶于水中和/或生理性缓冲液中。
本发明的第二方面
在第二个方面中，本发明提供了用于还原胺化多糖的还原端处的羰基的方法，其中在pH4至5之间进行还原胺化。可以在pH4.1至4.9之间，例如pH4.2至4.8之间，例如pH4.3至4.7之间，例如pH4.4至4.6之间进行还原胺化。本发明人发现，与参考文献13中的7天反应相比，相对低的pH允许更快地(例如在30℃，1个小时以内)进行反应。
优选地，根据本发明第一方面的方法，特别地根据涉及上述间接偶联的第一组实施方案的步骤(a1)进行还原胺化。因此，还原胺化可以包括羰基与上述其他连接体反应。其他连接体通常在两个末端均具有伯胺基，从而允许通过伯胺基中的一个与羰基反应来进行还原胺化。使用伯胺基与多糖中的羰基反应。本发明人发现，酰肼(特别地-C(＝O)NHNH2)或者羟氨基(-ONH2)基团是合适的。通常在其他连接体的两个末端存在相同的伯胺基。反应产生了多糖-其他连接体中间产物，其中多糖通过C-N键与其他连接体偶联。本发明还提供了通过本方法获得的或者可获得的多糖-其他连接体中间产物。
特别地，其他连接体可以是通式Y1-L-Y2的双功能连接体，其中Y1包含可以与多糖中的羰基反应的第一伯胺基；Y2包含可以与载体分子连接的第二反应基团，例如伯胺基或—SH基；并且L是其他连接体中的连接部分。一般的L基团是具有1-10个碳原子的直链烷基(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)，特别地-(CH2)4-。通式Y-L-Y的同型双功能连接体是特别合适作为其他连接体的，其中两个Y基团是相同的，并且均能与羰基反应；并且其中L是其他连接体中的连接部分。一般X基团是-NHNH2基团。L通常具有通式-L'-L2-L'-，其中L'是羰基。一般L2基团是具有1-10个碳原子的直链烷基(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)，特别地-(CH2)4-。因此，通常其他连接体是己二酸二酰肼(ADH)，并且本发明人发现该化合物特别适合作为本发明的其他连接体。然而，可以使用更短的其他连接体，并且本发明人发现羧二肼(CDH，即Y-L-Y，其中Y是-NHNH2,L是羰基)也特别适合作为用于本发明的其他连接体。
当多糖是来自脂多糖，特别地来自甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒杆菌或肠炎沙门菌的O-抗原-核心时，该方法是特别合适的。
还原胺化在有机化学中是标准的技术，并且已经广泛地用于荚膜多糖(用于疫苗用途)，包括O-抗原-核心的缀合物的生产中[13]。在本发明的第二方面中，多糖中的羰基与例如上述其他连接体中的伯胺基反应。该步骤也在本发明第一方面的方法，特别地在涉及上述间接偶联的第一组实施方案的步骤(a1)中发生。可以在合适的还原剂(例如，氰基硼氢化物，例如氰基硼氢化钠NaBH3CN；吡啶硼烷；三乙酰氧基硼氢化钠；氢硼化物离子交换树脂等)存在的情况下，通过将多糖与伯胺基组合，来方便地实现还原胺化。本领域技术人员能鉴定用于还原胺化的合适条件。例如，本发明人发现，在pH4.5，在100mM乙酸钠中，用多糖:其他连接体比例(w/w)为2:1的其他连接体(ADH或CDH)和多糖:NaBH3CN比例为2:1的NaBH3CN处理40mg/ml的多糖(来自副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒杆菌或肠炎沙门菌的O-抗原-核心)是合适的。反应通常在30℃进行1个小时。
本发明的第三方面
在第三方面中，本发明提供了用于减少未反应的连接体污染多糖-连接体中间产物的方法，其包括在小于5的pH在含水条件下沉淀未反应的连接体的步骤。该方法不需要使用毒性溶剂如二烷或乙酸乙酯。特别地，本方法允许在含水条件下进行去污，同时避免多糖-连接体中间产物失活(例如通过水解)。
优选地，多糖-连接体中间产物是通过上述本发明第一方面的步骤(a)获得的或者可获得的中间产物。当连接体是SIDEA时，该方法是特别合适的。多糖特别地是来自脂多糖，特别地来自甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒杆菌或肠炎沙门菌的O-抗原-核心。
通常，进行沉淀的pH为2至5之间。在本发明的实施方案中，pH可以在2-3、3-4或4-5之间。可将任何合适的水溶液用于获得该pH。例如，本发明人发现，添加含水缓冲液例如，含水的柠檬酸缓冲液是合适的。柠檬酸缓冲液可以是pH3的100mM柠檬酸钠。选择加入的水溶液的体积，以确保在最终的混合物中未反应的连接体是不溶的。例如，本发明人发现，特别地对于SIDEA连接体，>60％(例如，61、62、63、64、65、66、67、68、69、70％等)的含水量是合适的。这些条件可以例如通过用pH3的100mM柠檬酸钠溶液使反应混合物的总体积增至三倍获得。通常将混合物放置约30分钟。通过例如离心去除沉淀。
本发明人还发现，盐酸(HCl)的水溶液适合于降低pH。例如，将2倍体积的HCl82.5ppm加入到反应混合物中至最终混合物中55ppm的HCl浓度，产生了2.3的pH。在4℃混合溶液30分钟，并通过离心回收溶液。
可以通过用醇沉淀，从溶液中回收多糖-连接体中间产物。因此，按未反应的连接体的摩尔数相对于中间产物中连接体的摩尔数计，未反应的连接体污染的多糖-连接体中间产物例如减少至了10％以下。
醇可以特别地是乙醇，尽管可以使用其他低级醇(例如，甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇、二元醇等)。通常将乙醇加入到含多糖-连接体中间产物的溶液中，以产生80％至95％之间的最终乙醇浓度(体积/体积)。最佳的最终乙醇浓度可以取决于多糖-连接体中间产物。当多糖是来自甲型副伤寒杆菌的O-抗原-核心时，本发明人发现约85％的浓度是合适的。
可以将乙醇以纯的形式加入到含多糖-连接体中间产物的溶液中，或者可以以用混溶溶剂(例如，水)稀释的形式加入。通过例如离心回收沉淀的多糖-连接体中间产物。可以在进一步使用之前洗涤沉淀。
在一个实施方案中，使用2-丙醇(90％终浓度v/v)沉淀具有SIDEA的中间产物，并用无水乙醇洗涤沉淀OAg-SIDEA。
优选地，然后在上述本发明第一方面的步骤(b)中使用回收的多糖-连接体中间产物。本发明第三方面的方法尤其可以在本发明第一方面的方法的步骤(a)和(b)之间进行。
多糖
本发明涉及多糖。通常，多糖具有KDO亚基的还原端。KDO亚基包含羰基。在本发明第一方面的一些实施方案(特别地，涉及上述间接偶联的第一组实施方案)中，将羰基用于本方法的步骤(a)中多糖与连接体的偶联。在本发明的第二方面中，羰基参与了本方法的还原胺化。在两个方面中，尽管多糖通常均具有KDO亚基的还原端，但本领域技术人员应当理解，可以使用在其还原端包含羰基的其他多糖。例如，本发明人发现，可以使用脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清组X的荚膜多糖。下文描述了适合用于本发明的其他细菌荚膜多糖。KDO亚基还包含羧基。在本发明第一方面的一些实施方案中(特别是在涉及上述间接偶联的第二组实施方案中)，将羧基用于本方法的步骤(a)中多糖与连接体的偶联。此外，本领域技术人员应当理解，可以使用包含羧基的其他多糖。例如，下文描述了适合用于本发明的细菌荚膜多糖。
在本发明第一方面的其他实施方案(特别是上述涉及直接偶联的实施方案)中，在本方法的步骤(a)中使用多糖中的伯氨基将多糖与连接体偶联。在这些方法中，不需要多糖在其还原端处包含羰基或羧基，尽管这些基团通常总是存在的(例如，当多糖具有KDO亚基的还原端时)。此外，本领域技术人员应当理解，可以使用包含伯氨基的其他多糖。例如，下文描述了适合用于本发明的荚膜多糖。
多糖可以特别地包含来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域。核心结构域是可见于革兰氏阴性菌的外膜的脂多糖的组分。脂多糖还包含O-抗原，其通过核心结构域与脂质A结构域连接。核心结构域具有末端KDO亚基，其在天然的脂多糖中与脂质A结构域连接。该KDO亚基可以是在用于本发明的多糖的还原端处的上述KDO亚基。因此，用于本发明的多糖可以包含来自脂多糖的核心结构域。在优选的实施方案中，该多糖还包含与核心结构域连接的O-抗原(在本文中称为O-抗原-核心)。O-抗原-核心特别地是来自特定的脂多糖(即没有其脂质A结构域的脂多糖)的O-抗原和核心结构域。纯化这些O-抗原-核心的一般方法是基于在20世纪60年代第一次描述的Westphal和Jann的苯酚-水方法[参考文献17]，然后用乙酸或无水肼使脂多糖去毒。例如，将该方法应用于参考文献1中的鼠伤寒杆菌；参考文献2中的副伤寒沙门氏菌；参考文献13中的S.dysentery和参考文献10中的大肠杆菌O157。这些方法涉及细菌的沉降；通过福尔马林固定失活培养物；脂多糖的热酚提取；以及纯化之前用乙酸(去除脂质A)或无水肼(去O-酰化脂质A)处理提取的脂多糖。这些方法还可以涉及用DNA酶、RNA酶和蛋白酶处理破坏的细胞团或者提取的脂多糖，以减少杂质。
为了在本文中所述的KDO羰基处进行还原胺化，应当去除脂质A，使得KDO基团可以自由反应。为此，可以优选地通过如在例如参考文献1-2-10-13和18中所述的乙酸水解来进行多糖的提取和纯化。然而，可将本发明应用于任意合适的O-抗原-核心，包括通过不同的纯化方法获得的O-抗原-核心。
包含核心结构域的多糖是优选的，因为它们提供了用于在本发明第一方面的步骤(a)中多糖与连接体偶联的KDO亚基。特别地，KDO亚基包含用于涉及上述间接偶联的第一组实施方案的羰基。KDO亚基还含有用于上述涉及间接偶联的第二组实施方案的羧基。多糖还提供了用于本发明第二方面的还原胺化的KDO亚基。特别地，KDO亚基包含用于上述还原胺化的羰基。在涉及本方法步骤(a)中使用多糖中伯氨基将多糖与连接体偶联的本发明第一方面的那些实施方案中，包含来自脂多糖的核心结构域的多糖也是有用的。因为核心结构域通常包含伯氨基(例如，在磷酸乙醇胺基团，特别地如在甲型副伤寒杆菌核心结构域中的焦磷酸乙醇胺基团中)。因此，对于本发明第一方面的那些备选的实施方案，优选的是使用具有含伯氨基的核心结构域的此种多糖。然而，磷酸乙醇胺含量在获自不同细菌或者相同细菌的不同菌株的核心结构域之间是不同的。因此，优选的是涉及在本方法步骤(a)中使用KDO亚基将多糖与连接体偶联的本发明第一方面的那些实施方案。在这些实施方案中，涉及还原胺化的方法是特别优选的，因为得到的C-N键比通过磷酸乙醇胺基团获得的键合更稳定。
通常，O-抗原和核心结构域来自沙门氏菌属细菌，例如来自沙门氏菌属A、B或D血清组，并且特别地来自甲型副伤寒沙门氏菌的脂多糖。已经描述了沙门氏菌属A、B和D血清组的O-抗原，并且认为共有公用骨架：→2-α-D-Manp-(1→4)-α-L-Rhap-(1→3)-α-D-Galp-(1→。与骨架的甘露糖(1→3)连接的α-3,6-二脱氧葡萄糖(α-D-泊雷糖)赋予了甲型副伤寒沙门氏菌的血清组特异性。骨架的α-L-鼠李糖在C-3处是部分O-乙酰化的(参考文献2，图1a)。还报道，α-D-泊雷糖具有不同程度的O-乙酰化。有时将来自甲型副伤寒沙门氏菌的O-抗原称为O:2。图2中显示了来自甲型副伤寒沙门氏菌的O-抗原和核心结构域的已发表结构，其包括核心结构域中的KDO亚基和伯氨基(在焦磷酸乙醇胺基团中)。本发明中的O-抗原还可以来自鼠伤寒杆菌。图1b中显示了该O-抗原(有时称为O:4,5)的重复单元的已发表结构。O-抗原还可以来自肠炎沙门菌(O:9，图1c中显示了重复单元的已发表结构)。与那些O-抗原的已发表结构相比，天然来源的O-抗原可以含有结构变异。
O-抗原和核心结构域还可以来自志贺氏杆菌属物种，例如来自弗氏志贺氏菌(S.flexneri)。可以提供用于本发明的O-抗原和核心结构域的其他志贺氏杆菌属物种是宋氏志贺氏菌(S.sonnei)、痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)和鲍氏志贺氏菌(S.boydii)[参考文献19]。O-抗原和核心结构域还可以来自大肠杆菌，例如大肠杆菌O157。可以提供用于本发明的O-抗原和核心结构域的含其他脂多糖的革兰氏阴性菌是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)[参考文献20]、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)[参考文献21]、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseria meningitidis)[参考文献22]。
相对于天然发现的多糖，多糖可以是经化学修饰的。例如，多糖可以是去-O-乙酰化的(部分的或完全的)，优选的是包含没有去-O-乙酰化的O-抗原的多糖。如果发生了去乙酰化，那么去-乙酰化可以在其他处理步骤之前、期间或者之后发生，但通常在任一个偶联步骤之前发生。可以通过常规测定法评估去-乙酰化等的作用。例如，参考文献2讨论了甲型副伤寒沙门氏菌O-抗原上O-乙酰化的相关性。在该文件中所述的甲型副伤寒沙门氏菌的天然O-抗原具有约80％的O-乙酰化。缀合的去-O-乙酰化O-抗原不会诱发具有杀菌活性的抗-脂多糖抗体。因此，用于本发明的甲型副伤寒沙门氏菌O-抗原可以具有0％至100％之间的O-乙酰化，但优选的是O-乙酰化的O-抗原。O-乙酰化的水平取决于提供O-抗原的细菌菌株。例如，甲型副伤寒沙门氏菌O-抗原的O-乙酰化程度可以为10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、55-95％、55-85％、60-80％或65-75％。通常，甲型副伤寒沙门氏菌O-抗原的O-乙酰化程度为55-85％，特别地65-75％。然而，在一些菌株中，通常存在更高程度的O-乙酰化例如70-100％，特别地85-95％的O-乙酰化。
多糖O-乙酰化的程度可以通过本领域已知的任意方法，例如通过质子NMR(例如如参考文献23中所述)、碳NMR(例如如参考文献2中所述)、Hestrin方法[24]或HPAEC-CD[25]测定。可以通过水解，例如通过用碱如无水肼处理，来去除O-乙酰基[2]。为了维持多糖上的高水平的O-乙酰化，使导致O-乙酰基团水解的处理，例如在极端pH的处理降到最低。
可以将其他多糖用于本发明。基于包含用于本发明方法的反应基团(即羰基、羧基或伯氨基)的多糖，技术人员应当能鉴定合适的多糖。特别地，可将细菌荚膜多糖用于本发明。这些细菌荚膜多糖可以例如来自脑膜炎奈瑟氏球菌，特别地A、C、W135和Y血清组；肺炎链球菌(S.pneumoniae)，特别地来自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F血清型；无乳链球菌(S.agalactiae)，特别地Ia、Ib和III血清型；金黄色葡萄球菌(S.aureus)，特别地来自5型和8型金黄色葡萄球菌；流感嗜血杆菌b型；肠沙门氏菌Typhi Vi；和艰难梭菌(Clostridium difficile)。本发明还可以使用非荚膜细菌多糖。示例性非荚膜细菌多糖是酿脓链球菌(S.pyogenes)GAS糖类(也称为GAS细胞壁多糖或GASP)。本发明还可以使用非细菌多糖。例如，本发明可以使用例如来自真菌细胞壁的葡聚糖。代表性葡聚糖包括昆布多糖和凝胶多糖。
可以使用寡糖形式的多糖。通过片段化纯化的多糖(例如通过水解)，然后通常纯化期望大小的片段来方便地形成所述寡糖形式的多糖。
可以通过已知技术纯化多糖。本发明并不限于纯化自天然来源的多糖，然而，可以通过其他方法，例如完全或部分合成来获得多糖。
载体分子
本发明涉及通常为蛋白质的载体分子的用途。一般而言，糖与载体的共价结合增强了糖的免疫原性，因为所述载体将糖从非T细胞依赖性抗原转变成T细胞依赖性抗原，从而允许引发免疫记忆。对于儿科疫苗，缀合是特别有用的[例如参考文献26]，并且是熟知的技术[例如在参考文献27至35中所综述]。
优选的载体蛋白是细菌毒素，例如白喉毒素或破伤风毒素、或者类毒素或其突变体。它们都是在结合疫苗中经常使用的。CRM197白喉毒素突变体是特别优选的[36]。
其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合体[37]、合成肽[38,39]、热休克蛋白[40,41]、百日咳蛋白[42,43]、细胞因子[44]、淋巴因子[44]、激素[44]、生长因子[44]、包含来自多种病原体衍生的抗原的多个人CD4+T细胞表位的人造蛋白[45]如N19[46]、来自流感嗜血杆菌的蛋白质D[47-49]、肺炎球菌溶血素[50]或其无毒衍生物[51]、肺炎球菌的表面蛋白PspA[52]、铁摄入蛋白[53]、来自艰难梭菌的毒素A或B[54]、重组的绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白(exoprotein)A(rEPA)[55]等。
可以使用载体蛋白的混合物。单个载体蛋白可以携带多个不同的多糖[56]。
缀合物和其他抗原的组合
还提供如上所述的各个缀合物，本发明提供了包含本发明缀合物和一种或多种其他抗原的组合物。组合物通常是免疫原性组合物。
其他抗原优选的是来自沙门氏菌属Typhi(Vi)或柠檬酸细菌属(Citrobacter)Vi的荚膜多糖。该荚膜糖可以是例如与重组的突变体绿脓假单胞菌胞外蛋白A(如在参考文献57中)或者更优选地与CRM197[36,58,59]缀合的。用于本发明的优选的Vi-CRM197缀合物描述于参考文献60中。
其他抗原可以包含通过本发明方法或者通过不同方法制备的其他缀合物。例如，在一个实施方案中，本发明提供了包含鼠伤寒杆菌O-抗原-核心的缀合物和肠炎沙门菌O-抗原-核心的缀合物，其中通过本发明方法制备至少一种(更通常地全部两种)缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了包含甲型副伤寒杆菌O-抗原-核心的缀合物、鼠伤寒杆菌O-抗原-核心的缀合物和肠炎沙门菌O-抗原-核心的缀合物，其中通过本发明方法制备至少一种缀合物(例如两种或两种以上，通常地全部三种缀合物)。
在其他实施方案中，一种或多种其他抗原选自以下抗原：
-来自肺炎链球菌的糖抗原[例如参考文献61-63；参考文献64的第22&23章]。
-来自甲型肝炎病毒的抗原，例如灭活病毒的抗原[例如65,66；参考文献64的第15章]。
-来自乙型肝炎病毒的抗原，例如表面和/或核心抗原[例如66,67；参考文献64的第16章]。
-来自丙型肝炎病毒的抗原[例如68]。
-来自百日咳杆菌(Bordetella pertussis)的抗原，例如来自百日咳杆菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)，任选地还与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3组合[例如69&70；参考文献64的第21章]。
-白喉抗原，例如白喉类毒素[例如参考文献64的第13章]。
-破伤风抗原，例如破伤风类毒素[例如参考文献64的第27章]。
-来自流感嗜血杆菌B的糖抗原[例如参考文献64的第14章]。
-来自淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)的抗原
-来自肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[例如71,72,73,74,75,76,77]。
-来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的抗原[例如78]。
-来自牙龈红棕色单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的抗原[例如79]。
-脊髓灰质炎抗原[例如80,81；参考文献64的第24章]如IPV。
-狂犬病抗原[例如82]如冻干的灭活病毒[例如83，RabAvertTM]。
-麻疹、病毒性腮腺炎和/或风疹抗原[例如参考文献64的第19,20和26章].
-流感抗原[例如参考文献64的第17&18章]，例如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
-来自粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原[例如84]。
-来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(链球菌属(Streptococcus)A组)的抗原[例如85,86,87]。
-来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(链球菌属B组)的抗原[例如88-90]。
-来自表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的抗原[例如如参考文献91,92和93中所述，可获自菌株ATCC-31432、SE-360和SE-10的I,II和/或III型荚膜多糖]。
当使用糖抗原时，通常与载体缀合，以增强免疫原性。流感嗜血杆菌B和肺炎球菌糖抗原的缀合是熟知的。
根据需要，可以解毒毒蛋白抗原(例如通过化学和/或遗传方法解毒百日咳毒素)。
当组合物中包含白喉抗原时，优选的是还包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，当包含破伤风抗原时，优选的是还包含白喉和百日咳抗原。相似地，当包含百日咳抗原时，优选的是还包含白喉和破伤风抗原。这些组合还可以包含来自乙型肝炎病毒的抗原和/或来自流感嗜血杆菌B的糖抗原，通常包含全部两种抗原。
组合物中的抗原通常以每种至少1μg/ml的浓度存在。一般而言，任意给定抗原的浓度足以诱发针对该抗原的免疫应答。
作为在本发明组合物中使用的蛋白质抗原的备选，可以使用编码该抗原的核酸[例如参考文献94-102]。因此，可以用编码该蛋白质的核酸(通常是例如质粒形式的DNA)替代本发明组合物的蛋白质组分。
药物组合物和方法
本发明提供了药物组合物，其包含(a)本发明缀合物和(b)可药用载体。一般的―可药用载体‖包括任意载体，其自身不会诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[103]、海藻糖[104]、乳糖和脂质聚集物(例如油滴或脂质体)。此类载体对本领域普通技术人员而言是熟知的。组合物还可以含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可以存在辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌的无致热源、磷酸缓冲的生理盐水是一般的载体。可药用赋形剂的充分讨论可在参考文献105中得到。
本发明组合物可以以含水形式(即溶液或悬浮液)或者以干燥形式(例如冻干的)存在。如果使用干燥的疫苗，那么在注射之前，将其重构成液体介质。结合疫苗的冻干是本领域已知的，例如MenjugateTM产品以冻干形式存在，而NeisVac-CTM和MeningitecTM以含水形式存在。为了在冻干期间稳定缀合物，组合物中通常包含例如1mg/ml至30mg/ml之间的糖醇(例如甘露醇)或(例如蔗糖或海藻糖)。
组合物可以存在于小瓶中，或者它们可以存在于预先填充的(ready-filled)注射器中。注射器可以提供或者不提供注射针。注射器包括单一剂量的组合物，而小瓶可以包括单一剂量或多个剂量的组合物。
本发明的含水组合物还适用于从冻干形式重构其他疫苗。当将本发明组合物用于该即时重构时，本发明提供了试剂盒，其可以包含两个小瓶或者可以包含一个预先填充的注射器和一个小瓶，其中在注射之前，注射器的内含物用于再活化小瓶的内含物。
本发明组合物可以以单位剂量形式或者以多剂量形式包装。对于多剂量形式，小瓶优选的是预先装满的注射器。可以常规地确立有效剂量体积，但例如对于肌内注射，组合物的一般人类剂量为0.5ml的体积。
组合物的pH通常在6至8之间，例如约7。可以通过使用缓冲液来维持稳定的pH。如果组合物包含氢氧化铝盐(aluminium hydroxide salt)，一般使用组氨酸缓冲液[106]。组合物可以是无菌的和/或无致热源的。就人类而言，本发明组合物可以是等渗的。
本发明组合物是有免疫原性的，并且更优选地是疫苗组合物。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或者治疗性的(即治疗感染)，但通常是预防性的。根据需要，用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及任意其他组分。‘免疫有效量’意为以单剂量或作为一系列的一部分施用给个体的量对于治疗或预防是有效的。该量取决于待治疗个体的健康和生理条件、年龄、待治疗个体的分类群(例如非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、期望保护的程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估，以及其他相关因素而变化。期望的是该量落入可以通过常规试验测定的相对宽的范围。
在每一剂量内，各个糖抗原的量一般在1-50μg之间(测量为糖的质量)例如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg。
可以将本发明组合物制备成多种形式。例如，可以将组合物制备成可注射的，成为液体溶液或悬浮液。可以使用细粉或喷雾来制备组合物，以用于例如作为吸入器经肺施用。可以将组合物制备成栓剂或子宫托。可以制备组合物以用于经鼻、经耳或经眼施用，例如作为喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉剂[例如参考文献107&108]。已经报道了成功地经鼻施用了肺炎球菌糖[109,110]、Hib糖[111]、MenC糖[112]，以及Hib和MenC复合糖的混合物[113]。
特别地当以多剂量格式包装时，本发明组合物可以包含抗菌剂。
本发明组合物可以包含去污剂例如Tween(聚山梨酯)，如Tween80。去污剂一般以低水平例如<0.01％存在。
本发明组合物可以包含钠盐(例如氯化钠)以产生张力。一般为10+2mg/ml NaCl的浓度。
本发明组合物一般包含缓冲液。一般为磷酸盐缓冲液。
本发明组合物一般与其他免疫调节剂组合施用。特别地，组合物通常包含一种或多种佐剂。此类佐剂包括但不限于：
A.含矿物质的组合物
在本发明中，适合用作佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐例如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如参见参考文献117的第8&9章]或者不同矿物质化合物的混合物，其中化合物为任意合适的形式(例如凝胶状、结晶状、非结晶状等)，并且优选的是具有吸附性。还可以将含矿物质的组合物配制成金属盐的颗粒。
已知为―氢氧化铝‖的佐剂通常是羟基氧化铝盐，其通常至少部分是结晶的。通过红外线(IR)光谱学，特别是通过1070cm–1处的吸收带和3090–3100cm–1处的强突出部(shoulder)的存在，可以将由通式AlO(OH)表示的羟基氧化铝与其他铝化合物如氢氧化铝Al(OH)3区别[参考文献117的第9章]。氢氧化铝佐剂结晶度的程度由半高处衍射带的宽度(WHH)反映，其中结晶差的颗粒由于更小的微晶大小，显示出更大的谱线增宽。表面区域随着WHH的增加而增加，并且具有更高WHH值的佐剂具有更大的抗原吸附能力。对于氢氧化铝佐剂，一般是纤维形态(例如在透射电子显微照片中所示)。氢氧化铝佐剂的pI通常为约11，即佐剂自身在生理pH具有正表面电荷。据报道，对于氢氧化铝佐剂，每mg Al+++在pH7.4的吸附能力在1.8-2.6mg蛋白质之间。
已知为―磷酸铝‖的佐剂通常为羟基磷酸铝，所述佐剂通常还含有少量的硫酸盐(即羟基磷硫酸铝(aluminium hydroxyphosphate sulfate))。可以通过沉淀获得它们，并且沉淀期间的反应条件和浓度会影响盐中磷酸取代羟基的程度。羟基磷酸盐一般具有0.3-1.2之间的PO4/Al摩尔比。通过羟基的存在，可以将羟基磷酸盐与精确的AlPO4区别。例如，3164cm-1处的IR光谱带(例如在200℃)表明结构性羟基的存在[参考文献117的第9章]。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比一般在0.3-1.2之间，优选地在0.8-1.2之间，以及更优选地为0.95+0.1。磷酸铝，特别是羟基磷酸铝，一般是非结晶形的。一般的佐剂是具有0.84至0.92之间的PO4/Al摩尔比的非结晶形羟基磷酸铝，包含0.6mg Al3+/ml。磷酸铝一般是微粒(例如如在透射电子显微照片中所示的板状形态)。任一抗原吸附后，颗粒的一般直径为0.5-20μm(例如约5-10μm)。据报道，对于磷酸铝佐剂，每mg Al+++在pH7.4的吸附能力在0.7-1.5mg蛋白质之间。
磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸取代羟基的程度反相关，并且取代的这种程度取决于用于通过沉淀制备该盐的的反应条件和反应物的浓度而变化。PZC还可以通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝PZC越酸)或者通过加入缓冲液如组氨酸缓冲液(使得PZC越碱)而改变。根据本发明使用的磷酸铝一般具有4.0至7.0之间，更优选地5.0至6.5之间，例如约5.7的PZC。
用于制备本发明组合物的铝盐的悬浮液可以含有缓冲液(例如磷酸或组氨酸或者Tris缓冲液)，但这并非总是必需的。悬浮液优选地是无菌的和无致热原的。悬浮液可以包含例如以1.0至20mM之间，优选地5至15mM之间，以及更优选地约10mM浓度存在的游离的水合磷酸根离子。悬浮液还可以包含氯化钠。
在一个实施方案中，佐剂组分包含氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在该情况下，磷酸铝可以比氢氧化铝多，例如磷酸铝与氢氧化铝的重量比为至少2:1如>5:1、>6:1、>7:1、>8:1、>9:1等。
在用于施用给患者的组合物中，Al+++的浓度优选地低于10mg/ml例如<5mg/ml、<4mg/ml、<3mg/ml、<2mg/ml、<1mg/ml等。优选的范围为0.3至1mg/ml之间。优选的最大量<0.85mg/剂量。
B.油性乳剂
适合用作本发明中的佐剂的油性乳剂包括鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献117的第10章；还参见参考文献114](5％鲨烯、0.5％Tween80和0.5％Span85，使用高压微射流机(microfluidizer)配置成亚微米颗粒)。还可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂。
多种合适的水包油乳剂是已知的，并且它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中油和表面活性剂是生物可降解的(可代谢的)和生物相容的。乳剂中的油滴一般直径小于5μm，并且有利地是乳剂包含具有亚微米直径的油滴，其中使用高压微射流机来得到这些小尺寸，以提供稳定的乳剂。尺寸小于220nm的小滴是优选的，因为可以将它们进行过滤灭菌。
本发明可以使用油，例如那些来自动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种子和谷物。花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是最常见的可得到的示例性坚果油。可以使用例如获自荷荷葩豆(jojobabean)的荷荷葩油(jojoba oil)。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物组中，玉米油是最容易得到的，但还可以使用其他谷类例如小麦、燕麦、黑麦、稻、埃塞俄比亚画眉草、黑小麦等。可以通过水解、分离和酯化来自坚果油和种子油的合适物质，制备在种子油中并非天然存在的甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。来自哺乳动物乳的脂肪和油是可代谢的，因此可以用于本发明的实践。分离、纯化、皂化的方法以及从动物来源中获得纯油所必需的其他方法是本领域熟知的。大多数鱼含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油，以及鲸油如鲸蜡是可以在本文中使用的几种示例性鱼油。以5-碳异戊二烯单位生物化学合成了许多支链油，并且一般称为类萜。鲨鱼肝油含有称为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-廿四碳六烯的分支的不饱和类萜。其他优选的油是生育酚(见下文)。包含sqlauene的水包油乳剂是特别优选的。可以使用油的混合物。
可以根据其？HLB‘(亲水性/亲脂性平衡)分类表面活性剂。本发明优选的表面活性剂具有至少10，优选地至少15，以及更优选地至少16的HLB。本发明可以使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为Tween)，特别是聚山梨醇20和聚山梨酯80；在DOWFAXTM商标名下出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如线性EO/PO嵌段共聚物；辛苯昔醇，其在重复的乙氧基(氧化-1,2-乙二基)基团的数目方面不同，其中辛苯昔醇-9(Triton X-100或叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)是特别有用的；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；来源于月桂基、鲸蜡基、硬脂酰和油醇的聚氧乙烯脂肪族醚(已知为Brij表面活性剂)，如三甘醇单月桂醚(triethyleneglycolmonolaurylether)(Brij30)；和脱水山梨糖醇酯(通常已知为SPAN)，例如三油酸山梨坦(Span85)和脱水山梨醇单月桂酸酯。乳剂中包含的优选的表面活性剂是Tween80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、Span85(三油酸山梨坦)、卵磷脂和Triton X-100。如上所述，去污剂如Tween80可以有助于下文实施例中所示的热稳定性。
可以使用表面活性剂的混合物，例如Tween80/Span85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(Tween80)和辛苯昔醇如叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)的混合物也是合适的。另一有用的组合物包含聚乙二醇单十二醚9(laureth9)以及聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯昔醇。
表面活性剂的优选量(按重量计的％)为：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如Tween80)0.01至1％，特别地约0.1％；辛基或壬基苯氧基聚氧基乙醇(如Triton X-100或者Triton系列的其他去污剂)0.001至0.1％，特别地0.005至0.02％；聚氧乙烯醚(如聚乙二醇单十二醚9)0.1至20％，优选地0.1至10％并且特别地0.1至1％或约0.5％。
用于本发明的特定水包油乳剂佐剂包括但不限于：
·鲨烯、Tween80和Span85的亚微粒乳剂。按体积计，乳剂的组成可以为约5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％Span85。以重量计，这些比例为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％Span85。如在参考文献117的第10章和参考文献118的第12章中所详述，该佐剂称作‘MF59’[114-116]。MF59乳剂有利地包含柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·包含鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳剂。这些乳剂可以具有2-10％的鲨烯、2-10％的生育酚和聚山梨酯80。这些乳剂可以具有2至10％的鲨烯、2至10％的生育酚和0.3至3％的Tween80，并且鲨烯:生育酚的重量比优选地<1(例如0.90)，因为这提供了更稳定的乳剂。鲨烯和Tween80可以以约5:2的体积比或者以约11:5的重量比存在。可以通过将Tween80溶解在PBS中以产生2％的溶液，然后将90ml该溶液与(5gDL-α-生育酚和5ml鲨烯)的混合物混合，然后微流化(microfluidis)该混合物来制备一种该乳剂。得到的乳剂可以具有例如100至250nm之间，优选地约180nm平均直径的亚微粒油滴。
·鲨烯、生育酚和Triton去污剂(例如Triton X-100)的乳剂。乳剂还可以包含3d-MPL(见下文)。乳剂还可以含有磷酸盐缓冲液。
·包含聚山梨酯(例如聚山梨酯80)、Triton去污剂(例如Triton X-100)和生育酚(例如α-生育酚琥珀酸盐)的乳剂。乳剂可以包含质量比为约75:11:10的这三种组分(例如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml Triton X-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸盐)，并且这些浓度应当包括来自抗原的这些组分的任何贡献。乳剂还可以包含鲨烯。乳剂还可以包含3d-MPL(见下文)。乳剂还可以含有磷酸盐缓冲液。
·鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401的乳剂(―PluronicTML121‖)。可以将乳剂配制在磷酸缓冲盐水，pH7.4中。该乳剂是胞壁酰二肽的有用递送载体，并且已经在―SAF-1‖佐剂[119](0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％Pluronic L121和0.2％聚山梨酯80)中与苏氨酰-MDP一起使用。所述乳剂还可以不与Thr-MDP一起使用，这样的佐剂如―AF‖佐剂[120](5％鲨烯、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨酯80)。优选的是微流化法。
·包含鲨烯、含水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水的非离子型表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)十六十八醇醚(cetostearyl ether))和疏水的非离子型表面活性剂(例如脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，例如去水山梨糖醇单油酸酯(sorbitan monoleate)或‘Span80’)的乳剂。乳剂优选的是热可逆的和/或具有至少90％尺寸小于200nm的油滴(按体积计)[121]。乳剂还可以包含一种或多种糖醇；冷冻防护剂(例如，如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷(alkylpolyglycosid)。此类乳剂可以是冻干的。
·具有0.5-50％的油、0.1-10％的磷脂和0.05-5％的非离子表面活性剂的乳剂。如参考文献122中所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。有利的是亚微粒小滴的大小。
·不可代谢的油(例如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(例如卵磷脂、Tween80或Span80)的亚微粒水包油乳剂。可以包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体缀合物(如参考文献123中所述的，通过葡糖醛酸的羧基，将脂肪胺加成到脱酰基皂苷产生的GPI-0100)、二甲基二十八烷基溴化铵和/或N,N-二十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。
·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如乙氧基脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳剂[124]。
·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如乙氧基脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳剂[124]。
·这样的乳剂，其中皂苷(例如QuilA或QS21)和固醇(例如胆固醇)结合作为螺旋状微胶粒[125]。
在递送给患者时，组合物中的抗原和佐剂通常是混合的。可以在生产期间或者在递送时临时将乳剂与抗原混合。因此，佐剂和抗原可以在包装的或者分配的疫苗中单独保存，备用为使用时的最终制剂。抗原通常是含水的形式，以使最后通过混合两种液体来制备疫苗。可以改变用于混合的两种液体的体积比(例如，5:1至1:5之间)，但一般为约1:1。
C.皂苷制剂[参考文献117的第22章]
还可以将皂苷制剂用作本发明中的佐剂。皂苷是在许多植物物种的树皮、树叶、茎、根以及甚至花中发现的固醇苷和三萜糖苷(triterpenoidglycoside)的异质群。已经将来自阜树(Quillaiasaponaria Molina)的树皮的皂苷广泛地研究作为佐剂。皂苷也可商业地获自丽花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花(brides veil))和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以StimulonTM出售。
已经使用HPLC和RP-HPLC纯化了皂苷组合物。使用这些技术已经鉴定了特定的纯化级分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选地，皂苷是QS21。参考文献126中公开了产生QS21的方法。皂苷制剂还可以包含固醇，例如胆固醇[127]。
皂苷和胆固醇的组合可以用于形成称为免疫刺激复合体的独特颗粒(ISCOM；参见参考文献117的第23章；以及参考文献128&129)。ISCOM通常还包含磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。可以将任意已知的皂苷用于ISCOM。优选地，ISCOM包含QuilA、QHA&QHC的一种或多种。任选地，ISCOM可以没有其他去污剂[130]。
研发基于皂苷的佐剂的综述可见于参考文献131&132。
D.细菌或微生物的衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物的衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激寡核苷酸和ADP-核糖基化的毒素及其解毒的衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3dMPL)。3dMPL是3去-O-酰化单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。参考文献133公开了3脱-O-酰化单磷酰脂质A优选的―小颗粒‖形式。3dMPL的这种―小颗粒‖小到足以通过0.22μm膜来过滤除菌[133]。其他无毒的LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸盐衍生物如RC-529[134,135]。
脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A，例如OM-174的衍生物。OM-174例如描述于参考文献136&137中。
适合用作本发明佐剂的免疫刺激寡核苷酸包括含CpG基序(含通过磷酸键与鸟苷连接的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含回文序列或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示出免疫刺激性。
CpG可以包括核苷酸修饰物/类似物如硫代磷酸酯修饰物，并且可以是双链的或单链的。参考文献138、139和140公开了可能的类似物取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷(deazaguanosine)取代鸟苷。参考文献141-146进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。
CpG序列可以涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[147]。CpG序列(例如CpG-A ODN)可以特异地诱导Th1免疫应答，或者(例如CpG-B ODN)可以更特异地诱导B细胞应答。参考文献148-150讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选地，CpG是CpG-A ODN。
优选地，构建CpG寡核苷酸，以使5'末端对于受体识别是可接近的。任选地，两个CpG寡核苷酸序列可以在其3'末端连接，以形成―免疫聚体(immunomer)‖。参见例如，参考文献151-153。
基于免疫刺激寡核苷酸的特别有用的佐剂已知为IC-31TM[154-156]。因此，本发明所使用的佐剂可以包含以下物质的混合物：(i)包含至少一个(并且优选地多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷连接，以形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸之间)，和(ii)包含至少一个(和优选地多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的聚阳离子聚合物，例如寡肽(例如5-20个氨基酸之间)。寡核苷酸可以是包含26-基体(mer)序列5'-(IC)13-3'(SEQID NO:1)的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是包含11-基体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO:2)的肽。SEQ ID NO:1和2的这种组合提供了IC-31TM佐剂。
可将细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒的衍生物用作本发明中的佐剂。优选地，蛋白质来源于大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素―LT‖)、霍乱(―CT‖)或百日咳(―PT‖)。解毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的用途描述于参考文献157中，并且在参考文献158中描述了作为肠胃外的佐剂的用途。毒素或类毒素优选地是包含A和B亚基的全毒素的形式。优选地，A亚基含有解毒突变；B亚基优选地是未突变的。优选地，佐剂是解毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特别地LT-K63和LT-R72作为佐剂的用途可见于参考文献159-166中。有用的CT突变体是CT-E29H[167]。氨基酸取代的数字基准优选地基于参考文献168中给出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基的比对，特别地在本文中将所述参考文献以其整体并入本文作为参考。
E.人免疫调节剂
适合用作本发明中的佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[169]等)[170]，干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。
F.生物粘附剂和粘膜粘着剂
还可将生物粘附剂和粘膜粘着剂用作本发明中的佐剂。合适的生物粘附剂包括酯化的透明质酸微球体[171]，合适的粘膜粘着剂例如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。还可将脱乙酰壳多糖及其衍生物用作本发明中的佐剂[172]。
G.微粒
还可将微粒用作本发明中的佐剂。由生物可降解和无毒材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选地聚(丙交酯-共聚-乙交酯)形成微粒(即直径～100nm至～150μm，更优选地直径～200nm至～30μm，以及最优选地直径～500nm至～10μm的微粒)，任选地处理微粒使其具有带负电荷的表面(例如用SDS处理)或带正电荷的表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。
H.脂质体(参考文献117的第13&14章)
参考文献173-175描述了适合用作佐剂的脂质体制剂的实例。
I.咪唑喹诺酮(Imidazoquinolone)化合物
适合用作本发明中的佐剂的咪唑喹诺酮化合物的实例包括咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如―Resiquimod3M‖)，其进一步描述于参考文献176和177中。
本发明还包含上文鉴定的一种或多种佐剂的组合。例如，可以将以下佐剂组合物用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[178]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)[179]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+固醇)[180]；(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂[181]的组合；(6)含10％鲨烯、0.4％Tween80TM、5％pluronic-嵌段聚合物L121，以及thr-MDP的SAF，其微流化成亚微粒乳剂或者涡旋以产生更大颗粒尺寸的乳剂。(7)RibiTM佐剂系统(RAS)，(RibiImmunochem)，其含有2％鲨烯、0.2％Tween80，以及选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁支架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，优选地MPL+CWS(DetoxTM)的细菌细胞壁组分；和(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。
作为免疫刺激剂的其他物质公开于参考文献117的第7章中。
氢氧化铝佐剂是有用的，并且抗原通常吸附到这种盐上。还优选的是包含鲨烯的具有亚微粒油滴的水包油乳剂(特别是在老龄中)。有用的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，例如CpG&铝盐或者瑞喹莫德(resiquimod)&铝盐。可以使用铝盐和3dMPL的组合。
治疗方法
本发明还提供了在哺乳动物中提高免疫应答的方法，包括将本发明的药物组合物施用给哺乳动物。免疫应答优选地是保护性的，并且优选地涉及抗体。本方法可以提高加强应答。
哺乳动物优选的是人类。当将疫苗用于预防性用途时，人类优选的是儿童(例如幼儿或婴儿)或青少年；当将疫苗用于治疗性用途时，人类优选地是成年人。还可以将意图用于儿童的疫苗施用给成年人，例如以评估安全性、剂量、免疫原性等。哺乳动物还可以是农场动物，例如猪或牛。此类兽医用途是特别设想的。鸟类优选地是家畜，特别地火鸡或其他家禽。
本发明还提供了用作药物的本发明组合物。药物优选地能在哺乳动物中提高免疫应答(即其是免疫原性组合物)，并且其更优选地是疫苗。
本发明还提供了本发明缀合物在生产用于在哺乳动物中提高免疫应答的药物的用途。
这些用途和方法优选地用于预防和/或治疗由多糖所来源的细菌引起的疾病。
检查治疗性治疗的有效性的一个方法涉及施用本发明组合物后监测细菌感染。检查预防性治疗的有效性的一个方法涉及施用组合物后例如使用血清细菌抗体测定法监测针对细菌抗原的免疫应答。
本发明优选的组合物可以在患者中赋予比每一抗原组分的血清保护标准更优的为人类受试者可接受百分比的抗体滴度具有高于这样的相关抗体滴度的抗原是熟知的，认为所述抗体滴度是宿主针对该抗原血清转化的，并且此类滴度已由组织例如WHO发布。优选地，80％以上，更优选地90％以上，极其优选地93％以上和最优选地96-100％统计学显著的受试者样品是血清转化的。
通常将本发明组合物直接施用给患者。可以通过肠胃外的注射(例如皮下地、腹膜内地、静脉内地、肌内地或者注射到组织的胞间隙)或者通过直肠、口腔、阴道、局部、经皮肤、鼻内、眼睛、耳、肺或其他粘膜施用来实现直接递送。优选地是肌内施用到股或上臂。注射可以通过注射针(例如皮下注射针)，当可以备选地使用无针注射。一般的肌内剂量是0.5ml。
本发明还可以用于诱发全身免疫和/或粘膜免疫。
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。可以在初次免疫方案中和/或加强免疫方案中使用多剂量。初次剂量方案之后可以是加强剂量方案。可以常规地测定引发剂量(例如4-16周之间)之间，以及引发至加强之间的合适时间。
概述
除非另外指明，可以使用本领域技术内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药学的常规方法实施本发明。文献中详细说明了此类技术。参见例如参考文献182-189等。
当本发明提及―表位‖时，该表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位。此类表位可以经验地鉴定(例如使用PEPSCAN[190,191]或者相似的方法)，或者它们是可以预测的(例如使用Jameson-Wolf抗原性指数[192]、基于矩阵的方法[193]、MAPITOPE[194]、TEPITOPE[195,196]、神经网络[197]、OptiMer&EpiMer[198,199]、ADEPT[200]、Tsites[201]、亲水性[202]、抗原性指数[203]或者参考文献204-208中公开的方法等)。表位是抗原的一部分，其识别并与抗体或T细胞受体的抗原结合位点结合，并且还可以称它们为―抗原决定簇‖。
术语―包含‖包括―包括‖以及―由……组成‖，例如组合物―包含‖X可以专门由X组成或者可以包括其他物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语―约‖表示，例如x+10％。
词语―基本上‖并不排除―完全‖，例如―基本上无‖Y的组合物可以完全没有Y。根据需要，词语―基本上‖可以从本发明的定义中省去。
当本发明提供涉及多个连续步骤的方法时，本发明还可以提供涉及少于步骤总数的步骤的方法。可以在不同的时间，由不同的人在不同的地方(例如在不同的国家)进行不同的步骤。
应当理解，糖环可以以开放和闭合形式存在，并且本发明包括这两种形式。相似地，应当理解，糖可以以吡喃糖和呋喃糖形式存在，并且也包括了这两种形式。还包括了糖的不同异头物形式。KDO可以特别地在酸性条件下经历重排。本发明还包括了KDO的这些衍生形式。例如，当本发明涉及KDO亚基时(例如在第一和第二方面的还原胺化中)，该亚基可以以一种或多种这些衍生形式存在。
伯胺基可以由通式NH2R表示。R基团通常是电子供体，并且包括–NH、-O、C1-8烃基，特别地C1-8烷基，特别是烷基。R通常是-CH3、-C2H5或-C3H7。可以用一个或多个基团取代烃基，所述基团例如：卤素(如Cl、Br、F、I)、三卤甲基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-SO3C1-6烷基、-OC(＝O)OC1-6烷基、-C(＝O)H、-C(＝O)C1-6烷基、-OC(＝O)C1-6烷基、-N(C1-6烷基)2、C1-6烷基、-N(C1-6烷基)2、-C(＝O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝O)O(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(＝O)N(C1-6烷基)2、-CO2H、-OC(＝O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝O)C1-6烷基、-N(C1-6烷基)C(＝S)C1-6烷基、-N(C1-6烷基)SO2N(C1-6烷基)2、-CO2C1-6烷基、-SO2N(C1-6烷基)2、-C(＝O)NH2、-C(＝S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2C1-6烷基、-N(C1-6烷基)C(＝S)N(C1-6烷基)2、-NH-C1-6烷基、-S-C1-6烷基或-O-C1-6烷基。术语―烃基‖包括由碳和氢组成的线性的、分支的或环状的单价基团。因此，烃基包括烷基、烯基和炔基基团、环烷基(包括聚环烷基)、环烯基和芳基及其组合，例如烷基环烷基、烷基聚环烷基、烷基芳基、烯基芳基、环烷基芳基、环烯基芳基、环烷基烷基、聚环烷基烷基、芳基烷基、芳基烯基、芳基环烷基和芳基环烯基。一般的烃基是C1-14烃基，更特别地C1-8烃基。在用于本发明的其他连接体中，伯胺基通常是酰肼(特别是-C(＝O)NHNH2)基团的一部分。
酯基可以由通式-C(＝O)OR表示。R基团通常是电子供体，并且包括C1-8烃基，特别地C1-8烷基，特别是甲基。R通常是-CH3、-C2H5或-C3H7。可以用一个或多个基团取代烃基，所述基团例如：卤素(如Cl、Br、F、I)、三卤甲基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-SO3C1-6烷基、-OC(＝O)OC1-6烷基、-C(＝O)H、-C(＝O)C1-6烷基、-OC(＝O)C1-6烷基、-N(C1-6烷基)2、C1-6烷基、-N(C1-6烷基)2、-C(＝O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝O)O(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(＝O)N(C1-6烷基)2、-CO2H、-OC(＝O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝O)C1-6烷基、-N(C1-6烷基)C(＝S)C1-6烷基、-N(C1-6烷基)SO2N(C1-6烷基)2、-CO2C1-6烷基、-SO2N(C1-6烷基)2、-C(＝O)NH2、-C(＝S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2C1-6烷基、-N(C1-6烷基)C(＝S)N(C1-6烷基)2、-NH-C1-6烷基、-S-C1-6烷基或-O-C1-6烷基。术语―烃基‖包括由碳和氢组成的线性的、分支的或环状的单价基团。因此，烃基包括烷基、烯基和炔基基团、环烷基(包括聚环烷基)、环烯基和芳基及其组合，例如烷基环烷基、烷基聚环烷基、烷基芳基、烯基芳基、环烷基芳基、环烯基芳基、环烷基烷基、聚环烷基烷基、芳基烷基、芳基烯基、芳基环烷基和芳基环烯基。一般的烃基是C1-14烃基，更特别地C1-8烃基。在用于本发明的连接体中，酯基通常是N-羟基丁二酰亚胺脂基团。
附图简述
图1图解了来自a)甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella Paratyphi A)；b)鼠伤寒杆菌(Salmonella Typhimurium)；和c)肠炎沙门菌(SalmonellaEnteritidis)的O-抗原的重复单元的已发布结构。
图2图解了甲型副伤寒沙门氏菌O-抗原重复单元和核心结构域的结构。
图3显示通过Sephacryl S300HR，将O:2-CRM197与未缀合的组分分离。
图4显示如通过抗-O:2抗体的ELISA免疫测定法所测量的，不同O:2-CRM197缀合物的免疫原性。
图5是应用于O-抗原-核心的本发明缀合方法的示意图。
图6图解了用于将来自甲型副伤寒沙门氏菌的O-抗原与CRM197缀合的大规模方法。
图7是应用于来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组X的荚膜多糖的本发明缀合方法的简图。
图8显示了来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组X的荚膜多糖和CRM197的缀合物的SDS-PAGE分析。
图9显示了使用来自用8ug缀合的或未缀合的O:2和甲型副伤寒沙门氏菌菌株免疫的小鼠的第42天的混合血清进行的血清杀菌活性(SBA)的结果。数据表示为与阴性对照中存在的CFU相比，在测试血清中用活化BRC(和在对照血清中用失活的BRC)回收的CFU的百分比(每一血清库的每一抗-O:2ELISA抗体)。
实施本发明的模型
缀合物产生的概述
比较了用于将来自副伤寒沙门氏菌的O-抗原-核心与CRM197缀合的不同方法。特别地，比较了通过末端KDO亚基随机或者特异活化O:2链获得的缀合物。理论上，只有KDO的活化不会修饰重复糖的结构，因此可以产生更好限定的且更容易表征的缀合物。
两种方法是基于现有技术的方法。在这些方法的第一种中，使用CDAP用ADH随机活化O-抗原，然后使用EDAC将O-抗原与CRM197缀合。在第二种方法中，用ADH(通过EDAC，使用KDO的COOH基)活化O-抗原的核心区，然后使用EDAC将O-抗原与CRM197缀合。
还测试了备选的方法。第一种方法涉及通过还原胺化，经酮基用ADH活化KDO，然后用SIDEA活化，然后将所述KDO与CRM197缀合。第二种方法用CDH取代ADH。第三种方法涉及使用核心区上的焦磷酸乙醇胺基团，用SIDEA(不同ADH活化KDO)活化O-抗原。
O-抗原-核心与CRM197的缀合
(对比)方法A：通过CDAP用ADH随机活化O-抗原-核心链以及通过EDAC将O-抗原与CRM197缀合
如下文所详述，根据参考文献2合成该缀合物。
通过CDAP使用ADH进行O-抗原-核心衍生化。在室温，在150mMNaCl中，每ml的10mg/ml O-抗原-核心加入30μl的CDAP(乙腈中100mg/mL)。将pH在5.8至6.0维持30秒，然后加入0.2M TEA，以将pH增加至7.0，并在室温混合溶液2分钟。然后每10mg的O-抗原-核心加入1ml在0.5M NaHCO3中的0.8M ADH。室温实施反应2小时，并用0.1N NaOH将pH维持在8.0至8.5。然后使用G-25柱，对水脱盐反应混合物，表征命名为―OAg-(CDAP)ADH‖的产物。
OAg-(CDAP)ADH与CRM197的缀合。见OAg-(CDAP)ADH溶解于pH5.8的100mM MES中。加入等重量的蛋白质，以产生以按重量计1:1的O-抗原-核心:CRM197比例，其中O-抗原-核心浓度为5mg/ml。将反应混合物置于冰上，并加入EDAC至终浓度50mM。在冰上混合反应物另外4小时。将得到的缀合物命名为―OAg-(CDAP)ADH-CRM197‖。
(对比)方法B：通过EDAC使用ADH活化末端KDO并通过EDAC将KDO与CRM197缀合
根据参考文献9合成该缀合物。
通过EDAC在KDO处用ADH衍生化O-抗原-核心。将O-抗原-核心以3mg/ml溶解于pH5.8的100mM MES中。然后以w/w比例为1.36的ADH:O-抗原-核心加入ADH，然后加入EDAC至3.7mM的终浓度。室温混合反应物4小时。然后使用G-25柱对水脱盐反应混合物，并表征命名为―OAg-(EDAC)ADH‖的产物。
OAg-(EDAC)ADH与CRM197的缀合。根据上文用于OAg-(CDAP)ADH的方法A中所述的方法制备缀合物。将缀合物命名为―OAg-(EDAC)ADH-CRM197‖。
方法C和D：通过还原胺化用ADH(方法C)或CDH(方法D)活化末端KDO，并通过SIDEA连接体将KDO与CRM197缀合
通过还原胺化用ADH或CDH在KDO处衍生化O-抗原-核心。测试不同条件后，鉴定了O-抗原-核心衍生化的最佳方案。将O-抗原-核心以40mg/ml溶解于pH4.5的100mM AcONa中。相对于O-抗原-核心，以1:2的w/w比例加入ADH或者CDH。然后相对于O-抗原-核心，以1:2的w/w比例加入NaBH3CN。在30℃混合溶液1小时。然后使用G-25柱对水脱盐反应混合物，并表征命名为―OAg-ADH‖或―OAg-CDH‖的产物。
使用SIDEA衍生化OAg-ADH和OAg-CDH。将OAg-ADH或OAg-CDH溶解于1:9(体积/体积)水/DMSO中，以形成50mg/ml的最终O-抗原-核心浓度。一旦多糖溶解于溶液中，加入TEA以产生TEA/总NH2基团为5的摩尔比例，然后加入SIDEA以产生SIDEA/总NH2基团为12的摩尔比例。室温混合溶液3小时。在纯化SIDEA-衍生化的O-抗原-核心的最初尝试中，通过加入AcOEt或二烷(在得到的溶液中90％的体积)沉淀O-抗原-核心，并用相同的有机溶剂洗涤沉淀数次(使用加入到沉淀的体积的1/3洗涤10次)，以去除未反应的SIDEA。然后改进该方法，以避免有毒的AcOEt和二烷试剂的使用。加入等同于SIDEA-衍生化的O-抗原-核心反应混合物的两倍体积的体积的pH3的100mM柠檬酸钠，并在4℃混合30分钟。通过低pH沉淀未反应的SIDEA，并通过离心分离。然后通过用无水乙醇(在得到的溶液中80％的体积)沉淀，来从上清液中回收SIDEA-衍生化的O-抗原-核心。用乙醇洗涤沉淀2次(使用加入到沉淀的体积的1/3)并干燥。表征命名为―OAg-ADH-SIDEA‖或―OAg-CDH-SIDEA‖的产物。
OAg-ADH-SIDEA缀合物以及OAg-CDH-SIDEA与CRM197的缀合。将OAg-ADH-SIDEA或OAg-CDH-SIDEA溶解于pH7.2的NaH2PO4缓冲液中，并加入CRM197以形成20mg/ml的最终蛋白质浓度、100mM的最终缓冲能力，以及30至1的活性酯基与CRM197的摩尔比例。室温混合反应物2小时。
方法E：通过SIDEA连接体与CRM197直接缀合
将用于上文―用SIDEA衍生化OAg-ADH和OAg-CDH‖的反应条件应用于天然O-抗原-核心(即以前没有用ADH或CDH衍生化的O-抗原-核心)。将得到的产物命名为―OAg-SIDEA‖。然后通过用于上文―OAg-ADH-SIDEA缀合物以及OAg-CDH-SIDEA与CRM197的缀合‖的反应条件，将OAg-SIDEA与CRM197缀合。
O-抗原-核心缀合物的纯化
通过在1.6cm×90cm S-300HR柱上进行大小排阻层析，用50mMNaH2PO4,0.15M NaCl，pH7.2以0.5ml/分钟洗脱，来纯化根据方法A-E制备的缀合物。根据相同洗脱条件下相同柱子上游离的O-抗原-核心谱和游离的CRM197谱收集不同的库(图3)。高分子量的第一库(对应于纯化的缀合物)不含游离的糖或游离的蛋白质。
缀合物的分析
通过SDS-PAGE分析缀合物，并且与游离的CRM197相比，所述缀合物显示出不期望的高分子量群条带。通过Sephacryl S300HR大小排阻(1.6×90cm柱；50mM NaH2PO4、150mMNaCl pH7.2；0.5mL/分钟流速)，从O:2和CRM197中分离缀合物。结果显示于图3中。然后通过参考文献209的苯酚硫酸测定法(phenol sulfuric assay)(总糖)、microBCA(总蛋白质)、HPAEC-PAD(糖组成)和HPLC-SEC(大小测定、Kd)表征纯化的缀合物。结果显示于下表1中。
表1
免疫原性研究
将ELISA免疫测定法用于检测经O:2-CRM197免疫的小鼠诱发的抗O:2抗体。对于该测定，用在碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)中的15μg/mLO:2包被MaxiSorp微量滴定板4℃包被过夜。
将O:2-CRM197缀合物与未缀合的O:2抗原比较。简言之，如在表2中所述，用200μL的缀合物皮下注射雌性CD1小鼠组(8只每组，5周龄)。在第0天、14天和28天免疫小鼠。在研究期间从小鼠收集血清，并通过ELISA测定法测试。
表2
经过42天研究的ELISA结果显示，当以1μg剂量递送时，除O:2-(EDAC)ADH-CRM197外，全部缀合物都能在小鼠中诱发高水平的抗-O:2IgG抗体(图4)。在用缀合物第二次接种后，观察到了抗体的增加，而用8μg未缀合的O:2-抗原重复免疫没有产生特异性IgG抗体。对于在小鼠中产生体液免疫应答，递送8μg剂量并不比1μg剂量好。
血清杀菌活性
使用来自用8ug缀合的或未缀合的O:2和甲型副伤寒沙门氏菌免疫的小鼠第42天的混合血清进行血清杀菌活性(SBA)测定(参见表2)。结果显示于图9中。体外甲型副伤寒沙门氏菌生长的抑制与血清库中存在的抗-O:2ELISA单位的增加相关。使用选择性化学作用产生的那些缀合物观察到了最强的生长抑制；与在缀合之前随机修饰O:2的O:2-(CDAP)ADH-CRM197相比，SIDEA缀合物和O:2-(EDAC)ADH-CRM197都产生了增加的抑制。尽管由于血清中存在较低量的抗体，未缀合的O:2远远没有达到高水平的细菌生长抑制，但其表现出与用未修饰的O:2链制备的缀合物相似的抑制谱。在iBRC存在的情况下，使用对照血清没有检测到细菌生长抑制(将活性BRC存在下的相同的血清显示为对照)，表明了补体介导的致死作用。
大规模处理
基于免疫原性研究以及减少缀合物的表征，选择基于使用ADH和然后SIDEA活化O:2并与CRM197反应的缀合方法(方法C，图5)用于进一步的研发。通过该方法制备的缀合物比例如通过方法B制备的缀合物更具免疫原性。尽管通过方法A制备的缀合物产生了相当的ELISA滴度(图4)，但它们产生了相当低的血清杀菌活性(参见实施例和图9)。此外，这些缀合物具有交联结构，在多糖链上具有与一种或多种蛋白质分子连接的多个可能点，这在产物的再生和表征方面是不利的。相反，方法C的缀合物，其中每一蛋白质分子含有多个多糖链，多糖链上仅具有一个连接点。多糖链的其他部分是未改变的。O-抗原-核心通过CDAP的衍生化(方法A)可以产生糖链的交联，并且整个缀合方法是更复杂的。在方法A和B中EDAC的使用也可以导致蛋白质的交联。
研发了方法C的比例增大方法，用于产生更大量的缀合物(图6)。特别地，优化了使用ADH还原胺化O:2的步骤，以将反应时间降低至1小时(而不是以前报道该类反应的7-14天[13])，O:2活化良好的百分比>65％。将该步骤按比例扩大至300mg的O:2，重复几次，在产率和衍生化程度上的结果是可重复的。切向流过滤后，回收率为＞75％，其中＞70％的O-抗原-核心是活化的(计算为O-抗原-核心上每一GlcNAc基团连接的ADH基团的摩尔比)并且纯度良好(游离的ADH/连接的ADH的比例＜1％)。经证实，O:2-ADH中间产物在4℃在水溶液中的稳定性＞1个月。本发明人设想用在85％乙醇中沉淀O:2-ADH，来替换干燥步骤。
优化了O:2-ADH与SIDEA的反应，以避免O:2-ADH-SIDEA纯化期间AcOEt的使用。通过在pH4-5沉淀，来去除游离的SIDEA。然后在85％EtOH中沉淀O:2-ADH-SIDEA，与用AcOEt沉淀相比，所述EtOH沉淀显示出更好的沉淀形成(更易洗涤)。100mg规模获得了＞85％的回收率，其中活化的NH2基团＞80％。
本发明人发现，除来自甲型副伤寒杆菌的O:2外，基于使用ADH和然后SIDEA活化O-抗原-核心，并与CRM197反应的缀合方法(方法C，图5)同样适用于来自鼠伤寒杆菌的O-抗原-核心和来自肠炎沙门菌的O-抗原-核心。
MenX荚膜多糖与CRM197的缀合
还将方法C应用于来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组X的荚膜多糖的缀合(图7)，所述方法C导致形成了缀合物，其中反应混合物中没有游离蛋白质(图8)。
应当理解，实施例仅描述本发明，并且可以在本发明的范围和精神内进行修改。
pH和温度对用ADH作为连接体的甲型副伤寒杆菌O-抗原-核心的还原胺化的影响
使用甲型副伤寒沙门氏菌O-抗原-核心进行表3中总结的实验。评价了不同pH和不同温度的影响。在较低的pH获得了最好的活性，并且其是不依赖于温度的。在100mM缓冲液中进行反应，其中O-抗原-核心浓度为20mg/mL，并且ADH与O-抗原-核心以及NaBH3CN与O-抗原-核心的比例均为1.2至1(w/w)。同时加入ADH和NaBH3CN，并混合溶液1小时。
表3使用ADH还原胺化O:2-KDO是pH依赖和温度不依赖的。
缓冲液 温度 ％活化的O:2
乙酸钠pH4.5 30℃ 65.8
乙酸钠pH4.5 50℃ 65.4
乙酸钠pH4.5 60℃ 68.3
MES pH6.0 30℃ 43.9
磷酸盐pH8.0 30℃ 262
比较在不同反应条件下，通过还原胺化使用ADH衍生鼠伤寒杆菌O-抗原-核心
将使用ADH进行还原胺化的本申请中所述的反应条件(表4，方法1)与文献[13]中所报道的常规方法比较(表4，方法2)，其中使用鼠伤寒杆菌O-抗原-核心(菌株D23580)。结果总结于表5中，其显示较低pH的方法更快并且也更有效率。
表4.使用ADH进行还原胺化所使用的反应条件与使用文献中所报道的经典方法的NVGH方法的比较
表5.使用方法1用ADH还原胺化O:4,5-KDO比使用文献中所报道的经典方法(方法2)更有效率且更快。
方法 反应时间 ％活化的O:4,5
1 3h 88
2 3h 31.6
2 24h 28.5
2 5d 28.5
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Claims (46)

1.用于还原胺化多糖的还原端处的羰基的方法，其中所述还原胺化在pH4至pH5之间进行。
2.权利要求1的方法，其中所述羰基在所述多糖的还原端处的KDO亚基内。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述多糖包含来自革兰氏阴性菌脂多糖的核心结构域。
4.权利要求3的方法，其中所述多糖包含与所述核心结构域连接的来自革兰氏阴性菌的脂多糖的O-抗原。
5.权利要求3或权利要求4的方法，其中所述脂多糖来自沙门氏菌属(Salmonella)细菌。
6.权利要求5的方法，其中所述脂多糖来自甲型副伤寒杆菌(S.Paratyphi A)、鼠伤寒杆菌(S.Typhimurium)或肠炎沙门菌(S.Enteritidis)。
7.权利要求1的方法，其中所述多糖是细菌荚膜多糖。
8.权利要求7的方法，其中所述细菌荚膜多糖来自脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清组X。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述还原胺化包括所述羰基与通式为Y1-L-Y2的双功能连接体中的Y1反应，以形成多糖-双功能连接体化合物，其中所述多糖通过C-N键与所述双功能连接体偶联，其中：所述Y1包含可与所述多糖中的羰基反应的伯胺基；所述Y2包含第二反应基团例如伯胺基或-SH基团；并且L是连接部分。
10.权利要求9的方法，其中所述Y1和Y2均是-NHNH2基团。
11.权利要求10的方法，其中所述L具有通式-L'-L2-L'-，其中所述L'是羰基，并且所述L2是具有1至10个碳原子的直链烷基。
12.权利要求11的方法，其中所述L2是-(CH2)4-。
13.权利要求10的方法，其中所述L是羰基。
14.通过权利要求9至13中任一项的方法获得的多糖-双功能连接体化合物。
15.用于制备多糖和载体分子的缀合物的方法，其包括步骤：(a)将所述多糖与连接体偶联，以形成多糖-连接体化合物，其中所述连接体的游离端是酯基；和(b)使所述酯基与所述载体分子中的伯胺基反应，以形成多糖-连接体-载体分子缀合物，其中所述连接体通过酰胺键与所述载体分子偶联，特别地，其中所述多糖包含(i)来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域或(ii)来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组X的荚膜多糖。
16.权利要求15的方法，其中所述多糖包含来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域，所述连接体在两个末端均具有酯基，并且所述多糖通过以下方式与所述连接体偶联，以形成多糖-连接体化合物：所述酯基中的一个通过亲核酰基取代与所述核心结构域中的伯氨基反应，其中所述多糖通过酰胺键与所述连接体偶联。
17.权利要求16的方法，其中所述连接体具有通式X1-L-X2，其中所述X1是可以与所述核心结构域中的伯氨基反应的酯基；所述X2是酯基；并且所述L是连接部分。
18.权利要求17的方法，其中所述L是具有1至10个碳原子的直链烷基。
19.权利要求18的方法，其中所述L是-(CH2)4-。
20.权利要求17至19中任一项的方法，其中所述X1-L-X2是己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯。
21.权利要求16至20中任一项的方法，其中所述多糖是如权利要求4至6中任一项限定的多糖。
22.权利要求17至21中任一项的方法，其中所述脂多糖来自甲型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌或肠炎沙门菌，并且所述伯氨基在焦磷酸乙醇胺基团内。
23.权利要求15的方法，其中使用其他连接体进行所述步骤(a)，所述其他连接体在与所述连接体偶联之前用于衍生所述多糖。
24.权利要求23的方法，其中所述其他连接体在两个末端均具有伯氨基，并且所述多糖通过以下方法使用所述多糖的还原端处的羰基与所述其他连接体偶联，所述方法包括两步：(a1)所述羰基通过还原胺化与所述其他连接体中的伯氨基中的一个反应，以形成多糖-其他连接体化合物，其中所述多糖通过C-N键与所述其他连接体偶联；和(a2)使所述其他连接体的游离端与所述连接体反应。
25.权利要求24的方法，其中所述还原胺化根据权利要求1的方法进行。
26.权利要求23的方法，其中所述其他连接体在两个末端均具有伯氨基，并且所述多糖通过以下方法使用所述多糖中的羧基与所述其他连接体偶联，所述方法包括两步：(a1)所述羧基通过EDAC活化与所述其他连接体中的伯氨基中的一个反应，以形成多糖-其他连接体化合物，其中所述多糖通过酰胺键与所述其他连接体偶联；和(a2)使所述其他连接体的游离端与所述连接体反应。
27.权利要求23至26中任一项的方法，其中所述其他连接体是权利要求9至13中任一项定义的双功能连接体。
28.权利要求24至27中任一项的方法，其中所述连接体在两个末端均具有酯基，并且所述步骤(a2)包括所述酯基中的一个通过亲核酰基取代与所述其他连接体的游离端处的伯氨基反应，以形成多糖-连接体化合物，其中所述多糖通过所述其他连接体与所述连接体偶联，其中所述其他连接体通过酰胺键与所述连接体偶联。
29.权利要求15和权利要求23至28中任一项的方法，其中所述连接体是权利要求16至20中任一项定义的连接体。
30.权利要求15和权利要求23至29中任一项的方法，其中所述多糖是如权利要求2至8中任一项限定的多糖。
31.权利要求15至30中任一项的方法，其中所述载体分子是白喉毒素、破伤风毒素、类毒素或其突变体。
32.权利要求31的方法，其中所述载体分子是CRM197白喉毒素突变体。
33.通过权利要求15至32中任一项的方法获得的多糖-连接体-载体分子缀合物。
34.在权利要求15至30中任一项的方法中获得的多糖-连接体化合物。
35.在权利要求24至30中任一项的方法中获得的多糖-其他连接体化合物。
36.用于减少未反应的连接体污染根据权利要求34的多糖-连接体化合物的方法，其包括在小于pH5的含水条件下沉淀未反应的连接体的步骤。
37.权利要求36的方法，其中所述沉淀在pH2至5之间，特别地在pH4至5之间进行。
38.权利要求36或权利要求37的方法，其中所述pH通过添加含水缓冲液，特别地柠檬酸缓冲液获得。
39.权利要求36或权利要求37的方法，其中所述pH通过添加HCl获得。
40.权利要求36至38中任一项的方法，其中所述沉淀在具有＞60％含水量(体积/体积)的水溶液中进行。
41.权利要求36至39中任一项的方法，其中所述沉淀通过离心去除。
42.权利要求36至41中任一项的方法，其中所述多糖-连接体化合物通过使用醇沉淀从溶液中回收。
43.权利要求42的方法，其中所述醇是乙醇或2-丙醇。
44.权利要求43的方法，其中将所述醇加入到含所述多糖-连接体化合物的溶液中，以产生80％至95％之间的乙醇或2-丙醇(体积/体积)的终浓度。
45.权利要求44的方法，其中沉淀的所述多糖-连接体化合物通过离心回收。
46.根据权利要求36至45中任一项的方法，其中所述方法在权利要求15至32中任一项的步骤(a)和(b)之间进行。
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